trascrizione - biopd i e ii... · una rna polimerasi bloccata può riprendere la trascrizione la...
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TRASCRIZIONE
TESTO: LEWIN’s GENES X, CAPITOLO 19
LEWIN IL GENE VIII, CAPITOLO 9
processo mediante il quale l‟informazione contenuta
nel DNA (geni) viene trasferita all‟RNA
UNIVERSALI
mRNA: codifica le proteine
tRNA: trasporto di aminoacidi per traduzione
rRNA: costituenti del Ribosoma
SPECIFICI DI EUCARIOTI
snRNA: (piccoli RNA nucleari):
assistono durante lo splicing (spliceosoma)
altri snRNA modificano gli rRNA
small RNA: microRNA, piwiRNA, siRNA…
RNA non codificante a funzione regolatoria
(Nobel medicina 2006)
CLASSI DI RNA
la TRASCRIZIONE è operata dalla RNA polimerasi
stessa funzione dai batteri all‟uomo: caratteristiche e logica comune tipicamente
proteine multisubunità
alcune RNA pol. fagiche (T7 e SP6) e mitocondriali sono a singola subunità
batteri: singola RNA pol; RNA è instabile (mRNA degradato rapidamente, rRNA,
tRNA processati
eucarioti: 3 RNA polimerasi Pol I, Pol II e Pol III; RNA viene modificato al 5' e al
3', complessato a proteine, sottoposto a taglio (rRNA, tRNA e SPLICING),
esportato dal nucleo
filamento CODIFICANTE:
-orientamento 5‟-3‟
-stessa sequenza nel TRASCRITTO di RNA (U al posto di T)
filamento STAMPO o TEMPLATE
-costituisce lo STAMPO (viene usato per appaiare le basi)
-è complementare al trascritto
DNA
RNA
Ripasso della chimica degli acidi nucleici…
la trascrizione e‟ unidirezionale: da 5’-->3’ , per aggiunta di nucleosidi 5‟
trifosfati al 3‟OH della catena crescente con formazione di legame
fosfodiesterico
nucleotide +1 del DNA (del gene):
corrisponde al primo ribonucleotide
presente nel trascritto (start point)
porzione a monte (upstream):
contiene, quasi sempre, il
promotore
porzione a valle (downstream):
si trova la regione codificante
(in eucarioti introni ed esoni)
ed il terminatore
osservando la struttura di un GENE:
unità trascrizionale: tratto di DNA compreso tra punto di inizio e
terminatore per la RNA polimerasi (può comprendere più geni)
TR
AS
CR
IZIO
NE
pro
cesso d
ivis
o in p
iù tappe
terminazione
inizio
allungamento
legame
complesso binario chiuso
riconoscimento
polimerizzazione primi nt
complesso ternario
melting del DNA
complesso binario aperto
(isomerizzazione)
50 nt/s, 1 errore/104 nt incorporati
-utilizza ribonucleosidi 5‟-trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP)
richiede Mg++
-inizia da singolo nt (non ha bisogno di innesco)
-(NMP)n+ NTP (NMP)n+1+ PPi; PPi → 2Pi
-ogni nucleotide è selezionato in base alle regole della
complementarietà A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi
-usa come stampo il filamento template del DNA
RNA polimerasi
RNA polimerasi battericala macchina molecolare
w
155 kDa
151 kDa
18/70 kDa
37 kDa
10 kDa
enzima dotato di struttura quaternaria (multisubunità)
a2bb‟ws
460 kDa
RNA polimerasi battericastruttura cristallografica (core enzima)
è in grado, in linea di principio, di iniziare la Tx da
qualsiasi punto della molecola di DNA
l‟enzima (basico) ha affinità generale per qualunque
sequenza casuale di DNA (acido), ove si lega con bassa
stabilità (emivita minuti)
il nucleo o core enzima:
in vivo nella cellula batterica:
la polimerasi inizia la tx solo da particolari sequenze
localizzate a monte dello start point dette PROMOTORI.
come si spiega questo paradosso?
è l‟aggiunta del fattore di inizio, detto SIGMA, che
converte il core enzima nella forma, OLOENZIMA, in
grado di iniziare SOLO DAI PROMOTORI.
sigma destabilizza i legami
aspecifici del core enzima e
conferisce specificità per i
promotori
l‟oloenzima ha una affinità
per i promotori 1000 volte
superiore a quella del core (emivita 30-60 ore)
1/3 delle RNA polimerasi sono
sotto forma di oloenzima
in parte legati a siti aspecifici in
parte ai promotori
1/2 dei core enzima sono impegnati
nella trascrizione
in una cellula di E.coli
circa 7000 molecole di
RNA polimerasi
sigma è in eccesso rispetto ai core enzima
come studiare le sequenze di DNA
coinvolte nel legame con la polimerasi
DNA footprinting
allineamento sequenze a monte start point
(sequenza consenso)
*
*
*
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*
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*
*
*
*
DNA DNA
**
**
*
tagli in tutte le
possibili posizioni
impronta
DNA footprinting
+ DNAsi + proteina+ DNAsi
tagli solo dove
non è legata la
proteina
*
**
**
come sono i promotori?
l‟allineamento delle sequenze geniche a monte dello
start point hanno permesso di evidenziare delle corte
regioni conservate (circa 6 bp)
SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per
ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si
trova con maggior frequenza (più spesso) quando
vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali
SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per
ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si
trova con maggior frequenza (più spesso) quando
vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali
T77A100 T77A61A84T100 Pur
struttura di un promotore batterico ideale/forza del promotore
SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per
ciascuna posizione è indicato il nucleotide/aa che si
trova con maggior frequenza (più spesso) quando
vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali
T77A100 T77A61A84T100T82T84 G78A65C54A45 T80A95 T45A60A50T96 Pur
Mutare a -35 o a -10 ha la stesse consequenze?
Risposta: NO, perchè
a) Esistono sia mutazioni favorenti (UP) che inibenti (DOWN
b) Sperimentalmente, si e' visto che le mutazioni in -35 influenzano
l'attacco iniziale della RNA polimerasi (formazione complesso
chiuso). Mentre le mutazioni a -10 non hanno alcuna
conseguenza per la formazione complesso chiuso ma rallentano
la conversione a complesso aperto
IL PROMOTORE E‟ LA SEQUENZA DI DNA GENOMICO
RICHIESTA PER IL CORRETTO AGGANCIO DELLA
RNA POLIMERASI E PER IL COMPIMENTO DELLA
REAZIONE DI INIZIO
cosa sono i promotori?
MANCANZA di una ESTESA conservazione di sequenza
PRESENZA di BREVI TRATTI CONSERVATI CRITICI PER LA FUNZIONE
(sequenza -35, sequenza -10 e lo spacing tra esse nei batteri)
CARATTERISTICHE GENERALI DELLE SEQUENZE
REGOLATORIE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI
promotore procariotico esteso
elemento UP (aumento della trascrizione):
-non presente in tutti i promotori
-aumenta l‟efficienza di trascrizione di circa 30 volte
-è importante la posizione (-40 -60 dal sito di inizio)
rRNA
TRASCRIZIONE
INIZIO
come avviene il contatto tra RNA
polimerasi oloenzima e DNA
è mediato dal
fattore sigma
ALLINEAMENTO DI SEQUENZA TRA DIVERSI FATTORI SIGMA…
…RIVELA REGIONI CODIFICANTI MOTIVI PROTEICI CONSERVATI
la struttura di sigma nel contesto dell‟oloenzima
motivi helix turn helix
motivi helix turn helix (elica giro elica)
il DNA ha una scanalatura principale e una
secondaria. Le proteine che interagiscono con
esso devono riconoscere sequenze specifiche.
il "bordo" di ciascuna coppia di basi è esposto in
superficie, con un suo preciso pattern di
accettori/donatori di ponti H e di zone
idrofobiche riconoscibile da proteine.
particolarmente vero per scanalatura principale,
che non a caso è il sito di legame generalmente
più usato dalle proteine che interagiscono con il
DNA come i fattori di trascrizione.
interazioni DNA – proteine
solco maggiore e solco
minore dell‟elica del DNA
interazioni DNA - proteina
codice di riconoscimento sul DNA
dalla scanalatura principale
ciascuna delle 4 configurazione
proietta uno schema unico
dalla scanalatura secondaria
il quadro è più monotono
interazioni DNA - proteina
codice di riconoscimento sul DNA
dalla scanalatura principale
ciascuna delle 4 configurazione
proietta uno schema unico
dalla scanalatura secondaria
il quadro è più monotono
una proteina si lega al DNA perché RICONOSCE UNA SEQUENZA:
la SUPERFICIE DELLA PROTEINA E„ COMPLEMENTARE ALLE
CARATTERISTICHE DI SUPERFICIE DELLA DOPPIA ELICA
NB: ci sono tanti contatti, ognuno debole per se, ma, sommati
assicurano una interazione specifica e stabile
regione 2.4 di sigma
interagisce con regione -10
regione 4.2 di sigma
interagisce con regione -35
sigma solo (separato dal core) è incapace di legare il DNA,
questa sua proprietà è inibita (autoinibita-frenata)
il fattore sigma (in rosa) nella struttura tridimensionale
della RNA polimerasi di T.aquaticus
strutturalmente SIGMA si estende oltre il sito attivo, quasi come
un'"antenna" che "cattura" il DNA e lo sistema "in fondo" al core
enzyme nella tasca catalitica
complesso binario
chiuso
complesso binario
aperto
SIGMA
CORE
RNA polimerasi incontra un dilemma nel conciliare
inizio e allungamento.
inizio richiede un legame FORTE e SPECIFICO
esclusivamente ai PROMOTORI;
allungamento un legame STABILE A TUTTE le
SEQUENZE incontrate dall‟enzima durante la Tx.
SOLUZIONE:
SIGMA che garantisce il riconoscimento
promotoriale serve SOLO all‟INIZIO;
dopo aver passato la fase di inizio abortiva, si
stacca e viene riciclato
l‟avidità per il DNA/RNA nascente
(indipendentemente dalla sequenza) da parte
della core Pol è sufficiente a mantenere il
legame durante l‟allungamento
come funziona sigma?
Sigma accelera questo
passaggio
la polimerasi è ferma sul promotore
sigma legato ostruisce il canale di uscita dell‟RNA
il DNA viene “tirato” dentro la polimerasi, vengono polimerizzati alcuni nt (2-9)
e poi rilasciati DNA e RNA (nuovo ciclo)
solo quando sigma viene rilasciato la polimerasi lascia il promotore
complesso terziario inizi abortivi:
è la RNA pol (sigma) che crea la
bolla di Tx quando si lega ad un
promotore.
il duplex di DNA e‟ parzialmente
(14 nt) e transitoriamente
denaturato
la bolla è sempre racchiusa nella
RNA polimerasi
la sintesi di RNA avviene
nella bolla di trascrizione
l‟RNA polimerasi cambia dimensione
durante le fasi di inizio e protegge
porzioni più o meno ampie della
regione intorno allo start point
TRASCRIZIONE
ALLUNGAMENTO
complesso di elengazione:
macchina enzimatica complessa:
svolge (DNA da tx)
riavvolge (DNA già tx)
stampa RNA
funziona da correttore di bozze
stacca l‟ibrido DNA/RNA
Le subunita' beta sono il cuore catalitico della RNA pol procariotica
alcuni farmaci, per es. Rifampicina, si attaccano a b in una posizione che
impedisce l'allungamento perché impedisce la fuoriuscita dell‟RNA.
quando viene incorporato un nucleotide sbagliato, viene sentito il
mismatch e l‟RNA polimerasi corregge l‟errore mediante:
editing pirofosfolitico
reazione inversa della formazione legame fosfodiestereo
il pirofosfato viene rilegato al nucleotide appena incorporato
editing idrolitico
RNA-pol torna indietro di 1 o più nucleotidi e taglia
l‟RNA prodotto rimuovendo la sequenza errata
è stimolato da fattori proteici (Gre)
correzione RNA neosintetizzato(errore: 1 ogni 10 000)
quando il DNA è danneggiato
quando mancano i nucleotidi
l‟enzima (la bolla tx) fa “retromarcia”
e rimane bloccata fino alla
“risoluzione del problema”
assistita da alcuni fattori proteici
(GreA e GreB) taglia la regione 3‟
dell‟RNA
il filamento stampo si trova quindi in
posizione corretta e l‟allungamento
può riprendere
una RNA polimerasi bloccata può riprendere la trascrizione
la polimerasi svolgendo il DNA introduce superavvolgimenti
positivi nella regione a valle (da trascrivere) che se non corretti,
intralcerebbero la Tx
il DNA che si riappaia a monte presenta dei
superavvolgimenti negativi
girasi = enzimi che tolgono i
superavvolgimenti positivi
topoisomerasi = enzimi che
introducono superavvolgimenti
positivi
due enzimi: girasi e topoisomerasi
intervengono per ripristinare il normale stato di
avvolgimento nel DNA
topoisomerasi I
taglia un filamento e fa passare filamento complementare,
ligazione
girasi (topoisomerasi II)
taglia entrambi i filamenti incrocia il DNA e ricuce usa
ATP per energia
riassumendo…..
3 fasi della tx
inizio: 3 passaggi.
A) formazione complesso chiuso legame della polimerasi ad
una speciale sequenza di dsDNA, cioe‟ al promotore.
B) fase di complesso APERTO, in cui il duplex si separa per
circa 14 basi= si libera il filamento stampo; i primi 2
nucleotidi vengono allineati nel sito attivo con il filamento
stampo e polimerizzati; la polimerasi comincia
polimerizzare in direzione 3‟, fino a fare un frammento di
10 basi; in questa fase la polimerasi va avanti ed indietro =
inizi abortivi (rilasciando i piccoli frammenti trascritti e
ripartendo dal +1)
C) formazione di un complesso ternario (DNA RNA e
Polimerasi) stabile. Fino a questo stadio la polimerasi
non ha lasciato il promotore
Allungamento la polimerasi volge e svolge il DNA e sintetizza il
trascritto (problema topologico, next slide). C‟e‟ un cambio
conformazionale che ancora stabilmente la pol al DNA.
Terminazione. Fine della Tx e rilascio del trascritto primario
In batteri, esistono ben precise sequenze di terminazione
(terminatore)
In eucarioti non c‟e‟ un vero e proprio terminatore. Vedremo più
avanti…
espressione genica
la trascrizione copia selettivamente
discrete porzioni di genoma, e ne fa
anche migliaia di copie
non tutti i geni vengono utilizzati nello
stesso momento e non tutti con la
stessa intensità
ma
controllo dell‟espressione genica
1) l'espressione genica è energicamente costosa (fare
RNA e proteine richiede molto dispendio energetico
per la cellula)
2) l‟espressione contemporanea di tutti i geni
causerebbe una tale cacofonia regolatoria e
strutturale da risultare incompatibile con la vita (per
es. differenziamento, sporulazione etc)
CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA E'
CENTRALE ALLA VITA (e quindi anche nella malattia)
la regolazione è dettata dal contesto cellulare, da
molteplici stimoli, dalle necessità
la regolazione è qualitativa (questo gene SI‟ e l‟altro NO)
ma è anche profondamente quantitativa
(accendo un gene e lo trascrivo 10-100 oppure milioni di
volte... e come dove e quando mi fermo ???)
l‟espressione genica è differenziale
cosa significa espressione genica differenziale?
capacità di esprimere una parte del proprio
repertorio genico nella giusta combinazione, in
momenti diversi ed in siti diversi.
lo sviluppo embrionale e la omeostasi (capacità
di mantenere un equilibrio) dei tessuti degli
organismi pluricellulari, o la capacità di
rispondere alle variazioni ambientali e la capacità
di differenziare (sporulazione) nei batteri sono
straordinari esempi di differential gene
expression
controllo dell‟espressione genica
controllo dell‟espressione genica
l‟espressione può essere regolata a vari livelli
pre trascrizionale (negli eucarioti)
trascrizionale (il più importante e diffuso)
post-trascrizionale (soprattutto negli eucarioti)
traduzionale
co e post-traduzionale (il più veloce e dispendioso)
elementi trans attivi - elementi cis attivi
un regolatore è elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol,
fattori di trascrizione, miRNA ecc.
agisce su qualunque copia del suo bersaglio
il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA è elemento cis attivo
(promotore, operatore, enhancer ecc.)
ha effetto solo sul DNA adiacente