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Travail de fin d’études

Mise au point d’un test de croissance cellulaire permettant le criblage de molécules en vue de trouver un inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGE-A1 aux cellules tumorales mammaires MCF-7 Présenté par

LEMAIRE MARTIN Sous la direction de WOUTERS JOHAN

En vue de l’obtention du grade de

Bachelier – Technologue de laboratoire médical

Section Biologie Médicale 2015 – 2016 Site de Fleurus

WOUTERS JOHAN DE BACKER OLIVIER MAURER TYPHANIE

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Travail de fin d’études

Mise au point d’un test de croissance cellulaire permettant le criblage de molécules en vue de trouver un inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGE-A1 aux cellules tumorales mammaires MCF-7 Présenté par

LEMAIRE MARTIN Sous la direction de WOUTERS JOHAN

En vue de l’obtention du grade de

Bachelier – Technologue de laboratoire médical

Section Biologie Médicale 2015 – 2016 Site de Fleurus

WOUTERS JOHAN DE BACKER OLIVIER MAURER TYPHANIE

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Stage effectué du 8 février 2016 au 20 mai 2016 par Martin Lemaire

Maitre de stage : Pr. Johan Wouters Promoteur de stage : Pr. Caroline Charlier

Superviseur de stage : Pr. Olivier De Backer & Typhanie Maurer Réalisé au laboratoire de génétique de l’URPhyM, faculté de médecine de l’université de Namur

Rue de Bruxelles 61, 5000 Namur

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Remerciements

Nombreux sont ceux ou celles qui ont participé, de près ou de loin, au bon déroulement de mon stage et à la réalisation de ce TFE. Je tiens à remercier tout spécialement le Pr. Johan Wouters qui a accepté le rôle important de maître de stage. Je lui suis extrêmement reconnaissant pour le temps qu’il m’a consacré, et le soutien apporté tout le long de mon stage. Je remercie également le Pr. Caroline Charlier, ma promotrice de stage. Ses conseils avisés, aussi bien pendant le stage qu’en première partie d’année, m’ont permis d’affronter sereinement l’épreuve qu’est la rédaction d’un TFE. J’adresse également mes remerciements au Pr. Olivier De Backer pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour m’avoir guidé par ses conseils judicieux. Je tiens tout spécialement à remercier Typhanie Maurer pour m’avoir supervisé et accompagné tout au long de ce stage. Son sens de l’accueil et de la pédagogie m’ont permis de me sentir très vite à l’aise au sein du laboratoire et avec mon projet de stage. Je ne compte plus les nombreuses heures qu’elle a passé à m’expliquer les manipulations, à discuter avec moi ou à relire mon travail. Je lui en suis très reconnaissant. Je tiens tout particulièrement à exprimer ma sympathie et à remercier pour leur aide les équipes de l’URPhyM et du laboratoire CBS : Eve, Coco, Dominique, Axelle, Olivier, Cédric, Camille, J-M, Gégé, Marie, Manon, Sébastien, Mégane et tous les autres. C’est grâce à eux que j’arrivais le matin avec le sourire et que j’ai passé tous ces moments inoubliables lors de mon stage. Je remercie énormément Manon, ma famille, mes amis et mon entourage pour leur soutien apporté lors de ce stage et lors de mes années d’étude. Pour finir, je tiens à remercier le Pr. Françoise Motte pour m’avoir trouvé ce stage passionnant et pour son accompagnement lors de ces trois années d’études. Plus généralement je remercie tous les professeurs et membres du personnel de la HELHa de Fleurus qui m’ont fourni un enseignement de qualité tout au long de mon cursus et ce, tout en en gardant cet esprit familial qui caractérise notre école.

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Table des matières

PRÉSENTATION DU LIEU DE STAGE ........................................................................................................ 11 INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 12

CONTEXTE GÉNÉRAL ...................................................................................................................... 14 1.1. CANCERS ET APOPTOSE ..................................................................................................................... 14

1.1.1. Mécanismes d’apoptose ................................................................................................... 14 1.1.1.1. La voie extrinsèque ..................................................................................................................... 14 1.1.1.2. La voie intrinsèque ...................................................................................................................... 15 1.1.1.3. Crosstalk...................................................................................................................................... 15

1.1.2. Chimiothérapie anticancéreuse ......................................................................................... 15 1.1.2.1. La doxorubicine ........................................................................................................................... 16 1.1.2.2. Résistance à la chimiothérapie ................................................................................................... 16

1.2. LES PROTÉINES MAGE ..................................................................................................................... 17 1.2.1. Les MAGE de type I ............................................................................................................ 18

1.2.1.1. Expression ................................................................................................................................... 18 1.2.1.2. Mécanisme de résistance à l’apoptose ....................................................................................... 19

1.2.1.2.1. La protéine p53 ...................................................................................................................... 19 1.2.1.2.2. Mécanismes d’inhibibition de p53 par les MAGE de type I ................................................... 20

1.2.1.2.2.1. Recrutement des HDAC ................................................................................................. 21 1.2.1.2.2.2. Dégradation via des E3 RING ubiquitine-ligases. ........................................................... 21 1.2.1.2.2.3. Interaction directe ......................................................................................................... 21

1.2.1.2.3. Les AMPK ............................................................................................................................... 22 OBJECTIFS ..................................................................................................................................... 23 MATÉRIEL ET MÉTHODES .............................................................................................................. 24 3.1. CULTURE CELLULAIRE ........................................................................................................................ 24

3.1.1. Cellules MCF-7 clones vides et clones MAGE-A1 ............................................................... 24 3.2. TECHNIQUES LIÉES À LA MANIPULATION DE CELLULES .............................................................................. 25

3.2.1. Passage des cellules MCF-7 et ensemencement de plaques 6 puits et 96 puits ................ 25 3.2.1.1. Principe ....................................................................................................................................... 25 3.2.1.2. Matériel ...................................................................................................................................... 26 3.2.1.3. Méthode ..................................................................................................................................... 26

3.2.2. Transfection de siRNA (siMAGEA et si CTRL) dans les cellules ensemencées sur plaques 6 puits (48h après ensemencement) et sur plaques 96 puits (24h après ensemencement) ........................ 27

3.2.2.1. Principe ....................................................................................................................................... 27 3.2.2.2. Matériel ...................................................................................................................................... 27 3.2.2.3. Méthode ..................................................................................................................................... 28

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3.2.3. Traitement des cellules à la doxorubicine et aux molécules du NAMEDIC (48h après ensemencement) ....................................................................................................................................... 29


3.2.4. Test de croissance cellulaire MTS (120h après ensemencement) ..................................... 30 3.2.4.1. Principe ....................................................................................................................................... 30 3.2.4.2. Matériel ...................................................................................................................................... 30 3.2.4.3. Méthode ..................................................................................................................................... 30

3.3. WESTERN BLOT ET TECHNIQUES ASSOCIÉES ........................................................................................... 31 3.3.1. Récolte des protéines pour le western blot ....................................................................... 31


3.3.2. Dosage de la solution de protéines ................................................................................... 32 3.3.2.1. Principe ....................................................................................................................................... 32 3.3.2.2. Matériel ...................................................................................................................................... 32 3.3.2.3. Méthode ..................................................................................................................................... 32

3.3.3. Western blot ...................................................................................................................... 33 3.3.3.1. Principe ....................................................................................................................................... 33 3.3.3.2. Matériel ...................................................................................................................................... 33 3.3.3.3. Méthode ..................................................................................................................................... 34

3.3.4. Contrôle de charge ............................................................................................................ 35 3.3.4.1. Principe ....................................................................................................................................... 35 3.3.4.2. Méthode ..................................................................................................................................... 35

3.4. TRAITEMENT DES DONNÉES ................................................................................................................ 35 3.4.1. Calcul de la viabilité face à une molécule du NAMEDIC .................................................... 35

3.4.1.1. Principe ....................................................................................................................................... 35 3.4.1.2. Méthode ..................................................................................................................................... 36

3.4.2. Calcul de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGEA1 et calcul de l’inhibition de cette résistance par une du NAMEDIC ............................................................................... 37

3.4.2.1. Principe ....................................................................................................................................... 37 3.4.2.2. Méthode ..................................................................................................................................... 37

3.5. STATISTIQUES ................................................................................................................................. 38 3.5.1. Test ANOVA à deux facteurs ............................................................................................. 38

RÉSULTATS ET DISCUSSION ........................................................................................................... 40 4.1. MISE AU POINT DU TEST .................................................................................................................... 40

4.1.1. Sélection d’un clone MAGE-A1 .......................................................................................... 40 4.1.2. Reproduction de l’expérience de Benjamin Demoulin et sélection d’une concentration en

doxorubicine et d’un temps d’incubation du MTS ..................................................................................... 41

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4.1.3. Confirmation de l’implication de MAGE-A1 dans la résistance à la doxorubicine............. 42 4.1.3.1. Vérification de l’efficacité du siRNA ............................................................................................ 42 4.1.3.2. Test de viabilité des cellules transfectées par le siRNA anti-MAGE-A et traitées à la

doxorubicine .................................................................................................................................................... 43 4.2. CRIBLAGE DE MOLÉCULES .................................................................................................................. 45

4.2.1. Test de non-toxicité sur les cellules MCF-7 clone vide et clone MAGE-A1 ......................... 45 4.2.2. Evaluation de l’inhibition, par les molécules du NAMEDIC, de la résistance à la

doxorubicine conférée par MAGE-A1 ........................................................................................................ 49 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..................................................................................................... 54

TABLE DES ABRÉVIATIONS ..................................................................................................................... 56 BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................................... 58

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Présentation du lieu de stage J’ai effectué mon stage au sein de l’université de Namur et plus particulièrement dans les

laboratoires l’Unité de Recherche en Physiologie Moléculaire (URPhyM) de la faculté de médecine. Cette unité aborde plusieurs sujets de recherche fondamentale en physiologie moléculaire normale et pathologique.

J’ai été accueilli au sein du laboratoire de génétique de l’URPhyM dirigé par le Pr. Olivier De Backer. Cette équipe travaille essentiellement sur le cancer et ses mécanismes génétiques. Leurs recherches se font à l’aide d’outils comme la PCR, la confection et la transfection de plasmides, la culture cellulaire, les analyses par western blot, l’immunoprécipitation, l’étude in vivo sur souris de laboratoire, …

Le projet sur lequel j’ai travaillé a été réalisé en collaboration avec le laboratoire de Chimie Biologie Structurale (CBS) de l’Unité de Chimie Physique Théorique et Structurale (UCPTS) de la faculté des sciences. Il appartient au Namur Medicinal Center (NAMEDIC), spécialisé dans le domaine de la chimie médicinale. Ce laboratoire est dirigé par mon maître de stage, le Pr. Johan Wouters. Ses membres travaillent, entre autres, sur la synthèse de molécules d’intérêts biologique, l’étude structurale de molécules, la cristallographie, …

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Introduction Lors de certaines formes de cancers, une déméthylation de certains gènes est observée.

Celle-ci peut provoquer l’expression anormale d’une famille de protéines appelée MAGE (melanoma antigen) de type I [De Smet et al., 1996]. Ces protéines font partie d’un groupe de protéines appelées cancer-testis antigens (CTA) qui regroupent les protéines qui sont normalement synthétisées uniquement dans les cellules germinales mais qui sont également anormalement exprimées dans certaines cellules tumorales [Scanlan et al., 2002].

En 2006, des études suggèrent que les protéines MAGE de type I sont à l’origine d’un blocage de l’apoptose et donc d’une résistance à la chimiothérapie par une inhibition de p53 [Monte et al., 2006] et de l’AMP-activated protein kinase (AMPK) [Pineda et al., 2015].

Ce travail se focalise sur une seule protéine faisant partie de la famille des MAGE de type I : MAGE-A1. Cette protéine est ici étudiée dans le cadre de la résistance à l’agent chimiothérapeutique doxorubicine qu’elle confère aux cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1.

Vingt-quatre molécules issues des travaux du centre NAMEDIC ont été sélectionnées par le laboratoire CBS (UNamur) dans le but d’être testées afin de trouver un éventuel inhibiteur de cette résistance.

Pour ce faire, un test de viabilité doit être mis au point pour permettre la détection de la résistance à la doxorubicine des cellules exprimant MAGE-A1 et pour permettre de détecter une éventuelle inhibition de cette résistance par les composés fournis. Ce test doit être adapté à un criblage efficace de la sélection de vingt-quatre molécules.

Une fois le test au point, ces vingt-quatre molécules seront testées et leurs effets sur la résistance à la doxorubicine analysés.

Ce travail sera divisé en quatre parties : la première consistera en une explication des éléments théoriques nécessaires pour la compréhension de l’effet de résistance à la doxorubicine engendrée par MAGE-A1, la deuxième explicitera les objectifs de ce travail, la troisième détaillera les méthodes utilisées dans la mise au point du test et le criblage des

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potentiels inhibiteurs et la dernière développera les résultats de cette mise au point et des tests effectuées à l’aide de ces vingt-quatre molécules.

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Contexte général

1.1. Cancers et apoptose Un cancer est une maladie caractérisée par une prolifération cellulaire anormale. Dans

certains cas, les cellules cancéreuses envahissent d’autres sites de l’organisme que celui d’origine [Pecorino, 2008].

Une des caractéristiques principales des cellules cancéreuses est leur capacité à pouvoir résister à l’apoptose [Hanahan et al., 2011]. 1.1.1. Mécanismes d’apoptose

L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un processus par lequel la cellule déclenche sa destruction contrôlée suite à des signaux spécifiques appelés facteurs de mort cellulaire ou suite à des dommages physiques ou chimiques comme un stress oxydatif ou une détérioration de l’ADN. L’apoptose est un phénomène non pathologique destiné à éliminer les cellules présentant une anomalie ou devenues non nécessaires [Pecorino, 2008].

Une fois déclenchée, l’apoptose est un phénomène très rapide (de l’ordre de quelques heures). Lors de son déroulement, l’ADN est fragmenté et des protéases spécifiques, les caspases, entrent en action. Ensuite, des corps apoptotiques (vésicules membranaires contenant le cytoplasme et les organites dégradés) sont relargués et phagocytés par les macrophages [Feldmann, 1999; Pecorino, 2008].

Il existe deux voies d’induction de l’apoptose : la voie extrinsèque et la voie intrinsèque [Haupt et al., 2003]. 1.1.1.1. La voie extrinsèque

La voie extrinsèque fait intervenir la liaison de protéines extracellulaires à des récepteurs cellulaires de la famille des récepteurs au TNF (Tumor Necrosis Factor). Cette famille comprend par exemple le récepteur Fas (CD-95) dont le ligand se retrouve à la surface des lymphocytes T cytotoxiques et Natural Killers (NK) [Pecorino, 2008].

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La liaison du récepteur au TNF avec son ligand entraîne une cascade d’activations enzymatiques faisant intervenir, entre autres, les caspases. Ce phénomène aboutit finalement à la mort de la cellule [Haupt et al., 2003]. 1.1.1.2. La voie intrinsèque

La voie intrinsèque dépend de stimuli internes aux cellules tels qu’un stress oxydatif ou l’altération de l’ADN [Pecorino, 2008]. Cette voie est contrôlée par une famille de protéines, les Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), qui induisent soit la libération soit la rétention du cytochrome c des mitochondries selon la nature de ces Bcl-2 (pro-apoptotiques ou anti-apoptotiques). La libération du cytochrome c, normalement impliqué dans la chaine respiratoire, provoque une cascade d’activations enzymatiques faisant aussi appel à des caspases. Ces réactions aboutissent également à la mort cellulaire [Haupt et al., 2003]. 1.1.1.3. Crosstalk

Il est intéressant de noter que ces deux voies ne sont pas totalement indépendantes. En effet, l’activation d’une de ces deux voies peut conduire à l’activation de l’autre. Dans ce cas, on parlera de « crosstalk » entre les deux voies. Par exemple, la caspase 8 activée dans la voie extrinsèque peut activer la voie intrinsèque [Pecorino, 2008]. Les cellules cancéreuses ont la capacité de résister à l’apoptose, ce qui permet la croissance tumorale mais explique aussi la résistance aux traitements chimiothérapeutiques. 1.1.2. Chimiothérapie anticancéreuse

La chimiothérapie est un des traitements envisagés lors d’un cancer. Elle consiste en un traitement médicamenteux dont le but est d’altérer le fonctionnement de la cellule en empêchant la division de celle-ci ou en déclenchant l’apoptose. Il existe trois principaux types de médicaments anticancéreux classiques. Le premier regroupe les agents alkylants et les sels de platine qui forment des ponts covalents avec l’ADN, inhibant la réplication. Le deuxième type englobe les antimétabolites, des agents chimiques ayant une configuration semblable à des molécules endogènes de la cellule. Ces agents inhibent la synthèse d’acides nucléiques entrainant la mort de la cellule. Finalement, le troisième type de drogues regroupe les autres médicaments organiques dont la doxorubicine [Pecorino, 2008].

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1.1.2.1. La doxorubicine La doxorubicine (figure 1) est une molécule complexe appartenant à la famille des

anthracyclines initialement extraite de la bactérie Streptomyces peucetius var. De nos jours, elle est utilisée dans le traitement de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, de l'estomac, des ovaires, de la thyroïde, les lymphomes, les myélomes multiples,… [Thorn et al., 2011].

Figure 1 Structure de la doxorubicine, disponible sur : http://file.selleckchem.com/downloads/struct/Adriamycin-Doxorubicin-chemical-structure-S1208.gif

La doxorubicine diffuse à travers la membrane plasmique et s’accumule dans la plupart des types cellulaires [Pecorino, 2008]. Cette molécule agit de deux façons sur les cellules.

Premièrement, elle s’intercale dans l’ADN entrainant des cassures et perturbant l’action des topoisomérases de type II, des enzymes qui régulent l’enroulement de l’ADN lors de la réplication et de la transcription.

Deuxièmement, le métabolisme de la doxorubicine par les cellules entraine la formation de radicaux libres et provoque des dommages dans la membrane plasmique.

Dans les deux cas, la voie intrinsèque de l’apoptose est activée entrainant la mort de la cellule [Thorn et al., 2011]. 1.1.2.2. Résistance à la chimiothérapie

Une des caractéristiques fréquentes des cellules cancéreuses est leur résistance aux mécanismes de mort cellulaire. Cette caractéristique permet de résister à certains agents chimiothérapeutiques causant un problème clinique majeur dans le traitement des cancers.

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Un des acteurs de cette résistance consiste en une famille de protéines partageant des similitudes structurales : les protéines MAGE [Monte et al., 2006]. 1.2. Les protéines MAGE

En 1991, P. van Der Bruggen et ses collègues découvrent des antigènes reconnus in vitro par des lymphocytes T cytotoxiques de patients souffrant de mélanomes. Les trois gènes, très semblables, codant pour ces antigènes sont identifiés et ne présentent aucune homologie avec les autres gènes répertoriés à l’époque. Ils nomment cette famille de gènes melanoma antigen (MAGE) et les trois gènes découverts : MAGE-1, MAGE-2 et MAGE-3 [Van der Bruggen et al., 1991].

La même équipe découvre quelques années plus tard que ces gènes sont exprimés dans de nombreux cancers comme celui du sein, du côlon... Ceux-ci sont identifiés comme faisant partie des cancer-testis antigens (CTA) qui regroupent les gènes qui sont normalement exprimés uniquement dans les cellules germinales mâles. Ils sont, également, anormalement exprimés dans certaines cellules cancéreuses [Scanlan et al., 2002].

De nombreuses autres protéines MAGE ont été découvertes par la suite. Elles possèdent toutes une région d’environ 200 acides aminés appelée MAGE homology domain (MHD). Cette région se situe le plus souvent à l’extrémité COOH-terminale. Différentes sous-familles de protéines MAGE diffèrent principalement par leur partie N-terminale [Chomez et al., 2001].

Sur base de leur profil d’expression dans les tissus, les protéines MAGE ont été classées en deux familles (figure 2).

Les protéines MAGE de type I reprennent celles identifiées comme des CTA. Elles comprennent les sous-familles MAGE-A (MAGE-1, -2, -3 appelées maintenant MAGE-A1, -A2, -A2), MAGE-B et –C. Les gènes MAGE de type I sont localisés exclusivement sur le chromosome X [Chomez et al., 2001].

Les protéines MAGE de type II sont quant à elles exprimées dans divers tissus somatiques. Elles comprennent les MAGE-D, -E, -F, -G, -H, -L et la protéine appelée Necdin. Certains gènes MAGE de type II sont localisés sur des autosomes [Weon et al., 2015].

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Figure 2: Les protéines MAGE et leurs MHD , extrait de [Weon et al., 2015]. Les différentes protéines MAGE recensées sont ici classées selon leur type et leur sous-famille. Les MHD sont mis en évidence en rouge (les MHD tronqués sont en rose).

1.2.1. Les MAGE de type I Le rôle physiologique des protéines MAGE de type I n’est pas connu mais on suppose que

cette protéine joue un rôle dans la spermatogenèse [Clotman et al., 2000]. L’expression d’un gène MAGE de type I dans certains cancers est associée à un mauvais

pronostique clinique car celle-ci favoriserait la croissance des tumeurs, de métastases et entrainerait une résistance à certains agents chimiothérapeutiques [Monte et al., 2006]. En plus de son caractère aggravant, des études récentes suggèrent que les protéines MAGE pourraient jouer un rôle important dans l’oncogenèse [Weon et al., 2015]. 1.2.1.1. Expression

La régulation de la transcription des gènes MAGE de type I dépend de marques épigénétiques.

Dans les cellules normales, le promoteur des gènes MAGE de type I, ainsi que les histones associées sont méthylés, entrainant une répression de l’expression de ces gènes [De Smet et al., 1996].

Lors du développement d’une tumeur cancéreuse, on observe souvent une déméthylation de nombreux gènes, dont certains gènes MAGE de type I. Ceux-ci sont alors exprimés [De Smet et al., 1996].

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1.2.1.2. Mécanisme de résistance à l’apoptose En 2006, des études suggèrent que les protéines MAGE de type I sont à l’origine d’un

blocage de l’apoptose et d’une résistance à la chimiothérapie par une inhibition de la protéine p53 [Monte et al., 2006]. 1.2.1.2.1. La protéine p53

La protéine p53 est un facteur de transcription jouant un rôle important dans le contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose. Elle est également un important suppresseur de tumeurs. On observe la mutation du gène p53 dans des nombreux cancers. De façon générale, p53 réprime les gènes anti-apoptiques (comme des Bcl-2 anti-apoptotiques) et active les gènes pro-apoptotiques (comme les gènes des récepteurs Fas) [May et al., 1999].

La protéine p53 se lie à l’ADN grâce à son domaine de liaison à l’ADN, ce qui provoque l’activation ou l’inhibition des gènes cibles. Elle peut être activée par des dommages dans l’ADN, par des facteurs de croissance anormaux, des signaux de l’oncogenèse, des stress cellulaires et oxydatifs (figure 3). L’activation de p53 peut entrainer l’arrêt du cycle cellulaire, l’apoptose, l’activation de la réparation de l’ADN ou encore l’inhibition de l’angiogenèse (figure 3) [May et al., 1999; Pecorino, 2008; Sablina et al., 2005].

Figure 3 Activateurs et Effets de p53, modifié de [Pecorino, 2008]

La principale régulation de p53 se fait grâce à MDM2 (murine double minute 2). MDM2 est une E3-ubiquitine-ligase, une enzyme qui attache un petit peptide, l’ubiquitine, sur le domaine C-terminal de p53. Ce groupement ubiquitine est ensuite reconnu par un complexe

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enzymatique, appelé protéasome, qui va dégrader p53 [Pecorino, 2008]. La régulation de MDM2 se fait par une boucle de rétroaction : p53 active l’expression de MDM2 et MDM2 induit alors la dégradation de p53. L’expression de MDM2 n’est donc plus activée (figure 4) [Wu et al., 1993].

Figure 4 : Boucle de rétroaction de MDM2, modifié de [Pecorino, 2008]

Selon l’évènement activateur de p53 (figure 3), le mécanisme d’activation est différent mais fait souvent intervenir des protéines kinases. Ces kinases catalysent une phosphorylation de la région N-terminale de p53, ce qui inhibe l’interaction de p53 avec MDM2. Dès lors, p53 n’est plus dégradée et devient active [Pecorino, 2008]. Un des évènements activateurs est l’exposition des cellules à la doxorubicine [May et al., 1999]. Un autre effet de p53 est l’arrêt du cycle et donc de la division cellulaire. Cet arrêt est dû à l’activation du gène p21 [Pecorino, 2008]. 1.2.1.2.2. Mécanismes d’inhibibition de p53 par les MAGE de type I

Les protéines MAGE de type I inhibent l’action de p53, ce qui entraine une résistance à la chimiothérapie, y compris à la doxorubicine [Monte et al., 2006]. Plusieurs mécanismes d’inhibition impliquant un recrutement d’histones désacétylases (HDAC), une dégradation de p53 via des E3 RING ubiquitine-ligases ou encore une interaction directe MAGE-p53 ont été proposés.

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1.2.1.2.2.1. Recrutement des HDAC Le premier mécanisme suggéré a été celui faisant intervenir les HDAC (histones

désacétylases). Des études ont démontré que certains MAGE de type I seraient à l’origine de la formation de complexes p53-HDAC. Ces HDAC provoquent une désacétylation des histones, ce qui provoque une condensation de la chromatine et empêche p53 d’activer la transcription des gènes cibles (figure 5) [Monte et al., 2006].

Figure 5 : Désacétylation des histones et extinction des gènes via un MAGE de type I (ici MAGE-A2) et

HDAC, modifié de [Demoulin, 2015] 1.2.1.2.2.2. Dégradation via des E3 RING ubiquitine-ligases.

En 2010, une nouvelle propriété des protéines MAGE de type I a été découverte : elles se fixeraient par leur MHD à certaines E3 RING ubiquitine-ligases, une famille d’ubiquitine-ligases. Une ou plusieurs protéines MAGE de type I fixeraient une E3 RING ubiquitine-ligase spécifique. Cette fixation entrainerait une augmentation de l’activité de ces enzymes pouvant mener à la dégradation de p53 (et d’autres protéines cibles) [Doyle et al., 2010]. 1.2.1.2.2.3. Interaction directe

En 2010 également, Marcar et son équipe ont mis en évidence une interaction directe entre certaines protéines MAGE de type I et le domaine de liaison à l’ADN de p53. Cette liaison empêche p53 d’activer ou d’inhiber les gènes cibles [Marcar et al., 2010].

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Les trois mécanismes décrits ci-dessus expliquent comment les MAGE de type I induisent une inhibition de p53 et donc une résistance à l’apoptose et à la chimiothérapie. 1.2.1.2.3. Les AMPK

L’AMP-activated protein kinase (AMPK) est un régulateur de l’énergie cellulaire. En cas de stress métabolique, son rôle est d’activer des processus cataboliques et de réfréner les processus anaboliques afin de rendre disponible l’énergie pour lutter contre ce stress et ralentir la croissance et la division de la cellule.

En 2015, il a été démontré que certaines protéines MAGE de type I activent des ubiquitine-ligases qui ubiquitinent l’AMPK induisant ainsi sa dégradation par le protéasome. La destruction des AMPK induit également une résistance à la chimiothérapie [Pineda et al., 2015].

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Objectifs Ce TFE a deux objectifs principaux :

Le premier objectif est la mise au point d’un test ayant pour but de détecter d’éventuels inhibiteurs de la résistance à la doxorubicine conférée par MAGE-A1 dans des cellules MCF-7. Ce test doit être adapté à un criblage efficace de la sélection de vingt-quatre molécules. Cette mise au point sera basée sur le test de résistance à la doxorubicine décrit dans la thèse de Benjamin Demoulin (figure 6) [Demoulin, 2015].

Figure 6 : L’expression de MAGE-A1 dans les cellules MCF-7 induit une résistance à la doxorubicine, issu

de [Demoulin, 2015]. Des cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1 (MAGE-A1) ou non (Empty) ont été traitées par différentes concentrations de doxorubicine. Leur viabilité a été ensuite mesurée par un test MTT et les résultats sont exprimés en pourcents en établissant que la viabilité en absence de drogue vaut 100%.

Le deuxième objectif est de tester les vingt-quatre molécules issues du centre NAMEDIC et sélectionnées par le laboratoire CBS afin de trouver d’éventuels inhibiteurs de cette résistance.

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Matériel et méthodes

3.1. Culture cellulaire

3.1.1. Cellules MCF-7 clones vides et clones MAGE-A1 La lignée cellulaire MCF-7 (figure 7) provient de cellules épithéliales d’un cancer

métastasique du sein [Soule et al., 1973]. Le niveau d’expression des ARNm des différents MAGE-A est extrêmement faible dans

cette lignée de cellules. Dès lors, Benjamin Demoulin (laboratoire du Pr. Patrick Dumon, ISV, UCL) a généré des clones stables exprimant MAGE-A1 dans cette lignée cellulaire. Le plasmide V1899-PuroR-MAGEA1 contenant le cDNA de MAGE-A1 et un gène de résistance à la puromycine a été transfecté dans ces cellules MCF-7. Des clones stables, dénommés « clones MAGE-A1 » dans la suite de ce travail, ont été obtenus par pression de sélection via la présence de puromycine dans le milieu de culture.

Des clones contrôles, appelés « clones vides », ont été obtenus de la même manière avec un plasmide identique mais ne contenant pas le cDNA de MAGE-A1.

Figure 7 : Plasmide V1899-PuroR-MAGE-A1, modifié de [Demoulin, 2015]. Le plasmide contient, entre autres, un promoteur constitutif CMV (CMV pr), un triple FLAG pour marquer la protéine MAGE-A1, le cDNA MAGE-A1 et le gène de résistance à la puromycine (PuroR).

25

3.2. Techniques liées à la manipulation de cellules

3.2.1. Passage des cellules MCF-7 et ensemencement de plaques 6 puits et 96 puits

3.2.1.1. Principe Le passage des cellules permet d’entretenir une culture cellulaire en favorisant leur

prolifération. Les cellules doivent être passées tous les trois à quatre jours dans un milieu de culture composé de DMEM additionné de 10% de fœtal bovine serum (FBS), 1% de pénicilline/streptomycine et de 0,5µg/ml de puromycine.

Lorsque les cellules sont proches du stade de confluence (100% de densité cellulaire), elles sont décollées et mises en suspension lors de la trypsinisation. La trypsine est une protéase dont l’action est inhibée par le FBS.

A partir de cette suspension cellulaire, on peut ensemencer une flasque (ici une flasque de 75cm2) pour entretenir la culture ou encore ensemencer des plaques 6 puits ou 96 puits pour de futurs tests.

Pour l’ensemencement des plaques, il est d’abord nécessaire d’effectuer un comptage au bleu de trypan. Le bleu de trypan est un colorant qui colore uniquement les cellules mortes. En effet, le colorant pénètre dans toutes les cellules mais seules les cellules vivantes vont très rapidement le relarguer. Ainsi, les cellules vivantes apparaitront blanches tandis que les cellules mortes apparaitront bleues. Les cellules vivantes sont ensuite comptées sur une cellule de KOVA.

26

3.2.1.2. Matériel Tableau 1 : Produits et matériel pour les techniques liées à la manipulation de cellules

3.2.1.3. Méthode Préalablement chauffer le milieu, la trypsine et le DPBS à 37°C Observer les cellules au microscope inversé et évaluer la densité cellulaire Désinfecter le matériel à l’éthanol 70% et le mettre sous une hotte à flux laminaire (à partir de maintenant travailler sous la hotte) Eliminer le milieu par aspiration Rincer avec 5ml de DPBS puis l’éliminer par aspiration Ajouter 3ml de trypsine et incuber environ 3min à 37°C Retourner sous le flux, ajouter 7ml de milieu et mélanger par aspiration-refoulement Pour ensemencer une nouvelle flasque :

o Prélever la quantité nécessaire de suspension pour réaliser une dilution 1/5 à 1/10 (en fonction de la densité cellulaire évaluée) o Ensemencer la nouvelle flasque et ajuster le volume avec du milieu

Pour ensemencer une plaque 6 puits ou 96 puits : o Compter les cellules :

Dans un Eppendorf, ajouter 40µl de milieu, 40µl de suspension et 80 µl de bleu de trypan Charger sur une cellule de KOVA approximativement 10µl de la suspension de l’Eppendorf Compter les cellules blanches sur 3 grands carrés (chacun composé de 9 petits carrés) et multiplier par 3 (pour obtenir le nombre de cellules dans 9 grands carrés) Calculer la concentration de la suspension cellulaire par la formule :

Concentration Cellules μl = nbre de cell. dans 9 grands carrés ∗ 90 ∗ 4 (fact. de dilu. )81

Produits et matériel Firmes Références Milieu de culture :

- 500ml DMEM - 10% Fœtal Bovine Serum (FBS) - 1% pénicilline/streptomycine - 0,5µg/ml puromycine

Trypsin EDTA (Trypsine) DPBS Trypan Blue Stain (bleu de trypan) Cell Culture Flasks 75cm2 filter screw cap (T75) KOVA Glasstic Slide (cellule de KOVA) 6 Well Cell Culture Plate (plaque 6 puits) 96 Well Cell Culture Plate (plaque 96 puits) Hottes à flux laminaire (vertical) Etuve 37°C sous 5% de CO2 Microscope inversé

LONZA SIGMA LONZA GIBCO LONZA LONZA GIBCO LONZA HYCOR CELLSTAR CELLSTAR

BE12-604F/U1 F7524 DE17-602E A11138-03 BE17-512E BE17-512F 15250-061 BE17-512F 87144 657160 655180

27

o Ensemencer : Par puits de plaque 6 puits : 4000µl de suspension à 25 cellules/µl (100000 cellules/puits) Par puits de plaque 96 puits : 200µl de suspension à 25 cellules/µl (5000 cellules/puits)

Incuber les plaques à 37°C sous CO2 3.2.2. Transfection de siRNA (siMAGEA et si CTRL) dans les cellules ensemencées

sur plaques 6 puits (48h après ensemencement) et sur plaques 96 puits (24h après ensemencement)

3.2.2.1. Principe Les siRNA sont des petits ARN pouvant se lier spécifiquement à une séquence d'ARN

messagers et ainsi empêcher l'expression de gènes en clivant cet ARN. Un siRNA inhibant spécifiquement les ARN messagers MAGE-A (et donc les MAGE-A1) est utilisé dans ce travail. Il est également nécessaire d’opérer une transfection avec un siRNA Negative Control, un siRNA qui ne reconnait aucune séquence du génome d’intérêt et ce, pour vérifier que la transfection d’un siRNA dans la cellule n’a aucun autre effet que celui désiré. Les siRNA sont introduits dans les cellules par lipotransfection : les siRNA sont d’abord inclus dans des liposomes (structures sphériques constituées de lipides) et puis ceux-ci fusionnent avec les cellules. 3.2.2.2. Matériel

Tableau 2 : Produits et matériel supplémentaires pour la transfection de siRNA

1 siRNA anti-MAGE-A (brin sens : 5' A.A.C.C.A.G.C.U.A.U.G.U.G.A.A.A.G.U.C 3'), publications utilisant ce siRNA : [Marcar et al., 2010; Monte et al., 2006].

Produits et matériel Firmes Références siRNA Negative Control (100µM) MAGEA siRNA1 (100µM) Lipofectamine RNAIMAX Optimem

EUROGENTEC DHARMACON INVITROGEN GIPCO

SR-CL000-005 CTM-212454 13778-150 31985-062

28

3.2.2.3. Méthode Sous hotte à flux laminaire : Pour 1 puits de plaque 6 puits : o Préparer les solutions suivantes :

Condition Optimem (µl) siRNA (anti-MAGE-A ou CTRL) (µl) Lipofectamine (µl)

siRNA Negative Control Mélange A 250 1,2 - Mélange B 250 - 5

siRNA anti-MAGE-A Mélange A 250 1,2 - Mélange B 250 - 5

Condition sans siRNA Mélange A 250 - - Mélange B 250 - 5

o Mettre la solution A dans la solution B et incuber 15 min à température ambiante (TA) o Distribuer 500µl de la condition adéquate par puits

Pour 1 puits de plaque 96 puits : o Préparer les solutions suivantes :

o Mettre la solution A dans la solution B et incuber 15 min (TA) o Distribuer 25 µl de la condition adéquate par puits

Condition Optimem (µl) siRNA (anti-MAGE-A ou CTRL) (µl) Lipofectamine (µl)

siRNA Negative Control Mélange A 12,5 0,06 - Mélange B 12,5 - 0,25

siRNA anti-MAGE-A Mélange A 12,5 0,06 - Mélange B 12,5 - 0,25

Condition sans siRNA Mélange A 12,5 - - Mélange B 12,5 - 0,25

29

3.2.3. Traitement des cellules à la doxorubicine et aux molécules du NAMEDIC (48h après ensemencement)

3.2.3.1. Principe Dans la première partie de ce travail, les cellules sont traitées, ou non, à la doxorubicine

pour mettre en évidence l’effet de mort cellulaire induite par celle-ci et la résistance des clones MAGE-A1 à cet agent chimiothérapeutique.

Dans la seconde partie, il sera ajouté, en même temps que la doxorubicine, 50µM des molécules du NAMEDIC dans le but de trouver un potentiel inhibiteur de la résistance des clones MAGE-A1. De plus, dans cette deuxième partie, les cellules non-traitées par la sélection de molécules seront quand même traitées par 0,5% de DMSO pour tenir compte de l’effet du DMSO contenu dans les solutions de molécules. 3.2.3.2. Matériel

Tableau 3 : Produits et matériel supplémentaires pour le traitement des cellules à la doxorubicine est aux molécules du laboratoire NAMEDIC

3.2.3.3. Méthode Culture des clones MCF-7 à une densité de 5000 cellules/puits Sous hotte à flux laminaire : Traiter les cellules par les composés (dilués dans du milieu de culture) aux concentrations

suivantes : o Doxorubicine : les cellules sont traitées par une gamme de concentration : 0nM,

10nM, 50nM, 100nM, 250nM, 500nM (seules les concentrations 0nM et 250nM ont été retenues pour les cellules transfectées aux siRNA et pour le criblage de la banque)

o Molécules du NAMEDIC : chaque molécule est testée sur les cellules à 0µM (0,5% de DMSO) et 50µM

Les cellules sont traitées 72h à 37°C sous CO2

Produits et matériel Firmes Références Doxorubicin hydorchloride resuspendue dans du DMSO (doxorubicine) (10mM) DMSO Hybri-Max 24 molécules du NAMEDIC sélectionnées par le laboratoire CBS (numérotées de 1 à 24) (10mM)

SIGMA-ALDRICH SIGMA D1515-10MG D2650 CONFIDENTIELLES

30

3.2.4. Test de croissance cellulaire MTS (120h après ensemencement) 3.2.4.1. Principe

Le test de croissance cellulaire MTS est un test colorimétrique permettant de déterminer la prolifération cellulaire. Il se base sur le métabolisme des mitochondries qui transforment le MTS en formazan de coloration pourpre (dont l’absorbance est lue à 490nm) grâce aux déshydrogénases mitochondriales. L’absorbance est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. 3.2.4.2. Matériel

Tableau 4 : Produits et matériel supplémentaires pour le test MTS

3.2.4.3. Méthode Ensemencer des cellules en plaque 96 puits Transfecter éventuellement aux siRNA et traiter à la doxorubicine Sous hotte à flux laminaire et à l’abri de la lumière : Remplacer le milieu par 100µl de milieu de culture Mélanger 20µl de MTS avec 1µl de PMS (kit CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell -

Proliferation Assay) Ajouter 20µl du mix dans chaque puits Incuber à 37°C à l’abri de la lumière pendant 2 ou 3h Lire l’absorbance à 490nm au SpectraMax (bien agiter avant lecture)

Produits et matériel Firmes Références CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) SpectraMax i3

PROMEGA MOLECULAR DEVICES G5421

31

3.3. Western blot et techniques associées

3.3.1. Récolte des protéines pour le western blot 3.3.1.1. Principe

Pour réaliser un western blot, il est d’abord nécessaire de récolter les protéines à partir des cellules ensemencées 120h plus tôt (2 puits de plaque 6 puits par condition). 3.3.1.2. Matériel

Tableau 5 : Produits et matériel supplémentaires pour la récolte de protéines

3.3.1.3. Méthode Sur glace : Eliminer le milieu Décoller les cellules au cell scraper dans du DPBS Centrifuger 5 min à 1250 rpm et éliminer le surnageant Resuspendre le culot dans 50µl de tampon de lyse + inhibiteur de protéases Incuber 10min sur glace Transvaser le falcon dans un eppendorf Soniquer 3 fois 30 secondes dans un bain à ultrasons en donnant entre chaque fois un

coup de vortex Centrifuger à froid (4°C) 10 min à 15300rpm Récupérer le surnageant (solution de protéines) dans un nouvel eppendorf

Produits et matériel Firmes Références Tampon de lyse avec inhibiteur de protéases

- 5µl Halt Protease Inhibitor - 495µl tampon de lyse 1% NP40

. 50mM tris pH8

. 5mM EDTA

. 150mM EDTA

. 150mM NaCl

. 1% Nonidet P40 Cell Scraper S Bain à ultrasons Centrifugeuse à froid

THERMO SCIENTIFIC TPP SIGMA

1862209 99002 2K15

32

3.3.2. Dosage de la solution de protéines 3.3.2.1. Principe

Pour réaliser un western blot, il est important de déposer dans chaque puits la même quantité de protéines. Il est donc nécessaire de doser au préalable la solution de protéines récoltées.

Le dosage est ici fait par la méthode BCA (acide bicinchoninique) : les protéines réduisent les ions cuivriques en milieu alcalin qui réagissent dès lors avec l'acide bicinchoninique pour produire un complexe coloré (absorption maximale à 562nm). L’absorbance est proportionnelle à la concentration en protéines. Une droite d’étalonnage est réalisée à l’aide de BSA (albumine de sérum bovin) titrée. 3.3.2.2. Matériel

Tableau 6 : Produits et matériel supplémentaires pour le dosage de la solution de protéines

3.3.2.3. Méthode Procéder à des dilutions étalons en série de la BSA : 1000µg/ml, 500µg/ml, 250µg/ml,

125µg/ml, 62,5µg/ml, 0µg/ml dans l’H2O mQ Diluer 10 fois les solutions de protéines récoltées (échantillons) dans de l’H2O mQ Déposer sur la plaque 96 puits 25µl de chaque étalon et échantillon en duplicats Mélanger la solution A et B du kit Pierce BCA Protein Assay avec un rapport de 50/1 Ajouter 160µl du mélange par puits Incuber 30 minutes à 37°C Mesurer l’absorbance au SpectraMax à 562nm Calculer les concentrations des échantillons sur base de l’équation de la courbe

d’étalonnage.

Produits et matériel Firmes Références Pierce BCA Protein Assay Kit BSA Albumin Standard 1mg/ml H2O mQ

THERMO SCIENTIFIC THERMO SCIENTIFIC 23225 23209

33

3.3.3. Western blot 3.3.3.1. Principe

Le western blot est une technique permettant de détecter spécifiquement une ou plusieurs protéines. Cette méthode est divisée en trois étapes : la migration et la séparation des différentes protéines en solution par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, le transfert des protéines du gel vers une membrane et la détection de la protéine recherchée sur la membrane par un anticorps primaire spécifique à celle-ci et un anticorps secondaire marqué par une enzyme chimiluminescente (révélée sur un film photo). 3.3.3.2. Matériel

Tableau 7 : Produits et matériel supplémentaires pour le western blot Produits et matériel Firmes Références Pour 2 gels de concentration 1,5mm (6ml) :

- 4,1ml H2O - 1ml 30% Acrilamide/Bis Solution - 0,75ml 1,0M tris (pH6,8) - 60µl 10% SDS - 60µl APS - 6µl Temed

Pour 2 gels de migration 10% 1,5mm (20ml) : - 7,9ml H2O - 6,7ml 30% Acrilamide/Bis Solution - 5ml 1,0M tris (pH8,8) - 200µl 10% SDS - 200µl APS - 8µl Temed

Tampon de migration : - 1L H2O - 3g tris base - 14,4g Glycine - 1g SDS

Tampon de transfert : - 1L H2O - 3,03 tris base - 14,4g glycine - 200ml éthanol

Bleu 5x SDS Sample buffer - 2,5ml Tris pH 6,8 - 1,54g DTT - 50mg BPB - 1g SDS - 5ml glycérol

Ethanol Foam Topping (Lait) PBS :

- 1L H2O - 8g NaCl - 2,68g Na2HPO4.7H2O - 0,24g KH2PO4 - 2g KCl

BIORAD ROTH BIORAD ROTH NESTLE

23673 1610158 23673 1610158 12099001

34

3.3.3.3. Méthode Dans un eppendorf ajouter : 15µg de protéines, 5µl de bleu et ajuster à 25µl avec de

l’H2O mQ puis chauffer à 95°C pendant 5 minutes. Préparer le gel de séparation 10% et le gel de concentration Monter le gel dans la cuve puis la remplir avec le tampon de migration Déposer les échantillons et le ladder Faire migrer à 120V environ 1h30 Equilibrer le gel dans le tampon de transfert Mouiller la membrane dans l’éthanol puis l’équilibrer dans le tampon de transfert Disposer les différents éléments de la manière suivante :

Dans la cuve de transfert, déposer le dispositif et le tampon de migration Transférer dans la glace 1h30 à 100V Bloquer la membrane dans du PBS + 0,5% de lait pendant 30min sous agitation Incuber la membrane dans la solution d’anticorps primaire (MAGEA) à 4°C pendant toute

la nuit sous agitation Laver 3 fois 10min au PBS + 0,05% tween sous agitation (TA) Incuber la membrane dans la solution d’anticorps secondaire (anti-mouse) pendant 1h

sous agitation

PBS + 0,05% Tween80 (PBS-Tween) Anticorps MAGEA 1/500 dans du PBS-Tween-5% lait Anticorps GADH 1/20000 dans du PBS-Tween-5% lait Anticorps anti-mouse marqué à la peroxydase de Raifort 1/2000 dans du PBS-Tween-5% lait Marqueur de poids moléculaire Western Lightning Plus Matériel de western blot PVDF Blotting Membrane Papier Whatman Cl-XPosure Film (film photo) Machine de développement

INVITROGEN SIGMA DAKO THERMO SCIENTIFIC PERKINELMER BIORAD GE HEALTHCARE LIFE SC. GE HEALTHCARE LIFE SC THERMO SCIENTIFIC FUJIFILM

35-6300 G8795 P0447 26612 NEL104001EA 10600021 3030-931 56218 FPM-100A

----------------- grille blanche ----------------- éponge passée dans le tampon de transfert ----------------- papiers Whatman (3) passés dans le tampon de transfert ----------------- membrane ----------------- gel ----------------- papiers Whatman (3) passés dans le tampon de transfert ----------------- éponge passée dans le tampon de transfert ----------------- grille noire

35

Laver 3 fois 10min au PBS + 0,05% tween sous agitation (TA) Révéler à l’aide du kit Western Lightning Plus 3.3.4. Contrôle de charge 3.3.4.1. Principe

Un contrôle de charge permet de s’assurer que la même quantité de protéines a été déposée dans chaque puits et que le transfert a été réalisé uniformément. Pour cela, on va réaliser une deuxième détection en utilisant ici un anticorps primaire qui détecte une protéine synthétisée uniformément dans toutes les cellules : la GAPDH. 3.3.4.2. Méthode Bloquer la membrane dans du PBS + 5% de lait pendant 5min sous agitation Bloquer la membrane dans la solution d’anticorps primaires (GAPDH) pendant 1h sous

agitation (TA) Incuber la membrane dans la solution d’anticorps secondaires (anti-mouse) pendant 1h

sous agitation(TA) Reprendre ensuite à la 5ème étape du 3.5.2.

3.4. Traitement des données

3.4.1. Calcul de la viabilité face à une molécule du NAMEDIC 3.4.1.1. Principe

Bien que les molécules sélectionnées par le laboratoire CBS ne soient pas toxiques sur la lignée cellulaire HepG2 (toxicité testée par un membre du laboratoire CBS sur cette lignée), il faut vérifier, avant toute chose, qu’elles ne sont pas toxiques pour les MCF-7 clones MAGE-A1 et clones vides. Pour cela, des cellules MCF-7 clones vides et clones MAGE-A1 sont traitées, ou non, par ces molécules. Un test MTS est ensuite réalisé sur celles-ci et leur viabilité face aux molécules est calculée (voir 4.1.2.). Les molécules induisant une viabilité de moins de 85% (jugées toxiques pour les cellules MCF-7) sont ensuite écartées du test.

36

3.4.1.2. Méthode

Figure 8 : Calcul de la viabilité face à une molécule X. Après réalisation du test MTS (quatre réplicats par condition) la moyenne (Moy.) des absorbances (Abs.) est calculée. La viabilité face à la molécule est ensuite calculée en imposant la condition « Non-traitée par la molécule » comme valant 100% de viabilité (a). Ces viabilités sont ensuite reportées sur un graphique avec des barres d’erreurs représentant les écarts-types (b).

(a)

(b)

100,0 100,0105,8 105,0

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

vide MAGE-A1

Viabili

té (%)

Non traité par la molécule X Traité par la molécule X

Viabilité face à la molécule X

37

3.4.2. Calcul de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGEA1 et calcul de l’inhibition de cette résistance par une du NAMEDIC

3.4.2.1. Principe Dans la suite de ce TFE, la résistance des clones MAGE-A1 à la doxorubicine sera mise en

évidence par traitements des clones vides et MAGE-A1 par cet agent chimiothérapeutique et par tests MTS. Une inhibition de cette résistance sera ensuite recherchée par traitement de ces cellules par des molécules du NAMEDIC. Pour cela, il faut tout d’abord définir les termes suivants : viabilité suite au traitement à la doxorubicine, résistance à la doxorubicine et pourcentage d’inhibition de la résistance à la doxorubicine (figure 9). 3.4.2.2. Méthode

Figure 9 : Calcul de la viabilité face à la doxorubicine, de la résistance à la doxorubicine et de l’inhibition de la résistance à la doxorubicine par une molécule X. Après réalisation du test MTS (quatre réplicats par condition) la moyenne (Moy.) des absorbances (Abs.) est calculée. La viabilité suite au traitement à la doxorubicine est ensuite calculée en imposant la condition « Non-traitée par la doxorubicine » comme valant 100% de viabilité. La résistance à la doxorubicine est ensuite calculée (pourcentage de viabilité en plus du clone MAGE-A1 par rapport au clone vide après traitement à la doxorubicine) en soustrayant la viabilité du clone vide à celle du clone MAGE-A1. Pour finir, le pourcentage d’inhibition de la résistance à la doxorubicine (pourcentage d’inhibition, induite par la molécule X, de la résistance du clone MAGE-A1 à la doxorubicine) en faisant la différence entre la résistance du clone MAGE-A1 traité par la molécule X et celle du clone MAGE-A1 non-traité par la molécule X et en faisant un pourcentage de cette différence par rapport à la résistance du clone MAGE-A1 non-traité.

38

3.5. Statistiques Le logiciel d’analyses statistiques utilisé est « Prism 5 » version 5.04.

3.5.1. Test ANOVA à deux facteurs Le Test ANOVA (analysis of variance) à deux facteurs est un test statistique permettant

de dire si des facteurs (par exemple ici la concentration en doxorubicine et si le clone est vide ou MAGE-A1) ont une influence sur un résultat (par exemple ici la viabilité) et à quel point cette influence est importante. Le résultat du test est donné sous la forme de deux p-valeurs (une pour chaque facteur) qui correspond à la probabilité que l’expérience donne de tels résultats si le facteur n’avait aucune influence sur le résultat. En d’autres termes, une p-valeur très faible indique que le facteur a une grande influence sur le résultat.

Sur le graphique, peuvent être inscrites des astérisques qui correspondent à la p-valeur : NS (non significatif) si p-valeur 0,05, * si 0,01 ˂ p-valeur ≤ 0,05, ** si 0,001 ˂ p-valeur ≤ 0,01, *** si 0,0001 ˂ p-valeur ≤ 0,001 et **** si p-valeur ≤ 0,0001.

40

Résultats et discussion

4.1. Mise au point du test

4.1.1. Sélection d’un clone MAGE-A1 Deux clones stables de cellules tumorales mammaires MCF-7 exprimant MAGE-A1,

obtenus après transfection du plasmide V1899-PuroR-MAGEA1 (figure 6), ont été fournis par Pr. Patrick Dumont, ISV, UCL (clones MAGE-A1). Deux clones stables MCF-7 possédant le même plasmide, sans le cDNA de MAGE-A1, ont également été mis à disposition (clones vides). Ils serviront de contrôles.

L’expression de MAGE-A1 dans les quatre clones MCF-7 décrits ci-dessus a été analysée par western blot afin de sélectionner, pour la suite des manipulations, un clone exprimant cette protéine (clone MAGE-A1) et un clone ne l’exprimant pas (clone vide) (figure 10).

Figure 10 : Analyse par western blot de l’expression de MAGE-A1 dans deux clones stables MCF-7 exprimant (clone MAGE-A1) ou non (clone vide) MAGE-A1. La protéine MAGE-A1 a été détectée par un anticorps anti-MAGE-A. Un contrôle de charge a également été réalisé à l’aide d’un anticorps anti-GAPDH. Comme attendu, l’analyse par western blot révèle que les clones vides A et B n’expriment

pas la protéine MAGE-A1. Il est également observable que le clone MAGE-A1 A exprime beaucoup plus cette protéine que le clone MAGE-A1 B.

Pour la suite des manipulations, les clones MAGE-A1 A (appelés maintenant clone MAGE-A1) et le clone vide A (appelé maintenant clone vide) ont donc été sélectionnés.

41

4.1.2. Reproduction de l’expérience de Benjamin Demoulin et sélection d’une concentration en doxorubicine et d’un temps d’incubation du MTS

Benjamin Demoulin, du laboratoire de P. Dumont (ISV, UCL), a démontré dans sa thèse publiée en 2015 que l’expression de MAGE-A1 conférait une résistance à l’agent chimiothérapeutique doxorubicine dans les cellules MCF-7 (figure 6). Ce résultat a été obtenu à partir d’un test de viabilité MTT [Demoulin, 2015].

Dans le but de trouver un inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par MAGE-A1, cette expérience a été reproduite au laboratoire. Le clone vide et le clone MAGE-A1 ont été traités à des concentrations de 0, 10, 50, 100, 250, 500nM de doxorubicine. Cette gamme de concentrations se base sur celle utilisée par B. Demoulin.

Après 72h de traitement, les cellules ont été incubées avec une solution MTS pendant 2h ou 3h. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage de viabilité cellulaire, la viabilité dans les puits non-traités (0nM de doxorubicine) correspondant à 100%. Chaque point correspond à la moyenne des mesures de trois tests indépendants (figure 11). Un test statistique ANOVA à deux facteurs a été réalisé pour les deux temps d’incubation.

(a) (b) 2h d'incubation

Concentration en doxorubicine (nM)

Viabili

té cellu

laire (%

)

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000102030405060708090

100110120

VIDEMAGE-A1

3h d'incubation

Concentration en doxorubicine (nM)

Viabili

té cellu

laire (%

)

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000102030405060708090

100110120

VIDEMAGE-A1

Figure 11 : Mise en évidence de la résistance à la doxorubicine du clone MCF-7 MAGE-A1, reproduction de l’expérience de Benjamin Demoulin. Des cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1 (MAGE-A1) ou non (VIDE) ont été traitées avec différentes concentrations de doxorubicine (0nM, 10nM, 50nM, 100nM, 250nM, 500nM). Leurs viabilités ont été ensuite mesurées par un test MTS. Les résultats sont exprimés en pourcents en établissant que la viabilité de la condition 0nM vaut 100%. L’absorbance à 490 nm a été mesurée après 2h (a) et 3h (b) d’incubation de la solution MTS. Trois tests indépendants ont été réalisés et l’erreur standard a été représentée (barres d’erreurs) pour chaque point.

42

Le traitement à la doxorubicine induit une diminution statistiquement significative de la viabilité cellulaire pour les deux clones (p-valeur<0,0001). Cependant, cette diminution est plus marquée pour le clone vide (p-valeur<0,0001). Tout comme dans l’expérience de B. Demoulin, la résistance à la doxorubicine du clone MAGE-A1 a donc pu être démontrée.

La courbe obtenue ne correspond pas exactement à celle de B. Demoulin (figure 6). En effet, dans ses résultats, la viabilité des cellules diminue plus rapidement que sur celle obtenue à la figure 11 lorsque la concentration en doxorubicine est augmentée. Ceci peut être expliqué par le fait que B. Demoulin utilise trois clones différents. De plus, dans ce travail, le test MTS est préféré au test MTT qu’il réalise. Il faut également noter que la culture cellulaire est une technique très sensible et que des différences de résultats peuvent survenir suite à des variations, même infimes, dans les manipulations (différences de comptages, d’ensemencements, …).

Pour le criblage de la banque de molécules du NAMEDIC, un seul temps d’incubation et une seule concentration en doxorubicine ont été sélectionnés. La concentration à 250nM a été choisie car c’est à cette concentration que la différence de viabilité cellulaire entre le clone vide et le clone MAGE-A1 est la plus importante. Le temps d’incubation de 3h a été sélectionné car c’est à ce temps-là que l’erreur standard est la plus petite. 4.1.3. Confirmation de l’implication de MAGE-A1 dans la résistance à la

doxorubicine Avant le criblage de la banque de molécules, il faut confirmer que la résistance à la

doxorubicine observée dans le clone MAGE-A1 est bien due à la protéine MAGE-A1. Pour ce faire, les clones MAGE-A1 ont été traités avec un siRNA (small interfering RNA) spécifique aux ARNm des MAGE-A puis la résistance à la doxorubicine a été mesurée. 4.1.3.1. Vérification de l’efficacité du siRNA

Avant de réaliser le test de viabilité cellulaire, l’efficacité du siRNA anti-MAGE-A a été analysée par western blot.

43

Pour cela, le clone vide et le clone MAGE-A1 ont été non-transfectés, transfectés avec un siRNA Negative Control (siCTRL) qui ne reconnait aucune séquence du génome d’intérêt ou transfectés avec un siRNA anti-MAGE-A.

Après 72h de culture, l’expression de MAGE-A1 a été analysée par western blot (figure 12).

Comme attendu, le clone vide n’exprime pas de protéine MAGE-A1. Par contre, celle-ci est exprimée par le clone MAGE-A1 non-transfecté ou transfecté avec le siRNA Negative Control. Le clone MAGE-A1 transfecté avec un siRNA anti-MAGE-A n’exprime, quant à lui, que très peu cette protéine.

Comme dans les publications de L. Marcar et M. Monte [Marcar et al., 2010; Monte et al., 2006] pour d’autres lignées cellulaires, la transfection avec le siRNA anti-MAGE-A induit bien une diminution importante de l’expression de la protéine MAGE-A1. Ce siRNA a donc pu être utilisé pour la suite des manipulations. 4.1.3.2. Test de viabilité des cellules transfectées par le siRNA anti-MAGE-A et traitées

à la doxorubicine Une fois l’effet du siRNA anti-MAGE-A confirmé, le clone vide et le clone MAGE-A1 ont

été transfectés avec celui-ci ou avec le siRNA Negative Control. Vingt-quatre heures plus tard, ces cellules ont été traitées avec 250nM de doxorubicine.

Après 72h de traitement, un test de viabilité MTS (3h d’incubation) a permis d’étudier la viabilité de ces cellules. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage de viabilité, la viabilité dans les puits non-traités (0nM de doxorubicine) correspondant à 100%.

Figure 12 : Analyse par western blot de l’expression des protéines récoltées à partir de cultures du clone MCF-7 vide et du clone MCF-7 MAGE-A1 non transfectés (NT), transfectés avec un siRNA contrôle (siCTRL) et transfectés avec un siRNA anti-MAGE-A (siMAGE-A). La protéine MAGE-A1 a été détectée par un anticorps anti-MAGE-A. Un contrôle de charge a également été réalisé à l’aide d’un anticorps anti-GAPDH.

44

Chaque barre correspond à la moyenne des mesures de trois tests indépendants (figure 13).

Figure 13 : Perte de la résistance à la doxorubicine des clones MAGE-A1 après transfection des cellules MCF-7 avec un siRNA anti-MAGE-A. Le clone vide et le clone MAGE-A1 ont été transfectés avec un siRNA anti-MAGE-A et un siRNA contrôle. Ceux-ci sont traités avec 0nM et 250nM de doxorubicine. Après 72h de traitement, la viabilité cellulaire a été mesurée par un test MTS. La viabilité des cellules traitées avec 250nM de doxorubicine est exprimée en pourcents en établissant que la viabilité de la condition 0nM vaut 100%. Trois tests indépendants ont été réalisés et les erreurs standards ont été représentées (barres d’erreurs). Les résultats ont été analysés avec un test ANOVA à deux facteurs. La présence de MAGE-A1 confère une résistance statistiquement très significative au traitement à la doxorubicine (**, p-valeur=0,0061). En présence du siRNA anti-MAGE-A cette résistance est perdue significativement (*, p-valeur=0,0401). La viabilité cellulaire du clone MAGE-A1 transfecté avec le siRNA Negative Control est,

comme précédemment, plus élevée que la viabilité du clone vide après 72h de traitement à la doxorubicine. L’expression de MAGE-A1 confère donc ici aussi une résistance à cette drogue.

Par contre, cet effet n’est plus observé en présence du siRNA anti-MAGE-A, prouvant l’implication de MAGE-A1 dans la résistance à la doxorubicine observée dans les cellules MCF-7.

45

Le test de croissance cellulaire permettant le criblage de molécules en vue de trouver un inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGE-A1 aux cellules MCF-7 est donc bien mis au point.

4.2. Criblage de molécules

Vingt-quatre molécules ont été sélectionnées par le laboratoire CBS (UNamur) au sein des composés de la chimiothèque NAMEDIC afin de trouver un éventuel inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par MAGE-A1 dans les cellules MCF-7. 4.2.1. Test de non-toxicité sur les cellules MCF-7 clone vide et clone MAGE-A1

Bien que les vingt-quatre molécules ne soient pas toxiques sur la lignée cellulaire HepG2 (hépatocarcinome humain), il est important de confirmer, avant toute chose, qu’elles ne le sont pas non plus pour les cellules MCF-7 clone vide et clone MAGE-A1.

Pour ce faire, le clone vide et le clone MAGE-A1 ont été traités ou non avec 50µM de chaque molécule à tester. Les cellules non traitées sont, quant à elles, exposées à 0,5% de DMSO (solvant de dilution des molécules).

Après 72h d’incubation, un test de viabilité MTS (3h d’incubation) a permis de juger de la viabilité de ces cellules. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage de viabilité cellulaire. La viabilité dans les puits non-traités correspondant à 100%. Chaque barre correspond à la mesure d’un test effectué en quatre réplicats techniques (non-indépendants) par test (figure 14).

46

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)

100,0 100,0105,8 105,0

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabilité

cellula

ire (%)

0µM molécule 1 50µM molécule 1

Viabilité suite à un traitement à la molécule 1

100,0 100,0108,3 107,9

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0105,9 105,4

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,065,2

84,2

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0101,6 106,6

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0127,5 127,1

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0116,3 119,8

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0120,7 111,8

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



Molécule 1 Molécule 2




47

(i) (j)

(k) (l)

(m) (n)

(o) (p)

100,0 100,0112,1 98,1

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0107,2 95,2

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0112,0 121,9

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0107,9 116,1

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,059,0

80,8

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0103,6 118,0

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0112,9 121,6

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

té cellu

laire (%

)



100,0 100,0109,2 120,4

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)







48

(q) (r)

(s) (t)

(u) (v)

(w) (x)

100,0 100,0107,9 117,0

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,099,9 104,4

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0104,7 110,7

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0101,7 111,7

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0120,2 126,4

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,0102,5 99,3

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,099,3 87,5

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)



100,0 100,099,3 97,0

0,020,040,060,080,0

100,0120,0140,0

vide MAGE-A1

Viabili

técellu

laire (

%)







49

Le traitement avec la molécule 4 (d) et la molécule 13 (m) induit une diminution de la viabilité cellulaire de plus de 15%. Ces deux molécules présentent donc une certaine toxicité pour les cellules MCF-7 clone vide et clone MAGE-A1. Dès lors, elles ont été écartées pour la suite des tests.

Les vingt-deux autres molécules ne sont pas ou peu toxiques pour les deux clones. Elles peuvent donc être testées en vue de trouver un potentiel inhibiteur de la résistance à la doxorubicine induite par MAGE-A1. 4.2.2. Evaluation de l’inhibition, par les molécules du NAMEDIC, de la résistance

à la doxorubicine conférée par MAGE-A1 Afin de détecter une éventuelle inhibition de la résistance à la doxorubicine, le clone vide

et le clone MAGE-A1, traités ou non avec 250nM de doxorubicine, ont été exposés ou non à une des vingt-deux molécules (50 µM).

Après 72h de traitement, un test de viabilité MTS (3h d’incubation) a permis d’évaluer la viabilité de ces cellules. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentages d’inhibition de la résistance à la doxorubicine (méthode de calcul détaillée au point 3.4.2.2.) et classés par ordre décroissant. Chaque pourcentage correspond à la mesure d’un test (quatre réplicats techniques par test) (tableau 8).

Figure 14 : Test de la toxicité des molécules sélectionnées sur les cellules MCF-7 clone vide et clone MAGE-A1. Le clone vide et le clone MAGE-A1 sont traités avec 0µM (+0,5% DMSO) et 50µM de la molécule testée. Après 72h d’incubation, laviabilité cellulaire a été mesurée par un test MTS. Les viabilités cellulaires sont exprimées en pourcents en établissant que la viabilité de la condition 0µM vaut 100%. Les tests ont été réalisés en trois réplicats techniques et les erreurs standards ont été représentées (barres d’erreurs).

50

Tableau 8 : Pourcentages d’inhibition de la résistance à la doxorubicine par les molécules sélectionnées

Les cinq molécules ayant donné le plus grand pourcentage d’inhibition de la résistance à la doxorubicine ont été retestées en suivant le même protocole afin d’obtenir trois réplicats indépendants (figure 15).

Molécule testée (50 µM) Pourcentage d’inhibition de la résistance à la doxorubicine

Molécule testée (50 µM) Pourcentage d’inhibition de la résistance à la doxorubicine

molécule 16 93,1% molécule 15 34,8% molécule 14 88,1% molécule 12 34,3% molécule 18 75,1% molécule 10 30,0% molécule 6 64,9% molécule 2 15,1% molécule 1 62,5% molécule 7 13,1% molécule 17 55,6% molécule 22 11,2% molécule 11 50,1% molécule 21 6,1% molécule 20 47,3% molécule 24 -3,0% molécule 5 46,3% molécule 9 -6,5% molécule 19 40,9% molécule 23 -12,1% molécule 8 37,9% molécule 3 -29,7%

a)

Molécule 16

1er pourcentage d’inhibition (tableau 8) : 93,1%

51

b)

c)

d)

Molécule 14

Molécule 18





52

La résistance du clone MAGE-A1 traité à la doxorubicine est toujours significative. Cependant, les cinq molécules testées n’ont aucun effet significatif sur celle-ci.

Aucun inhibiteur de la résistance à la doxorubicine conférée par la protéine MAGEA1 aux cellules MCF-7 n’a donc été trouvé parmi les vingt-quatre molécules sélectionnées pour ce travail.

e)

Figure 15 : Mesure des viabilités du clone MCF-7 vide et du clone MCF-7 MAGE-A1 après 72h de traitement à la doxorubicine en présence ou non d’une des cinq molécules sélectionnées. Le clone MCF-7 vide et MAGE-A1 ont été traités ou non avec 250nM de doxorubicine. Simultanément, ces clones, traités ou non à la doxorubicine, sont exposés ou non à une des cinq molécules sélectionnées. Après 72h, leurs viabilités ont été mesurées par un test MTS. Les viabilités cellulaires sont exprimées en pourcents en établissant que la viabilité de la condition non traitée à la doxorubicine vaut 100%. Les graphes représentent les moyennes de trois tests indépendants et les barres d’erreur représentent les erreurs standards. L’analyse statistique ANOVA à deux facteurs démontre que la résistance à la doxorubicine du clone MAGE-A1 est significative (*), très significative (**) ou extrêmement significative (***). Cependant, la différence de viabilité cellulaire suite au traitement par les cinq molécules sélectionnées est non significative (NS).

Molécule 1


54

Conclusion et perspectives Afin de mettre au point un test mettant en évidence la résistance à la doxorubicine des

cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1, un clone exprimant MAGE-A1 (clone MAGE-A1) et un clone ne l’exprimant pas (clone vide) ont été sélectionnés par western blot.

Ensuite, via un test de viabilité MTS, la résistance du clone MAGE-A1 à la doxorubicine a pu être mise en évidence au sein du laboratoire. Il a également été démontré que, dans ce cas-ci, les meilleures conditions pour observer cette résistance étaient un traitement avec 250nM de doxorubicine et 3h d’incubation de la solution MTS.

Pour clôturer la mise au point du test, l’implication de la protéine MAGE-A1 dans la résistance à la doxorubicine a été confirmée. En effet, une fois son expression diminuée par un siRNA, la résistance n’était plus observée.

Sur les vingt-quatre molécules sélectionnées pour cette étude, vingt-deux ne présentaient pas de toxicité pour les cellules MCF-7. Ces vingt-deux molécules ont dès lors pu être ajoutées en même temps que le traitement à la doxorubicine dans le but de trouver un inhibiteur de la résistance à la doxorubicine du clone MAGE-A1. Parmi celles-ci, les cinq molécules présentant le plus grand effet d’inhibition ont été testées en trois réplicats indépendants mais aucune n’a eu un effet significatif. Aucun inhibiteur de la résistance à la doxorubicine des cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1 n’a donc été trouvé parmi les vingt-quatre molécules sélectionnées dans les conditions expérimentales choisies.

Dans le futur, le test pourra être modifié en changeant, par exemple, le temps du traitement des cellules à la doxorubicine, en ajoutant les molécules avant la doxorubicine (pré-sensibilisation des cellules), en testant une autre concentration de ces potentiels inhibiteurs ou encore en choisissant un autre test de viabilité cellulaire (comme par exemple le dosage de l’ATP).

Il pourra aussi être envisagé de faire le test sur plusieurs clones de cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1 pour éliminer des éventuelles erreurs dues au choix d’un seul clone. Il

55

est également important de noter que le cDNA de MAGE-A1 qui a été transfecté dans les cellules est marqué d’un triple FLAG. Bien que cette séquence d’acides aminés ajoutés à MAGE-A1 soit sensée ne pas modifier les effets de cette protéine, il sera peut-être judicieux de travailler avec des clones exprimant MAGE-A1 sans triple FLAG pour se rapprocher au plus près de la réalité in vivo.

Exceptées les cinq molécules sélectionnées au final, les autres molécules n’ont été testées qu’une seule fois, ce qui ne permet pas d’affirmer statistiquement qu’elles n’ont aucun effet. Si le temps le permet, il sera peut-être judicieux d’effectuer ces tests supplémentaires pour être certain de ne pas passer à côté d’un inhibiteur effectif.

Enfin, le test étant maintenant au point, d’autres banques de molécules pourront être criblées afin d’augmenter les chances d’en trouver une inhibant la résistance à la doxorubicine engendrée par la protéine MAGE-A1.

56

Table des abréviations

°C degré Celsius h heure µg/ml microgramme par millilitre H2O mQ eau milli-Q µl microlitre HDAC histone désacétylase µM micromolaire MAGE protéine du melanoma antigen ADN acide désoxyribonucléique MAGE-A1 protéine MAGE de type A1 AMPK AMP-activated protein Kinase MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 ANOVA analys of variance MDM2 murine double minute 2 APS ammonium persulfate MHD MAGE homology domain ARN acide ribonucléique min minute ARNm ARN messager ml millilitre ATP adénosine triphosphate MTS sel de tétrazolium MTS BCA acide bicinchoninique MTT sel de tétrazolium MTT Bcl-2 B-cell lymphoma 2 NK natural killers BSA bovin serum albumin nM nanomolaire Caspase cysteine-aspartic

protease nm nanomètre PBS phosphate buffered saline

CD-95 cluster of differentiation 95 puroR gène de résistance à la puromycine cDNA complementary DNA rpm revolution per minute cm² centimètre carré SDS dodécylsulfate de sodium CMVpr promoters for cytomegalovirus siCTRL siRNA negative control CTA cancer-testis antigens siMAGEA siRNA inhibiteur de MAGE-A CTRL contrôle siRNA small interfering RNA DMEM Dulbecco's Modified Eagle

Medium TA température ambiante

DMSO diméthylsulfoxyde Temed tetramethylethylenediamine DPBS Dulbecco's Phosphate-

Buffered Saline TNF tumor necrosis factor

DTT dithiothréitol Tris trishydroxyméthylaminométhane fact. de dilu. facteur de dilution V volt FBS fœtal bovine serum Protéine en

italique gène codant pour cette protéine

GAPDH glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

58

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Dans de nombreux cancers, une expression anormale d’une famille de protéine appelée MAGE (melanoma antigen) de type I peut être provoquée par la déméthylation de son gène. Des études suggèrent que les protéines MAGE de type I sont à l’origine d’un blocage de l’apoptose et donc d’une résistance à la chimiothérapie par une inhibition de p53 et de l’AMP-activated protein kinase (AMPK). Ce travail se focalise sur une seule protéine faisant partie de la famille des MAGE de type I : MAGE-A1. Cette protéine est ici étudiée dans le cadre de la résistance à l’agent chimiothérapeutique doxorubicine qu’elle confère aux cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1. Vingt-quatre molécules ont été sélectionnées au sein de la chimiothèque NAMEDIC (UNamur) dans le but d’être testées et ce, afin de trouver un éventuel inhibiteur de cette résistance. Pour ce faire, un test de viabilité cellulaire a été mis au point pour permettre la détection de la résistance à la doxorubicine des cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1. Ensuite, chacune des vingt-quatre molécules a été ajoutée aux cultures de ces cellules simultanément au traitement à la doxorubicine. La résistance à cet agent chimiothérapeutique a ensuite été mesurée. Aucune inhibition de la résistance à la doxorubicine des cellules MCF-7 exprimant MAGE-A1 n’a été induite par une des molécules étudiées mais le test est au point et pourra servir au criblage d’autres composés.