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Travaux pratiques de biochimie (30h)
Année 2015-2016
Enseignant : Guillaume Caulier (Prof. Ruddy Wattiez)Fonction : Assistant en biologieContact : [email protected]
Biochimie
Introduction : les travaux pratiques de biochimie ont pour but d’illustrer lesnotions théoriques vues aux cours du Professeur Ruddy Wattiez. Chaquejour sera dédié à l’extraction, la mise en évidence et la purification dedifférentes macromolécules (protéines, ADN, sucres, lipides).
Dynamique de groupe : Laboratoire divisé en 4 ateliers. 2 groupes paratelier.
Evaluation : 1 rapport par groupe
Travaux pratiques de biochimie (30h)
Enseignant : Guillaume Caulier (Prof. R. Wattiez)Fonction : Assistant en biologieContact : [email protected]
Biochimie
Consignes pour la rédaction du rapport (1 pour 2 étudiants):
Deadline : à discuter.N.B. le rapport peut être commencé lors des scéances.
Fonds : General: Page de garde (noms), introduction, but, bibliographie² .Pour chaque atelier: Introduction, but, matériel et méthode (pas uncopier/coller du protocole), analyse des résultats de l’expérience etdiscussion/conclusion pour chaque atelier.
Forme : Word/PDF d’uneTrentaine de pages maximum.
A envoyer via Moodle: NOM1-Nom2_Tpbiochimie 14-15
² Introduction du TP de biochimie, Caulier 2014.
Année 2015-2016
Remarques préalables :
• Port du tablier de laboratoire, gants et lunettes obligatoires! Prise de conscience du matériel de sécurité en cas d’incident.
•Ne pas manger ni boire dans le laboratoire, attention aux nouvelles paillasses.
• Bien suivre les instructions, comprendre l’expérience avant de commencer.
•Ne pas manipuler les solvants ou autre produit toxique en dehors des hottes prévues à cet effet!
• Bien respecter le matériel! micropipettesbalancespectrophotomètre
Bien nettoyer les paillasses + matériel
Travaux pratiques de biochimie (30h)
Biochimie Année 2015-2016
Protéines
Biochimie
Séparation de protéines par colonne de chromatographie
Dosage de protéines par spectrophotométrie
Réalisation d’une électrophorèse SDS-PAGE
Année 2015-2016
Séparation de protéines par colonne de chromatographie
Biochimie
-Chromatographie d’exclusion (stérique)
-Phase stationnaire : Sephadex G10,20,30…Polymères de dextran hydrophile, différents domaines de réticulation
-Phase mobile : NaCl
-Séparation sur base de la taille, mesure des volumes d’élution. V0 = volume mort.
Déroulement de l’expérience:-Couler 2 colonnes-Séparation de 3 molécules : Blue dextran (2000000 Da)Hémoglobine (65000 Da)Ferycianine de K (329 Da)-Mesure des volumes d’élution-Droite d’étalonnage
Année 2015-2016
Dosage de protéines par spectrophotométrie
Biochimie
-Fonctionnement d’un spectrophotomètre
-Formule de Beer Lambert
A λ = ε λ LC
A = absorbance du chromophore (DO : densité otpique)ε = coefficient d’extinction molaire (mg-1.ml.cm-1)L= longueur du trajet de la lumière dans le spectrophotomètre (cm)C= concentration du chromophore (mg/ml)
Année 2015-2016
Dosage de protéines par spectrophotométrie
Biochimie
-Protéines et chromophores :
-Absorption des Uvs:
280nm 230nm : lien peptidique
-Absorption des protéines avec bleu de Comassie (dosage de Bradford)
595nm
Déroulement de l’expérience:-Vérifier la concentration BSA 1g/l-Spectre abs. (250-350nm) blanc d’oeuf-Droite étalonnage (BSA-bradford)-Determination concentration protéines dans le blanc d’oeuf
Année 2015-2016
Réalisation d’une électrophorèse SDS-PAGE
Biochimie
-Electrophorrèse :
Mobilité et séparation de molécules de différentes tailles dans un gel soumis à un champs électrique.
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) détergeant-dénature-uniformise les charges
Gel d’acrylamide en 2 phases (PH et concentration)- concentration-séparation
Tampon Tris-glycine
Déroulement de l’expérience:-Préparation du gel-Dépôt des échantillons et electrophorèse-Comparer les distances de migration des protéines du blanc d’œuf avec un Référent (droite de calibrage).
Année 2015-2016
ADN
Biochimie
Extraction et précipitation
Dénaturation et mesure de la densité optique
Année 2015-2016
Extraction et précipitation
Biochimie
-Extraction à partir de thymus de veau (ris de veau)-Role biologique-Rapport nucléocytoplasmique élevé
Déroulement de l’expérience:- Destruction des membranes cellulaires (citrate de sodium)-Séparer les protéines de l’ADN (centrifugation)-Dissocier les histones (SDS)-Précipiter les protéines (NaCl)-Précipitation de l’ADN ( alcool) observation
Dénaturation
Déroulement de l’expérience:-Faire chauffer l’ADN et mesurer la DO régulièrement à 260 nm-Déterminer le pourcentage en GC
Année 2015-2016
Lipides
Biochimie
Séparation de différents groupes de lipides
Chromatographie sur couche mince
Année 2015-2016
Séparation de différents groupes de lipides
Biochimie
-graisse neutre vs phospholipides vs stéroides
-Comparaison des contenus en lipides de 2 tissus différents : du lard et dela cervelle de porc.
Déroulement de l’expérience:- Extraction chloroforme/methanol-Précipitation des phospholipides (sels de cadmium)-Saponification
-bêcher cervelle ampoule à décanter (séparation savons et stéroides)-bêcher lard précipitation des acides gras
Année 2015-2016
Chromatographie sur couche mince
Biochimie
-Séparation des différents lipides en fonction de leursaffinitiés pour les deux phases :
-solide : silice (capilarité)
-liquide : solvants
-Révélation de différentes couleurs :
- Vapeur d’iode (taches jaunes)
- Ninhydrine (rose)
- Réactif du phosphore (bleu)
Déroulement de l’expérience:-Préparation de la plaque de silice, notamment pour les aires de dépôt.-Déposer les échantillons et faire migrer dans la cuve avec les solvants.-Révéler avec un spray les différentes couleurs.
Année 2015-2016
Sucres
Biochimie
Tests de révélation de carbohydrates
Digestion d’amidon par l’amylase
Digestion de glucose par les levures
Année 2015-2016
Tests de révélation de carbohydrates
Biochimie
•Sucre = Carbohydrate= plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques polyhydroxylées.
•Coloration couleur de Fehling (oxydoréduction du cuivre)sur 4 sucres différents : glc, fruc, gal, amidon.
•Coloration réactif de Tollens (miroir d’argent)
Déroulement de l’expérience:-Préparation des réactifs de Fehling et Tollens.-Mise en contact (Bain Marie 100°C)-Expliquer les différents résultats.
Année 2015-2016
Digestion d’amidon par amylase
Biochimie
•Mise en évidence de l’activité enzymatique De l’amylase contenue dans notre salive afinde dégrader l’amidon. Vérification par
Coloration à l’iode (lugol) et liqueur de Fehling.
Déroulement de l’expérience:-Mettre l’amidon en solution-Incuber en bain marie à 37°C avec notre salive-test à l’iode + fehling
Digestion de glucose par les levures
•Fermentation alcoolique (anaérobie)C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP
Mesure du métabolisme de la levure par titration du CO2 produit, capté par du NaOH en fiole conique (anaérobie)
Année 2015-2016