Triedenie a úpravy proteínov 2.

(Vezikulárny transport proteínov)

• Sekrétované proteíny sa pohybujú od drsného ER cez Golgi k PM

• 50 nm transportné vezikuly(dopravné prostriedky)

• Cesta späť je možná – retrogradnétransportné vezikuly.

• „cisternal progression“ – pohyb z cis-, k medial- a trans- Golgi

• Konštitutívna (kontinuálna) sekrécia uvoľňuje proteíny mimo bunky exocytózou.

• Regulovaná sekrécia (hormóny, Ca2+,

neurotramsmitery).• Endocytická cesta - vstup

membránových a rozpustných proteínov pomocou vezikúl

Pohyb proteínov v sekréčnej ceste

(triediaca linka proteínov)

Syntéza a pohyb proteínov v škrečích pankreatických bunkách

George Palade, 1960

Vizualizácia transportu proteínov v sekréčnej dráhe pomocou GFP - hybridov

G proteín z vírusu vezikulárnej stomatitidy (VSV)

VSV Gproteín -GFP

Transport membránového glykoproteínu z ER do Golgi je možné sledovať na základe citlivosti voči endoglykozidáze D

Sledovanie transportu sekretovanýchproteínov pomocou organelo- špecifických

modifikácie oligosacharidov

Fenotyp ts sec mutantov špecifikuje jednotlivé kroky sekrécie proteínov

invertase

In vitro analýza proteínového transportu v Golgiho membránach

Mutantná línia fibroblastov (-N-acetylglukozamintransferáza); cytosol, ATP a GTP sú potrebné

1. Aký je mechanizmus tvorby transportných vezikúl? Prečo určité rozpustné a integrálne membránové proteíny sa inkorporujú selektívne v jednom type vezikúl a v druhom nie?

2. Ako vezikuly, ktoré obsahujú proteíny pre sekréciu z bunky, a ktoré pučia z ER sa „vedia“ nasmerovať a fúzovať s cis-Golgim a nie s trans-Golgim? (Aký je molekulárny signál?)

3. Aký je mechanizmus fúzie membrán transportných vezikúl a cieľovej organely?

Odlišné typy vezikúl participujú pri transporte

• COP-I vezikle sa zúčastňujú retrográdneho (Golgi –ER) transportu.

• COP-II – v priamom (anterográdneho) transporte z ER do Golgiho aparátu.

• Klatrínom sú obalené:

• i) sekrečné granuly postupujúce z trans-Golgi k PM alebo k endozómom,

ii) endocytické vezikle, ktoré sú uvoľňované z PM a transportujú svoj obsah do

vnútra bunky.

Molekulárne mechanizmy vezikulárneho transportu

(Obalové proteíny)

• COP -I ( , , , , )

Golgi-Golgi; Golgi ->>ER (retrográdny)

• COP -II (Sec23/24; Sec13/31; Sec16)

ER->>Golgi (anterográdny)

• Klatrin (T- a L- reťazce, AP1-3)

sekrečné granule postupujúce z trans-Golgik PM alebo k endozómom,

endocytické vezikuly, ktoré sú uvoľňované z PM a transportujú svoj obsah do vnútra bunky.

- Sekrečná a endocytická cesta majú spoločné elementy

„cisternal progression“

Tri základné procesy sú:

1) Tvorba (budding), 2) spojenie (docking), a 3) fúzia

Vznik (pučaním) a zánik vezikúl (fúziou) umožní transport nákladu proteínov

• ~70 nm vezikle sú obalené klatrínom, cop-I, alebo cop-II proteínom• Obalené vesikle rozpoznávajú svoje miesto určenia pomocou reakcie medzi proteínom v membráne vesiklu a receptorom v cieľovej membráne.• Transportované proteíny, ktoré nie sú súčasťou štruktúry samotnej vezikuly sa nazývajú kargo• Retrogradný transport vezikul nemusí vždy obsahovať kargo

Všeobecná schéma tvorby transportných vezikúl

(Komponenty zúčastňujúce sa pučania obalených vezikúl)

Kargo proteínyu obsahujú krátku signálnu sekvenciu

Štruktúra klatrínu a tvorba klatrínových vačkov

Klatrínové vezikuly majú priemer 50-100 nm. Ťažký reťazec má 180 kD a ľahký – 40 kD

Klatriinové vezikle majú 3 druhy adapterovýchproteínov – AP2 (PM k endozómu pri endocytóze), AP1 (od t-Golgi do endozómu, a AP3 (Golgi do lyzozómu, vakuoly, melanozómu). Všetky tieto použivajú ARF ako mali GTP- proteín. GGA – 70,000 D.

Štruktúra klatrín-obalených vezikúl

Pestrosť adaptorových komplexov, ich umiestenie v špecifických transportných cestách a ich úloha pri rozpoznávaní proteínov, všetko hovorí v prospech kľúčovej úlohy týchto proteínov pri zabezpečení správnej lokalizácie proteínov.

Dynamínomkatalyzovaná GTP hydrolýza je potrebná pri tvorbe vezikúl.

- Tyr-X-X- resp. Leu-Leu - AP2

Model tvorby COP-I obalených vezikúl(retrográdny transport)

KDEL receptor a ďalšie membránové proteíny pre transport z cis-GM do ER obsahujú LyzLyzXX na C konci – v cytoplazme

1. Sec12 (proteín ER) – G nukleotid výmenný faktor. Signál??

2. Membránový Sar1 riadi polymerizáciu cytopl. COPII

3. Po uvoľnení vezikúl z membrány Sar1-GTPáza hydrolyzuje GTP

4. Sar1-GDP spúšťa disociáciu COPII obalu.

Malé GTP-proteíny (Sar1; ARF) regulujú tvorbu a rozpadu všetkých troch typov obalov

In vitro akumulácia obalených vezikúl v prítomnosti nehydrolyzovateľného analógu GTP

ARF je ukotvený v GM myristátom

Lokalizácia proteínov závisí od špecifických „sorting“ signálov

!!!„Sorting“ signál v luminálnomproteíne interaguje s adaptérom cez trans-membránový receptor!!!

!!!Typický „kargo“ proteín má „sorting“ signál, ktorý interaguje s adaptérom a riadi vstup do pučiacich vezikúl!!!

- Cieľové („sorting“) signálne sekvencie transportovaných proteínov vytvárajú špecifické molekulárne kontakty s obalovými proteínmi

Tabuľka známych „sorting“ signálov, ktoré nasmerujú proteíny do špecifických transportných vezikúl

Fúzia obalu zbavených vezikúl s cieľovou membránou

• Obal braní fúzii a musí byť najprv odstránený.•Disociácia obalu je odštartovaná hydrolýzou GTP v ARF (SAR1).•Disociacia klatrínových vezikúlpotrebuje ďalšie proteíny - šaperón a ATPázu.

Ďalšia skupina malých GTP-proteínov (Rab) sa zúčastňuje v nasmerovaní vezikúl k vhodnej cieľovej

membráne

Prík

lad -

exoc

ytóz

a

1. Rab proteín sa viaže na t.zv. efektor v cieľovej membráne

2. Dvojica v-, a t-SNARE proteínov napomáha fúzii vezikúl s cieľovou membránou

3. Tvorba SNARE komplexu a fúzia

4. Disociácia SNARE komplexu je poháňaná hydrolýzou ATP. Dva proteíny, NSF a -SNAP , sa zúčastňujú rozpletania SNARE komplexu. GTP je tiež hydrolyzované Rab-GTPázou – a Rab disociuje od RAB efektoru.

V S. cerevisiae SEC4 je Rab proteín. Sec4- patrí do klas E mutantov.

Sec18 , sec17 (NSF, -SNAP – klas C (hromadia sa ER→Golgi vezikuly)

Model SNARE-ovej spinky

Komplex SNARE má tyčinkovitú štruktúru (~ 4x14 nm) s membránovými kotvami na tom istom konci.

Interakcia medzi v- a t-SNARE môže byť terčom regulácie. Synaptický proteín nazvaný SYNAPTOTAGMIN sa môže viazať ku komplexu všetkých 3 synaptických SNARE. Jeho väzba vylučuje väzbu SNAP a takto synaptotagmin zabraňuje fúzii tým, že braní tvorbe fúznych častíc. Jeho uvoľnenie môže odštartovať exocytózu.

Rab proteíny sa zúčastňujú zamierenia transportných vezikúl a hydrolýza GTP reguluje rýchlosť fúzie

vezikúl

• Rab proteíny (~30 rôzne) sú monomérne G-proteíny, ktoré pôsobia v špecifických štádiách transportu.

• Mutácia v kvasinkových génoch YPT1 alebo v SEC4, ktoré kódujú Rab proteíny spôsobuje akumuláciu vezikúl v Golgiho ap., alebo medzi Golgim a PM.

Rab proteíny sú pripojené k membránam cez adiciu prenylovej alebo palmytilovej skupiny na C-konci.

Nervové ukončenia (synapsy) ako modelový systém pre exocytózu

• Impulzy v nervovej sústave sú prenášané prechodom molekúl z donoru (pre-synaptická) do recipienta (post-synaptická bunka). Impulz v donorovej bunke odštartuje exocytózu.

Dva modely recyklácie synaptických vezikúv z PM

„Kiss and run“ model predpokladá krátke spojenie s membránou a uvoľnenie obsahu cez vytvorený pór v membráne.

Fúzny model predpokladá tvorbuklatrinových vezikúl a endocytózu.

RECEPTOROM-SPROSTREDKOVANÁ ENDOCYTÓZA

• Sekrétované proteíny sa pohybujú od drsného ER cez Golgi k PM

• 50 nm transportné vezikuly(dopravné prostriedky)

• Cesta späť je možná – retrogradnétransportné vezikuly.

• „cisternal progression“ – pohyb z cis-, k medial- a trans- Golgi

• Konštitutívna (kontinuálna) sekrécia uvoľňuje proteíny mimo bunky exocytózou.

• Regulovaná sekrécia (hormóny, Ca2+,

neurotramsmitery).• Endocytická cesta - vstup

membránových a rozpustných proteínov pomocou vezikúl

Pohyb proteínov v sekréčnej ceste

(triediaca linka proteínov)

Endocytóza (fagocytóza, pinocytóza)

• Nástroje používané pre import proteínov do bunky sú podobné ako pri exporte (sekrécii) proteínov. • Niektoré receptory sú pravidelne internalizované, iné zostávajú na povrchu bunky, pokiaľ sa na nich naviaže ligand, a tým sa odštartuje ich endocytóza.•Signály, ktoré spúšťajú internalizáciusú odlišné pre ligand-nezávislú a pre ligandom-indukovanú endocytózu.• V obidvoch prípadoch receptory sa dostavajú do vačkov v PM, ktoré sú obalene klatrínom (coated pits).

Tvorba klatrínom obalených vezikúl na cytosolickej strane PM

Vznik (pučaním) a zánik vezikúl (fúziou) umožní transport nákladu proteínov

Klatrín/AP2 obalené vačky na začiatku receptorovej endocytózy LDL

Skorý endozóm po 6 min

Lipidy vstupujú do bunky vo forme veľkých lipoproteínových komplexov

Model LDL Vzťah prekurzor-produkt pri vstupe LDL do buniek

• Povrch – apolipoproteín• CHL obsahujúca fosfolipidická monovrstva 20-25 nm

Receptorom sprostredkovaná endocytóza- objav LDLR- osud komplexu receptor-ligand závisí na reakcii kyslého prostredia v endozóme

(Asn-Pro-X-Tyr)

nízko-hustotný lipoproteíny, LDL

Dedičná hypercholesterolemia – zvýšený LDL cholesterol v plazme, mutácia v LDLR géne. Mutácia v NPXY „sorting“ signáli , mutácie v subjednotkách AP2.

Model pH-závislej väzby LDL častíc na LDL receptor

V endozóme His v -prop. doméne receptoru viaže H+ a spojuje sa s R1-R7 ramenom

Signál NPXY = AspProXTyr

Endocytóza transferín-viazaného Fe3+ do bunky

Phe-Arg-X-Tyr

Trans-cytóza prenaša ligandy cez bunku

Trans-cytóza materských IgG cez bunky črevného epitela novonarodených jedincov.

Dodanie proteínov z plazmatickej membrány pre degradáciu v lyzozómoch

Multivezikulárne endozómy oddelia membránové proteíny určené pre lyzozomálnu membránu od proteínov určených pre degradáciu

Tvorba multivezikulárnych endozómov

Poly- a mono- ubiquitinované proteíny

ESCRT – endosomalsorting complex requiredfor transport

(ESCRT a Vps4 – majú podobnú funkciu ako SNARe a NSF pri tipickejmembránovej fúzii)

Autofágia dodáva do lyzozómov pre degradáciu cytoplazmatické proteíny alebo aj celé organely

•Recyklácia vlastných makromolekúl s cieľom získavania „potravy“•Autofagické vezikuly (autofagozóm) sú pravdepodobne derivované z membrán ER •Atg8 maskuje proteíny potrebné pre fúziu a takto braní predčasnú fúziu

Skorá fáza sekrečnej cesty – súhrn

COPII vezikuly transportujú proteíny z ER do cis-Golgi; COPI vezikuly transportujú proteíny v opačnom smere (retrogradný transport)

COPII obal má tri hlavné zložky: malý GTP-proteín Sar1, Sec23/Sec24 komplex a Sec13/Sec31 komplex

Komponenty COPII obalu viažu membránové „kargo“ proteíny, ktoré obsahujú dvojitý kyslý (di-acidic) signál vo svojej cytoplazmatickej doméne. Rozpustné „kargo“ proteíny sa pravdepodobné dostanú do COPII vezikúl pomocou väzby k membránovému receptoru.

Veľa rozpustných ER-proteínov obsahuje KDEL triediaci (sorting) signál. Väzba týchto sekvencii k špecifickému receptoru v cis-Golgi membránach napomáha návratu proteínov prostredníctvom COPI vezikúl.

Membránové proteíny potrebné pre tvorbu COPII vezikúl sú získavané späť z cis-Golgi pomocou COPI vezikúl. Jeden z triediacich signálov, ktorý nasmeruje membránové proteíny do COPI vezikul je aj LysLysXX (KKXX) sekvencia, ktorá sa viaže k subjednotkám COPI obalu.

COPI vezikuly tiež prenášajú Golgi-proteínov z neskorých k skorým kompartmentom Golgiho cysterien.

Receptorom-sprostredkovaná endocytóza – súhrn

ligandy, ktoré sa viažu na špecifické povrchové receptory sú internalizované spolu s ich receptormi v klatrin-obalených vezikloch (obsahujú tiež AP2)

triediace (sorting) signály v cytoplazmatických doménach receptorov ich nasmerujú do klatrin/AP2 váčkov pre internalizaciu. Známe signály sú AsnProXTyr, TyrXX , LeuLeu.

Niektoré ligandy sú prenašané do lyzozómov a tam sú degradované. Transportné vezikuly z PM najprv fuzúju s neskorým endozómom, ktorý následne fúzuje s lyzozómom.

Väčšina komplexov receptor-ligand disociuje v kyslom prostredi neskorého endozómu; receptory sú recyklované späť k PM a ligandy sú nasmerované k lyzozómu.

End

Fluorescenčné proteíny ktoré patria do cis-, a trans-Golgiho aparátu ukazujú, že Golgi nie je statickým súborom kompartmentov

Vrg4-GFP patrí do cis-Golgiho a Sec7-DsRed – do trans-Golgiho ap.

Tento obrázok je priamym potvrdením hypotézy cisternalnej (vakovej) progresii. Ukazuje, že kompozícia individuálneho membránového vaku podlieha procesu maturácie, ktorý je charakterizovaný stratou cisGoldiho proteínu a nadobudnutia transGolgiho proteínu.

Anterogradný transport cez Golgi pravdepodobne prebieha ako cisternalná progresia (maturácia)