triquinelosis oie

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008, 1

C A P T U L O 2 . 1 . 1 6 .

TRIQUINELOSIS

RESUMEN

La triquinelosis del hombre est causada por el consumo de carne cruda o poco cocinada de animales domsticos o de caza infectados por Trichinella. Los adultos sobreviven menos de dos meses en el intestino delgado de la especie hospedadora, incluyendo al hombre, los cerdos, las ratas, los osos, las morsas, ocasionalmente los caballos y en cualquier otro mamfero carnvoro, y en las aves y los reptiles. Las larvas de Trichinella se localizan en los tejidos musculares de sus hospedadores y los individuos susceptibles se infectan mediante la ingestin de tejidos que contengan dichas larvas.

Identificacin del agente: Las pruebas de diagnstico para la triquinelosis se agrupan en dos: 1) la deteccin directa de la primera etapa de la larva enquistada o libre en tejido de msculo estriado, y 2) la deteccin indirecta de la infeccin mediante pruebas para anticuerpos especficos.

Para detectar directamente la infeccin por Trichinella en los tejidos, se utilizan el mtodo de compresin y el mtodo de digestin del tejido muscular. Las larvas de Trichinella normalmente se localizan en los lugares preferidos de los msculos, sobre todo en las infecciones moderadas, y esos lugares varan segn la especie hospedadora. Es importante muestrear dichos lugares para maximizar la sensibilidad. Por ejemplo, en los cerdos, son el diafragma, la lengua y los msculos maseteros y abdominales, mientras que, en los caballos, los msculos de la lengua y los maseteros hospedan la mayora de los parsitos, seguidos por el diafragma y los msculos del cuello.

Los mtodos de digestin artificial incluyen la digestin enzimtica de muestras de tejido muscular individuales o agrupadas, y utilizan la homogeneizacin o trituracin mecnica, la agitacin y la incubacin. A continuacin se aplican los procedimientos de filtracin y sedimentacin. Las muestras procesadas con estos mtodos se someten a un examen estreomicroscpico para comprobar la presencia de larvas. Mediante los mtodos de digestin se puede detectar < 1 larva por gramo (lpg) de tejido, pero en estos niveles de infeccin moderada la desigual distribucin de las larvas dentro de los tejidos constituye un factor limitativo. Eso se compensa mediante el ensayo de muestras ms amplias de las canales, tales como un mnimo de 15 g para cerdos y 10 g para animales de caza y caballos. Estos mtodos se recomiendan en la inspeccin individual de las canales de los animales de abasto como los cerdos, los caballos y los animales de caza.

El mtodo de compresin es menos sensible que la digestin artificial y no es recomendable como prueba fiable para la inspeccin de las canales. Aunque actualmente est obsoleto, se utiliz ampliamente en el pasado y aqu lo mencionamos por estudiarlos exhaustivamente. Consiste en una inspeccin visual de piezas comprimidas de tejido muscular para comprobar la presencia de las larvas in situ. Este mtodo se puede llevar a cabo con un estreomicroscopio o con un microcopio especializado como el triquinoscopio, que tiene una eficacia estimada de deteccin de como mnimo de tres larvas por gramo de tejido. Este mtodo tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo para la inspeccin de mltiples muestras de cada canal. Tambin es muy difcil detectar las larvas de Trichinella sin cpsula (T. pseudospiralis, T. papuae y T. zimbabwensis). Las tcnicas de compresin solo son tiles para detectar medianas o grandes infecciones cuando se necesita examinar unos pocos animales y las instalaciones no estn preparadas para la prueba de digestin artificial.

Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas son las que con mayor frecuencia se utilizan para la deteccin indirecta. La sensibilidad y la especificidad de los mtodos serolgicos dependen sobre todo del tipo de la calidad del antgeno utilizado. La mayora de los datos relativos a la

slOriginal ingls

Captulo 2.1.16. Triquinelosis

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realizacin (validacin) de las pruebas serolgicas provienen de su aplicacin a los cerdos. Se pueden producir resultados serolgicos falsos negativos de tipo serolgico hasta 3 semanas o ms despus de que las larvas de los msculos se hacen infectivas en cerdos con una infeccin leve o moderada. Tambin se ha descrito un ndice bajo de resultados positivos falsos en las pruebas serolgicas. Para efectuar una inspeccin individual de la canal, solo pueden recomendarse los mtodos directos. Para un seguimiento o verificacin de las regiones libres de triquinas, son aceptables los mtodos serolgicos. En los cerdos se han detectado niveles de 1 larva/100 g de tejido. La especificidad del enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar la infeccin por Trichinella est directamente relacionada con el tipo y la calidad del antgeno empleado en la prueba. Los antgenos secretores que se han recogido manteniendo in vitro por breve tiempo (1820 horas) las larvas T. spiralis del msculo y los antgenos carbohidratados sintticos, proporcionan actualmente la fuente ms especfica y econmica, aunque en algunos estudios se han obtenido ndices bajos de positivos falsos. Es de suma importancia la utilizacin de sueros control positivo y negativo adecuados para asegurarse de que los ELISA se realicen con un grado de sensibilidad y especificidad mnimamente aceptable. Se recomienda la digestin de 100 g o ms de tejido como prueba confirmativa para los animales serolgicamente positivos.

Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: No existen vacunas adecuadas para la infeccin por Trichinella en los animales de abasto. En los mtodos (serolgicos) directos de deteccin, deben utilizarse antgenos adecuados a fin de lograr una correcta especificidad y sensibilidad de la prueba. Estos antgenos pueden obtenerse a partir de productos secretores de las larvas del msculo mantenidas in-vitro. Hay una necesidad perentoria de un banco internacional de sueros de referencia para poder dotar de un estndar comn a las pruebas serolgicas para Trichinella.

A. INTRODUCCIN

La triquinelosis del hombre est causada por la ingestin de carne cruda o poco cocinada de animales de abasto o de caza (10. Los parsitosadultos, de breve vida, viven en el intestino delgado de las especies hospedadoras, incluyendo al hombre, los cerdos, las ratas, los osos, las morsas, los caballos, muchos otros mamferos carnvoros, y algunos pjaros y reptiles. El parsito tiene un ciclo de vida directo. A las pocas horas de la ingestin del msculo infectado por un hospedador adecuado, las primeras larvas del msculo son liberadas por la digestin y comienzan a excavar surcos en las vellosidades del intestino delgado. Se convierten rpidamente en adultas (hay machos que alcanzan hasta 1,8 mm de longitud y las hembras hasta 3,7 mm) y sobreviven menos de 2 meses. Durante ese tiempo tiene lugar la cpula y las hembras, ovo-vivparas, liberan las larvas recin nacidas (LRN), que emigran por las vnulas y el sistema linftico hacia el sistema circulatorio general. Las LRN se extienden por el cuerpo, invadiendo los msculos estriados y mostrando predileccin por grupos especficos de msculos. Por ejemplo, en los cerdos la lengua contiene la mayor concentracin de larvas, seguida por el diafragma; en los caballos, la mayor concentracin se da en la lengua y en segundo lugar en los msculos maseteros. Los sitios preferidos varan de una especie hospedadora a otra, pero, en general, la lengua, los msculos maseteros y el diafragma son los lugares ptimos para el muestreo. Actualmente se dispone de informacin sobre la localizacin preferida de varias especies de hospedadores (22). En los casos de infeccin grave, la mayor parte de los msculos voluntarios contienen cantidades elevadas de larvas. Las larvas de casi todas las especies de Trichinella se envuelven en colgeno dentro de la musculatura del hospedador, donde permanecen infectivas durante aos.

Dentro del gnero Trichinella, se han identificado once genotipos, a ocho de los cuales se les ha asignado la categora de especie (10, 21, 27). Trichinella spiralis (T-1) se distribuye en zonas templadas de todo el mundo y se asocia comnmente con los cerdos domsticos. Es muy infecciosa para los cerdos domsticos y los salvajes, ratones y ratas, pero tambin puede detectarse en otros mamferos carnvoros. Trichinella nativa (T-2) se presenta en los mamferos carnvoros del rtico y de las regiones rticas de Norteamrica, Europa y Asia. Trichinella britovi (T-3) se encuentra principalmente en los animales salvajes y ocasionalmente en los cerdos o los caballos. Se da en regiones templadas de Europa y Asia y en el norte y occidente de frica. Trichinella pseudospiralis (T-4) tiene una distribucin cosmopolita y ha sido recuperada de las aves de rapia, de los carnvoros salvajes y de los omnvoros, ratas y marsupiales, en Asia, Norteamrica, Europa y Australia. A diferencia del resto de los genotipos de Trichinella, la T-4 no aparece envuelta en una cpsula de colgeno en el msculo. Trichinella murrelli (T-5) se encuentra en los mamferos carnvoros de Norteamrica. Tiene una infectividad baja en los cerdos domsticos, pero representa un riesgo para los humanos que consumen carne de animales de caza. La Trichinella T-6 est adaptada a los climas fros y parece que est estrechamente asociada con T. nativa en el norte de Norteamrica (27). T. nativa y T-6 son muy resistentes a la congelacin. Tienen una infectividad limitada en los cerdos. Trichinella nelsoni (T-7) se ha aislado de los mamferos carnvoros y, de forma espordica, de los cerdos salvajes en el ste de frica. Se ha detectado Trichinella T-8 en mamferos carnvoros


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de Namibia y Sudfrica, y Trichinella T-9 en mamferos carnvoros de Japn (27). T-8 y T-9 tienen rasgos intermedios con T. britovi y T. murrelli, respectivamente. Al igual que ocurre con T. pseudospiralis, T. papuae (T-10) y T. zimbabwensis (T-11) son parsitos no encapsulados del msculo. Se ha informado sobre la presencia de Trichinella papuae en los cerdos domsticos y salvajes, en cocodrilos de granja y en el hombre en Papa Nueva Guinea. Se ha descrito Trichinella zimbabwensis en cocodrilos salvajes y de granja en Zimbabwe, Etiopa y Mozambique, y en el lagarto monitor de Zimbabwe. Segn los experimentos realizados, muestra una gran infectividad en un amplio espectro de hospedadores mamferos, incluidos los cerdos y las ratas (27). Todas las especies y los genotipos de Trichinella causan la enfermedad en el hombre.

La triquinelosis en los humanos puede ser una enfermedad debilitadora que puede ocasionar la muerte. Los parsitos adultos, de vida corta, en el intestino delgado, pueden causar gastroenteritis temporal, pero las seales y sntomas ms graves se producen como resultado de la migracin y presencia de las larvas en los msculos voluntarios. La enfermedad se transmite por comer carne infectada que no ha sido suficientemente cocinada (o con cualquier procedimiento seguro). Para prevenir la infeccin en el hombre es necesario inspeccionar la carne procesndola (bien sea cocinndola, congelndola o curndola) y evitando el contacto de los animales comestibles con carne infectada, incluyendo los desperdicios de la comida sin cocinar, con roedores y con otros animales salvajes (10, 12 y 13). La carne procedente de la caza debera considerarse siempre como una fuente potencial de infeccin y, por tanto, dicha carne debe ser controlada o cocinada cuidadosamente. La Trichinella que se encuentra en la carne procedente de la caza (principalmente T. nativa, T-6 y, en menor grado, T. britovi) puede ser resistente a la congelacin y, por lo tanto, la carne de animales de caza congelada que no se haya sometido a anlisis puede tambin representar un riesgo para la Salud pblica.

Los mtodos de prueba para la deteccin de la infeccin por Trichinella en los cerdos y otras especies o bien sirven (a) para detectar directamente el parsito en las muestras de tejido o (b) o para demostrar de forma indirecta, la presencia del parsito mediante el uso de mtodos inmunolgicos para detectar anticuerpos especficos frente a Trichinella spp. en las muestras de sangre, suero o lquido tisula.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

1. Identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)

Los nicos procedimientos recomendados para la deteccin de las larvas de Trichinella en la carne son las pruebas de digestin. En varios pases se reconoce oficialmente un cierto nmero de pruebas de digestin con fines comerciales. La Comisin Internacional para Triquinelosis (CIT) recomienda varias de estas pruebas, que constituyen estndares documentados en la UE, Canad y EE. UU. Sin embargo, otros mtodos oficiales no utilizados de forma rutinaria en la actualidad no se recomiendan debido a su nula eficacia o fiabilidad. Las pruebas de diagnstico modernas deben cumplir con las normas internacionales sobre garanta de calidad, que incluyen datos de validacin con una base cientfica y un diseo que permita el control rutinario y la documentacin de los principales puntos de control. Aunque generalmente se considera que la prueba de la digestin es el mejor procedimiento, an se carece de un protocolo para dicha prueba universalmente aceptado para fines comerciales y de seguridad alimentaria. La prueba de la digestin aqu recomendada se basa en las interesantes innovaciones inherentes a algunas pruebas de digestin que se han adoptado para el comercio internacional.

a) Procedimiento directo recomendado para analizar la carne

Sensibilidad: La sensibilidad de los mtodos de prueba directos depende de la cantidad de tejido examinado y del lugar del que se ha obtenido la muestra. Los mtodos directos permitirn la identificacin de cerdos, caballos u otros animales infectados por T. spiralis en un plazo mnimo de 17 das despus de la exposicin al parsito, intervalo que coincide con el tiempo necesario para que las larvas alojadas en los msculos, adquieran la capacidad de infectar a un nuevo hospedador. Los mtodos directos continan siendo efectivos siempre y cuando las larvas permanezcan viables. Con el fin de asegurar la viabilidad de las triquinas, las muestras de tejido no deben guardarse durante largos periodos de tiempo ni congelarse antes de ensayarse. Los mtodos actuales para la prueba de la digestin artificial mediante el empleo de una muestra de 1 g tienen una sensibilidad de aproximadamente tres larvas/g de tejido, y el ensayo de una muestra de 5 g aumenta la sensibilidad a 1 larva por g de tejido (13, 22). La sensibilidad de esta prueba aumenta considerablemente cuando grandes cantidades de tejido (hasta 100 g) estn disponibles para la digestin

Muestreo: Las pruebas se realizan normalmente en muestras de las canales recogidas post mrtem. Las muestras de los msculos se toman de los sitios predilectos, normalmente de los pilares del diafragma o de la lengua de los cerdos, o de la lengua o los msculos maseteros de los caballos. El tamao de la muestra puede variar; se pueden tomar muestras individuales de 100 g de un animal, o se pueden tomar varias muestras de menor tamao de varios animales para hacer un agrupamiento de 100 g. El tamao de las



muestras que componen este agrupamiento determinar la sensibilidad del mtodo. La CIT recomienda muestras de 5 g por cerdo para las pruebas en reas endmicas. Para analizar la carne de caballo, se requiere un mnimo de 5 g por canal. Para los caballos procedentes de reas endmicas, se recomienda utilizar una muestra de 10 g.

Digestin y deteccin

i) Se determina el volumen de la solucin digestiva requerida para la digestin (2.000 ml de la solucin para 100 g de carne y 1.000 ml para 50 g o menos).

ii) Solucin de digestin: Se prepara un volumen apropiado de una solucin de HCl al 37% /agua (0,55% v/v HCl al 37%) combinando el HCl con agua del grifo (p.ej. 11 ml de HCl al 37% con 1.989 ml de agua). No se aade pepsina a la solucin en ese momento. Se debe precalentar esa solucin a 45C antes de su uso.

iii) Se retira tanta grasa y fascia como sea posible de cada muestra de carne.

iv) Se pesa la cantidad adecuada de carne magra de cada muestra. Se corta cada muestra en trocitos de 12 g y se mezclan con otras muestras hasta lograr una cantidad de 100-g.

v) Se coloca la muestra de carne agrupada en un triturador. Se aaden 50100 ml de la solucin agua/HCl para la mezcla de una muestra de 100 g.

vi) Se pica la carne en el triturador hasta que est homogeneizada (no deben quedar trocitos enteros de carne; la muestra debe tener la consistencia de un pur para bebs). Esto se logra normalmente con varias pulsaciones de 13-segundos. Se aaden aproximadamente 100 ml de la solucin preparada de agua/HCl y se mezcla hasta que la mezcla tenga una textura lquida uniforme. Eso puede requerir 510 segundos (es posible que sea necesario aadir ms solucin).

vii) Se esparcen 10 g de pepsina (1:10.000 NF/1:12.500 BP/2.000 FIP; a ser posible en forma granular) sobre el homogeneizado, se aaden unos 200 ml de solucin agua/HCl, y se mezcla durante unos 5 segundos.

viii) Se transfiere la muestra homogeneizada a una cubeta de 3 litros que contenga un agitador. Se aade el resto de los 2 litros de solucin agua/HCl vertindolos en el triturador y se aclara todo el homogeneizado residual introducindolo en la cubeta de 3 litros. Se aclara cualquier material adherido a la tapa del triturador y se introduce el agua con los restos del aclarado en la cubeta utilizando 1020 ml de solucin digestiva mediante un frasco con eyector.

ix) Se coloca la cubeta en la plancha precalentada de un agitador magntico o en una cmara de incubacin dispuesta a 452C. Se cubre la cubeta con papel de aluminio. Se activa el agitador a una velocidad lo bastante alta para crear un vrtex potente que no salpique. Nota: Si la temperatura de digestin al comienzo de la digestin no es 452C, debe permitirse que la muestra se caliente a esa temperatura antes de iniciar el cronometraje de la digestin.

x) Se deja que contine la digestin durante 30 minutos. Si la temperatura de digestin desciende por debajo de 452C, puede que sea necesario un tiempo adicional para completar la digestin. Eso se puede decidir previa observacin de la mezcla de la digestin. Si se observan trozos de tejido muscular, no digeridos, la digestin debe prolongarse otros 30 minutos o hasta que esos trozos se digieran. Hay que asegurarse de no sobrepasar la temperatura de digestin. Como alternativa, puede realizarse la digestin a 37C durante un mayor periodo de tiempo.

xi) No ms tarde de 5 minutos despus de retirar el lquido de digestin de la plancha del agitador magntico, se vierte aquel, a travs de un filtro de malla de 177180 m, en un embudo de separacin de dos litros. Se aclara la cubeta con agua del grifo a temperatura ambiente utilizando una frasco con eyector y se introducen los restos aclarados en un embudo de separacin de 2 litros a travs del tamiz.

xii) Se aclara el tamiz sobre el embudo de separacin de 2 litros, con un chorro de agua del grifo a temperatura ambiente vertido sobre el tamiz. No deberan quedar trozos de msculo no digeridos sobre el tamiz, aunque pueden quedar restos de grasa, fascia y otros tejidos. Se deja que el lquido del embudo de separacin se sedimente durante 30 minutos.

xiii) Se escurren 40 ml del lquido de la digestin del embudo separador en un tubo cnico o en un cilindro medidor (frasco Pilsner) de 50 ml y se deja durante 10 minutos.

xiv) Transcurridos los 10 minutos, se usa una pipeta para retirar 30 ml de la parte superior del lquido (o sobrenadante), dejando en el tubo los 10 ml del fondo (no se deben derramar los 30 ml del sobrenadante, ya que eso puede remover el sedimento).

xv) Se remueven con suavidad los 10 ml de lquido restantes y se transfieren rpidamente a una placa de Petri con una rejilla o a una bandeja para recuento de larvas. Se aclara el tubo o cilindro sobre una placa de Petri dos veces usando 5ml de agua del grifo cada vez. La capa lquida de la placa de Petri debe tener una profundidad de solo unos pocos milmetros.



xvi) Ha de esperarse un mnimo de 1 minuto para que las larvas se depositen en el fondo, luego se utiliza un estreomicroscopio a 1016 aumentos a fin de examinar de forma sistemtica cada rejilla de la placa de Petri para detectar la presencia de larvas de Trichinella. La deteccin de larvas sospechosas en ese examen sistemtico debe confirmarse mediante la identificacin de detalles morfolgicos utilizando un aumento mayor, por ejemplo 40 aumentos. Si el sedimento est turbio o es difcil de analizar, se proceder a una clarificacin adicional como se describe ms adelante.

xvii) Los productos de la digestin deben analizarse tan pronto como estn listos. En ningn caso debe posponerse el anlisis de los productos digeridos para el da siguiente.

xviii) Si los productos de la digestin no se examinan antes de que transcurran 30 minutos despus de su preparacin, es posible que haya que clarificarlos cono se describe ms adelante.

xix) Clarificacin de la muestra: se transfiere el contenido de la placa de Petri a un tubo cnico de 50 ml utilizando una pipeta. Se aclara la placa de Petri con agua del grifo, aadiendo el agua del aclarado al tubo cnico. Se aade ms agua hasta completar un volumen de 45 ml. Se deja que el tubo se sedimente, sin remover, durante 10 minutos.

Despus de los 10 minutos se utiliza una pipeta para retirar el sobrenadante, dejando los 10 ml del fondo (no se debe derramar el sobrenadante, ya que eso podra alterar el sedimento). Se guarda el lquido retirado para su eliminacin o descontaminacin una vez se haya ledo la muestra.

Se repiten los pasos (xv) y (xvi).

xx) En caso de un resultado positivo o dudoso, debe tomarse una muestra adicional de cada canal para completar la muestra agrupada. Esas muestras deben ensayarse individualmente o en grupos sucesivos ms pequeos hasta que se puedan identificar los animales individuales infectados.

Identificacin de las larvas: Una vez separadas por digestin de la clula muscular, las larvas de la primera fase del ciclo tienen aprox. 1 mm. de largo y 0,03 mm. de ancho. El rasgo ms caracterstico de las larvas de Trichinella es el esticosoma, formado por una serie de clulas discoides que, dispuestas a lo largo del esfago, ocupan la mitad anterior del cuerpo del parsito. Las larvas de Trichinella pueden aparecer enroscadas (a baja temperatura), mviles (a temperatura templada) o en forma de una C (media luna) (cuando estn muertas). En caso de duda, las larvas deberan observarse con un mayor aumento y deberan examinarse ms tejidos. Si el recuento es elevado, deber repetirse la prueba llevando antes la muestra a una dilucin apropiada.

Garanta de calidad

Los laboratorios que utilicen mtodos de digestin artificial deben mantener un sistema de garanta de calidad apropiado para garantizar la sensibilidad de la prueba. Los componentes de un sistema de garanta de calidad para la prueba de digestin estn descritos por la Comisin Internacional para la Triquinelosis (CIT) (13) y en otros lugares, y deben incluir el uso regular de pruebas de suficiencia (7, 8).

b) Otras pruebas

Otros mtodos de deteccin directa

i) El mtodo del embudo de separacin doble: Esta prueba se recomienda como alternativa del procedimiento de digestin comn descrito anteriormente, y est autorizado por la UE para su utilizacin con fines de exportacin. El mtodo se dise para su aplicacin bajo condiciones estrictas de control de calidad, para minimizar el los errores tcnicos, y se ha validado ampliamente para su utilizacin con la carne de cerdo y de caballo (5).Incluye una tcnica de digestin con un spin-bar y embudos de separacin secuencial para la sedimentacin de las larvas. El procedimiento tiene pocas fases, requiere menos tiempo y apenas necesita fases de clarificacin adicionales. Para realizar la digestin se utiliza una cmara de incubacin equipada con puertas de cristal transparente y con una temperatura de 45C. La digestin se realiza en 3 litros de lquido de digestin en un agitador magntico. Tras la digestin, se cuela la suspensin en un embudo de separacin de 4 litros a travs de una malla de filtro de 177180 m, que se aclara meticulosamente con agua del grifo hacia el interior del embudo de separacin. Se deja que la suspensin se sedimente durante 30 minutos y se escurren 125 ml en un embudo de separacin de 500 ml. Se aumenta el volumen hasta 500 ml aadiendo 375 ml de agua del grifo, y se deja que la suspensin resultante se sedimente durante 10 minutos ms. Finalmente, se escurren 2227 ml de sedimento en una placa de Petri y se examina para comprobar la presencia larvas como se describi anteriormente.

ii) Mtodo de digestin de una muestra agrupada asistido mecnicamente tcnica de sedimentacin (Mtodo 4: 84/319/EEC): En este mtodo se utiliza un triturador Stomacher para la fase de digestin y un embudo de separacin para la sedimentacin de las larvas (3).

iii) Reaccin en cadena de la polimerasa: Algunos estudios han puesto de manifiesto que se puede utilizar la PCR para detectar el cido nucleico de las larvas en la musculatura de los animales



infectados. Sin embargo, carece de sensibilidad y no es prctico para el uso rutinario en animales de abasto. La identificacin de las especies o los genotipos de Trichinella recuperados del tejido muscular puede ser til para entender la epidemiologa de los parsitos en animales, para evaluar el riesgo relativo de la exposicin humana y para rastrear la granja en la que se haya originado la infeccin. Se han desarrollado cebadores especficos que permiten la identificacin de la especie y el genotipo de las larvas individuales, tomadas de tejidos musculares, mediante la PCR (25). La solicitud para aislar o genotipificar las larvas de Trichinella puede hacerse a travs del Laboratorio de Referencias de la OIE en Roma, Italia, o en Saskatoon, Canad (vase el cuadro en la parte 3 del Manual de la Pruebas disgnstico y de la vacunas para los Animales Terrestres (www.iss.it/Trichinella/index/asp).

Mtodos de deteccin directa no recomendados para la inspeccin de la carne

i) Triquinoscopa: Este mtodo implica la compresin de mltiples trozos de tejido muscular de 2 10 mm entre dos placas de vidrio (compressorium) hasta que se vuelven translcido, seguida de un examen al microscopio (2). Aunque este mtodo se ha utilizado durante dcadas, es laborioso y se dispone de datos comparativos segn los cuales no es tan sensible como los ensayos de digestin (6). Un aumento del tamao de la muestra para compensar ese dficit no prctico cuando se han de probar en grandes cantidades de animales, y la Trichinella spp. no encapsulada (T. pseudospiralis, T. papuae y T. zimbabwensis) puede presentarse sin enroscamiento fuera de las clulas musculares, lo que dificulta su deteccin mediante la triquinoscopa. Debido a esas limitaciones, no se recomienda la triquinoscopa ni otros mtodos de compresin para el anlisis rutinario de las canales.

ii) Trichomatic 35: en este mtodo se utilizan una cmara de digestin automatizada y un filtro de membrana para la recuperacin y el anlisis de las larvas. Los pasos fundamentales para la digestin y el proceso de recuperacin son difciles de monitorizar en este sistema, y la capacidad de la prueba es de solo 35 g.

Mtodos inmunolgicos

Se han descrito una serie de pruebas para el diagnstico de la triquinelosis en los animales domsticos y salvajes (17). Los mtodos incluyen la prueba de inmunofluorescentia (IFA), blot de inmuno-electrotransferencia (IEBT), western blot, pruebas de inmunohistoqumica enzimtica, y el enzimoinmunensayo (ELISA). Con la excepcin del ELISA, estas pruebas no han sido estandarizadas y no se dispone de reactivos para uso rutinario. No obstante, la CIT ha ofrecido un conjunto uniforme de recomendaciones para la elaboracin y el uso de las pruebas serolgicas para la deteccin de anticuerpos en circulacin (17). El ELISA es la nica prueba avalada por la CIT. Est autorizado solamente como herramienta de vigilancia para la deteccin de anticuerpos anti-Trichinella en los cerdos; no es fiable para la deteccin de la infeccin por Trichinella en animales individuales.

2. Pruebas serolgicas

Aunque otras pruebas serolgicas pueden tener algunas aplicaciones prcticas, el ELISA es reconocido generalmente como el mtodo preferido por ser econmico, fiable y adaptable a las prcticas de buena calidad, la existencia de una cantidad cada vez mayor de datos de validacin por su buena sensibilidad y especificidad cuando se aplica en condiciones adecuadas. Es un instrumento til para llevar a cabo en poblaciones y se utiliza de forma rutinaria para los programas de vigilancia y las investigaciones de los focos de la enfermedad. Sin embargo, por las razones que se exponen ms adelante, no se recomienda el ELISA parautilizarlo individualmente a los cerdos con fines de seguridad alimentaria.

a) Enzimoinmunoensayo (ELISA)

Sensibilidad y especificidad

En cerdos se pueden detectar niveles de infeccin muy bajos (11), de una larva por 100 g de tejido, mediante los ensayos ELISA. Este alto nivel de sensibilidad hace de la prueba serolgica mediante el ensayo ELISA un mtodo til para la deteccin de la transmisin de la infeccin por Trichinella en las granjas o para los programas de seguimiento ms amplios. Una desventaja de la serologa en la deteccin de la triquinelosis es la incidencia de la baja tasa de resultados negativos falsos que se han observado en el caso de los animales infectados. Tales resultados se deben a un desfase en la cintica de las respuestas de los anticuerpos en los animales ligera o moderadamente infectados por la T. Spiralis o por las especies de Trichinella silvestre. Esta baja tasa de produccin de anticuerpos significa que los animales infectados no pueden detectarse hasta 35 semanas despus de la exposicin (9, 13). Eso se debe sobre todo, al retraso en la respuesta inmune tras la ingestin de las larvas. Normalmente no se presentan niveles detectables de anticuerpos en los cerdos hasta despus de 35 semanas o ms despus de la exposicin (11, 14). Por esta razn, las pruebas serolgicas no son recomendables en las pruebas con canales individuales. Las respuestas serolgicas persisten en los cerdos durante un largo perodo despus de la infeccin sin disminucin del ttulo; sin embargo, se ha detectado la disminucin de anticuerpos en los caballos a los



pocos meses de la infeccin (22). Las pruebas serolgicas pueden ser poco tiles en los caballos, ya que los ttulos de anticuerpos terminan por descender por debajo de los niveles de diagnstico a pesar de la presencia de larvas infectantes en los msculos (19, 26) Es poco lo que conoce acerca de las respuestas de los anticuerpos a la infeccin por Trichinella en las especies de caza, pero deben obtenerse muestras de suero de gran calidad con el fin de disminuir la probabilidad de reacciones positivas falsas.

Muestras

La utilizacin del ELISA para detectar la presencia de los anticuerpos especficos del parsito propicia un mtodo que puede realizarse en suero, en sangre o en lquido de tejidos recogidos antes o despus del sacrificio (15). La dilucin utilizada para el suero es diferente de la utilizada para el lquido de tejidos (23).

Antgenos

La especificidad y sensibilidad del ELISA depende en gran medida de la calidad del antgeno utilizado en la prueba. Los antgenos que se secretan especficamente de los esticocitos de las larvas L1 vivas y contienen el eptopo de carbohidrato del TSL-1 son reconocidos por los animales infectados por Trichinella. Los antgenos reconocidos en los productos ES de las lombrices constan de un grupo de glicoprotenas estructuralmente relacionadas con pesos moleculares de 4555 kDa (24). En el ensayo ELISA tambin se ha utilizado un antgeno de carbohidrato sinttico (tivelosa). Algunos estudios realizados con cerdos indican que el antgeno de tivelosa puede ser tan bueno como el antgeno ES para las pruebas de vigilancia en los cerdos; sin embargo, la sensibilidad del ELISA en el que se utiliza el antgeno sinttico es ms baja que la del ELISA con antgenos ES (4, 18). Se han desarrollado varias preparaciones de antgenos que proporcionan un alto grado de especificidad para la infeccin por Trichinella en cerdos (16). Los antgenos secretores (ES) de la T. spiralis usados en el ensayo ELISA se conservan en todas las especies y genotipos de Trichinella (24), y, por tanto, la infeccin puede detectarse en cerdos o en otros animales que hospedan alguna de las ocho especies

Produccin de antgeno

El diagnstico de la infeccin por Trichinella mediante el ELISA se puede realizar utilizando antgenos del esticosoma recogidos de los productos ES de las larvas de Trichinella en cultivo (16). A efectos de estandarizacin, es recomendable que T. spiralis se utilice para la produccin de antgeno para las pruebas con animales de abasto. Sin embargo, se ha demostrado que el antgeno preparado de cualquier otra especie de la Trichinella puede usarse para la deteccin de anticuerpos en animales infectados independientemente de cul sea la especie que produce la infeccin (20). Los parsitos que van a usarse en la preparacin de antgeno deben ser mantenidos por pases en serie en ratones y ratas.

Para preparar el antgeno que se va a utilizar en los ensayos ELISA (16), se recuperan las larvas de T. spiralis (T-1) en estadio muscular de las canales de ratones de campo o de ratas sin piel ni vsceras mediante la digestin en pepsina al 1% con HCI al 1% a 37oC durante 30 minutos (como se ha descrito anteriormente). Se lavan las larvas (3 veces durante 20 minutos cada vez) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con penicilina (500 unidades/ml) y estreptomicina (500 unidades/ml). Luego se colocan (a una densidad de 5.000 L1/ml) en DMEM suplementado con HEPES (hidroxietilpiperazina N-2, cido etanesulfnico N-2) (10mM), glutamina (2mM), piruvato (1mM) y penicilina (250 unidades/ml) / estreptomicina (250 g/ml) (DMEM completo) a 37C en atmsfera con un 10% de CO2 . El medio de cultivo se recupera despus de 1820 horas, se retiran los vermes mediante filtracin y el fluido se concentra a presin mediante una membrana de retencin de un peso molecular de 5.000 Da. Los antgenos (ES) as recuperados pueden almacenarse congelados durante cortos perodos a 20C o por ms tiempo a 70C; estos antgenos contienen aproximadamente 25 componentes proteicos segn SDS/PAGE (sulfato dodecil de sodio / electroforesis en gel de poliacrilamida), muchos de los cuales admiten la diagnosis del eptopo de antgeno de carbohidrato TSL-1.

La pureza del antgeno es fundamental para la especificidad del ensayo ELISA. Deben seguirse varios pasos para monitorizar el crecimiento de las bacterias, bien sea de forma visual con el microscopio o recubriendo una muestra de medio. Los cultivos que muestren cualquier crecimiento bacteriano deben ser desechados. Las larvas no deberan mantenerse ms all de 18 horas; el deterioro de las lombrices despus de este tiempo contribuye al escape de antgenos somticos que reducen la especificidad de la prueba. Los antgenos producidos en la forma descrita deberan tener una gama (ratio) de absorbancia 280:260 nm de >1.0. Los antgenos obtenidos a partir del mantenimiento in-vitro de las larvas de la Trichinella deben ensayarse frente a un panel de sueros positivos y negativos conocidos antes de usarse.

Procedimiento de la prueba

Ms adelante se expone un ejemplo de un ensayo ELISA para detectar la infeccin por Trichinella en cerdos. Es esencial que todos los reactivos usados en el ensayo estn estandarizados para una concentracin ptima con el fin de obtener resultados fiables. Los valores tpicos se indican en el ejemplo.



i) Se cubre la placa de microtitulacin de 96 pocillos con 100 l de antgenos ES de T. spiralis diluidos a 5 g/ml en agua tamponada (50 mM de carbonato/bicarbonato tamponado, pH 9,6). Se realiza la cobertura durante 60 minutos a 37C o toda la noche a 4C.

ii) Se lavan tres veces los pocillos cubiertos con antgeno en tampn de lavado que contenga 50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% de leche desntada en polvo y 1,0% de Triton X-100. Despus de cada lavado, las placas se deben secar.

iii) Se diluye a 1/50 o 1/100 suero de cerdo en tampn de lavado. Las fuentes alternativas de anticuerpos que pueden usarse en lugar de los sueros son, entre otros, la sangre total o los fluidos de tejidos a una dilucin de 1/5 o 1/10 (23). Se agregan 100 l de suero diluido a los pocillos cubiertos con antgeno. Debe usarse en cada placa una muestra de suero positivo conocida y una muestra de suero negativo conocida con una dilucin idntica a la de los sueros de la prueba. Se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.

iv) Se lavan tres veces los pocillos como en el apartado ii.

v) Se aade a cada pocillo 100 microlitros de una IgG (inmunoglobulina G) anticerdo obtenida en conejo, purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa a una dilucin apropiada en tampn de lavado, por ejemplo, una dilucin 1/1.000 de IgG de conejo anticerdo (0,1 mg/ml) producido por Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA. Tras aadir el segundo anticuerpo, se incuban las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.

vi) Se lavan tres veces los pocillos como en el apartado (ii) y se enjuagan una vez con agua destilada.

vii) Se aaden 100 l de un sustrato de peroxidasa apropiado (por ejemplo, cido aminosaliclico-5 [0,8 mg/ml] con 0,005% de hidrgeno de perxido, pH 5,66,0).

viii) Despus de 515 minutos, se leen las placas para ver la densidad del color a 450 nm en un lector de microtitulacin automtico. Los valores obtenidos de los ensayos ELISA, que son cuatro veces superiores a los de los controles agrupados de suero normal, se consideran positivos. Los valores tres veces mayores que los normales se consideran sospechosos.

Existen adaptaciones comerciales del ensayo ELISA. El fabricante debe validar el equipo antes de la concesin de la licencia y el usuario debe tambin evaluar el funcionamiento del equipo antes de su uso mediante la utilizacin de muestras de referencia positivas y negativas.

La prueba debe aplicarse en un ambiente en el que se cumplan las normas de gestin de calidad aceptadas internacionalmente, como la ISO 17025.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO.

No existen vacunas frente a la triquinelosis en los animales de abasto ni en los de caza. No existen productos biolgicos establecidos para la deteccin directa del parsito. Para los mtodos inmunolgicos aplicables, se recomiendan los antgenos TSL-1, a fin de maximizar la especificidad de la prueba. Estos antgenos pueden obtenerse como productos ES recuperados mediante el mantenimiento de las larvas del msculo in-vitro como se ha descrito anteriormente.

REFERENCIAS

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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la triquinelosis (vase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

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