Tuberkulose i allmennpraksis

DNLF kurs Diakonhjemmet November 12 2015

Tone Tønjum

Avdeling for mikrobiologi

Mycobacterium tuberculosis og tuberkulose Oversikt

• Tuberkulose (TB) – Epidemiologi, klinikk,

patogenese

• M. tuberculosis-komplekset og NTM

• Diagnostikk – agens, resistens,

epidemiologi

• TB behandling

• Diagnostikk av vertsrespons ved TB

Mykobakteriediagnostikk -

OUS-RH

TB-utfordringen

De 22 mest TB-belastede land

1/3 av verdens befolkning er infisert med Mtb

Global TB insides Drug-resistant Mtb

1/3 av verdens befolkning er kolonisert med Mtb Data from WHO, 2014

TB-utfordringen

• WHO anslag for 2020:

– 1 milliard personer nylig infisert

– 200 millioner TB-tilfeller

– 35 millioner dødsfall

1.3 millioner dødsfall

8.6 million nye TB tilfeller

2.0 milliarder PPD+ individer

Den globale TB-sitasjonen!

TB-insidensen er nå fallende…!

Insidens-ratene fra

2010-11 faller i alle

deler av verden,

fallet var 0.5% i

Øst-Europa,

2.0% I Sørøst-Asia,

3.1% i Afrika, 3

.8% i Amerikas og

8.5% per år i Europa

7 Men: MDR- og –XDR-TB er økende…!!

TB i Norge • Jevn stigning i forekomst av tuberkulose i Norge, fra 201 tilfeller i

1996 til 405 tilfeller i 2014

• Insidensen blant norskfødte var i 2014 blant de laveste i verden,

på under ett tilfelle per 100 000 innbyggere

8

Årsaken til TB

Mycobacterium tuberculosis:

Medlem av Mtb-komplekset

Ikke-bevegelig og ikke-sporulerende

staver (1-10 μm i lengde, 0.2-0.6 μm i

bredde)

En aerob bakterie

Deler seg hver 16-20 time (svært

langsomtvoksende)

Klassifisert som Gram-positiv, men er

vanskelig å farge pga svært høyt lipid- og

mykolsyre-innhold i celleveggen

Siden MTB beholder visse farger selv

etter syrebehandling, kalles de syrefaste

bakterier

Tuberkulose kan forårsakes av andre medlemmer av

M. tuberculosis-komplekset enn Mtb

• Mycobacterium bovis

• Mycobacterium africanum

• Mycobacterium microti

• M. canettii: mindre virulent enn den klassiske

M. tuberculosis H37Rv

• M. caprae: en art som finnes primært hos spanske geiter, samt hos mennesker

• M. pinnipedii: gir TB hos marine vertsdyr

Tuberkulosens historie

• 1679, Sylvius identifiserte “tuberkelen” som

en konsistent og karakteristisk forandring i

lungene, og beskrev progresjonen til

abscesser og kaviteter

• 1720, Benjamin Marten foreslo en ny teori for

årsaken til TB - “vidunderlige bittesmå

levende skapninger”

Tuberkulosens historie

1882 Robert Koch

oppdaget en fargemetode

for å påvise

Mycobacterium

tuberculosis

mikroskopisk

1874 Armauer-Hansen:

Mycobacterium leprae

Tuberkulosens historie

• 1895, Roentgen oppdaget røntgenstråling/x-ray

• 1921, BCG vaksine

• 1944, streptomycin og para-aminosalicylic

acid (PAS) ble utviklet

• 1950-1960/70-tallet, isoniazid, rifampicin og

andre anti-TB medikamenter utviklet develped

• 1980 - HIV

• 1990-tallet - DOTS

Aerosolspredning fra pasient med TB

Aerosoldråpnene må ha riktig størrelse (1-5 um) for å nå alveolene

Tuberkulose – overføring av smitte

• Høy sittsomhet

• Luftveiene er hovedinnfallsport

• Oftest overført via luft pga hoste, nysing og tale

• Tre tusen aerosoldråper spres ved 1 host, 1 minutt sang og 5

minutters samtale

Klassiske symptomer lungetuberkulose utgjør 85% av tilfellene

• Langvarig hoste (over tre uker), etter

hvert med oppspytt

• Vekttap

• Nedsatt allmenntilstand

• Feber

• Nattesvette

• Sjeldnere symptomer er:

Brystsmerte, tung pust,

blodtilblandet oppspytt

Tuberkulose - klinikk

Ekstrapulmonal TB TB-lymfadenitt Hud-TB Potts sykdom

TB peritonitt

og lever-TB Intestinal TB

Tuberkulose - klinikk

Ekstrapulmonal TB

Meninger Extrapulmonal TB 15%

Hjerne Ryggmarg/Ryggsøyle

Binyre-TB

Testes TB

Tuberkulose - klinikk

Ekstrapulmonal TB TB endometritt Ovarie-TB

19

Vandal, O. H., et al. (2009). J. Bact.191:4714-4721 Pieters, J. (2008). Cell Host and Microbe 3:399-407

TB patogenese

Mycobacterium tuberculosis: patogenese og latens

FEMS Microbiology Reviews 36, 514-532, 2012

Tuberkulose – utfall av infeksjon

Faktorer som kan bidra til progresjon av

latent infeksjon til aktiv TB sykdom omfatter:

– Immunstatus

– HIV infeksjon

– Genetikk

– Miljøfaktorer

– Ernæring, alkohol

– Underliggende medisinske vertsforhold

– Bakterielle virulensfaktorer – lite kartlagt

Diagnostikk

Prøvetaking ved mistanke om TB

Rekvirer dir mikro, PCR og dyrkning

NB! Utfylling av rekvisisjon!

• Lungetuberkulose: Luftveisprøver

(larynksaspirat, ekspektorat, BAL): 3X

• Ekstrapulmonal TB:

– 6X uriner

– 10 ml spinalvæske

– Prøver fra lokale lokalisasjoner: glandler,

halscyster, biopsier, etc

http://www.fhi.no/publikasjoner-og-haandboker/tuberkuloseveilederen

Diagnostikk

Flyt-

skjema

TB: Den diagnostiske

utfordringen

• Mål: Høy sensitivitet og spesifisitet i

både direkte påvisning og dyrkning!

25

Klinisk prøvemateriale TB-lab Dekontaminasjon +/-

Kultur

BACTEC MGIT 960

0.8 ml Panta + 0.5 ml prøve

Tumor colli: + FOS 0.5 ml

Tumor colli/sår: + 30oC

Kultur pos:

Ring svar

Identifikasjon, MSIS

Direkte påvisning

- Mikroskopi: Auraminfarging

Auramin pos: Ring svar,

Mtb PCR, meld MSIS

- Mtb PCR for identifikasjon

PCR pos: Ring svar

- Mtb Rifampicinresistens/ rpoB,

RpoB pos/neg: Ring svar

Resistensbestemmelse

-Rifampicin-resistens (PCR sequencing rpoB)

Ring svar

- Kultur Mtb res.best. Ring svar

NB! Meld multiresistente stammer

(samtidig Rifampicin og Isoniazid resistens)

Direkte påvisning ved mikroskopi

• Auramin-farging

• Ziehl-Neelsen-farging

27

Direkte påvisning ved PCR:

Cobas TaqMan MTB Test

Sensitivitet Taqman:

Luftveisprøver: 98.9% (Direkte mikro neg: 98.1%)

Ekstrapulmonale prøver: 88.9% (Direkte mikro neg: 85.4%)

28

Rifampicin-resistens som

surrogat-markør for MDR- og XDR-Mtb

• RIF-resistens som mono-resistens er ikke

vanlig (5-15%)

• 80-95% av RIF-resistente stammer er også

resistente overfor INH

29

Genetikk ved Mtb rifampicin-resistens

30

GenXpert MTB/RIF:

direkte påvisning av Mtb og

rifampicin-resistens

Boehme et al NEJM 2010

Helb et al., JCM 48:29-237, 2010

Blakemore et al., JCM 48:2495-2501, 2010 31

GeneXpert: Enkel prøvepreparering

2. Add 1.5ml Sample

Reagent to 0.5ml deposit 3. Shake then

stand10 min.

1. Inoculate media and prepare

smear from deposit

5. Transfer the

2ml to cartridge

Begin Test…

4. Shake then stand

further 5 minutes

32

PAGE | 33

Molecular

Beacon

Target

Hybrid

GeneXpert MTB/RIF molecular beacon-testen

5 Probes bind to wildtype

Probes do not bind to mutant sequence

6 fluorescent dyes detected simultaneously

5’- 3’-

-3’ -5’

A

B

C D

E rpoB gene

33

Mtb GenXpert sensitivitet/spesifisitet

• Sensivity in smear positive, culture positive (S+C+) was 100%

(275/275)

• Sensitivity in smear negative, culture positive (S-C+) was

90.9% (70/77)

• Specificity of the assay was 98.3%

• Sensitivity observed for rifampicin resistance was 96.7%

• Specificity observed for rifampicin resistance was 98.6%

Smear

Positive

Culture

Positive

Culture

Negative

Culture

Positive

Xpert

Positive70 5 275

Xpert

Negative7 289 0

Smear negative

34

GenXpert TB/Rif

• Resultater like i alle geografiske områder

• Mulig begrensning: Elektrisitet tilgjengelig,

høy temperature

• Høyere sensitivitet enn mikroskopi

• Xpert MTB/RIF – kort opptrening ila 2-3 dager

– Ziehl-Neelsen opptrening tar 2 uker

• Xpert MTB/RIF – kort hands-on tid < 15 minutter

35

PAGE | 36

Xpert MTB/RIF: biosafety levels required

Ikke nødvendig med laboratorium med sikkerhetsbenk (CDC) 36

Dyrkning av mykobakterier Löwenstein-Jenssen fast

medium:eggeplommer m.m.

Høy kompleksitet

Deteksjon ved visuell

inspeksjon

BACTEC MGIT 960

medMiddlebrook liquid 7H9

medium

Deteksjon av fluorescence

ved

oksygenreduksjon/forbruk

BACTEC MGIT 960

• 1. Helautomatisert dyrkningssystem for

mykobakterier

• 2. Inkubering og påvisning/deteksjon i det

samme systemet

• 3. Gulvmodell med 3 skuffer med plass til 320

MGIT-rør i hver skuff. Total kapasitet 960 rør;

8000 kulturer hvert år

• 5. Fluorescens-basert teknologi: Oksygen

forbruk fluorescens

Resistensbestemmelse

Gjelder Mtb, sjelden NTM

Førstelinje-medikamenter:

Rifampicin, isoniazid, pyrazinamid,

etambutol, streptomycin – testes i TB rutinelab

Andrelinje-medikamenter:

Fluoroquinoloner, capreomycin,

kanamycin, amikacin, .. Bedaquiline..

Mer underveis.. – testes TB referanselab

Resistensbestemmelse

• Löwensten-

Jenssen’s medium

(LJ)

BACTEC MGIT

960

Økt deteksjon og hurtigere

vekst av mykobakterier ved

tilsetning av næringscocktail

Fastidious Organism Supplement (FOS)

0

10

20

30

40

50

60

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73

No supplements

Supplements added

Time

until

growth

Specimen no.

Supplements added

No supplements

1. 22.7% høyere sensitivitet og signifikant kortere tid

nødvendig for vekst av M. tuberculosis isolater når

cocktail-supplement tilsatt, økt sensitivitet 38% for NTM

2. 4-7 dager kortere dyrkningstid

TB-diagnostikk - utfordringer

• Oppdaterte metoder høy sensitivitet

og spesifisitet, også i direkte påvisning

• Optimal logistikk rask diagnostikk

• Hyppig telefonbeskjeder og foreløpig

elektronisk svar god og rask service

All antibiotikaresistens hos

mykobakterier skyldes

punktmutasjoner eller andre

endringer i kromosomale gener

Gener som kan kode for

Mtb resistensutvikling • Rifampicin: rpoB (RNA polymerase B subunit)

• Isoniazid: katG (katalase-peroxidase), inhA

(enoyl-acyl carrier protein reductase), aphC

(alkyl-hydroperoxide reductase), kasA (keto-acyl

synthase), ndh (NADH dehydrogenase), etc.

• Pyrazinamid: pncA(pyrazinamidase)

• Streptomycin: rpsL (S12), rrs (16S rDNA)

• Ethambutol: embB (arabinosyl transferase)

• Kinoloner: gyrA, gyrB (DNA gyraser)

• Flere..

TB molekulær epidemiologi

Metoder

• IS6110 Spoligotyping

• Minisatelitter: Variable Number Tandem

Repeats (VNTR)/ Mycobacterial

Interspersed Repetitive Units (MIRU)

• Multiple Locus VNTR (Variable Number of

Tandem Repeats) Analysis (MLVA):

basert på polymorfi i tandem-repeterte

DNA sekvenser

IS6110-basert fingerprinting: Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP av

# IS6110-kopier i TB-genomer (0 - 25)

Mest diskriminerende metode

Tidkrevende metode (2-4 uker)

Vanskelig å sammenligne store datasett

PCR-RFLP Hemi-nested Inverse PCR (HIP) RAPD 1353

603

310

Spoligotyping: Spacer Oligonucleotide Typing

Direkte repeterte (DR) elementer 36bp, frekvens varierer

Bruker primere for DR til å amplifisere flankerende ikke-repetitive

spacer-sekvenser 34-41bp Identifiserer spacerne ved hybridisering

Mindre diskriminerende enn IS6110 typing … MEN...

Raskere å utføre, kortere turnaround time

Digitale resultater, muliggjør sammenligning fra stamme til stamme

Kan gjøres direkte, krever ikke kultur

Variable Number of Tandem Repeats

Measures variability in 6 (av 24) loci

Mycobacterial Interspersed Repetitive Units

Measures variability in 12 loci

Molekylær epidemiologi kan spore utbrudd:

Spoligotyping & MIRU-VNTR

IS 6110 RFLP

Current gold standard

MIRU-VNTR

Up to DR 24 loci in genome

Nye utfordringer innen TB

• Antibiotikaresistens: MDR XDR

• Immun-evasjon & tilpasning /

adaptasjon

• Økt virulens / overlevelse

M. tuberculosis genom-karakteristika

• 4,411,532 basepar

• 3,959 ORFs

• 90.80% ORFs encodes proteins

• G-C content of 65.6 %

• Relatively constant G-C content

• 1 rRNA operon

Cole et al., Nature 393, 537-44, 1998

Lineage 7; New lineage

Dance-academy outbreak;

Beijing strains

200 Mtb genomes, 43000 polymorphic sites

Mycobacterium tuberculosis

Genomsekvensering: short-term & long-term evolution

Tuberkulose - behandling

WHOs anbefaling:

– Kombinasjonsbehandling:

– Isoniazid

– Rifampicin

– Pyrazinamide

– evt ethambutol, streptomycin

NB! Direkte observert terapi!

Standard medikamentregime

ved tuberkulose

• Fortsettelsesfase

4 måneder

• Isoniazid; Rifampicin

• Intensivfase

2 måneder

• Isoniazid;

Rifampicin;

Pyrazinamid;

Etambutol

Standard medikamentregime

ved tuberkulose

Medikament

(Forkortelse)

Dosering

Daglig behandling

Dosering

Behandling 3x/uke

Isoniazid (H) 5 mg/kg* (Maks 300 mg ) 10–15 mg/kg (Maks 900 mg)

Rifampicin (R) 10 mg/kg (Maks 600 mg) 10 mg/kg (Maks 600 mg)

Pyrazinamid (Z) 25 mg/kg (Maks 2 g) 35 mg/kg (Maks 3 g)

Etambutol (E) 15 mg/kg** (Maks 1,6 g) 30 mg/kg (Maks 2,4 g )

Streptomycin (S) 15 mg/kg (Maks 1,0 g) 15 mg/kg (Maks 1,5 g)

Dosering: En gang daglig, evt til fettrikt måltid Evt supplere med pyridoksin 40 mg daglig, gis til pasienter i dårlig ernæringsstatus, gravide og

ammende og ved økt risiko for nevropati for å forebygge nevrologiske bivirkninger av isoniazid

TB behandling

Førstelinje-medikamenter:

Rifampicin, isoniazid, pyrazinamide,

ethambutol, streptomycin

Andrelinje-medikamenter:

Fluoroquinolonex, capreomycin,

kanamycin, amikacin, .. Bedaquiline..

Behov for flere..

Trussel: MDR-Mtb XDR Mtb

Tidspunkt Blodprøver Lungerøntgen/

skjermbilde Andre

tester

Tuberkulose-undersøkelse

av luftveisprøve

Ved behandlingsstart hemoglobin (Hb), leukocytter

(LPK), SR, CRP ASAT,

ALAT, bilirubin, urinsyre,

kreatinin, urinstoff, hivtest,

ev.hepatitt B og hepatitt C

Lungerøntgen(hvis

ikke nylig tatt), ev.

supplert med CT

thorax

direkte mikroskopi, PCR og

dyrkning

Etter 2 uker Hb, LPK, SR, CRP, ASAT,

ALAT, bilirubin, kreatinin,

urinstoff, trombocytter

direkte mikroskopi

Etter 2 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT,

ALAT, bilirubin, kreatinin,

urinstoff, trombocytter

Lungerøntgen direkte mikroskopi og

dyrkning

Etter 4 måneder Hb, LPK, SR, CRP ASAT,

ALAT, bilirubin, kreatinin,

urinstoff, trombocytter

direkte mikroskopi og

dyrkning

Ved opphør av

behandling, vanligvis

etter 6 måneder

Hb, LPK, SR, CRP, ASAT,

ALAT, bilirubin, kreatinin,

urinstoff, trombocytter

Lungerøntgen direkte mikroskopi og

dyrkning

Prøver og undersøkelser som utføres ved

oppfølging av TB- behandling

Tuberkulintest: Mantoux

58

Mantoux-metoden med standard

Purified Protein Derivate:

PPD med styrke 2 tuberkulinenheter (TU)

Tuberkulinreaksjonen: intrakutan injeksjon

en typisk type IV-reaksjon =

forsinket hypersensitivitet /

cellemediert immunitet:

Makrofager og Th1-lymfocytter

Mantoux - avlesning

72 t - - 16-18 mm

59

Interferon gamma release assays (IGRA)

Tilgjengelige tester

Quantiferon TB Gold

(In Tube)-ELISA: Utføres ved alle regionale

mikrobiologiske laboratorier

ELISpot - Utføres ved referanselaboratoriet, FHI

Steps to T Cell Activation: T cells recognize antigen not in its natural form; rather the antigen is presented

by reference structures encoded by the major..T cell groups. Cell Host &amp; Microbe, Volume 4, Issue 3, 2008, 219 - 228

TB Aktivering vs latens

Immunologisk hukommelse: Tidligere sensitiviserte celler

Immunologisk diagnostikk: Interferon Gamma Release Assay (IGRA)

Prinsipper

Presentasjon av myko antigen

PPD

Mantoux hudtest: måler indurasjon/erytem

In vitro blodtest: Måler IFNgamma-produksjon

IGRA Antigen: ESAT-6,

CFP-10. TB7.7

62

Immmunologiske prinsipper

TB IGRA

Mtb antigenene ESAT-6, CFP-10, and

TB7.7 finnes i:

• M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum

• 4 atypiske mykobakteriearter/NTM:

M. kansasii, M. szulgai, M. flavescens,

M. marinum

• Finnes ikke i BCG

Kilde: The Lancet, 2000

TB IGRA – Tester Source: Nature Clinical Practice Rheumatology (2007)

• QuantiFERON® TB-GOLD (QFT) måler nivået av frigjort IFN-g i

plasma med ELISA-teknikk (enzyme linked immunosorbent assay)

etter stimulering og inkubering av fullblod over natt. ESAT-6 og CFP-

10 er tilsatt direkte i bunnen av tapperøret. ELISA-prosedyren kan

gjøres neste dag, eller plasma kan lagres i rørene i opptil 8 uker på

kjøl eller 3 måneder i -20 °C frys før analyse analyse av OD-verdier

og kalkulering av resultater minus neg kontroll IU/ml verdien

IFN-gamma = 0.35 IU/ml anses som sannsynlig tuberkuloseinfeksjon

• T- SPOT-TB® er en ELISPOT basert test som detekterer IFN-g-

produserende T celler (spots) etter antigen-stimulering av et definert

antall mononucleære celler isolert fra blod. mer sensitiv enn

tuberkulintest og QFT for individer med immunsvikt, inkludert lavt CD4

tall. Stimulering av celler og inkubering over natt må gjøres samme

dag som prøven tas, og ELISPOT prosedyren må gjøres dagen etter.

Med T-Cell XtendTM kan imidlertid blodet transporteres eller lagres

ved romtemperatur i opptil 32 timer før celler isoleres og testen utføres

64

Quantiferon i praksis

• Spesielle prøvetakingsglass:

3 glass, 1 ml i hver

• Forbehandling av prøven

–Inkubering(37oC, 16-24t)

–Sentrifugeres før forsendelse

• Positiv og negativ kontroll

IGRA

Sensitivitet og spesifisitet

• Sensitivitet: 75-97%

• Spesifisitet: 90-100%

God ”spesifisitet”

Usikker sensitivitet, særlig i spesielle pasientgrupper:

• Små barn

• Pasienter med immunsvikt

• Mulig TB-smitte - lang tid tilbake

• Usikker negativ prediktiv verdi

Pai M. Expert Rev. Mol. Diagn. 2006; 6 (3), p 413-422

Pai M., Ann of Int Med 2008

Diagnostikk av latent

tuberkulose: Hvorfor? • Identifisere de som skal ha profylaktisk

behandling

• Reaktivering - viktigste årsak til ikke-

importert sykdom i områder med lav

forekomst av TB

• Ved positiv Mantoux for å utelukke falsk

positiv test

• Ved negativ Mantoux der mistanke om falsk

negativ test pga anergi

Når skal IGRA-tester anvendes?

• Mantoux er fortsatt første test

• Supplement til tuberkulin hudtest utført på

risikogrupper

• –Ved positiv tuberkulintest for å utelukke

falsk positiv test (NTM/BCG-vaksine)

• –Ved negativ tuberkulintest som mistenkes

å være falsk negativ på grunn av T celle-

anergi

• Pasienter som skal tilbys forebyggende

behandling dersom testen er positiv

Spesielle grupper

• Utredning av tuberkulosesmitte ved

svekket immunitet

– Små barn 0-5 år

– Immunsvekkede

– HIV

• Før oppstart immunosuppressiv

behandling

• Aktiv tuberkulose

• Helsearbeidere

• Asylsøkere

IGRA: Oppsummering

• Ingen gullstandard!

• Resultat må sees i sammenheng med:

• –Smitterisiko

• –Klinisk vurdering

• –Øvrig diagnostikk

• –Alder og generell immunstatus

• Nyttig hos definerte risikogrupper

• Best egnet i lavendemisk land med BCG

vaksinasjon

Behandling av latent TB

• Behandling bør tilbys med mindre det er

tungtveiende grunner for ikke å gjøre

det

• Behandling bør vurderes, men risiko for

bivirkninger må vurderes nøye

• Behandling er vanligvis ikke indisert,

med mindre det foreligger annen risiko

Stopp TB