TUGAS TERSTRUKTURBIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Agrobacterium tumefaciens, Gen Penanda (antibiotic resistance) Gen Pelapor (GUS)

Oleh:Nama: Firmansyah CapasaputraNIM: A1L112011Prodi: Agroteknologi Paralel

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS PERTANIANPURWOKERTO2014Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami,A. tumefaciensdapat menginfeksi tanamandikotiledonmelalui bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor). Bakteri yamg tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Bakteri ini menyerang tanaman dikotiledon serta tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 1,0 m sampai 1,5 3,0 m, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan bakteri yangmudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagelaperitrichous serta merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah 25-28C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan takberpigmen.Agrobacterium diisolasi dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi antara tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens.Secara singkat mekanisme infeksi A. tumefaciens dimulai dengan tanaman luka dan bakteri A. tumefaciens menginfeksi. Sel A. tumefaciens menempel pada sel tanaman. Selanjutnya T-DNA ditransfer dari Ti-plasmid, masuk ke sel tanaman dan terintegrasi pada kromosom tanaman. T-DNA yang disisipkan mengandung gen-gen yang menyandikan senyawa opine, yaitu senyawa yang merupakan sumber karbon dan nitrogen bakteri tersebut, dan gen gen yang menyandikan enzim untuk menyintesis auksin dan sitokinin untuk mendorong pembelahan sel inang yang menyebabkan tumbuh tumor sehingga tanaman terkena crown gall.

Kemampuan bakteri Agrobacterium untuk mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman dan T-DNA tersebut terintegrasi pada kromosom tanaman, digunakan sebagai alat untuk memasukkan dan mengintegrasikan gen yang diinginkan manusia untuk terekspresi di tanaman. Hal ini dimungkinkan dengan memodifikasi T-DNA Agrobacterium sehingga sel tanaman yang terinfeksi tidak menjadi sel tumor yaitu dengan menghilangkan oncogenes dan menambahkan gen yang dikehendaki pada T-DNA, atau menambahkan plasmid yang mengandung gen yang dikehendaki ke dalam sel Agrobacterium yang telah dimodifikasi Ti-plasmidnya.A. tumafaciens mengandung sebuah Ti-plasmid dan kromosom. Sebuah Ti-plasmid bertanggung jawab pada proses onkogenesitas A. tumefaciens. Namun, Ti-plasmid sendiri tidak mampu menyebabkan terjadinya transformasi pada tanaman. Gen-gen pada kromosom dari A. tumifaciens juga menyumbangkan fungsi lain yang berguna untuk onkogenesitas in planta. Ti-Plasmid A. tumefaciens merupakan plasmid yang berukuran besar 200-250 kb dengan berat molekul 1,2 x108 dan bereplikasi di dalam sel secara mandiri. Bagian-bagian Ti Plasmid adalah T-DNA yang mengandung Left border, Gen auksin synthase, Gen sitokinin synthase, Gen opine synthase, dan Righ border, Gen virulensi yang berfungsi untuk mentransfer T-DNA ke genom inang, Gen replikasi, Gen konyugasi transfer, Gen opine katabolisme.

Sebuah wilayah T-DNA (DNA yang ditransfer) diduplikasi dan ditransfer ke sel tanaman. Walaupun T-DNA merupakan elemen yang mudah berpindah, T-DNA bukanlah elemen yang dapat diubah urutannya, karena T-DNA sendiri tidak mengkode produk yang memediasi perpindahannya. Sebagai gantinya, sebuah komponen kedua, yaitu wilayah virulen (vir) pada Ti-plasmid, menyediakan sebagian besar produk trans-acting untuk transit T-DNA. Daerah virulen (vir) berukuran 35 kb, yang terdiri dari tujuh lokus utama (virA,virB,virC, virD, virE, virF, virG). Protein produk dari gen ini, disebut protein virulen (Vir), yang respon terhadap senyawa fenolik yang dikeluarkan oleh tanaman berkayu untuk menghasilkan copy T-DNA dan sebagai mediasi T-DNA ke dalam sel inang. Proses transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel tanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari expresi gen-gen virulen untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen. Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal yang disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini dimediasi oleh produk dari gen virD1 dan virD2 yang berfungsi memotong T-DNA di bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5 end dari T-strand dan membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti sel tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman inang.

Gambar. Ilustrasi transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens kedalam sel tanaman

Penanda GenetikPenanda genetik disebut juga dengan penanda, marker, marka, atau markah. Penanda genetik merupakan ekspresi pada individu yang terlihat oleh mata atau terdeteksi dengan alat tertentu, yang menunjukkan dengan pasti genotipe suatu individu. Penanda genetik dapat diketahui lokasinya pada kromosom. Penanda yang lokasinya dapat diketahui pada kromosom memberikan informasi bagi sekuensing dan perbandingan antar genotipe, meskipun seringkali tidak praktis dalam aplikasinya. Penanda genetik yang sering digunakan Penanda selektif (selectable marker) dan Penanda analitik (analytical marker).Penanda selektif adalah penanda genetik yang dapat membedakan antara sel/jaringan yang mengalami transformasi atau tidak. Cara membedakan antara sel yang tertransformasi sesuai dengan keinginan kita (cell of interest) adalah dengan menumbuhkannya dalam media atau kondisi selektif yang tidak memungkinkan sel yang tidak mengalami transformasi untuk tumbuh. Macam Penanda Selektif adalah: Penanda selektif yang dapat divisualisasi :a) Penanda HistologisDapat menghasilkan penampakan yang dapat dilihat secara visual pada sel/jaringan tertentu. Macam penanda hitologis adalah Gen GUS, Gen lacZ yang berasal dari Escherichia coli, Luciferase, dan GFP (Green Fluorescent Protein).b) Penanda Morfologis Penanda morfologis adalah penanda genetik yang jika diekspresikan dapat menyebabkan perubahan morfologis pada jaringan tanaman yang ditransformasi. c) Penanda Pigmentasi Penanda pigmentasi adalah penanda genetik yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan warna pada tanaman yang ditransformasi. Penanda yang dapat menyebabkan kematiana) Penanda resistensi terhadap antibiotik atau herbisidaResistensi tersebut dapat dilakukan dengan salah satu mekanisme berikut:1. Detoksifikasi dengan menggunakan modifikasi enzimatis2. Pengurangan afinitas suatu target terhadap agensia selektif3. Ekspresi berlebih suatu target tipe alamib) Penanda Auksotrofik (PA)PA adalah penanda berupa mutasi pada salah satu atau beberapa gen yang terlibat dalam jalur sintesis metabolit tertentu, misalnya sintesis asam amino dan sintesis nukleotida. Dalam hal ini, tanaman yang akan ditransformasi berupa mutan tanaman pada salah satu atau beberapa gen sintesis metabolit tersebut. Penanda analitik, adalah penanda yang didasarkan pada pengujian atau analisis terhadap ekspresi gen yang dapat dikuantitasi. Penanda analitik dapat dilakukan in vitro dengan cara:a. Uji enzimatik, dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri, fluorometri atau luminometri.b. Uji aktivitas protein pada gel, adalah metode analisis suatu enzim dengan mengukur aktivitas pita protein enzim yang muncul pada suatu gel native (tidak mengalami perlakuan denaturasi). c. Uji imunokimia, uji ini untuk menganalisa protein yang tidak dapat diekspresikan pada tanaman transgenik dengan menggunakan antibodi terhadap protein tersebut, misalnya dengan teknik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) yang dimana protein-protein yang disintesis pada suatu jaringan tanaman diekstraksi kemudian direaksikan dengan antibodi terhadap protein asing (antigen) yang menjadi target analisis, atau dengan teknik immunoblotting.

Gen GUSGen GUS merupakan gen penanda yang mengkode sintesis enzim -Glucoronidase. Gen GUS banyak digunakan sebagai reporter gene (gen penanda) dalam transformasi pada tanaman. Salah satu sifat gen reporter yang dikehendaki oleh para peneliti adalah ekspresinya cepat dan mudah dideteksi. Ekspresi gen Gus dapat dideteksi dengan substrat fluorogenic dan chromogenic. X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucoronidase) adalah substrat chromogenic yang sangat efisien untuk lokalisasi histokimia aktivitas -glucoronidase dalam jaringan dan sel, memberikan presipitat biru (spot biru) pada tempat terdapatnya aktivitas enzima tersebut.Konstruksi gen GUS mengadung sekuen gen nptII yang menyandi terbentuknya enzim neomicyne phosphotransferase, sehingga selain sebagai gen penanda, konstruksi gen GUS juga berfungsi sebagai penyeleksi. Aktifitas nptII akan menyebabkan eksplan tebu tahan terhadap antibiotik yang tergolong aminoglikosida seperti genecin dan kanamisin yang terdapat di dalam media seleksi. Eksplan yang berhasil ditransformasi konstruksi gen GUS ini akan menunjukkan ketahanan terhadap antibiotik tersebut ketika ditanam di dalam media seleksi.

Gambar. GUS assay pada T-DNA tagging: a. biji; b. daun; c. bagian organ bunga

DAFTAR PUSTAKAAnanda, Rr. W. U. 2004. Studi Transformasi pada Tebu dengan Perantara Agrobacterium Tumafaciens GV2260 (Pma) serta Regenerasi Kalus Transgenik.(Tesis). Sekolah Pascasarjana. IPB.

Anonymousa. 2012. Transformasi gen oleh bacteri agrobacterium tumefaciens. http:// anggunhannes. blogspot.com /2011/ 05/ transformasi-gen-oleh-bakteri.html. Diakses pada tanggal 13 Oktober 2014

Dwidjoseputro. 2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang.

Ogras T.T., and Gozukirmizi N. 1999. Expression And Inheritance of GUS Gene in Transgenic Tobacco Plants. Tr. J. of Botany. 23: 297-302.

Zulfahmi. 2013. Penanda Dna Untuk Analisis Genetik Tanaman (DNA Markers for Plants Genetic Analysis). Jurnal Agroteknologi. Vol. 3, No. 2: 41-52.