Tumeurs solides  ; outils diagnostics en 2015 "

Nathalie Auger!

Laboratoire de cytogénétique

15 janvier"

2015

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Introduction"❖ Tumeur solide par opposition au tumeur se développant

dans les liquides (cellules circulantes) ""

❖ Principaux types de tumeurs solides"à Tumeurs épithéliales : carcinomes, adénocarcinomes"à Tumeurs mésenchymateuses (mésoderme) : tumeurs

bénignes (lipome) ou malignes (sarcomes) "• rares chez l’adulte, majoritaires chez l’enfant "• anomalies chromosomiques spécifiques : signatures

cytogénétiques. "à Tumeurs neuro ectodermiques : cutanées et du systèmes

nerveux "à Tumeurs séreuses

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Technique d’étude : caryotype❖ Prélèvements : "

à cellules vivantes cytoponction ou fragments biopsiques ou d’exèrèse."à Ils doivent être stériles (travail sous hotte…pb tube digestif)""

❖ Culture courte (18 à 72H) en suspension"à tumeurs peu cohésives (lymphomes, tumeurs à cellules rondes, tumeurs.

embryonnaires de l ’enfant…)"à dissociation mécanique, culture en suspension, récolte en 24 à 48 h."à Utilisation de stimulant (PHA, peptides C +IL2, 72H) pour lymphomes""

❖ Culture en monocouche longue jusqu’à croissance primaire ou premier passage (5-15jrs)"à tumeurs cohésives (tumeurs à cellules fusiformes, sarcomes de l’adulte,

carcinomes), dépendantes de l’adhésion"" ! dissociation enzymatique (collagénase), culture en mono-couche, récolte

après le 1er passage (5-15 jours).

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Technique d’étude : caryotype❖ Anomalie si (index mitotique faible) :"

à Une seule cellule avec une anomalie connue, caractéristique "à Deux cellules avec la même anomalie.""

❖ Différents types d’anomalies"à Ploïdie (d’haploïde à polyploïde- pentaploïde et plus)""

à Perte (délétion ou monosomie), gain (trisomie ou plus, duplication) et amplification, translocation ou inversion spécifique d’un type histologique""

à hétérogénéité entre cellules d'une même tumeur et entre tumeurs d'un même type histologique. Caractère polyclonal ""

à Le nombre d’anomalie n’est pas corrélé à l’agressivité

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Technique d’étude : caryotype"

❖ Problèmes du caryotype"à d'ordre technique : spécimens nécrotiques et/ou infectés, index

mitotique bas,""

à Pb d’interprétation : "• multiplicité des anomalies souvent non identifiables, "• cellules à caryotype normal : cellules tumorales ou cellules réactives du

stroma. ""

à Certaines anomalies difficiles à mettre en évidence"• amplifications

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Technique d’étude : caryotype"

❖ Problèmes du caryotype"à d'ordre technique : spécimens nécrotiques et/ou infectés, index

mitotique bas,""

à Pb d’interprétation : "• multiplicité des anomalies souvent non identifiables, "• cellules à caryotype normal : cellules tumorales ou cellules réactives du

stroma. ""

à Certaines anomalies difficiles à mettre en évidence"• amplifications""

Cytogénétique moléculaire

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Techniques d’étude : FISH❖ Interphasique""

❖ Sur empreintes, cryocoupe et paraffine""

❖ Protocole sur paraffine"à Sur coupe de 3-5µm (fixateur, conservation)"à Déparaffinage"à Étape de prétraitement dans bain de thiocyanate de sodium chaud"à Digestion enzymatique à la pepsine (temps de digestion)"à Dénaturation hybridation"à lavages

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Techniques d’étude : FISH❖ lecture"

à Lames HES +/- IHC recommandées voir nécessaires"à 60 à 200 noyaux dans plusieurs champs"à Double lecture recommandée (ECA)"à 3 images représentatives archivées"à Seuil de 15% pour les délétions et les remaniements de structure"

"❖ Echec ou impossibilité technique (10-15%)"

à Biopsie épuisée"à Fixation dans du Bouin ou décalcification (BOM)"à Temps de digestion inadéquate : regarder le DAPI"à Autofluorescence (éosine)"

"❖ Technique utilisée pour le diagnostic, le pronostic et la médédcine

personnalisée

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Techniques d’étude : CGHa❖ Tumeur congelée""

❖ 50% de cellules tumorales""

❖ Témoin commercial""

❖ Multiplicité des anom"alies, problème de ploïdie""

❖ ISCN inadaptée""

❖ Technique de choix pour la médecine personnalisée et le pronostic. Peu utile en diagnostic.

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● Présence d’un NB testiculaire localisé chez un enfant de 8 mois. ●Déduction de la ploïdie : nuc ish(MYCN,D2Z)x3[76]/(MYCN,D2Z)x4[5]/(MYCN,D2Z)x2[18] ●Problème des anomalies dans des clones minoritaires (<50% des cellules) ● Problème des CNV "

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Quelles anomalies?

❖ amplifications:"- " multiples copies d ’un oncogène (MYCN, MDM2), d’un gène de fusion (PAX7/

FOX1A des RMSa, COL1A/PDGFB des DF)."" - de faible niveau (3-10 copies): anneaux, marqueurs géants"" " tumeurs de malignité intermédiaire (LPSbd)"" - de haut niveau (20-100 copies): dm, hsr"" " tumeurs de haut grade"" - s’accompagnent d’un gain de fonction, hyperexpression"" - pronostic défavorable: neuroblastome, médulloblastome…"" - cible thérapeutique""Technique de choix :"" - La FISH"" - CGHa moins sensible ""

"

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Enfant porteur d’un glioblastome

Amplification focale d’EGFR en FISH

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Genes amplification

cMET ≥5 copies avec ratio MET/cen7 >2 dans 10% des cellules"ou">6 copies en moyenne sur 100 cellules

FGFR1 ≥6 copies avec ratio FGFR/cen8 >2 dans 10% des cellules

EGFR Ratio EGFR/cen7 >3 dans 10% des cellules

HER2 Asco 2009 HER2/cen17 ≥ 2.2 ou nombre moyen de HER2 ≥6"Non amplifié si HER2/cen17 <1.8 Zone grise entre les deux "

Actualisation en 2013 "GEFPICS 2014">6 amplifié"<4 non amplifié"Entre 4 et 6 si ratio HER2/cen17<2 non amplifié si >2 amplifié

❖ Problème de définition des amplifications en FISH

""""""""""""

❖ Amplifications en CGHa : Log ratio>1 et amplicon <10Mb

amplifications

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Quelles anomalies?

❖ Délétions :!- délétion 1p/19q et gliomes grade II et III!"

à FISH ou CGHa!

" "❖ Anomalies de structure :!"

-inversion du chromosome 2 ALK-EML4"" - remaniement de ROS1, RET""

à " FISH parfois CGHa (ROS1)!

""

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En pratique

Cytogénétique diagnostique"Tumeurs bénignes

16CYTOGENETIQUE TUMORALE

Tumeurs bénignes"Des tumeurs bénignes ont des translocations, des trisomies, ou des délétions: "❖ Adénome pléomorphe de la parotide t(3;8)(p21;q12) CTNNB1/PLAG1 "❖ Lipoblastome t(8;…)(q12) PLAG1

❖ Lipomes t(12;…)(q15;…) HMGA2 t, inv(6;…)(p21;…) HMGA1 t, del(13)(q12-22…) "❖ Leiomyomes utérins t(12;14)(q15;q24) HMGA2 ""❖ Exostoses del(8)(q24.1) EXT1

del(11)(p11-12) EXT2 "❖ Méningiomes Schwannomes -22 (NF2) "❖ Fibrome de l ’ovaire +12 "❖ Tumeur desmoïde +8, +20 ...

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En pratique

Cytogénétique diagnostique"Tumeur mésenchymateuse

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1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 x y

Tumeur d’Ewing (PNET)

19

Tumeur d’Ewing

Sonde "de fission" LSI EWSR1 (Vysis)

der(11)t(11;22)

der(22)t(11;22)

22

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Patient EWS 1 1 signal normal bicolore (N), 1 signal rouge et 1 signal vert séparés

Patient EWS 2 2 signaux normaux bicolores (N), "1 signal rouge et 1 signal vert séparés

N

N

N

N

N

N N

N

Tumeurs d’Ewing!FISH sur coupes en paraffine

Sonde LSI EWSR1 (Vysis)

N

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TUMEUR D'EWING

"❖ Gène de fusion comportant le segment 5’

d’EWSR1!" et 3’ de FLI1, sous le contrôle du

promoteur d’EWSR1.""❖ Gènes codant pour des facteurs de

transcription ""

❖ FLI1, ERG… famille ETS"""""

❖ EWS a d'autres partenaires d’autres familles dans d'autres tumeurs.

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RHABDOMYOSARCOMES PEDIATRIQUESDiagnostic différentiel

Tumeur du tissu musculaire strié"❖ alvéolaire: extrémités"" - fréquemment péritétraploïde""- t(2;13)(q35;q14)! PAX3/FOXO1A!" - t(1;13)(p36;q14)" PAX7/FOXO1A variant, amplifié (dm, hsr)"" amplifications de MYCN, MDM2, CDK4!" ! agressif""❖ embryonnaire: uro-génital, tête et cou"" - anomalies de nombre: gains 2, 8 (++), 11, 12, 13"" ! meilleur pronostic"" - anaplasiques: amplifications" ! même pronostic que les" alvéolaires.

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Rhabdomyosarcome alvéolaire

t(2;13)(q35;q14) ! !PAX3-FKHR/FOXO1

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Genes de fusion des Sarcomes (35%)Sarcoma type Chromosomal transl. Fusion gene

Ewing’s sarcoma t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI1 t(21;22)(q22;q12) EWS -ERG Clear cell sarcoma t(12;22)(q13;q12) EWS -ATF1 Desmoplastic small round cell tumor t(11;22)(p13;q12) EWS -WT1 Extraskeletal myxoid chondrosarcoma t(9;22)(q22;q12) EWS -CHN

Myxoid liposarcoma t(12;16)(q13;p11) TLS/FUS-CHOP t(12;22)(q13;q12) EWS –CHOP/DTIT3

Angiomatoid fibrous histiocytoma t(12;16)(q13;p11) TLS/FUS-ATF1 Alveolar rhabdomyosarcoma t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR/FOXO1

t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR Extraskeletal myxoid chondrosarcoma t(9;17)(q22;q11) TAF2N-CHN Synovial sarcoma t(X;18)(p11;q11) SYT-SSX1,2

Dermatofibrosarcoma protuberans t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB Congenital fibrosarcoma t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3

Inflammatory myofibroblastic tumor t(2p23) Various ALK fusions Alveolar soft part sarcoma t(X;17)(p11;q25) ASPL-TFE3

Endometrial stromal sarcoma t(7;17)(p15;q21) JAZF1-JJAZ1

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Synovilosarcome avec remaniement SYT en FISH

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SARCOMES COMPLEXESLiposarcomes"

Une entité hétérogène: 3 groupes génétiques principaux ""

❖ LPS myxoïdes, les plus fréquents"" - t. à gène de fusion t(12;16): FUS/DDIT3"" "❖ LPS bien différencié, ‘lipome atypique’"" - le plus fréquent après myxoïdes."" - dans localisations rétro-péritonéales, dé-différenciation dans 20% des cas

(diagnostic différentiel avec MFH)."" - caryotypes peu remaniés, avec amplifications.""❖ LPS pléomorphes""- caryotypes complexes: accumulation de remaniements.

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LIPOSARCOMES BIEN DIFFERENCIES""

❖ Cytogénétique conventionnelle"" - caryotypes peu remaniés, avec anneaux et/ou grands marqueurs en excès"" "❖ CGH!" - amplifications constantes de 12q14-15"" - amplicons complexes, mais MDM2, CDK4 constants"" " inhibent l'apoptose et activent le cycle"" " cibles thérapeutiques potentielles!! - l’évolution vers la dé-differenciation se fait par acquisition d’autres

amplifications: "" 1p32 (JUN)!! 6q23 (MAP3K5), 2q15 (MAP3K2), 1q21-24,12q24"" " bloquent la différenciation adipeuse"" "

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lipome

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Liposarcome bien différencié

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Liposarcome dé-différencié

31

Liposarcome bien différencié!peinture 12

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Liposarcome bien différencié!"FISH MDM2

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Liposarcome bien différencié

Liposarcome dé-différencié

MDM2 CDK4

6q23 MAP3K5

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Liposarcome pleiomorphe

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En pratique

Cytogénétique diagnostique"carcinomes

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Carcinome juvénile du rein

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TRANSLOCATIONS SPECIFIQUESCarcinomes

"❖ Carcinome juvénile! t(X;1)(p11.2;q21)! ! PRCC/TFE3!! du rein! ! t(X;1)(p11.2;p34)" " SFPQ/TFE3!" " " " t(X;17)(p11.2;q25)" " ASPSCR1/TFE3!"" " " " t(6;11)(p21;q12) " " Alpha-TFEB!"Carcinome papillaire! inv, t(10;...)(q11.2;…)! RET/PTC1, 2, 3!! de la thyroïde!"Carcinome folliculaire ! t(2;3)(q13;p25)! ! PAX8/PPARG!! de la thyroïde!"❖ Carcinome de la ! t(15;19)(q14;p13.1)! ! BRD4/NUT!! ligne médiane

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En pratique

Cytogénétique pronostique "et"

Thérapie ciblée

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NEUROBLASTOMES

""Tumeur du système nerveux sympathique, en particulier de la médullo-surrénale. 7-10% des

cancers de l'enfant.

"Entité hétérogène: 3 groupes génétiques principaux ❖ Type 1: <1 an, 30% des cas . forme en général localisée (stades 1 et 2), et 4S (localisations hépatiques); . d’excellent pronostic

">1an ❖ Type 2: 40% des cas . forme fréquemment métastatique (stades 3 et 4); . de pronostic intermédiaire.

"❖ Type 3 : 30% des cas . forme métastatique (stades 4); . de mauvais pronostic, survie: 20%.

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Mise en évidence d’une amplification: NEUROBLASTOME

N Myc LAF4

Tumeur du système nerveux sympathique, en particulier de la médullo-surrénale. 7-10% des cancers de l'enfant.""Entité hétérogène: groupes génétiques principaux """Amplification MYCN"

Double minute ou episome

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Type A = gain ou perte de chromosome sans amplification MYCN

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Type C = anomalie structure de chromosome avec amplification MYCN

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Type D = anomalie structure et gain ou perte de chromosome sans amplification MYCN

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Les Neuroblastomes : classification génétique globale

Type génétique Anomalies de nombre

Anomalies segmentaires

Amplification MYCN

A + - -B - + -C - + +D + + -E + + +

Survie sans progression en fonction du stade clinique et de l’âge au diagnostic (d’après Janoueix et al, JCO, 2009)

la présence des anomalies segmentaires = meilleur facteur pronostic de rechute.

L’âge et la présence de métastases donnent des informations supplémentaires à l’intérieur de chaque groupe.

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Situation normale:2 copies Her2 Situation pathologique: Her2 Amplifié >20 copies

centromère 17

HER-2 + cen 17

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Shaw et al al, The Lancet Oncology, 2011

ALK-EML44-5% de remaniement de ALK (inversion paracentrique en 2p (ALK-EML4) dans les adénocarcinomes du poumon du non fumeur, sujet jeune

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Mise en évidence d’une translocation en CGHa

ALK-EML4 dans un adénocarcinome bronchique."

Duplication des signaux de fusion en FISH

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Mise en évidence d’une translocation en CGHa

ROS1

FISH ROS1 Zytovision

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CGHa et diagnostic

Adénocarcinome de prostate

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Il faut connaître les limites des techniques et savoir les choisir

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Brugger, JCO,2011

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Brugger, JCO,2011

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Au total❖ Caryotype peu utilisé""

❖ FISH très utile pour les diagnostics, le pronostic et les thérapies ciblées""

❖ CGHa très utile pour le pronostic et la recherche thérapie ciblée""

❖ Quid du RNAseq dans l’avenir?