1

TUTOR KIMIA KLINIK

PEMERIKSAAN KOLESTEROL LDLI Made Sila Darmana,dr/ Leonita Anniwati, dr,SpPK (K)

14 September 2011

14/9/2011

2

PENDAHULUAN

Lipid tidak larut dalam air, dalam plasma sebagai lipoprotein.

Lipoprotein berbentuk sferis.Ukuran 10 – 1200 nm.Terdiri dari lipid dan protein.Bagian Hidrofobik di inti, bagian

hidrofilik di permukaan.

14/9/2011

3

Gbr.1.Model Struktur Lipoprotein

14/9/2011

4

PENDAHULUAN Ada 4 kelas lipoprotein mayor:

- kilomikron.- VLDL.- LDL.- HDL.

Lipoprotein minor:- IDL.- Lipoprotein (a).

Metabolisme : absorpsi, jalur eksogen, jalur endogen, reverse cholesterol transport pathway.

14/9/2011

5

Gbr.2.Diagram jalur metabolisme lipoprotein mayor.

LPL:lipoprotein lipase; CETP: cholesteryl ester transfer protein;

LCAT: lechitin-cholesterol acyltranferase

14/9/2011

6

PENDAHULUAN

KOLESTEROL LDL.Densitas 1,019- 1,063 g/mL.Kaya kolesterol, derivat utama

metabolisme VLDL.Kandungan : 45% kolesterol, 22%

protein (Apo B-100), 22% fosfolipid, sedikit trigliserida.

14/9/2011

7

Gbr.3.Struktur LDLCL: cholesterol; TG: trigliseride; EC: ester cholesteryl; PL: phospholipid; NEFA: non

esterified fatty acid

14/9/2011

8

KOLESTEROL LDL Fungsi: Mengangkut kolesterol ke jaringan

perifer untuk biosintesis membran sel. Ke hepar dan jaringan lain untuk sintesis

hormon steroid. Ke hepatosit untuk sintesis asam

empedu. Kadar kolesterol LDL berhubungan

langsung dengan resiko penyakit jantung koroner.

14/9/2011

9

PEMERIKSAAN KOLESTEROL LDLPersiapan pasien Puasa 9 – 12 jam. Tidak mengkonsumsi obat (2

minggu terakhir). stabil, tidak ada perubahan BB,

pola makan, merokok, minum kopi dan alkohol (2 minggu terakhir).

Tidak sedang mengalami stres oleh suatu penyakit akut.

14/9/2011

10

Persiapan sampel. Pasien duduk saat pengambilan

sampel. tourniquette tidak terpasang lebih

dari 1 menit. Serum dipisahkan dari sel darah

sesegera mungkin. sampel dapat disimpan:

- 2 hari pada suhu 15 – 25 oC.- 4 hari pada suhu 2 – 8o C.- 3 bln pada suhu minus 20o C.

Sebaiknya antikoagulan EDTA.14/9/2011

11

METODE PEMERIKSAAN KOLESTEROL LDL

A. Ultrasentrifugasi.B. Elektroforesis.C. Friedewald calculation.D. Beta quantification.E. Metode homogenous untuk

pemeriksaan LDL secara langsung.

- automated LDL cholesterol (Dimension)

14/9/2011

12

1. Ultrasentrifugasi Prinsip: pemisahan berbagai

lipoprotein secara ultrasentrifugasi sesuai densitas masing-masing.

Pada 105.000 g, selama 18 jam, suhu 10º C.

Kilomikron akan mengapung di bagian paling atas, disusul VLDL, LDL dan HDL

14/9/2011

13

2. Elektroforesis Prinsip : pemisahan bahan

terlarut bermuatan dalam medan listrik, dalam media berpori (kertas, selulose asetat dan gel agarose).

Kecepatan pemisahan partikel tergantung muatan partikel, ukuran dan bentuk partikel.

Makin besar muatan maka makin cepat jalannya.

14/9/2011

14

Gbr.4.Elektroforesis, menunjukkan mobilitas lipoprotein sebagai α,pre-β dan β

14/9/2011

15

3.Friedewald calculation. Kol-LDL = Kol Total – (Kol-HDL) – TG/5 Perhitungan ini tidak tepat bila :

- TG > 400 mg/dL.- Adanya kilomikron.- Pasien dengan

dysbetalipoproteinemia (hiperlipoproteinemia tipe III ).

14/9/2011

16

4.Beta quantification.metode referen ,terdiri dari 3

langkah yaitu :- ultrasentrifugasi.- presipitasi dengan reagen

heparin-mangan. - kuantifikasi metode

referen Abell-Kendal. mahal, perlu waktu lama dan

rumit.

14/9/2011

17

Cara pemeriksaan:Aliquot plasma

sentrifugasi

(105.000g,18j,10ºC)

supernatan (<1,006) infranatan - VLDL (>1,006)

- kilomikron. - LDL - β-VLDL - HDL

14/9/2011

18

Lapisan terapung dibuang dengan tube slicer.

infranatan diaduk, direkonstitusi dengan volume tertentu, dan kandungan kolesterolnya dihitung.

HDL bisa dihitung setelah presipitasi sisa lipoprotein yang berisi apo B-100 (IDL, LDL, dan lipoprotein (a)).

14/9/2011

19

Kolesterol VLDL dan LDL dihitung dengan persamaan berikut:

 [kolesterol VLDL] = [kolesterol total] - [ kolesterol densitas > 1,006 g/ml].

 [kolesterol LDL] = [kolesterol densitas > 1,006 g/ml] - [kolesterol HDL].

14/9/2011

20

5.Metode homogenous untuk pemeriksaan kolesterol LDL secara langsung.

Prinsip: menggunakan dua reagen.

reagen 1:selektif menyingkirkan lipoprotein non LDL (HDL,VLDL, kilomikron).

reagen 2 : melepaskan kolesterol dari LDL sehingga dapat diukur secara enzimatis.

14/9/2011

21

Reagen 1: detergen polimer campuran

yang merusak lipoprotein non-LDL kolesterol keluar.

oleh kolesterol oksidase peroksida kompleks kurang berwarna.

14/9/2011

22

Reagen 2 detergen yang melepaskan

kolesterol dari LDL. akhirnya membentuk kompleks

berwarna. Intensitas warna proporsional

terhadap kadar kolesterol LDL.

14/9/2011

23

Metode pemeriksaan kolesterol LDL dengan automated LDL cholesterol (Dimension).

Prinsip: metode homogenous untuk secara

langsung mengukur kadar LDL-C. detergen 1 yang melarutkan hanya

partikel non- LDL. Kolesterol yang dilepaskan dipecah

oleh kolesterol esterase dan kolesterol oksidase

hasil reaksi yang tidak berwarna.

14/9/2011

24

Detergen 2 melarutkan sisa partikel LDL.

Kolesterol LDL yang larut dioksidasi oleh kolesterol esterase dan kolesterol oksidase

cholestenone dan H2O2.

Reaksi enzimatik peroksidase pada H2O2 warna dengan adanya DSBmT dan 4-AA.

14/9/2011

25

diukur dengan sinar bikromatik ( 540 nm dan 700 nm), teknik end point.

Warna yang dihasilkan berbanding langsung dengan jumlah kolesterol LDL dalam sampel.

14/9/2011

26

Non soluble LDL-C, VLDL-C, HDL-C, chylomicrons

Detergen 1

DSBmT +peroksidase

Soluble non LDL-C (VLDL-C),HDL-C, chylomicrons)

Soluble non-LDL-C Cholesterol esterase

Cholesterol oxidase

Non- color forming

Non soluble LDL-C Detergent 2 Soluble LDL-C

Soluble LDL-C + O2

Cholesterol esterase

Cholesterol oxidase

Cholestenon + H2O2

H2O2+ DSBmT+ 4-AA

Peroksidase Color development

14/9/2011

27

reagenwells Form Ingredient Concen

trationsource

1,2,3(reagen 1)

Liquid MES BufferDetergent 1Cholesterol esteraseCholesterol oxidasePeroxidase4-amino antipyrin (4-AA)Ascorbic acid oxidasePreservative

pH 6,3

Cellulomonas spPseudomaonas spHorseradish

Curcubita sp

4,5,6(reagen 2)

MES BufferDetergent 2DSBmTPreservative

pH 6,3

14/9/2011

28

Spesimen.Darah harus dikumpulkan setelah

puasa 12 jam. Spesimen yang direkomendasikan adalah serum, plasma EDTA atau heparin, harus dipisahkan dari sel dalam 3 jam dari pungsi vena.

14/9/2011

29

Kondisi Tes.Ukuran sampel 3 µL Volume reagen 1 300 µL. Volume reagen 2 100µLSuhu 37 ° C Panjang gelombang 540 nm dan

700 nmJenis Pengukuran Bichromatic

endpoint

14/9/2011

30

kalibrasi

Rentang assay : 5-300 mg/dL (0,13-7,8 mmol/L). Bahan kalibrasi : ALDL calibrator, Cat.No.DC131. Skema kalibrasi : 3 level. Unit :mg/dL (mmol/L), dimana : mg/dL x 0,0259 =

mmol/L. Tipikal level kalibrasi :0, 130, 315 mg/dL (0- 3,4 – 8,1

mmol/L ). Frekuensi kalibrasi : tiap 60 hari untuk satu lot. Kalibrasi baru diperlukan:

- untuk lot reagen cartridge.-Setelah servis mayor dan pemeliharaan.- sesuai indikasi prosedur quality control laboratorium.- sesuai regulasi pemerintah.

14/9/2011

31

Kendali Mutu.Paling sedikit sekali sehari dilakukan analisis terhadap 2 level serum kontrol yang telah diketahui kadar kolesterol LDL-nya.

14/9/2011

32

Hasil

Instrumen otomatis menghitung dan mencetak konsentrasi LDL-C dalam mg / dL [mmol / L] , hasil tes ini harus selalu dihubungkan dengan riwayat kesehatan pasien, presentasi klinis dan temuan lainnya.

Rentang pengukuran analitis (AMR): 5 - 300 mg / dL [0,13-7,8 mmol / L]. Sampel dengan hasil lebih dari 300 mg / dL [7.8 mmol / L] harus diulang dengan pengenceran.

14/9/2011

33

Bahan yang mengganggu.

Bilirubin yang unkonjugasi: kadar 80 mg/dL menurunkan hasil kolesterol LDL sampai 10%.

Lipemia: kadar lipid 3000 mg/dL menurunkan hasil kolesterol LDL sampai 19%.

Hemoglobin (hemolisat) : 1000 mg/dL.

14/9/2011

34

Klasifikasi konsentrasi kolesterol LDL

Kategori LDL-C (mg/dl) LDL-C (mmol/L)

OptimalDekat optimal/ di atas optimalTinggi borderlineTinggiSangat tinggi

< 100

100- 129130 – 159160 – 189≥ 190

< 2,6

2,6 – 3,33,4 – 4,14,1 – 4,9≥ 4,9

14/9/2011

35

TERIMA KASIH

14/9/2011

TERIMA KASIH

36

METODE ABELL-KENDALMetode referen kolesterol.Kolesteril ester dihidrolisis KOH.Kolesterol non esterifikasi diekstraksi

dengan minyak eter.Diukur reagen Liebermann-Buchard.Akurat sampai 0,5% dari true value.

14/9/2011

Reaksi liebermann Buchard

14/9/201137

Dasar penentuan fotometri kolesterol.Reagen : -Asam sulfat pekat.

- asam asetat. - asetat anhidrat.

Warna khas sterol tunggal Hijau.

14/9/201138

CARA KERJA.

6 ml LB 6 ml LB 6 ml LB

+ 0,1 ml +0,1 ml serum. Kol.std

Inkubasi 37ºC, 18 menit.Tabung dikeluarkan dan dibaca

spektrofotometer pjg gelombang 625 nm.Blanko larutan LB diatur agar transmitennya

100%.

U S B

39

Konsentrasi kolesterol dihitung:

Cu = konsentrasi bahan yang diperiksa.Cs = konsentrasi kolesterol standar.Au = absorbance bahan.As = absorbance standar.

14/9/2011

Cu = Cs x Au/As

40

Absorbsi lipid

14/9/2011

Paling banyak dlm bentuk trigliserida.Lipase pankreas merubah lipid

makanan mjd > polar.Bersama asam empedu : micelles.Micelles pada mikrovilli sel mukosa usus

absorpsi.Dalam sel usus reesterifikasi TG +

kol ester kilomikron (apo B-48)

41

Jalur eksogenKilomikron masuk sirkulasi lewat duktus

thorasicus.Berikatan dengan proteoglikan pada

permukaan kapiler (otot rangka, jantung dan jar adiposa).

LPL lipolisis kilomikron kilomikron remnant

hati ( apo E ).Enzim lisosom as lemak bebas,

kolesterol bebas.kolesterol asam empedu.

14/9/2011

42

Jalur endogen

14/9/2011

VLDL diproduksi di hati, dikeluarkan ke sirkulasi.

Pertama oleh LPL VLDL remnant LDL.

LDL berikatan dgn reseptor LDL endositosis oleh sel, dibawa ke lisosom degradasi.

TG-nya as lemak bebas + gliserol. Kolesterol bebas biosintesis

membran.

43

Reverse cholesterol transport pathway

Menjaga keseimbangan kolesterol pada sel perifer.

HDL : a. aqueous diffusion pathway. b. ABCA1 transporter pathway.

Aqueous diff path : seperti bak cuci utk kolesterol yg dapat berdifusi dari sel.

Beberapa Kolesterol bebas oleh LCAT kolesteril ester (HDL).

CETP transfer kolesterol dr HDL ke LDL.

14/9/2011

44

Reverse cholesterol transport pathway

ABCA1 transporter: famili transporter kaset pengikat ATP.

Pompa berbagai ligan menyebrang membran plasma.

Mekanisme pasti tdk diketahui. Modifikasi membran plasma untuk

transpor lipid, yang memungkinkan Apo A-I berikatan dgn membran sel.

14/9/2011

45

Karakteristik kilomikrn VLDL LDL HDL

Densitas (g/mL) <0.93 0,93-1,006 1,019-1,063

1,063- 1,21

Berat molekul (kD)

(0,4-30)X 109

(10-80) X 106

2,75 X 106 (1,75-3,6) X 105

Diameter (nm) 80-1200 30-80 18-30 5- 12

Tot lipid (% berat) 98 89-96 77 50

TG (% berat) 84 44-60 11 3

TC (% berat) 7 16-22 62 19

14/9/2011

Karakteristik major lipoprotein

46

Terdapat β-VLDL. > kaya kolesterol daripada VLDL normal. Rasio kolesterol:TG 1 :3. Estimasi VLDL-C dalam rumus friedewald

terlalu rendah lDL-C > tinggi dari sebenarnya.

14/9/2011

Hiperlipoproteinemia tipe III