230 H. Morimoto, I. Imada, T. Murata und N . Matsumoto

Liebigs Ann. Chem. 708, 230-240 (1967)

Bd. 708

u b e r die Bestandteile der Hefe, XIV')

n e r die Sterine von Can&& utilis

von Hiroshi Morimoto *), Isuke Imada, Tadakazu Murata und

Norichika Matsumoto

Aus den Forschungslaboratorien fur Chemie der Takeda Chemische Industrie AG, Juso/Osaka, Japan

Eingegangen am 5. April 1967

Nach chromatographischer Auftrennung des unverseifbaren Anteils der Hefe Candida utilis werden Ergosterin (l), p-Sitosterin (2), 4cr-Methyl-zymosterin (3), 14-Desmethyl-lanosterin (4), Sa-A7-Ergosten-3P-o1 (6) und ein neues Sterin isoliert, dessen Konstitution als A4.6.*(14).22-Er- gostatetraen-3-011 (5) bewiesen wird.

Die unverseifbare Fraktion der Hefen ist reich an Sterinen und schon seit langem grundlich untersucht worden. Dabei wurden Ergosterin sowie einige andere Sterine aufgefunden und deren Strukturen geklart. Die moderne Entwicklung der Trenn- verfahren ermoglichte uns, nun auch die untergeordneten Sterinkomponenten zu studieren.

Isolierung der Sterine Wir untersuchten zuerst diinnschichtchromatographisch die Lipid-Gesamtfraktion

der Hefe Candida utilis und den daraus hergestellten unverseifbaren Anteil. Dabei beobachteten wir einige nahe dem Hauptfleck (Ergosterin: 1) liegende, mit konz. Schwefelsaure anfarbbare Substanzen (2-5 in Tab. 1). Von ihnen zeigte 5 unter der UV-Lampe (254 mp) eine charakteristische Fluoreszenz. Der unverseifbare Anteil wurde dann saulenchromatographisch an Kieselsaure/Hyflo-Super-Cel unter diinn- schichtchromatographischer Kontrolle grob getrennt (Chromatographie I). Dabei enthielten die Fraktionen 4 und 5 als Hauptbestandteil 1 und daneben etwas 5. Durch mehrmalige Diinnschichtchromatographie an Kieselgel G mit Benzol/Essigester (8 : 2) konnte 1 aus der Fraktion4 in farblosen Nadeln vom Schmp. 160" und =

-1 19.8" erhalten werden.

*) Herrn Dr. K. Miyake, dem ehemaligen Direktor unseres Institutes, zum 75. Geburtstag

1) XIII. Mitteilung: H. Morimoto, T. Shima, I . Imada, M. Sasaki und A . Ouchida, gewidmet.

Liebigs Ann. Chem. 702, 137 (1967).

1961 Uber die Sterine von Cundidu utilis 23 1

Tabelle 1. RF-Werte der Sterine im Diinnschichtchromatogramm Diinnschicht: Kieselgel G (Merck); Schichtdicke 0.025 cm. - Ausfiihrung : absteigend bei 22".

Substanz FlieRmittel Farbung Benzol Benzol/Essigester *) rnit konz. H2SO4

Ergosterin (1) 0.11 0.55 blau -+ braun p-Sitosterin (2) 0.12 0.59 blau + violett 4cr-Methyl-zymosterin (3) . 0.16 0.13 violett -+ braun 14-Desmethyl-lanosterin (4) 0.23 0.11 rot -+ violett + braun A4.6.8(14). 2i-Ergostatetraen-3-on (5) 0.10 0.82 gelb + braun 5cr-A7-Ergosten-3p-o1 (6) 0.10 0.51 violett + braun

*) VoLVerhaltnis 8: 2.

Die Fraktion 3, in welcher die Sterine 2, 3 und 4 weitgehend angereichert waren, wurde einer saulenchromatographischen Trennung an Kieselgel rnit Hexan/Benzol (1 : 4) unterworfen (Chromatographie 11).

f3-Sitosterin (2)

Die Fraktion 6 von Chromatographie I1 zeigte im Dunnschichtchromatogramm rnit Benzol die Flecke bei RF = 0.16(3) und ca. 0.12. Die Form des Flecks bei 0.12 war jedochetwas birnenformig, und sein unterer Teil farbte sich rnit konz. Schwefelsaure blau; er bestand aus 1 als Hauptkomponente und 6 (vgl. S. 232). Dagegen ging die zunachst blaue Farbe des oberen Teils des Fleckes in Violett uber (2). Die Trennung von 1 und 2 gelang durch 4mal wiederholte Chromatographie an KieselgelG rnit Benzol/Essigester (7 : 3). Dabei wurde ein bisher nicht bekanntes Sterin (6) abgetrennt. Die Substanz 2 wurde nach Umkristallisation aus khan01 in farblosen Blattchen vom Schmp. 137-140" und [a]'," = -33" rein erhalten. Durch Elementaranalysen und Massenspektren von 2 und dessen Acetat wurde die Bruttoformel C29HS00 ermittelt. 2 zeigte im IR-Spektrum eine dreifach substituierte Doppelbindung bei 1640, 837 und 798 cm-1, ferner eine positive Liebermann-Burchard-Reaktion, gab jedoch keinen positiven SeOz-Test nach Fieser2). Dies deutet darauf hin, daB es sich bei 2 um ein As-Sterin handelt; auch war ein Vinyl-Proton (C-6) im NMR- Spektrum bei 4.827 ersichtlich. In den Massenspektren von 2 und dessen Acetat waren die Peaks M-R, M-R-HzO, M-CZHS und M-CZHS-H~O (bzw. M-R, M -R -CH3C02H, M --CzH5 und M -C2H5 -CH3C02H) ersichtlich. Daraus konnte geschlossen werden, daB 2 eine CloH21-Seitenkette rnit einer CzH~-Gruppe tragt. DaB es sich bei 2 um p-Sitosterin handelt, wurde danach durch Vergleich der Eigenschaften mit einem authentischen Praparat festgestellt. p-Sitosterin ist unseres Wissens hiermit zum erstenmal in einer Hefe aufgefunden worden.

2) L. F. Fieser, J. Amer. chem. SOC. 75, 4395 (1953).

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5a-A7-Ergosten-3P-ol (6) Die Substanz 6, welche durch die praparative Dunnschichtchromatographie der

Fraktion 6 (Chromatographie 11) von 1 und 2 befreit worden war, kristallisierte aus Methanol in farblosen Blattchen vom Schmp. 141 -145" und [a]'d = 0". Die Brutto- formel c28H480 wurde in gleicher Weise wie bei 2 bestatigt. Eine dreifach substituierte Doppelbindung war auch hier im IR-Spektrum bei 1630, 827 und 795 cm-1 ersichtlich und lie13 sich auf Grund des positiven Se02-Tests2) der Position C-7 (8) zuordnen. Ein Vinyl-Proton (C-7) war im NMR-Spektrum bei 5.00 r ersichtlich. Die Massen- spektren von 6 und dessen Acetat zeigten, daB 6 eine CgHlg-Seitenkette tragt. Damit handelt es sich bei 6 um Sa-A7-Ergosten-3@-01 (A7-Ergosteno1, y-Ergostenol, Fungi- sterin). Die Konstanten von 6 und dessen Derivaten (Acetat, Benzoat) stimmten mit den Literaturangaben3) gut uberein (Tab. 2). Das Sterin 6 ist erstmals in Mutterkorn aufgefunded), jedoch aus Hefe bisher noch nicht isoliert worden.

Tabelle 2. Eigenschaften des Sterins 6 und seiner Derivate

Substanz Gef. Lit.3) Gef. Lit.3)

6 141 - 145" 145 - 146" 0" 0" Acetyld 153" 157" -3.4" -5.3" Benzoyl-6 175' 179" +2.0" 0"

Schmp. [a] D

4a-Methyl-zymosterin (3)

Aus der Fraktion 5 (Chromatographie 11) wurde 3 nach wiederholter Dunnschicht- chromatographie und anschlieBender Umkristallisation aus Methanol in farblosen Nadeln vom Schmp. 128- 130" und [0c]k3 = $31.8" rein erhalten. Elementaranalysen und Massenspektren von 3, dessen Acetat sowie Dihydroderivat ergaben die Brutto- formel C28H46O. Die Substanz 3 zeigte eine schwach positive Tortelli-Jaffe-Reaktion, im IR-Spektrum eine dreifach substituierte Doppelbindung bei 1635 cm-1 und im NMR-Spektrum zwei CHrGruppen an einer Doppelbindung (8.40 und 8.48 r) sowie ein Vinyl-Proton (bei 5.10 r). Das Dihydroderivat lie13 stattdessen die Protonen von zwei CHrGruppen einer Isopropyl-Gruppierung bei 9.02 7 erkennen. Dieses Verhalten war sehr ahnlich demjenigen von Lanosterin und seinem Dihydroderivat. Aus den Massenspektren von 3 und dessen Derivaten lieB sich entnehmen, daB die Doppel- bindung in der CgHls-Seitenkette steht. Damit konnte 3 eines der methylierten Zymosterine sein. Die Daten von 3 und dessen Derivaten zeigten groBe Ahnlichkeit mit den Literaturangaben fur 4a-Methyl-zymosterin, welches erst kurzlichs) in der Hefe gefunden worden ist. Ein direkter Vergleich mit dem Acetat des 4a-Methyl- zymosterins (Praparat von Prof. G. Ourisson, Strasbourg) ermoglichte die eindeutige Identifizierung von 3.

3) A . Windaus und R. Langer, Liebigs Ann. Chem. 508, 105 (1934). 4) C. Tanret, C. R. hebd. Sbances Acad. Sci. 147, 75 (1908). 5 ) G. Ponsinet und G. Ourisson, Bull. SOC. chim. France 1965, 3682.

1967 Uber die Sterine von Cundidu utilis 233

14-Desmethyl-lanosterin (4)

Die Substanz 4 wurde aus der Fraktion 3 von Chromatographie I1 durch praparative Diinnschichtchromatographie an Kieselgel G und anschliel3ende Umkristallisation aus Methanol in farblosen Nadeln vom Schmp. 136-138.5" und [a]&3 = +40.4' rein erhalten. Aus den Elementaranalysen und Massenspektren von 4 sowie seinem Acetat ergab sich die Bruttoformel C29H480. Die positive Tortelli-Jaffe-, die schwache Liebermann-Burchard-Reaktion und der Drehwert wiesen auf ein As-Sterin hin. 4 zeigte im NMR-Spektrum zwei CH3-Gruppen an einer Doppelbindung (8.45 und 8.40 7) sowie ein Vinyl-Proton bei 5.05 7, die dem Dihydroderivat fehlten. Damit war die Gruppierung (CH3)2C=CH- in 4 anzunehmen. Die Massenspektren von 4 sowie dessen Dihydroderivat zeigten grol3e Ahnlichkeit mit denen von Lanosterin und 24.25-Dihydro-lanosterin. Danach mul3te 4 eine Isooctenyl-Seitenkette und eine CH3-Gruppe weniger als Lanosterin enthalten, die beiden CH3-Gruppen also geminal an C-4 oder an C-4 und C-14 tragen. Von den beiden in Frage kommenden Substanzen war 14-Desmethyl-lanosterin bereits in Rattenorganen als Zwischenprodukt der Cholesterin-Biosynthese aufgefundens. 7) und neuerdings auch aus Hefe isoliert wordens). Unser 4 und sein Dihydroderivat stimmten mit den fur diese Verbindung angegebenen Konstanten gut uberein (Tab. 3).

Tabelle 3. Eigenschaften des Sterins 4 und seiner Derivate

Schmp. [El D Substanz Gef. Lit. Gef. Lit.

4 136- 138.5" 139.5-140"s) +40.4" +42.5"5)

Acetyl-4 128 - 132" 133 - 134"s) +41.8" +39"5)

Dihydro-4 155-160" 159- 161"7) - -

Dihydroacetyl-4 124- 126" 122 - 124'7) - -

A4.6.8(14).22-Ergostatetraen-3-on (5)

Aus der Fraktion 4 von Chromatographie I konnte 5 durch wiederholte Dunn- schichtchromatographie rein erhalten werden. Es lag danach als schwach gelbe Blattchen vom Schmp. 114- 116" (aus Methanol) vor, die starke Rechtsdrehung ([a]',' = +581 .So) aufwiesen. Die durch Elementaranalyse und Massenspektrum g e sicherte Bruttoformel C28H400 wies auf eine Steroid-Struktur hin. Das UV-Spektrum zeigte ein Absorptionsmaximum bei 348 my (E = 25650) und stimmte mit dem be- rechneten Wert (356 my) fur A4.6.8(14)-Trien-3-~x~-~terin 8) uberein. Diese Partial- struktur wurde weiter wie folgt gesichert: Im IR-Spektrum waren Banden bei 1665,

6 ) F. Gautschi und K. Bloch, J. Amer. chem. SOC. 79, 684 (1957). 7) F. Gautschi und K. Bloch, J. biol. Chemistry 233, 1343 (1958). 8) Vgl. L. F. Fieser und M . Fieser, Steroids, Reinhold Publ. Co., New York 1959, S. 20.

234 H. Morimoto, I . Imada, T. Murata und N. Motsumoto Bd. 708

1634, 1594 und 1565 cm-1 ersichtlich, im NMR-Spektrum zwei gekoppelte Vinyl- Protonen (Dublett) von C-6 (3.44 T) und C-7 (4.00 T) sowie ein Vinyl-Proton (Singulett) von C-4 (4.30 7). AuBerdem wurde noch eine isolierte trans-Doppelbindung bei 967 cm-1 bzw. 4.79 T nachgewiesen. Das Massenspektrum von 5 zeigte den Molekul- peak sowie einen starken Peak M-R. Die letztgenannte Doppelbindung muBte in der Seitenkette sitzen. Nach diesen Befunden handelte es sich bei 5 um A44.6.8(14).22- Ergostatetraen-3-011, das zuerst durch Oppenauer-Oxydation aus 14-Dehydro- ergosterin (einem Nebensterin von Aspergillus niger 99, spater aus Ergosterin herge- stellt worden istlo). Die Identitat wurde durch direkten Vergleich rnit einem authen- tischen Praparat (von Prof. D. H. R. Burton, London) sichergestellt.

Da 5 schon in dem Lipid-Gesamtextrakt der Hefe dunnschichtchromatographisch festgestellt worden war, kann es kein bei der Isolierung entstandenes Artefakt, sondern muR ein natives Sterin dieser Hefe sein. 5 ist relativ labil gegen Licht; es wandelt sich in Benzollosung unter direkter Sonnenstrahlung in einige Substanzen um, welche im Dunnschichtchromatogramm meist kleinere RF-Werte als 5 zeigen.

Quantitative Bestimmung der Sterine Hierzu benutzten wir die gaschromatographische Methode (SE-30 auf Gas-Chrom P

als stationare Phase). Die aus den Retentionszeiten fur die einzelnen, authentischen Sterine erhaltenen Eichwerte zeigt Tabelle 5 (S. 240). Die Sterine 1 und 3 sowie 2 und 4 mit jeweils nahezu gleichen Retentionszeiten liel3en sich durch Kombination der gaschromatographischen Methode rnit der dunnschichtchromatographischen Vortrennung quantitativ erfassen. Um die Fehler moglichst klein zu halten, wurde der unverseifbare Lipid-Anteil dazu direkt an Kieselgel G mit Benzol/Essigester (8 : 2) diinnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die fur das jeweilige Sterin charak- teristischen Flecke wurden dann gaschromatographisch quantitativ analysiert. So erhielt man folgende O/oo-Gehalte an den Sterinen 1-6 im getrockneten Mycel von Candida utilis: 1 = 0.11, 2 = 0.03, 3 = 0.022, 4 = 0.059, 5 = 0.0016 und 6 =

0.0150/00. Die Substanz 5 kann auf Grund ihres UV-Maximums bei 348 mp ( E =

25 650) auch spektrographisch bestimmt werden. Der so gefundene Wert (0.00120/00 des getrockneten Mycels) stimmt gut rnit dem gaschromatographisch erhaltenen iiberein.

Betrachtungen zur Biosynthese Nach den gegenwartigen Vorstellungen durfen die folgenden Synthesewege der

Sterine 1-6 in der Hefe angenommen werden: Lanosterin, welches aus Squalen durch enzymatische Cyclisierung entsteht, wandelt sich 1) unter Abspaltung der Methylgruppen an C-14 und C-4 nacheinander in 4, 3 und Zymosterin um, wobei

9) D. H. R. Barton und T. Bruun, J. chem. SOC. [London] 1951, 2728. 10) J. EZks, J. chem. SOC. [London] 1954, 468.

1961 Uber die Sterine von Candida utilis 235

Lanosterin: 3 : H R CH3 R' CH3 CH3 R" CH3 H - 4 : C H 3 CH3 H

R

-

die Reihenfolge offenbleiben muD; 2) entsteht daraus unter Mitwirkung des aktivierten Methionins das 24-Methylen-dihydrolanosterinlo), das durch weitere enzymatische Verhderungen die Substanzen 1, 2, 5 und 6 hervorgehen lie&.

HO & HsC "CH3 -

Wir sind den Herren Prof. Dr. G. Ourisson und Prof. Dr. D. H. R. Barton fur die uber- lassung authentischer Steroid-Proben sehr zu Dank verpflichtet. Die Elementaranalysen und die Messung der physikalischen Konstanten wurden in der Physikochemischen Abteilung unserer Firma ausgefiihrt, wofiir wir auch an dieser Stelle herzlich danken.

Beschreibung der Versuche

Die Schmelrpunkte wurden auf dem Kofler-Heiztischmikroskop (Reichert, Wien) bestimmt und sind unkorrigiert. - Die UV-Spektren wurden mit dem Hitachi-Spektralphotometer EPS-2, die IR-Spektren in KBr mit dem Hitachi-Spektrographen EPI-2 und die NMR-Spektren mit dem Varian-Instrument A-100 (Tetramethylsilan als innerer Standard) gemessen. - Die optischen Drehungen sind mit dem Perkin-Elmer-Polarimeter, Modell 141, aufgenommen worden. - Fur die Dunnschichtchromatographie verwendeten wir 10 g Kieselgel G (Merck)

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als Trager je Platte (20 x 20 cm). Die Flecke wurden unter einer UV-Lampe (254 mp) sowie durch Bespriihen rnit konz. Schwefelsaure sichtbar gemacht. - Zur Entfernung von Losungs- mitteln diente ein Umlaufverdampfer.

Isolierung des unverseifbaren Lipid-Anteils der Hefe

50 kg getrocknete Mycelien der Hefe Candida utifis wurden mit 200 I Methanol unter Riihren 1 Stde. bei 60" gehalten. Die Mycelien wurden dann abgenutscht und rnit 50 I Methanol gewaschen. Die vereinigten methanol. Extrakte wurden auf 12 f i. Vak. eingeengt, mit 7 I 15-proz. methanol. NaOH versetzt und 30 Min. bei 65" verseift. Das Gemisch wurde mit 40 I Methanol verdiinnt und mit Hexan (35, 30, 30 I) extrahiert. Die vereinigten Ausziige wusch man mit 10 Z90-prOZ. Methanol und anschlieDend 2mal mit je 10 f gesattigter NaC1-Losung. Die Hexanlosung ergab nach dem Trocknen iiber Na2.504 und Eindampfen 150 g unverseif- bare Lipide als zahes, rotes 61.

Isolierung der Sterine

Chromatographie I : 140 g unverseifbare Lipide wurden in 400 ccm Hexan gelost und iiber eine Saule (10 x 35 cm) rnit 790 g Kieselsiiure (100-200 mesh)/Hyflo-Super-Cel (1 : 1) unter diinnschichtchromatographischer Kontrolle chromatographiert. Es wurden folgende Frak- tionen aufgefangen:

Frakt. FlieBmittel Eluat Ausbeute Sterine

1 Hexan 10.5 I 63.00 g - 2 Hexan 8 21.92 - 3 Hexan 3 31.54 2, 3, 4 4 Benzol 5 14.58 1, 5 5 Benzol/Methanol (1 : 1) 3 9.66 1

Chromatographie 11: 10 g Fraktion 3 von Chromatographie I wurden mittels einer Saule (5 x 68 cm) aus Kieselgel (Wakogel Q-22) rnit Hexan/Benzol(l : 4) als FlieRmittel chromato- graphiert. Man erhielt :

Frakt. Eluat Ausbeute Hauptsterine

- 1 1.0 I 1.4 g 2 1.5 0.4 3 3.5 1.14 4 4 5.0 0.8 3, 4 5 4.0 0.9 3 6 22.0 1.17 2, 3, 6

-

Ergosterin (1). - 1.5 g der Fraktion 4 (Chromatographie I ) wurden in 3 ccm Athanol gelost; von dieser Losung wurden 0.3 ccm auf Kieselgel G mit Benzol/Essigester (8 : 2) diinnschichtchromatographiert. Die das Ergosterin enthaltende Kieselgelzone wurde 3 ma1 rnit je 10 ccm Athanol extrahiert. Der aus der Athanollosung erhaltene Riickstand ergab

1967 Uber die Sterine von Candida utilis 237

nach wiederholter gleicher Reinigung 85 mg rohes 1. Farblose Nadeln (aus Athanol) vom Schmp. 160", [u]g = - 1 19.8" (Chloroform, c = 1.0). - UV-Spektrum (Athanol): A,, (E) =

271 (9530), 282 (10250), 293 my (6170). - IR-Spektrum: 3410 (OH), 1655, 1600 (=C-C=), 967 (trans-CH=CH), 832, 800cm-1 (CH=C). - NMR-Spektrum (CC14): T = 4.70 (l), 4.80 (1 ; CH-6, 7), 4.97 (2; CH-22, 23), 7.06 (1 ; CH-3), 9.22 (3; CH3-19), 9.40 (3; CH3-18).

C28H440.0.5HzO (405.6) Ber. C 82.90 H 11.18 Gef. C 82.70 H 11.78

p-sitosterin (2). - 1.77 g der Fraktion 6 (Chromatographie II ) wurden in 5 ccm Chloroform gelost und auf 10 Kieselgel-G-Schichten mit Benzol/Essigester (7 : 3) chromatographiert. Die 2 enthaltende Kieselgelzone wurde 3 ma1 mit je 10 ccm Athano1 extrahiert. Aus der ein- geengten Athanollosung schieden sich 50 mg farblose Blattchen vom Schmp. 137- 140", [a l l = -33.0" (Chloroform, c = 0.5) ab. - IR-Spektrum: 3420 (OH), 1640, 837, 798 cm-1 (CH=C). - NMR-Spektrum (CC14): T = 4.82 (1; CH-6), 6.70 (1; CH-3).

C29H50O (414.7) Ber. C 83.99 H 12.15 Gef. C 84.07 H 12.25

Acetat: 38 mg 2 wurden in einem Gemisch von 0.5 ccm Pyridin und 0.1 ccm Aceranhydrid 12 Stdn. bei Raumtemperatur stehengelassen. Das nach der Aufarbeitung erhaltene Rohacetat wurde aus khan01 umkristallisiert. Farblose Nadeln vom Schmp. 117'; Ausbeute 15 mg.

4a-Methyl-zymosterin (3). - 900 mg der Fraktion 5 (Chromatographie I l ) wurden in 3 ccm Chloroform gelost und auf Kieselgel G mit Benzol/Essigester (8 : 2) diinnschichtchromato- graphiert. Die 3 enthaltende Kieselgelzone wurde 3mal mit je 10 ccm Athanol extrahiert. Der Riickstand des Extraktes ergab nach Umkristallisieren aus Methanol 200 mg farblose Nadeln vom Schmp. 128-130", [a]g = +31.8" (Chloroform, c = 1.0). - IR-Spektrum: 3430 (OH), 1670 (C=C), 1635 cm-1 (CH=C). - NMR-Spektrum (CC14): T = 8.48 (3), 8.40 (3; CH3-26, 27), 8.05 (4; CHz-7, I]), 7.11 (1; CH-3), 5.10 (1; CH-24).

C28H460 (398.7) Ber. C 84.35 H 11.63 Gef. C 84.21 H 11.54

Acetat: 45 mg 3 wurden mit einem Gemisch von 0.5 ccm Pyridin und 0.1 ccm Acetanhydrid in 12 Stdn. bei ca. 20" acetyliert. Man erhielt 50 mg farblose Blattchen (aus Xthanol/Essig- ester : 2 : 1) vom Schmp. 137--141°, [a16 = +51.0° (Chloroform, c = 1.0).

Dihydroderivat: 52 mg 3 in I3 ccm khan01 wurden nach Zugabe von 15 mg PtOz bei Raum- temperatur hydriert. 4.5 ccm Wasserstofl wurden aufgenommen. Nach der Aufarbei- tung ergab die Kristallisation aus Methanol/khanol (1 : 1) 40 mg Dihydroderivat von 3 als Nadeln vom Schmp. 139-140". - NMR-Spektrum (CC14): T = 9.02 (6; CH3-26, 27).

14-Desmethyl-lanosterin (4). - I .I4 g der Fraktion 3 (Chromatographie I I ) wurden in 5 ccm Chloroform gelost und, wie bei 3 angegeben, diinnschichtchromatographisch gereinigt. Der aus der Athanollosung erhaltene Riickstand ergab nach Umkristallisation aus 2 ccm Methanol 465 mg farblose Nadeln vom Schmp. 136-138.5", [a1203 = +40.4" (Chloroform, c = 1.0). - IR-Spektrum: 3470 (OH), 1680 (C=C), 1630 cm-1 (CH=C). - NMR-Spektrum (cCl4): T = 8.45 (3), 8.40 (3; CH3-26, 27), 8.05 (4; CH2-7, I I), 6.92 (1 ; CH-3), 5.05 (1 ; CH-24).

C29H480.0.5H20 (421.7) Ber. C82.60 H 11.71 Gef. C 82.97 H 11.40

Acetat: 34 mg 4 wurden in 0.9 ccm Pyridin + 0.2 ccm Acetanhydrid gelost und 12 Stdn. bei Raumtemperatur stehengelassen. Das nach der Aufarbeitung erhaltene Rohacetat wurde in 0.5 ccm Chloroform gelost, auf 3 Kieselgel-G-Platten rnit Benzol diinnschichtchromato-

238 H. Morimoto, I . Imada, T. Murata und N. Matsumoto Bd. 708

graphisch gereinigt und aus khanol umkristallisiert. Ausbeute 28 mg farblose Blattchen vom Schmp. 128--132", [or]&4 = +41.8" (Chloroform, c = 1.0).

C31H5002.0.5H20 (463.7) Ber. C 80.31 H 11.09 Gef. C 80.22 H 10.71

Dihydroderivat: 50 mg 4 in 7.5 ccm khan01 wurden mit 15 mg Pro2 bei Raumtemperatur hydriert, wobei 2.7 ccm Wasserstof aufgenommen wurden. Ausbeute 25 mg farblose Blattchen (aus khanol) vom Schmp. 155 - 160". Dihydroacetat: 20 mg 4-acetat wurden in 10 ccm khan01 mit 10 mg PtO2 hydriert; H2-

Aufnahme 1 ccm. Nach Umkristallisieren aus Athano1 lagen 10 mg farblose Blattchen vom Schmp. 124 - 126" vor.

A4.6.s(l4).22-Ergostatetraen-3-on (5). - 1.4 g der Fraktion 4 (Chromatographie I ) wurden auf 6 Kieselgel-G-Schichten mit Benzol/Essigester (8 : 2) chromatographiert. Die vereinigten Anteile der unter der UV-Lampe (254 my) stark blau fluoreszierenden Zone wurden mit 80 ccm Aceton extrahiert. Der aus Acetonlosung erhaltene Ruckstand wurde noch 2mal in gleicher Weise gereinigt. Das rohe 5 (735 mg) kristallisierte aus Methanol in schwach gelben Blattchen vom Schmp. 114- 116", = +581.5" (Chloroform, c = 0.2); Ausbeute 340 mg. UV-Spektrum (Methanol): Amax (E) = 348 my (25650). - IR-Spektrum: 1665, 1634, 1594, 1565 (CO -C = C -C = C -C = C), 967 (trans-CH = CH), 875 cm-1 (A4-3-0x0-Gruppe). - NMR-Spektrum (CDC13): T = 3.44 (l), 4.00 ( I , d ; J = 10Hz; CH-6, 7), 4.30 (1; CH-4),

C28H400 (392.6) Ber. C 85.65 H 10.27 Gef. C 85.75 H 10.00

2.4-Dinitro-phenylhydrazon: 16 mg 5 in khanol wurden mit 10 mg 2.4-Dinitro-phenylhydrarin in athanol. Phosphorsaure-Losung versetzt. Nach dem Trocknen wurde der Niederschlag uber eine Kieselgel-Saule chromatographisch gereinigt. Die mit Benzol/Chloroform (1 : 1) eluierte Fraktion ergab das rohe Hydrazon, welches aus Essigester in dunkelroten Nadeln vom Schmp. 236-237" kristallisierte. - UV-Spektrum (Chloroform): Amax ( E ) = 425 my (42 500).

4.79 (2; CH-22, 23).

C34H44N404 (572.7) Ber. N 9.78 Gef. N 9.83

Sa-A7-Ergosten-3~-01 (6). - Bei der dunnschichtchromatographischen Auftrennung von 1.77 g der Fraktion 6 (Chromatographie 11) wurde 6 aus dem unterhalb von 2 liegenden Fleck isoliert. Umkristallisation aus Methanol ergab 50 mg farblose Blattchen vom Schmp. 141 -145", [or]&* = 0" (Chloroform, c = 0.5). - IR-Spektrum: 3400 (OH), 1630,827,795 cm-1 (CH=C). - NMR-Spektrum (CCI4): T = 5.00 (1 ; CH-7), 5.48 (1; CH-9 oder -14), 6.60 ( I ; CH-3).

C28H480.0.5H20 (409.7) Ber. C 82.09 H 12.06 Gef. C 82.39 H 11.82

Acetat: 20 mg 6 wurden in 1 ccm Acetanhydrid 20 Min. bei 100' gehalten. Aus Methanol kristallisierte das Acetat in farblosen Blattchen vom Schmp. 153", [u]g = -3.4" (Chloroform, c = 0.5); Ausbeute 15 mg. Benzoat: 20 mg 6 wurden mit 0.3 ccm Pyridin + 0.13 ccm Benzoylchlorid 12 Stdn. bei Raum- temperatur stehengelassen. Das Rohbenzoat wurde aus 2 ccm Aceton umkristallisiert. 8 mg farblose Blattchen vom Schmp. 175", [or]$,' = +2.0° (Chloroform, c = 0.5).

Massenspektren: Die fur die Sterine 1-6 und ihre Derivate erhaltenen m/e-Werte sind zusammen mit den Lanosterin-Vergleichssubstanzen in Tabelle 4 zusammengestellt.

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-

-

240

Quantitative Bestimmung der Sterine

H. Morimoto, I . Imada, T. Murata und N. Matsumoto Bd. 708

Gaschromatographisches Verfahren: Verwendet wurde der Ohkura-Gaschromatograph (Modell 2100) rnit einem Flammenionisationsdetektor. Die Saule aus nicht-rostendem Stahl (100 x 0.5 cm) enthielt 3 :A SE-30 (Applied Science Laboratories) an Gas-Chrom P (80 bis 100 mesh; Nishio Kogyo Co.). Gearbeitet wurde unter folgenden Bedingungen: Saulen- temperatur 225", EinlaRtemperatur 240 + lo", Tragergas N2 rnit 110 ccm/Min., DurchfluR- geschwindigkeit im Detektor fur H2 = 60 ccm/Min., fur Luft = 600 ccm/Min. Fur die authentischen Sterine 1 -6 sind die in Tabelle 5 angegebenen Retentionszeiten gemessen und die aufgefuhrten Mengen wiedergefunden worden.

Tabelle 5. Gaschromatographisch wiedergefundene Mengen (aus den Peakflachen) und Retentionszeiten der Sterine 1-6

EinlaRmenge Wiedergefunden (pg) 1 2 3 4 5 6

10 10.6 10.6 10.6 10.6 11.6 8.6 20 20 20 20 20 20 22 40 - 43 40 38 48

51 50 54 80 92 90 83 80 1 1 1 91

-

- - - -

Retentionszeit 18.6 24.0 18.6 25.0 28.1 22.0 Min.

Bestimmungsmethodik: 45 mg unverseifbarer Lipid-Anteil der Hefe Candida utilis wurden in 2 ccm Methanol/Chloroform (1 : 1) gelost und aufsteigend an Kieselgel G rnit Benzol/ Essigester (8 : 2) diinnschichtchromatographiert. Die jeweilige Sterin-haltige Schicht wurde abgelost, 3mal rnit je 10 ccm k h a n 0 1 extrahiert und der Extrakt eingedampft. Der jeweilige Ruckstand wurde in der erforderlichen Menge Aceton/Toluol (1 : 1) gelost und der Gas- chromatographie unterworfen. Mit Hilfe der aus Tabelle 5 erhaltlichen Eichkurven wurden die aus dem getrockneten Mycel der Hefe erhaltenen Ausbeuten an den Sterinen 1-6 bestimmt: 1 = 0.11, 2 = 0.03, 3 = 0.022, 4 = 0.059, 5 = 0.0016, 6 = 0.0150/00.

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