Übungen zu Ökologischen fragen in der lebensmittelproduktion mit mikrobiellen gemeinschaften...
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Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit
mikrobiellen GemeinschaftenHaslberger, Handschur
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Übungsablauf
• MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung
• DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-
Fällung• MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse• DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels
neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital)
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Inhalt
• Culture dependent vs. Culture independent Methods
• PCR• RT-PCR• DGGE, TGGE• SSCP, MSSCP• RFLP, TRFLP• RISA, ARISA• Cloning, Sequencing
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2 ways for identification: +/- cultivation
Sample
Identification of MicroorganismsDNA/RNA
Culture- independent Methods
Culture Culture- dependent Methods
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Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation
Habitat Cultivability (%)
Freshwater 0,25
Brackish water 0,1-3
Sedimente 0,25
Soil 0,3
Food general 0,5-10
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Culturable
• Wachstumsbedingungen bekannt– Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob
• Keim lebend
• Verschiebung der Flora
• 99% aller Bakterien unbekannt
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Culture independent
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Culture independent
Spezies Sequenz
S. aureus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT
S. epidermidis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC
S. capitis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC
S. warneri CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC
S. haemolyticus CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC
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Polymerase Chain Reaction
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Realtime-PCR
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RT-PCR
100.000
1.000
10.000
4520 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Flu
ore
scen
ce (
F1)
Cycle Number
106 cop105 cop
104 cop
103 cop
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RT-PCR
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Denaturant Gradient Gel Electrophoresis
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Denaturant Gradient Gel Electrophoresis
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Temperature Gradient Gel Electrophoresis
• Prinzip wie DGGE
• Keine DNA- denaturierende Substanzen
• Temperatur Gradient
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Singlestrand Conformatiom Polymorphism
• DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt ssDNA
• Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel
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SSCP
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Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism
• ssDNA
• Denaturants added to PCR- product
• Different bands because of different conformation of ssDNA
• Temperature is changing during the electrophoresis
• Using high voltage
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MSSCP
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Temperatur changing during run
Temp.
34°C
22°C
10°C
5´
2´
Zeit
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MSSCPSSCP bei untersch. Temp. SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP
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MSSCP
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(Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism
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Cutting enzymes
• HIND III A/AGCTT
• BAM HITGG/CCA
• Eco RI GT/AATTC
• 1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC
• 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT
• 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC
1) 2) 3) 1) + 2) + 3)
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(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
• dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer)
• Fluorescently primers
• Different bands because of different length of PCR- product
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Sensitivity
• DGGE: 95 - 100% 100-700 bp
• SSCP: 80 - 85 % 100-500 bp
• MSSCP: 85 - 95% 100-500 bp
• [T]RFLP: 90 – 100% 100-10000 bp
• [A]RISA: 95 - 100% 200-1200 bp
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Membran Hybridisierungsverfahren
Target DNA
Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen
Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen
YWestern Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen
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Methode
DNA extraction PCR DGGE
Food samples
Comparison of bandpatterns
Monitoring Community fingerprints
Clone libraries
Screenig for different clones and sequencing
Identification of microorganisms
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PCR
1. Runde PCR (lange Fragmente)
600 –1300 bp
Nested PCR
Einer der Primer trägt am 5‘-Ende eine GC-clamp.
200 – 500 bp
Amplifikation der 16S rDNA
Klonierung
DGGE
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Agarosegel
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DGGE
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Cloning
BHI-Agar + Tet+ Amp + IPTG+ X-Gal
~ 700 bp
Extrahierte DNA
PCR Amplifikation der langen Fragmente
Ligation
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Cloning
Lac ZLactose --> Galactose + GlcX-Gal --> blau (Kolonien blau)
klonierte DNA
LactoseX-Gal (Kolonien weiß)
ß-Galactosidase
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Blue/white screening
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Clone screening
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Sequenzierung
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Sequenzierung
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FASTA run• Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped%
EM_PRO:AB012212 Enterococcus faecalis gene 1517 99.719 100.000 356 8e-57 10 EM_PRO:AB036835 Enterococcus faecalis gene 1518 100.000 100.000 356 1.2e-57 45 EM_PRO:AB092693 Enterococcus faecalis gene 1455 100.000 100.000 329 9.6e-53 18 EM_PRO:AB098122 Enterococcus faecalis gene 1466 99.719 100.000 356 2e-57 30 EM_PRO:AB100597 Enterococcus faecalis gene 394 100.000 100.000 356 2.9e-57
• .......
• EM_PRO:AB101658 Streptococcus epidermidis g 197 69.854 70.1000 245 2e-48 31
http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html
98% Similarity Speziesgrenze96% Similarity Genusgrenze
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Tendogramm
http://rdp8.cme.msu.edu/html/index.html
Clone
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Fragestellung
Verursachen alle (kultivierbare/nicht-kultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme?
Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten?
Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten?
Was kann man dagegen tun?KLINISCHE BEDEUTUNG
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Wozu molekulare Analyse ?
Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN
WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN
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Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
Gelelektrophorese
![Page 43: Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022051614/55204d6149795902118b4b1a/html5/thumbnails/43.jpg)
Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
Gelelektrophorese
Staphylococcus specific PrimersEnterobacteriaceae/Pseudomonadaceae
specific Primers
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Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut
DGGE
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Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation
unspiked spiked m. E.coli u. S.flexneri
Shigella- Sonde E.coli- Sonde
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Spezielle DNA- Extraktionsmethode
Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA
Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM
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Spezielle DNA- ExtraktionsmethodeGelelektrophorese
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Spezielle DNA- Extraktionsmethode
![Page 49: Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022051614/55204d6149795902118b4b1a/html5/thumbnails/49.jpg)
Spezielle DNA- ExtraktionsmethodeDGGE
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Abwesenheit v. Blut-DNA
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Sensitivität