učinak proteina fgf i hmgb1 na preživljenje i proliferaciju živčanih matičnih...
TRANSCRIPT
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Ana Bogut
Učinak proteina FGF i HMGB1 na preživljenje i
proliferaciju živčanih matičnih stanica u kulturi
Diplomski rad
Zagreb, 2014.
»Ovaj rad, izrađen u Laboratoriju za matične stanice i Laboratoriju za neurogenetiku i
razvojnu genetiku pri Hrvatskom institutu za istraživanje mozga na Medicinskom fakultetu u
Zagrebu, u sklopu Glowbrain projekta, financiranog od strane Europske komisije, pod
mentorstvom doc.dr.sc. Dinka Mitrečića i doc.dr.sc. Inge Marijanović, predan je na ocjenu
Biološkom odsjeku Prirodoslovno matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi
stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.«
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
Učinak proteina FGF i HMGB1 na preživljenje i proliferaciju živčanih matičnih stanica u
kulturi
ANA BOGUT
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb
Ovaj rad opisuje utjecaj FGF i HMGB1 molekula na živčane matične stanice u kulturi (NSC).
Primjenom metode magnetofekcije živčane matične stanice transfecirane su plazmidima s
FGFR1 receptorom. Osim NSC stanica u eksperimentima su korištene i embrionalne matične
stanice bubrega (HEK293T). Pokazalo se da FGF utječe pozitivno na preživljenje HEK293T
stanica s transfeciranim plazmidima u usporedbi sa HEK stanicama koje nisu transfecirane.
HMGB1 je smanjio pozitivan učinak FGF-a u kulturi HEK293T stanica. NSC stanice u
svojem mediju već imaju FGF te je postignuto bolje preživljenje NSC stanica transfeciranih
FGFR1-EGFP plazmidom. Korištenjem dvostruko veće količine plazmida u odnosu na
magnetne čestice postigla se dvostruko bolja uspješnost transfekcije metodom magnetofekcije
u usporedbi sa prethodnim istraživanjima. HMGB1 je na njihovo preživljenje djelovao
negativno kao i kod HEK293T stanica.
(55 stranica, 13 slika, 2 tablice, 106 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski jezik)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici
Ključne riječi: živčane matične stanice, transfekcija, FGF, HMGB1
Voditelj: Doc.dr.sc. Dinko Mitrečić, dr.med.
Suvoditelj: Doc.dr.sc. Inga Marijanović, doc.
Ocjenitelji: Doc.dr.sc. Duje Lisičić, doc.
Doc.dr.sc. Inga Marijanović, doc.
Doc.dr.sc. Renata Šoštarić, doc.
Doc.dr.sc. Petar Kružić (zamjena)
Rad prihvaćen: 06.11.2014.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Division of Biology Graduation Thesis
Effects of FGF and HMGB1 proteins on Cultured Neural Stem Cells' Survival and
Proliferation
ANA BOGUT
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb
The aim of this study was to describe the effects of FGF and HMGB1 molecules on cultured
neural stem cells (NSCs). Using magnetofection, NSCs were transfected with plasmides
containing the FGFR1 receptor. Along with NSCs, embryonal kidney stem cells (HEK293T)
were also used. The results show that FGF positively affects the survival of HEK293T cells,
which were transfected with plasmides, as opposed to non-transfected cells. The HMGB1
molecule reduced the positive effect of FGF in cultured HEK293T cells. NSCs were already
grown in a medium containing FGF. The ones transfected with the FGFR1-EGFP plasmide
showed increased survival. Using twice as many plasmides as magnet particles resulted in a
twofold increase in magnetofection success rate, compared to previous studies. At the same
time, HMGB1 affected their survival negatively, just as in HEK293T cells.
(55 pages, 13 figures, 2 tables, 106 references, original in: Croatian)
Thesis stored in the Central Biological Library
Keywords: neural stem cells, transfection, FGF, HMGB1
Supervisor: Dr. Dinko Mitrečić, MD
Cosupervisor: Dr. Inga Marijanović, Asst. Prof
Reviewers: Dr. Duje Lisičić, Asst. Prof
Dr. Inga Marijanović, Asst. Prof
Dr. Renata Šoštarić, Asst. Prof
Dr. Petar Kružić, Asst. Prof. (replacement)
Thesis accepted: 06.11.2014.
Sadržaj
1. Uvod ............................................................................................................................... 1
1.1. Moždani udar .................................................................................................................. 1
1.2. Živčane matične stanice ................................................................................................. 3
1.3. Ljudske embrionalne matične stanice bubrega ............................................................... 5
1.4. Faktor rasta fibroblasta ................................................................................................... 6
1.5. HMGB1 – protein skupine visoke mobilnosti B1 ........................................................ 12
1.6. Cilj istraživanja ............................................................................................................. 15
1.6.1. Opći cilj istraživanja ........................................................................................... 15
1.6.2. Specifični ciljevi istraživanja ............................................................................. 15
2. Materijali i metode ....................................................................................................... 16
2.1. Materijali ...................................................................................................................... 16
2.1.1. Stanice ................................................................................................................ 16
2.2. Metode .......................................................................................................................... 17
2.2.1. Uzgoj i transformacija bakterija ......................................................................... 17
2.2.2. Izolacija plazmidne DNA ................................................................................... 19
2.2.3. Vizualizacija plazmidne DNA ........................................................................... 21
2.2.4. Kultura HEK293T stanica .................................................................................. 23
2.2.5. Kultura živčanih matičnih stanica ...................................................................... 24
2.2.6. Transfekcija stanica ............................................................................................ 26
2.2.7. MTT test preživljenja i proliferacije stanica ...................................................... 29
3. Rezultati ........................................................................................................................ 30
3.1. Optimizacija tehnike magnetofekcije na HEK293T stanicama .................................... 30
3.2. Magnetofekcija živčanih matičnih stanica ................................................................... 33
3.3. Utjecaj aktivnosti receptora FGFR1 i proteina HMGB1 na preživljenje HEK293T
stanica ........................................................................................................................... 34
3.4. Utjecaj aktivnosti proteina FGF i HMGB1 na preživljenje živčanih matičnih stanica 37
4. Rasprava ....................................................................................................................... 39
5. Zaključak ...................................................................................................................... 44
6. Literatura ...................................................................................................................... 45
Popis kratica
DAMP Damage associated molecular
pattern
HMGB1 High Mobility Group Box Protein 1
NSC Neural stem cell
SVZ Subventrikularna zona
CNS Central nervous system
HEK Human embryonic kidney
Ad5 Humani adenovirus tip 5
NF-M Neurofilament M
NF-L Neurofilament L
FGF Fibroblast growth factor
bFGF Basic fibroblast growth factor
FGFR Fibroblast growth factor receptor
HSPG Heparan sulfate proteoglycans
RTK Receptor tyrozine kinase
CAM Cell adhesion molecule
PD Parkinsons disease
EGF Epidermal growth factor
BDNF Brain derived neurotrophic factor
LIF Leukemia inhibitory factor
NK Natural killer
LPS Lipopolisaharidi
IFN-γ Interferon γ
TLR Toll like receptor
RAGE Receptor for advanced glycation
end products
NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-
enhancer of activated B cells
MAPK Mitogen activated protein kinase
IL-1 Interleukin 1
TNF-α Tumor necrosis factor α
HAT Histon acetiltransferaza
MyD88 Myleoid differentiation primary
response gene 88
IRAK IL-1R associated kinase 1
TRAF6 TNF-receptor associated factor 6
MSC Mesenchymal stem cell
IDO Indolamin-2,3-dioksigenaza
TBE Tris / Borat-EDTA
1
1. Uvod
1.1. Moždani udar
Moždani udar je drugi vodeći uzročnik smrti u svijetu te njegovo liječenje predstavlja ozbiljan
znanstveni problem i klinički izazov. Trenutno dostupne terapije za pacijente još uvijek su
ograničavajuće. Iako mnoge supstance pokazuju obećavajuće djelovanje na molekularnim,
staničnim i animalnim modelima, iznimno je teško prenijeti pretkliničke ideje do učinkovite
kliničke upotrebe (Nakahara i sur, 2009).
Uslijed moždanog udara dolazi do prekida krvnog toka što dovodi do smrti živčanih stanica
u dijelu mozga pogođenim ishemijom. Ishemija dovodi do nesposobnosti održanja ionskog
gradijenta na membrani živčanih stanica te povišene razine glutamata što uzrokuje
ekscitotoksičnost i poremećaje u krvno moždanoj barijeri (Liu i sur, 2007). Kao odgovor na
početnu ozljedu, u izvanstanični mikrookoliš izlučuju se DAMP molekule (eng. Damage
Associated Molecular Pattern) koje pojačavaju sekundarne procese upale i remete krvno
moždanu barijeru. Oštećen mozak začuđujuće je plastičan, pri čemu procesi neurogeneze i
angiogeneze te remodeliranje aksona i dendrita mogu služiti kao izvor supstrata potrebnih za
kompenzaciju i popravak. Aktualna istraživanja u području regenerativne medicine teže
poboljšavanju stanja pacijenta nakon moždanog udara, među ostalim kroz pojačanje
regulacijskih mehanizama u mozgu i terapiju stanicama (Moskowitz i sur, 2010).
Strategije bazirane na staničnoj terapiji pokazuju da matične stanice mišjeg i ljudskog
porijekla mogu preživjeti, diferencirati se u neurone, astrocite i oligodendrocite te inducirati
remodeliranje mozga nakon ozljede (sl. 1) (Lindvall i Kokaia, 2010; Mitrečić, 2010). Dokazi
ukazuju na to da stanice obnavljaju oštećen mozak tako što povećavaju opskrbu krvlju
stvaranjem krvnih žila, smanjenjem upale i stanične smrti te pojačavanjem endogenih
mehanizama popravaka. Dokazano je da intravenozno injektiranje mezenhimalnih matičnih
stanica potiče angiogenezu i poboljšavaju protok moždane krvi, dok injektiranje ljudskih
živčanih matičnih stanica potiče obnavljanje tkiva nakon moždanog udara u štakora kroz
protuupalno djelovanje (Lee i sur, 2008).
Također je pokazano da intravenozno ubrizgane ljudske embrionalne mezenhimalne matične
stanice putuju do regije pogođene infarktom, izražavaju stanične markere endotelnih i
živčanih stanica te vrše neuroprotekciju i pospješuju oporavak (sl.1.) (Liu i sur, 2009).
2
Također, protein iz obitelji molekula DAMP, protein skupine visoke mobilnosti 1 (eng. High
Mobility Group Box Protein 1, HMGB1), pokazao se kao jedan of ključnih regulatora
migracije, proliferacije i diferencijacije matičnih stanica (Hayakawa, 2013).
Slika 1. Transplantacija multipotentnih/živčanih matičnih stanica mogla bi se koristiti za popravak oštećenog
moždanog tkiva (a). Dodatkom egzogenih molekula potakla bi se neurogeneza, popravak aksona i angiogeneza
(b). Matične i progenitorske stanice mogle bi se također injektirati u cirkulaciju te tako dati neuroprotekciju i
modulirati upalu (c) (Hayakawa i sur, 2013).
3
1.2. Živčane matične stanice
Živčane matične stanice (eng. neural stem cells, NSCs) su samoobnavljajuće, multipotentne
stanice iz kojih daljnjom diferencijacijom nastaju tri glavna stanična tipa središnjeg živčanog
sustava: neuroni, astrociti i oligodendrociti (Guillemot, 2007). Osobine ovih stanica daju nadu
u njihovu uspješnu primjenu u popravku neurona nakon ozljeda i bolesti živčanog sustava.
Osnovna ideja upotrebe ovih stanica u terapijske svrhe jest da se stanice izgubljene zbog
ozljeda živčanog sustava zamijene živčanim matičnim stanicama (Martino i Pluchino, 2006,
Mitrečić).
Reynolds i suradnici (1992) demonstrirali su izolaciju stanica iz središnjeg živčanog sustava
embrija i odraslog miša te su ih uspješno umnožili uz prisutnost epidermalnog faktora rasta
čime su dobili sfere stanica tj. neurosfere. Neurosfere se sastoje od neurona i glija stanica te
stanica koje ekspresiraju nestin (intermedijarni filament). Ista studija pokazala je da cijela
neurosfera može biti razvijena iz jedne stanice te da se naknadno može disocirati kako bi
proizvela novu neurosferu. Prema tome, izolirane živčane stanice imaju svojstva matičnih
stanica, samoobnavljanje i multipotentnost te su nazvane živčane matične stanice (Kornblum,
2007).
Paralelno s ovim istraživanjem ispitivalo se i postojanje neurogeneze u mozgu. Studija
Luskina, Loisa i Alvarez-Buylla 1993. godine dala je jasne dokaze o proliferaciji stanica u
subventrikularnoj zoni (SVZ) odraslog glodavca što je rezultiralo novim neuronima unutar
olfaktornog bulbusa (Luskin, 1993) (Lois i Alvarez Bully, 1993).
Najvažnija osobina živčanih matičnih stanica je sposobnost izbora njihove sudbine. Mnoge
potencijalne terapeutske primjene zahtijevaju upotrebu specifičnih staničnih linija (npr.
dopaminenergičnih neurona kod Parkinsonove bolesti ili glutaminenergičnih neurona kod
moždanog udara). Prvi način upravljanja izborom sudbine živčane matične stanice je upotreba
trofičkih faktora dodanih in vitro i in vivo. Primjer je dodatak faktora rasta trombocitnog
porijekla u embrionalne kortikalne progenitorske stanice potiče diferencijaciju u neurone
(Williams i sur, 1997), dok cilijarni neurotrofni faktor i inhibitorni faktor leukemije potiču
diferencijaciju u astrocite (Galli i sur, 2000).
4
Drugi način je manipulacija izražaja transkripcijskih faktora kao što je poticaj ekspresije
Neurogenina 1 u kultiviranim embrionalnim matičnim stanicama telencefalona inducira
diferencijaciju u neurone (Sun i sur, 2001). S druge strane, pojačana ekspresija Notch
receptora rezultira diferencijacijom u glija stanice (Irvin i sur, 2003; Morrison i sur, 2000).
Osim toga sve se više proučava i regulacija transkripcije na epigenetičkoj razini. Metilacija
DNA igra ključnu ulogu u određivanju sudbine nediferencirane živčane matične stanice kao i
u slučaju s drugim vrstama stanica (Fan i sur, 2005). Također se provode istraživanja koja bi
otkrila ključne regulatore proliferacije živčanih matičnih stanica kako bi se preko njih došlo
do više razine kontrole cijelog procesa. Proliferacija živčanih matičnih stanica ne određuje
samo broj stanica unutar CNS-a (eng. central nervous system) već i vrstu stanica (Ohnuma i
Harris, 2003).
Duljina ciklusa povezana je sa stupnjem diferencijacije na taj način da dulji ciklus dovodi do
višeg stupnja diferencijacije, a kraći ciklus k samoobnavljanju stanica (Lukaszewicz i sur,
2002).
Potencijalna upotreba NSC stanica za popravak oštećenja nakon moždanog udara bila je
osnovna ideja za izradu ovog rada.
5
1.3. Ljudske embrionalne matične stanice bubrega
Stanična linija ljudskih embrionalnih matičnih stanica bubrega (eng. Human Embryonic
Kidney, HEK) široko je primjenjivana stanična linija još od njene prvotne izolacije 70-tih
godina prošlog stoljeća. HEK 293T stanice dobivene su iz primarnih HEK stanica
transformacijom pomoću izrezanih fragmenata DNA humanog adenovirusa tipa 5 (Ad5) te
sadrže nukleotide 1 - 4344 adenovirusa, koji se sastoje od sekvenci koje transformiraju rane
regije 1 (eng. early regions 1, E1), ugrađene u kromosom 19. Ovaj stanični tip najčešće se
koristi u transfekcijama zbog velikog postotka uspješnosti i jednostavnog rukovanja
stanicama (Shaw i sur, 2002) . Izvor stanica bio je zdrav, abortiran fetus, a staničnu liniju
uzgojio je znanstvenik Alex Van der Eb u svom laboratoriju na Sveučilištu u Leidenu u
Nizozemskoj. Transformaciju je izvršio Frank Graham, znanstvenik iz istoga laboratorija koji
je osmislio tehniku transformacije stanica pomoću kalcijeva fosfata (Graham i Smiley, 1977).
Ime HEK293T proizlazi iz činjenice da je to bio Grahamov 293 eksperiment.
Godinama se smatralo da su HEK293T stanice epidermalnog porijekla. Prisutnost značajnih
količina neurofilamentnih (NF) podjedinica, NF-M, NF-L i α-interneksina, kao i drugih
proteina tipičnih za živčane stanice, podupire hipotezu da su HEK293T stanice ipak živčanog
porijekla. HEK293T stanice stoga nisu tipične stanice bubrega te se ne mogu koristiti za
kontrole i istraživanja funkcija bubrega (Shaw i sur, 2002).
Kako bi metoda magnetofekcije bila optimizirana u ovom radu korištene su HEK stanice.
6
1.4. Faktor rasta fibroblasta
Živčani sustav kralježnjaka nesumnjivo je najkompleksniji organ živog svijeta po svojoj
morfološkoj organizaciji i staničnoj raznolikosti. Od mnogih molekula uključenih u razvoj
živčanog sustava, faktori rasta fibroblasta (eng. fibroblast growth factors, FGFs) imaju najširu
i najbolje istraženu ulogu u stvaranju kompleksnosti živčanog sustava (Guillemot i Zimmer,
2011).
Faktori rasta fibroblasta čine veliku obitelj polipeptidnih faktora rasta koje nalazimo u
različitim varijantama u višestaničnim organizmima, uključujući i beskralježnjake. Prvi
poznati FGF ligandi, FGF1 i FGF2 izolirani su 1975. godine iz mozga i hipofize na temelju
njihove sposobnosti da stimuliraju proliferaciju mišjih 3T3 fibroblasta. Druge FGF molekule
su identificirane kao onkogeni ili faktori rasta za druge stanične tipove. Kasnijim
sekvenciranjem humanog i mišjeg genoma otkriveno je ukupno 22 FGF gena u svakoj vrsti.
Manji broj FGF-ova postoji u beskralježnjaka, 2 gena u Caenorhabditis elegans (fgl-17 i let-
756) i 3 u Drosophili melanogaster (branch-less i pyramus thisbe) (Guillemot i Zimmer,
2011).
Većina članova FGF obitelji su klasične signalne molekule koje se izlučuju u izvanstanični
prostor gdje se vežu na heparin sulfatne proteoglikane (heparan sulfate proteoglycans,
HSPGs). Djeluju na autokrini i parakrini način različitim afinitetom te drugačijim stupnjevima
specifičnosti sa tirozin kinaznim receptorima (eng. Receptor tyrozine kinase, RTKs)
prisutnima na površini stanica. Također postoji i podskupina molekula FGF slična hormonima
koja djeluje na veće udaljenosti kao endokrini faktori koji reguliraju metabolizam. Treća
podskupina molekula FGF su unutarstanični FGF-ovi koji se ne izlučuju i ne aktiviraju
receptorima FGF, ali stvaraju interakcije sa unutarstaničnim domenama i natrijevim (Na2+
)
kanalima visokog naboja (Itoh i Ornitz, 2008).
FGF obitelj u ljudi sastavljena je od članova koji osim afiniteta za heparin dijele i visoku
homologiju u sekvencama centralne domene sastavljene od 120 aminokiselina (Itoh i Ornitz,
2001) koje stvaraju interakciju s receptorima FGF (Eriksson i sur, 1991). FGF faktore
klasificiramo u skupine prema njihovoj strukturi, biokemijskim osobinama i izražaju
(Szebenyi i Fallon, 1999). Molekule FGF lako difundiraju (Christen i Slack, 1999) te su
sposobne djelovati ovisno o dozi (npr. inducirati različite markere gena pri različitim
koncentracijama) (Green i sur, 1992).
7
FGF signalizacija regulirana je na više razina što rezultira dobrom kontrolom te
pravovremenim širenjem signala. Neki od uključenih mehanizama specifični su za FGF
signalni put dok drugi reguliraju RTK signalizaciju općenito. Interakcija molekula FGF i
njihovih receptora sa HSPG-ovima u izvanstaničnom prostoru je središnji događaj FGF
signalizacije budući da su HSPG-ovi potrebni i za visoko afinitetno vezanje FGF molekula za
receptore FGF-a (FGFR) te za premošćivanje dvije podjedinice FGFR dimera što je potrebno
za njihovu autofosforilaciju. HSPG pridonose specifičnosti interakcija između FGF i FGFR
parova, ali također i štite FGF molekule od degradacije i ograničavaju njihovu difuziju.
HSPG-ovi predstavljaju vrlo raznoliku skupinu molekula sa složenim vremenskim i
prostornim ekspresijskim uzorcima o kojima je prikupljeno mnoštvo eksperimentalnih dokaza
o njihovoj važnosti u FGF signalizaciji na različitim razinama razvoja živčanog sustava
(Grobe i sur, 2005).
FGF receptori su podskupina staničnih površinskih receptora tirozinskih kinaza (RTK) koji
prenose izvanstanične signale nakon vezanja liganda kroz razne citoplazmatske signalne
puteve fosforilacijom tirozina (McKeehan i sur, 1998). Genska obitelj ovih receptora u
kralježnjaka sastoji se od 4 iznimno srodna gena FGFR1-4 (Powers i sur, 2000) Ti geni
kodiraju transmembranske proteine s izvanstaničnom vezujućom regijom te unutarstaničnom
domenom sa tirozin kinaznom aktivnosti (Böttcher i Niehrs, 2005).
Izvanstanična regija sastavljena je od domena sličnih imunoglobulinima (Ig) koje su potrebne
kako bi se FGF molekule vezale. Imunoglobulinima slične domene utječu na afinitet prema
vezanju i na specifičnost (Böttcher i Niehrs, 2005).
Između prve i druge Ig-slične domene proteže se niz aminokiselina na koje se nastavlja
heparin-vezujuća domena. Ove domene potrebne su za interakciju receptora sa
komponentama izvanstaničnog matriksa, tj. s heparin sulfat proteoglikanima i staničnim
adhezijskim molekulama (eng. cell adhesion molecules, CAMs). Unutarstanični dio domene
sastoji se od jukstamembranskog dijela, tirozin kinazne domene i kratkog ugljikovog repa (sl.
2). Osim enzimske aktivnosti, unutarstanični dio receptora veže proteine te ima fosforilacijska
i autofosforilacijska mjesta koja su u interakciji sa unutarstaničnim supstratima (Böttcher i
Niehrs, 2005).
8
Slika 2. Prikaz građe receptora FGFR: A) FGF struktura sastoji se od signalne sekvence i središnje
regije s kojom se veže za receptorske i HSGP-vezujuće domene B) Izvanstanična regija sastavljena je od domena
sličnih imunoglobulinima (Ig) koje su potrebne za vezanje FGF-ova. Između prve i druge domene proteže se
heparin vezujuća domena za koje se vežu CAM molekule. Unutarstanični dio receptora sastoji se od
juksatamembranskog dijela. Tirozin kinazne domene i kratkog ugljikovog repa (Böttcher i Niehrs, 2005).
Vezanje FGF molekula za receptor uzrokuje dimerizaciju dviju molekula receptora i tirozin
kinaznu aktivnost, što vodi autofosforilaciji unutarstanične domene (Mckeehan i sur, 1998).
Autofosforilacija tirozina kontrolira tirozin kinaznu aktivnost te služi kao mehanizam za
regrutiranje signalnih proteina unutar stanica (Schlessinger, 2000). Fosforilirani tirozin je
vezujuće mjesto za Src regiju 2 i fosfotirozin vezujuću domenu signalnih proteina što rezultira
njihovom fosforilacijom i aktivacijom (Pawson, 1993).
Podset proteina sa Src homolognom regijom 2, kao što su Src-kinaza i fosfolipaza Cy (PLCy),
posjeduje intrinzične katalitičke aktivnosti. FGF signalna transdukcija, kao što je analizirano
tijekom ranog embrionalnog razvoja, odvija se kroz tri glavna puta. Formacija tročlanog
kompleksa FGF-heparin-FGFR vodi do autofosforilacije i aktivacije unutarstaničnih signalnih
kaskada, uključujući Ras/MAPK put, fosfatidilinozitol 3 (PI3) kinaza/Akt i PLCy/Ca2+
put
(Böttcher i Niehrs, 2005).
9
FGF je povezan s mnogim neurološkim bolestima. Studije su povezale smanjeno izlučivanje
FGF-a sa atrofijom hipokampusa i prefrontalnog korteksa kod depresivnih pacijenata (Evans i
sur, 2004.). Uloga FGF-a je uočena i kod djelovanja antidepresiva. Liječenje ljudi i glodavaca
sa specifičnim inhibitorima povratnog unosa serotonina pojaćava ekspresiju FGF-a u
prefrontalnom korteksu i drugim moždanim regijama, a akutno i kronično primjenjivanje
FGF2 smanjuje anksioznost i depresivno ponašanje u štakora (Evans i sur, 2004; Perez i sur,
2009). Osim što FGF2 sprečava atrofiju hipokampusa i korteksa također ima i mitogenetski
efekt (potiče proliferaciju) na progenitore hipokampusa (Duman i Monteggia, 2006).
Disregulacija FGF signaliziranja tijekom razvoja povezana je i sa poremećajima poput
autizma (Rubenstein, 2010), spino-cerebralne ataksije i Parkinsonove bolesti (PD, Laezza i
sur, 2007). Polimorfizam jednog nukleotida FGF20 gena u više je studija povezan sa
Parkinsonovom bolešću (Clarimon i sur, 2005; van der Walt i sur, 2004; Wang i sur, 2008).
FGF2 (bazični FGF, bFGF; FGF) se ekspresira u substantii nigri srednjeg mozga i
cerebellumu gdje potiče preživljenje dopaminenergičnih neurona oštećenih u PD (Murase i
McKay, 2006).
Lezije u živčanom sustava reaktiviraju razvojne procese poput proliferacije i diferencijacije
progenitorskih stanica na mjestu ozljede. Članovi FGF obitelji, posebice FGF2, uključeni su u
neuroprotekciju i popravak oštećenog živčanog tkiva. FGF1 i FGF2 pojačano su ekspresirani
u glija stanicama i živčanim matičnim stanicama nakon oštećenja živčanog sustava, a studije
na miševima s mutiranim FGFR1 i FGFR2 receptorima pokazuju da su oba gena potrebna za
živčani popravak koji slijedi nakon epileptičkih napada, moždanog udara i traumatske ozljede
mozga (Fagel i sur, 2009; Yoshimura i sur, 2001).
bFGF osim samostalnog djelovanja pozitivno utječe na popravak lezija i uz pomoć drugih
faktora poput EGF-a ili moždanog neurotrofnog faktora (eng. brain derived neurotrophic
factor, BDNF). bFGF također sudjeluje i u zaštiti neurona od smrti što je zabilježeno u mišjim
modelima s neurodegenerativnim bolestima poput Parkinsonove ili Huntingtonove (Jin i sur,
2005).
S obzirom na sva ova saznanja o FGF faktorima počele su se provoditi znanstvena
istraživanja koja koriste stanice iz vanjskog izvora i primjenjuju ih na područje oštećenja
živčanog sustava kako bi se zaobišla ograničena mogućnost samostalne regeneracije tkiva.
FGF-ovi imaju glavnu ulogu u proliferaciji i diferencijaciji neurona te se stoga koriste u tu
svrhu.
10
Pluripotentne embrionalne stanice se mogu in vitro bezbroj puta samoobnoviti pod utjecajem
inhibitornog faktora leukemije (leukemia inhibitory factor, LIF), a pod utjecajem FGF-a
prelaze u živčane stanice (Kunath i sur, 2007). Pri transplantaciji progenitora induciranih
FGF-om u mozak neonatalnog miša ili oštećeni mozak odraslog miša, progenitorske stanice
se integriraju u moždano tkivo i diferenciraju u neurone i astrocite. Ipak, njihov kapacitet
obnove u animalnim modelima je dosta ograničen. Pravilnim pristupom u ovome problemu
smatra se prvo diferencijacija ovih stanica u kulturi, a zatim njihova transplantacija (Rosser i
sur, 2000). U svrhu tog cilja istražuju se FGF-ovi i razvijaju mnogi protokoli za
diferencijaciju živčanih progenitora u medicinski bitne stanične tipove (sl 3).
Slika 3. FGF i in vitro generacija neurona: FGF je uključen u 3 različita koraka tijekom generiranja
tri tipa stanica iz embrionalnih matičnih stanica. LIF održava stanice u nediferenciranom stanju blokirajući FGF4
koji potiče stvaranje mesodermalnih ili živčanih stanica (lijevo). FGF2 (bFGF) potiče stvaranje multipotentnih
samoobnavljajućih NSC, a uz EGF potiče brzi rast NSC u adherentnim kulturama ili u obliku neurosfera (u
sredini). Različiti FGF-ovi se koriste za stvaranje različitih živčanih podtipova (desno) (Guillemot i Zimmer,
2011).
11
FGF2 je također mitogenički faktor te je dodatak visoke koncentracije i FGF2 i EGF-a postao
dio standardne procedure širenja NSC stanica u kulturi u obliku neurosfera ili adherentnih
kultura (Conti i sur, 2005; Palmer i sur, 1995; Vescovi i sur, 1993).
FGF2 potiče proliferaciju živčanih progenitora u kulturama skraćivanjem G1 faze staničnog
ciklusa i inhibicijom stvaranja postmitotičkih neurona (Lukaszewicz i sur, 2002).
Budući da se pravilnim pristupom korištenja matičnih stanica smatra prvo njihovo tretiranje
FGF-om, a zatim transplantacija, živčane matične stanice tretirane su FGF-om u kulturi kako
bi se uočio njegov učinak na njihovu proliferaciju i preživljenje.
12
1.5. HMGB1 – protein skupine visoke mobilnosti B1
Protein skupine visoke mobilnosti B1 (HMGB1), poznat i kao amfoterin, je DNA-vezujući
protein koji se izlučuje aktivno kao odgovor na stimulaciju citokinima ili pasivno tijekom
stanične smrti (Scaffidi i sur, 2002) te je prisutan u gotovo svim eukariotskim stanicama
(Bonaldi i sur, 2003) gdje je uključen u stabilizaciju jezgrine strukture i transkripciju gena
(Pasqualini i sur, 1989). Veže se nespecifično za linearnu DNA i time olakšava stvaranje
nukleoproteinskih kompleksa i regrutaciju transkripcijskih čimbenika (Goodwin i sur, 1973).
Originalno je otkriven unutar stanica, a kasnije je otkrivena i njegova izvanstanična aktivnost
(Rauvala and Pihlaskari, 1987). HMGB1 molekule prisutne u izvanstaničnoj sredini mogu
služiti kao nekrotični markeri koji aktiviraju prirođeni imunosni sustav i posreduju širok
spektar fizioloških i patoloških odgovora (Yamada and Maruyama, 2007).
Izvanstanični HMGB1 izlučuju aktivirani makrofagi (Bonaldi i sur, 2003), NK stanice
(Semino i sur, 2005) i mijeloidne dendritičke stanice (Dumitriu i sur, 2007) kao odgovor na
endotoksine poput lipopolisaharida (LPS-a) i druge upalne stimulanse kao što je molekula
interferon γ (IFN- γ) (Hayakawa, 2013). HMGB1 ne sadrži vodeću sekvencu, pa se stoga
izlučuje neklasičnim putem koji može uključivati specijalizirane vezikule endolizosomalnog
odjeljka (Sims i sur, 2009). Osim aktivnog izlučivanja, HMGB1 može biti otpušten u
izvanstanične prostore iz oštećenih ili nekrotičnih stanica. U tom slučaju, membrane postaju
propusne, a HMGB1 difundira iz jezgre u citoplazmu, pa u izvanstanični prostor. Kod
moždanog udara izlučivanje HMGB1 počinje 30 minuta nakon okluzije arterija, dok se većina
citokina krene izlučivati par sati nakon moždanog udara. Inhibicija aktivnosti HMGB1
proteina smanjuje upalu i disrupciju krvno-moždane barijere što dovodi do zaključka da je
upravno on rani medijator koji aktivira upalnu kaskadu (Hayakawa, 2013).
Izvanstanični HMGB1 veže se na svoje receptore i aktivira signalni put koji vodi pojačanom
izražaju citokina i pro-upalnih molekula. Djeluje na autokrini i parakrini način. (Hayakawa i
sur, 2013). Na stanicama mozga djeluju TLR-ovi (eng. toll-like receptors) i RAGE-ovi (eng.
Receptor for advanced glycation end products) receptori preko kojih se odvija HMGB1
signalizacija (Caso i sur, 2007). RAGE-ovi pripadaju podskupini imunoglobulinskih receptora
te se povezuju sa raznim patološkim stanjima poput dijabetesa, neurodegenerativnih bolesti,
upalnih procesa i tumora (Rauvala and Rouhiainen, 2007). Izražavaju ih monociti, makrofazi,
živčane, endotelne i tumorske stanice (Yang i sur, 2005).
13
Vezanjem za RAGE receptore potiču se NF-κB (engl. nuclear factor kappa-light-chain-
enhancer of activated B cells) (Thoranelly, 1998) i MAPK (engl. Mitogen Activated Protein
Kinase) signalni putevi (Degryse i sur 2001). Preko proteinskih kinaza Rac1, CDC42, Ras i
p38 dolazi do aktivacije NF-kβ puta (Yang i sur, 2010). NF-kβ je proteinski kompleks
uključen u stanične odgovore na stres, citokine, slobodne radikale. Igra ključnu ulogu u
regulaciji imunosnog odgovora kontrolom mnogih gena uključenih u stvaranje upale.
Prisutnost NF-kβ vezujućih mjesta na promotoru RAGE receptora stvara pozitivnu povratnu
spregu (Yan et al, 1994).
Ovi putevi su bitni i u samom izlučivanju HMGB1. Vezanjem IL-1 (engl. interleukin 1),
TNF-α (engl. tumor necrosis factor α), IFN-γ, LPS-a ili samog HMGB1 dolazi do njihove
aktivacije pri čemu fosforilirani MAPK-ovi i NF-kappa B migriraju do jezgre gdje direktno ili
preko adaptorskih proteina aktiviraju HAT-ove (engl. Histone Acetylases) ili inhibiraju
deacetilaze. Taj događaj zauzvrat potiče acetilaciju HMGB1. Jednom izvezeni acetilirani
HMGB1 ne može se više vratiti u stanicu (Palumbo i sur, 2004). Izražaj RAGE receptora
nizak je u uobičajenim uvjetima, ali pojačani izražaj uočen je kod upalnih procesa (Barlovic i
sur, 2011).
TLR receptori imaju građu sličnu proteinu Tollu te se nalaze na staničnoj membrani gdje
prepoznaju izvanstanične produkte mikroorganizama, ili u citosolu, gdje prepoznaju mikrobne
produkte nastale unutar stanice. Mogu biti u monomernom obliku ili međusobno stvarati
dimere. TLR receptori najvažnija su skupina receptora urođene imunosti. Njihova aktivacija
dovodi do niza događaja koji završavaju lučenjem proupalnih citokina, antimikrobnih peptida
i proteina (Andreis i sur, 2010). Nakon vezanja HMGB1 TLR2/4 šalju signale preko MyD88
(engl. Myeloid differentiation primary response gene 88), IRAK (engl. IL-1R-associated
kinase 1) i TRAF6 (engl. TNF-receptor-associated factor 6) do NF-kB kompleksa (Yang i
sur, 2010).
Više razine ekspresije TLR4 nađene su u regijama mozga gdje nije čvrsta krvno-moždana
barijera (Laflamme i sur, 2003). Blokadom ovih receptora smanjena je produkcija citokina i
dušikovog oksida te time i cjelokupna upala (Kim i sur, 2006) što predstavlja još jedan dokaz
uloge HMGB1 u indukciji upale.
Unatoč njegovim negativnim osobinama smatra se da HMGB1 ima i pozitivne funkcije.
HMGB1 signalizacija promiče endotelnu aktivaciju (Treutiger i sur, 2003) i rast (Schlueter i
sur, 2005) te može pojačati rast neurita i preživljenje neurona (Huttunen i sur, 2002).
14
Inhibicijom reaktivnih astrocita, u mišjem modelu, zatomljuju se HMGB1 pozitivni astrociti
infarktnog područja što je dovelo do poremećaja u ekspresiji neurovaskularnih markera
(CD31, PSD95) koji su povezani sa funkcionalnom obnovom nakon moždanog udara
(Hayakawa i sur, 2010).
HMGB1 također pokazuje blagotvoran učinak u velikom broju patoloških stanja zahvaljujući
njegovoj sposobnosti regrutacije matičnih stanica te pozitivnom učinku na njihovu
proliferaciju (Hayakawa, 2013). HMGB1 inducira transmigraciju matičnih stanica preko
endotelnih membrana. Dokazano je da implantacijom u zdravi mišić može privući matične
stanice injektirane u optok krvi (Palumbo i Bianchi, 2004).
Također se pokazao kao ključni faktor u angiogenezi nakon moždanog udara (Biscetti i sur,
2010) te regulator aktivnosti mezenhimalnih matičnih stanica (eng. mesenchymal stem cell,
MSC) (Pistoia i Raffaghello, 2011). HMGB1 osim privlačenja MSC stanica utječe pozitivno i
na njihovu proliferaciju te inhibira njihovu sposobnost izlučivanja imunosupresivne molekule
indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO) čije izlučivanje potiče IFN-γ. S druge strane, postoje
istraživanja koja govore o negativnom utjecaju HMGB1 na proliferaciju MSC stanica, ali
pozitivniom učinku na diferencijaciju prema osteoblastima (Meng i sur, 2008).
HMGB1 je vrlo važan i pri razvoju mozga vrste lat. Danio rerio (eng. Zebrafish) jer
omogućava preživljenje i proliferaciju živčanih progenitorskih stanica (Zhao i sur, 2011).
Živčani progenitori zamjenjuju izgubljene živčane stanice, pojačavaju neurogenezu,
angiogenezu i sinaptogenezu.
Multipotentnost HMGB1 mogla bi pomoći regeneraciji živčanog tkiva pojačavanjem
potencijala živčanih progenitora nakon moždanog udara. Iz tog razloga, u svrhu izrade ovoga
rada, živčane matične stanice su tretirane HMGB1 proteinom u kulturi prije magnetofekcije.
15
1.6. Cilj istraživanja
1.6.1. Opći cilj istraživanja
Opći cilj istraživanja je bio istražiti utjecaj FGF i HMGB1 na preživljenje i proliferaciju
živčanih matičnih stanica u kulturi.
1.6.2. Specifični ciljevi istraživanja
1. Optimizirati tehniku magnetofekcije HEK293T stanica plazmidima FGFR1-mcherry,
FGFR1-EGFP i pEGFP-N1.
2. Transfecirati živčane matične stanice plazmidima koji sadrže FGFR1 receptor.
3. Odrediti uspješnost transfekcija HEK293T i živčanih matičnih stanica
kvantificiranjem transfeciranih stanica pomoću fluorescencijskog mikroskopa.
4. Odrediti učinak proteina FGF i HMGB1 na tretirane matične stanice.
5. Odrediti preživljenje transfeciranih i tretiranih stanica MTT testom.
16
2. Materijali i metode
2.1. Materijali
2.1.1. Stanice
Živčane matične stanice korištene u ovom radu dobivene su izolacijom iz mozgova mišjih
zametaka starih 14 dana linije C57bl/6 prema dolje opisanom protokolu Laboratorija za
matične stanice pri Hrvatskom institutu za istraživanje mozga.
HEK293T stanice su dobivene u Laboratoriju za matične stanice pri Hrvatskom institutu za
istraživanje mozga, gdje su u redovitoj upotrebi.
2.1.2. Plazmidi
Za transfekcije stanica korištena su tri različita plazmida. pEGFP-N1 je komercijalno
dostupan plazmid (Clontech), dok je FGFR1-mCherry i FGFR1-EGFP plazmide ljubazno
ustupio laboratorij prof.dr.sc. Klimachewskog (Irshick i sur, 2012.)
17
2.2. Metode
2.2.1. Uzgoj i transformacija bakterija
Budući da plazmidi korišteni u eksperimentima nose gen za otpornost na kanamicin,
pripremljene su bakterijske podloge s tim antibiotikom s ciljem da se potakne rast samo
uspješno transformiranih kolonija. Plazmidi FGFR1-mcherry, FGFR1-EGFP i pEGFP-N1
sadrže otpornost na kanamicin. Za pripravu podloga u 400 ml deionizirane vode dodano je 6
g agara (Agar-agar, Kobe 1; Carl Roth) te 10 g LB Broth medija (Luria Miller, LB; Carl
Roth). Medij je prije korištenja steriliziran autoklaviranjem (Kambič) te nakon toga ohlađen
na otprilike 55 °C prije dodavanja antibiotika u konačnoj koncentraciji od 100 µg/ml. Medij je
zatim izliven u Petrijeve posudice. Nakon što je podloga prešla u kruto stanje LB ploče su
pohranjene u hladnjak na 4 C°.
Kompetentne bakterije su pripremljene su tako da je inkubirano 10 µl DH5α bakterija (izvor
laboratorij prof. dr.sc. Gajovića) preko noći u 4 ml LB medija i uz trešnju brzinom od 220
rpm. 1 ml prekonoćne kulture nasađen je u 50 ml LB medija bez antibiotika te ponovno
inkubiran uz trešenje (pri 37 °C) sve dok optička gustoća kulture nije iznosila 0,3 - 0,4.
Optička gustoća kulture izmjerena je na spektrofotometru (BIO RAD Model 680XR) pri
valnoj duljini od 600 nm. Zatim je 25 ml bakterijske kulture odvojeno i inkubirano na ledu 10
minuta. Kultura je centrifugana 5 min na 4 °C pri brzini od 2000 x g (Centrifuge 5415C,
Eppendorf). Supernatant je otklonjen, a talog resuspendiran u 12,5 ml hladnog 50 mM CaCl2.
Bakterijska kultura je ponovno centrifugirana 5 min na 4 °C pri brzini od 2000 x g, a talog
resuspendiran u 2,5 ml otopine za smrzavanje (25 ml 100 mM CaCl2, 5 ml glicerol, 20 ml
dvostruko destlirane H20, dvostruko destilirane H2O). Bakterije su pohranjene u alikvotima
od po 150 µl na -80°C.
Nakon toga, DH5α bakterijske stanice transformirane su heat-shock metodom, što
podrazumijeva izlaganje stanica temperaturi višoj od optimalne temperature organizma iz
kojeg su izolirane. Izlaganjem bakterijskih stanica nagloj promjeni temperaturi, tj. heat
shocku, dolazi do stvaranja razlike u tlaku između unutrašnjosti bakterije i njezine okoline što
dovodi do stvaranja pora u membrani bakterija kroz koje može proći superzavijena DNA.
Kompetentne Escherichia Coli DH5α bakterije preseljene su s -80°C, gdje su pohranjene na
led kako bi se postupno odmrznule. Dodano je 2.5 µl plazmidne DNA (Clontech; laboratorij
prof. Klimachewskog) u 50 µl DH5α kompetenih bakterijskih stanica.
18
Smjesa bakterija i plazmida kratko je promiješana te ostavljena na ledu 30 minuta. Zatim je
prenesena u vodenu kupku na 45 sekundi pri temperaturi od 42 °C. Smjesa bakterija i
plazmida je potom ostavljena na ledu 2 minute, a nakon toga dodano je 450 µl LB medija.
Tako pripremljene bakterije inkubirane su na 37 °C sat vremena u inkubatoru za bakterije s
horizontalnom tresilicom (OPTIC Ivyem System). Nakon sat vremena po 50 µl bakterija
nasađeno je na svaku pojedinu LB ploču te su LB ploče ostavljene u inkubatoru na 37 °C
preko noći. LB ploče sadržavale su selektivni antibiotik (kanamicin) tako da su rasle samo
bakterije s plazmidom budući da on nosi rezistentnost. Idući dan su određene kolonije
prenesene s ploča u LB medij s antibiotikom koncentracije 100 µg/ml. Epruvete su ostavljene
preko noći u tresilici na 37 °C.
19
2.2.2. Izolacija plazmidne DNA
Nakon što su se bakterijske stanice namnožile u prekonoćnoj kulturi uslijedila je izolacija
plazmidne DNA. Plazmidna DNA izolirana je metodom alkalne lize u tri koraka. Za prvi
korak, pripravljen je pufer za stabilizaciju stanica. U tu svrhu, 0,303 g Tris baze i 0,372 g
Na2EDTA x 2H20 otopljeno je u 80 ml deionizirane vode. pH je podešen na 8,0 pomoću
klorovodične kiseline. Puferu s pH 8,0 dodano je 0,9 g glukoze i deionizirane vode do
ukupnog volumena od 1 l. Tik prije korištenja, puferu je dodano 10 mg RNaze A na 100 ml
otopine. Glukoza u puferu za stabilizaciju stanica održava otopinu izotoničnom, EDTA kelira
divalentne katione koji su produkt lize bakterija te se inaktiviraju enzimi koji mogu naštetiti
plazmidnoj DNA, dok Tris baza ima pufersku ulogu. RNaza A je stabilni enzim aktivan u
uvjetima poput visoke alkalnosti, prisutnosti kelirajućih reagensa i deterdženata. RNaza A
pomaže ukloniti RNA kako bi bila izolirana što čišća plazmidna DNA.
Za drugi korak, pripravljen je pufer za lizu stanica. U tu svrhu, 0,8 g NaOH otopljeno je u 95
mL deionizirane vode te dodano 5 mL 20%-tnog SDS-a. SDS je deterdžent koji otapa
fosfolipide i denaturira proteinske komponente stanične membrane što dovodi do lize
bakterijskih stanica i oslobađanja staničnog sadržaja. NaOH stvara visoko alkalne uvjete što
dovodi do denaturacije plazmidne i genomne DNA.
Za treći korak, pripremljen je pufer za neutralizaciju. U tu svrhu je otopljeno 29,44 g
kalijevog acetata u 50 mL deionizirane vode. pH je podešen na 5,5 pomoću glacijalne acetilne
kiseline i dodano deionizirane vode do ukupnog volumena od 100 mL. Kalijev acetat u puferu
ima neutralizacijsko djelovanje, dakle vraća pH u normalu što rezultira renaturacijom i
precipitacijom plazmidne i genomske DNA. Obje DNA se renaturiraju dodatkom pufera za
neutralizaciju. Plazmidna DNA se renaturira pravilno zahvaljujući svojoj kružnoj
konformaciji i kovalentnim vezama te zadržava u otopini. Genomska DNA se nepravilno
renaturira te dolazi do njene precipitacije i padanja na dno epice.
Za početak procesa izolacije odvojen je 1,5 mL kulture inkubirane preko noći. Cetrifugirana
je 10 minuta pri 3000 x g i 4 °C. Supernatant je bačen, a talog s bakterijama resuspendiran u
100 µL hladnog pufera za stabilizaciju vorteksiranjem kako bi se stanice razišle jedna od
druge. Nadalje, smjesi je dodano 200 μl pufera za lizu stanica te je smjesa nježno promiješana
oko pet puta i inkubirana na ledu 4 - 5 minuta. Nakon ovog koraka dodana je RNaza A (100
mg/L) te potom otopina za lizu stanica.
20
U zadnjem koraku, dodano je 150 µL pufera za neutralizaciju, ponovno je sve lagano
izmiješano i inkubirano na ledu 5 minuta. Centifugiranjem 5 minuta na 12000 x g i 4 °C
dobiven je bijeli talog. Supernatant je odvojen te mu je dodan je fenol-kloroform u jednakom
volumenu (450 μl). Otopina je vorteksirana i centrifugirana 2 minute na 12000 x g.
Supernatant je prenesen u čiste epice te je dodano dvostruko više volumena 100% etanola
(EtOh) pri sobnoj temperaturi kako bi se precipitirala plazmidna DNA.
Nakon ponovnog vorteksiranja izdvojile su se dvije faze otopine. Gornja faza je odvojena i
centrifugirana 5 minuta na 12000 x g i 4 °C. Supernatant je bačen, a DNA talog je ostavljen
da se posuši. Dodan je 1 ml 70%-tnog etanola kako bi se uklonile soli iz peleta. Talog je
otopljen u 50 µL deionizirane vode koja je sadržavala 20 µg/ml RNaze A, te je pohranjen u
zamrzivač na -20 C°.
Koncentracija plazmidne DNA izmjerena je na NanoDrop ND-1000 spektrofotometru.
Mjerenje je izvršeno nakon izolacije plazmidne DNA, a prije obrade restrikcijskim
endonukleazama. Maksimalna apsorpcija DNA je na valnoj duljini od 260 nm, pa je na
spektrofotometru mjerena apsorpcija ultraljubičastih zraka na toj valnoj duljini. Također je
mjerena i čistoća DNA u otopini mjereći apsorbanciju ultraljubičastih zraka na valnoj duljini
od 280 nm, na kojoj proteini maksimalno apsorbiraju. Čistoća je izražena kao omjer
apsorbancije na 260 nm (DNA) i apsorbancije na 280 nm (proteini). Taj omjer kod dobro
pročišćene DNA iznosi između 1,6 i 1,8. Rezultati mjerenja prikazani su tablicom 1.
Tablica.1. Koncentracije plazmidne DNA
Plazmidi C (ng/μl)
pEGFP-N1 5000
FGFR1-mcherry 3100
FGFR1-EGFP 3200
21
2.2.3. Vizualizacija plazmidne DNA
Restrikcijske endonukleaze (RE) su enzimi koji prepoznaju specifične kratke palindromske
slijedove DNA i režu dvolančanu DNA na tim slijedovima ili nedaleko od njih.
Rekombinantni plazmid FGFR1-mCherry podvrgnut je obradi restrikcijskom endonukleazom
EcoRI (Promega) uz pripadajući pufer H (Promega), a plazmidi pEGFP-N1 i FGFR1-EGFP
restrikcijskom endonukleazom HindIII (Promega) uz pripadajući pufer E (Promega), kako
bismo plazmide mogli vizualizirati na elektroforezi. Cijepanje restrikcijskim endonukleazama
uslijedilo je nakon izolacije plazmida iz bakterija. Obrada restrikcijskim enzimima je vršena
na 1,5 µg DNA u reakciji ukupnog volumena 20 µL koristeći goveđi serum albumin (Bovine
Serum Albumin, BSA, Promega) koji pospješuje enzimatske reakcije te pripadajući pufer.
Reakcijska smjesa inkubirana je 4 sata na 37 C°. Sastojci reakcijske smjese i njihovi volumeni
prikazani su tablicom 2. Rezultat obrade provjeren je elektroforezom na agaroznom gelu (sl.
4).
Tablica. 2. Sastojci reakcijske smjese
(µl) FGFR1-mCherry FGFR1-EGFP pEGFP-N1
ddH20 5 5 14,5
BSA 2 2 2
Pufer 2 2 2
Plazmidna DNA 10 10 0,5
RE 1 1 1
Elektroforeza plazmidne DNA na agaroznom gelu koristila se za razdvajanje molekula DNA
prema veličini. S obzirom da konformacija molekule DNA utječe na njenu pokretljivost u
elektroforezi na gelu, koristila se DNA prethodno linearizirana restrikcijskim
endonukleazama. Nelinearizirana plazmidna DNA daje 3 linije na gelu, od kojih svaka
odgovara jednoj njenoj konformaciji (otvorenoj kružnoj, linearnoj i superzavijenoj
konformaciji) te nam ne bi mogla poslužiti kao pokazatelj veličine, odnosno broja baza
plazmidne DNA.
22
Za elektroforezu su korišteni gelovi s 1% agaroze (Invitrogen), a za vizualizaciju DNA na
gelu korišten je etidijev bromid (Sigma-Aldrich) budući da on fluorescira na UV svjetlu kad
je interkaliran u DNA, čime različite linije DNA molekule postaju vidljive. U jažice gela se
također s uzorkom dodaje i pufer za nanošenje koji ima dvojaku funkciju. Budući da je obojen
on omogućuje praćenje kretanja uzoraka kroz gel te omogućuje da se uzorak nataloži u jažici
kod nanošenja na gel. Elektroforeza je provođena u 1 x TBE puferu (Tris/Borat/EDTA) pri
sobnoj temperaturi i naponima od 10 do 15 mV/cm na uređaju za elektroforezu (Biometra
PS304 II minipac). Veličina fragmenata DNA određivana je pomoću komercijalnih standarda
poznatih veličina (Bench Top 1kb DNA Ladder, G754 A). Rezultat elektroforeze prikazan je
slikom 4.
Slika 4. Ljestvice DNA na agaroznom gelu: redom su poredani pEGFP-N1, FGFR1-mcherry i FGFR1-EGFP
plazmid. U zadnjem stupcu je prikazan marker (Bench Top 1kb DNA Ladder) prema kojemu se uspoređuje
veličina fragmenata ispitivanih plazmida.
23
2.2.4. Kultura HEK293T stanica
HEK293T stanice dobivene su smrznute te su za uspostavu kulture prvo morale biti
odmrznute. Smrznute HEK293T stanice prenesene su u iz zamrzivača u vodenu kupelj
(Techne TE-10D Tempette) na 37 °C. Nakon što su se otopile, cijeli volumen je dodan u 20
ml medija za rast HEK293T stanica. HEK293T stanice uzgajane su u polistirenskim bocama
za uzgoj stanica povrsine 75 cm2 (Falcon). Medij za HEK293T stanice sastoji se od sa 1%
Pen/Strep-a (mješavina penicilina i streptomicina, Gibco), 1% L-glutamina (Sigma) i 10%
telećeg seruma (eng. Fetal Bovine Serum, Gibco) i DMEM-a (Lonza).
Kada postigne konfluentnost od oko 80% (svakih 3-4 dana), kultura HEK293T stanica mora
biti presađena. Nakon uklonjanja starog medija dodano je 10 ml sterilnog 1 X PBS-a. Sterilni
PBS ima ulogu uklanjanja iona koji su sadržani u mediju za HEK stanice. Ione je potrebno
ukloniti kako bi tripsin koji se dodaje u sljedećem koraku mogao djelovati. Tripsin-EDTA
(PAA- The Cell Culture Company) je dodan direktno na stanice te ostavljen da djeluje 1-2
minute, dok se stanice nisu krenule odvajati od podloge. Čim su se stanice počele odvajati
dodano je 4 ml medija za rast koji sadrži ione (Ca2+
) te inaktivira tripsin. Pri dužem vremenu
tripsin može uzrokovati smrt stanica. Nakon dodatka medija za rast stanice su centrifugirane
4 min pri 1000 x g na centrifugi Thermo Scientific SL 16R Centrifuge. Potom je sav medij
uklonjen te su stanice resuspendirane u 2 ml medija. Izvršeno je prebrojavanje stanica
pomoću hemocitometra (Marienfield) te je dodan željeni volumen u 20 ml svježeg medija.
Ukoliko su bile potrebne za eksperiment, nakon prebrojavanje stanica, dodan je željeni
volumen stanica u bunariće na pločama (eng. Tissue Culture Treated Plate, 24 well, Falcon).
Dio HEK 293T stanica nanovo je smrznut kako bi ostale pohranjene za buduće eksperimente.
Medij sa stanicama pohranjen je u cryo-tubice (Kisker Biotech). Cijeli proces izveden je na
ledu jer je korišten DMSO (Sigma) čije otapanje je egzotermna reakcija što može uzrokovati
koagulaciju proteina u serumu. Medij za smrzavanje sastoji se od 70% DMEM-a , 10% FBS-a
(Gibco) i 20% DMSO-a. Prvo su promiješani DMEM i FBS, a zatim je dodan DMSO na ledu.
Nakon toga stanice su tripsinizirane i centrifugirane (vidi ''Presađivanje HEK293T stanica'') a
zatim resuspendirane u 1,5 mL medija koji se sastojao samo od DMEM-a i FBS-a.
Na tih 1,5 mL stanica u DMEM-u dodan je 1,5 mL već pripremljenog medija s DMSO. Po 1
mL medija dodan je u svaku cryo tubicu koje su zatim pohranjene u zamrzivač na -80 °C.
24
2.2.5. Kultura živčanih matičnih stanica
Mišica iz linije C57bl/6 trudna 14 dana eutanazirana je cervikalnom dislokacijom. Izvađena
su oba roga maternice s embrijima i premješteni u Petrijevu posudicu s hladnim 1 X PBS-om.
Unutar digestora (EHRET) su izolirani embriji iz maternice. Glave su im odvojene od tijela na
mjestu vratne leđne moždine. Zatim, počevši od kranijalnog kraja glave, izvršen je sagitalni
rez kroz kožu i lubanju te je izoliran mozak. Nakon izolacije, mozgovi su usitnjeni škaricama
i pincetom te je započet proces disocijacije. Odvojen je višak tekućine i dodana je akutaza (2-
3 ml za 4-5 mozgova) (eBioscience.com). Inkubacija s akutazom trajala je 20-30 minuta uz
resuspendiranje do ukupno 30 puta. Nakon inkubacije tkivo se istaložilo te je odvojen gornji
sloj tekućine sa stanicama. Kako bi se inaktivirala akutaza dodano je 5 ml DMEM-F12
(Gibco) budući da se ona inaktivira razrijeđenjem. Provedena je centrifuga 6 min na 340 x g i
pri sobnoj temperaturi. Stanični talog je resuspendiran u 2 ml medija za rast. Izvršeno je
prebrojavanje stanica te nasađen željeni broj stanica u 25 ml medija za živčane matične
stanice. Medij za živčane matične stanice sastoji se od DMEM-F12 (92%), sa 1xN2 (Gibco),
1xB27 (Gibco) i 1xPen/Strep (Gibco) sa 20 ng/ml EGF (Gibco) i 10 ng/ml bFGF (Gibco).
Stanice su pohranjene u inkubator (Binder) pri 37 C° i 5% CO2. Unutar 24 - 48h stanice su
počele stvarati neurosfere. Treći dan je vršeno presađivanje stanica.
Živčane matične stanice presađivane su pri veličini nakupina od 150-200 µm. Nakon 5 min
centrifuge pri brzini od 200 x g i sobnoj temperaturi supernatant je uklonjen te je dodano 2 ml
akutaze. Neurosfere su inkubirane u akutazi 10 minuta pri sobnoj temperaturi uz konstantno
trešenje i trituraciju (20-30 puta). Za zaustavljanje reakcije dodano je 5 ml DMEM-F12 kako
bi se akutaza razrijedila te je suspenzija centrifugirana 6 min pri brzini od 340 x g te sobnoj
temperaturi. Supernatant je uklonjen, a talog sa stanicama resuspendiran u mediju za rast.
Izvršeno je prebrojavanje stanica te je željeni broj stanica dodan u svježi medij. Ukoliko su
bile potrebne za eksperiment, nakon prebrojavanje, željeni broj stanica dodan je u bunariće na
pločama (eng. Tissue Culture Treated Plate, 24 well, Falcon).
Višak živčanih matičnih stanica uvijek je smrzavan za buduće eksperimente. Kako bi bile
spremne za smrzavanje prethodno su nasađene u gustoći od 10 milijuna stanica u 10 ml
medija i ostavljene dan, dva u kulturi kako bi se oblikovale neurosfere. Proces smrzavanja je
izveden na ledu budući da je korišten DMSO kao i kod smrzavanja HEK stanica. Medij za
smrzavanje sastoji se od 70% DMEM-F12, 10% FBS-a i 20% DMSO-a. Prvo su promiješani
DMEM i FBS, a zatim je dodan DMSO na ledu.
25
Neurosfere nisu tretirane akutazom već su centrifugirane (200 x g, 5 minuta). Medij je
uklonjen, a pelet je vrlo oprezno resuspendiran u 1,5 ml DMEM/F-12 s 10% FBS-a. Na tih
1,5 ml dodan je 1,5 ml prethodno pripremljenog medija za smrzavanje te je razdijeljen po 1
ml u 3 cryo-tubice. Stanice su zatim pohranjene na -80 °C.
Stanice su izvađene sa -80°C i prebačene u kupelj na 37 °C. Čim su se otopile izvršena je
centrifuga (200 x g, 5 minuta). Uklonjen je supernatant (medij za smrzavanje s DMSO), a
talog resuspendiran u 1 ml medija za rast vrlo oprezno kako se ne bi razbile sfere. Stanice su
nasađene u 20 ml medija za NSC te su nakon dva dana neurosfere bile spremne za
presađivanje.
26
2.2.6. Transfekcija stanica
Transfekcija je metoda unosa strane DNA u stanice eukariota, a izvodi se pomoću
prijenosnika ili vektora. Za transfekciju stanica korištena je metoda magnetofekcije.
Magnetofekcija predstavlja transfekciju pomoću magnetnog polja te magnetnih čestica koje
pod utjecajem polja prolaze kroz membranu stanica u njihovu unutrašnjost. Magnetofekcije su
izvršene prvo na HEK293T stanicama, a kasnije i na živčanim matičnim stanicama.
HEK293T stanice korištene su kako bismo dobili početne rezultate s kojima bismo mogli
usporediti uspješnost na živčanim matičnim stanicama. Korištene su dvije različite vrste
magnetnih čestica. Za HEK293T stanice korištene su ntMAG (Nanotherics), a za živčane
matične stanice NeuroMag čestice (Oz Biosciences). Magnetofekcija je vršena na uređaju za
magnetofekciju Magnefect-nano II Nanotherics. Provedeno je 11 magnetofekcija na
HEK293T stanicama pomoću komercijalnih ntMag magnetih čestica. Korišteni su plazmidi
pEGFP-N1 i dva plazmida s ugrađenim FGFR1 receptorom: FGFR1-mCherry te FGFR1-
EGFP.
HEK293T stanice pokazale su se najboljima za tretiranje magnetofekcijom nakon što su 2-3
puta presađene nakon odmrzavanja. Dan prije magnetofekcije bilo je potrebno nasaditi stanice
na ploče s 24 bunarića. Tijekom uobičajenog postupka presađivanja, nakon prebrojavanja
stanica, željeni broj stanica (40 000 po bunariću) bio je nasađen na ploču. Korištene su
komercijalne ploče prethodno tretirane za uzgoj tkiva (eng. Tissue Culture Treated Plate, 24
well, Falcon). Ovisno o eksperimentu na stanice su dodani FGF i/ili HMGB1 protein. FGF je
dodavan u količini od 1,2 μl/bunariću ploče (koncentracija 5 μg/ml), a HMGB1 500
ng/bunariću ploče (tj. 800 ng/ml).
Za početak su pripravljeni kompleksi reagensa (ntMag) i DNA. Reagens je vorteksiran i
dodan u mikrotubicu (7,2 μl; taj volumen je kasnije razdijeljen na 6 bunarića – 1,2 μl po
bunariću). DNA je dodavana u željenoj količini u OPTIMEM (proizvođač) u drugu
mirkotubicu. Količina DNA tj. njena koncentracija mijenjala se kroz eksperimente, a
najboljom se pokazala koncentracija od 2,5 μg po bunariću.
Budući da su eksperimenti rađeni u triplikatima DNA je bila otopljena u 180 μl OPTIMEM-a,
a taj volumen je zatim razdijeljen na 6 bunarića na ploči. DNA i OPTIMEM su zatim bili
dodani u tubicu s ntMag-om uz pipetiranje i vorteksiranje te je smjesa inkubirana 15 minuta
pri sobnoj temperaturi kako bi se stvorili kompleksi stanica i magnetnih čestica.
27
Kompleksi DNA i čestica su zatim dodani na stanice koje su dan prije bile nasađene na ploču
s 24 bunarića (sl. 5). Dodavanje je izvedeno sporo i nježno, a cijela ploča je prije stavljanja a
uređaj za magnetofekciju lagano protresena kako bi se stanice jednoliko rasporedile na
podlozi. Ukupan volumen za transfekciju je trebao iznositi 600 µl po bunariću. ntMag čestica
je dodano 1,2 µl, plazmidne DNA 2,5 µg, a ostatak je bio OPTIMEM do volumena od 600 µl.
Kroz sve magnetofekcije mijenjan je broj stanica u bunarićima, količina magnetnih čestica te
količina DNA kako bi se dobila najveća moguća uspješnost transfekcije te provjerila
vijabilnost stanica ovisno o koncentracijama pojedinih komponenti. Transfekcija HEK293T
stanica trajala je sat vremena, a uređaj za magnetofekciju (Magnefect-nano II, Nanotherics) je
za to vrijeme bio u inkubatoru. Nakon sat vremena, ploča je maknuta s uređaja i pohranjena u
inkubator na 24h pri 37 °C i koncentraciji CO2 5% . Sljedeći dan rezultati su očitavani na
Axiovert 200 fluorescencijskom mikroskopu.
Za transfekcije živčanih matičnih stanica pomoću magnetnog polja korištene su drugačije
vrste magnetnih čestica, NeuroMag čestice (Oz Biosciences). Također je i podloga morala biti
posebno pripremljena. Za tu namjenu korišten je poliaminokiselina poli-D-lizin, koja olakšava
pričvršćivanje stanica za čvrste podloge. U svaki bunarić ploče dodano je 600 μL poli-D-
lizina (100 μg/ml, Sigma). Ostavljen je da djeluje sat vremena, a nakon toga bunarići su
isprani dva puta s deioniziranom vodom te su ploče bile spremne za nasađivanje živčanih
matičnih stanica.
Za magnetofekciju živčanih matičnih stanica također je potrebno 24 sata prije nasaditi stanice
u željenoj količini na ploču s 24 bunarića. Tijekom uobičajenog postupka presađivanja, nakon
prebrojavanja stanica, željeni broj stanica bio je nasađen u bunariće na ploči (35 000 stanica
po bunariću ploče se pokazao kao optimalan broj stanica). Ovisno o eksperimentu stanice su
prije magnetofekcije tretirane sa HMGB1 proteinom u koncentraciji od 500 ng/bunariću ploče
(800 ng/ml). Postupak je bio jednak onome s HEK293T stanicama s razlikom u trajanju same
magnetofekcije te korištenju drugih čestica.
Za početak su pripravljeni kompleksi reagensa (ntMag) i DNA. Reagens je vorteksiran i
dodan u mikrotubicu (7,2 μl; taj volumen je razdijeljen dalje na 6 mikrotubica). DNA je
dodavana u željenoj količini u OPTIMEM (proizvođač) u drugu mikrotubicu. Količina DNA
tj. njena koncentracija mijenjala se kroz eksperimente, a najboljom se pokazala koncentracija
od 2,5 μg po bunariću. Budući da su eksperimenti rađeni u triplikatima DNA je bila otopljena
u 180 μl OPTIMEM-a, a taj volumen je zatim razdijeljen na 6 bunarića na ploči.
28
DNA i OPTIMEM su zatim bili dodani u tubicu s NeuroMag-om uz pipetiranje i vorteksiranje
te je smjesa inkubirana 15 minuta pri sobnoj temperaturi kako bi se stvorili kompleksi stanica
i magnetnih čestica. Kompleksi DNA i čestica su zatim dodani na stanice koje su dan prije
bile nasađene na ploču s 24 bunarića (sl. 5). Dodavanje je izvedeno sporo i nježno, a cijela
ploča je prije stavljanja a uređaj za magnetofekciju lagano protresena kako bi se stanice
jednoliko rasporedile na podlozi. Ukupan volumen za transfekciju je trebao iznositi 600 µl po
bunariću. ntMag čestica je dodano 1,2 µl, plazmidne DNA 2,5 µg, a ostatak je bio OPTIMEM
do volumena od 600 µl. Kroz sve magnetofekcije mijenjan je broj stanica u bunarićima,
količina magnetnih čestica te količina DNA kako bi se dobila najveća moguća uspješnost
transfekcije te provjerila vijabilnost stanica ovisno o koncentracijama pojedinih komponenti.
Transfekcija NSC stanica trajala je 15 minuta, a uređaj je za to vrijeme bio u inkubatoru.
Nakon sat vremena, ploča je maknuta s uređaja i pohranjena u inkubator na 24h pri 37 °C i
koncentraciji CO2 5% . Sljedeći dan rezultati su očitavani na Axiovert 200 fluorescencijskom
mikroskopu.
Slika 5. Prikaz stvaranja kompleksa magnetnih čestica i DNA te njihovo dodavanje na stanice
(www.origene.com/cdna/magnetofection.mspx)
29
2.2.7. MTT test preživljenja i proliferacije stanica
Preživljenje stanica nakon transfekcija određivano je MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-
difeniltetrazolium bromid) testom. Dvadeset i četiri sata nakon magnetofekcije dodan je MTT
u koncentraciji od 0,5 mg/ml te su stanice inkubirane 45 min pri 37 °C i 5% CO2. Nakon
inkubacije, pojavljuju se kristalići ljubičaste boje kod živih stanica. Žive stanice sadrže
enzime koji reduciraju MTT u njegov netopivi oblik formazan te je stoga količina formazana
proporcionalna broju živih stanica. Apsorbancija se u MTT testu mjeri na valnim duljinama
između 500 i 600 nm. Izmjerena je pri 595 nm na NanoDrop ND-1000 spektrofotometru.
MTT podaci prikazani su kao postotak prosječnih vrijednosti kontrolnih stanica. Preživljenje
stanica izračunato je prema formuli:
pri čemu je blank prazan DMSO u kojem se otapaju kristalići, a kontrola uzorak netretiranih
stanica (nisu podvrgnute magnetofekciji). Ovim testom se osim preživljenja stanica
određivala i njihova proliferacija. Budući da je MTT test provođen 24h nakon megnatofekcije
u tom razdoblju je došlo do proliferacije stanica te njihov broj nije bio mogao biti jednak
nasađenom broju stanica na ploče.
30
3. Rezultati
3.1. Optimizacija tehnike magnetofekcije na HEK293T stanicama
Kako bismo testirali utjecaj FGF i HMGB1 na stanice transfecirane receptorom FGFR1, bilo
je potrebno optimizirati tehniku transfekcije. U tu svrhu smo proveli 11 pokusa transfekcije
korištenjem uređaja kojim se transfekcija postiže putem magnetnih nanočestica
(magnetofekcija). HEK293T stanice su transfecirane plazmidima pEGFP-N1 (Clontech),
FGFR1-EGFP i FGFR1-mCherry pomoću ntMAG (Nanotherics) reagensa.
U svrhu optimizacije tehnike, HEK293T stanice su, slijedeći preporuke proizvodača,
nasađivane u različitim gustoćama (od 30 000 do 50 000) na ploče s 24 bunarića, a
eksperimentalno određena optimalna gustoća iznosila je 40 000 HEK293T stanica po
bunariću. Također, slijedeći preporuke proizvodača, testirane su različite koncentracije
plazmida (od 0,6 μg do 4,8 μg), a stanice su pritom nasađivane u triplikatima za svaku
pojedinu koncentraciju. Korištene su i različite količine reagensa (1,2 μl, 2,4 μl i 3,6 μl) kako
bi se ustanovila optimalna koncentracija za magnetofekciju HEK293T stanica te kako bismo
odredili uzrokuju li veće količine reagensa smrt stanica.
Za transfekciju HEK293T stanica plazmidima pEGFP-N1, FGFR1-EGFP i FGFR1-mCherry
najučinkovitija je bila količina plazmida od 2,4 μg, dok povećanje koncentracije ntMAG
reagensa nije bitno utjecalo na učinkovitost. Optimalnim se pokazao omjer od 2,4 μg
plazmidne DNA na 1,2 μl ntMAG reagensa.
31
Slika 6. Vizualizacija uspješnosti magnetofekcije HEK293T stanica fluorescencijskom mikroskopijom.
Učinkovitost magnetofekcije HEK293T stanica određena je pobrojavanjem tranfeciranih (GFP/mCherry
pozitivnih) stanica za plazmid pEGFP-N1 (A´), FGFR1-mCherry (B´) i FGFR1-EGFP (C´) te ukupnog broja
stanica za svaki plazmid (A, B, C). Mjerne skale: 50 μm.
Uspješnost magnetofekcije HEK293T stanica određena je pomoću fluorescencijske
mikroskopije (sl. 6) budući da sva tri korištena plazmida sadrže proteine koji fluoresciraju
obasjani UV svjetlošću (zeleni fluorescentni protein EGFP (eng. Enhanced Green
Fluorescence Protein) u slučaju plazmida pEGFP-N1 i FGFR1-EGFP te crveni fluorescentni
protein mCherry u slučaju FGFR1-mcherry). Protein EGFP fluorescira zeleno u plavom dijelu
UV spektra, a protein mCherry crveno u zelenom dijelu UV spektra. To nam je omogućilo da
razlikujemo transfecirane stanice od netransfeciranih (sl. 6).
32
Slika 7. Uspješnost magnetofekcije HEK293T stanica plazmidima FGFR1-mCherry, FGFR1-EGFP i
pEGFP-N1. Učinkovitost magnetofekcije HEK293T stanica izračunata je kao postotak transfeciranih stanica
(GFP/mCherry pozitivne) kroz ukupni broj stanica te prikazana grafom (A) i tablicom (B).
Učinkovitost transfekcije HEK293T stanica određena je brojanjem stanica na
fluorescencijskom mikroskopu u 3 nasumično izabrana vidna polja za svaki bunarić ploče sa
24 bunarića (sl. 6). Izračunata je kao postotak transfeciranih stanica (GFP ili mCherry
pozitivne)/ukupni broj stanica (sl. 7B). Najučinkovitija transfekcija HEK293T stanica bila je
FGFR1-mCherry plazmidom i iznosila je 18,80%. Postotak transfeciranih stanica s pEGFP-
N1 plazmidom iznosio je 17,42%, a s FGFR1-EGFP plazmidom 13,87% (sl. 7B).
33
3.2. Magnetofekcija živčanih matičnih stanica
Ukupno je provedeno 7 eksperimenata magnetofekcije NSC stanica plazmidima pEGFP-N1
(Clontech), FGFR1-EGFP i FGFR1-mCherry pomoću NeuroMag (Oz Biosciences) reagensa.
Živčane matične stanice su, slijedeći preporuke proizvodača, nasađivane u različitim
gustoćama (od 30 000 do 50 000) na ploče sa 24 bunarića, a eksperimentalno određena
optimalna gustoća iznosila je 35 000 NSC stanica po bunariću.
Kao i u HEK293T stanica, za magnetofekciju NSC stanica plazmidima pEGFP-N1, FGFR1-
EGFP i FGFR1-mCherry optimalnim se pokazao omjer od 2,4 μg plazmidne DNA na 1,2 μl
NeuroMag reagensa.
Slika 8. Vizualizacija uspješnosti magnetofekcije živčanih matičnih stanica fluorescencijskom
mikroskopijom. Učinkovitost magnetofekcije živcanih matičnih stanica određena je pobrojavanjem
tranfeciranih (GFP/mCherry pozitivnih) stanica za plazmid pEGFP-N1 (A´), FGFR1-mCherry (B´) i FGFR1-
EGFP (C´) te ukupnog broja stanica za svaki plazmid (A, B, C). Mjerne skale: 50 μm.
Uspješnost magnetofekcije NSC stanica određena je brojanjem stanica na fluorescencijskom
mikroskopu u 3 nasumično izabrana vidna polja za svaki bunarić ploče sa 24 bunarića (sl. 8).
Učinkovitost transfekcije izračunata je kao postotak transfeciranih stanica (GFP ili mCherry
pozitivne)/ukupni broj stanica (sl. 9B). Najučinkovitija transfekcija NSC stanica bila je
FGFR1-EGFP plazmidom i iznosila je 27,14%. Postotak transfeciranih stanica s pEGFP-N1
plazmidom iznosio je 21,83%, a s FGFR1-mCherry 9,57% (sl. 9).
34
Slika 9. Uspješnost magnetofekcije živčanih matičnih stanica plazmidima FGFR1-mCherry, FGFR1-
EGFP i pEGFP-N1. Učinkovitost magnetofekcije živčanih matičnih stanica izračunata je kao postotak
transfeciranih stanica (GFP/ mCherry pozitivne) kroz ukupni broj stanica te prikazana grafom (A) i tablicom
(B).
3.3. Utjecaj aktivnosti receptora FGFR1 i proteina HMGB1 na
preživljenje HEK293T stanica
Kako bi se NSC stanice mogle usporediti sa drugim rezultatima u eksperimentima su
korištene HEK293T stanice za koje se vjeruje da su također živčanog podrijetla zbog
izraženih neurofilamentnih podjedinica kao i drugih proteina tipičnih za živčane stanice
(Shaw i sur, 2002). Budući da HEK293T stanice u svom mediju za rast nemaju FGF, MTT je
izveden kod njih u tri slučaja. Mjereno je preživljenje nakon transfekcije plazmidima kako
bismo vidjeli sam utjecaj tih plazmida na stanice. U drugom slučaju, transfekcija je provedena
na jednak način, ali je dodan i FGF tijekom nasađivanja stanica prije magnetofekcije kako bi
se ustanovio utjecaj FGF-a na preživljenje. U trećem slučaju dodan je i protein HMGB1 uz
FGF kako bi se odredio njihov kumulativan utjecaj na stanice.
Pokazalo se da sama magnetofekcija ne utječe negativno na stanice te nije došlo do promjena
u njihovoj morfologiji. Dodatak reagensa je uzrokovao određenu smrtnost stanica (87,33%
preživjelih). U kombinaciji sa plazmidima ta smrtnost se dodatno povećala. S plazmidom
FGFR1-EGFP preživjelo je 70,33% stanica, sa pEGFP-N1 68% stanica, a sa FGFR1-mcherry
64,33% stanica (sl. 10).
35
Slika 10. Utjecaj magnetofekcije na preživljenje HEK293T stanica transfeciranih FGFR1-mcherry, FGFR1-
EGFP i pEGFP-N1 plazmidom (stanice nisu tretirane FGF i HMGB1 molekulama)
Dodatak FGF na kontrole bez plazmida uzrokovao je niže preživljenje nego bez njega.
Stanice s FGF-om imale su preživljenje od 85,33% nakon magnetofekcije, a stanice koje su
imale dodan i reagens uz to su imale preživljenje od 79,33%.
Međutim, kod stanica koje su transfecirane s plazmidima uočilo se bolje preživljenje nego u
eksperimentu bez dodanog FGF-a. Stanice sa pEGFP-N1 plazmidom su imale najbolje
preživljenje od 97%. Visoko preživljenje od 95,67% zabilježeno je kod stanica s
transfeciranim FGFR1-EGFP plazmidom. Kod stanica s FGFR1-mcherry plazmidom nije
uočena razlika u usporedbi sa stanicama u eksperimentu bez dodanog FGF-a (sl. 11).
Slika 11. Utjecaj magnetofekcije na preživljenje HEK293T stanica transfeciranih FGFR1-mcherry, FGFR1-
EGFP i pEGFP-N1 plazmidom (stanice su tretirane FGF molekulom prije magnetofekcije)
36
Iako je pri dodatku FGF-a i HMGB1 zasebno stanicama uočeno podjednako preživljenje
(85,33% i 85%), dodatkom oba proteina stanicama koje imaju u mediju i reagens dobiveno je
preživljenje od 103,33%. Dodatak oba proteina stanicama s plazmidima smanjio je
preživljenje stanica te je tako kod stanica s pEGFP-N1 plazmidom preživljenje 92%, s
plazmidom FGFR1-EGFP preživljenje je 90%, a kod stanica s FGFR1-mcherry plazmidom
preživljenje je najniže i iznosi 59% (sl. 12).
Slika 12. Utjecaj magnetofekcije na preživljenje HEK293T stanica transfeciranih FGFR1-mcherry, FGFR1-
EGFP i pEGFP-N1 plazmidom (stanice su tretirane FGF i HMGB1 molekulom prije magnetofekcije)
37
3.4. Utjecaj aktivnosti proteina FGF i HMGB1 na preživljenje živčanih
matičnih stanica
Kako bi se se utvrdio utjecaj aktivnosti signalnih puteva posredovanih FGF i HMGB1
molekulama na preživljenje i proliferaciju živčanih matičnih stanica, stanice su uzgajane u
mediju koji sadrži te proteine, te je proveden MTT test preživljenja stanica 24 h nakon
magnetofekcije. Budući da je MTT test provođen 24h nakon magnetofekcija, njime nije
mjereno samo preživljenje stanica već i njihova proliferacija s obzirom da su se stanice
nastavile dijeliti u kulturi te njihov broj nije jednak onome koji je nasađen za eksperiment.
NSC stanice u svom mediju za rast već imaju FGF budući da on uz EGF održava stanice u
kulturi u nediferenciranom stanju (Lotz i sur, 2013) te je pri nasađivanju stanica za
magnetofekciju bilo potrebno dodati samo HMGB1 protein. Iz tog razloga kod NSC stanica
imamo dva tipa eksperimenata, s HMGB1 i bez HMGB1 proteina.
Najprije je provedena magnetofekcija kako bi uočio utjecaj FGF-a na stanice transfecirane
plazmidima s FGFR1 receptorom, a zatim su stanice dodatno tretirane i HMGB1 proteinom.
U slučaju stanica s dodanim NanoMag nanočesticama preživljenje je iznosilo 96,67%.
Dodatkom HMGB1 proteina stanicama dobiveno je preživljenje od 93,33%.
Kod transfeciranih stanica, najbolje preživljenje imale su one s FGFR1-EGFP (96,67%), a
najslabije one s FGFR1-mcherry plazmidom (90,67%). Stanice transfecirane s pEGFP-N1
imale su preživljenje od 94,67%.
Dodatak HMGB1 proteina smanjio je preživljenje stanica. Stanice s pEGFP-N1 plazmidom
imale su preživljenje od 82,67%, stanice s FGFR1-EGFP plazmidom 78,67%, dok je kod
stanica s FGFR1-mcherry plazmidom promjena bila neznatna te je preživljenje iznosilo
90,33% .
Rezulatati MTT testova na NSC stanicama u oba tipa eksperimenata prikazana su slikom 13.
38
Slika 13. Utjecaj FGF-a te kumulativnog utjecaja FGF-a i HMGB1 proteina na živčane matične stanice
transfecirane FGFR1-mcherry, FGFR1-EGFP i pEGFP-N1 plazmidom u kulturi
39
4. Rasprava
Ovo istraživanje opisuje utjecaj FGF i HMGB1 proteina na preživljenje i proliferaciju
živčanih matičnih stanica i HEK293T stanica in vitro transfeciranih metodom magnetofekcije
plazmidima koji sadrže FGFR1 receptor. Eksperimenti su pokazali pozitivan utjecaj FGF-a i
negativan utjecaj HMGB1 na obje stanične linije.
Magnetofekcija je jedna od najnovijih metoda transfekcije izumljena sa svrhom da zamijeni
metode koje uključuju viralne vektore. Transfekcije viralnim vektorima dovode do pojačane
smrtnosti stanica, abnormalne diferencijacije i poremećene proliferacije što posljedično
smanjuje njihov terapeutski potencijal (Pickard i sur, 2011). Prijašnja istraživanja (Pickard i
sur, 2010A i Pickard i sur, 2010B) u kojima su testirane magnetne čestice pokazala su njihovu
visoku učinkovitost u transfekciji astrocita. Dosadašnja rijetka istraživanja magnetofekcije na
živčanim matičnim stanicama su pokazala značajno umiranje stanica pod utjecajem većih
količina magnetnih čestica Stoga ja zaključeno da reagens treba dodavati u niskim
koncentracijama od 1,2 μl/bunariću. Koncentracije veće od 1,6 μL/bunariću dovodile su do
smrti stanica okarakteriziranih masovnim odvajanjem stanica od podloge te je stoga bilo
nemoguće odrediti uspješnost same transfekcije (Sapet i sur, 2011).
Metodom magnetofekcije na NSC stanicama najveća uspješnost dobivena je transfeciranjem
pomoću FGFR1-EGFP plazmida (27,14%). FGFR1-mcherry se pokazao najmanje uspješnim
(9,57%). Budući da FGFR1-mcherry plazmid kroz sve eksperimente davao najmanju
uspješnost transfekcije, a i preživljenje, smatra se da je nefukcionalan u ovome tipu
istraživanja na NSC stanicama. U usporedbi sa istraživanjem Sapet i sur. (2011) uočena je
skoro dvostruko bolja uspješnost transfekcije koristeći FGFR1-EGFP i pEGFP-N1 plazmide.
Za potrebe njihovog istraživanja korištene su doze plazmida i reagensa u omjeru 1:1, a za ovo
istraživanje omjer je iznosio 2:1. Iz toga se može zaključiti da dvostruka doza DNA naprema
količini magnetnih čestica daje dvostruko bolju uspješnost magnetofekcije.
U slučaju HEK293T stanica, FGFR1-mcherry plazmidom postignuta je veća uspješnost
(18,80%) transfekcije nego s FGFR1-EGFP (13,87%). HEK293T stanice smo transfecirali
kako bismo ustvrdili najbolje omjere stanica i plazmida te toksičnost magnetnih čestica.
Magnetofekcije stanica sa pEGFP-N1 plazmidom su također postigle bolje rezultate (17,42%)
od eksperimenata s FGFR1-EGFP plazmidom. pEGFP-N1 plazmid je kroz sve eksperimente
pokazivao dobre rezultate i snažan signal u stanicama.
40
Razlog zašto smo testirali utjecaj FGF na NSC jest taj što je član FGF obitelji kojim smo
tretirali stanice, FGF2, uključen u neuroprotekciju i popravak živčanog tkiva te je pojačano
izražen u živčanim matičnim stanicama nakon oštećenja živčanog sustava. Istraživanja na
miševima s mutiranim FGFR1 i FGFR2 pokazuju da je FGF potreban za poravak živčanog
tkiva koji slijedi nakon epileptičkih napada ili moždanog udara (Fagel i sur, 2009; Yoshimura
i sur, 2001). Ekspresija FGF2 zabilježena je kroz cijelu ventrikularnu zonu korteksa (Dehay i
sur, 2001). Dokazana je uloga FGF2 u progresiji živčanih linija tijekom neurogeneze te
održavanju proliferacije neuroepitelnih stanica prije početka neurogeneze (Raballo i sur,
2000; Storm i sur, 2006). Ispitivan je i utjecaj mutiranih verzija FGFR1 receptora u NSC
stanicama u kulturi. Navedena istraživanja su pokazala da je MAPK/Erk put signalizacije
FGF-a uključen u održavanju proliferativnog stanja stanica, a PLCγ/Ca2+ signalni put u
inhibiciji astroglijalne diferencijacije i održavanju živčanog diferencijacijskog potencijala
NSC stanica (Ma i sur, 2009). U istraživanju Lotz i sur. (2013) ispitivale su se razni protokoli
za održavanje kultura NSC stanica. Stanice izolirane iz mozga miša podvrgnuli su rastu u
medijima koji su se razlikovali po tome sadrže li FGF ili ne. Nakon sedam dana u kulturi
stanica s dodanim FGF-om uočilo se značajno preživljenje u usporedbi sa stanicama u kulturi
bez FGF-a (Lotz i sur, 2013). Sva ova saznanja o FGF-u su potvrđena i kroz ovaj rad. FGF je
korišten za održavanje stanica u nediferenciranom stanju te ih je poticao na proliferaciju, a
dodatnim pojačanjem FGFR1 receptora dobivena je bolja uspješnost preživljenja NSC
stanica.
U kulturu NSC stanica nije se moralo dodatno dodavati FGF-a budući da je on sastavni dio
njihovog medija (5 μg/ml). Visoko preživljenje stanica smo dobili kod svih NSC stanica
neovisno jesu li transfecirane FGFR1-mcherry, FGFR1-EGFP ili pEGFP-N1 plazmidom.
Najbolje preživljenje je dobiveno sa FGFR1-EGFP plazmidom (96,67%) što objašnjava
činjenica da smo dodatno pojačali FGFR1 receptor na NSC stanicama u usporedbi sa
stanicama koje nemaju transfeciran FGFR1 receptor. Stanice transfecirane FGFR1-mcherry
plazmidom imale su najlošije preživljenje (90,67%), a ovaj plazmid nije povoljno djelovao ni
kod HEK293T stanica.
Iz ovih rezultata možemo zaključiti o boljem preživljenju NSC stanica u kulturi ako ih
prethodno transfeciramo plazmidom s FGFR1 receptorom (u ovom slučaju FGFR1-EGFP).
U eksperimentima s HEK293T stanicama zabilježeno je bolje preživljenje u kulturama stanica
sa dodanim FGF ligandom.
41
Iznimka je bio FGFR1-mcherry plazmid kod kojega nije bilo nikakve promjene pri dodatku
FGF-a. U slučaju stanica transfeciranih FGFR1-EGFP plazmidom došlo je do boljeg
preživljenja što pokazuje da je bitna i vrsta plazmida koji se koristi za eksperimente.
Zaključeno je da postoji mogućnost da nije došlo do okidanja kaskade signalnog puta FGF-a
jer plazmidi, koji su korišteni u istraživanju, originalno nisu namijenjeni eksperimentima za
istraživanje novih funkcija stanica u koje su transfecirani već samo za praćenje signala.
Najbolje preživljenje je dobiveno kod transfekcije HEK293T stanica pEGFP-N1 plazmidom
iako on nema transfeciran FGFR1 receptor, pa razlog vjerojatno leži u činjenici da HEK293T
stanice i same imaju izražen FGFR1 receptor na svojoj površini (Zhou i sur, 2010).
HMGB1 protein izražen u većini eukariotskih stanica, uključujući i živčane matične stanice
(Hayakawa i sur, 2013), predmet je interesa sve većeg broja istraživanja zbog njegovih širokih
funkcija od sudjelovanja u stvaranju upale do privlačenja matičnih stanica na mjesto ozljede u
organizmu. Zadnjih godina prikupljen je velik broj podataka o pozitivnih učincima HMGB1.
Njegova signalizacija potiče endotelnu aktivaciju (Treutiger i sur, 2003) i bujanje (Schleueter,
2005) te rast neurita i preživljenje neurona (Huttunen i sur, 2002). Također je zabilježeno
izlučivanje HMGB1 od strane astrocita u ekstracelularni medij (Passalacqua i sur, 1998).
Metaboličkom inhibicijom HMGB1-pozitivnih astrocita u peri-infarktnom području
poremeteli su se neuronalni markeri (CD31, sinaptopsin) koji su u uzajamnoj vezi sa
oporavkom nakon moždanog udara (Hayakawa i sur, 2010).
U ovome radu živčane matične stanice tretirane su također i HMGB1 proteinom kako bismo
zabilježili njegov učinak na njihovo preživljenje, budući da postoje radovi koji opisuju njega
pozitivna djelovanja ne samo na preživljenje već i na proliferaciju i diferencijaciju (Zhao i
sur, 2011; Hayakawa, 2013). Prilikom eksperimenata HMGB1 je dodavan zajedno sa FGF-
om budući da je ispitivan njihov kumulativan učinak (800 ng/ml HMGB1).
U slučaju NSC stanica dodatkom HMGB1 smanjena je uspješnost preživljenja (sl. 10), iako se
primarno očekivalo da bi HMGB1 mogao djelovati pozitivno. Pretpostavlja se da je to
moguće iz više razloga. Postoji mogućnost da bi viša ili niža koncentracija proteina možda
pokazala bolji učinak na NSC stanice. Također moguće je da nije dano dovoljno vremena
HMGB1 proteinu da djeluje na stanice te bi nakon duže inkubacije rezultati bili pozitivni za
preživljenje.
42
Osim toga, stanice u ovome eksperimentu su nakon dodatka FGF-a i HMGB1 prošle kroz
magnetofekciju koja je mogla stresno djelovati na stanice.
Ipak, rezultati ovih eksperimenata nisu neobični budući da mnoga istraživanja izvještavaju o
negativnim utjecajima HMGB1 u organizmu. Opsežna istraživanja na molekularnim,
staničnim i animalnim modelima podržavaju postojanje proupalnog efekta HMGB1 u
akutnom moždanom udaru (Hayakawa, 2013). Iz tog razloga istraživan je i utjecaj anti-
HMGB1 monoklonalnog antitijela u svrhu određivanja HMGB1 utjecaja na moždani udar.
Tretiranjem infarktnog područja anti-HMGB1 došlo je do dramatičnog smanjenja infarktnog
područja što je povezano sa značajnim poboljšanjem neuroloških manjkavosti uzrokovanih
udarom. Ovime je pokazan negativan utjecaj HMGB1 u razvoju moždane ozljede unutar
ishemičnih uvjeta razaranjem mikrovaskularne strukture i interakcija među neuronima (Liu i
sur, 2007). Osim utjecaja na interakcije među neuronima postoji mogućnost HMGB1
negativnog utjecaja i na strukturu neurona što je moglo dovesti do pojačane smrtnosti u ovim
eksperimentima.
Budući da je HMGB1 pokazan kao najjači aktivator RAGE receptora (Degryse i sur, 2001)
istraživano je i njegovo djelovanje preko njih. Aktivacija RAGE receptora HMGB1
proteinom na neuronima stimulira produkciju reaktivnih kisikovih vrsta i vodi do smrti
živčanih staničnih linija (Yan i sur, 1996., Vincent i sur, 2006). S druge strane, uočeno je da
aktivacija RAGE receptora vodi do rasta neurita (Pichiule i sur, 2007). Drugo istraživanje je
upitno jer rad (Muhammad i sur, 2008) nije uočio sličan utjecaj već je potvrdio prvi. Dakle,
razna istraživanja daju oprečne rezultate u eksperimentima s HMGB1 proteinom. Dodatkom
HMGB1 proteina NSC stanicama u kulturi postoji mogućnost da su također potaknuti RAGE
receptori što je posljedično dovelo do veće smrtnosti stanica.
Qiu i sur (2008.) su detektirali ekspresiju RAGE mRNA u svojoj staničnoj liniji primarnih
neurona (bEnd3) što upućuje na činjenicu da bi stanice neurovaskularnog sustava mogle biti
regulirane HMGB1 regulacijom budući da je poznata bila činjenica da HMGB1 djeluje preko
RAGE receptora (Hori i sur, 1995).
Vrlo niske razine RAGE receptora su uočene u normalnom mozgu, ali snažna ekspresija je
imunohistokemijski zabilježena u kortikalnoj ishemičnoj periinfarktnoj regiji. Ovi rezultati
upućuju na to da je HMGB1 receptor pojačano eksprimiran nakon moždanog udara što je još
jedan od dokaza o njegovom doprinosu upali.
43
Njihovo istraživanje se orijentiralo i na utjecaj HMGB1 otpuštenog iz živčanih stanica u
kulturi. Pod njegovim utjecajem došlo je do izlučivanja proupalnih citokina iz neurona,
astrocita i epitelnih stanica.
S obzirom na oprečne rezultate dobivene u brojim istraživanjima važno je naglasiti da
HMGB1 protein djeluje u dvije faze. Tijekom kasnijih faza moždanog udara, HMGB1 ne
samo da potiče veze između neurovaskularnih stanica poput neurona, astrocita i endotelnih
stanica nego i pridonosi pozitivno migraciji stanica u područje ozljede mozga (Hayakawa,
2013). Iz tog razloga se smatra da bi duža inkubacija NSC stanica u kulturi sa HMGB1
proteinom dovela do boljeg preživljenja.
Na temelju trenutnih saznanja o različitim fazama djelovanja ovog proteina potrebno je
modificirati HMGB1 odgovor na način da se optimizira inhibicija njegovog djelovanja
tijekom akutnih faza nakon ozljede bez utjecaja na blagotvorne mehanizme neurovaskularnog
remodeliranja posredovanog matičnim i progenitorskim stanicama (Hayakawa, 2013).
Osim na NSC stanicama, jednak ekspriment proveden je i sa HEK293T stanicama kako bi se
ispitao učinak proteina i na drugim staničnim linijama. U slučaju HEK293T stanica njegovo
djelovanje je bilo jednako kao i kod NSC stanica i dovelo je do manjeg preživljenja stanica u
kulturi (sl. 13). Iako su HEK293T stanice godinama smatrane epidermalnog porijekla (Shaw i
sur, 2002), sve je više istraživanja koja zbog izraženih neurofilamenatnih podjedinica ukazuju
da su ipak živčanog porijekla što može biti razlog sličnog djelovanja HMGB1 proteina.
Ulogu HMGB1 potrebno je dodatno istraživati budući da pokazuje važnu ulogu u stvaranju
upalnog odgovora nakon moždanog udara, a sve više istraživanja uočava i pozitivne uloge u
privlačenju matičnih stanica na mjesto ozljede u živčanom sustavu.
44
5. Zaključak
Korištenjem različitih koncentracija DNA pri magnetofekciji NSC stanica došlo je do bolje
uspješnosti transfekcija korištenjem plazmidne DNA i magnetnih čestica (reagensa) u omjeru
2:1. Time je poboljšan protokol objavljen u literaturi koji je koristio omjere 1:1 (Sapet i sur,
2011). Utvrđeno je toksično djelovanje reagensa pri koncentracijama većim od 2,6 μl/1ml.
Dodatkom FGF-a u kulturu HEK293T stanica značajno se poboljšalo preživljenje stanica, a
korištenjem FGF-a u kulturi NSC stanica postignuto je njihovo preživljenje i proliferiranje uz
održavanje nediferenciranog stanja. Također, došlo je do boljeg preživljenja NSC stanica
transfeciranih plazmidom sa FGFR1 receptorom (FGFR1-EGFP).
HMGB1 protein pokazao je negativno djelovanje na preživljenje obje vrste staničnih linija što
potvrđuje brojna prijašnja istraživanja (Hayakawa, 2013; Liu i sur, 2007; Yan i sur, 2007,
Vincent i sur, 2006).
45
6. Literatura
Degryse B, Bonaldi T, Scaffidi P, Muller SAndreis I, Batinić D, Čulo F, Grčević D,
Lukinović-Škudar V, Marušič M, Taradi M, Višnjić D (2010.): Imunologija. Medicinska
naklada, Zagreb
Bakowska JC, Breakefield XO, Moskowitz MA (2001.) FGF2 regulation of neurogenesis in
adult hippocampus after brain injury. Proc Natl Acad Sci 98: 5874–5879
Barlovic DP, Soro-Paavonen A, Jandeleit-Dahm KA (2011.): RAGE biology,
atherosclerosis and diabetes. Clin Sci (Lond) 121: 43-55
Biscetti F, Straface G, De Cristofaro R, Lancellotti S, Rizzo P, Arena V, Stigliano E, Pecorini
G, Egashira K, De Angelis G, Ghirlanda G, Flex A (2010.) High-mobility group box-1
protein promotes angiogenesis after peripheral ischemia in diabetic mice through a
VEGF-dependent mechanism. Diabetes 59:1496–1505
Bonaldi T, Talamo F, Scaffidi P, Ferrera D, Porto A, Bachi A, Rubartelli A, Agresti A,
Bianchi ME (2003.): Monocytic cells hyperacetylate chromatin protein HMGB1 to
redirect it towards secretion. EMBO J 22: 5551-5560
Böttcher RT , Niehrs C (2005.) Fibroblast Growth Factor Signaling during Early
Vertebrate Development. Endocrine Reviews 26 (1): 63-77
Caso JR, Pradillo JM, Hurtado O, Lorenzo P, Moro MA, Lizasoain I (2007.): Toll-like
receptor 4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke.
Circulation 115: 1599-1608
Christen B, Slack JM (1999.): Spatial repsonse to fibroblast growth factor signalling in
Xenopus embryos. Development 126: 119-125
Clarimon J, Xiromerisiou G, Eerola J, Gourbali V, Hellstrom O, Dardiotis E, Peuralinna T,
Papadimitriou A, Hadjigeorgiou GM, Tienari PJ, Singleton AB (2005). Lack of evidence for
a genetic association between FGF20 and Parkinson’s disease in Finnish and Greek
patients. BMC Neurol 5, 11
Conti L, Pollard SM, Gorba T, Reitano E, Toselli M, Biella G, Sun Y, Sanzone S, Ying QL,
Cattaneo E, Smith A (2005) Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian
tissue stem cell. PloS Biol 3, e283
46
Resnati M, Sanvito F, Arrigoni G, Bianchi ME (2001.): The high mobility group (HMG)
boxes of the cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells. J Cell Biol 152: 1197-
1206
Duman RS i Monteggia LM (2006.) A neurotrophic model for stress-related mood
disorders. Biol Psychiatry 59: 1116–1127
Dumitriu IE, Bianchi ME, Bacci M, Manfredi AA, Rovere-Querini P (2007.): The secretion
of HMGB1 is required for the migration of maturing dendritic cells. J Leukoc Biol 81:
84-91
Eriksson AE, Cousens LS, Weaver LH, Matthews BW (1991.): Three-dimensional
structures of acidic and basic fibroblast growth factors. Science 251: 90-93
Evans, S.J., Choudary, P.V., Neal, C.R., Li, J.Z., Vawter, M.P., Tomita, H., Lo-pez, J.F.,
Thompson, R.C.,Meng, F., Stead, J.D. i sur (2004.) Dysregulation of the fibroblast growth
factor system in major depression. Proc Natl Acad Sci 101: 15506–15511
Fagel DM, Ganat Y, Cheng E, Silbereis J, Ohkubo Y, Ment LR,Vaccarino FM (2009.)
FGFR1 is required for cortical regeneration and repair after perinatal hypoxia. J
Neurosci 29: 1202–1211
Fan G, Martinowich K, Chin MH, He F, Fouse SD, Hutnick L, Hattori D, Ge W, Shen Y, Wu
H (2005.): DNA methylation controls the timing of astrogligenesis through regulation of
jak-stat signaling. Development 132: 3345-3356
Galli R, Pagano SF, Gritti A, Vescovi AL (2000.): Regulation of neuronal differentiation in
human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Dev Neurosci 22: 86-95
Gong H, Zuliani P, Komuravelli A, Faeder JR, Clarke EM (2010.) Analysis and verification
of the HMGB1 signaling pathway. BMC Bioinformatics 7:S10
Goodwin GH, Sanders C, Johns EW (1973.): A new group of chromatin-associated
proteins with a high content of acidic and basic amino acids. Eur J Biochem 38: 14-19
Graham FL, Smiley J (1977.) Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA
from Human Adenovirus Type 5. J.gen.Virol. 36: 59-74
47
Green JB, New HV, Smith JC (1992.): Responses of embyonic Xenopus cells to activin and
FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the
mesoderm. Cell 71: 731-739
Grobe K, Inatani M, Palleria SR, Castagnola J, Yamaguchi Y, Esho JD (2005.): Cerebral
hypoplasia and craniofacial defects in mice lacking heparan sulfate Ndst1 gene function.
Development 132: 3777-3786
Guillemot F (2007.): Cell fate specification in the mammalian telencephalon. Prog
Neurobiol 83: 37-52
Guillemot F, Zimmer C (2011.) From Cradle to Grace: The Multiple Roles of Fibroblast
Growth Factors in Neural Development. Neuron 71: 574-588
Hayakawa K, Nakano T, Irie K, Higuchi S, Fujioka M, Orito K, Iwasaki K, Jin G, Lo EH,
Mishima K, Fujiwara M (2010.) Inhibition of reactive astrocytes with fl uorocitrate
retards neurovascular remodeling and recovery after focal cerebral ischemia in mice. J
Cereb Blood Flow Metab 30:871–882
Hayakawa K, Pham LDD, Arai K, Lo HE (2013.) High Mobility Group Box 1: An
amplifier of Stem and Progenitor Cell Activity After Stroke Acta Neurochi Suppl 118:31-
38
Huttunen HJ, Fages C, Kuja-Panula J, Ridley AJ, Rauvala H (2002.) Receptor for advanced
glycation end products-binding COOH-terminal motif of amphoterin inhibits invasive
migration and metas-tasis. Cancer Res 62:4805–4811
Irschick R, Trost T, Karp G, Hausott B, Auer M, Claus P, Klimachewski L (2013.) Sorting of
the FGF receptor 1 in a human glioma cell line. Histochem Cell Biol 139: 135-148
Irvin DK, Dhaka A, Hicks C, Weinmaster G, Kornblum HI (2003.): Extrinsic and intrinsic
factor govering cell fate in cortical progenitor cultures. Dev Neurosci 25: 162-172
Itoh N, Ornitz DM (2008.): Functional evolutionary history of the mouse FGF gene
family. Dev. Dyn 237: 18-27
48
Jin K, LaFevre-Bernt M, Sun Y, Chen S, Gafni J, Crippen D, Logvinova A, Ross CA,
Greenberg DA, Ellerby LM (2005.) FGF2 promotes neurogenesis and neuroprotection
and prolongs survival in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. Proc Natl
Acad Sci 102: 18189–18194
Kim JB, Sig Choi J, Yu YM, Nam K, Piao CS, Kim SW, Lee MH, Han PL, Park JS, Lee JK
(2006.): HMGB1, a novel cytokine-like mediator linking acute neuronal death and
delayed neuroinflammation in the postischemic brain. J Neurosci 26: 6413-6421
Kornblum HI (2007.) Stem Cells and Stroke Recovery: Introduction to Neural Stem
Cells. Stroke 38: 810-816
Kunath T, Saba-El-Leil M.K, Almousailleakh M, Wray J, Meloche S, Smith A (2007.) FGF
stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic
stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development 134: 2895–2902
Laezza F, Gerber BR, Lou JY, Kozel MA, Hartman H, Craig AM, Ornitz DM, Nerbonne JM
(2007.) The FGF14(F145S) mutation disrupts the interaction of FGF14 with voltage-
gated Na+ channels and impairs neuronal excitability. J Neurosci 27: 12033–12044
Laflamme N, Echchannaoui H, Landmann R, Rivest S (2003.): Cooperation between tool-
like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived
from gram-negative and gram-positive bacteria. Eur J Immunol 33: 1127-1138
Lee ST, Chu K, Jung KH, Kim SJ, Kim DH, Kang KM, Hong NH, Kim JH, Ban JJ, Park HK,
Kim SU, Park CG, Lee SK, Kim M, Roh JK (2008.): Anti-inflammatory mechanism of
intravascular neural stem cell transplantation in haemorragic stroke. Brain 131: 616-629
Lindvall O, Kokaia Z (2010.): Stem cells in human neurodegenerative disorders – time for
clinical translation. J Clin Invest 120:29-40
Liu K, Mori S, Takahashi HK, Tomono Y, Wake H, Kanke T, Sato Y, Hiraga N, Adachi N,
Yashino T, Nishibori M (2007.) Anti-high mobility group box 1 monoclonal antibody
ameliorates brain infarction induced by transient ischemia in rats. The FASEB Journal
21: 3904-3916
49
Liu YP, Seckin H, Izci Y, Du ZW, Yan YP, Baskaya MK (2009.): Neuroprotective effects of
esenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells in transient focal
cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab 29: 780-791
Lois C, Alvarex Nuylla A (1993.): Proliferating subventricular zone cells in the adult
mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia. Proc Nate Acid Sci 90:
2074-2077
Lukaszewicz A, Savatier P, Cortay V, Kennedy H, Dehay C (2002) Contrasting effects of
basic fibroblast growth factor and neurothropin 3 on cell cycle kinetics of mouse cortical
stem cells. J Neurosci 22:6610-6622
Lukaszewicz A, Svatier P, Cortay V, Kennedy H, Dehay C (2002.): Contrasting effects of
basic fibroblast growth factor and neurotrophin 3 on cell cycle kinetics of mouse corical
stem cells. J Neurosci 22: 6610-6622
Luskin MB (1993.): Restricted proliferation and migration of postnatally generated
neurons derived from the forebrain subventricular zone. Neuron 11: 173-189
Martion G, Pluchino S (2006.): The therapeutic potential of neural stem cells. Nat
RevNeurosci 7: 395-406
McKeehan WL, Wang F, Kan M (1998.): The heparan sulfate-fibroblast growth factor
family: diversity of structure and function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 59: 135-176
Meng E, Guo Z, Wang H, Jin J, Wang J, Wu C, Wang L (2008.) High mobility group box 1
protein inhibits the proliferation of human mesenchymal stem cells and promotes their
migration and differen-tiation along osteoblastic pathway. Stem Cells Dev 17:805–813
Mitrečić D, Nicaise C, Gajovic S, Pochet R (2010) Distribution, differentiation and
survival of intravenously administered neural stem cells in a rat model of amyotrophic
lateral sclerosis. Cell Transplantation 19(5):537-48.
Mitrečić D, Nicaise C, Klimaschewski L, Gajovic S, Bohl, D, Pochet R (2012) Genetically
modified stem cells for the treatment of neurological diseases. Front Biosci 1(4):1170-81.
Morrison SJ, Perez SE, Qiao Z, Verdi JM, Hicks C, Weinmaster G, Anderson DJ (2000.):
Transient Notch activation initiats an irreversible switch from neuorgenesis to
gliogenesis by neural crest stem cells. Cell 101: 499-510
50
Moskowitz MA, Lo EH, Iadecola C (2010.): The science of stroke: mechanisms in search
of treatments. Neuron 67: 181-198
Murase S i McKay RD (2006.) A specific survival response in dopamine neurons at most
risk in Parkinson’s disease. J Neurosci 26: 9750–9760
Nakahara T, Tsuruta R, Kaneko T, Yamashita S, Fujita M, Kasaoka S, Hashiguchi T, Suzuki
M, Maruyama I, Maekawa T (2009.): High mobility group box 1 protein in CSF of
patients with subarachnoid hemorrhage. Neurocrit Care 11:362-368
Ohnuma S, Harris WA (2003.): Neurogenesis and the cell cycle. Neuron 40: 199-208
Ornitz DM, Itoh N (2001.): Fibroblast growth factors. Gen Biol 2(3) 3005.1-3005-12
Palmer TD, Ray J, Gage FG (1995) FGF-2 responsive neuronal progenitors reside in
proliferative and quiescent regions of the adult rodent rain. Mol Cell Neurosci 6:474-486
Palumbo R, Bianchi ME (2004.) High mobility group box protein, a cue for stem cell
recruitment. Biochem Pharm 68: 1165-1170
Palumbo R, Sampaolesi M, Marchis F, Toulorenzi R, Colombetti S, Mondino A, Cossu G,
Bianchi ME (2004.) Extracellular HMGB1, a signal to tissue damage, induces
mesoangioblast migration and proliferation. J Cell Biol 164: 441-449
Pasqualini JR, Sterner R, Mercat P, Alfrey VG (1989.): Estradiol enhanced acetylation of
nuclear high mobility group proteins of the uterus of newborn guinea pigs. Biochem
Biophys Res Commun 161: 1260-1266
Pawson T, Olivier P, Rozakis-Adcock M, McGlade J, Henkemeyer M (1993.): Proteins with
SH2 and SH3 domains couple receptor tyrosine kinases to intracellular signaling
pathways. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 340: 279-285
Perez JA, Clinton SM, Turner CA,Watson SJ, Akil H (2009.) A new role for FGF2 as an
endogenous inhibitor of anxiety. J Neurosci 29: 6379–6387
Pistoia V, Raffaghello L (2011.) Damage-associated molecular pat-terns (DAMPs) and
mesenchymal stem cells: a matter of attraction and excitement. Eur J Immunol 41:1828–
1831
51
Powers CJ, McLeskey SW, Wellstein A (2000.): Fibroblast growth factors, their receptors
and signaling. Endocr Relat Cancer 7: 165-197
Rauvala H, Pihlaskari R (1987.): Isolation and some characteristics of an adhesive factor
of brain that enhances neurite outgrowth in central neurons. J Biol Chem 262: 16625–35
Rosser, AE, Tyers P, Dunnett SB (2000.) The morphological develop-ment of neurons
derived from EGF- and FGF-2-driven human CNS precursors depends on their site of
integration in the neonatal rat brain. Eur J Neurosci 12: 2405–2413
Rubenstein JL (2010.) Three hypotheses for developmental defects that may underlie
some forms of autism spectrum disorder. Curr Opin Neurol 23: 118–123
Scaffidi P, Misteli T, Bianchi M (2002.): Release of chromatin proteins HMGB1 by
necrotic cells triggers inflammation. Nature 418: 191-195
Schlessinger J (2000.): Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 103: 211-225
Schlueter C, Weber H, Meyer B, Rogalla P, Roser K, Hauke S, Bullerdiek J (2005.)
Angiogenetic signaling through hypoxia: HMGB1: an angiogenetic switch molecule. Am
J Pathol 166:1259–1263
Semino C, Angelini G, Poggi A, Rubartelli A (2005.): NK/iDC iteraction results in IL-18
secretion by DCs at the synaptic cleft followed by NK cell activation and release of the
DC maturation factor HMGB1. Blood 106: 609-616
Shaw G, Morse S, Ararat M, Hragam FL (2002.) Preferential Transformation of human
neuronal cells by human adenoviruses and the origin of HEK293T cells. (2002.) The
FASEB Journal 16:869-871
Sims GP, Rowe DC, Rietdijk ST, Herbst R, Coyle AJ (2009.) HMGB1 and RAGE in
Inflammation and Cancer. Annual Review of Immunology 28: 367-388
Sun Y, Nadal-Vicens M, Misono S, Lin MZ, Zubiaga A, Hua X, Fan G, Greenberg ME
(2001.): Neurogenin promotes neurogenesis and inhibits glial differentiation by
independent mechanisms. Cell 104: 365-376
Szenebyi G, Fallon JF (1999.): Fibroblast growth factors as multifunctional signaling
factors. Int Rev Cytol 185: 45-106
52
Taupin P, Gage FH (2002.): Adult neurogenesis and neural stem cells of the central
nervous system in mammals. J Neurosci 69: 745-749
Thornalley PJ (1998.): Cell activation by glycated proteins AGE receptors, receptor
recognition factors and functional classification of AGEs. Cell Mol Biol 44: 1013-1023
Treutiger CJ, Mullins GE, Johansson AS, Rouhiainen A, Rauvala HM, Erlandsson-Harris H,
Andersson U, Yang H, Tracey KJ, Andersson J, Palmblad JE (2003.) High mobility group 1
B-box mediates activation of human endothelium. J Intern Med 254:375–385
van der Walt JM, Noureddine MA, Kittappa R, Hauser MA, Scott WK, McKay R, Zhang F,
Stajich JM, Fujiwara K, Scott BL i sur (2004.) Fibroblast growth factor 20 polymorphisms
and haplotypes strongly influence risk of Parkinson disease. Am J Hum Genet 74: 1121–
1127
Vescovi AL, Reynolds BA, Fraser DD, Weiss S (1993) bFGF regulates the proliferative
fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS
progenitor cells. Neuron 11:951-966
Wang A, Yang H, Czura CJ, Sama AE, Tracey KJ (2001.) HMGB1 as a Late Mediator of
Lethal Systemic Inflammation. ATS Journals 164: 1768-1773
Wang G, van der Walt JM, Mayhew G, Li YJ, Zuchner S, Scott WK, Martin ER, Vance JM
(2008.) Variation in the miRNA-433 binding site of FGF20 confers risk for Parkinson
disease by overexpression of alpha-synuclein. Am J Hum Genet 82: 283–289
Williams BP, Park JK, Alberta JA, Muhlebach SG, Hwang GY, Roberts TM, Stules CD
(1997.): A PDGF-regulated immediate early gene response initiates neuronal
differentiation in ventricular zone progenitor cells. Neuron 18:553-562
Yamada S, Maruyama I (2007.): HMGB1, a novel inflammatory cytokine. Clin Chim Acta
375: 36-42
Yan SD, Schmidt AM, Anderson GM, Zhang J, Brett J, Zou YS, Pinsky D, Stern D (1994.):
Enhanced cellular oxidant stress by the interaction of advanced glycation end products
with their receptors/binding proteins. J Biol Chem 269: 9889-97
Yang H, Wang H, Czura CJ, Tracey KJ (2005.): The cytokine activity of HMGB1. J Leukoc
Biol 78: 1-8
53
Yang Q, Wang JZ, Li JC, Zhou Y, Zhong Q, Lu FL, Xiang J (2010.) High-mobility group
protein box-1 and its relevance to cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 30: 243-
254
Yoshimura S, Takagi Y, Harada J, Teramoto T, Thomas SS,Waeber C, Bakowska JC,
Breakefield XO, Moskowitz MA (2001.) FGF2 regulation of neurogenesis in adult
hippocampus after brain injury. Proc Natl Acad Sci 98: 5874–5879
Zhao X, Kuja-Panula J, Rouhiainen A, Chen YC, Panula P, Rauvala H (2011) High mobility
group box-1 (HMGB1; amphoterin) is required for zebra fish brain development. J Biol
Chem 286:23200–23213
Passalaqua M, Patrone M, Picotti GB, Del Rio M, Sparatone B, Melloni E, Pontremoli S
(1998) Stimulated astrocytes release high-mobility group 1 protein, an inducer of LAN-5
neuroblastoma cell differentitation. J Neurosci 82: 1021-1028
Yan SD, Chen X, Fu J, Chen M, Zhu H, Roher A, Slattery T, Zhao L, Nagashima M, Morser
J, Migheli A, Nawroth P, Stern D, Schmidt AM (1996) RAGE and amyloid-beta peptide
neurotoxicity in Alzheimer's disease. Nature 382: 685-691
Vincent AM, Perrone L, Sullivan KA, Backus C, Sastry AM, Lastoshic C, Feldman EL
(2006) RAGE activation injures primary sensory neurons via oxidative stress.
Endocrinology 148: 2548-2558
Pichiule P, Chavez JC, Schmidt AM, Vannuci SJ (2007) Hypoxia inducible factor-1
mediates neuronal expression of the receptor for advanced glycation endproducts
following hypoxia/ischemia. J Biol Chem 282: 36330-36340
Muhammad S, Barakat W, Stoyanov S, Murikinati S, Yang H, Tracey KJ, Bendszus M,
Rossetti G, Nawroth PP, Bierhaus A, Schwaninger M (2008) The HMGB1 receptor RAGE
mediates ischemic brain damage. J Neurosci 28(46): 12023-12031
Qiu J, Nishimura M, Wang Y, Sims JR, Qiu S, Savirz SI, Salomone S, Moskowitz MA (2008)
Early release of HMGB1 from neurons after the onset of brain ischemia. J Cereb Blood
Flow Metab 28: 927-938
54
Hori O, Brett J, Slattery T, Cao R, Zhang J, Chen JX, Nagashima M, Lundh ER, Vijay S,
Nitecki P i sur. (1995) The receptor for advanced glycation end products (RAGE) is a
cellular binding site for amphoterin mediation of neurite outgrowth and co-expression
of rage and amphoterin in the developing neurons system. J Biol Chem 270: 25752-61
Zhou Y, Luo W, Zheng L, Li M, Zhang Y (2010) Construction of recombinant FGFR1
containing full-lenght gene and its potential application. Plasmid 64: 60-67
Pickard MR, Barrand P, Chari DM (2011) The transfection of multipotent neural
precursor/stem cell transplant populations with magnetic nanoparticles. Biomaterials 32:
2274-2284
Pickard M, Chari O (2010A) Enhancement of magnetic nanoparticle-mediated gene
transfer to astrocytes by magnetofection: effects of static and oscillating fields.
Nanomedicine 5: 217-232
Pickard MR, Jenhins SI, Koller CJ, Furness DN, Chari DM (2010B) Magnetic nanoparticle
labeling of astrocytes derived for neural transplatation. Tissue Eng Pat C Methods 17(1):
89-99
Sapet C, Laurent W, Chevigny A, Gourrierec LL, Bertosio E, Zelphati O, Beclin C (2011)
High transfection efficiency of neural stem cells with magnetofection. BioTechniques 50:
187-189
Lotz S, Goderie S, Tokas N, Hirsch SE, Ahmad F, Corneo B, Le S, Banerjee A, Kane RS,
Stern JH, Temple S, Fasano CA (2013) Susteined levels of FGF2 maintain undifferentiated
stem cell cultures with biweekly feeding. pLos ONE 8(2): e56289
Dehay C, Savatier P, Cortay V, Kennedy H (2001) Cell-cycle kinetics of neocortical
precursors are influenced by embryonic thalamic axons. J Neurosci 21: 201-214
Raballo R, Rlee J, Lyn-Cook R, Leckman JF, Schwartz ML, Vacarino FM (2000) Basic
fibroblast growth factor (FGF2) is necessary for cell proliferation and neurogenesis in
the developing cerebral cortex. J Neurosci 20: 5012-5023
Storm EE, Garel S, Borello U, Hebert JM, Martinez S, McConnel SK, Martin GR, Rubenstein
JL (2006) Dose-dependent functions of FGF8 in regulating telencephalic patterning
centers. Development 133: 1831-1844
55
Ma DK, Pannusary K, Song MR, Ming GL, Song H (2009) Molecular genetic analysis of
FGFR1 signalling reveals distinct roles of MAPK and PLCγ1 activation for self-renewal
of adult neural stem cells. Mol Brain 2: 16
56
ŽIVOTOPIS
ANA BOGUT
Osobni podaci:
Ime i prezime: Ana Bogut
Datum rođenja: 07.11.1990.
Adresa: Kolarova 17, Zagreb
Broj mobitela: 098 1639 358
E-mail: [email protected]
Obrazovanje:
2012.-2014. Prirodoslovno matematički fakultet, odsjek biologija, diplomski smjer
Eksperimentalna biologija, modul Fiziologija i imunobiologija (Zagreb)
2009.-2012..Prirodoslovno matematički fakultet, odsjek Biologija, smjer biologija –diploma
Prvostupnik biologije/Bachelor of biology (Zagreb)
2005.-2009. VII. gimnazija (Zagreb)
57
Profesionalno iskustvo:
- sudjelovanje na Croatian Student Summit-u na Medicinskom fakultetu (CROSS, 2014.)
- izlaganje vlastitog postera na 2. Glowbrain workshopu: ''Analyses of the cumulative effect
of FGF and HMGB1 on neural stem cell survival, proliferation and differentiation potential’’
- sudjelovanje na 2. Glowbrain workshopu na Hrvatskom institutu za istraživanje mozga (27.-
29.3.2014.)
- izrada diplomskog rada u sklopu projekta Glowbrain na Hrvatskom institutu za istraživanje
mozga
- sudjelovanje na 11. Vienna Biocenter simpoziju u Beču; Time – how nature sets the clock
(7.-8.11.2013.)
- obavljanje prakse na Imunološkom zavodu (Zagreb, 2013.)
- sudjelovanje na terenu u sklopu Udruge studenata biologije (BIUS) na Cresu (2013.)
- demonstrator na vježbama iz kolegija ''Mikrobiologija ekosustava''
- sudjelovanje na terenu u sklopu Udruge studenata biologije (BIUS) na Hvaru (2011.)
58
Radno iskustvo:
2012.-2014. MPG
2013.-2014. dm-drogerie markt
Osobne vještine i kompetencije:
- vozačka dozvola B kategorije
- napredno poznavanje engleskog jezika – diploma za C1.1 stupanj
- osnovno poznavanje njemačkog jezika
- vladanje Office paketom i drugim standardnim računalnim aplikacijama
Dodatne informacije:
- članica studentske udruge BIUS (Udruga studenata biologije)