Uji BSLTYunietha Lakhiafa

Toksisitas Akut Dengan BSLT ( Brine Shrimp Letality Test )

I.Tujuan Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT Mengetahui cara perhitungan LD50dengan metode BSLT Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan metode BSLT Mampu menetapkan LC50sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa probit.II.Landasan TeoriToksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenaiatau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit).Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, pemaparan bahan kimia terhadap organism tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia.Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkandengan metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alas an-alasan tersebut, maka uji ini sangat tepat digunakan dalam penelitian bahan alam.Peranan antioksidan sangat penting dalam meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme normal, dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif. Reaksi radikal bebas secara umum dapat dihambat oleh antioksidan tertentu baik alami maupun sintetis. Sebahagian besar antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol, karatenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid.Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuhin vivodari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian. Salah satu organisme yang sesuai untuk hewan uji adalahbrine shrimp(udang laut).Untuk mengetahui toksisitas ekstrak daundalam penelitian ini digunakanmetode BSLT (Brine ShrimpLethality Test) dan untuk mengetahui aktivitas ekstrak daunsebagai antioksidan digunakan metode DPPH (-1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Pengukuran antioksidan secara Efek peredaman radikal bebas DPPH merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya uji lain (xantin-xantin oksidase, metode Tiosianat, antioksidan total). Hasil pengukuran menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum tidak berdasar jenis radikal yang dihambat. Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan antioksidan tersebut membentuk 1,1,-difenil-2- pikril hidrazin. Reaksi ini menyebabkan terjadinya perubahan warna yang dapat diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada 515 nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.

Uji Toksisitas dengan Metode BSLT.Metode Meyeret al.digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salinaLeach).Penetasan Larva Udang,disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.

Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT.Sebanyak 100 L air laut yang mengandung larvaudang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudiandimasukkan ke dalam wadah uji. Di tambahkanlarutan sampel yang akan diuji masing-masingsebanyak 100 L, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3kali pengulangan (triplikat). Larutan diaduk sampaihomogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahansampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudiandihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup daritiap lubang. Angka mati dihitung dengan menjumlahkanlarva yang mati dalam setiap konsentrasi (3 lubang).Angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yanghidup dalam setiap konsentrasi (3 lubang).Perhitunganakumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan caraberikut: akumulasi mati untuk konsentrasi 10 ppm =angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi matiuntuk konsentrasi 100 ppm = angka mati padakonsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100nppm, akumulasi mati untuk konsentrasi 200 ppm =angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati padakonsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200ppm. Akumulasi angka mati dihitung sampaikonsentrasi 1000 ppm. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut:akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angkahidup pada konsentrasi 1000 ppm, akumulasi hidupuntuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup padakonsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi500 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 200 ppm =angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup padakonsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka hidup dihitungsampai konsentrasi 10 ppm.Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasimati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasisebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zatmenyebabkan kematian 50% yang diperoleh denganmemakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zatdikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

III.Alat dan Bahan Kotak penetasan larva Mikro pipet2-20 L Mikro pipet 20-200 L Wellplate Kaca pembesar Tabung reaksi Labu ukur kotak steroform

IV.Prosedur kerjaa.Penetasan larva

b.Orientasi konsentrasi

V.HASIL PENGAMATANAnalisis data BSCT dengan analisis ProbitKelasKonsentrasi ppmLog C (y)Hidupmati% kematianProbitLc 50

AEkstrak BINTARO100004-101008,7190-

10003-101008,7190

1002-101008,7190

101-101008,7190

10-101008,7190

0,1-1-101008,7190

BEkstrak Alpukat100004-101008,719026,4338 ppm

1000319906,2816

100246605,2533

10155505,000

1028805,8416

0,1-137705,5244

Ket :Digunakan regresi linierY = a + bxProbit= a + b (log C)a = 3,26715b = 1,21853r = 0,9271di hitung LC 50 ?LC 50 = (5-a)/bLC 50 = (5-3,26715)/1,21853LC50 = 1,42216Antilog LC 50 = 26,4338 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis Reed-MunchkelasKonsentrasi ppmhidupmatimati hiduptotalratio% kematianLC 50

BEkstrak Alpukat0,1111919456419/6429,680,6223 ppm

172342347642/7655,26

10131759278652/7968,6

100131776149076/9084,4

10001291051106105/10699,0

100000301350135135/135100

Di hitung :h= 50%-a/(b-a)h : ukuran jaraka : % yang menyebabkan kematian lebih kecildari 50 %b : % yang menyebabkan kematianlebih besar dari 50 %

h = (50%-29,68%)/(55,26%-29,68%)

Di hitung :i = logkematian diatas 50% / kematian dibawah 50% i : log kenaikan dosisi = log 1/0,1i = log 10i = 1

Di hitung :g = h X ig : hasil kali dari ukuran jarak dan log kenaikan dosisg = 0,749 X 1g = 0,749DI hitung :y = g + log kematian lebih kecil dari 50 %y : hasil penjumlahan g dan log kematian kecil dari 50 %y = 0,749 + log 0,1y = 0,749 1y = - 0,206

LC50 = anti log yLC50 = anti log 0,206LC50 = 0,6223 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis FarmakopekelasKonsentrasi ppmLog dosisHidupMati matiPi PiLC 50

BEkstrak Alpukat0,1-11119630,634,471,071 ppm

10723760,76

1011317560,56

10021317560,56

10003129960,96

100004030100100

Di hitung :m = a b (Pi 0,5)Pi:% kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakan.m = 4 1 (4,47 0,5)m = 4 1 (3,97)m = 4 3,97m = 0,03

LC 50 = anti log mLC 50 = anti log 0,03LC 50 = 1,071 ppm

VI.PembahasanUji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)merupakan uji toksisitas yang digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.Pada praktikum kali ini larva udang yang digunakan adalah jenisArtemia salinayang telah berumur 48 jamdan proses pembenihan telur udang yang digunakan adalah sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan dalam air garam dengan kadar 38%(38 gram dalam 1liter air) hal ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli udang yaitu air laut.Adapun ekstrak yang digunakan adalah ekstrak buah alpukat dan bintaro yang dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu mulai dari 10000, 1000, 100, 10, 1 dan 0,1 ppm. Hal ini bertujuan untuk mengetahui LC50dari masing - masing ekstrak tersebut dengan berbagai konsentrasi.Pada prakteknya dengan perlakuan yang sama yaitu larutan ekstrak yang dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 10 buah larva dengan 10 ml larutan (9 ml air garam dan ekstrak sebanyak 1 ml). Ekstrak bintaro menunjukkan hasil data yang error, hal ini ditunjukkan dengan adanya kematian pada semua larva udang di berbagai konsentrasi. Adapun untuk ekstrak alpukat menunjukkan hasil bahwa dengan naiknya konsentrasi maka larva udang yang mati semakin banyak, tetapi pada konsentrasi 1 dan 0,1 ppm tidak menunjukkan hal denmikian, sehingga data yang dipakai adalah pada konsentrasi 10000 sampai 100 ppm. Selain itu percobaan dilakukantriplo agar didapat data statistik yangbaik sehingga, dapat dihitung secara statistik dari data tersebut.Dalam penentuannilai LC50 ini dapat dilakukan dengan 3 cara/metode, yaitu :1.Perhitungan probit2. analisis Reed-Munch3.analisis FarmakopeDalam perhitungan dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam rumus X50=(b-a)/bdan kemudian dapat ditentukan nilai LC50. Adapun hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa LC50adalah 26,438 ppm.Sedangkan dalam perhitungan dengan metode analisis Reed-Munch sebelumnya harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup. Yang kemudian dihitung ukuran jarak (h) = (50%-a)/(b-a), kenaikan dosis (i) = log kematian diatas 50 %/kematian dibawah 50%, nilai (g) = h X I , nilai (y) = g + log kematian lebih kecil dari 50 %, kemudian dapat ditentukan bahwa:nilai LC50= anti log yDengan menggunakan metode analisis Reed-Munch didapatkan hasil LC50sebesar 22,54 ppm.Perhitungan data BSLT dengan metode yang ketiga yaitu dengan analisis Farmakope. Terlebih dahulu dicari nilai Pi dan sigma Pi untuk selanjutnya dimasukkan dalam rumus :m = a b ( Pi 0,5)Pi = % kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakana = dosis terendah yang dapat menyebabkan kematian100%b = beda log dosis yang berurutanselanjutnya dapat ditentukan nilai LC50= anti log m. Dari hasil perhitungan didapatkan nilai LC50 sebesar 26,3 ppm.Dari ketiga metode tersebut dapat diketahui bahwa didapatkan LC50dengan perbedaan yang tak terlalu jauh yaitu 26,438 ppm, 22,54 ppm, dan 22,54 ppm sehingga hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji alpukat bersifat toksik terhadap larva udang karena LC50 1000 g/mL, sedangkan suatu ekstrak dikatakan aktif apabila mempunyai LC50 1000 g/mL.

VII.Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan :1.Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin banyak larva udang yang mati.2.Nilai LC50 pada metode perhitungan analisis probit adalah 26,438 ppm,pada analisis Reed-Munch nilai LC50 adalah 26,438 ppm,dan pada analisis farmakope nilai LC50 adalah 26,3 ppm.3.Ekstrak biji bintaro tidak dapat dihitung LC50 nya karena pada berbagai konsentrasi larva udang mati semua.

VIII.Daftar PustakaAnonim. 2000.Informatorium Obat Nasional Indonesia. Depkes RI : JakartaAnief, Moh.2000.Ilmu Meracik Obat. Gadjah Mada University Press : YogyakartaAnonim. 1995.Farmakope IndonesiaEdisi IV. Depkes RI : JakartaAnsel, Howard.C. 1989.Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Universitas Indonesia Press : JakartaErnst Mutschler, 1986,Dinamika Obat ; Farmakologi dan Toksikologi(terjemahan), ITB, Bandung