0

2000

4000

6000

8000

44 T2 MgCl2 To

0

10000

20000

30000

40000

XC AT XC T MgCl2 To

Una nueva variante de Xanthomonas citri subsp. citri reduce el desarrollo del cancro cítrico

Roxana A. Roeschlin1; María Amalia Chiesa1; María Alejandra Favaro1; María Paula Filippone2; Atilio Castagnaro2; Frederick G. Gmitter Jr.3; José

Gadea Vacas4; María Rosa Marano1. 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR. 2 Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste

Argentino (ITA-NOA); (EEAOC)-CONICET. 3 Universidad de Florida (IFAS), Citrus Research and Education Center Lake Alfred - U.S.A. 4 Instituto de Biología Molecular y Celular de

Plantas (IBMCP), Universidad Politécnica de Valencia - España

UV Visible

XC

T

XC

AT

Mg

Cl 2

E

E

Azúl de tripán

MC

Síntomas desarrollados a los 16 días post

inoculación (dpi) en la cara abaxial de hojas

de limonero inoculadas con XC AT y XC T

(cepa de referencia) transformadas con GFP

(proteína verde fluorescente) utilizando dos

metodologías de infección: A, infiltración (107

ufc/ml) y B, hisopado (109 ufc/ml). Los

síntomas fueron observados con lupa bajo luz

visible y UV (Escala, 10mm).

C. Muerte celular en hojas de limonero

inoculadas por hisopado. 48 hpi, hojas de

limonero fueron teñidas con azul de tripán y

observadas microscópicamente. Escala,

150µm; MC, muerte celular; E, estoma.

Sintomatología desarrollada durante la interacción XC AT-limonero

A. C.

UV Visible

B.

XC

AT

X

C T

5 hpi 24 hpi

XZ

XY

XZ

XY

A. Movimiento estomático en la superficie

abaxial de hojas de limonero. Luego de 1 y 4

hpi, impresiones del tejido epidémico se

observaron microscópicamente. Los datos

marcados con diferentes letras son

significativamente diferentes (p < 0.05).

B. Adherencia bacteriana en la superficie

abaxial de hojas de limonero utilizando cristal

violeta a 5 y 24 hpi. Las células teñidas

adheridas a la superficie de la hoja fueron

analizadas microscópicamente.

C. Formación de biofilm observada por

microscopía laser confocal a los 6 dpi. La

fluorescencia en rojo representa la

autofluorescencia de la clorofila; la fluorescencia

en verde corresponde a las bacterias

tranformadas con GFP. XY y XZ son las

imágenes proyectadas de los ejes XY y XZ.

Escala, 50 μm; E, estoma.

6 dpi

Caracterización biológica de la interacción XC AT-limonero

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 hora 4 horas

XCATXCTABAMgCl2

a a a

b

a

b b

b

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

1 hora 4 horas

XC AT

XC T

ABA

MgCl2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

1 hora 4 horas

XCATXCTABAMgCl2

a

b

a

c

ab

c

c c

Ap

ert

ura

esto

má

tic

a (

µm

)

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

1 hora 4 horas

Infiltración (107 UFC/mL) Hisopado (109 UFC/mL)

0.0

A.

B. C.

XC

AT-G

FP

X

C T

-GF

P

E

E E

E

E

E

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000 3000

2500

2000

1500

1000

500

3000

2500

2000

1500

1000

500

XC AT XC T XC AT XC T

Infiltración (107 UFC/mL) Hisopado (109 UFC/mL)

Nro

. d

e g

en

es

(≥ 2

fo

ld;

p≤0.0

5)

Reprimidos

anotados

Reprimidos

no anotados

Inducidos

anotados

Inducidos no

anotados

Perfil transcriptómico de Citrus limon en respuesta a XC AT y XC T

Análisis de la respuesta transcriptómica a

Xanthomonas citri en hojas de limonero utilizando

microarreglos de Citrus (Agilent). Expresión

diferencial de genes evaluados a las 48 hpi en

hojas de limonero inoculadas con XC AT y XC T

comparadas con una muestra de referencia (To)

utilizando: A. hisopado; B. infiltración. Las barras y

los números coloreados en verde y rojo

representan los genes inducidos y reprimidos,

respectivamente. Las barras más oscuras

representan los genes de Citrus que poseen un

ortólogo en Arabidopsis. 994 461 251

198 618 838 693

884 516 253

1845 2047

Diagramas

de Venn

A. B.

Procesos biológicos- Infiltración XC AT

(FDR)

XC T

(FDR)

Metabolismo de lignina 1.10E-07 n.s.

Deposición de calosa en la pared celular 1.54E-02 n.s.

Procesos apoptóticos 2.81E-02 n.s.

Metabolismo de especies reactivas del

oxígeno 4.70E-02 n.s.

Señalización mediada por etileno n.s. 1.52E-03

Respuesta de defensa a bacterias 8.66E-09 5.69E-08

Respuesta inmune 2.50E-08 1.52E-03

Respuesta a ácido salicílico 6.46E-06 6.61E-06

Respuesta a ácido abscísico 3.02E-04 3.06E-05

Respuesta a ácido jasmónico 7.17E-04 2.88E-04

Respuesta a auxina 1.04E-05 n.s.

Procesos apoptóticos n.s. 1.30E-03

Señalización mediada por receptores

tirosin-kinasa 6.85E-04 1.10E-02

Procesos biológicos – Hisopado XC AT

(FDR)

XC T

(FDR)

Biosíntesis de flavonoides 3.62E-04 n.s.

Respuesta a ácido salicílico 2.47E-03 n.s.

Respuesta a ácido jasmónico 1.03E-02 n.s.

Metabolismo de glucosinolatos 1.60E-02 n.s.

Catabolismo de peróxido de hidrógeno n.s. 1.81E-04

Modificación de la pared celular n.s. 1.40E-02

Desenrrollamiento del ADN n.s. 2.84E-02

Respuesta a bacterias 1.60E-08 7.47E-07

Metabolismo de lignina 2.62E-03 n.s.

Respuesta a auxina 9.19E-03 n.s.

Señalización mediada por receptores de

superficie n.s. 2.94E-06

Respuesta inmune n.s. 3.19E-02

Señalización mediada por ácido abscísico n.s. 3.66E-02

Muerte celular 2.25E-05 9.80E-04

Categorización funcional de los transcriptos involucrados en estrés biótico

Análisis bioinformático utilizando el programa FatiGO (www.babelomics.bioinfo.cipf.es) y ortólogos de Arabidopsis. FDR:

False Discovery Rate. n.s.: no significativo. Los recuadros en verde y rojo representan genes inducidos y reprimidos.

0

0.5

1

1.5

2

44 T2 MgCl2

0

1

2

3

4

5

44 T2 MgCl2 0

0.5

1

1.5

2

2.5

XCAT XCT MgCl2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

XCAT XCT MgCl2

XC

AT

X

C T

Visible UV

0.5

1.0

2.0

2.5

2.5

0.0

XCAT XCT XCAT XCT

Flavonoides Antocianinas

* *

XCAT XCT MgCl2

0.5

1.0

1.5

0.0

2.0

*

Expresión chs

1.0

2.0

3.0

0.0

4.0

Expresión pal1 5.0

*

MgCl2

0.5

1.0

2.0

1.5

2.5

0.0

MgCl2 XCAT XCT MgCl2

** ** ** **

**

**

*** **

Análisis transcriptómico y metabolómico de la interacción XC AT-limonero

A. Imágenes microscópicas del tejido vegetal y autofluorescencia de compuestos fenólicos en hojas inoculadas por hisopado.

La flecha indica la fluorescencia debida a compuestos fenólicos. B. qRT-PCR de pal1 y chs relativos a histona. La expresión

fue comparada con To (muestra de referencia). C. Determinación del contenido fenólico en hojas de limonero. La medidas de

absorbancia de los flavonoides se realizó a 310nm, mientras que el nivel de antocianinas se evaluó a través de: Abs

anthocyanins= Abs(530) - (0,25 Abs(657)). Los datos marcados con diferentes asteriscos son significativamente diferentes (p < 0.05).

A. B. C.

0

50

100

150

44 1 T2 1 Mg1

50

0

100

Expresión pr1 150

*

XCAT XCT MgCl2

**

** 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

44 1 T2 1 Mg 1

Expresión wrky70

0.5

1.0

1.5

0.0

2.0

2.5

3.0 *

XCAT XCT MgCl2 0

XCAT XCT MgCl2 To

SA (pmol g-1 PS)

10000

20000

30000

40000

XCAT XCT MgCl2

JA (pmol g-1 PS)

2000

4000

6000

8000

0

*

** **

***

*

** **

To

A. qRT-PCR de wrky70 y pr1 relativos a histona. La expresión fue comparada con To (muestra de referencia). B.

Cuantificación de las hormonas ácido salicílico y jasmónico en hojas de limonero mediante LC-MS. PS: peso seco. Los datos

marcados con diferentes asteriscos son significativamente diferentes (p < 0.05).

XC AT

XC T

XC AT

XC T

0

60

120

180

240

XC T

+

XC AT

XC T

N° de cancros/cm2

A. B.

La respuesta inmune de XC AT disminuye la formación de cancros

A. Observación de la disminución de los

cancros en hojas de limonero co-

infiltradas con XC AT. Síntomas

observados con lupa bajo luz UV.

B. Cuantificación del número de cancros

en hojas de limonero inoculadas por

infiltración (XC AT: 107 UFC/ml; XC T: 103

UFC/ml)

*

Conclusiones:

XC AT induce una respuesta tipo hipersensible en limonero caracterizada por la acumulación de metabolitos secundarios como flavonoides y antocianinas junto con el incremento de ácido salicílico. Esta respuesta inmune es

capaz de disminuir el desarrollo del cancro cítrico en hojas de limonero y controlar el desarrollo de la enfermedad.

Comprender los mecanismos genéticos y moleculares de la defensa inducida por XC AT permitirá desarrollar estrategias biotecnológicas para el manejo de la cancrosis bacteriana de los cítricos.

Agradecimientos: * Préstamo BID PICT 2011 N° 1833. * Citrus Research and Education Center, University of Florida (Contrato UF1150 y UF13089).