Ứng dụng quechers khảo sát dư lượng chlorpyrifos trong nấm rơm trên địa bàn...

8/17/2019 Ứng dụng Quechers khảo sát dư lượng Chlorpyrifos trong nấm rơm trên địa bàn Thành phố Cần Thơ bằng UPLC-…

http://slidepdf.com/reader/full/ung-dung-quechers-khao-sat-du-luong-chlorpyrifos-trong-nam-rom 1/68

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

PHẠM THANH TIỀN

ỨNG DỤNG QUECHERS KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG

CHLORPYRIFOS TRONG NẤM RƠM TRÊN ĐỊA BÀN

THÀNH PHỐ CẦN THƠ BẰNG UPLC-MS-MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC

Cần Thơ, 12/2014

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

PHẠM THANH TIỀN

ỨNG DỤNG QUECHERS KHẢO SÁT DƢ LƢỢNG

CHLORPYRIFOS TRONG NẤM RƠM TRÊN ĐỊA BÀN

THÀNH PHỐ CẦN THƠ BẰNG UPLC-MS-MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC

HƢỚ NG DẪN KHOA HỌC HƢỚ NG DẪN THỰ C NGHIỆM

ThS. NGUYỄ

N THỊ DI

ỆP CHI TR

ẦN VĂN ĐẢM

Cần Thơ, 12/2014





GVHD: Ths. Nguyễ n Thị Diệ p Chi Luận văn tố t nghiệ p – Hóa học K37

SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang i Niên khóa 2011-2015

LỜ I CẢM ƠN

----------

Để có đƣợ c ngày hôm nay là nhờ công ơn của Cha, Mẹ đã vất vả nuôi dạy, lolắng, động viên cho con suốt hơn 3 năm tại giảng đƣờng đại học. Mỗi khi con gặ p khó

khăn Cha, Mẹ luôn tin tƣở ng, an ủi, khuyến khích và động viên con vƣợt qua, công ơn

Cha, Mẹ r ộng lớn nhƣ trờ i biển, con cám ơn Cha, Mẹ nhiều lắm.

Nếu không có công ơn dạy dỗ, chỉ dẫn tận tình của Thầy, Cô thì em cũng không

có đƣợ c ngày hôm nay. Em r ất cám ơn Thầy, Cô khoa Khoa Học Tự Nhiên và các

Thầy, Cô cũ đã luôn dìu dắt, dạy dỗ, truyền đạt những bài học quý giá về đạo đức, k ỹ

năng sống, kiến thức chuyên môn để em bƣớc vào đờ i.

Luận văn hoàn thành hôm nay, là nhờ sự giúp đỡ của rất nhiều Thầy, Cô,

Anh, Chị và bạn bè. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Cô Nguyễn Thị Diệp Chi – Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Cần Thơ, Cô đã

tận tình quan tâm, giúp đỡ, hƣớ ng dẫn, gở i gắm chỗ thực tập. Cô đã trực tiế p góp ý,

chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn tốt nghiệ p.

Cô Lê Thị Thanh Diệp, cô Phƣợ ng và các Anh, Chị phòng hóa lý trung tâm y tế

dự phòng thành phố Cần Thơ. Cô đã gở i gắm em qua công ty thực tậ p, tận tình chỉ

dẫn, quan tâm chia sẽ, động viên trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cô Lê Thị Bạch (Cố vấn học tậ p), khoa Khoa học Tự nhiên, Cô đã hƣớ ng dẫn,

giúp đỡ , chỉ dẫn và giải đáp những thắc mắc của em trong quá trình thực tậ p.

Ban giám đốc công ty TNHH Warrantek và tất cả Anh Chị trong công ty đã tạo

điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn. Em cám ơn chân thành đến tất cả Anh,

Chị phòng sắc ký đã chỉ dẫn tận tình về k ỹ năng thực hành, k ỹ năng phòng thí nghiệm

trong quá trình thực tậ p. Cuối cùng cám ơn tậ p thể lớ p hóa học khóa 37, bạn bè đã

luôn bên cạnh, ủng hộ và chia sẽ những khó khăn, vất vả trong suốt thờ i gian qua.






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang ii Niên khóa 2011-2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘ NG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lậ p – Tự do – Hạnh phúcBỘ MÔN HÓA ----------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚ NG DẪN

1. Cán bộ hƣớ ng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Diệp Chi

- Đề tài: “Ứ ng d ụng Quechers kh ảo sát dư lượ ng chlorpyri fos trong n ấm rơm

trên điạ bàn thành ph ố C ần Thơ bằng UPLC-MS-MS ”

- Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Tiền MSSV: 2111983

- Lớ p: Cử nhân hóa học Khóa: 37

2. Nội dung nhận xét:

a. Nhận xét về hình thức LVTN:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

b. Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):

Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

...........................................................................................................................................

........................................................................................................................................... Những vấn đề còn hạn chế:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

c. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội

dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

d. K ết luận, đề nghị và điểm:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ hƣớ ng dẫn






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang iii Niên khóa 2011-2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘ NG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMKHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lậ p – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA ----------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN




-

Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Tiền MSSV: 2111983


4.

Nội dung nhận xét: e. Nhận xét về hình thức LVTN:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

f. Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):


...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

g. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội


...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

h. K ết luận, đề nghị và điểm:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Cán bộ chấm phản biện






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang iv Niên khóa 2011-2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘ NG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMKHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lậ p – Tự do – Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA ----------

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN




-

Sinh viên thực hiện: Phạm Thanh Tiền MSSV: 2111983


6.

Nội dung nhận xét: i. Nhận xét về hình thức LVTN:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

j. Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):


...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

k. Nhận xét đối vớ i từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội


...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

l. K ết luận, đề nghị và điểm:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Cán bộ chấm phản biện






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang v Niên khóa 2011-2015

TÓM TẮT

----------

Dƣ lƣợ ng thuốc tr ừ sâu trong nấm rơm đƣợ c phân tích bằng phƣơng phápQuechers. Phƣơng pháp Quechers cho thờ i gian phân tích nhanh, hiệu quả cao, dễ thực

hiện, giảm đƣợ c chi phí sử dụng dung môi và an toàn cho nhân viên kiểm nghiệm. Dƣ

lƣợ ng thuốc tr ừ sâu trong nấm rơm đƣợ c chiết vớ i acetonitrile và MgSO4, làm sạch

bằng phƣơng pháp phân tán pha rắn dSPE, dịch chiết đƣợ c phân tích bằng hệ thống

LC/MS/MS vớ i k ỹ thuật ion hóa ESI và k ỹ thuật ghi phổ MRM. Giớ i hạn phát hiện

của phƣơng pháp là 0,744 ppb và giớ i hạn định lƣợng là 2,254 ppb. Đƣờ ng chuẩn có

sự tƣơng quan tuyến tính rõ r ệt giữa nồng độ chất phân tích và diện tích peak

(R > 0,99). Phƣơng pháp có độ lặp (RSD = 6,23%) và độ thu hồi (75% đến 114,6%)

đều đạt tiêu chuẩn AOAC 2007, và tiêu chuẩn châu Âu EC/657/2002. Phƣơng pháp

Quechers đƣợ c áp dụng r ộng rãi ở các nƣớ c tiên tiến phân tích dƣ lƣợ ng thuốc tr ừ sâu

trong các nền mẫu khác nhau và ngày càng cải tiến mở r ộng cho các nhóm kháng sinh,

độc tố, chất bảo quản trong thực phẩm, môi trƣờ ng…






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang vi Niên khóa 2011-2015

ABSTRACT

----------

The pesticide residues in straw mushrooms were analyzed by Quechers. The methodwas known as the quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for pesticide

residues in straw mushroom involves the extraction of the sample with acetonitrile

(ACN) and simultaneous liquid – liquid partitioning formed by adding anhydrous

magnesium sulfate (MgSO4 ) followed by a simple clean-up step known as dispersive

solid-phase extraction (dSPE). The extract was analyzed by Electrospray ionization

(ESI) MS/MS liquid chromatography – mass spectrometer. Chlorpyrifos was detected in

positive ion mode using four multi-reaction monitoring (MRM ). The limit of

detection was 0,744 ppb in straw mushrooms. The limit of quantification was 2,254 ppb. The linear calibration curve with the correlation coefficient (r > 0,99) was

obtained . The repeatability at 10 ppb was lower than 8% (RSD = 6,23%). The

percentage recoveries from 75% to 114,6% were observed for chlorpyrifos from straw

mushrooms. Thus, the present Quechers method is useful for detection of

chlorpyrifos in straw mushrooms, water, vegetables, fruits and other products.






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang vii Niên khóa 2011-2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam k ết luận văn này đƣợ c hoàn thành dựa trên các k ết quả nghiên cứu của tôi và các k ết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợ c dùng cho bấtcứ luận văn cùng cấ p nào khác.

Cần Thơ, ngày 27 tháng 11 năm 2014

Phạm Thanh Tiền






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang viii Niên khóa 2011-2015

MỤC LỤC

----------

Lờ i cảm ơn .............................................................................................................. i

Trang xác nhận hội đồng ....................................................................................... iiTóm tắt................................................................................................................... vAbstract................................................................................................................. viLời cam đoan ....................................................................................................... viiMục lục ............................................................................................................... viiiDanh mục bảng ..................................................................................................... xiDanh mục hình .................................................................................................... xiiDanh mục từ viết tắt ........................................................................................... xiii

Chƣơng 1: Mở đầu ........................................................................................................ 1

1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1

1.2 Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 1

Chƣơng 2: Tổng quan ......................................................................................... 3

2.1 Tổng quan về nấm rơm .................................................................................... 3

2.1.1 Giớ i thiệu chung về nấm rơm ............................................................... 3

2.1.2 Thành phần dinh dƣỡ ng nấm rơm ........................................................ 3

2.1.3 Quy trình sản xuất nấm rơm ................................................................. 3

2.1.4 Thu hoạch và chế biến nấm rơm .......................................................... 5

2.1.5 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nấm rơm ............................................ 6

2.2 Khái niệm dƣ lƣợ ng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) một số quy định dƣlƣợ ng HCBVTV trong nấm rơm ............................................................................ 6

2.2.1 Khái niệm về dƣ lƣợ ng HCBVTV ....................................................... 6

2.2.2 Dƣ lƣợ ng tối đa cho phép – MRL (Maximum residue limit) ............... 6

2.3 Chlorpyrifos, quy định MRL và phƣơng pháp phân tích chlorpyrifos trongnông sản.................................................................................................................. 7

2.3.1 Tổng quan về chlorpyrifos ................................................................... 7

2.3.2 Độc tính và cơ chế tác dụng ................................................................. 8

2.3.3 Tình hình sử dụng chlorpyrifos trên thế giớ i và Việt Nam .................. 9

2.3.4 Quy định của một số tổ chức quốc tế và Việt Nam về dƣ lƣợ ngchlorpyrifos trong nông sản ............................................................................... 10

2.3.5 Một số phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợ ng chlorpyrifos trong nông sản ....................................................................................................................... 11

2.4 Tổng quan phƣơng pháp Quechers ............................................................... 12

2.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển phƣơ ng pháp Quechers ................... 12

2.4.2 Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp Quechers ..................................... 13






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang ix Niên khóa 2011-2015

2.4.3 Quy trình chung phân tích Quechers và các cải tiến của phƣơng phápQuechers ............................................................................................................ 14

2.5 Tổng quan về LC/MS/MS .............................................................................. 17

2.5.1 Giớ i thiệu chung về HPLC ................................................................. 17

2.5.2 Đầu dò khối phổ - Đầu dò khối phổ MS/MS TQD ............................ 21

2.5.3 Đầu dò khối phổ ba tứ cực xevo TQD, k ỹ thuật ghi phổ SRM(Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) ..... 23

2.6 Thẩm định quy trình phân tích ....................................................................... 25

2.6.1 Tầm quan tr ọng của thẩm định phƣơng pháp ..................................... 25

2.6.2 Nội dung thẩm định quy trình phân tích ............................................ 25

Chƣơng 3: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứ u ....................................... 31

3.1 Địa điểm và thờ i gian thực hiện ..................................................................... 31

3.1.1 Địa điểm thực hiện ............................................................................. 31

3.1.2 Thờ i gian thực hiện............................................................................. 31

3.2 Phƣơng tiện thực hiện .................................................................................... 31

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 31

3.2.2 Hóa chất, dung môi ............................................................................ 32

3.3 Đối tƣợ ng nghiên cứu..................................................................................... 32

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 33

3.5 Hoạch định thí nghiệm ................................................................................... 33

3.5.1 Lựa chọn quy trình, cài đặt các thông số máy UPLC/MS/MS ........... 33

3.5.2 Thẩm định quy trình định lƣợ ng chlorpyrifos .................................... 33

3.5.3 Áp dụng quy trình, phân tích một số mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ. ..................................................................................................... 33

Chƣơng 4: Thự c nghiệm và k ết quả ................................................................ 34

4.1 Lựa chọn quy trình, cài đặt thông số UPLC, TQD ........................................ 34

4.1.1 Lựa chọn quy trình phân tích ............................................................. 34

4.1.2 Cài đặt thông số cho UPLC/MS/MS .................................................. 36

4.1.3 Khảo sát cơ chế phân mảnh, chọn mảnh ion cho k ỹ thuật ghi MRM 38

4.2 Thẩm định quy trình phân tích ....................................................................... 41

4.2.1 Khảo sát tính đặc hiệu của phƣơng pháp............................................ 41

4.2.2 Khảo sát tính tuyến tính của đƣờ ng chuẩn ......................................... 42

4.2.3 Tìm giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lƣợ ng (LOQ) của phƣơng pháp ................................................................................................ 44

4.2.4 Khảo sát độ lặ p lại của phƣơng pháp. ................................................ 45

4.2.5 Khảo sát độ thu hồi của phƣơng pháp ................................................ 46

4.3 K ết quả phân tích mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ ................ 48






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang x Niên khóa 2011-2015

4.3.1 Mục đích ............................................................................................. 48

4.3.2 Tiến hành ............................................................................................ 48

4.3.3 K ết quả................................................................................................ 49

Chƣơng 5: Kết luận và kiến nghị ..................................................................... 50

5.1 K ết luận .......................................................................................................... 50

5.2 Kiến nghị ........................................................................................................ 50






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang xi Niên khóa 2011-2015

DANH MỤC BẢNG

----------

Bảng 2.1: Dƣ lƣợ ng tối đa MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơm theo tiêuchuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7, 2013.[6] ................................... 7Bảng 2.2: Dƣ lƣợ ng tối đa cho phép MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơmtheo tiêu chuẩn Châu Âu EC 1107 / 2009 ...................................................................... 7Bảng 2.3: Quy định dƣ lƣợ ng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong một số loại nôngsản theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7, 2013.[6] ........... 10Bảng 2.4: Quy định dƣ lƣợ ng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong nấm theo tiêu chuẩnEC/212/2013 ................................................................................................................. 10Bảng 2.5: Quy định dƣ lƣợ ng tối đa (MRL) chlorpyrifos trong một số loại nông sản ở Việt Nam theo tiêu chuẩn TCVN 5624-2 : 2009 .......................................................... 10Bảng 2.6: Sự không tƣơng thích của hệ thống HPLC và khối phổ MS ........................ 21Bảng 2.7: Quy định điểm IP đối vớ i k ỹ thuật MS / MS ............................................... 27Bảng 3.1: Thống kê địa điểm, số lƣợ ng, thờ i gian lấy mẫu tại các chợ trên địa bànthành phố Cần Thơ ........................................................................................................ 32Bảng 4.1: Chƣơng trình gradient dung môi .................................................................. 37Bảng 4.2: Tổng quát năng lƣợ ng phân mảnh ion của chlorpyrifos .............................. 40Bảng 4.3: Số điểm IP của chuẩn chlorpyrifos 1ppb ..................................................... 42Bảng 4.4: Dãy chuẩn chlorpyrifos để xây dựng đƣờ ng chuẩn ..................................... 43Bảng 4.5: K ết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chuẩn chlorpyrifos ....................... 43Bảng 4.6: K ết quả khảo sát độ lặ p lại của phƣơng pháp ............................................... 45

Bảng 4.7: K ết quả độ thu hồi tại 5 ppb ......................................................................... 45Bảng 4.8: K ết quả độ thu hồi tại 10 ppb ....................................................................... 47Bảng 4.9: Độ thu hồi tại nồng độ 20 ppb ...................................................................... 48Bảng 4.10: K ết quả phân tích các mẫu nấm rơm tại các chợ trên địa bàn thành phố CầnThơ ................................................................................................................................ 49Bảng 4.11: Tổng quát k ết quả phân tích mẫu nấm ....................................................... 49






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang xii Niên khóa 2011-2015

DANH MỤC HÌNH

----------

Hình 2.1: Công thức của chlorpyrifos ............................................................................ 8Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos trong cơ thể .................................................. 9Hình 2.3: Quy trình phân tích bằng phƣơng pháp Quechers truyền thống ................... 15Hình 2.4: Cấu trúc cơ bản của PSA .............................................................................. 16Hình 2.5: Cấu trúc cơ bản của C18 ................................................................................ 16Hình 2.6: Mẫu so sánh quá trình làm sạch của PSA, C18 ............................................. 16Hình 2.7: Tác dụng làm sạch của PSA, GCB và C18 trên nền rau ................................ 17Hình 2.8: Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................... 17Hình 2.9: Sơ đồ tạo C18 từ silicagel .............................................................................. 20

Hình 2.10: Sơ đồ cơ chế phân mảnh của khối phổ MS/MS ......................................... 22Hình 2.11: Cấu tạo đầu dò khối phổ TQD của hãng Waters ........................................ 23Hình 2.12: Sơ đồ k ỹ thuật tạo ion ESI .......................................................................... 24Hình 3.1: Hệ thống UPLC xevo TQD của Waters ....................................................... 31Hình 4.1: Phổ đồ chuẩn chlorpyrifos 10 ppb trong acetonitrile ................................... 36Hình 4.2: Cơ chế phân mảnh (1) của chlorpyrifos........................................................ 38Hình 4.3: Cơ chế phân mảnh (2) chlorpyrifos .............................................................. 39Hình 4.4: Cơ chế phân mảnh (3) chlorpyrifos .............................................................. 39Hình 4.5: Cơ chế phân mảnh (4) chlorpyrifos .............................................................. 40

Hình 4.6: Phổ đồ mẫu Blank của nấm rơm ................................................................... 41Hình 4.7: Biểu đồ phƣơng trình hồi quy của chuẩn chlorpyrifos ................................. 43






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang xiii Niên khóa 2011-2015

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Quechers: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and safe (nhanh chóng,dễ dàng, r ẻ, hiệu quả, ổn định và an toàn)

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu LongAOAC: Association of Official Analytical Chemists (Hiệ p hội các nhà hóa học

phân tích chính thức)

BNNPTNT: Bộ Nông Nghiệ p và Phát Triển Nông Thôn

HCBVTV: Hóa chất bảo vệ thực vật

MRL: Maximum residue limit (dƣ lƣợ ng tối đa cho phép)

Codex Alimentarius Commission: Ủy ban thực phẩm quốc tế FDA: Cục quản lý thực phẩm và dƣợ c phẩm Hoa K ỳ

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (liên minh hóa họcthuần túy và hóa học ứng dụng)

OP: Nhóm thuốc tr ừ sâu lân hữu cơ

LD50: Letalisdosis (liều gây chết trung bình)

EPA: Environmental Protection Agency (Cơ quan bảo vệ môi trƣờ ng Hoa K ỳ)

EFSA: European Food safety Authority (Cục an toàn thực phẩm Châu Âu)

ADI (mg/kg bodyweight/day): acceptable daily intake (lƣợ ng tiêu thụ hàngngày mà cơ thể chấ p nhận đƣợ c)

ArfD (mg/kg bodyweight): acute reference dose (liều cấ p tính tham chiếu)dSPE: Dispersive Solid-phase extraction (chiết phân tán pha r ắn)

PSA: Primary secondary amine

GCB: Graphite carbon black

LOD: limit of detection (giớ i hạn phát hiện)

LOQ: limit of quantification (Giớ i hạn định lƣợ ng)

S/N: signal to noise ratio (tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu)

USP: dƣợc điển mỹ

GC-ECD: Sắc ký khí ghép đầu dò bắt điện tử UPLC-MS-MS: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu dò hai lần khối phổ

IR: Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại)

TQD: Triple Quadrupole detectorSRM: Selected Reaction MonitoringMRM: Multiple reaction monitoringESI: Electrospray ionizationIP: indenfitication pointISO 17025: international standard organization (Tiêu chuẩn quốc tế về phòng thí

nghiệm)






SVTH: Phạm Thanh Tiề n Trang 1 Niên khóa 2011-2015

CHƢƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

ĐBSCL có diện tích tr ồng lúa đứng đầu cả nướ c vì vậy sản lượ ng phụ

phẩm rơm rạ trong quá trình sản xuất nông nghiệ p là r ất lớ n. Ngườ i nông dân

tận dụng rơm rạ để tr ồng nấm đem lại thu nhập đáng kể và nâng cao đờ i sống

của ngườ i dân. Nhờ tiến bộ của khoa học k ỹ thuật, nghề tr ồng nấm rơm phát

triển mạnh không chỉ phục vụ cho thị trường trong nước mà còn hướng đến

xuất khẩu. Nấm rơm phát triển trong điều kiện ẩm ướ t, thườ ng xuyên bị sâu r ầy và

côn trùng tấn công. Để bảo vệ năng suất nấm, người dân đã sử dụng các loại

thuốc bảo vệ thực vật phòng tr ừ sâu hại, trong đó nhóm lân hữu cơ đượ c sử

dụng phổ biến. Theo danh sách hóa chất bảo vệ thực vật đượ c phép đăng ký sử

dụng của Bộ Nông Nghiệ p và Phát Triển Nông Thôn (BNNPTNT) năm 2009,

các sản phẩm thuốc tr ừ sâu thương mại chứa hoạt chất chlorpyrifos chiếm số

lượ ng nhiều nhất trong nhóm thuốc tr ừ sâu lân hữu cơ .

Dư lượ ng chlorpyrifos tồn đọng trong nấm rơm gây hại r ất lớn đến sức

khỏe của ngườ i sử dụng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương, giảm nội tiết

tố sinh sản, gây vô sinh, bạch tạng.... Ngoài ra, một số nghiên cứu dịch tễ học

gần đây cho thấy chlorpyrifos có khả năng gây ung thư phổi và ung thư tiền

liệt tuyến [1]. Vì vậy kiểm soát dư lượ ng chlorpyrifos trong nấm rơm và các sản

phẩm nông nghiệp là điều r ất cần thiết. Dược điển nhiều nướ c (Mỹ, Anh, Nhật

Bản...), AOAC, tiêu chuẩn Châu Âu đã quy định mức dư lượ ng cho phép của

chlorpyrifos trong thực phẩm và dượ c liệu.

Để kiểm soát dư lượ ng thuốc tr ừ sâu đề tài “Ứ ng d ụng Quechers khảo

sát dư lượ ng chlorpyrifos trong nấm rơm trên đị a bàn thành phố C ần Thơ

bằng UPLC/MS/MS” nhằm mục đích nâng cao chất lượ ng nấm rơm, hướ ng

đến xuất khẩu và bảo vệ sức khỏe ngườ i tiêu dùng.

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tiến hành xây dựng và khảo sát phương pháp xác định dư lượ ng

chlorpyrifos trong nấm rơm bằng k ỹ thuật Quechers vớ i hệ thống UPLC/ MS/MS.







Xác định dư lượ ng chlorpyrifos trong một số mẫu nấm rơm trên địa bàn

thành phố Cần Thơ.







CHƢƠNG 2

TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM RƠM [2,3]

2.1.1 Giớ i thiệu chung về nấm rơm

Nấm rơm có tên khoa học là Volvariella volvacea gồm nhiều loại khác

nhau có màu tr ắng xám, xám, đen kích thước đườ ng kính cây nấm lớ n, nhỏ tùy

thuộc từng loại. Ở các quốc gia vùng nhiệt đớ i r ất thích hợ p về nhiệt độ để

nấm rơm sinh trưở ng và phát triển. Nhiệt độ thích hợp để nấm phát triển từ

30-32oC; độ ẩm nguyên liệu (cơ chất) 65-70%; độ ẩm không khí 80%; pH = 7,thoáng khí. Nấm rơm sử dụng dinh dưỡ ng cellulose tr ực tiế p từ nguyên liệu

tr ồng.

2.1.2 Thành phần dinh dƣỡ ng nấm rơm

Nấm rơm giàu dinh dưỡ ng, 100 g nấm rơm khô chứa 21 g – 37 g đạm

(thành phần đạm chứa hàm lượ ng cao, đầy đủ các acid amin cần thiết mà cơ

thể không tự tổng hợp đượ c) chất béo 2,1 g - 4,6 g, bột đườ ng chiếm 9,9 g,chất xơ 21 g, các yếu tố vi lượ ng là Ca, Fe, P và các vitamine A, B1, B2, C, D,

PP... Nhờ giàu thành phần dinh dưỡ ng, nên nó là nguồn sử dụng để chế biến

thành thực phẩm chức năng, làm món ăn, làm thuốc trong việc hỗ tr ợ tr ị liệu

nhiều bệnh tật như các chứng r ối loạn chuyển hóa, béo phì, r ối loạn lipid

máu, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và đái tháo đườ ng.

2.1.3 Quy trình sản xuất nấm rơm

2.1.3.1 Xử lý nguyên liệu Rơm rạ được làm ướ t bằng nướ c vôi (3,5 kg vôi hòa tan vớ i 1000 lít

nước), vun đống ủ khoảng 4 đến 6 ngày. Nếu nguyên liệu quá ướ t (khi vắt vài

cọng rơm có nướ c chảy thành dòng) cần tr ải r ộng ra mới đem trồng. Rơm, rạ

đủ ướ t (khi vắt vài cọng rơm nướ c chảy thành giọt) là tốt nhất. Nếu rơm quá

khô thì phải thêm nước vào đống ủ.

2.1.3.2 Đóng mô cấy giống

Đặt khuôn (có thể vun thành luống không dùng khuôn) theo diện tíchkhu đất tr ồng. Chiều ngang mặt mô từ 0,3 - 0,4 m, chiều cao từ 0,35 – 0,4 m.



http://vi.wikipedia.org/wiki/B%C3%A9o_ph%C3%AC

http://vi.wikipedia.org/wiki/X%C6%A1_v%E1%BB%AFa_%C4%91%E1%BB%99ng_m%E1%BA%A1ch





http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C4%83ng_huy%E1%BA%BFt_%C3%A1p



http://vi.wikipedia.org/wiki/Ti%E1%BB%83u_%C4%91%C6%B0%E1%BB%9Dng






http://vi.wikipedia.org/wiki/B%C3%A9o_ph%C3%AC





Tr ải một lớp rơm rạ vào khuôn dày 10 – 12 cm. Cấy một lớ p giống viền xung

quanh cách mép khuôn 4 - 5 cm.

Lượ ng giống cấy cho 1,2 m mô khoảng 200 - 250 g. Mỗi lớ p giống cấyxong dùng tay ấn chặt, nhất là xung quanh thành mô. Trung bình một tấn rơm

r ạ khô tr ồng đượ c khoảng 90 m đến 100 m mô nấm.

2.1.3.3 Chăm sóc mô nấm đã cấy giống

Tùy theo tr ồng nấm trong nhà hay ngoài tr ờ i mà có k ỹ thuật chăm sóc

khác nhau.

Tr ồng trong nhà sau 3 đến 5 ngày không cần tưới nướ c, những ngày tiế p

theo thấy rơm khô thì tưới nướ c xung quanh. Nếu mật độ dày cần tưới hai đến ba lượt nướ c trong một ngày. Lượng nước tướ i r ất ít 0,1 lít cho 1,2 mét mô,

nếu tướ i nhiều nấm sẽ bị thối chân và chết ngay còn nhỏ. Đến ngày thứ 7, 8

bắt đầu xuất hiện nấm con, 3 đến 4 ngày sau nấm phát triển nhanh chóng to

bằng quả táo và bắt đầu nở dù.

Đóng mô nấm ngoài tr ời thườ ng bị các đợt mưa lớ n, nắng nóng làm hư

hỏng, vì thế cần che phủ thêm một lớp rơm rạ khô trên bề mặt mô nấm. Lớ p

rơm rạ xế p theo một chiều, phủ theo kiểu lợ p mái nhà. Chiều dày 4 - 5 cm. Tất

cả bề mặt của những mô ở mép ngoài khu vực tr ồng cũng cần che phủ bằnglớp rơm phủ áo, kiểm tra nếu thấy mô nấm bị khô có thể tướ i tr ực tiế p lên lớ p

áo phủ nhiều lần trong ngày, sao cho lớp rơm phía ngoài của mô nấm không bị

mất nướ c.

2.1.3.4 Phòng trừ sâu bệnh cho nấm

Trong quá trình tr ồng nấm rơm thườ ng bị một số loại sâu bệnh tấn công

hại nấm sau:

Nấm dại (nấm mực) do độ ẩm nguyên liệu quá cao. Loại này không gâyhại nhưng cạnh tranh dinh dưỡ ng của nấm rơm, cần điều chỉnh độ ẩm nguyên

liệu lúc đem trồng, hạn chế tưới khi chăm sóc.

Các loại nấm mốc (mốc xanh, vàng, đen,…) loại này nguy hiểm, nguyên

nhân có thể do nguyên liệu bị nhiễm bệnh từ trước. Nhà xưở ng vệ sinh không

sạch sẽ, khu vực nuôi tr ồng ẩm thấp, đã trồng nấm nhiều lần,… Cần loại bỏ

những mô nấm đã bị bệnh ra xa khu vực nuôi tr ồng thậm chí chôn sâu hoặc

đốt để hạn chế nguồn bệnh lây lan. Cách hiệu quả nhất là dùng hóa chất phun

tr ực tiế p lên mô nấm trước giai đoạn gieo meo.







Côn trùng phá hoại, gặm nhấm, chuột, gián, dế, sâu bọ…. tấn công nấm

rơm trong giai đoạn thu hoạch hoặc ăn meo nấm khi vừa mớ i gieo. Tốt nhất là

dùng thuốc để diệt côn trùng, bẫy diệt chuột, hoặc tr ộn hóa chất vào meo nấm

khi gieo lên mô.

2.1.4 Thu hoạch và chế biến nấm rơm

2.1.4.1 Thời gian và cách thu hoạch

K ể từ lúc tr ồng đến lúc thu hoạch đợt đầu là 15 đến 17 ngày. Nấm ra r ộ

từ ngày thứ 12 đến ngày thứ 15. Sau 7 đến 8 ngày tiế p theo thu hái nấm đợ t 2

và k ết thúc đợ t nuôi tr ồng. Thờ i gian từ lúc tr ồng đến khi thu hoạch khoảng 25

đến 30 ngày. Hái nấm trong giai đoạn nấm hình tr ứng là tốt nhất để đảm bảonăng suất cao. Vào những ngày nắng nóng, nấm phát triển r ất nhanh vì vậy

ngườ i tr ồng nấm cần phải thu hoạch nhanh để tránh hiện tượ ng nấm bung dù.

Năng suất nấm giao động từ 12 đến 20% so vớ i nguyên liệu khô. Năng suất

nấm cao hay thấ p tùy thuộc vào chất lượ ng meo giống, k ỹ thuật nuôi tr ồng và

yếu tố khí hậu.

2.1.4.2 Cách chế biến nấm rơm

Nấm rơm có thể bảo quản, chế biến bằng nhiều cách khác nhau để phục

vụ cho nhu cầu của thị trường trong nướ c và xuất khẩu.

Chế biến nấm muối

Đun nướ c sôi, thả nấm tươi vào chần, dùng vỉ tre nén cho nấm chìm

trong nước, đun to lửa cho sôi lại càng nhanh càng tốt. Để sôi 5 - 7 phút, vớ t

nấm ra thả vào chậu nướ c lạnh, thay nướ c nhiều lần tới khi mát tay là đượ c (có

thể để vòi nướ c chảy liên tục) đảm bảo nấm r ắn chắc, đổ nấm ra r ổ để ráo

nướ c. Cho nấm đã chần vào túi nilon không thủng, chum vại hoặc can nhựa,

một lớ p nấm, một lớ p muối theo tỷ lệ 1kg nấm, 0,3 kg muối khô, 0,2 lít dungdịch muối bão hòa. Thờ i gian muối khoảng 15 ngày, nấm sẽ ổn định về chất

lượng, khi đó chúng ta có thể đóng hộ p và xuất khẩu.

Chế biến nấm muối phục vụ cho xuất khẩu các thị trườ ng châu Á, châu

Âu như Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ý,...

Chế biến nấm khô

Quy trình chế biến nấm khô đơn giản hơn nấm muối, nấm được phơi khô

dướ i tr ờ i nắng hoặc đượ c sấy ở 400C cho đến khi nấm khô giòn. Nấm khô phải







có độ ẩm khoảng 13% mới đảm bảo chất lượ ng và bảo quản đượ c lâu.Trung

bình 10 kg nấm tươi cho 1,1 kg nấm khô. Nấm khô có màu vàng r ất đẹp, đượ c

tiêu thụ trong nướ c hoặc xuất khẩu sang các thị trường khó tính như Nhật,

Châu Âu, Hoa K ỳ….

2.1.5 Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu nấm rơm[3]

Nước ta đứng thứ 3 thế giớ i về xuất khẩu nấm, theo số liệu thống kê của

tổng cục hải quan, kim ngạch xuất khẩu nấm năm 2009 đạt 17 triệu USD, tăng

26,7% so vớ i cùng k ỳ 2008, riêng vớ i nấm rơm đạt 8,4 triệu USD tăng 86,7%

so với năm 2008. Sản lượ ng nấm cả nước năm 2011 ước đạt khoảng 270 nghìn

tấn tậ p trung ở khu vực tr ọng điểm là phía Bắc và phía Nam vớ i 16 chủng loạinấm khác nhau (Cục Tr ồng tr ọt, 2011).

2.2 KHÁI NIỆM DƢ LƢỢ NG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰ C VẬT

(HCBVTV), MỘT SỐ QUY ĐỊNH DƢ LƢỢ NG HCBVTV TRONG NẤM

RƠM

2.2.1 Khái niệm về dƣ lƣợ ng HCBVTV [4]

Dư lượng HCBVTV là lượ ng HCBVTV sử dụng còn tồn đọng trên nôngsản sau khi thu hoạch, chế biến. Dư lượng HCBVTV thường đượ c tính bằng

đơn vị miligam HCBVTV trên 1 kilogam (mg/kg) nông sản hoặc dượ c liệu.

2.2.2 Dƣ lƣợ ng tối đa cho phép – MRL (Maximum residue

limit) [5]

Dư lượ ng HCBVTV tối đa cho phép là lượ ng HCBVTV lớ n nhất đượ c

phép tồn dư trong nông sản hay dượ c liệu mà không gây ảnh hưởng đến cơ thể

ngườ i và vật nuôi khi sử dụng. Dư lượ ng tối đa đượ c viết tắt là MRL. Tùy

thuộc từng loại HCBVTV và nông sản khác nhau mà MRL cho phép khác

nhau. Để đảm bảo sự an toàn đối vớ i sức khỏe ngườ i tiêu dùng các tiêu chuẩn

quốc tế như CODEX, AOAC, FDA, tiêu chuẩn Châu Âu, Nhật… quy định

MRL của HCBVTV trong nông sản nhậ p khẩu.







Bảng 2.1: Dư lượ ng tối đa MRL của một số loại thuốc BVTV trong nấm rơm

theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7, 2013[6]

Thuốc tr ừ sâu MRL Năm áp dụngDeltamethrin 0,05 mg/Kg 2004

Permethrin 0,1 mg/Kg 2000

Diflubenzuron 0,3 mg/Kg 2004

Prochloraz 3 mg/Kg 2010

Cyromazine 7 mg/Kg 2008

Bảng 2.2: Dư lượ ng tối đa cho phép MRL của một số loại thuốc BVTV trong

nấm rơm theo tiêu chuẩn Châu Âu EC 1107 / 2009

Tên hóa chất tồn đọng MRL(mg/kg) Năm áp dụng

1,1-dichloro-2,2-bis(ethylphenyl)ethane 0,01 02/09/2008

1,2-dibromoethane(ethylene dibromide) 0,01 02/09/2008

1,2-dichloroethane (ethylene dichloride) 0,01 02/09/2008

1,3-Dichloropropene 0,05 02/09/2008

1-Naphthylacetamide 0,05 02/09/2008

1-Naphthylacetic acid 0,05 02/09/2008

1-methylcychlorpropene 0,01 02/09/2008

2,4 DB 0,01 02/02/20142,4,5-T 0,05 02/09/2008

2,4-D 0,05 06/07/2014

8-hydroxyquinoline sulphate 0,01 20/10/2013

2.3 CHLORPYRIFOS, QUY ĐỊNH MRL VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN

TÍCH CHLORPYRIFOS TRONG NÔNG SẢN.

2.3.1 Tổng quan về chlorpyrifos [8]

Chlorpyrifos có tên theo IUPAC là o,o-Diethyl-o-(3,5,6-trichloropyridin-

2-yl) phosphorothioate. Chlorpyrifos đượ c sản xuất vào năm 1965 bở i công ty

hóa chất Dow Agro Sciences (Hoa k ỳ) vớ i nhiều tên thương mại khác nhau

như Brodan, Dowco 179, Dursban, Empire, Eradex, Lorsban, Piridane,

Stipend....



http://www.codexalimentarius.net/pestres/data/pesticides/details.html?id=135



















Hình 2.1: Công thức của chlorpyrifos

Chlorpyrifos là tinh thể màu tr ắng, mùi hôi, nhiệt độ nóng chảy trong

khoảng 41,5oC – 42,5oC. Chlorpyrifos bền vững trong môi trườ ng trung hòa và

acid yếu. Bị phân hủy trong môi trườ ng kiềm. Độ bền của hợ p chất giảm theo

pH. Chlorpyrifos không tan trong nướ c, tan tốt trong dung môi hữu cơ như

(Acetone, acetonitrile, methylene chloride....) Chlorpyrifos đượ c tổng hợ p từ

3-Methylpyridine qua nhiều giai đoạn phức tạp để tạo ra 3,5,6-Trichloro-2-

pyridinol sau đó cho phản ứng vớ i Diethylthiophosphoryl Chloride.

2.3.2 Độc tính và cơ chế tác dụng [9,19]

Chlorpyrifos có khả năng gây ngộ độc cấ p tính vớ i liều lượ ng cao và gây

ra ngộ độc mãn tính nếu tiế p xúc trong một khoảng thờ i gian dài. Chlorpyrifos

r ất độc hại vớ i sự phát triển của thai nhi và tr ẻ em dù ở liều lượ ng r ất nhỏ[9,19].

Trong 50 loại thuốc tr ừ sâu nhóm lân hữu cơ (OP) đượ c nghiên cứu thìchlorpyrifos có nguy cơ gây ung thư cao nhất.

Theo tổ chức y tế thế giới chlorpyrifos đượ c xếp vào nhóm độc II vớ i

LD50 là 32 mg/kg đến 1000 mg/kg.

Chlor pyrifos tác động chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương, ức chế quá

trình dẫn truyền xung thần kinh và gây r ối loạn quá trình chuyển hóa của cơ

thể. Theo EPA Chlorpyrifos bị oxi hóa thành chlorpyrifos oxon sau đó bị thủy

phân thành 3,5,6 trichloro-2-pyridiol (TCP) liên k ết vĩnh viễn vớ i enzyme

acetylcholinesterase làm enzyme bị bất hoạt không gắn đượ c vớ i các thụ thể,

xung thần kinh truyền liên tục dẫn đến hiện tượ ng co giật ở ngườ i bị nhiễm

độc. Khoảng 70% các tế bào thần kinh bị ức chế theo cơ chế này.







Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa Chlorpyrifos trong cơ thể

2.3.3 Tình hình sử dụng chlorpyrifos trên thế giớ i và Việt

Nam[7]

Theo EPA 1987 - 1998 có khoảng 21 đến 24 triệu pound đượ c sử dụng

tại Hoa K ỳ mỗi năm. Trong đó có khoảng 11 triệu pound đượ c áp dụng chocác lĩnh vực phi nông nghiệ p. Công ty Dow đã đăng ký cung cấ p chlorpyrifos

thương mại cho gần 100 quốc gia và phục vụ hơn 8,5 triệu hecta cây tr ồng mỗi

năm.

Ở Hoa K ỳ hầu hết các sản phẩm diệt tr ừ mối có chứa chlorpyrifos đều bị

cấm sử dụng từ 31/12/2005. Năm 2009, Singapore ban hành luật hạn chế sử

dụng chlorpyrifos trong thuốc diệt mối. Hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có quy

định về việc hạn chế sử dụng chlorpyrifos trong HCBVTV và thuốc diệt côn

trùng.

Năm 2006, EPA đã quy định dư lượ ng chlorpyrifos trong một số loại

nông sản dướ i 0,01 ppm và trong nướ c là nhỏ hơn 2 ppb.

Năm 2012, EFSA đã đưa ra các chỉ số ADI là 0,01 mg/kg thể tr ọng/ngày

và ARfD là 0,1 mg/kg thể tr ọng.

Ở Việt Nam theo danh sách HCBVTB được đăng ký sử dụng của bộ

nông nghiệ p và phát triển nông thôn năm 2009 cho thấy chlorpyrifos có số







lượ ng sản phẩm nhiều nhất trong nhóm lân hữu cơ và nó đượ c sử dụng phổ

biến ở nướ c ta hiện nay.

2.3.4 Quy định của một số tổ chứ c quốc tế và Việt Nam về dƣlƣợ ng chlorpyrifos trong nông sản[6,7,10]

Bảng 2.3: Quy định dư lượ ng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong một số loại

nông sản theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius Commission, 36 Th, tháng 7,

2013[6]

Loại nông sản MRL (mg/Kg) Năm áp dụng

Các loại đậu 0,01 2003Quả hạnh, chanh 0,05 2003

Cà r ốt 0,1 2003Súp lơ 0,05 2003Khoai tây 2 2005Bắ p 0,05 2003Cà phê 0,05 2003

Nho khô 0,1 2003Dâu 0,3 2003Củ cải đườ ng 0,05 2003Trà 2 2005

Bảng 2.4: Quy định dư lượ ng tối đa (MRL) của chlorpyrifos trong nấm theo

tiêu chuẩn EC/212/2013

Ở Nhật, Châu Âu đều quy định dư lượ ng tối đa của chlorpyrifos trong nấm

rơm và một số loại nông sản nhậ p khẩu phải dướ i 10 ppb.

Bảng 2.5: Quy định dư lượ ng tối đa (MRL) chlorpyrifos trong một số loại

nông sản ở Việt Nam theo tiêu chuẩn TCVN 5624-2 : 2009

Loại sản phẩmMRL

(mg/kg)

Nấm rơm 0,05Quả có múi (cam, quýt), táo 1Quả lê, Hạt tiêu, cà chua, cà r ốt 0,5Củ hành, bắ p cải, súp lơ, khoai tây 0,05Các loại đậu 0,2

Các loại nho 1Cà, quả mâm xôi 0,2

Loại nấm MRL (mg/kg) Năm áp dụng

Nấm rơm 0,01 2012 Nấm bào ngư 0,01 2012 Nấm đông cô 0,01 2012Các loại nấm khác 0,01 2012







2.3.5 Một số phƣơng pháp phân tích dƣ lƣợ ng chlorpyrifos

trong nông sản

2.3.5.1 Phƣơng pháp trắc quang[11]

Các mẫu chứa phosphorous dướ i dạng phosphorous hữu cơ và

polyphosphate sẽ đượ c phá mẫu để chuyển về dạng orthophosphate.

Khi mẫu có orthophosphate, trong môi tr ườ ng acid trung bình sẽ phản

ứng với ammonium molybdate để phóng thích molybdophosphoric acid, sau

đó sẽ bị khử bở i SnCl2 cho molybdenum màu xanh dươ ng.

O H NH MoO PO NH H MoO NH PO 23434424

3

4 122112.)(24)(12

4

3434 12.)( MoO PO NH + Sn2+ → molybdenum (màu xanh dương).

Sắc đồ màu khi so sánh vớ i các dung dịch màu tham chiếu cho phép xác

định đượ c hàm lượ ng phosphate trong mẫu.

Hạn chế của phƣơng pháp trắc quang

Trong giai đoạn phá mẫu toàn bộ phosphorous trong mẫu đượ c chuyển

thành orthophosphate nên không thể xác định chính xác từng hoạt chất, mà chỉ

có thể phân tích toàn bộ phosphorous có trong mẫu.Các yếu tố phức tạ p của nền mẫu ảnh hưởng đến độ hấ p thụ quang và

khả năng tạo phức màu.

Không thể phân tích dư lượng dướ i dạng vết nồng độ ppb, hoặc nhỏ hơn.

2.3.5.2 Phƣơng pháp chiết lỏng − lỏng với CH2Cl2 (AOAC

990.06)

Mẫu sau khi đồng nhất đượ c pha loãng và chiết xuất vớ i CH2Cl2, sau đó

loại bỏ phần nướ c lấy CH2Cl2 làm khô bằng Na2SO4, chiết chuyển pha vớ i 5mlMethyl-tert -butyl ether . Đem phân tích bằng GC-ECD, hoặc GC/MS.







2.3.5.3 Phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng với n-Hexane [12]

3 (g) ml mẫu

↓ Thủy phân trong 175µl acid acetic 2,5 N bão hòa trong NaCl

(vortex 10 phút)

↓

Chiết vớ i hỗn hợ p CH3OH+ Hexane (0,75ml:4,5ml)

↓

Lắc 1h, ly tâm 20 phút

↓ Chiết lấy n-Hexane, thổi khô bằng N2

↓

Định mức 50 µl toluene , phân tích GC/MS.

2.3.5.4 Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng

Chiết đượ c chất phân tích có hàm lượ ng thấ p (ppb) hoặc nhỏ hơn, dịch

chiết sạch, ít tạ p, phân tích bằng các thiết bị có đầu dò nhạy như ECD, MS,

MS/MS… cho kết quả r ất tốt.Hạn chế là tốn nhiều thờ i gian cho quá trình chuẩn bị mẫu, sử dụng một

lượ ng lớ n dung môi chứa chlor, hoặc hexane gây độc hại cho nhân viên phân

tích.

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chiết lỏng - lỏng về

thờ i gian phân tích, bảo vệ sức khỏe của nhân viên, bảo vệ môi trườ ng,

phương pháp Quechers đượ c sử dụng và cải tiến quá trình làm sạch bằng vi

chiết trên nền pha r ắn dSPE ngày càng phổ biến ở các phòng thí nghiệm đượ c

trang bị các dụng cụ phân tích có độ nhạy cao như GC/MS/MS,

LC/MS/MS,…

2.4 TỔNG QUAN PHƢƠNG PHÁP QUECHERS

2.4.1 Lịch sử hình thành và phát triển phƣơng pháp

Quechers[13,14 ]

Ban đầu, phương pháp Quechers đượ c tìm ra bở i MichelangeloAnastassiades, Steven Lehotay và các cộng sự để phân tích một số loại thuốc







thú y. Phương pháp Quechers đượ c trình bày lần đầu tiên vào tháng 2 năm

2002 tại hội thảo dư lượ ng thuốc tr ừ sâu Châu Âu, xuất bản lần đầu vào 2003.

Năm 2007 Lehotay đã cải tiến phương pháp sử dụng đệm acetate để điềuchỉnh pH = 6 và Quechers đượ c chính thức đưa vào tiêu chuẩn AOAC

2007.01.

Năm 2008 Anastassiades đã cải tiến Quechers vớ i việc sử dụng đệm

citrate để chiết một dãy r ộng các loại thuốc tr ừ sâu khác nhau, và các loại

thuốc tr ừ sâu phân cực. Bên cạnh đó việc cải tiến phương pháp sử dụng dSPE,

C18 và GCB giúp quá trình làm sạch mẫu tốt hơn mà không ảnh hưởng đến

chất phân tích. Phương pháp Quechers được đưa vào tiêu chuẩn châu Âu EN

15.662.

Hiện nay phương pháp Quechers đượ c sử dụng r ộng rãi trên thế giớ i,

phân tích dư lượng hơn 400 loại thuốc bảo vệ thực vật đang mở r ộng phân tích

dư lượ ng các loại thuốc kháng sinh.

2.4.2 Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp Quechers [15]

2.4.2.1 Ƣu điểm:

Có thể phân tích một dãy r ộng các hợ p chất thuốc tr ừ sâu bao gồm cả những chất khó phân tích.

Có độ chính xác cao, độ thu hồi trên 70%, có thể hiệu chỉnh và cải tiến

phương pháp trên các nền mẫu khác nhau.

Khối lượ ng mẫu phân tích ít (5 g – 10 g), thờ i gian phân tích ngắn

(10 - 15 phút) cho hàng loạt mẫu (8 đến 10 mẫu).

Dung môi sử dụng r ất ít (không dùng dung môi chứa chlor) ít chất thải, ít

độc hại cho môi trườ ng và nhân viên phân tích.Dung môi chiết acetonitrile, vớ i acid hữu cơ như acetic acid, formic

acid... pha vớ i các tỉ lệ khác nhau mà không cần tạo dẫn suất cho chất phân

tích.

2.4.2.2 Hạn chế của Quechers

Sử dụng Quechers đòi hỏi detector phải có độ nhạy cao như MS/MS,

huỳnh quang, ECD,...







Dung môi sử dụng là acetonitrile nên không phù hợ p vớ i GC. Phải có

quá trình chiết vớ i dung môi dễ bay hơi như n-hexane, toluene trước khi đưa

vào phân tích GC.

Hiệu suất thu hồi chịu ảnh hưở ng nhiều bở i pH vì vậy cần điều chỉnh pH

phù hợ p cho quá trình chiết.

2.4.3 Quy trình chung phân tích Quechers và các cải tiến của

phƣơng pháp Quechers

Phương pháp Quechers gồm có 2 giai đoạn chính là quá trình chiết và

quá trình làm sạch.

Quá trình chiết sử dụng dung môi acetonitrile hoặc hỗn hợ p acetonitrile

vớ i formic acid, acetic acid, đệm acetate, đệm citrate... vớ i các tỉ lệ khác nhau

tùy theo pH của chất cần phân tích và nền mẫu. Bên cạnh đó còn sử dụng thêm

muối MgSO4 và NaCl để tăng hiệu suất chiết.

Quá trình làm sạch sử dụng PSA, muối MgSO4, GCB và C18 tùy theo

nền mẫu và chất cần phân tích.







2.4.3.1 Phƣơng pháp Quechers truyền thống [ 14 ]

Cân 10 gam mẫu cho vào ống 50ml

Spike nội chuẩn hoặc hỗn hợ p nộichuẩn chất phân tích

Thêm 10 ml acetonitrile

Lắc khoảng 5 phút

Vortex 1 phút

Ly tâm 5 phút

Lấy dịch trong cho qua kít làm sạch

(PSA, MgSO4).

Ly tâm 3 phút

Hình 2.3: Quy trình phân tích bằng phương pháp Quechers truyền thống

Thêm muối Quechers MgSO4 và 1g

NaCl

Lấy 1ml cho vào vial

Phân tích HPLC/GC-MS/MS







2.4.3.2 Cải tiến của phƣơng pháp Quechers

Cải tiến quá trình chiết: Sử dụng đệm acetate và đệm citrate để ổn định

pH trong quá trình chiết.Quechers truyền thống sử dụng PSA và MgSO4 để làm sạch. Ngày nay

để tăng hiệu quả làm sạch, kit Quechers đượ c thêm vào GCB và C18.

Hình 2.4: Cấu trúc cơ bản của PSA

Hình 2.5: Cấu trúc cơ bản của C18

Hình 2.6: Mẫu so sánh quá trình làm sạch của PSA, C18

Vial 0: Mẫu xử lý chưa qua làm sạch.

Vial 1: Mẫu xử lý đượ c làm sạch PSA và C18.

Vial 2,3: Mẫu chỉ làm sạch bằng PSA.







Khônglàm sạch

100 mgPSA

100 mgPSA

7.5 mgGCB

100 mgPSA 12.5mg GCB

100 mgPSA

100 mgC18

12.5 mgGCB

100 mgPSA

100 mgC18 25 mg

GCB

100 mgPSA

100 mgC18

50 mgGCB

Hình 2.7: Tác dụng làm sạch của PSA, GCB và C18 trên nền rau

2.5 TỔNG QUAN VỀ LC/MS/MS

2.5.1 Giớ i thiệu chung về HPLC [ 16,18 ]

Nguyên tắc hoạt động của máy HPLC

Mẫu sau khi đượ c tiêm vào cột sẽ được pha động kéo qua cột. Dựa vào

khả năng tương tác giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động

mà chúng đượ c tách khỏi nhau. Sau khi ra khỏi cột, dung dịch mẫu phân tích

sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò.

Cấu tạo của hệ thống HPLC

Bình dung môi, bộ phận đuổi khí, hệ thống bơm , bộ phận tiêm mẫu, cột

sắc ký, detector, bộ phận ghi nhân tín hiệu.

Hình 2.8: Sơ đồ hệ thống HPLC







2.5.1.1 Hệ thống bình chứa dung môi

Bình làm bằng thủy tinh, có hệ thống ống dẫn dung môi, ở đầu các ống

có gắn nút bằng kim loại để lọc dung môi, nút được đặt trong một giếng ở đáy bình để đảm bảo hút đến giọt dung môi cuối cùng.

Hệ thống pha động thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp

cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để r ửa giải

theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đườ ng là 100 %.

Trướ c khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm), dung môi phải đượ c

đánh siêu âm khoảng 45 đến 60 phút hoặc cho dòng khí He sục qua vớ i vận

tốc 300 ml/ phút để loại hết bọt khí lẫn trong dung môi vì bọt khí sẽ làm giảm

hiệu lực cột, làm nhiễu đườ ng nền.

Có hai cách dùng pha động rử a giải

Đẳng dòng (isocratic): thành phần pha động không thay đổi trong quá

trình sắc ký.

Gradient: Pha động là hỗn hợ p của nhiều dung môi, thườ ng là 2-4 loại

được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá

trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi).

Pha động có thể là nướ c, các loại dung dịch đệm (pha trong nướ c),

methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợ p các loại trên. Pha động sẽ vận chuyển và

tương tác vớ i chất cần phân tích, do đó chúng giữ vai trò quan tr ọng trong việc

tách các chất phân tích.

2.5.1.2 Bộ khử khí Degases

Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai tr ừ các bọt khí còn sót lại trong

dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện tượ ng sau:

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thờ i gian

lưu của peak thay đổi.

Trong trườ ng hợ p bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai tr ừ hết đượ c

thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất

và hoạt động của cả hệ thống HPLC.







2.5.1.3 Hệ thống bơm

Bơm HPLC có áp suất r ất cao lên đến 7000 psi. Đặc biệt vớ i UPLC TQD

xevo của waters bơm hoạt động vớ i áp suất lên đến 14000 psi. Tốc độ dòng0,5 đến 4 ml/phút. Có hai kiểu bơm là bơm trực tiếp và bơm màng nén ép tự

động. UPLC vớ i hệ thống bơm gradient đa kênh cho phép tự động hóa trong

việc lựa chọn kênh dung môi để giải ly theo chế độ tăng dần tuyến tính.

2.5.1.4 Hệ thống tiêm mẫu vào máy

Có 2 cách đưa mẫu vào trong cột: tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay )

và tiêm mẫu tự động (Autosample).

Tiêm mẫu tự động: mẫu lỏng hoặc dung dịch đượ c tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay đầu cột (không cần phải dừng dòng) bằng một van tiêm

có vòng chứa mẫu. Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau: thườ ng dùng loại

0,5-20 µl. Khi dùng van tiêm sẽ dễ dàng tự động hóa, phần mềm máy tính dễ

dàng điều khiển và kiểm soát hệ thống bơm mẫu tự động. Sai số tiêm mẫu

dùng van khoảng 0,5%.

Tiêm mẫu thủ công: mẫu được bơm bằng tiêm qua tấm đệm ở đầu

cột. Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này

có độ lặ p lại thấ p, sai số lớn hơn nhiều so vớ i khi dùng van tiêm.

2.5.1.5 Cột sắc ký

Cột HPLC đượ c làm bằng thép không gỉ, thườ ng dài 10-15 cm và có

đườ ng kính bên trong 2,1- 4,6 mm có trên 10.000 mâm lý thuyết. Chất phân

tích được cho đi qua cột bảo vệ để loại bỏ tạ p bẩn trướ c khi vào cột sắc ký.

Cột HPLC đượ c nhồi vớ i r ất nhiều loại pha tĩnh khác nhau: pha thườ ng, pha

đảo, pha tạo nối, cột trao đổi ion, cột sắc ký lọc gel.... vớ i UPLC các hạt

silicagel làm pha tĩnh có kích thướ t r ất nhỏ, UPLC xevo TQD với kích thướ thạt của pha tĩ nh là 1,7µm.

Cột C18 pha đảo đượ c tạo ra bằng cách thủy phân các hạt silicagel, đun

nóng vớ i HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH

(8 µmol SiOH/m2 bề mặt). Sau đó cho phản ứng vớ i các organochlorosilane để

tạo ra các pha tĩnh không phân cực (C18) hoặc phân cực trung bình tùy gốc R

gắn vào.







Hình 2.9: Sơ đồ tạo C18 từ silicagel

Cột C18 có ưu điểm là tách tốt nhiều chất có độ phân cực khác nhau dựa

vào chương trình gradient dung môi giải ly.Tách đượ c các chất từ r ất phân

cực, phân cực trung bình và kém phân cực. Tuy nhiên cột pha đảo C8 và C18

chỉ hoạt động đượ c trong khoảng pH từ 2 đến 8,5. Nếu pH < 2 thì các liên k ết

tạo nối ether sẽ bị thủy phân và pH > 8.5 thì nền silicagel sẽ bị phân hủy thànhsilicate.

2.5.1.6 Detector

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu

ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượ ng. Tín hiệu đầu dò thu đượ c

có thể là: độ hấ p thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện,

độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

Đầu dò trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:− Đáp ứng nhanh và lặ p lại.

−

Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở nồng độ thấ p.

− Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng.

− Khoảng hoạt động tuyến tính r ộng.

− Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.

Hiện nay có r ất nhiều loại detector cho HPLC như UV-Vis, mảng diod,

huỳnh quang, đo chỉ số khúc xạ.... Ngoài ra HPLC có thể ghép với các đầu dò

có hiện đại có độ nhạy r ất cao như IR, MS, MS/MS....

2.5.1.7 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện. Đối vớ i các hệ thống

HPLC hiện đại, phần này đượ c phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các

thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số

phân giải,… đồng thờ i tính toán, xử lý các thông số liên quan đến k ết quả phân

tích.







2.5.2 Đầu dò khối phổ - Đầu dò khối phổ MS/MS TQD [ 17 ]

2.5.2.1 Giới thiệu chung về đầu dò khối phổ

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên

cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượ ng phân tử của chất đó

dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện

trườ ng hoặc từ trườ ng nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có

ảnh hưở ng r ất lớn đối vớ i chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích

của ion thì ta dễ dàng xác định đượ c khối lượ ng của ion đó.

Tuy nhiên giữa hệ thống HPLC và đầu dò khối phổ có sự khác biệt r ất

lớ n.Bảng 2.6: Sự không tương thích của hệ thống HPLC và khối phổ MS

Hệ thống HPLC Hệ thống MS/MS

Chất phân tích hòa tan pha động lỏngChất phân tích trong khối phổ ion thể khí.

Áp suất r ất cao ( trên 7000psi) Chân không sâu (10-6 mmHg)

Nhiệt độ thấ p (300C-400C) Nhiệt độ cao (khoảng 2000C)

Dòng chảy pha động vớ i thể tích lớ n Lượ ng mẫu phân tích r ất nhỏ Vận tốc dòng chảy lớ n (vài ml/phút) Vận tốc dòng chảy nhỏ ( vài µl/phút)

Để khắc phục những khó khăn trên trong việc ghép hai loại máy lại vớ i

nhau, cần phải có một trung gian là giao diện. Có nhiều loại giao diện khác

nhau dùng cho HPLC- MS như: chùm tia hạt (PB), bắn phá nhanh nguyên tử

dòng liên tục (CF-FAB), tia nhiệt (TSP), ion hóa bằng cách phun ion (ESI),

ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI),…Tùy thuộc vào khối lượ ng phân

tử và đặc tính (phân cực hay không phân cực) của hợ p chất khảo sát mà có thể

sử dụng máy LC-MS vớ i các k ỹ thuật giao diện khác nhau.

Trong phân tích khối phổ, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các

phân mảnh) r ất quan tr ọng cho việc xác định chất đượ c phân tích. Một hợ p

chất xác định, trong những đều kiện xác định sẽ cho cho các ion tương ứng

trên khối phổ. Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên khối phổ lại có thể

xuất phát từ nhiều chất khác nhau. Trong việc phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng

ghép khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảm bảo, các chất tách ra không

hoàn toàn dẫn tớ i khối phổ thu đượ c sẽ có ion của các phân tử khác làm ảnhhưở ng tớ i việc nhận định k ết quả.







Trong trườ ng hợ p này, việc xác định MS thông thườ ng (một lần) không

cho đượ c k ết quả chính xác. Để khắc phục, ngườ i ta sử dụng các k ỹ thuật khối

phổ n lần với n thườ ng là 2 hay đôi khi hơn. Kỹ thuật này đượ c gọi là MS/MS

hay MSn.

2.5.2.2 Đầu dò khối phổ MS/MS

Nguyên tắc của k ỹ thuật này là lựa chọn một ion xác định (thườ ng là

M+, nhưng cũng có thể là ion con đặc trưng) trong các ion con của lần ion hóa

thứ nhất và loại bỏ tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion

này đượ c cho vào buồng va chạm với khí trơ heli và bị phân mảnh thành ion

con hoặc mảnh trung hòa; tiế p theo các mảnh ion con này đượ c cho vào máy

khối phổ thứ hai để phân tích và xác nhận. Khối phổ ghi nhận đượ c từ một loạiion duy nhất nên không còn bị ảnh hưở ng của các tạ p chất trong mẫu nữa.

Việc nhận định k ết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khi hàm

lượ ng chất phân tích thấ p và nằm trong hỗn hợ p phức tạ p.

Hình 2.10: Sơ đồ cơ chế phân mảnh của khối phổ MS/MS







2.5.3 Đầu dò khối phổ ba tứ cự c xevo TQD, k ỹ thuật ghi phổ

SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM Multiple

Reaction Monitoring)2.5.3.1 Cấu tạo hệ thống khối phổ TQD

Đầu dò khối phổ có ba bộ phận chính là: buồng ion hóa (ionizer), bộ tách khối (mass analyzer) và đầu dò ion (detector).

Hình 2.11: Cấu tạo đầu dò khối phổ TQD của hãng Waters

a. Buồng ion hóa

Buồng ion hóa là nơi mẫu đượ c biến thành các ion để đi vào hệ thống

phân tích. Đối với đầu dò ba tứ cực có bốn nguồn tạo ion ở áp suất khí quyển,

đó là: CI, ESI, APCI và APPI. Hai k ỹ thuật ion hóa phổ biến là ESI và APCI.

b. Kỹ thuật tạo ion ESI

Pha động đi ra từ cột sắc ký vào một ống mao quản bằng thép không gỉ

có đườ ng kính 0,1- 0,5 mm, được phun sương ra khỏi ống mao quản vớ i vận

tốc phun sương chậm 10-20 µl/phút, các giọt sương này sẽ đi vào vùng điện

trườ ng mạnh 3-6 kV, dướ i ảnh hưở ng của điện thế các hạt sương này sẽ mang

điện tích. Khí xung quanh các hạt sương sẽ làm bay hơi dung môi ra khỏi các

hạt sương. Ở càng xa lỗ phun sương các hạt sương có kích thướ c càng nhỏ và

điện tích càng tăng lên, hệ quả là các hạt sương mang nhiều điện tích sẽ kém

bền dẫn đến sự bùng nổ coulomb tạo thành các ion. Các ion này sẽ được đưavào bộ phận phân tích khối phổ.







Hình 2.12: Sơ đồ k ỹ thuật tạo ion ESI

Yêu cầu k ỹ thuật ESI

Dung môi phù hợ p cho k ỹ thuật ESI là ethanol, isopropanol, acetonitrile,

acetone, tetrahydrofuran, chloroform...

Chất phân tích phải đượ c biến đổi thành chất điện ly, tan trong dung dịch

để phun sương. Pha động phải có tính phân cực, để có thể hòa tan chất phân tích thành

ion.

Ƣu điểm của k ỹ thuật ESI

K ỹ thuật có thể tạo thành ion dương hoặc âm tùy vào việc áp đặt điện thế.

K ỹ thuật ESI ít cho phân mảnh ion hơn APCI, là k ỹ thuật ion hóa êm dịu,

phù hợ p cho các chất kém bền nhiệt, có tính phân cực, có khối lượ ng phân tử

lớ n.

c. Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận ghi nhận tín hiệu gồm một loạt khoảng 10 điện cực gọi là các

dynode. Khi các ion chạm vào dynode đầu tiên một loạt điện tử sẽ đượ c phóng

thích ra và chạm vào dynode thứ nhì, quá trình tiế p diễn cho đến dynode cuối

cùng. K ết quả là khi ion chạm vào dynode đầu tiên, sẽ tạo nên một dòng điện

nhỏ, dòng điện này qua các dynode tiế p theo sẽ đượ c khuếch đại lên gấ p 106

lần, đủ lớn để có thể ghi nhận tín hiệu.







2.5.3.2 Kỹ thuật ghi phổ SRM và MRM

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-

MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM vàMRM.

SRM: cô lậ p ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các

mảnh ion sinh ra, cô lậ p 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu

dò để phát hiện.

MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi

lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ

thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần

chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cựcthứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2

(hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò

để phát hiện.

2.6 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH [20]

2.6.1 Tầm quan trọng của thẩm định phƣơng pháp

Thẩm định phương pháp là quá trình tiến hành thiết lậ p bảng thựcnghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp

đáp ứng yêu cầu phân tích thực tế của điều kiện phòng thí nghiệm. Nói cách

khác, việc thẩm định một quy trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng

minh một cách khoa học r ằng khi tiến hành thí nghiệm các sai số mắc phải là

r ất nhỏ và có thể chấ p nhận đượ c.

Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là chứng tỏ r ằng

quy trình đáp ứng vớ i yêu cầu phân tích dự kiến.

Phương pháp phân tích sau khi thẩm định và đánh giá của cơ quan

chuyên môn, sẽ được đưa vào tiêu chuẩn cơ sở để đăng ký lưu hành.

2.6.2 Nội dung thẩm định quy trình phân tích

Theo quy định của AOAC, USP, VILAS đối với phương pháp hóa học

các thông số thẩm định bao gồm:

− Tính đặc hiệu của phương pháp

− Khoảng tuyến tính và đườ ng chuẩn







− Giớ i hạn phát hiện (LOD), giớ i hạn định lượ ng (LOQ) của phương

pháp

− Độ đúng

− Độ lặ p lại

2.6.2.1 Tính đặc hiệu của phƣơng pháp

a. Định nghĩa

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng phát hiện đượ c chất phân

tích khi có mặt các tạ p chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các

chất có bản chất hóa học tương tự chất phân tích, tạ p chất…Cụ thể, trong phép

phân tích đó phải chứng minh đượ c k ết quả là dương tính khi có mặt chất phân

tích và âm tính khi không có mặt nó.

b. Cách xác định

− Phân tích các mẫu tr ắng, lặ p lại tối thiểu 6 lần vớ i nhiều loại nền mẫu.

Mẫu tr ắng phải không đượ c cho tín hiệu chất phân tích.

− Phân tích mẫu thử hoặc mẫu tr ắng thêm chuẩn ở hàm lượ ng gần LOQ,

lặ p lại 6 lần, k ết quả phải cho tín hiệu chất phân tích.

− Phân tích mẫu không có chất phân tích, nhưng có chất có cấu trúctương tự chất phân tích, k ết quả phải âm tính và không ảnh hưởng đến k ết quả

định lượ ng của chất phân tích.

− Vớ i các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS thườ ng so sánh phổ của

chất phân tích vớ i phổ chuẩn trong thư viện phổ, hoặc phổ của chất chuẩn

tương ứng.

− Vớ i các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS thườ ng so sánh phổ của

chất phân tích vớ i phổ chuẩn trong thư viện phổ, hoặc phổ của chất chuẩn

tương ứng.

− Vớ i LC/MS/MS sử dụng phương pháp xác nhận (Confirmation

method) là một cách r ất tốt để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp. Theo

hội đồng châu Âu cách tính điểm IP (identification point) đối với các phương

pháp khác nhau để khẳng định sự có mặt của chất phân tích.







Bảng 2.7 Quy định điểm IP đối vớ i k ỹ thuật MS / MS

K ỹ thuật Số ion Sốđiểm

IP

GC/MS(EI hoặc CI) N N

GC/MS(EI và CI) 2EI+2CI 4

LC/MS N N

GC/MS/MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4

LC/MS/MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4

GC/MS/MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5

LC/MS/MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5

LC/MS/MS/MS 1 ion mẹ,1 ion con, 2 ion cháu 5.5

2.6.2.2 Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn

a. Định nghĩa

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ khảo sát có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo đượ c và nồng độ chất phân tích.


Để xác định khoảng tuyến tính cần khảo sát các dung dịch chuẩn có nồng

độ thay đổi, khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó quan sátsự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính nữa.

Tiến hành xây dựng đườ ng chuẩn trên khoảng tuyến tính đã xác định.

Chuẩn bị dãy nồng độ (tối thiểu 6 nồng độ). Khảo sát sự thay đổi tín hiệu y

theo nồng độ x, nếu sự phụ thuộc tuyến tính ta có phương trình đườ ng chuẩn

y = ax + b

Trong đó: a là độ dốc của đườ ng chuẩn

b là hệ số chặn

Hệ số tương quan của đườ ng chuẩn theo công thức sau

R=∑( ̅)()

√ ∑( )̅∑()

Nếu 0.99 < R 1: có tương quan tuyến tính rõ r ệt.







2.6.2.3 Giới hạn phát hiện LOD), giới hạn định lƣợng LOQ)

a. Định nghĩa

Giớ i hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đượ c lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấ p nhất của chất phân

tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng đượ c.

LOQ là nồng độ tối thiểu của chất cần phân tích trong mẫu thử mà ta có

thể định lượ ng bằng phương pháp khảo sát và cho k ết quả có độ chụm mong

muốn.


− Phân tích mẫu 10 lần song song trên nền mẫu tr ắng, tính độ lệch chuẩn.

LOD = +3SDo

SDo = ∑( ̅)

− Phân tích 10 lần trên nền mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấ p (5

đến 7 lần LOD ước lượ ng). Tính giá tr ị trung bình và SD.

LOD = 3SD

SD = ∑( ̅)

− Phương pháp xác định LOD dựa vào cường độ mũi sắc ký đồ khối

S/N( signal to noise ratio)

LOD đượ c chấ p nhận khi cường độ mũi sắc ký đồ T đáp ứng điều kiệnsau:

3 < < 15.

Trong đó: S là cường độ tín hiệu

N: là nhiễu nền.

Nếu T > 15 thì cần phải pha loãng (hoặc spike ở nồng độ thấp hơn) cho

đến khi 3 < T < 15, ngượ c lại nếu T < 3 thì cần tăng nồng độ spike chuẩn vào

mẫu blank.







− Phương pháp xác định LOD dựa vào đườ ng chuẩn

LOD= 3,3

Trong đó: α là hệ số góc của đườ ng chuẩn

SD: là độ lệch chuẩn của nồng độ đo từ đườ ng chuẩn.

Giớ i hạn định lượ ng LOQ3 LOD.

2.6.2.4 Độ lặp lại của phƣơng pháp

a. Định nghĩa

Độ lặ p lại (độ chính xác) là mức độ sát gần giữa k ết quả thử riêng lẻ, vớ igiá tr ị trung bình ̅ thu đượ c khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng

một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.

Độ lặ p lại thể hiện sai số ngẫu nhiên của phương pháp.

b.Cách xác định

Tiến hành thí nghiệm lặ p lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng một mẫu.

Mẫu phân tích có thể là mẫu tr ắng, hoặc mẫu thực đượ c thêm chuẩn.

Tính SD và RSD của phương pháp.

SD= ∑( ̅)

% RSD = CV% = 100 x ̅

2.6.2.5 Độ đúng của phƣơng pháp

a. Định nghĩa Độ đúng của phương pháp là mức độ sát gần của giá tr ị tìm thấy trên giá

tr ị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được đồng

nhất trong cùng điều kiện xác định.

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là độ thu hồi.


Thêm chất chuẩn ở ba khoảng nồng độ thấ p, trung bình và cao trong

khoảng nồng độ làm việc. Theo quy định của hội đồng Châu Âu đối vớ i các







chỉ tiêu an toàn (các chỉ tiêu thuộc nhóm độc tố, hormone, kháng sinh, dư

lượ ng hóa chất bảo vệ thực vật…) thêm chuẩn vào mẫu tr ắng tại 0,5; 1; 2 lần

giớ i hạn cho phép. Xác định độ thu hồi theo công thức sau

Đối vớ i mẫu thực

H% =

Đối vớ i mẫu tr ắng

H% =







CHƢƠNG 3

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜ I GIAN THỰ C HIỆN

3.1.1 Địa điểm thự c hiện

Địa điểm: Phòng chuẩn bị mẫu sắc ký công ty TNHH Warrantek.

Địa điểm thu mẫu: Mẫu nấm rơm thu mua ngẫu nhiên tại các chợ trong

địa bàn thành phố Cần Thơ.

3.1.2 Thờ i gian thự c hiện

Từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014.

3.2 PHƢƠNG TIỆN THỰ C HIỆN

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ

− Hệ thống UPLC xevo TQD của Waters vớ i hệ thống bơm mẫu tự động

waters acquity.

− Đầu dò khối phổ MS/MS waters TQD vớ i nguồn phun ion ESI, APCI.

− Cột sắc ký acquity UPLC BEH C18 2,1mm x 50 mm, 1,7 µm.

Hình 3.1: Hệ thống UPLC xevo TQD của Waters

− Máy lắc.

− Máy ly tâm.

− Máy vortex.

− Bồn siêu âm có gia nhiệt.− Cân phân tích gram, chính xác tớ i 0,0001g.







− Micropipette loại 20-200µl và 100-1000µl.

− Ống nhựa 50 ml chịu đượ c dung môi.

− Pipette 1ml, 5 ml

− Bình định mức 10 ml, 25 ml, 50 ml.

3.2.2 Hóa chất, dung môi

− Chuẩn gốc chlorpyrifos của Dr.Ehrenstorfer 98%.

− Muối CH3COONa, CH3COOH, MgSO4 và Na2SO4, PSA, C18,

acetonitrile, H2O dùng cho HPLC (Merck và Waters).

− Muối Quechers gồm MgSO4 và NaCl đượ c cân vào ống 15ml và bảo

quản trong vòng 15 ngày.−Kit Quechers đượ c cân vào ống 15 ml và bảo quản trong 1 tuần.

3.3 ĐỐI TƢỢ NG NGHIÊN CỨ U

Các mẫu nấm đượ c lấy ngẫu nhiên tại các chợ trên địa bàn thành phố

Cần Thơ.

Mẫu khách hàng gở i công ty kiểm đượ c thực hiện theo quy trình xử lý

mẫu của công ty.

Bảng 3.1: Thống kê địa điểm, số lượ ng, thờ i gian lấy mẫu tại các chợ trên địa

bàn thành phố Cần Thơ

Địa điểm Số lượ ng mẫu nấm rơm Thờ i gian

Tân An 4 mẫu (NR1đến NR4) 22-23/10/2014

An Lạc 4 mẫu (NR5 đến NR8) 22-23/10/2014

Cái khế 4 mẫu (NR9 đến NR12) 24-25/10/2014Huê Viên 4 mẫu (NR13 đến NR16) 24-25/10/2014

Hưng Lợ i 5 mẫu (NR17 đến NR21) 26-27/10/2014

Xuân Khánh 5 mẫu (8725,8726,10282,10283,10284) 26-27/10/2014

Phú Thứ 4 mẫu (10265,10266,10301,10302) 28/10/2014







3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Thực hiện nghiên cứu dựa trên quy trình của tiêu chuẩn AOAC 2007.01

và EN 15662 năm 2008.

Nghiên cứu k ết hợ p hai quy trình, khảo sát lại phương pháp Quechers

truyền thống không sử dụng đệm và làm sạch bằng C18, k ết hợ p PSA.

3.5 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM

3.5.1 Lự a chọn quy trình, cài đặt các thông số máy UPLC/MS/MS

− Xây dựng quy trình dựa vào quy trình phân tích AOAC 2007.01 và EN

15662 (2008).

− Cài đặt thông số cho UPLC, TQD

− Lựa chọn cơ chế phân mảnh của chlorpyrifos, cài đặt cơ chế ghi phổ

MRM.

3.5.2 Thẩm định quy trình định lƣợ ng chlorpyrifos

− Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp.

− Khảo sát tính tuyến tính tín hiệu chuẩn chlorpyrifos trong xây dựng

đườ ng chuẩn.

− Tìm giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng của phương pháp.

− Khảo sát độ lặ p lại của phương pháp.

− Khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp.

So sánh k ết quả thẩm định vớ i tiêu chuẩn EC/657/2002 và AOAC

2007.

3.5.3 Áp dụng quy trình, phân tích một số mẫu nấm rơm trên

địa bàn thành phố Cần Thơ.







CHƢƠNG 4

THỰ C NGHIỆM VÀ K ẾT QUẢ

4.1 LỰ A CHỌN QUY TRÌNH, CÀI ĐẶT THÔNG SỐ UPLC, TQD

4.1.1 Lự a chọn quy trình phân tích

4.1.1.1 Mục đích

Lựa chọn quy trình phân tích phù hợp để phân tích nhanh số lượ ng mẫu

lớ n, trong thờ i gian ngắn, khảo sát thẩm định quy trình để áp dụng vào thực tế.

4.1.1.2 Thực hiện

K ết hợ p quy trình phân tích theo AOAC 2007.01 và EN 15662

a. Quy trình phân tích theo AOAC 2007.01

Cân 15 g mẫu đã đồng nhất cho vào ống 50 ml

(Spike nội chuẩn)

↓

15 ml acetonitrile 1 % CH3COOH, 1.5 g CH3COONa, 6 g MgSO4.

↓

Lắc khoảng 1 phút, ly tâm >1500 vòng/phút khoảng 1 phút

↓

Chuyển 1 đến 8 ml vào ống chứa 150 mg MgSO4, 50 mg PSA

Vortex 30 giây, ly tâm khoảng 1 phút

↓

Lấy 1ml cho vào vial, phân tích LC/MS/MS

Theo AOAC 2007.01 sử dụng đệm acetate để duy trì pH 6, là khoảng

pH tối ưu để chiết một loạt các loại thuốc tr ừ sâu nhóm OP. Tuy nhiên việc

làm sạch qua kit chỉ sử dụng muối MgSO4 và PSA không thể loại bỏ tạ p chất

màu, sắc tố, béo và các hydrocarbon.







b. Quy trình phân tích theo EN 15662

Cân 10 g mẫu cho vào ống 50 ml

↓

Spike nội chuẩn, chiết 10 ml acetonitrile lắc khoảng 1 phút

↓

Thêm 4 g MgSO4, 1 g NaCl, 1,5 g sodium citrate, ly tâm 5 phút.

↓

Chuyển 1- 6 ml vào ống chứa 150 mg MgSO4, 25 mg PSA, lắc 30 giây (có thể

sử dụng GCB, hoặc C18 để loại tạ p tùy nền mẫu)↓

Ly tâm 3000 vòng, 5 phút

↓

Chuyển 1ml vào vial phân tích LC/MS/MS

Tiêu chuẩn EN 15662 sử dụng đệm citrate pH 5 chiết tốt các hợ p chất

thuốc tr ừ sâu có tính acid và một dãy r ộng thuốc tr ừ sâu nhóm lân hữu cơ và

chlor hữu cơ.

Chlorpyrifos thuộc nhóm lân hữu cơ, tan tốt trong acetonitrile, trong nền

mẫu nấm rơm 5 pH 7. Do nền mẫu nấm rơm rất ít diệ p lục và các sắc tố

màu nên khi khảo sát không cần sử dụng GCB, bên cạnh đó nền mẫu nấm

chứa nhiều acid hữu cơ, và hàm lượ ng muối khoáng cao, cùng vớ i các hợ p

chất hydrocarbon nên việc sử dụng PSA và C18 là r ất cần thiết.

4.1.1.3 K ết quả quy trình chuẩn bị mẫu

Cân 10 g mẫu nấm vào ống 50 ml

↓

Chiết 10 ml acetonitrile

↓

Muối Quechers (4 g MgSO4, 1 g NaCl)

↓

Rút 2 ml cho vào kit (100 mg C18, 100 mg PSA, 900 mg MgSO4)

↓

Rút 1ml cho vào vial, phân tích bằng UPLC/MS/MS







4.1.2 Cài đặt thông số cho UPLC/MS/MS

4.1.2.1 Xác định thời gian lƣu chuẩn

a. Mục đích

Chạy chuẩn chlorpyrifos pha trong dung môi acetonitrile để xác định thờ i

gian lưu TR của chuẩn, làm cơ sở cài đặt thờ i gian chạy máy, thờ i gian ghi phổ

của chế độ ghi MRM và các thông số máy ghi nhận chất phân tích.

b. Thự c hiện

Dùng micropipette lấy 100µl chuẩn chlorpyrifos 1ppm cho vào bình định

mức 10 ml, thêm acetonitrile tớ i vạch đượ c dung dịch chuẩn chlorpyrifos 10

ppb.

Sau khi máy chạy ổn định tiến hành bơm mẫu vào máy vớ i chế độ bơm

mẫu tự động thể tích tiêm 7µl.

c. K ết quả

Thời gian lưu chuẩn chlorpyrifos được xác định là TR = 3,71 (phút).

Hình 4.1: Phổ đồ chuẩn chlorpyrifos 10 ppb trong acetonitrile







4.1.2.2 Cài đặt cho UPLC

Kênh dung môi: Kênh dung môi A: H2O + 0.01% formic acid

Kênh dung môi B : acetonitrile + 0.01 % formic acid

Áp suất: áp suất thấ p nhất 0 psi. Áp suất cao nhất 14000 psi.

Chu k ỳ làm sạch seal: 5 phút.

Thể tích bơm mẫu: 7µl

Thờ i gian chạy: 6 phút.

Dung môi làm sạch: acetonitrile : H2O (1:9).

Nhiệt độ của cột: 300C.

Bảng 4.1: Chương trình gradient dung môi

Thờ i gian (phút)Tốc độ dòng

(ml/phút)Kênh A % Kênh B %

0 0,3 20 80

0,5 0,3 20 80

2,5 0,35 100 0

3 0,35 100 0

3,5 0,3 20 80

4 0,3 20 80

4.1.2.2 Cài đặt thông số cho MS/MS TQD

Tốc độ dòng: 5 µl/phút Nhiệt độ nguồn: 150 0C

Desolvation temp: 500 0C

K ỹ thuật phân mảnh: ESI

Loại ghi phổ và thờ i gian ghi: MRM, thờ i gian ghi 5 phút.







4.1.3 Khảo sát cơ chế phân mảnh, chọn mảnh ion cho k ỹ thuật

ghi MRM [ 12 ]

4.1.3.1 Mục đích Khảo sát cơ chế phân mảnh để lựa chọn mảnh ion định lượ ng, ion con

xác nhận phù hợ p cho k ỹ thuật ghi phổ MRM, điều chỉnh các thông số về điện

thế, từ trườ ng cho khối phổ TQD để bắt đượ c mảnh ion con tốt nhất.


K ỹ thuật ion hóa ESI cho nhiều mảnh ion con, với cơ chế phân mảnh

phức tạ p.

Trong cấu trúc phân tử chlorpyrifos nguyên tử chlor ở các vị trí 3, 5, 6của vòng pyridine là các nhóm khử hoạt, cấu trúc aryl không ổn định nên

chlorpyrifos dễ dàng bị mất HCl theo cơ chế benzyl. Ở mức năng lượ ng phân

ly từ 30 – 70V mảnh ion phân tử m/z = 350 (M+), mất HCl cho mảnh

m/z = 314 (M+ - HCl), mảnh m/z = 314 kém bền tiế p tục mất hai phân tử

ethylene, cho mảnh ion m/z = 258 bền hơn.

Hình 4.2: Cơ chế phân mảnh (1) của chlorpyrifos

Sau khi hình thành ion m/z = 314 hệ thống điện tử trên vòng benzyl khá

dày đặc (liên k ết ba) nên để dàng lấy H từ các phân tử k ế cận, tiế p tục mất hai

phân tử trung hòa ethylene.







Hình 4.3: Cơ chế phân mảnh (2) chlorpyrifos

Bên cạnh đó do nguyên tử P còn các obitan tr ống liên k ết tr ực tiế p vớ i

nguyên tử O, mật độ điện tử trên các nguyên tử O khác dày đặc, phân tử

chlorpyrifos cũng dễ dàng phân mảnh theo cơ chế sau









4.1.3.3 Kết quả

Căn cứ vào quá trình khảo sát cơ chế phân mảnh, mảnh ion m/z = 258

bền nhất, có cường độ mũi cao nhất đượ c chọn làm ion định lượ ng, ion mẹ (ion phân tử) m/z = 350 (M+) và hai mảnh ion con xác nhận lần lượ t là

m/z = 198 và m/z = 97.

Bảng 4.2: Tổng quát năng lượ ng phân mảnh ion của chlorpyrifos

STTTiềnion

Ionđịnh

lượ ng

Ion xácnhận(Da)

Dwell(s)

Điệnthế

cone

(V)

Điệnthế

Coll

(eV)

Delay(s)

Compound

1 349,45 257,87 96,87 0,161 30 30 -1,00 Chlorpyrifos

2 349,85 257,87 197,85 0,161 30 18 -1,00 Chlorpyrifos







4.2 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

4.2.1 Khảo sát tính đặc hiệu của phƣơng pháp


Xác định sự có mặt chất phân tích không bị ảnh hưở ng bở i các tạ p chất

khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất có bản chất hóa học

tương tự chất phân tích…


Phân tích lặp đi lặ p lại nhiều lần trên 10 nền mẫu blank cá và 10 nền mẫu

blank nấm rơm. Xác định sự có mặt của chất phân tích và ảnh hưở ng của

nhiễu nền tại thời gian lưu chuẩn.

Yêu cầu: Mẫu blank phải không có tín hiệu peak tại thời gian lưu

chuẩn, tỉ lệ S/N < 3.

Khảo sát tín đặc hiệu của phương pháp thông qua kỹ thuật ghi để xác

định điểm IP (identification point) của chuẩn chlorpyrifos 1ppb.

Dùng micropipette lấy 10µl chuẩn chlorpyrifos 1p pm cho vào bình định

mức 10 ml, thêm acetonitrile tớ i vạch đượ c dung dịch chuẩn chlorpyrifos

1ppb.

Yêu cầu: Số điểm IP ghi nhận đượ c phải từ 4 tr ở lên.

4.2.1.3 Kết quả

Phân tích 20 mẫu blank không phát hiện đượ c chất phân tích và tín hiệu

peak tại thờ i gian lưu chuẩn. Tỷ lệ S/N= 2.15 < 3.

Hình 4.6: Phổ đồ mẫu blank của nấm rơm







Bảng 4.3: Số điểm IP của chuẩn chlorpyrifos 1ppb

Mảnh ion Số điểm IP ghi nhận đượ c

m/z = 349,45 1m/z = 257,87 1

m/z = 197,85 1

m/z = 96,87 1

K ết luận : Phương pháp có tính đặc hiệu cao vớ i nền mẫu nấm rơm.

4.2.2 Khảo sát tính tuyến tính của đƣờ ng chuẩn

4.2.2.1 Mục đích Khảo sát tính tuyến tính của đườ ng chuẩn làm cơ sở cho việc định lượ ng

các mẫu thực.

Xác định phương trình hồi quy của đườ ng chuẩn y = ax + b và hệ số

tương quan tuyến tính R 2 giữa nồng độ chất phân tích và diện tích peak

chlorpyrifos.


Theo tiêu chuẩn của EC/212/2013 cũng như tiêu chuẩn dư lượ ngchlorpyrifos trong nông sản và nấm rơm nhậ p khẩu vào thị trườ ng Hoa K ỳ,

Châu Âu và Nhật Bản đều quy định MRL dướ i 10 ppb.Vì vậy 10 ppb đượ c

xem là giớ i hạn cấm của chlorpyrifos trong nấm rơm khi xuất khẩu.

Theo tiêu chuẩn ISO 17025 thì đườ ng chuẩn đượ c xây dựng phải có ít

nhất 5 điểm bao gồm cả blank và phải bao trùm khoảng nồng độ quan tâm

(giớ i hạn cấm) từ 100%-150%. Vì vậy khoảng tuyến tính của đườ ng chuẩn

đượ c xây dựng trên khoảng nồng độ 1ppb, 5 ppb, 10 ppb, 20 ppb và 100 ppb.

Đườ ng chuẩn có độ tuyến tính tốt khi hệ số tương quan R 2 > 0.99

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Chuẩn gốc Co (100 ppm): cân chính xác 1.0205 mg chuẩn chlorpyrifos,

định mức thành 10 ml bằng acetonitrile (hàm lượ ng tinh khiết của chuẩn gốc

là 98%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ -18oC, bền trong vòng 3 tháng.

Chuẩn trung gian (10 ppm): lấy 1ml chuẩn Co cho vào bình định mức

10 ml, định mức đến vạch bằng acetonitrile. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ

-18oC, bền trong một tháng.







Chuẩn làm việc (1ppm): lấy 1ml chuẩn 10 ppm cho vào bình định mức

10 ml định mức đến vạch bằng acetonitrile. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ

-18oC, bền trong một tháng.

Chuẩn bị dãy chuẩn

Mẫu đượ c xử lý và đồng nhất, cân 10 g mẫu nấm rơm cho vào ống

50 ml, tiến hành spike chuẩn chlorpyrifos 1ppm.

Bảng 4.4 Dãy chuẩn chlorpyrifos để xây dựng đườ ng chuẩn

Điểmchuẩn

Thể tíchspike chuẩnchlorpyrifos

1ppm (µl)

Nồng độ (ppb)

S1 10 1S2 50 5S3 100 10S4 200 20S5 1000 100

4.2.2.3 Kết quả

Bảng 4.5: K ết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chuẩn chlorpyrifos

Điểmchuẩn Nồng độspike (ppb) TR diện tích pick Nồng độthực (ppb) S/N

S1 1 3,71 368,673 0,97 254,9

S2 5 3,70 1023,848 4,56 634,6S3 10 3,71 2054,988 10,21 776

S4 20 3,71 4140,763 21,64 1628,1S5 100 3,71 18385,551 99,67 4932,4

Hình 4.7: Biểu đồ phương trình hồi quy của chuẩn chlorpyrifos

y = 182.535x + 191.513

R² = 0.9994

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0 20 40 60 80 100 120

d i ệ n

t í c h

p i c k

nồng độ thực (ppb)







Nhận xét

Giá tr ị P = 6,58.10-9 < 0,05; hằng số b của đườ ng thẳng có ý nghĩa.

Tra chuẩn F (Fischer), Fα = FINV(0.05,1,3) = 10,128 < Flt = 9,26.108.

Hệ số góc α, và phương trình hồi quy có ý nghĩa.

R 2 = 0,9994 có sự tương quan tuyến tính rõ r ệt giữa nồng độ chuẩn

chlorpyrifos và diện tích peak.

4.2.3 Tìm giớ i hạn phát hiện (LOD) và giớ i hạn định lƣợ ng

(LOQ) của phƣơng pháp

4.2.3.1 Mục đích Khảo sát LOD để tìm ra khoảng nồng độ chlorpyrifos nhỏ nhất có trong

mẫu mà máy còn có thể phát hiện đượ c.


LOD đƣợ c tính dự a vào đƣờ ng chuẩn

Dựa vào đườ ng chuẩn để dự đoán giớ i hạn phát hiện của phương pháp.

Giớ i hạn phát hiện (LOD) đượ c tính theo công thức

LOD= 3,3

Trong đó: α là hệ số góc của đườ ng chuẩn

SD: là độ lệch chuẩn của nồng độ đo từ đườ ng chuẩn.

4.2.3.3 K ết quả

Thống kê mô tả xử lý số liệu của đƣờ ng chuẩn

SD = 41,146, hệ số góc α = 182,535.

LOD = 3,3 = 3,3

= 0,744 (ppb).

LOQ = 10 = 10

= 2,254 (ppb).

K ết luận: Phương pháp có giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng

thấ p, phù hợp để phân tích dư lượ ng chlorpyrifos ở nồng độ vi lượ ng

ppb.







4.2.4 Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp.


Khảo sát độ lặ p lại để xác định độ lệch chuẩn tương đối của phươ ng pháp% RSD. Theo tiêu chuẩn AOAC 2007, % RSD tại nồng độ 10 ppb < 21%.


Thí nghiệm đượ c lặ p lại 10 lần tại nồng độ spike chuẩn chlorpyrifos

vào mẫu blank, nồng độ trong mẫu 10 ppb.

Cách tiến hành

Cân 10 g nấm đã xay nhuyễn vào ống 50 ml, sau đó spike 100µl chuẩn

chlorpyrifos 1ppm vào mẫu, tiến hành chiết vớ i 10 ml acetonitrile và phân tích

theo quy trình.

Nồng độ chuẩn chlorpyrifos trong mẫu đượ c tính bằng công thức

mC = Cc Vc

Trong đó m là khối lượ ng mẫu nấm cân (10 g)

C là nồng độ chất phân tích trong mẫu (ppb)

Cc là nồng độ của chuẩn chlorpyrifos (1ppm)

Vc là thể tích chuẩn chlorpyrifos (µl).

4.2.4.3 Kết quả

Bảng 4.6 K ết quả khảo sát độ lặ p lại của phương pháp

STT TR S/N Area Nồng

độ (ppb) di = |xi1-xi2|

1 3,71 608,4 1.558,369 7,49 1,04

2 3,72 648,3 1.748,052 8,53 0,273 3,72 774,2 1.699,721 8,26 0,71

4 3,71 931,6 1.828,252 8,97 0,585 3,72 706,3 1.933,859 9,55 1,09

6 3,71 648,8 1.736,38 8,46 0,097 3,72 631,5 1.751,587 8,55 0,22

8 3,71 485,1 1.711,851 8,33 0,059 3,72 660,9 1.721,047 8,38 0,44

10 3,71 584,7 1.801,751 8,82 1,91

Trung bình

8,534 0,582







Xử lý k ết quả thống kê

Nồng độ chuẩn chlorpyrifos trong mẫu: = 8,534±0,380; SD= 0,531;

RSD = 6,23% < 21%.

K ết luận

Độ lệch chuẩn tương đối RSD = 6,23% đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn

AOAC 2007.

Phương pháp có độ lặ p lại tốt.

4.2.5 Khảo sát độ thu hồi của phƣơng pháp


Theo tiêu chuẩn EC/657/2002 khảo sát độ thu hồi đối với dư lượ ng thuốc

tr ừ sâu tại các điểm 0,5; 1; 1,5 lần giá tr ị MRL. Giá tr ị MRL của chlorpyrifos

là 10 ppb.

Khảo sát độ thu hồi của chuẩn chlorpyrifos spike vào mẫu blank ở các

mức nồng độ 5 ppb, 10 ppb, 20 ppb.

Tính độ thu hồi ở từng nồng độ.4.2.5.2 Thực hiện

Cân 10 g mẫu nấm blank cho vào 10 ống nhựa 50ml, tiến hành spike

50 µl chuẩn chlorpyrifos 1ppm vào các mẫu đã cân. Nồng độ trong mẫu là

5 ppb.

Tiến hành tương tự cho các mẫu ở nồng độ 10 ppb, 20 ppb, vớ i thể tích

chuẩn chlorpyrifos spike vào mẫu lần lượ t là 100µl, 200µl.

Thực hiện quy trình phân tích và xác định độ thu hồi.

4.2.5.3 Kết quả

Công thức tính độ thu hồi như sau

H% =

Ctt là nồng độ đo đượ c từ máy

Cc là nồng độ chuẩn spike vào trong mẫu







Bảng 4.7 K ết quả độ thu hồi tại 5 ppb

STT TR Area Nồng độ

(ppb)

S/N H%

1 3,71 880,028 3,75 546,8 75

2 3,72 990,859 4,36 590,7 87,2

4 3,71 1083,521 4,87 632,7 97,4

5 3,71 1294,283 5,73 674,8 114,6

6 3,72 1029,013 4,57 612,5 91,4

8 3,71 963,605 4,21 578,9 84,2

10 3,71 1138,027 5,17 643,2 103,4

Nhận xét độ thu hồi tại 5 ppb Nồng độ: x = 4,666±0,606

Hiệu suất thu hồi H% = 93,3±12,12. Hiệu suất thu hồi thuộc

khoảng 75% 114,6 %. Hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu của AOAC

2007 (60% 115%), nhưng chưa đạt yêu cầu của EC/657/2002

(70% 110%).

Bảng 4.8 K ết quả độ thu hồi tại 10 ppb

STT TR Area Nồng độ(ppb) S/N H%

1 3,71 2057,762 10,73 776 107,3

2 3,72 1748,052 8,53 648,3 85,33 3,72 1699,721 8,26 774,2 82,6

4 3,71 1828,252 8,97 931,6 89,75 3,72 1933,859 9,55 706,3 95,5

6 3,71 1736,38 8,46 648,8 8467 3,72 1751,587 8,55 631,5 85,5

8 3,71 1711,851 8,33 485,1 83,39 3,72 1721,047 8,38 660,9 83,8

10 3,71 1801,751 8,82 584,7 88,2

Nhận xét độ thu hồi tại 10 ppb

Nồng độ: x = 8,858±0,545

Hiệu suất thu hồi H% = 88,58±5,45. Hiệu suất thu hồi thuộc

khoảng 82,6% 107,3%. Có độ thu hồi tốt đạt yêu cầu của tiêu

chuẩn Châu Âu EC/657/2002.







Bảng 4.9 Độ thu hồi tại nồng độ 20 ppb

SST TR Area Nồng độ

(ppb)S/N H%

1 3,72 3289,876 16,57 1431,3 82,852 3,71 3678,987 18,84 1618,3 94,2

3 3,71 4118,657 20,89 1679,5 104,45

4 3,71 4235,256 21,45 1684,3 107,255 3,71 4412,321 21,78 1692,6 108,9

6 3,71 3417,874 17,32 1521,4 86,6

Nhận xét độ thu hồi tại 20 ppb

Nồng độ: x = 19,475±2,333

Hiệu suất thu hồi H% = 97,4±11,66. Hiệu suất thu hồi thuộckhoảng 82,6% 108,9%. Có độ thu hồi tốt đạt yêu cầu của tiêu

chuẩn Châu Âu EC/657/2002.

4.3 K ẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU NẤM RƠM TRÊN ĐỊA

BÀN THÀNH PHỐ CẦN THƠ

4.3.1 Mục đích

Phân tích các mẫu nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ để đánh giátrình tr ạng nhiễm dư lượ ng thuốc tr ừ sâu chlorpyrifos, khuyến cáo, để bảo vệ

sức khỏe ngườ i tiêu dùng.

4.3.2 Tiến hành

Tiến hành thu mua mẫu tại các chợ trong địa bàn thành phố Cần Thơ.

Mã hóa code cho mẫu: từ NR01 cho đến NR21, 8725, 8726, 10282,

10283,10284,10265,10266,10301,10302.

Xử lý mẫu: Mẫu nấm thu mua sau khi mã hóa code đượ c xay nhuyễn, và

đem phân tích.







4.3.3 K ết quả

Bảng 4.10 K ết quả phân tích các mẫu nấm rơm tại các chợ trên địa bàn thành

phố Cần Thơ Mẫu C(ppb) Mẫu C(ppb) Mẫu C(ppb)

NR1 KPH NR11 4.330 NR21 KPH

NR2 KPH NR12 KPH 8725 7,7 NR3 KPH NR13 KPH 8726 7,2

NR4 10,93 NR14 KPH 10282 6,3

NR5 64,3 NR15 11,2 10283 9,19

NR6 KPH NR16 KPH 10284 KPH NR7 KPH NR17 KPH 10265 KPH

NR8 KPH NR18 12,4 10266 KPH

NR9 2.800 NR19 18,8 10301 KPH

NR10 KPH NR20 11,4 10302 KPH

Bảng 4.11 Tổng quát k ết quả phân tích mẫu nấm

Mẫu Phát hiện nhiễm CPR (ppb) Không pháthiện

Tổng số mẫu< 10 10 C< 50 ≥ 50

Nấmrơm 4 5 3 18 30

Số mẫu không phát hiện chlorpyrifos là 18 mẫu chiếm 60% tổng số mẫu

khảo sát. Số mẫu nhiễm vượ t tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5624-2 : 2009 (quy

định 50 ppb) là 3 mẫu chiếm 10% tổng số mẫu. Số mẫu phát hiện có nhiễm

chlorpyrifos là 12 mẫu chiếm 40%.

Nấm rơm có số lượ ng nhiễm dư lượ ng chlorpyrifos là khá nhiều, tuy ở

nồng độ thấ p, phần lớ n nằm trong giớ i hạn cho phép của TCVN, tuy nhiên

ngườ i tiêu dùng nên cẩn thận khi sử dụng nấm rơm như ngâm nướ c muối, luộcsơ qua nước sôi để loại bỏ phần lớn dư lượ ng thuốc tr ừ sâu trướ c khi chế biến

và sử dụng.

Vớ i 30 mẫu khảo sát, số lượ ng mẫu nhiễm chlorpyrifos trên 10 ppb là

8 mẫu, chiếm 27% chưa đạt tiêu chuẩn xuất khẩu vào các thị trườ ng Châu Âu,

Nhật, Hoa K ỳ quy định dư lượng chlorpyrifos không được vượ t quá 10 ppb

(EC/212/2013).







CHƢƠNG 5

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 K ẾT LUẬN

Quá trình khảo sát việc định lượ ng chlorpyrifos trong nấm rơm bằng

phương pháp Quechers UPLC/MS/MS, đề tài thu đượ c k ết quả sau:

Lựa chọn được phương pháp Quechers có tính đặc hiệu cao, phân tích

nhiều mẫu trong khoảng thờ i gian ngắn, an toàn, ít sử dụng dung môi.

Phương pháp phù hợ p vớ i hệ thống UPLC/MS/MS phòng thí nghiệm,

và có khả năng cải tiến, mở r ộng phân tích trên nhiều nền mẫu khácnhau như thủy sản, nướ c, nông sản.

Phương pháp có tính tuyến tính trong khoảng nồng độ 1ppb đến 100

ppb, có giớ i hạn phát hiện LOD thấp 0,744 ppb, độ lặ p lại và độ thu

hồi đều đạt tiêu chuẩn AOAC 2007 và EN/657/2002.

Phương pháp đượ c áp dụng phân tích một số mẫu nấm rơm trên địa

bàn thành phố Cần Thơ, 40% số mẫu nấm nhiễm dư lượ ng

chlorpyrifos ở nồng độ thấ p, chỉ có 10% số mẫu nấm rơm nhiễm dư

lượng chlorpyrifos vượ t tiêu chuẩn TCVN 5624-2:2009.

5.2 KIẾN NGHỊ

Vì thời gian và điều kiện phòng thí nghiệm có hạn nên đề tài chỉ khảo sát

dư lượ ng chlorpyrifos bằng sắc ký lỏng, nếu có điều kiện chúng tôi kiến nghị:

− Áp dụng k ỹ thuật Quechers cho hệ thống máy GC/MS/MS, k ết hợ p vớ i

k ỹ thuật headspace, HPLC/TOF… để phân tích mẫu nhanh chóng và giớ i hạn

phát hiện ở nồng độ nhỏ hơn.

− Khảo sát các điều kiện tối ưu của pH, tỷ lệ PSA và C18… để tăng hiệu

suất cho quá trình chiết và làm sạch nền mẫu trong k ỹ thuật Quechers.

− Áp dụng k ỹ thuật Quechers để phân tích thêm các loại thuốc tr ừ sâu

nhóm lân hữu cơ khác như diazinon, methidazinon,trichlofon,…

− Mở r ộng và cải tiến k ỹ thuật Quechers để phân tích một số nhóm

kháng sinh trên nhiều nền mẫu khác như thủy sản, nông sản, nướ c, thực

phẩm…







− Khảo sát thêm nhiều mẫu để đánh chính xác, khách quan tình tr ạng

nhiễm dư lượ ng thuốc tr ừ sâu trong nấm rơm trên địa bàn thành phố Cần Thơ,

từ đó có biện pháp khuyến cáo, bảo vệ sức khỏe ngườ i tiêu dùng.







TÀI LIỆU THAM KHẢO----------

1. Phùng Trí Dũng, Nguyễn Việt Hùng, Tr ần Thị Tuyết Hạnh. Nguy cơ sứckhỏe do phơi nhiễm chlorpyrifos trên đối tượ ng nông dân tr ồng lúa tại TháiBình, Việt Nam; Đánh giá nguy cơ sức khỏe bằng phương pháp xác xuất. Tạ pchí y tế dự phòng, tậ p XXIII, số 4, trang 140.

2. Nguyễn Duy Trình, Nguyễn Hữu Ngoan. Phân tích hiệu quả kinh tế ngànhhàng nấm tại vùng đồng bằng Sông Hồng.Tạ p chí khoa học và phát triển 2013,tậ p 11, số 4, trang 593-601.

3. Ilumtics Viet Nam. Báo cáo tóm tắt ngân hàng nấm Quảng Bình, dự án

quản lý bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên miền trung Việt Nam (SMRN-CV).

4. US Environmental Protection Agency (2007), What is a pesticide epa.gov.Retrieved on September 15, 2007.

5. TS. Nguyễn Thị Bích Thu, 12/2010. Nghiên cứu ứng dụng sắc ký khí ghépkhối phổ để phân tích dư lượ ng một số hóa chất bảo vệ thực vật thườ ng dùng.Báo cáo k ết quả nghiên cứu đề tài cấ p bộ số 8079, viện dượ c liệu, bộ y tế.

6. FAO/WHO Food standard CODEX alimentarius. Pesticide residue in foodand feed.

7. EFSA Journal 2012. Modification of the existing MRLs for chlorpyrifos invarious crops and in products of animal origin. European Food SafetyAuthority (EFSA), Parma, Italy.pp.12-13.79.

8. Tomlin, C. D. S. The Pesticide Manual, A World Compendium, 14th ed.;British Crop Protection Council: Alton, Hampshire, UK, 2006; p 186-187.

9. Kathy A. Brzak, Daniel W. Harms, Michael J. Bartels, and Richard J. Nolan ,1998. Determination of chlorpyrifos, chlorpyrifos oxon, and 3,5,6-trichloro-2-piridinol in rat and human blood. Journal of Analytical

Toxicology, Vol, 22, May/June 1998.pp.203-210.10. Satoshi Takatori, Masahiro Okihashi, Yoko Kitagawa, Naoki Fukui,YouKakimoto-Okamoto and Hirotaka Obana. Rapid and Easy MultiresidueMethod for Determination of Pesticide Residues in Foods Using Gas or LiquidChromatography – Tandem Mass Spectrometry. Osaka Prefectural Institute ofPublic Health Japan.pp.197-198.

11. Th. Nguyễn Thị Diệ p Chi (2008). Giáo trình thực tập hóa môi trường. ĐạiHọc Cần Thơ.

12. Sukesh Narayan Sinha, Ramavati Pal, Aruna Dewan, M.M. Mansuri, H.N.

Saiyed, 29 March 2006. Effect of dissociation energy on ion formation andsensitivity of ananalytical method for determination of chlorpyrifos in human






blood, using gas chromatography – mass spectrometer (GC – MS in MS/MS).Sciencedirect, International Journal of Mass Spectrometry 253 (2006) 48 – 57.

13. Anastassiades M, Lehotay SJ, et al.Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged

and Safe (QuEChERS) approach for the determination of pesticide residues2002.

14. Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D and Schenck FJ.Fast and easymultiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning anddispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in

produce 2003 JAOAC Int 86(2) 412-31.

15. Steven J. Lehotay , Michelangelo Anastassiades, Ronald E. Majors. The

quechers revolution. LCGC europe. Volume 23, issue 8, pp.446.

16. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lậ p hợ p chất hữu cơ. Đạihọc quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Trang 407-450.

17.Nguyễn Kim Phi Phụng, 2004. Khối Phổ. Đại học quốc gia thành phố Hồ

Chí Minh. Trang 13 – 51.

18.Ths.Nguyễn Thị Diệp Chi (2008), Các phương pháp phân tích hiện đại,Đại

học Cần Thơ.

19. EPA,July 31,2006. Reregistration Eligibility Decision for Chlorpyrifos.

EPA, Washington D.C.pp.3-20.20. Tr ần Cao Sơn, PGS.TS. Phạm Xuân Đà, TS. Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn

Thành Trung. Tháng 8, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học

và vi sinh vật. Nhà xuất bản khoa học và k ỹ thuật.Viện kiểm nghiệm an toàn

vệ sinh thực phẩm quốc gia.Trang 19-23,27,28,32-37,55-58.


Ứng dụng quechers khảo sát dư lượng chlorpyrifos trong nấm rơm trên địa bàn...

Documents