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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
Ciencias Biológicas y de la Salud
DISCRIMINACION DE ESPECIES DE PECES BLANCOS(ATHERINOPSIDAE: CHIROSTOMA) DEL LAGO DE
PATZCUARO, POR MEDIO DE CARACTERES MORFOLOGICOS,ALOENZIMATICOS Y RFLPs DEL GEN MITOCONDRIAL 16S
Licenciatura en Hidrobiología
MONICA YANELLI PEREZ RAMIREZ
Asesor:
Irene de los Angeles Barriga Sosa
México, 2003
DATOS PERSONALES
NOMBRE: Mónica Yanelli Pérez Ramírez
MATRICULA: 98332188
LICENCIATURA: Hidrobiología
DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud
UNIDAD: Iztapalapa
TRIMESTRE LECTIVO: 03 Otoño
TITULO DEL PROYECTO:
Aplicación de marcadores genéticos para discriminar especies de “pescado blanco” en el
Lago de Pátzcuaro.
TITULO DEL TRABAJO DE SERVICIO SOCIAL:
Discriminación de especies de peces blancos (Atherinopsidae: Chirostoma) del Lago de
Pátzcuaro, por medio de caracteres morfológicos, aloenzimáticos y RFLP’s del gen
mitocondrial 16S.
NOMBRE DEL ASESOR: Dra. Irene de los Angeles Barriga Sosa
LUGAR DE REALIZACION: Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la Planta
Experimetal de Producción Acuícola, UAMI.
CLAVE DE REGISTRO: H. 015. 02
Discriminación de especies de peces blancos (Atherinopsidae:Chirostoma)del Lago de Pátzcuaro, por medio de caracteres morfológicos,
aloenzimáticos y de RFLP s del gen mitocondrial 16S.
JUSTIFICACION
El pez blanco (Chirostoma estor, Chirostoma promelas, Chirostoma lucius, Chirostoma
sphyraena y su posible ancestro Chirostoma humboldtianum) constituye un recurso de gran
importancia cultural, alimentaria y económica para diversos grupos étnicos de la Mesa
Central de México. Estos peces se distribuyen en los lagos de Pátzcuaro y Chapala
principalmente, considerándose como una de las pesquerías más antiguas y de mayor
tradición en nuestro país.
Actualmente, en el lago de Pátzcuaro, las especies C. estor y C. humboldtianum se
encuentran bajo sobreexplotación y problemas de deterioro ambiental producto de la
actividad humana, lo cual aunado a la introducción de especies (C. lucius principalmente)
ha provocado la hibridación natural por un lado y por el otro, la disminución de las
poblaciones de especies locales.
Pero quizá el mayor problema está representado en la discriminación de especies,
necesaria para formular o emprender cualquier trabajo de manejo o conservación por
ejemplo, cultivos con fines de repoblamiento. La discriminación de especies por métodos
taxonómicos tradicionales resulta problemática debido a la gran similitud de caracteres
morfométricos y merísticos entre especies o bien a la combinación de caracteres de
diferentes especies en un solo organismo (híbrido). Por lo anterior, en los últimos años, en
la Planta Experimental de Producción Acuícola se han venido utilizando técnicas
moleculares (aloenzimas, restricción enzimática de genes mitocondriales amplificados vía
PCR y secuenciación) que permiten establecer métodos más confiables para la
discriminación de especies.
El presente trabajo es parte de un Convenio establecido con el INP (SAGARPA) y
pretende utilizar patrones de restricción enzimática (haplotipos) y aloenzimas para la
discriminación de especies de peces blancos (C. estor y C. lucius) del Lago de Pátzcuaro,
además de contribuir a la formación de la base de datos morfométricos y merísticos del
género y determinar si existen diferencias en las muestras analizadas.
INTRODUCCION
El género Chirostoma es uno de los elementos ictiofaunísticos representativos del Altiplano
Mexicano, de acuerdo con Barbour (1973 a) está formado por 18 especies y 6 subespecies
cuyo origen difilético se remonta al Terciario, con un antecesor parecido a Menidia el cuál
penetró a territorio mexicano por el portal del Balsas y debido a la intensa actividad
volcánica y geológica, así como a los cambios en el patrón de drenaje, quedó aislado
iniciando su divergencia con una amplia distribución, la cual, actualmente es característica
de la cuenca Lerma-Santiago con las especies del grupo Jordani. Quizá a finales del
Mioceno, una forma semejante a Melaniris invadió los sistemas dulceacuícolas,
restringiendo su distribución para evitar la competencia dando origen al grupo Arge.
Los datos morfológicos y genéticos (Barbour y Chernoff, 1984; Echelle y Echelle,
1984) apoyan la hipótesis de un ensamble monofilético en el grupo Jordani compuesto por
siete especies y un ancestro común posiblemente del tipo humboldtianum. Dentro de este
grupo, los peces blancos (Chirostoma estor, C. promelas, C. lucius, C. sphyraena y C.
humboldtianum) constituyen un recurso de gran importancia alimentaria, cultural y
económica para diversas etnias de la Mesa Central del país, considerándose como una de
las pesquerías más antiguas y de mayor tradición. (Soria-Barreto et al., 1998; Maya et al.,
2000).
En el Lago de Pátzcuaro, se presenta la segunda mayor abundancia de especies del
género (después de Chapala), aunque en épocas anteriores se introdujeron especies de otros
embalses, principalmente C. lucius (Alaye Rahy, 1993 b), lo cual aunado al deterioro
ambiental producto de la actividad humana y la sobreexplotación de C. estor y C.
humboldtianum ha provocado la hibridación natural, la disminución de las poblaciones de
especies locales y la posible subdivisión de poblaciones de C. grandocule (Barriga-Sosa et
al. 2002).
ANTECEDENTES
En 1984, Echelle y Echelle analizan la distribución y situación taxonómica de 15 de las 18
especies del género Chirostoma, así como dos especies de Poblana y dos especies de
Menidia, concluyendo por medio de la caracterización de la variabilidad aloenzimática que
Poblana y Chirostoma comparten con Menidia un ancestro no compartido con otros
aterinópsidos y que el proceso de especiación de estos géneros ocurrió de manera rápida
una vez que el ancestro Menidia invadió la Mesa Central de México, esta hipótesis también
es apoyada por Barbour (1973 b).
Alaye-Rahy (1996 a) realiza estudios del polimorfismo de la hemoglobina para
identificar especies de Chirostoma en el Lago de Pátzcuaro, considerando que la expresión
de las proteínas permanece constante a lo largo de todo el ciclo de vida. Por medio de
electroforesis en gel de poliacrilamida, se identifica a C. estor, C. humboldtianum, C. lucius
y C. grandocule, al encontrarse diferencias cuantitativas (intensidades en las bandas)
dependientes de la concentración de oligomonómeros en la molécula de hemoglobina. En
un trabajo posterior (1996 b), se reporta la existencia de híbridos entre la especie
introducida C. lucius y la nativa C. estor además de otros híbridos cuyas formas parentales
son difíciles de determinar. Estos resultados derivan en una hibridación del 19.6% un valor
muy alto reportado en ambientes naturales. Por otra parte, se desconoce si los híbridos
interespecíficos pueden conducir a una gametogénesis normal y descendencia viable. El
factor que posiblemente influye en la formación de híbridos, es la alteración ecológica que
sufre el Lago de Pátzcuaro (ChacónTorres et al., 1991; Chacón Torres, 1993).
Empleando la técnica de los marcadores RAPD (Random Amplified Pylomorphic
DNA Markers, por sus siglas en inglés), Coyote (2000) analiza las relaciones taxonómicas
entre Poblana y Chirostoma, puntualizando que a nivel intergenérico el 0.87% de los
marcadores RAPD son exclusivos para ambos géneros y, debido al traslape es necesaria
una revisión taxonómica para determinar su estado real.
Barriga-Sosa (2001) analiza morfológica y molecularmente a diferentes poblaciones
de 13 especies del género Chirostoma, proponiendo nuevos intervalos para variables
merísticas útiles para la identificación, determinando la variabilidad genética por medio de
aloenzimas y además, secuenciando el gen mitocondrial 16S de las especies de peces
blancos.
Por medio de análisis de la variación morfológica y génetica de las especies del
grupo humboldtianum, Barriga-Sosa et al. (2002), determinan que los valores de
variabilidad genética de algunas especies presentan cambios con relación a datos previos,
por lo que concluyen que dicha variación puede ser resultado del constante proceso
evolutivo. Chirostoma grandocule es objeto de un análisis morfológico y aloenzimático
(Barriga-Sosa et al. en revisión) intra-lacustrino (Lago de Pátzcuaro) en tres diferentes
años. Se observaron diferencias genéticas entre sitios y años, relacionadas con factores
biológicos, ecológicos y ambientales propios de cada localidad. Los datos obtenidos
permiten sugerir a los autores que esta especie se encuentra en un proceso de diferenciación
poblacional.
OBJETIVOS
General
Discriminar especies de peces blancos provenientes del Lago de Pátzcuaro, Michoacán a
nivel molecular, por medio de aloenzimas y restricción enzimática del gen mitocondrial
16S.
Específicos
* Identificar morfológicamente a la (s) especie (s).
* Determinar el grado de variabilidad morfométrica y merística de la muestra a analizar.
* Determinar el grado de variabilidad aloenzimática y el grado de variabilidad genética por
medio de análisis de restricción enzimática del gen mitocondrial 16s.
METODOLOGIA
Colecta de muestras – Se colectaron 50 organismos (provenientes de huevos no
identificados) del Lago de Pátzcuaro, los cuales fueron mantenidos en el Instituto de
Investigaciones de Recursos Naturales (INIRENA) de la Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo. Se transportaron en hielo seco al laboratorio de Genética y Biología
Molecular de la PEXPA, en la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa. Dichos
organismos componen dos muestras diferentes, la primera con un intervalo de talla de los
79 a los 102 mm (n= 15) y considerados como progenitores. La segunda muestra,
considerada como F1 con tallas de 40.5 a 54.9 mm (n= 35) (Fig. 1).
Figura 1. Representantes de ambas muestras (P= progenitores)
Análisis Morfométrico (M) y Merístico (m) e identificación de la especie – Se
emplean 27 variables (Fig. 2) para la identificación morfológica de acuerdo a Barbour
(1973 b) y Barriga-Sosa (2001).
F1
P
Las 19 variables morfométricas utilizadas son: 1) longitud total (LT); 2) longitud
patrón (LS); 3) longitud de la cabeza (LC); 4) diámetro orbital (Dor); 5) longitud del hocico
(LH); 6) longitud mandíbula inferior (LMi); 7) longitud postorbital de la cabeza (LPoC); 8)
longitud del pedúnculo caudal (LpC); 9) base de la aleta anal (BaA); 10) distancia del
hocico a la primera dorsal (DH1D); 11) distancia del hocico a l segunda dorsal (DH2D);
12) distancia del hocico a la aleta pélvica (DHP); 13) base de la aleta pélvica (BaP); 14)
altura máxima (Amax); 15) altura mínima (Amin); 16) altura aleta anal (AaA); 17) altura
aleta pectoral (AaP); 18) altura primera dorsal (A1D) y 19) altura segunda dorsal (A2D)
(Barriga-Sosa et al., 2002). Los organismos se miden del lado izquierdo con ayuda de un
vernier y un ictiometro.
Figura 2. Variables morfométricas y merísticas registradas en las muestras de
Chirostoma (Tomada de Barriga-Sosa, 2001).
Las ocho variables merísticas (m) son: 1) el número de escamas de la línea lateral
(ELL); 2) escamas predorsales (EpD); 3) escamas interdorsales (EiD); 4) radios de la aleta
pectoral (RaP); 5) espinas de la primera dorsal (E1D); 6) espinas de la segunda dorsal
(E2D); 7) radios de la aleta anal (RaA) y 8) número de branquiespinas (B). Las escamas se
tiñen con verde de malaquita y su cuantificación se realiza bajo el microscopio.
Análisis Univariado -- De los caracteres analizados se obtuvieron: máxima, mínima,
media y coeficiente de variación (DS/media*100), mediante el uso del programa EXCEL
versión 7.0. Se realizó una comparación de los resultados del presente estudio con los
citados por Barbour (1973 b), Alaye-Rahy (1996 a) y Barriga-Sosa (2001).
Análisis Multivariado --- Las variables merísticas y morfométricas se analizan por
separado. Los datos morfométricos son transformados (Cuadras, 1991) de acuerdo a dos
criterios: a) proporciones de las variables con relación a una de ellas (en este caso, longitud
estándar), con la finalidad de eliminar las diferencias de talla y b) transformación
logarítmica de cada una de las medidas para linealizar la información (Ibañez y Lleonart,
1996). De los análisis multivariantes exploratorios que se pueden realizar, se escogieron: i)
Análisis de Componentes Principales (PCA) y ii) Análisis Discriminante (DA), por medio
del programa STARGRAPHICS Plus para Windows versión 2.1.
Extracción del tADN. -- Empleando el Dneasy Tissue Kit (Quiagen R) con las
siguientes modificaciones, se toman 25 mg de tejido branquial del pez, macerándose en un
microtubo de 1.5 mL, adicionando 180 µL de amortiguador de lisis (ATL) y 20 µL de
Proteinasa K para degradar proteínas e incubando a 55 °C de 40 a 60 minutos. Después de
la incubación, se añaden 200 µL de amortiguador AL, el cual remueve los restos de tejido
contenidos en la muestra, se mezcla nuevamente e incuba por 10 minutos a 70°C. Al
terminar éste periodo, se agregan 200 µL de etanol (100%) para hacer que el ADN
precipite, obteniéndose una mezcla homogénea, la cual se deposita en una minicolumna
DNeasy R y se centrifuga a 8000 rpm por 2 minutos. El sobrenadante de cada una de las
muestras es decantado. Se adicionan 500 µL de amortiguador AW1 para centrifugar a 8000
rpm por 2 minutos y nuevamente se decanta el sobrenandante. El uso de ambos
amortiguadores permite eliminar impurezas del ADN. Posteriormente, se adicionan 500 µL
de amortiguador AW2 centrifugando a 12 000 rpm por 3 minutos, con la finalidad de
eliminar residuos de etanol. Por último, todas las minicolumnas se colocan en un microtubo
limpio de 1.5 mL y se añaden directamente 150 µL de amortiguador AE para hidratar el
ADN, se incuba por 15 minutos a temperatura ambiente para después centrifugar a 8000
rpm por 2 minutos, obteniéndose la elución A, nuevamente la microcolumna se coloca en
un microtubo limpio y previamente etiquetado de 1.5 mL, se adicionan 100 µL de
amortiguador AE para incubar 10 minutos a temperatura ambiente, las muestras se
centrifugan durante 2 minutos a 8000 rpm para obtener la elución B. Se mantienen a 4 °C
una vez terminado el procedimiento (Barriga-Sosa, 2001).
Determinación de la concentración de ácidos nucleicos -- El tADN de las
diferentes muestras se cuantifica por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0.7%,
utilizando como amortiguador TAE (Tris-acetato 10mM y EDTA mM)(1x). Se emplea el
marcador molecular 100bp λDNAR (50UG) como referencia para determinar el peso
molecular de la muestra por interpolación. Los geles se someten a 60 voltios (v) por 45
minutos, para después teñirlos con Bromuro de Etidio (EtBr, 10mg/L).
Las bandas se observan al exponer los geles a la luz ultravioleta (320 nm), siendo la
intensidad de la banda proporcional a la cantidad y calidad del ADN total (Alaye Rahy,
1996 a). Los geles son fotografiados.
Amplificación del gen mitocondrial 16S ADN (Polymerase Chain Reaction) --
Empleando el Taq PCR Core Kit (Quiagen R), se prepara una mezcla conteniendo: 2.5 µL
de amortiguador 10xQIAGEN, 0.5 µL (25mM) de MgCl2 (cofactor), 0.5 µL (200 µM)
mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0.5 µL (0.5 µM)
cebador 16Sar (5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’) y 0.5 µL (0.5 µM) cebador
16Sbr (5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’), 0.125 µL de la enzima Taq DNA
polimerasa (0.65 unidades) y un volumen variable de agua destilada. Los cebadores
empleados son los universales (gen 16S) (Kocher et al., 1989). Todo se mezcla en un
microtubo eppendorf (0.6 mL) para PCR, adicionando posteriormente la muestra de DNA
(∼1 µg /reacción). El volumen final de la mezcla de reacción es de 25 µL por tubo (Palumbi
et al., 1991).
Las amplificaciones se realizan en el termociclador BiometraR con el siguiente
programa: un ciclo de inicio que comprende la desnaturalización por 1 minuto 30 segundos
a 96 °C (separación doble cadena DNA), un minuto a 36 °C de fase de anillamiento
(reconocimiento del cebador) y la elongación por 1 minuto 30 segundos a 72 °C; 30 ciclos
con las mismas condiciones de temperatura pero por 30, 45 y 30 segundos respectivamente.
El ciclo final es de 10 minutos a 72 °C como fase de extensión (Barriga-Sosa, 2001). Al
terminar, las muestras se almacenan a 4 °C.
Cuantificación de productos amplificados -- Los productos amplificados se
observan mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, utilizando como
amortiguador TAE (1x) y el marcador de peso molecular de referencia 100 bp λDNAR
(50UG). Los geles son sometidos a 60 v por una hora para después teñirse con Bromuro de
etidio (10mg/L) en ausencia de luz.
Las bandas o productos de amplificación se observan al exponer los geles a la luz
ultravioleta (320 nm). Posteriormente, son fotografiados. El peso molecular de cada uno de
los productos se determina por interpolación a partir de la curva teórica construida con los
pesos moleculares de los diferentes segmentos desplegados por el marcador 100 bp
λDNAR.
Purificación del DNA -- Utilizando el QIA quick (QuiagenR) para purificar
fragmentos de 100 bp a 10 Kb, se calcula el volumen de reacción obtenido vía PCR, para
adicionar a cada muestra 5 volúmenes del amortiguador PB por 1 volumen de reacción
PCR y se mezcla. Cada una de las muestras se coloca en una columna QIA quick para
centrifugarse por 1 minuto a 13 000 rpm, lo cual permite extraer las impurezas del DNA
(restos de nucleótidos, MgCl2) que puedan inhibir la actividad enzimática. El sobrenadante
obtenido es descartado. En seguida, se adicionan 600 µL de amortiguador PE a las
columnas para centrifugar por 1 minuto a 13 000 rpm , el sobrenadante se decanta. Las
columnas se colocan en un microtubo limpio de 1.5 mL, para adicionar 30 µL de
amortiguador EB incubando a temperatura ambiente por 10 minutos, las muestras se
centrifugan por un minuto a 13 000 rpm y terminando pueden almacenarse a 4°C (Barriga-
Sosa, 2001).
Cuantificación de productos purificados – Los productos purificados son sometidos
a electroforesis en gel de agarosa, bajo las condiciones antes mencionadas, se tiñen con
Bromuro de etidio (10mg/L) y se exponen a una longitud de onda de 320 nm. La
concentración (ng) de los productos purificados se determina con base en el marcador
molecular de referencia 100 pb λDNAR de manera cualitativa.
Restricción enzimática – Se utilizó el programa NEB cutter R
(http://rebase.neb.com/rebase/) que permite simular el número y tamaño de fragmentos
esperados con una enzima de restricción determinada para secuencias del gen mitocondrial
r16S (Barriga-Sosa, 2001) de las tres especies de peces blancos reportadas en Pátzcuaro
(Chirostoma lucius, C. estor y C. humboldtianum) y determinar las enzimas que permitan
discriminar a las especies. Las enzimas son que presentan patrones de bandeo diferentes
son: Taq I Thermus aquaticus (5’-T’CGA-3’), HpyCH4 IV Heliobacter pylori CH4 (5’-
A’CGT-3’), Eag I Enterobacter agglomerans (5’-C’GGCCG-3’) y Bbv I Bacillus brevis
(5’-GCAGC(N)8’-3’) (Barriga-Sosa et al. , en prep.) (Tabla 1).
Las digestiones se llevan a cabo en un microtubo de 0.6 mL en el cual se coloca 1
µg del purificado 16S ADN (≈ 610 pb), 2 a 5 unidades de enzima, 2.5 µL de amortiguador
(Tris, cofactor y pH dependiendo de la enzima) y se afora a 25 µL con agua destilada,
dejándose incubar a 37°C por 17 horas. La reacción es detenida a temperatura de 4°C
(Dowling et al., 1990).
Tabla 1. Fragmentos y tamaños esperados de acuerdo al NEBcutterR para la secuencia del
gen 16S
Enzima C. humboldtianum C. estor C. lucius
Taq I 463 483 461
83 83 84
21 21
HpyCH4 IV 556 NSR 553
13 13
Eag I 531 NSR NSR
38
Bbv I 524 524 483
43 42 83
NSR = No se encontró Sitio de Restricción.
Cuantificación de fragmentos de restricción – Por medio de electroforesis en gel de
agarosa al 2%, se colocan de 10 µL de la restricción y 1.5 µL del amortiguador de carga
para restricción, se emplea un marcador molecular de referencia 20pb λDNAR (2.5 µL).
Las diferencias en el patrón de bandeo (numero y/o tamaño de fragmentos) entre individuos
se asumen como diferencias genéticas, las cuales permiten discriminar a la (s) especie(s)
(Gusmao y Solé-Cava, 2002).
Análisis de resultados -- Se construye una base de datos haplotípica (no. de
organismo/haplotipo) con sus respectivas frecuencias para cada una de las cuatro enzimas
de restricción empleadas.
En caso de encontrar variabilidad en las muestras, se emplea el programa REAP
(McElroy et al., 1992) para analizar los haplotipos encontrados, estimando cuantos eventos
mutacionales pudieron haber ocurrido. La premisa es que a mayor número de haplotipos,
mayor diversidad nucleotidica (producto de transiciones y trasversiones), por lo tanto
mayor variabilidad entre las muestras. Se realiza un análisis de distancias genéticas (Nei y
Kumar, 2000).
Aloenzimas - Se toma 0.1-0.2 g de tejido (músculo y ojo) se macera y homogeniza
con los amortiguadores Tris-EDTA y/o NADP (0.5 mL) para centrifugar a 12 000 rpm por
2 minutos, se almacenan posteriormente a -20° C. Los extractos de tejido se colocan en
acetatos de nitrocelulosa y se someten a electroforesis por un período de 20 minutos a 130-
280 volts. Los amortiguadores de electroforesis son Tris-glicina (pH= 8.5) y ácido cítrico
morfolina (pH=7.0). La selección de los dos sistemas enzimáticos se basa en Barriga-Sosa
et al. (2002) y Barriga-Sosa (2003), y son: glucosa-6-fosfato isomerasa (Gpi, EC5.3.1.9) y
L-lactato deshidrogenasa (Ldh, EC1.1.1.27), los cuales permiten discriminar a las especies
mencionadas. Las tinciones histoquímicas se realizan de acuerdo a Hebert y Beaton
(1989), modificadas por Barriga-Sosa et al. (en prensa).
Análisis de resultados aloenzimáticos – Primeramente, se discriminan las especies
de peces blancos (C. humboldtianum, C. estor, C. lucius) de acuerdo con los alelos
presentados. En caso de encontrarse variabilidad, se estima la proporción de loci
polimorficos (empleando los criterios P.95 y P.99), la heterocigosidad (He) para cada
muestra (GENEPOP 3.1, Raymond y Rousset, 1995) y se determina el equilibrio de Hardy-
Weinberg (H-W), también se aplica la prueba P de Fisher para determinar las diferencias
significativas entre las frecuencias alélicas entre especies o muestras (TFPGA 1.3, Miller,
1998).
ACTIVIDADES REALIZADAS
Con base en los objetivos del proyecto, se llevo a cabo:
a) La medición, registro e identificación de los 50 organismos, creando bases de datos para
cada una de las muestras.
b) La extracción (tADN), amplificación y purificación (16S) de los 50 organismos con la
metodología descrita.
c) La presentación de resultados obtenidos hasta ese momento en forma de seminario,
impartido en la PEXPA el 26 de Febrero de 2003.
d) El uso del programa NEBcutter para la nueva selección de enzimas de restricción así
como un total de 174 restricciones enzimáticas, discriminando a la especie.
e) La discriminación de especies empleando aloenzimas (Gpi y Ldh).
f) La compilación y análisis de los resultados moleculares, efectuando la discriminación de
especies y la elaboración del Informe Final de Servicio Social.
Aunadas a estas actividades, se encuentran una constante revisión bibliográfica, el
desarrollo de una bitácora de laboratorio y la asistencia a conferencias y seminarios
relacionados con el tema.
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS
Objetivo General
Discriminación de especies de peces blancos provenientes del Lago de Pátzcuaro,
Michoacán a nivel molecular, por medio de aloenzimas y restricción enzimática del gen
mitocondrial 16S.
Objetivos Específicos
* Identificación morfológica de la especie.
* Determinación del grado de variabilidad morfométrica y merística de las muestras
analizadas.
* Discriminación de la especie por medio de patrones de restricción enzimática.
* Discriminación de la especie por medio de loci aloenzimáticos.
Metas
* Manejo de las técnicas moleculares.
* Desarrollo escalonado del proyecto y cumplimiento de los objetivos.
* Superación y remediación de pequeños inconvenientes presentados en el transcurso del
mismo.
* Desarrollo de habilidades
RESULTADOS Y DISCUSION
Análisis Morfométrico (M) y Merístico (m) e Identificación de la (s) especie (s).
De acuerdo a las claves de Barbour (1973 a), los organismos de ambas muestras
fueron identificados como Chirostoma humboldtianum. Para discriminar a la especie, se
emplea la variable morfométrica distancia del hocico a la aleta pélvica expresada en
porcentaje de longitud estándar y las merísticas: número de escamas de la línea lateral,
número de escamas predorsales, número de radios anales y número de branquiespinas.
Por lo que respecta al número de escamas interdorsales, éste no se ajusta al
reportado en las claves de Barbour (1973 a). Barriga-Sosa (2001), al analizar diferentes
poblaciones de C. humboldtianum y 12 especies más, amplia el intervalo para dicha
variable, siendo compatible con los datos obtenidos en el presente trabajo. Así mismo, se
comparan los intervalos de las variables morfológicas útiles para la discriminación de C.
humboldtianum, propuestos por tres autores (Tabla 2).
En la tabla 3 se presentan los promedios y las medidas de dispersión (análisis
univariado) de las 19 variables morfométricas y las ocho merísticas para ambas muestras.
Cabe mencionar que las claves utilizadas (Barbour, 1973 a) son aplicables a organismos
mayores de 200 mm de LS, por lo que su utilidad para nuestras muestras es limitada,
debido a ello, los resultados de este trabajo pueden considerarse como una base de datos de
referencia para futuros estudios.
Tabla 2. Intervalos y medias para 4 variables merísticas y 2 morfométricas (%LS) para C.
humboldtianum.
VariableBarbour, 1973 a
(n ’=515)
Alaye-Rahy,
1996 a (n =2)
Barriga-Sosa,
2001 (n =89)
Este trabajo
2003 (n1=15 y
n2*=35)
Esc. línea lateral 47-73 (60) 63-72 (68.3) 42-78 (63.2) 58-72 (66)57-71(64)*
Esc. predorsales 24-50 (ND) 38-58 (48.6) 25-75 (47.13) 28-38 (33)23-39 (31)*
E. interdorsales 4-12 (ND) 12-14 (12.6) 7-17 (10.9) 12-20 (17)11-17 (14)*
Branquiespinas 19-28 (23) 23-26 (24.6) 19-32 (24.3) 17-23 (20) 17-22 (19)*
Dist. H. pélvica 40.9-51.2 (44.0) 44.4-47.0 (45.7) 38.7-49 (43.7) 43.8-48.3 (46.04)35.6-45(41.08)*
Dist. H. 2ª dorsal ND 66.3-67.7 (67.2) ND 65.6-71.2 (67.16)60.8-71.4 (66.0)*
n = no. muestra; n ’= no. muestra promedio; n1 = 1ra. Muestra; n2*= 2da. Muestra; ND= no
disponible.
Tabla 3. Intervalos, medias (en paréntesis) y coeficiente de variación (en cursiva) de
caracteres morfométricos (%LS) y merísticos.
C.MORFOMETRICO 1a Muestra n1= 15 2a Muestra n2= 35
Long. Cefálica (LC)26.38-32.47 (28.09)
6.63
22.38-26.98 (24.64)
5.43
Diam. ojo (Dor)7.0-8.66 (7.67)
6.69
4.90-10.36 (7.89)
6.83
Long. hocico (LH)4.16-7.16 (5.54)
13.42
6.39-8.93 (7.56)
8.05
Long. mandibular (Lmi)9.15-12.05 (10.43)
7.73
5.82-10.4 (8.49)
12.30
Long. postorbital (LPoc)11.0-13.13 (12.04)
9.20
8.60-14.07 (10.4)
10.71
Long. P. caudal (LpC)15.87-21.19 (18.58)
8.67
14.66-30.86 (20.78)
10.47
Base aleta anal (BaA)19.61-23.24 (21.96)
4.25
17.60-25.52 (22.31)
8.75
Dist.hocico 1 dorsal (DH1D)52.05-57.93 (54.34)
3.10
46.23-56.27 (50.53)
4.38
Dist.hocico 2 dorsal (DH2D)63.6-71.19 (67.17)
2.56
60.87-71.47 (66.09)
3.48
Dist. hocico pélvica (DHP)43.76-48.31 (46.17)
2.81
35.57-44.67 (41.03)
5.50
Base aleta pélvica (BaP)3.61-5.37 (4.34)
12.62
1.09-5.03 (3.23)
14.58
Altura máxima (Amax)16.49-21.15 (18.39)
5.91
14.81-18.78 (16.47)
7.43
Altura mínima (Amin) 5.84-8.59 (7.2) 5.77-9.8 (7.53)
8.79 10.63
Altura aleta anal (AaA)12.47-18.67 (15.07)
11.55
13.04-19.04 (15.88)
8.74
Altura aleta pectoral (AaP)9.10-17.76 (15.96)
12.86
12.99-19.57 (17.33)
9.05
Altura 1 dorsal (A1D)7.53-10.30 (9.04)
11.34
6.93-10.83 (8.96)
11.69
Altura 2 dorsal (A2D)5.49-15.87 (12.96)
20.02
10.86-18.73 (15.74)
11.34
C. MERISTICO 1a Muestra n= 15 2a Muestra n= 35
Esc. línea lateral (ELL)58-72 (66)
6.23
57-71 (64)
5.74
Esc. predorsales (EPD)28-38 (33)
9.89
23-39 (31)
12.32
Esc. interdorsales (EID)12-20 (17)
12.00
11-17 (14)
13.93
No. radios pectorales (RP)10-14 (12)
9.52
11-14 (13)
8.29
No. radios 1 dorsal (R1D)3-7 (4)
16.80
5-7 (6)
12.99
No. radios 2 dorsal (R2D)10-13 (11)
8.64
10-14 (13)
12.68
No. radios anales (RaA)15-20 (18)
6.76
20-23 (21)
8.20
Branquiespinas (B)17-23 (20)
10.34
17-22 (19)
7.69
Por otra parte, empleando el análisis multivariante, se encontró que no hay
diferencias significativas en las variables morfológicas capaces de separar a ambas
muestras (n = 15 y n =35); la única separación está dada por la talla (LS).
Extracción de tADN y cuantificación.
Las extracciones de tADN realizadas con el DNeasy Tissue KitR presentaron buenos
resultados y una ventaja sobre el método tradicional fenol-cloroformo empleado por
diversos autores (Bartlett y Davidson, 1991; Grijalva Chon et al., 1994; Ruiz-Rejón et al.,
2000; Solé-Cava y Gusmao, 2002), ya que permite obtener un tADN libre de trazas o
impurezas orgánicas las cuales pueden impedir el proceso de amplificación vía PCR. De
este modo, se obtuvo tADN branquial de alto peso molecular y buena calidad en 13 de los
15 organismos de la primera muestra (n =15) (Fig. 3), los dos individuoss que no
funcionaron con branquia se repitieron empleando tejido muscular y el mismo protocolo,
con buenos resultados en ambas diluciones (A y B). Las extracciones de tADN de la
segunda muestra (n= 35) también presentan alto peso molecular y buena calidad, aunque se
observa actividad de RNAsa (Fig. 4) debida posiblemente a un mal manejo de los
organismos durante su congelación.
Figuras 3 y 4. Extracción de tADN de tejido branquial.
Amplificación del gen mitocondrial 16S vía PCR y cuantificación de productos.
La amplificación del gen mitocondrial 16S se llevó a cabo con una temperatura de
anillamiento de 36°C en 49 muestras, la restante funcionó a 50.5°C. Los principales
cambios practicados a la técnica de PCR fueron los volúmenes de tADN empleados para
cada reacción, en ocasiones se utilizaron 1, 2 ó 3 µL de acuerdo a la concentración de
tADN de cada muestra.
El tamaño del fragmento amplificado coincide con el esperado para la especie C.
humboldtianum (Barriga-Sosa, 2001), siendo de aproximadamente 620 pares de pb (Fig. 5)
en todos los organismos por lo que de entrada, se puede suponer que las dos muestras
pertenecen a la misma población y/o especie (Mora-Souza, 1998; Torres-Frías, 1998).
Fig. 5. Gen mt 16S amplificado vía PCR (∼620 pb).
Purificación de productos amplificados y cuantificación.
La purificación de productos amplificados permite la eliminación de impurezas
(restos de dNTP’s principalmente) indispensable para llevar a cabo las restricciones
enzimáticas debido a la sensibilidad de las diferentes enzimas (Dowling et al., 1990). Por
otro lado, es posible cuantificar la concentración y el tamaño del fragmento amplificado y,
de manera cualitativa determinar su calidad. En las figuras 6 y 7 se muestra el gen
mitocondrial 16s ya purifcado para algunos organismos, estos productos muestran bandas
limpias y libres de RNAsa con tamaños de aproximadamente 620 pb y diferentes
concentraciones.
Figuras 6 y 7. Purificación del gen mt 16S.
Algo que es importante mencionar, es que la concentración del fragmento
amplificado (gen mt 16S) varia entre los organismos, se determina en relación con el
marcador molecular de peso conocido (100pb λDNAR) y se expresa en ng/µL
Restricción Enzimática.
Discriminación de especies
De las enzimas utilizadas para la discriminación de las especies, los patrones
generados por Taq I, HpyCH4 IV y Bbv I son los esperados para la especie C.
humboldtianum (Tabla 4, Figura 8), sin embargo, cabe señalar que el patrón esperado para
la enzima Eag I no se observó en ninguno de los organismos analizados. La incertidumbre
en la información que proporciona ésta enzima será resuelta por medio de la utilización de
otro marcador molecular y otras enzimas de restricción que permitirán elucidar sí éste es un
efecto determinado por variabilidad genética dentro de la especie.
Tabla 4. Patrones de restricción del gen mitocondrial 16S.
Taq I HpyCH4 IV Eag I Bbv I
A B A A A
500 620 570 620 560
90 50 60
30
Cabe resaltar que el uso del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP’s) es una técnica potencial para efectuar la discriminación de especies
sometidas a presión pesquera (Bartlett y Davidson, 1991), la cual ofrece resultados hasta
con un 98.5% de confiabilidad empleando dos enzimas de restricción (Gusmao y Solé-
Cava, 2002).
Variabilidad genética determinada por RFLP s
El análisis de RFLP’s de genes mitocondriales amplificados es una herramienta de
utilidad para determinar la variabilidad genética de poblaciones o especies (Grijalva-Chon
et al., 2002). En el presente trabajo, las cuatro enzimas empleadas presentaron un solo
haplotipo (A) a excepción de la Taq I (Tabla 4) que también presenta el haplotipo B (en un
individuo) y puesto que, la variabilidad genética está dada por el número de haplotipos
(Grijalva-Chon et al., 1994); la variabilidad para ambas muestras es nula, por esta razón
los resultados no se analizaron en el programa REAP.
a) b)
c) d)
Figura 8. Patrones de restricción enzimática observados en geles de agarosa 2%: a) Taq I;
b) HpyCH4 IV; c) Bbv I y d) Eag I.
Lo anterior, permite sugerir una homogeneidad genética en la especie C.
humboldtianum del Lago de Pátzcuaro (mantenidos en el INIRENA), aunque es necesario
robustecer el estudio genético poblacional, ya sea aumentando el número de enzimas de
restricción o bien empleando una región mitocondrial altamente variable como la control
(D-loop) (Faber y Stepien, 1997).
Aloenzimas
Discriminación de especies.
Este marcador molecular permitió discriminar a la especie, debido a la resolución
electroforética que se obtuvo al emplear tejido (ojo y músculo) en buenas condiciones
(Bouza et al., 2002).
De acuerdo a los sistemas aloenzimáticos ensayados, todas las muestras mostraron
el patrón de discriminación determinado para la especie C. humboldtinuam (Barriga-Sosa,
2003), el cual consiste en la presencia del alelo f para el locus Gpi-3, así como el alelo d
para el locus Gpi-1 y monomorfismo para los loci Ldh-1 y 2 (Figura 9).
a) b)
Figura 9. Patrones aloenzimáticos a) Gpi; b) Ldh.
Variabilidad genética
Al igual que con los RFLP’s, no se presenta variabilidad en las muestras, ya que
todos los organismos presentaron patrones monomorficos.
Barriga-Sosa et al. (2002), empleando 23 loci, reportan un proporción de
polimorfismo (P.95) para la especie de 17 y una heterocigosidad (He) de 0.087; por lo que
es recomendable aumentar el numero de loci para determinar la variabilidad (Barriga-Sosa
et al., 2003).
CONCLUSIONES
* Por medio del análisis morfológico, se identificaron a los 50 individuos como C.
humboldtianum.
* Los datos morfométricos reportados en el presente trabajo, pueden ayudar a futuros
estudios para llevar a cabo la discriminación de C. humboldtianum en estadio juvenil.
* El análisis de RFLP’s del gen mitocondrial 16S sustenta que la especie es C.
humboldtianum, en su caso, los mismos marcadores pueden discriminar a las especies C.
lucius y C. estor, usando tejido vivo o congelado.
* Los loci diagnóstico empleados, apoyan los resultados morfológicos y RFLP’s.
• Se reporta cero variabilidad genética con ambos marcadores, por lo que se
sugiere aumentar el número de sistemas enzimáticos y el uso de la región
control en el caso de los RFLP’s.
•
* Los marcadores moleculares específicos (RFLP’s y aloenzimas) constituyen un
sistema de diagnóstico que podrá ser útil para el desarrollo de programas de manejo y
conservación de este recurso.
CRITERIOS DE EVALUACION
El alumno será evaluado de acuerdo a su desempeño académico y experimental,
durante el desarrollo del proyecto y con base en el contenido del reporte final.
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Chirostoma) DEL LAGO DE PÁTZCUARO, POR MEDIO DE CARACTERES
MORFOLÓGICOS, ALOENZIMÁTICOS Y RFLP’S DEL GEN MITOCONDRIAL 16S.
H.015.02, 5 de Junio, 2003.
Dra. Irene de los Angeles Barriga sosa. Titular C, Dpto. Hidrobiología, CBS.
Resumen
Los peces blancos del Lago de Pátzcuaro (Chirostoma estor, C. lucius y C.
humboldtianum) constituyen un recurso de gran importancia cultural y económica. El
deterioro ambiental, la sobreexplotación y la introducción de especies, ha provocado la
disminución de las poblaciones locales y la hibridación natural la cual, aunada a la gran
similitud de caracteres morfológicos entre éstas especies, dificulta la discriminación por
métodos tradicionales. En este trabajo, se discrimina a 50 organismos por medio de 27
caracteres morfológicos: 19 morfométricos y 8 merísticos (análisis univariado y
multivariado); dos loci diagnóstico (Gpi-3 y Ldh-1) y RFLP’s del gen mitocondrial 16S
amplificado vía PCR. Los resultados morfológicos eluden que se trata de la especie C.
humboldtianum, lo cual es soportado por el uso de los marcadores moleculares. Así mismo,
se reporta cero variabilidad en las muestras, por lo que se recomienda aumentar el número
de enzimas de restricción y emplear la región control (D-loop) en el caso de los RFLP’s.
Por lo anterior, se concluye que el empleo de marcadores moleculares permite establecer
métodos confiables para efectuar la discriminación de especies, necesaria para formular o
desarrollar programas de manejo y/o conservación.