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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD – IZTAPALAPA
ÁREA DE NEUROCIENCIAS.
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN.
EFECTO DE LA PREGNANOLONA (PNA) SOBRE LA ARQUITECTURA DEL SUEÑO DE
RATAS INTACTAS Y ESTRESADAS.
BIOL. EXP. IVIS IBRAHIM MORALES ARROYO.
ASESORA: Dra. ANABEL JIMÉNEZ ANGUIANO.
DICIEMBRE del 2006
ABREVIATURAS
ACTH Hormona adrenocorticotrópica
ACTH Hormona liberadora de corticotrofina
EEG Electroencefalograma
EMG Electromiograma
GABAA Ácido γ amino-butírico.
GH Hormona de crecimiento.
LCR Líquido Cefalorraquídeo.
LoCo Locus Coeruleus.
PMDD Síndrome disfórico premenstrual.
PNA 5α-pregnan-3β-ol-20-ona.
PRL Prolactina
SMOR Sueño de Movimientos Oculares Rápidos.
SNC Sistema Nervioso Central.
SOL I Sueño de Ondas Lentas I.
SOL II Sueño de Ondas Lentas II
TDS Trastornos de sueño.
PMDD Síndrome Disfórico pre-Menstrual.
2
ÍNDICE
Introducción ..................................................................................................... 5
Antecedentes teóricos ............................................................................... 6
Síntesis de hormonas ................................................................................... 9
Progesterona y SNC ................................................................................... 10
Receptor GABA .......................................................................................... 11
Metabolitos de la progesterona ............................................................... 12
Efecto de las hormonas en el SNC ........................................................... 13
Efectos de los pregnanos en el SNC ........................................................ 13
Síntesis de PNA y efectos sobre el sueño ................................................. 14
Neuroesteroides y Sueño ...................................................................... .... 15
Estrés, otro factor que altera el ciclo sueño/vigilia ............................... 15
Estrés y sueño .............................................................................................. 16
Objetivos .......................................................................................................... 18
Hipótesis ............................................................................................................ 18
Justificación ...................................................................................................... 18
Metodología ..................................................................................................... 19
Diseño experimental ................................................................................ 19
Cirugía estereotáxica .............................................................................. 19
Preparación del anestésico .................................................................... 19
Colocación de la rata en el aparato estereotáxico .......................... 21
Incisión en la rata ...................................................................................... 22
Trepanaciones y colocación de los tornillos ......................................... 22
Preparación de la neurohormona .......................................................... 24
Primera fase experimental ................................................................................ 24
Administración de la neurohormona .................................................... 24
3
Sistema Reticular Activador Ascendente ........................................... 25
Segunda fase experimental ............................................................................. 26
Estrés agudo por inmovilización .............................................................. 26
Registro polisomnográfico ..................................................................... 27
Fases de sueño/vigilia (características) ........................................................ 27
Vigilia ......................................................................................................... 27
SOL ......................................................................................................... 28
SMOR ......................................................................................................... 29
Análisis estadístico ........................................................................................... 30
Resultados ......................................................................................................... 30
Discusión ............................................................................................................ 35
Conclusiones ..................................................................................................... 38
Perspectivas ...................................................................................................... 39
Bibliografía ......................................................................................................... 40
4
INTRODUCCIÓN
El ciclo sueño-vigilia constituye uno de los eventos neurobiológicos
con una alta complejidad y al mismo tiempo con una enorme importancia
en la historia evolutiva de los organismos. El sueño además de ocupar un
enorme espacio temporal, repercute de manera favorable en el
desempeño óptimo de las actividades diarias. Las concepciones acerca
de qué es y cómo se genera han evolucionado ligados al avance de la
instrumentación para su análisis. Así, a pesar de extraordinarias
concepciones acerca del sueño por diversas culturas, no fue sino a
principios del siglo XX cuando, con el advenimiento del
electroencefalograma (EEG), fue posible generar las primeras definiciones
de las diferentes etapas del sueño. En años recientes, el sueño ha llamado
la atención en la medicina, ya que se ha generado una nueva área, la de
los Trastornos del Sueño (TDS), que comprende un gran número de
alteraciones. Los TDS son frecuentes en la población general. Si éstos no son
atendidos oportunamente, producen ejecución deficiente durante el día,
accidentes automovilísticos y laborales, así como cambios en el estado de
ánimo
Además, se ha observado que durante el sueño existe una
correlación importante entre la actividad del ciclo sueño-vigilia y la
secreción de diversas hormonas. Estas correlaciones se han atribuido, en
parte, a que existe una estrecha relación y sincronización circadiana, entre
la secreción de hormonas y el sueño. Las investigaciones realizadas
respecto a los picos máximos de liberación de las hormonas hipofisarias,
hormona del crecimiento (GH) y prolactina (PRL), durante el sueño, tienen
5
aproximadamente 20 años. Durante este tiempo, se ha documentado que
la liberación de la GH ocurre durante el inicio del sueño de ondas lentas
(SOL), en una gran variedad de especies de mamíferos. En el caso de la
prolactina, se ha visto que en el ser humano los más altos incrementos de
secreción se observan después del inicio de sueño, pero en contraste con
la GH, la concentración de PRL en el plasma alcanza los valores máximos
durante la media noche. (1)
Estas observaciones han sido de gran importancia, pero aún se
desconocen en gran medida los mecanismos por los cuales estos procesos
se presentan durante el sueño.
ANTECEDENTES TEÓRICOS
A principios del siglo XX, la idea de que existían sustancias
encargadas de la aparición del sueño era muy posible. En Francia, en
1913, Henry Pieron llevó a cabo las primeras observaciones. El mostró que el
líquido cefalorraquídeo (LCR) obtenido de perros privados de sueño era
capaz de producir sueño cuando se administraba a perros receptores que
habían estado durmiendo normalmente. Estas observaciones fortalecieron
la idea de que durante la vigilia prolongada se acumulaban sustancias
inductoras de sueño en el LCR, a las que denomino “hipnotoxinas”.
A partir de entonces, se han postulado la existencia de varias
sustancias o factores inductores, tanto para el SOL como para el sueño de
Movimientos Oculares Rápidos (SMOR). En la actualidad existen decenas
de sustancias endógenas a las que se les ha atribuido alguna participación
en la regulación del ciclo sueño-vigilia.
Estas substancias no solo se encuentran en el cerebro, ya que
Monnier en 1963 sugirió que existían sustancias inductoras del sueño en el
plasma sanguíneo de conejos. Datos posteriores mostraron que el dializado
obtenido de las muestras de sangre de estos animales inducía sueño en
6
conejos despiertos sí se les inyectaba por vía intravenosa o
intracerebroventricular. Años después en 1972, se determino que el
principio activo del dializado era un neuropéptido que al administrarse en
el tercer ventrículo inducía SOL. Este péptido ha sido localizado en cerebro
de rata, en neuronas serotoninérgicas, catecolaminérgicas y productoras
de somatostatina, así como en el suero y en LCR en humanos.(1)
Por otro lado, el sistema nervioso central (SNC) ha sido reconocido
como un blanco para diferentes hormonas esteroideas (corticosteroides,
progestinas, andrógenos y estrógenos). Muchas de estas, han sido
relacionadas con procesos de diferenciación sexual cerebral y con la
pubertad. Las acciones de los esteroides no solo participan en cambios
funcionales y estructurales de las neuronas, sino que además afectan la
estructura y función de las células gliales.(2)
La influencia de las hormonas gonadales sobre el ciclo de sueño, se
ha confirmado plenamente al reconocerse los cambios específicos que
ocurren durante el ciclo estral, el embarazo, el parto y en la menopausia.
Al respecto, los primeros experimentos que estudiaron esta relación fueron
realizados en la década de los 60’s cuando el grupo dirigido por el Dr.
Charles Sawyer decretó que la conducta sexual en conejas provocaba un
estado que electroencefalográfica y conductualmente era parecido al
sueño.
Otras observaciones hechas por Colvin y colaboradores, mostraron
los efectos del ciclo estral, de la ovariectomía y de la terapia sustitutiva de
estrógenos sobre el patrón de sueño en ratas, reportando una supresión
total de SMOR durante la etapa de pro-estro, momento en que los
estrógenos alcanzan las concentraciones más altas.(1)
A principio de la década de 1970, se evidencio que la
administración de progesterona en ratas ovariectomizadas, producía una
disminución de SOL y de SMOR. Adicionalmente, se ha reportado que la
7
progesterona, modifica la excitabilidad neuronal, la respuesta al estrés la
ingestión de alimentos, así como algunas expresiones afectivas como son
el estado de ánimo, los estados de ansiedad y depresión, y funciones
cognoscitivas, como el aprendizaje y la memoria.(2)
Estas hormonas esteroideas, en el humano, provienen del colesterol,
como puede apreciarse en la (Fig. 1.)
Las hormonas sexuales se sintetizan en las gónadas masculinas y
femeninas; y en la placenta. Entre estos esteroides se incluyen a los
andrógenos y estrógenos, que influyen en el desarrollo de las
características sexuales secundarias propias de varones y hembras
respectivamente, y la progesterona que es la que regula el ciclo
reproductor en las hembras.(3) Además de sintetizarse en las gónadas,
existe evidencia de que la progesterona también es sintetizada de novo en
regiones como el hipotálamo y la hipófisis.(4)
8
Figura 1 Síntesis de los esteroides sexuales
9
Todas las hormonas esteroides poseen una estructura similar, con
pequeñas diferencia químicas, que condicionan sus diferentes actividades
biológicas. Esta estructura básica es la del
ciclopentanoperhidrofenantreno, compuesto por un anillo ciclo pentano
(5C) y 3 bencénicos (6C cada uno).
Existen tres grupos principales de esteroides sexuales en función del
número de carbonos de su molécula:
• Derivados del pregnano (21C): Incluye los corticoides y la
progesterona (progestinas).
• Derivados del androstano (19C): Al que pertenecen los andrógenos.
• Derivados del estrano (18C): Al que pertenecen los estrógenos
Asimismo, se ha mostrado que el tejido nervioso no solamente es
blanco de las hormonas esteroideas producidas por las glándulas
endocrinas periféricas como las suprarrenales y las gónadas; sino que
contiene varios sistemas enzimáticos capaces de metabolizar estas
hormonas y en algunas regiones cerebrales, sintetizarlas a partir de
colesterol. De la interacción de las hormonas y de sus metabolitos con los
diferentes componentes celulares resultan los múltiples y complejos efectos
sobre el SNC. En particular, varias de las acciones de la testosterona y de la
progesterona son producidas por alguno de sus metabolitos producto de
su biotransformación.
PROGESTERONA Y SNC
La progesterona, ejerce diversas acciones en el SNC a través de
diferentes mecanismos de acción. Algunas de estas acciones son
mediadas por la interacción de la progesterona con su receptor
intracelular dando como resultado la regulación de la expresión génica.
Otra, producida por la propia progesterona o por alguno de sus
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metabolitos, es ejercida a nivel membranal en receptores específicos que
estimulan sistemas de segundos mensajeros.(2)
Otras acciones membranales son mediadas por la biotransformación
de la progesterona a metabolitos 3α, 5α o 3β, 5β reducidos, que se unen a
canales iónicos operados por receptores para neurotransmisores, como los
receptores GABAA, los cuales están compuestos por dos sub–unidades α,
dos β y una γ. Este receptor tiene un gran dominio extracelular en su
terminal amino, que es el sito en donde se une el ligando.
Los canales para los receptores GABAA, contienen restos básicos
neutros o cargados de forma positiva, lo que podría contribuir en la
selectividad para los aniones.(5) (Fig. 2)
Los metabolitos secundarios de la progesterona, pueden sintetizarse
en los ovarios, formarse en el cerebro a partir de la progesterona circulante
o bien, originarse a partir de la
progesterona sintetizada de novo en el
SNC(4) ,considerándose entonces como
neuroesteroides o neurohormonas. Se
ha demostrado la presencia de los
sistemas enzimáticos necesarios para la
síntesis a partir de colesterol y para la
biotransformación de la progesterona y
de otros esteroides en el cerebro de
roedores y de otras especies
incluyendo la especie humana.(2)
La progesterona es metabolizada
en el cerebro a una variedad de
progestinas reducidas por la acción de la 5 α- o de la 5β-reductasa y luego
por la acción de la 3α- o de la 3β-hidroxiesteroideoxidoreductasa, dando
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origen a la 5α- o a la 5β-pregnandiona respectivamente y a las 3α5α-,
3β5α-, 3 α 5β- y 3β5β pregnanolonas.(2)
Con los antecedentes de los efectos anestésicos de la progesterona
se han hecho estudios que muestran que este esteroide, lo mismo que sus
metabolitos 5β-, o 5α- reducidos inhiben la respuesta neuronal de la
formación reticular mesencefálica, el núcleo ventromedial del hipotálamo
y la región dorsal del hipocampo en el gato e induce sincronización del
EEG de estas estructuras sub-corticales y de la corteza cerebral.(2)
Estos resultados muestran la capacidad de la progesterona y de
algunos de sus metabolitos para reducir la excitabilidad neuronal en el SNC
y además sugiere que el efecto de la progesterona puede ser debido en
gran parte, a su conversión en metabolitos activos.(2)
Los esteroides GABAérgicos, al igual que los barbitúricos,
benzodiacepinas y el alcohol, tienen un efecto bimodal, es decir, en
concentraciones farmacológicas ejercen efectos depresores del SNC,
anestésicos, antiepilépticos, sedantes y ansiolíticos; y en bajas
concentraciones puede producir efectos emocionales adversos en un 20%
de los individuos. Por ejemplo: el síndrome disfórico premenstrual (PMDD), la
epilepsia catamenial y la migraña menstrual, así como los cambios de
estado de ánimo, las perturbaciones de la memoria y el aprendizaje, el
insomnio ligado al ciclo, los cambios en la ingestión de alimentos y de
alcohol ligados al ciclo, las alteraciones de la concentración, la mayor
sensibilidad el estrés, la perdida del control de los impulsos, la dificultad de
controlar las emociones, etc. Muchos de estos fenómenos son parte del
PMDD.(2)
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EFECTO DE LAS HORMONAS ESTEROIDEAS EN EL SNC
Las hormonas esteroideas afectan de manera positiva a las
neuronas, en el crecimiento de proyecciones, y en la formación de
conexiones sinápticas desde el desarrollo temprano hasta los cambios
plásticos observados en el sistema nervioso adulto.(2)
Después de un daño o enfermedad los esteroides ejercen acciones
protectoras en neuronas y células gliales, ya que promueven procesos
neuroregenerativos.(2) La progesterona ejerce una variedad de efectos
neuroprotectores en el SNC y periférico,(2) protege contra la toxicidad del
glutamato a neuronas de la médula espinal en cultivo, reduce la gliosis
reactiva y la proliferación de astrocitos luego del daño cerebral por
penetración de cuerpos extraños en ratas, e incrementa la mielinización de
los axones del nervio ciático de ratones posterior al daño inducido por frío,
reduce la perdida neuronal y facilita la recuperación cognoscitiva luego
de daño traumático al cerebro y acelera la respuesta de reaparición del
daño al aumentar la expresión de la proteína asociada al crecimiento
(GAP-43) posterior al daño por sección espinal en ratas.(2)
EFECTO DE PREGNANOS SOBRE EL SNC
La progesterona y sus metabolitos poseen un amplio espectro de
actividad biológica en el SNC y periférico. El hallazgo de que la
progesterona se sintetiza en diferentes regiones del cerebro, ha permitido
concebirla como un neuroesteroide y considerar su función en diversas
funciones cerebrales.
La acción de los neuroesteroides, a nivel neuronal se establece a
través de receptores intracelulares específicos para producir algunas
acciones.
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La progesterona y sus metabolitos, actúan principalmente sobre el
receptor GABAA aumentando la frecuencia de apertura de canales de Cl-
que establece una acción inhibitoria.
Los pregnanos, ejercen diversos efectos plásticos sobre el SNC, la
influencia del crecimiento, la maduración y funcionamiento de las células
nerviosas, en la regeneración axonal, en la reducción de edema cerebral
después de un traumatismo, en la actividad cognoscitiva, en el estrés y en
otros procesos.
También han sido demostradas las funciones anestésicas analgésicas
e hipnóticas de por lo menos uno de los metabolitos de la progesterona 5α-
pregnan-3α-ol-20-ona, tambien llamada Alopregnanolona (ALO).(20)
Evidencias clínicas y experimentales sugieren que la progesterona
modula otros sistemas de receptores de membrana tales como el
serotoninérgico, noradrenérgico y el dopaminérgico, que son los tres
neurotransmisores que intervienen en la depresión y en las acciones de los
antidepresivos.(20)
La síntesis de PNA a partir de progesterona esta dada por 2 enzimas:
la primera, la 5 α-reductasa, que reduce a la progesterona en su C5 para
formar la 5α-dihidroprogesterona; con la ayuda de la 3α-
hidroxiesteroloxidoreductasa, se formara la 5β -pregnan-3β-ol 20-ona (Fig. 3)
PNA.
Otra propiedad que tiene la ALO, es la de ser un agente
neuroprotector. En 2004, Jun y cols, lesionaron ambos lados de la corteza
prefrontal en ratas y posteriormente les administraron ALO (4mg/kg) 1 hora
14
después de la lesión durante cinco días consecutivos. Después los animales
fueron evaluados en una prueba de laberinto y a los 10 días se observo
que las ratas lesionadas, presentaban recuperación cognoscitiva, la cuál
estaba mediada por un recobro neuronal.(19) Adicionalmente, se ha
mostrado que esta neurohormona es secretada en diferentes estados de
estrés y que influencia el sueño.
NEUROESTEROIDES Y SUEÑO
Diversos trabajos han evidenciado la participación de los
neuroesteroides en la regulación del sueño.
En el trabajo realizado por Dale y cols, en 1997; mostraron que la
administración de PNA (10-30 mg/kg) en ratas y del análogo sintético
CCD-3693, durante el periodo de oscuridad, produjo un aumento en el
SOL(7) , mediada por una afinidad positiva hacia el receptor GABAA.
En otro estudio realizado en ovejas gestantes de 130 y 135 días, se les
administró PNA (20 mg) y el derivado activo iso-pregnanolona; lo que
observaron fue que la PNA aumento de manera significativa la actividad
cortical, en tanto que con el derivado activo no produjo ningún cambio.(23)
Ambos trabajos sugieren que la PNA es un neuroesteroide que se
liga al receptor GABAA promoviendo su acción y facilitando la inducción
del SOL.
Además de la PNA, existen otros metabolitos de la progesterona que
también intervienen en el ciclo sueño/vigilia. Tal es el caso de la ALO, que
presenta una mayor afinidad positiva por los receptores GABAA,
produciendo un mayor incremento en el SOL y una parición más rápida de
él, en ratas.(18)
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ESTRÉS Y SUEÑO
El estrés según Hans Selye, (1946) es una respuesta no específica del
cuerpo frente a cualquier demanda del exterior, sin embargo a lo largo de
las décadas la definición de Selye ha caído en imprecisiones. Las
condiciones que producen estrés se han ampliado para incluir todas
aquellas circunstancias que producen una demanda extraordinaria en el
organismo, aun cuando esta sea de naturaleza placentera.(21)
El estrés causa trastornos psicosomáticos que afecta el
funcionamiento cerebral, produce taquicardias, dolor de estomago, colon
irritable, etc.(8) Además, la calidad del sueño esta asociada con los
eventos producidos durante la vigilia(8) dado que algunos estresores tienen
variaciones circadianas y pueden modificar los estados de vigilia y sueño
de un individuo.
La cascada de eventos hormonales que componen la respuesta de
estrés inicia en la zona Hipótalamica-hipofisiaria con la liberación de factor
liberador de Corticotrofina (CRF), el cual ayuda a la liberación, desde la
hipófisis de hormona liberadora de corticotrofina (ACTH) la que provoca la
liberación de esteroides como el cortisol.(22)
Hay tres etapas de respuesta al estrés descritas por Selye que están
relacionadas con el síndrome general de adaptación (estrés). En la
primera etapa de, “alarma”, el cuerpo reconoce la amenaza que genera
el estrés y se prepara para la acción, ya sea de agresión o de fuga. Las
glándulas endocrinas liberan hormonas que aumentan los latidos del
corazón, el ritmo respiratorio, elevan los niveles de azúcar en la sangre,
incrementan la transpiración, dilatan las pupilas y hacen más lenta la
digestión. La segunda etapa es la de “resistencia”, el cuerpo repara
cualquier daño causado por la reacción de alarma, pero si el estresor
continúa el cuerpo permanece alerta y no puede reparar los daños, y si
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continúa la resistencia se inicia la tercer etapa, la de “agotamiento”, cuya
consecuencia puede ser una alteración producida por estrés crónico.(8).
Dependiendo el tipo de estrés vamos a tener una respuesta en el
ciclo sueño-vigilia, ya que los estresores que alteran el seño, pueden ser
caracterizados por grandes demandas físicas o psicológicas, y las
diferentes respuestas del organismo hacia el estrés pueden ser de corta
duración, en el caso del estrés agudo, o prolongado, si se habla de un
estrés crónico.
Estudios en animales, principalmente roedores, indican que las
modificaciones en el patrón de sueño ante situaciones estresantes están
relacionadas con las características del estresor. Sin embargo, la tendencia
general señala una modificación en el patrón de sueño que con mucha
frecuencia se refleja en el SMOR y en pocas ocasiones incrementa la
vigilia.
Uno de los estresores mas utilizado en el estudio del sueño ha sido el
de la privación de este, ya sea de manera total o selectiva; este tipo de
estrés produce un fenómeno de rebote caracterizado por un aumento en
la duración total del sueño, aumentos en la duración promedio de cada
uno de los episodios de SMOR, incrementando así, la eficiencia del sueño,
lo que se puede traducir como un menor número de despertares y
latencias de sueño cortas.(9)
En el caso de un estrés agudo causado por inmovilidad, Altman y
cols., en 1972, realizaron experimentos en ratas, a las que sometían a este
tipo de estresor. Las introducían en tubos por 5 horas impidiéndoles todo
movimiento, y después de ese periodo encontraron que había un aumento
significativo de SOL, y una reducción en el SMOR y de su latencia.
Sin embargo, estudios mas recientes en los que el estresor por
inmovilización fue aplicado por un periodo de 2 horas al inicio de la etapa
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de oscuridad, en donde los animales son más activos, se induce un rebote
significativo en el SMOR, mientras que el SOL fue pobremente afectado.(10)
JUSTIFICACIÓN
Los antecedentes que se tienen sobre la participación de los
metabolitos de la progesterona así como el factor del estrés en el sueño no
han sido completamente estudiados, aunque es sabido que los pregnanos,
que es el grupo al cual pertenecen la PNA, son secretados por una
respuesta inducida por el estrés, pero se desconocen los efectos de ambos
factores sobre el ciclo sueño/vigilia.
HIPÓTESIS
Sí la PNA modifica el patrón de sueño, incrementando el SOL y
disminuyendo el SMOR en ratas intactas, entonces es posible que en ratas
estresadas, la PNA favorezca la aparición de sueño.
OBJETIVOS
Determinar el efecto de la administración de dos de PNA sobre el
patrón de sueño de ratas intactas.
Establecer el efecto de la administración de la PNA sobre el patrón
de sueño de ratas estresadas por inmovilización.
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METODOLOGÍA
DISEÑO EXPERIMENTAL
Se utilizaran 12 ratas Wistar machos de entre 250 y 300gr. de peso las
cuales se mantuvieron en condiciones de bioterio de la UAM–I , en un
cuarto con temperatura controlada de 24 + 1°C con un ciclo normal de
luz- oscuridad de 12:12 (luz de 9:00 a 21:00 hrs.) con agua y alimento ad
libitum.
Las ratas fueron implantadas con electrodos para registros
convencionales de sueño.
CIRUGÍA ESTEREOTAXICA:
ANESTÉSICO:
El paso mas crítico en el procedimiento quirúrgico es el de anestesiar
al animal. A todo animal al que se le va a aplicar un anestésico se le debe
pesar exactamente, a fin de determinar la dosis que se le va a inyectar.
En las ratas la dosis usual es de 0.8 ml de un cóctel de diferentes
anestésicos.
PREPARACIÓN DEL ANESTÉSICO:
COMBELEN: Es un anestésico derivado de la fenotiacina que ejerce
un fuerte poder tranquilizante sobre ciertos nervios, de tal forma que
los animales agresivos se vuelven dóciles o fácilmente manejables.
KETAMINA: Es un anestésico general de acción corta que posee la
capacidad de eliminar la sensibilidad al dolor pero conserva los
reflejos palpebrales, faríngeos, laríngeos y viscerales.
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ROMPUM: Es un anestésico de acción tranquilizante, así como
relajante muscular, esta actividad esta relacionada con la depresión
del SNC. El efecto de relajante muscular se basa en la inhibición de
la transmisión del impulso nervioso al músculo.
Estos diferentes anestésicos se prepararon con las siguientes
concentraciones:
PREPARAR
1ml. 10ml.
COMBELEM 0.1 ml 1 ml
KETAMINA 0.25 ml 2.5 ml
ROMPUM 0.05 ml 0.5 ml
SOLUCIÓN SALINA 0.6 ml 6.0 ml
Y las concentraciones de cada uno de los anestésicos por frasco son:
COMBELEN: Propionilpromazina 10mg.
Excipiente 1ml.
KETAMINA: Clorhidrato de Ketamina equivalente a 1000mg de
Ketamina.
ROMPUM: Cada ml. contiene Hidroclururo de xilazina 20 mg.
Vehículo c.p.v. 10ml.
El anestésico se inyecta (0.8 ml) en la cavidad
peritoneal (CP), para obtener un efecto rápido, (Fig. 4)
ya que la CP posee una gran superficie absorbente a
través de la cual, el fármaco penetra con rapidez en
la circulación aunque lo hace mas bien por la vena
20
porta.(11) En los animales mayores se prefiere la inyección intravenosa,
pero en ratas el empleo de esta vía es difícil ya que las venas son muy
pequeñas y delicadas. La aguja se inserta con firmeza a través de los
músculos abdominales. Cuando esto se hace adecuadamente la punción
no provocará contracciones en el animal. Después de haber insertado la
aguja dentro de la CP, se separo ligeramente el émbolo de la jeringa, para
observar si se absorbe sangre, esto con el fin de asegurarse de que la
punta de la aguja esta en la cavidad y no en algún órgano. Una vez
hecho esto se inyecto la anestesia rápidamente y se retirando de igual
forma la aguja.
Después de haber anestesiado al animal, se esperaron 5 minutos
para que este haga su efecto. Posteriormente, la rata se rasuró en la zona
superior de la cabeza, desde arriba de los ojos hasta la parte de la nuca
(hueso interparietal).(12, 13)
MONTAJE DE LA RATA
El montaje del animal en los lápices estereotáxicos para el oído es la
manipulación más difícil en todo el proceso quirúrgico y, asimismo, el paso
más importante para determinar la exactitud de la colocación de los
electrodos implantados. Por lo tanto, debe tenerse especial cuidado en
asegurarse de que la punta de cada uno de
los lápices para el oído se encuentre en el
meato auditivo del animal. (Fig. 5).
A fin de comprobar si las puntas de los lápices
para el oído están adecuadamente colocadas
dentro de los meatos auditivos, se puede tomar
la nariz del animal y movérsela firmemente
hacia delante y hacia atrás. Sí la cabeza del animal esta montada
apropiadamente no será posible sacarlo de las barras. Para montar los
21
dientes del animal sobre la barra de los incisivos apretando las pinzas sobre
la nariz. La parte superior de la barra para los incisivos debe estar a
exactamente 5 mm por arriba del centro de las barras para los oídos. (Fig. 5)
Ya montada la rata en el aparato
estereotáxico, se le hizo una incisión
comenzando por detrás de los ojos sobre
la línea media de los mismos en una
dirección antero posterior.
La incisión debe ser de
aproximadamente de 20 a 25 mm de largo, permitiendo que queden
visibles en la herida las uniones de las suturas óseas BREGMA (B) y LAMBDA
(L) (Fig.6).
Si la incisión se hace demasiado larga, será necesario suturar para
cerrar la herida después de haber colocado en su sitio el conector del
electrodo.
Después de haber hecho la incisión, el tejido
conjuntivo perióstico que está adherido al hueso
será raspado con una arista roma con el fin de
dejar el cráneo limpio.
Al secar el hueso, se hace más visible las
suturas craneales. El punto (B) en la parte superior
del cráneo es la intersección de las placas frontal
y parietal en su línea media. El punto (L) es la
intersección de las placas parietal e interparietal
en su línea media. Estos puntos así como el
meato auditivo, pueden ser usados como punto
de referencia estereotáxica. Para marcar los
puntos en donde de harían las trepanaciones, se
22
usaron como puntos de referencia las suturas de B y L, marcando 5 puntos
en las zonas siguientes:
Dos puntos bilaterales sobre las coordenadas del hipocampo (desde
bregma posterior 4mm, lateral + 3.2mm), dos mas anteriores a bregma
(anterior 2mm lateral + 2.5mm) y uno más en la región interparietal. (Fig.7).
Usando un taladro de dentista, y con un barreno del No. 56 se perforo la
superficie del cráneo haciendo una leve presión hacia abajo hasta
perforar solo el cráneo, teniendo cuidado de no lesionar el cerebro.
Se usaran tornillos de acero inoxidable ya que los metales no inoxidables
causarían daño a las meninges y a la corteza. El tornillo de acero
inoxidable, fue de 0-80 X ⅛ de pulgada, que es el más adecuada para la
rata.
Para insertar el tornillo, se debe colocar de forma perpendicular a la
superficie del orificio, una vez en esta posición y con la ayuda de un
desatornillador, se enrosca el tornillo al
cráneo hasta una profundidad de + 0.5 mm
para no lesionar el cerebro. (Fig. 8).
Adicionalmente a esto, se insertaron
alambres flexibles de plata en los músculos
dorsales del cuello para el registro del
Electromiograma (EMG) (Fig.7). Todos los electrodos fueron soldados a un
conector de 9 entradas (5 en cráneo y 4 músculo) fijándose a la cabeza
de la rata con acrílico dental. (Fig.9).
Después de fijar el conector en el cráneo con el acrílico dental, a la
rata se le administro una dosis de 0.3 ml de antibiótico (penicilina) por vía
intramuscular, utilizando el músculo bíceps crural, por ser un músculo de
gran tamaño.
Después de al menos una semana de recuperación post-operatoria,
los animales fueron habituados a las condiciones de manejo, que consiste
23
en la manipulación del animal, la conexión al polígrafo y a las condiciones
de habituación de registro.(13)
PREPARACIÓN DE LA NEUROHORMONA
Para la preparación de las hormonas, se obtuvo un promedio del
peso de las ratas seleccionadas, y se hizo una conversión de acuerdo a la
siguiente fórmula:
1000g PNA 5.6mg/kg Promedio del peso de ratas seleccionadas
Cantidad de g de PNA a preparar
Estas formulas se usaron para la preparación de ambas dosis de PNA (2.8
y 5.6mg/kg).
ADMINISTRACIÓN DE LA NEUROHORMONA
La administración de la neurohormona se realizó en dos etapas:
En la primera fase, se realizaron los experimentos de controles de
aceite y de PNA a dosis de 2.6 y 5.8 mg/kg de peso, para los cuales se
utilizaron 12 ratas. La vía de administración del vehículo y de la PNA fue
subcutánea, ya que por esta vía de administración, la velocidad de
absorción suele ser baja y constante, para lograr un efecto sostenido.(11)
24
Después de la administración de la PNA y del vehículo, las ratas
fueron registradas polisomnográficamente durante 8 horas continuas.
(Fig.11) que nos permitirá registrar la
actividad neuronal cortical del cerebro de
la rata, captando los potenciales de acción
ya sean inhibitorios o excitatorios, que llegan
a las células corticales procedentes de otras
neuronas, pasando de una a otra a través
de ciertos puntos de unión localizados en
distintos puntos del cuerpo de la neurona
llamados sinapsis.
La actividad de la corteza cerebral
depende de los impulsos que llegan desde
un marcapaso central, llamado Tálamo, que esta formado por dos núcleos
que se encuentran en la base del cerebro, de donde parten proyecciones
en forma radiada que se dirigen hacia la corteza cerebral.
Las proyecciones de estos impulsos hacia la corteza cerebral
producen potenciales post-sinápticos que son registradas en el EEG, en
forma de ondas de 10Hz.(14)
La formación reticulada situada en el tallo cerebral, entre múltiples
funciones tiene el llamado Sistema Reticular Activador Ascendente, la cual
recibe impulsos de todas las aferencias que le llega a través de los diversos
sistemas sensitivos y a su vez envía los impulsos que llegan a la corteza
cerebral, unos en forma directa y otros ascienden a través de relevos en el
Tálamo, por lo que se le denomina: Vía Retículo Tálamo Cortical.(14) (Fig.
10)
Para registrar esta actividad cortical en las ratas, se les dejo una 1
semana por experimento para impedir el efecto acumulativo de la
neurohormona.
25
En la segunda etapa del proyecto se involucró el factor del estrés, el
cual fue un estrés agudo,(8) por inmovilidad durante las últimas 2 horas del
periodo de oscuridad, ya que si se hubieran estresado las ratas en el
periodo de luz, se estaría además privando de sueño a los animales, ya
que las ratas presentan un ciclo invertido con respecto a los humanos, es
decir, que presentan mayor actividad durante el periodo de oscuridad y
duermen durante el periodo de luz.
En esta fase, las ratas se estresaron por
inmovilización por un periodo de 2 horas en tubos de
acrílico de 20 cm de largo por 6 cm de diámetro (Fig.
12), iniciando el estrés a las 6 a.m. y finalizando las 8
a.m. Inmediatamente después se registraron
polisomnográficamente durante 8 horas, para los
experimentos controles con estrés.
En los experimentos de estrés + PNA de 2.8mg/kg y de estrés + PNA
5.6mg/kg, primero se estresaron las
ratas de la misma manera que los
controles, e inmediatamente después
de sacarlos del estrés, se les inyectó la
dosis correspondiente de PNA y se les
realizó el registro polisomnográfico de
8 horas (Fig. 11).
26
Entre cada uno de los experimentos se dejó una semana como
mínimo de tiempo para la recuperación de los animales y para la
realización de cada uno de los experimentos, utilizando un cuadro latino.
Los registros polisomnogáficos fueron evaluados manualmente
utilizando criterios estandarizados de acuerdo al manual de Takeuchi(16)
para distinguir las diferentes fases del ciclo sueño-vigilia. De tal forma que
en la rata podemos diferenciar durante el sueño 3 etapas que son: el SOL
I, SOL II y el SMOR.
En la vigilia, los animales permanecen quietos con los ojos abiertos y
alertas al medio que los rodea.(15) Electroencefalográficamente, la vigilia
se caracteriza por una actividad desincronizada en el EEG con una
frecuencia rápida que va de 4 a 12 Hz, con un bajo voltaje que varía en el
intervalo de entre 30-50 µv. El EMG, durante la vigilia presenta una gran
actividad.(15) (Fig. 13)
EEG
EEG
EMG
Figura 13. Representación polisomnográfica de la vigilia.
Para el SOL, las características conductuales de las ratas son:
echarse sobre un costado o sobre su vientre. Esta última posición es
conocida en el gato como “esfinge”. También podemos apreciar que se
presenta una relajación de las membranas nictitantes, la pupila se contrae
y se presentan pocos movimientos oculares. Funciones como la respiración
y ritmo cardiaco se lentifican, mientras que se presenta el umbral para
reaccionar ante los estímulos corporales.(15)
En las características electroencefalográficas es posible registrar tres
principales tipos de oscilaciones: los husos (7 a 14 Hz), el ritmo delta (1 a
27
4Hz) y las oscilaciones lentas (<1Hz) que pueden presentarse con una
amplitud desde 150 a 250 µv.(15)
Las células glutamatérgicas corticales son responsables de la
generación de la actividad lenta, las reticulares talámicas GABAérgicas se
encargan de los husos mientras que, las talámicas generan la actividad
delta.(15)
El SOL, también puede llamarse sincronizado, ya que la actividad
que se registra en el EEG presenta esa característica, ligero porque el
umbral para despertarse es bajo, y también puede llamarse Sueño no-
MOR, ya que en esta etapa no se presentan movimientos oculares rápidos.
(Fig. 14, 15)
EEG
EEG
EMG
Figura 14. Representación polisomnográfica del SOL I.
EEG
EEG
EMG
Figura 15. Representación polisomnográfica del SOL II.
En las ratas el SMOR se caracteriza por presentar en el EEG una
actividad conocida como ritmo theta (θ) cuya frecuencia varía entre 4 –
12Hz. El voltaje puede variar desde 50 hasta 150µv.(15)
En el SMOR, existe atonía muscular, la cual se da por mecanismos en
donde se involucran grupos neuronales del Locus Coeruleus (Lo.Co.) y el
Locus Subcoeruleus. Se ha demostrado que una región conocida como
28
peri-Lo.Co., descrita por Sakai en 1980, es la zona que dispara la atonía
muscular durante el SMOR.(15)
Los movimientos oculares, característicos de esta etapa de sueño,
pueden ser, en forma vertical, horizontal o circulares, los cuales son
producidos por grupos celulares del Núcleo abducens, el cual dispara en
forma de ráfaga durante el SMOR.(15) (Fig. 16)
EEG
EEG
EMG
Figura 16. Representación polisomnográfica del SMOR.
Al SMOR, también se le llama sueño rápido, porque la frecuencia de
la actividad cerebral dominante en este periodo es rápida; se conoce
también como desincronizado porque sus ondas no presentan sincronía
como en el SOL; también es llamado sueño profundo, porque el umbral
para despertar es elevado. Estas son las diferentes características que se
observan en un registro polisomnográfico de las diferentes etapas del ciclo
sueño/vigilia.
Los registros polisomnográficos fueron medidos por fases de sueño, y
capturados en el programa “HIPNO” (Elaborado por el Lic. en Comp.
Javier Puga Soriano ex alumno de la división de CBI de la UAM-I), el cual
nos proporciona a través de un hipnograma el tiempo total de cada una
de las fases de sueño y de la vigilia; así como promedios, latencias y
duración de cada fase. (Fig. 17)
29
Figura.17 Hipnograma que muestra en el eje de las ordenadas las fases del ciclo sueño/vigilia, y en el eje de las absisas el tiem o del registro en horas. p
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos fueron analizados estadísticamente a través
de una prueba de ANOVA y posteriormente una prueba de
comparaciones múltiples de Fisher, que son pruebas no paramétricas, para
determinar la significancia entre grupos, mediante la utilización del
programa estadístico “NCSS”.
RESULTADOSRESULTADOS
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
PNA EN RATAS INTACTAS:
Durante 8 horas de registro de sueño, los animales que recibieron las
dos dosis de PNA, incrementaron de manera significativa el SOL II, a
expensas de una reducción en el SOL I, ambos diferentes
significativamente en relación al grupo control (* p < 0.05 *** p < 0.005).
En la vigilia se observó una tendencia a disminuirla directamente
proporcional a la dosis administrada de PNA, aunque no hubo cambios
30
significativos. En tanto que en el SMOR, la dosis mayor de PNA produjo un
ligero aumento, sin ser este, un aumento significativo (Ver Gráfica y Tabla
1).
Tabla 1. X ± E.E. del tiempo total (min) de los efectos producidos por las dosis de PNA durante 8 horas de registro de sueño. (* p < 0.05 *** p < 0.005).
31
PNA EN RATAS INTACTAS
0
50
100
150
200
250
300
350
VIGILIA SOL I SOL II SMOR
X +
E.E.
TIEM
PO T
OTA
L (m
in.)
CONTROL ACEITE n=8
PNA 2.8mg/Kg n=10
PNA 5.6mg/kg n=8
* *
**** p < 0.05
*** p < 0.005
***
GRÁFICA 1. En esta gráfica se ilustran los efectos producidos por la administración de la PNA sobre la arquitectura de sueño en ratas durante 8 horas de registro. Como puede apreciarse, ambas dosis de PNA produjeron un aumento significativo del TTSOL II, a expensas de una disminución en el TTSOL I con respecto al grupo control (* p < 0.05 *** p < 0.005).
32
PNA EN RATAS ESTRESADAS:
La administración de PNA en ratas estresadas produjo un aumento
significativo en el SOL II en ambas dosis, en relación a los grupos controles
(** p < 0.001). Para el SOL I observamos una disminución estadísticamente
significativa solo en el grupo de estrés + PNA 2.8 mg/kg con respecto a los
controles. Asimismo observamos que la vigilia tuvo una disminución
significativa únicamente en el tratamiento de estrés + PNA 5.6 mg/kg en
relación al control de aceite.
Para el caso del SMOR, observamos un aumento estadísticamente
significativo únicamente en los controles de estrés diferente al control de
aceite y al de estrés+PNA (2.6 mg/kg) (** p < 0.001) (Ver gráfica y Tabla 2).
Tabla 2. X ± E.E. del tiempo total (min) de los efectos producidos por el estrés + dos dosis de PNA durante 8 horas de registro de sueño. (* p < 0.05 ** p < 0.001).
33
ESTRÉS + PNA
0
50
100
150
200
250
300
350
VIGILIA SOL I SOL II SMOR
X +
E.E.
TIE
MPO
TO
TAL
(min
.)
CONTROL ACEITE n=8
CONTROL DE ESTRÉS n= 10
ESTRÉS+PNA 2.8mg/kg n=10
ESTRÉS+PNA 5.6mg/kg n=12
**
**
**
***
* p < 0.05
p < 0.001
*
GRÁFICA 2. En esta gráfica se muestran los efectos producidos por la administración de PNA en ratas estresadas durante 8 horas de registro. Podemos observar que la PNA a dosis de 2.6 y 5.8 mg/kg, mantuvo el efecto inductor de SOL II de manera significativa con respecto a los controles, a expensas de una reducción en el SOL I y la vigilia. En tanto que para el SMOR observamos un aumento significativo en el control de estrés, con respecto al control de aceite y al de estrés + PNA 2.6 mg/kg (* p < 0.05 ** p < 0.001).
34
DISCUSIÓN
Con base en los resultados obtenidos en el presente trabajo, pudimos
observar que la administración de la PNA en ratas intactas, aumento de
manera significativa el SOL II y disminuyó el SOL I. El efecto de la PNA sobre
el patrón de sueño ya había sido previamente mostrado, en donde
observaron un incremento en la actividad cortical (SOL). En otro estudio se
evidencio que la PNA produjo un aumento de la fase de SMOR(24) De
acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, nosotros mostramos
que efectivamente la PNA incrementa la actividad lenta del EEG,
específicamente el SOL II o sueño profundo, efecto que no había sido
diferenciado anteriormente. Además mostramos que la PNA no incrementó
de manera significativa la fase de SMOR, solo observamos una tendencia
a inducirlo con la dosis más alta de PNA.
Es posible que el aumento en el SOL II posterior a la administración de
PNA sea el resultado de una estimulación positiva producida por la
neurohormona sobre el receptor GABAA, al actuar como un agonista; el
cuál produciría una atenuación de la actividad neuronal produciendo por
ende un aumento en el SOL.(5)
Además, es posible que la actividad lenta, este mediada por
neuronas talámicas de relevo que son proyectadas hacia la corteza
cerebral, ya que la actividad de estas neuronas es resultado de la acción
de neuronas inhibitorias GABAérgicas situadas en el núcleo reticular. Estas
células reticulares permitirían la entrada de Ca++ a través de unos canales
de membrana que solo son sensibles al voltaje, y que solo se abren cuando
las células están hiperpolarizadas.
35
Por otra parte, la cantidad de sueño, así como su calidad, es
modificada por diferentes condiciones de estrés que el sujeto experimenta
durante la vigilia, estas modificaciones inducidas por el agente estresor,
dependen de la intensidad y del momento en el que este se presenta.
Además, el estrés, afecta directamente al SNC, en donde ocurren cambios
que modifican la fisiología del organismo repercutiendo en el patrón de
sueño.(8, 4)
Se ha evidenciado que la respuesta de estrés inducida por 2 horas
de inmovilización, en las ratas produce un incremento de SMOR. Los
resultados que obtuvimos corroboran estas observaciones, ya que también
obtuvimos un aumento significativo en la cantidad de SMOR posterior al
estrés.
En cuanto a la regulación neuroquímica de la fase de SMOR, se ha
demostrado que existen diversos neurotransmisores y núcleos cerebrales
involucrados en su regulación. Se ha propuesto que el SMOR depende de
una actividad serotoninérgica presente en la vigilia, la cual promueve la
acción de péptidos hipotálamo-hipofisiarios, que al activar a estructuras de
la región pontina del tallo cerebral facilitarían los mecanismos del SMOR.
Adicionalmente, se ha evidenciado que el cerebro anterior también
modula la fase de SMOR, en especial existen tres regiones límbicas que
están relacionadas con la generación de SMOR, estas regiones son: el giro
del cíngulo, el hipocampo y la amígdala del lóbulo temporal. Además, en
el ser humano, al estimular eléctricamente estas regiones del sistema
límbico, se generan alucinaciones, cambios emocionales, movimientos
oculares rápidos y el sujeto experimenta sensaciones como de estar
soñando.
Asimismo, durante situaciones de estrés, se producen cambios en
otros sistemas del cuerpo. Tal es el caso del sistema hormonal, en el que
destaca el eje Hipotálamo-Hipófisis-Suprarrenal(9) (el cual influye en algunos
36
aspectos del sueño), de donde se secretan diferentes hormonas como la
hormona adrenocorticotrofica (ACTH).
También, se ha observado que el estrés inducido por 2 horas de
inmovilización, en las ratas, produce un incremento en los niveles de
Acetilcolina (ACh). Se ha mostrado por una gran cantidad de aporte
experimental realizado en animales de laboratorio y en humanos, que la
ACh juega un papel importante en la generación del SMOR. Es posible
entonces de acuerdo a nuestros resultados obtenidos, que durante el
periodo de estrés se incrementen los niveles de este neurotrasmisor y
posiblemente module de manera positiva el aumento de SMOR.(9)
Por otra parte, la administración de PNA no promovió el incremento
de sueño MOR en las ratas estresadas, pero mantuvo sus propiedades
inductoras de sueño lento. Es posible entonces que la PNA no module la
cantidad de SMOR en condiciones de estrés, aunque los niveles de
diferentes metabolitos de la Progesterona, entre ellos la PNA incrementen
sus niveles durante los periodos de estrés.
En cuanto al efecto de la PNA sobre el SOL en ratas estresadas,
pudimos observar que la PNA mantuvo el efecto de incrementar el SOL II,
pero dicho efecto no fue potenciado, por lo que entonces podemos
concluir que la PNA promovió la aparición de SOL II en ratas intactas y
estresadas y no modifico la fase de SMOR.
37
CONCLUSIONES
Los resultados mostraron que ambas dosis de PNA, tuvieron efectos
sobre el SOL; aumentando significativamente el SOL II, a expensas de una
reducción del SOL I, esto podría deberse a que la PNA es una substancia
que se sintetiza naturalmente en el cerebro (4), la cual tiene su mecanismo
de acción sobre los receptores GABAA que permite la entrada de iones Cl-
hacia el interior celular hiperpolarizando la membrana de la neurona y
facilitando la parición de sueño.
En situaciones de estrés, nuestros resultados mostraron, que la
presencia del estresor, por si mismo, provocó un rebote de SMOR, lo que
podría explicarse por un incremento de la actividad de la enzima colin-
aceti-transerasa (CAT), enzima de síntesis de la ACh. Dicho incremento fue
observado en la medula oblonga y en el hipocampo posterior al estrés
agudo producido por inmovilización.(17) Estos incrementos pueden
traducirse en una mayor disponibilidad de acetilcolina y probablemente
en una mayor disponibilidad para producir un aumento en la cantidad de
SMOR.
En cuanto al efecto de la PNA en ratas estresadas solo observamos
un incremento en la cantidad de SOL II y no modificó el SMOR. Es posible
entonces que la PNA no promueva la aparición de SMOR, aunque los
niveles de esta neurohormona en el cerebro estén incrementados en el
cerebro durante los periodos de estrés.(4)
38
PERSPECTIVAS
I. Probar el efecto del estrés y de la PNA sobre el patrón de sueño
durante la primera mitad del ciclo de oscuridad. Periodo durante el
cuál los animales son más activas, y donde es posible un efecto
mayor del estresor y de la neurohormona sobre la arquitectura del
sueño.
II. Determinar el efecto de un antagonista al receptor GABAA como la
5-pregnen-3β-ol-20-ona (Pregnenolona) sobre el patrón de sueño, ya
que en nuestro estudio solo probamos el efecto de la PNA que es un
agonista al receptor GABAA .
III. Probar el efecto de un agonista a GABAA más potente que la PNA,
como lo es la 5 α -pregnan-3 α-ol-20-ona (Alopregnanolona), sobre el
ciclo sueño-vigilia de la rata.
39
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