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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
TEMA: Caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea
americana) y posterior extracción e identificación de la fracción con mayor
actividad antimicrobiana y antioxidante.
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la
obtención del título de Química de Alimentos
Autor: Alexandra Elizabeth Aymacaña Albán
Tutora: MSc. Dayana Paulina Borja Espín
Co-tutora: MSc. María Lorena Goetschel Gómez
DMQ, noviembre, 2018
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DEDICATORIA
A mi hija Valentina por ser mi inspiración y motivación en cada paso que doy en mi
vida.
A mis padres Hugo y Rebeca por su apoyo incondicional y ayudarme a salir adelante
siempre.
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AGRADECIMIENTO
A mi hija Valentina por llenar de alegría mis días que con su inocencia se me olvidaba
los malos momentos.
A mis padres Hugo y Rebeca por la paciencia y su ayuda día a día para poder terminar
mis estudios.
A mis hermanos Carlos y Edison por estar siempre pendiente de mí y apoyarme en cada
momento, yo sé que cuando necesite su ayuda siempre van a estar ahí.
A Daniel por haber llegado en el momento indicado y estar a mi lado durante toda mi
carrera universitaria, compartir los buenos y malos momentos y sobre todo no permitir
que me rindiera.
A mi tutora MSc Dayana Borja por toda su ayuda, tiempo, dedicación y guiarme para
terminar el trabajo de investigación.
A mi cotutora MSc Lorena Goestchel por todos los conocimientos impartidos durante
la carrera y todo el apoyo para concluir el trabajo de investigación.
A mi tribunal Dr. Fernando Novillo y MSc. Rommy Terán por el tiempo dedicado a
esta investigación y por todos sus conocimientos.
Al Ing. William Viera por los aguacates entregados para poder realizar la investigación.
A mi amiga Shirley por la compañía y largas conversaciones en todo el proceso
experimental de la investigación.
A mis amigos Miller, Shirley y Mishel con quienes terminó esta etapa de mi vida
rodeados de risas, llantos, malentendidos, pero al final, juntos.
A mis amigas Dianis, Anis y Alejandra por compartir los primeros semestres juntas, las
amanecidas, las largas tardes de sueño y las risas que nunca podían faltar.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Alexandra Elizabeth Aymacaña Albán en calidad de autora del trabajo de
investigación: “Caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea
americana) y posterior extracción e identificación de la fracción con mayor
actividad antimicrobiana y antioxidante”, autorizo a la Universidad Central del
Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que
contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Dayana Paulina Borja Espín en calidad de tutora, del trabajo de investigación
titulado “Caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea
americana) y posterior extracción e identificación de la fracción con mayor
actividad antimicrobiana y antioxidante”, elaborado la estudiante Alexandra
Elizabeth Aymacaña Albán de la Carrera de Química de Alimentos, Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo
reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico, en el campo
epistemológico y paginas preliminares, por lo que APRUEBO, a fin de que sea
sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito a los 05 días del mes de octubre del 2018
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR
TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dr. Fernando Novillo, MSc. Rommy Terán, MSc
Dayana Borja, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: “Caracterización
bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea americana) y posterior extracción
e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana y
antioxidante”, previo a la obtención del título de Química de Alimentos presentado por
la señorita Alexandra Elizabeth Aymacaña Albán. APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
CAPÍTULO I .................................................................................................................. 2
EL PROBLEMA ............................................................................................................. 2
1.1. Planteamiento del problema ........................................................................... 2
1.2. Formulación del problema .............................................................................. 3
1.2.1. Preguntas directrices. ............................................................................... 3
1.3. Objetivos ........................................................................................................... 3
1.3.1. General. ..................................................................................................... 3
1.3.2. Específicos. ................................................................................................ 4
1.4. Justificación e importancia ............................................................................. 4
CAPITULO II ................................................................................................................. 6
MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 6
2.1. Antecedentes ......................................................................................................... 6
2.2.1. Generalidades del Aguacate ......................................................................... 6
2.2.2. Análisis bromatológicos .............................................................................. 10
2.2.3. Componentes químicos de los vegetales .................................................... 14
2.2.4. Métodos de determinación ......................................................................... 18
2.2.5. Antibióticos .................................................................................................. 21
2.2.6. Antioxidantes ............................................................................................... 24
2.3. Marco legal ......................................................................................................... 27
2.4. Hipótesis .............................................................................................................. 28
2.5. Conceptualización de variables ........................................................................ 29
2.5.1. Variables independientes ............................................................................ 29
2.5.2. Variables dependientes ............................................................................... 29
CAPITULO III ............................................................................................................. 30
MARCO METODOLÓGICO ..................................................................................... 30
3.1. Diseño de la investigación ............................................................................. 30
3.2. Población y muestra....................................................................................... 30
3.3. Materiales y métodos ..................................................................................... 30
3.3.1. Materiales ..................................................................................................... 31
3.3.2. Métodos ........................................................................................................ 32
3.4. Operacionalización de las variables ............................................................. 41
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3.5. Diseño experimental ...................................................................................... 42
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos ........................................ 42
3.7. Procesamiento de datos y análisis de datos ................................................. 42
CAPITULO IV.............................................................................................................. 45
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ....................................................... 45
4.1. Análisis bromatológico .................................................................................. 45
4.1.1. Análisis de comparación de medias ...................................................... 45
4.2. Extracción ....................................................................................................... 46
4.3. Fraccionamiento............................................................................................. 47
4.4. Tamizaje Fitoquímico .................................................................................... 48
4.5. Cuantificación de fenoles totales .................................................................. 57
4.6. Cuantificación de flavonoides totales ........................................................... 59
4.7. Actividad antioxidante .................................................................................. 61
4.8. Actividad antimicrobiana ............................................................................. 66
CAPÍTULO V ............................................................................................................... 73
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ......................................................... 73
5.1. CONCLUSIONES ......................................................................................... 73
5.2. RECOMENDACIONES ............................................................................... 74
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 75
ix
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Árbol de problemas ......................................................................................... 80
Anexo 2. Categorización de variables ........................................................................... 81
Anexo 3. Certificación de la obtención de la muestra. .................................................. 82
Anexo 4. Puntos críticos para la distribución T de Student. ......................................... 83
Anexo 5. Valores críticos de F para una prueba de dos colas (p=0,05). ...................... 84
Anexo 6.Proceso de preparación de la muestra. ........................................................... 85
Anexo 7. Proceso de extracción. .................................................................................... 87
Anexo 8.Pruebas cualitativas para el tamizaje fitoquímico. ......................................... 89
Anexo 9. Resultados de placas de cromatografía en capa fina ..................................... 90
Anexo 10.Ensayo de la actividad antimicrobiana por el método de microdilución en
placa. .............................................................................................................................. 91
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.Clasificación taxonómica del aguacate .............................................................. 7
Tabla 2. Composición proximal del aguacate por 100g (pulpa) ..................................... 8
Tabla 3. Análisis Bromatológico de la cáscara de aguacate de tres variedades
diferentes. ......................................................................................................................... 8
Tabla 4. Zonas de cultivo para aguacate Hass en Ecuador ............................................ 9
Tabla 5. Obtención de extractos y los compuestos químicos ......................................... 20
Tabla 6. Técnicas analíticas para el análisis de compuestos químicos vegetales ......... 21
Tabla 7. Susceptibilidad antimicrobiana de Ceftriaxona frente a diferentes bacterias. 24
Tabla 8. Clasificación de los antioxidantes ................................................................... 24
Tabla 9. Materiales, equipos y reactivos a utilizar en el trabajo de investigación. ...... 31
Tabla 10. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de la
primera fracción. ............................................................................................................ 34
Tabla 11. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de la
segunda fracción ............................................................................................................ 35
Tabla 12. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de la
tercera fracción. ............................................................................................................. 35
Tabla 13. Criterios de interpretación de pruebas cualitativas. ..................................... 36
Tabla 14. Fase móvil y revelador utilizados en la cromatografía. ................................ 37
Tabla 15. Diluciones para la curva de calibración de Quercetina. .............................. 38
Tabla 16. Diluciones para el método DPPH ................................................................. 39
Tabla 17. Factores y niveles del diseño experimental. .................................................. 42
Tabla 18. Tabla de ANOVA con dos factores. ............................................................... 43
Tabla 19. Resultados del análisis de comparación de medias en base seca. ................ 46
Tabla 20. Datos obtenidos del proceso de extracción. .................................................. 47
Tabla 21. Resultados del fraccionamiento. .................................................................... 47
Tabla 22. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las diferentes fracciones de
la cáscara de aguacate. .................................................................................................. 49
Tabla 23. Resumen del tamizaje fitoquímico. ................................................................ 54
Tabla 24. Resultados de la cromatografía de capa fina. ............................................... 56
Tabla 25. Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina. ............................................. 56
Tabla 26. Datos de concentración y absorbancia de ácido gálico. ............................... 57
Tabla 27. Resultados de la concentración de fenoles totales. ....................................... 58
xi
Tabla 28. Datos de concentración y absorbancia de Quercetina. ................................. 59
Tabla 29. Resultados de la concentración de flavonoides totales. ................................ 60
Tabla 30. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición del ácido ascórbico.
........................................................................................................................................ 61
Tabla 31. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición del extracto total de
la variedad Hass y Fuerte. ............................................................................................. 62
Tabla 32.Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la fracción
acuosa de la variedad Hass y Fuerte. ............................................................................ 63
Tabla 33. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la fracción éter
dietílico de la variedad Hass y Fuerte ........................................................................... 64
Tabla 34. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la fracción NaCl
de la cáscara Hass.......................................................................................................... 65
Tabla 35. Resultados de la absorbancia de los extractos y fracciones frente a
Escherichia coli. ............................................................................................................. 66
Tabla 36. Resultados de la absorbancia del blanco, control positivo y antibiótico frente
a Escherichia coli ........................................................................................................... 67
Tabla 37. Porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones frente a Escherichia
coli. ................................................................................................................................. 67
Tabla 38. Resultados del análisis de varianza frente a Escherichia coli en las
fracciones de la variedad Hass. ..................................................................................... 68
Tabla 39.Resultados del análisis de varianza frente a Escherichia coli en las fracciones
de la variedad Fuerte. .................................................................................................... 69
Tabla 40. Resultados de la absorbancia de los extractos y fracciones frente a
Staphylococcus aureus. .................................................................................................. 70
Tabla 41.Resultados de la absorbancia del blanco, control positivo y antibiótico frente
a Staphylococcus aureus ................................................................................................ 70
Tabla 42.Porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones frente a Staphylococcus
aureus. ............................................................................................................................ 71
Tabla 43. Resultados del análisis de varianza frente a Staphylococcus aureus en las
fracciones de la variedad Hass. ..................................................................................... 71
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de algunos de los núcleos alcaloides más sencillos .................... 15
Figura 2. Estructura alcaloides ternarios no oxigenados ............................................. 16
Figura 3. Estructura alcaloides cuaternarios................................................................ 16
Figura 4. Estructuras químicas de los ácidos: cinámico (A), p-cumárico (B), cafeico
(C), ferúlico (D) y sinápico (E) ...................................................................................... 17
Figura 5. Estructura general de compuestos flavonoides ............................................. 17
Figura 6. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante. .. 27
Figura 7. Esquema de distribución para el método de microdilución en placa. ........... 41
Figura 8. Curva de calibración de ácido gálico. ........................................................... 58
Figura 9.Curva de calibración de quercetina. .............................................................. 60
Figura 10. Porcentaje de inhibición vs concentración de ácido ascórbico. ................. 61
Figura 11. Porcentaje de inhibición vs volumen del extracto total de la variedad Hass
y Fuerte. .......................................................................................................................... 62
Figura 12. Porcentaje de inhibición vs concentración de la fracción acuosa de la
cáscara Hass. ................................................................................................................. 63
Figura 13. Porcentaje de inhibición vs volumen de la fracción éter dietílico de la
variedad Hass y Fuerte. ................................................................................................. 64
Figura 14. Porcentaje de inhibición vs volumen de la fracción NaCl de la cáscara
Hass. ............................................................................................................................... 65
Figura 15. Resumen de las gráficas de la actividad antioxidante ................................. 66
xiii
Tema: Caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea americana) y
posterior extracción e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana
y antioxidante.
Autor: Alexandra Aymacaña Albán
Tutora: MSc. Dayana Borja Espín
Cotutora: Msc. Lorena Goetschel
RESUMEN
El presente trabajo de investigación tiene como finalidad caracterizar la cáscara de
aguacate (Persea americana) de dos variedades, Hass y Fuerte, mediante el análisis de
su composición proximal, asi como la identificación de las fracciones responsables de
su actividad antimicrobiana y antioxidante. El análisis bromatológico se realizó en base
seca obteniendo como resultados los siguientes porcentajes de la variedad Hass: 9,46%
humedad, 6,65% ceniza, 7,42% proteína, 13,67% grasa, 46,59% fibra cruda y 16,24%
carbohidratos, variedad Fuerte: 9,10% humedad, 7,71% ceniza, 6,49% proteína,
20,41% grasa, 39,26% fibra cruda y 17,05% carbohidratos. La extracción se realizó
mediante maceración con etanol al 96%, al extracto se le realizó tres fraccionamientos
para obtener diferentes fracciones. Los ensayos cualitativos de tamizaje fitoquímicos se
realizaron sobre cada fracción identificando la presencia de: triterpenos y/o esteroides,
aminas, quinonas, compuestos fenólicos y/o taninos, compuestos grasos y alcaloides en
la variedad Hass. Para la variedad Fuerte triterpenos y/o esteroides, compuestos grasos,
saponinas, aminas, quinonas, compuestos fenólicos y/o taninos. El ensayo de actividad
antimicrobiana se realizó mediante el método de microdilución en placa frente a dos
cepas bacterianas, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, usando el extracto total y
las fracciones, donde la variedad Hass tuvo mayor porcentaje de inhibición de 72,95%
en la fracción éter dietílico frente a Escherichia coli y el porcentaje de inhibición frente
a Staphylococcus aureus fue de 72,62% en la fracción NaCl. En la actividad
antioxidante se utilizó el método del DPPH, donde la fracción con mayor capacidad de
inhibir la actividad del DPPH es la fracción acuosa de la variedad Fuerte con 74,35%
de inhibición con un volumen de extracto de 0,002 ml.
Palabras claves: Persea americana, extracción, análisis bromatológico, tamizaje
fitoquímico.
xiv
ABSTRACT
The present research work has as a purpose to characterize the avocado´s peel (Persea
americana) two varieties; Hass and Strong through the analysis of its proximal
composition and the identification of the fractions responsible for its antimicrobial and
antioxidant activity. Bromatological analysis was made on dry basis getting as results
the following percentages of the Hass variety 9.46% humidity, 6.65% ash, 7.42%
protein, 13.67% fat, 46.59% raw fiber, 16.24% carbohydrates. About Strong variety;
9.10% humidity, 7.71% ash, 6.49% protein, 20.41% fat, 39.26% raw fiber, 17.05%
carbohydrates. The extraction was done by maceration with the 96% ethanol solvent.
The extract was applied in three different analytical marches in order to get different
fractions. Qualitative tests of phytochemical screening were made on each fraction to
identify the presence of: triterpenes and / or steroids amines; quinones; phenolic
compounds and / or tannins. Determination of antimicrobial activity was made by
microdilution technique in plate against two bacterial strains; Escherichia coli and
Staphylococcus aureus. The total extract and the fractions were used in Hass variety
with the highest inhibition percent; 72,95% in the diethyl ether fraction with
Escherichia coli and the percentage of inhibition with Staphylococcus aureus was
72.62% in the NaCl fraction. The DPPH method was used in the antioxidant activity; in
that case the fraction with the greatest capacity to inhibit the activity of DPPH is the
aqueous fraction of the Strong variety; 74.35% inhibition with an extract volume of
0.002 ml.
Key words: Persea americana, extraction, bromatological analysis, phytochemical
screening.
1
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo de investigación se realizó la caracterización
bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea americana) de dos variedades, Hass y
Fuerte, y posterior extracción e identificación de la fracción con mayor actividad
antimicrobiana y antioxidante.
En el capítulo 1 “El Problema”, se especifica el planteamiento del problema
donde se explica la problemática que conllevó a realizar este proyecto de investigación;
la formulación del problema y por último la justificación, donde se detalla la
importancia de este trabajo de investigación.
En el capítulo 2 “Marco teórico”, se explican cómo antecedentes varias
investigaciones realizadas sobre la cáscara de aguacate, composición y los diferentes
usos que se le da al extracto antioxidante de la cáscara de aguate. También se detalla
información sobre el aguacate, análisis proximal de los alimentos, métodos de
extracción, componentes químicos de los vegetales, etc. Por último, se presentan las
hipótesis, se definen las variables y el marco legal donde se detallan las políticas y
reglamentos que involucran el desarrollo del trabajo de investigación.
En el capítulo 3 “Metodología”, se establece el tipo, nivel y paradigma de
investigación al que pertenece el proyecto de investigación, se detalla la población,
muestra, métodos y materiales que se van a utilizar en la parte experimental.
En el capítulo 4 “Análisis y discusión de resultados”, contiene los resultados
obtenidos, así como su análisis y discusión de estos.
En el capítulo 5 “Conclusiones y Recomendaciones” se detallan las conclusiones
generales y específicas de acuerdo con los objetivos propuestos y las recomendaciones
para futuras investigaciones.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1. Planteamiento del problema
La agricultura es el conjunto de actividades desarrolladas por el hombre,
destinados a cultivar la tierra, las actividades agrícolas suelen estar destinadas a la
producción de alimentos y a la obtención de verduras, frutas, hortalizas y cereales. La
agricultura implica la transformación del medio ambiente para satisfacer las
necesidades del hombre. (Borja & Ramón, 2012)
La agricultura desempeña un papel crucial en la economía de un país; es la
columna vertebral de nuestro sistema económico; no sólo proporciona alimentos y
materias primas, sino también oportunidades de empleo a una importante cantidad de
población. (UTN, 2017)
En la última década el sector agropecuario ecuatoriano se desenvolvió con
dinamismo y relevancia, presentando tasas de crecimiento interanual del 3% (2006-
2012) y 5% (2012-2015). Los cultivos de banano, café y cacao fueron los rubros que
más aportaron al desarrollo del sector agropecuario (6.5%), seguido por la actividad de
silvicultura (3.3%). La producción agrícola se ha incrementado en un 38%; y los
precios internacionales de los principales productos de exportación han favorecido al
monto exportable (2013- 2015: cacao 28% y banano 5% de ascenso). El aumento en la
producción nacional ha sido estructurado por el crecimiento productivo en los cultivos
de caña de azúcar, banano y maíz duro seco. El PIB Agropecuario cerró el 2016 con un
descenso de 0.8% (USD 5.3 mil millones a precios constantes) y su participación en la
economía nacional fue de 8% (0.1 puntos porcentuales más con respecto al 2015).
(Monteros Guerrero, 2016)
La agricultura ocupa un lugar importante en el desarrollo de una economía. De
hecho, es una condición previa para el crecimiento económico del país, pero así mismo
la agricultura genera grandes cantidades de subproductos o residuos de difícil
degradación en el medio ambiente derivados del uso y mantenimiento de las
explotaciones agrícolas, entre ellos se destacan, tanto cualitativa, como
cuantitativamente: residuos plásticos, vegetales, de envases de pesticidas y otros.
(Infoagro, 2006)
La producción de residuos se ha incrementado de forma exponencial en las
últimas décadas, siendo los de naturaleza orgánica o biodegradable de los más
importantes, como los residuos orgánicos de distinta naturaleza tales como los
ganaderos (ovino, caprino, porcino y avícola y sus correspondientes estiércoles),
agrícolas de cultivos extensivos (arroz, maíz, trigo, soja, etc.), residuos agroindustriales
(industria azucarera, vitivinícola, producción de aceites vegetales, etc.), poniendo de
3
manifiesto la enorme variedad tanto en su naturaleza como en la producción de tales
residuos, teniendo un enorme potencial como fuente de materia orgánica. (Tortosa,
2009)
Con lo mencionado anteriormente la agricultura es una actividad que se va a
seguir incrementando conforme aumente la población es por ello qué al pasar de los
años la agricultura va a seguir desarrollándose para el bien del hombre y con ello la
generación de subproductos va a aumentar es por eso qué se produce la necesidad de
aprovechar las propiedades de los residuos con el fin de reducir el impacto ambiental y
beneficiar a los mismos productores.
1.2. Formulación del problema
¿Cuáles son los grupos de compuestos fitoquímicos de la cáscara de aguacate
(Persea americana) responsables de su efecto antimicrobiano y antioxidante?
1.2.1. Preguntas directrices.
¿Qué porcentaje de humedad, cenizas, fibra, grasa, proteína y
carbohidratos tiene la cáscara de aguacate (Persea americana)?
¿Cómo extraer los compuestos fitoquímicos de la cáscara de aguacate
(Persea americana)?
¿Cómo identificar los grupos o familias de la cáscara de aguacate
(Persea americana)?
¿Cómo identificar los compuestos antioxidantes de la cáscara de
aguacate (Persea americana)?
¿Cómo evaluar la capacidad antimicrobiana de los compuestos
fitoquímicos de la cáscara de aguacate (Persea americana)?
¿Existen diferencias en la capacidad antioxidante y antimicrobiana de las
dos variedades de la cáscara de aguacate Hass y Fuerte?
1.3. Objetivos
1.3.1. General.
Realizar la caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea
americana) de las variedades Hass y Fuerte, y posterior extracción e identificación de la
fracción con mayor actividad antimicrobiana y antioxidante.
4
1.3.2. Específicos.
Determinar la composición proximal de la cáscara de aguacate (Persea
americana) mediante el cálculo en porcentaje de humedad, ceniza, grasa,
fibra, proteína y carbohidratos de las variedades: “Hass” y “Fuerte”.
Realizar una extracción mediante maceración con etanol al 96%.
Identificar los grupos o familias presentes en las fracciones de la cáscara
de aguacate mediante pruebas cualitativas de tamizaje fitoquímico.
Evaluar la actividad antioxidante de los extractos obtenidos, mediante el
método DPPH.
Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos sobre
microorganismos, mediante el ensayo de microdilución en placa.
Comparar los resultados de las actividades antioxidante y antimicrobiana
entre las cáscaras de aguacate Hass y Fuerte.
1.4. Justificación e importancia
Los desechos generados por las industrias proporcionan consecuencias negativas
sobre el medio ambiente y la salud humana, como la contaminación del agua, suelo y
aire, la generación de gases de efecto invernadero, que entre otras causas se debe a la
inadecuada gestión de residuos. Una buena gestión de residuos sólidos es más que
contar con una ciudad limpia, se evidencia con la mejora de la economía y el medio
ambiente mediante “un impacto respecto a lo que realmente importa: la calidad de vida
de los residentes urbanos”.
Los subproductos obtenidos de la producción de productos elaborados a base de
aguacate constituyen una fuente de biomasa fácilmente disponible para la utilización de
materia prima en el desarrollo de nuevos productos, lo cual otorga valor añadido a
materiales considerados como desechos, en este caso la cáscara de aguacate. La pulpa o
porción comestible contiene muy poco azúcar, menos de 1.5 a 3.5 por ciento antes de su
maduración y de 0.25 a 1.8 por ciento en los maduros; contiene un gran porcentaje de
proteínas y grasas; el azúcar tiende a bajar mientras aumenta el contenido de grasas, que
a veces llega hasta el 20 por ciento. El aceite es altamente digestivo y similar al aceite
de oliva, aunque cambia según la variedad, con respecto a vitaminas, posee cantidades
moderadas de A y B. (Secretaria General de la Organización de los Estados
Americanos, 2012)
El Aguacate es uno de los frutales de mayor interés para su cultivo en los valles
Interandinos del Ecuador, así en 1997, la estimación de la superficie cultivada fue de
3005 has, con rendimientos de 14.996 kg/ha, siendo las Provincias de Pichincha,
Imbabura y Tungurahua las de mayor extensión. Este fruto es consumido por todos los
ecuatorianos y cada día tiene mayor aceptación en el mercado nacional lo que ha
incentivado su cultivo. (León, 1999)
5
En Carchi, Imbabura y Tungurahua se determinó la rentabilidad del aguacate, se
establecieron: costos de producción, y se determinó la rentabilidad. Los costos de
producción obtenidos fueron: Aguacate variedad Fuerte = 177 702.71 USD/ha,
Aguacate variedad Hass = 199 077.39 USD/ha. (Pilapaña, 2013)
La industria del aguacate ha ido creciendo entre sus productos más conocidos se
encuentra el aceite muy valorado por sus propiedades nutricionales y sus beneficios
para la salud. En el Ecuador hay fabricantes de productos derivados como es la pulpa de
aguacate. El aguacate Hass es la variedad de aguacate más conocida a nivel mundial por
su calidad de pulpa y contenido de aceite es la preferida para el consumo en guacamole,
jugos, helados entre otros. Como un producto nuevo se lanzó al mercado la mantequilla
de aceite de aguacate, un producto que es elaborado con aguacate Hass.
Con los antecedentes mencionados, la importancia de este trabajo es evidente ya
que la producción de productos elaborados a base de aguacate va a continuar y presenta
un patrón de crecimiento, esto implica la generación de grandes cantidades de
subproductos, siendo la cáscara uno de los más importantes y menos valorados en la
industria. El realizar un estudio a profundidad de la composición bromatológica,
actividad antimicrobiana y actividad antioxidante de la cáscara de aguacate, permitirá
identificar nuevas aplicaciones de esta, la cual es considerada como desecho y sin
ninguna función. También se va a reducir la generación de residuos orgánicos
mejorando el medio ambiente, la economía y la salud de las personas.
6
CAPITULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes
En varios países el aguacate es un producto con gran interés económico, un
ejemplo es Colombia el cual tiene muchas áreas cultivadas con este producto y se
consume fresco o se elaboran varios productos, lo que lleva a la generación de desechos
los cuales no son aprovechados, mediante un estudio bibliográfico realizado por Muñoz
& Rojas (2016) se determinó el potencial de cáscaras y semillas del aguacate,
encontrando fitoquímicos y polifenoles, que son compuestos de interés en las industrias
de alimentos, farmacéutica, cosmética y ambiental, también tienen capacidad
antioxidante y antimicrobianas.
Otro estudio realizado en Colombia por Barreto (2014) sobre la Actividad
antioxidante de los residuos del aguacate Hass (Persea americana Mill. var Hass)
sometidos a extracciones clásicas y a fluidos presurizados, en el cual obtuvo extractos a
partir de la semilla y cáscara del aguacate, que son capaces de proteger la oleína de
palma y la carne de res cruda de la oxidación lipídica. En este estudio se utilizó una
extracción Soxhlet a presión reducida empleando como solvente hexano, acetato de
etilo y etanol.
En México también se ha estudiado la actividad antioxidante del aguacate a
partir de extractos de cáscara y semilla, comparándola con extractos de planta de tomate
y granada, donde como conclusión se encontró que la extracción metanólica de la
cáscara de aguacate fue la más efectiva con la mayor capacidad antioxidante.
(Hernández, Ruíz, Rodriguez, Gassos, & Valenzuela, 2007)
Chávez (2012), preparó extractos metanólicos y acetónicos de cáscaras y
semillas de aguacate pulverizados en forma fresca, los extractos obtenidos fueron
evaluados para determinar la actividad antioxidante, así como fenoles, flavonoides,
clorofilas y carotenoides totales. La actividad antimicrobiana se la realizó con
Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Listeria monocytogenes y Staphylococcus
aureus, la actividad antioxidante más eficiente fue la polifenólica y en cuanto a la
actividad antimicrobiana fue mayor en extractos de semillas.
2.2. Marco teórico
2.2.1. Generalidades del Aguacate
El aguacate es el fruto del árbol del mismo nombre, de hoja perenne de la
familia Lauráceae. Con forma de pera, en su interior contiene una única semilla
redondeada de color claro y 2-4 cm de longitud (salvo la variedad dátil), que aparece
7
recubierta de una delgada capa leñosa de color marrón. El aguacate es originario de
México, Colombia y Venezuela. Los antiguos aztecas lo llamaban ahuacatl (testículo),
ya que se le consideraba como un fruto afrodisíaco. Los primeros españoles que
llegaron a América lo bautizaron con el nombre de «pera de las Indias», por su
semejanza externa con las peras españolas. (Mejia, 2011)
2.2.1.1. Taxonomía del aguacate
De acuerdo con la clasificación taxonómica el aguacate se ubica de la siguiente
manera en la tabla 1.
Tabla 1.Clasificación taxonómica del aguacate
Reino Vegetal
División Spermatophyta
Subdivisión Angiosperma
Clase Dicotiledónea
Subclase Dipétala
Orden Ranales
Familia Lauraceae
Género Persea
Especie Persea americana
Fuente: (Mejia, 2011)
2.2.1.2. Composición del aguacate
El contenido de agua del aguacate es inferior al encontrado en la mayoría de las
frutas, mientras que el aporte de lípidos, como en el caso de la aceituna, es muy
superior, lo que aumenta su valor calórico. Las grasas que contiene son en su mayor
parte insaturadas (monoinsaturadas), destacando en particular el elevado contenido en
ácido oleico. Además, el aguacate es una de las frutas más ricas en fibra, tanto de tipo
soluble como insoluble, siendo más abundante esta última. Es rico en minerales como el
magnesio y el potasio. Y en cuanto a su composición vitamínica, el aguacate aporta
cantidades destacables de vitamina E —potente antioxidante—, a diferencia del resto de
las frutas que apenas la contienen. Además, su consumo contribuye a cubrir las
necesidades de otras vitaminas como la vitamina C, y, en menor grado, la vitamina B6.
(FEN, 2010)
En la tabla 2 se muestra la composición proximal del aguacate tomada de la
United States Department of Agriculture (USDA).
8
Tabla 2. Composición proximal del aguacate por 100g (pulpa)
Nutriente Valor por 100g
Agua 72,33 g
Energía 167 Kcal
Proteína 1,96 g
Lípidos totales (grasas) 15,41 g
Carbohidratos por
diferencia
8,64 g
Fibra dietética total 6,8 g
Azucares totales 0,30 g
Fuente: (USDA, 2016)
En la tabla 3 se indica los resultados del análisis bromatológico realizado a la
cáscara de tres variedades de aguacate en su maduración fisiológica. Esta tabla se
obtuvo de un estudio realizado por Ceballos Adela y Montoya Sandra titulado”
Evaluación química de la fibra en semilla, pulpa y cáscara de tres variedades de
aguacate”.
Tabla 3. Análisis Bromatológico de la cáscara de aguacate de tres variedades
diferentes.
Parámetro Variedad
Booth8 Trinidad Papelillo
% Humedad total 70,79 73,36 86,68
% Materia seca 29,21 26,64 13,32
% Nitrógeno total 0,93 0,93 1,48
% Proteína Bruta 5,81 5,81 9,25
% Grasa Total 4,24 10,14 8,67
% Fibra Bruta 53,40 57,13 17,21
% Cenizas Totales 3,69 3,86 9,93
% Fósforo 0,06 0,06 0,08
% Calcio 0,03 0,01 0,04
% Magnesio 0,03 0,03 0,05
% Potasio 0,46 0,59 1,16
9
% Sodio 0,00 0,01 0,00
Hierro ppm 67,80 65,30 53,30
Magnesio ppm 3,13 0,33 0,05
Zinc ppm 13,68 12,38 20,28
Cobre ppm 2,78 4,88 6,78
Fuente: (Ceballos & Montoya, 2013)
2.2.1.3. Producción de Aguacate
El cultivo del aguacate en el Ecuador tiene un futuro promisorio debido a que el
clima y los suelos son excepcionales en los valles Andinos desde Carchi hasta Loja. En
el país tenemos las tres razas de aguacates: antillanos, mexicanos y guatemaltecos,
diseminados en las zonas del Litoral (antillanos), los valles abrigados de la serranía
(mexicanos y guatemaltecos), incluso en la zona amazónica hay presencia de antillanos
nativos. (Reinoso, 2016)
En Ecuador Según el Censo Agropecuario (2002), existían 2300 ha de aguacate
en huertos como monocultivo, y en asocio con especies perennes y/o anuales 5.500 has.
La Dirección de Información Geográfica y Agropecuaria del MAGAP (2008), señala
que en el país existen 1.216 ha de aguacate guatemaltecos, 1. 491 ha de aguacates
nacionales y antillanos y 500 ha se encuentran sembradas con la variedad Hass.
Tabla 4. Zonas de cultivo para aguacate Hass en Ecuador
Provincia Sector
Carchi Bolívar y Mira.
Imbabura Ibarra, Antonio Ante, Urcuqui, Pimampiro y
Cotacachi
Pichincha Guayllabamba, Puéllaro, Perucho, San José de
Minas, Yaruquí, Checa y Quinche
Tungurahua Patate y Baños
Chimborazo Cumandá, Chunchi, Pallatanga
Bolívar Echandía, Balsapamba
Azuay Paute, Gualaceo, Santa Isabel
Loja
Macará, Calvas, Catamayo, Chaguarpamba,
Espíndola, Gonzanamá, Olmedo, Paltas, Pindal,
Puyango, Sozonango, Zapotillo
El Oro La Hoya del Puyango, Balsas, Piñas, Portovelo,
10
Santa Rosa, Zaruma
Península de Santa Elena Santa Elena.
Santo Domingo de los
Tsáchilas Concordia
Esmeraldas La Unión.
(Reinoso, 2016)
2.2.2. Análisis bromatológicos
El análisis de los alimentos asegura que estos sean aptos para el consumo y que
cumplan con las características y composición adecuadas. La composición global de un
alimento constituye una etapa preliminar obligatoria que es la obtención de datos que
miden la eficacia nutricional de diversos componentes y se debe disponer de varias
técnicas en alimentos, una de ellas es la frescura del alimento, métodos fisicoquímicos,
con ello proporcionan resultados con significación nutricional, y microbiológicos.
(Musoq, 2009)
La composición química por cuantificación de los componentes se la realiza
identificando los grupos de componentes como lo son sólidos totales, cenizas, fibra,
grasas, proteínas, etc. Dependiendo de la naturaleza de la muestra los procedimientos
pueden ser modificados.
2.2.2.1. Determinación de humedad
Todos los alimentos, cualquiera que sea el método de industrialización a que
hayan sido sometidos, contienen agua en mayor o menor proporción. Las cifras de
contenido en agua varían entre un 60 y un 95% en los alimentos naturales. En los
tejidos vegetales y animales, puede decirse que existe en dos formas generales: “agua
libre” y “agua ligada”. El agua libre o absorbida, que es la forma predominante, se
libera con gran facilidad. El agua ligada se halla combinada o absorbida. Se encuentra
en los alimentos como agua de cristalización (en los hidratos) o ligada a las proteínas y
a las moléculas de sacáridos y absorbida sobre la superficie de las partículas coloidales.
(UNAM, 2008)
Los métodos de secado son los más comunes para valorar el contenido de
humedad en los alimentos; se calcula el porcentaje en agua por la perdida en peso
debida a su eliminación por calentamiento bajo condiciones normalizadas. El principio
operacional del método de determinación de humedad utilizando estufa con o sin
utilización complementaria de vacío, incluye la preparación de la muestra, pesado,
secado, enfriado y pesado nuevamente de la muestra. (García, 2014)
11
El contenido en agua de la muestra se calcula por diferencia de peso y se
expresa en % de humedad (g de H2O/100 g de muestra).
%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎∗ 100 (Ecuación 1)
2.2.2.2. Determinación de ceniza
Las cenizas en los alimentos están constituidas por el residuo inorgánico que
queda después de que la materia orgánica se ha quemado. Las cenizas obtenidas no
tienen necesariamente la misma composición que la materia mineral presente en el
alimento original, ya que pueden existir pérdidas por volatilización o alguna interacción
entre los constituyentes. (Quiminet, 2009)
La ecuación 3 se utiliza para calcular el contenido de ceniza:
%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 =𝐵−𝐴
𝑀∗ 100 (Ecuación 2)
Donde:
A= peso en gramos del crisol vacío
B=peso en gramos del crisol con la muestra calcinada
M=peso en gramos del crisol con la muestra calcinada
2.2.2.3. Determinación de grasa bruta
La determinación cuantitativa del contenido de grasa de una muestra se realiza
mediante extracción con un disolvente lipófilo. La grasa libre se calcula mediante la
extracción directa, sin digestión previa. El método de extracción más extendido es la
extracción sólido-líquido. La muestra preparada se extrae con el disolvente. Tras la
extracción, el disolvente se destila y se pesa el residuo secado. El contenido de grasa
libre se calcula con la diferencia entre el peso inicial y el peso final. (Gerhardt, 2015)
Una extracción completa en el reflujo del disolvente destilado tras un
procedimiento clásico Soxhlet requiere mucho tiempo y dura varias horas.
El químico americano Randall completó el método con una fase de extracción en la que
el cartucho de extracción con la muestra se sumerge en el disolvente caliente,
reduciéndose el tiempo de extracción para la mayor parte de las muestras a menos de
una hora. (Gerhardt, 2015)
La cantidad de grasa extraída se expresa como porcentaje en la siguiente
formula.
%𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 =𝐵−𝐴
𝑀∗ 100 (Ecuación 3)
12
Donde:
A= peso en gramos del vaso vacío
B=peso en gramos del vaso con el residuo de grasa
M=peso en gramos de la muestra
2.2.2.4. Determinación de proteína
El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla
compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos,
que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el
contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método
absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína, pero dicho método se
utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco
práctico. (Santiago, 2017)
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado
en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la
determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros
componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia
de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en
sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila
posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del
borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el
nitrógeno contenido en la muestra. (Santiago, 2017)
%𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 =14∗𝑁∗𝑉∗100∗𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝑚∗1000 (Ecuación 4)
Donde:
V= volumen de ácido consumido
N=normalidad del ácido de valoración
F= factor proteínico (6,25 proteínas en general)
m= peso en gramos de la muestra
2.2.2.5. Determinación de carbohidratos
Los carbohidratos también llamados azúcares o sacáridos son
polihidróxialdehidos o polihidroxicetonas o compuestos polímeros que por hidrolisis
producen polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas. Según el número de unidades de
azúcares sencillos que posean se clasifican en:
13
Monosacáridos o azúcares sencillos, que a su vez pueden ser aldosas
cuando contienen el grupo aldehído o cetosas
cuando contienen el grupo cetona.
Disacáridos que están formados por dos monosacáridos unidos entre sí
por enlaces glucosídicos.
Oligosacáridos que tienen entre tres y diez monosacáridos unidos
también por enlaces glucosídicos.
Polisacáridos que son polímeros naturales con varios miles de unidades
de azúcar sencillo ligadas entre sí. (Iturbe, 2014)
Para la determinación de carbohidratos se encuentra los métodos cualitativos los
cuales se basan en las propiedades físicas de los carbohidratos, entre ellos tenemos
cromatografías en papel y capa fina, cromatografía gas-liquido, intercambio iónico,
electroforesis, refractometría y espectroscopia de rayos infrarrojos. Los métodos
químicos están basados en reacciones que dan origen a compuestos coloreados, como
en el caso de los monosacáridos, también se los puede determinar por su capacidad
reductora y la capacidad de formar complejos coloreados con yodo.
La cuantificación de carbohidratos se la realiza con el análisis proximal por
diferencia, para realizar este análisis primero se determina la humedad, proteína, grasa,
cenizas y fibra cruda de la muestra. El porcentaje de carbohidratos se determina
mediante la siguiente ecuación.
%𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠 = 100 − (𝐴 + 𝐵 + 𝐶 + 𝐷) (Ecuación 5)
Donde:
A=porcentaje de humedad
B=porcentaje de cenizas
C=porcentaje de proteína
D=porcentaje de grasa
2.2.2.6. Determinación de fibra cruda
La fibra representa la porción no digerible de los alimentos y, por consiguiente,
mientras mayor sea su concentración en un producto dado, menor será su valor
alimenticio, aunque es importante recomendarlo para el buen funcionamiento del
intestino. La naturaleza química de la fibra cruda, aun cuando no está bien establecida,
se considera constituida por celulosa, hemicelulosa y lignina. El contenido de fibra en
los vegetales de consumo habitual oscila entre un 3-8% de alimento comestible. En la
fruta es del 1,4-2,4%, siendo la media del 1,6%. Los alimentos más ricos en fibra son el
salvado, las alcachofas, las habas, los espárragos, las espinacas, las judías verdes, las
berenjenas, las acelgas, la col lombarda, los puerros, los tomates y otros. (Bautista,
2008)
14
En la determinación de fibra cruda previamente se elimina el contenido de agua
y grasa de la muestra y se realiza un tratamiento con ácido y álcali. Al final del
procedimiento se obtiene fibra cruda, y minerales, para lo cual se debe corregir los
resultados incinerando la muestra. El porcentaje de fibra cruda se la expresa en la
siguiente ecuación:
%𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 =(𝐷−𝐶)−(𝐹−𝐸)
𝑚∗ 100 (Ecuación 6)
Donde:
D=peso en gramos del filtro más fibra
C=peso en gramos del filtro
F=peso en gramos del crisol más ceniza
E=peso en gramos del crisol
m=peso en gramos de la muestra
2.2.3. Componentes químicos de los vegetales
Los fitoquímicos, como el nombre implica, son los químicos individuales de los
que están formadas las plantas. Las categorías generales de los productos naturales de
las plantas están organizadas muy ampliamente en términos de estado creciente de
oxidación, que incluye a los lípidos, incluyendo los hidrocarburos simples y
funcionalizados, así como los terpenos. Les siguen los productos naturales insaturados
incluyendo el poliacetileno y los compuestos aromáticos. Posteriormente se incluyen las
moléculas primariamente hidrofílicas, incluyendo los azúcares, y se continúa con
aquellas que forman sales, incluyendo alcaloides, aminoácidos y nucleósidos. (Yáñez,
2010)
2.2.3.1. Clasificación de metabolitos secundarios
Los compuestos se clasifican teniendo en cuenta su origen biosintético, las
características estructurales comunes y las propiedades de solubilidad.
- Compuestos nitrogenados y azufrados, caracterizados por poseer
nitrógeno y/o azufre en su estructura, de solubilidad y origen biosintético
diverso, pero mayoritariamente derivados de aminoácidos.
- Compuestos fenólicos, con al menos un grupo hidroxilo unido a uno o
más anillos aromáticos en su estructura química, la mayoría
hidrosolubles y derivados biosintéticamente del ácido shikímico.
- Terpenoides, con la molécula de isopreno como unidad estructural,
liposolubles, y biosintéticamente asociados a la vía del ácido mevalónico
o a la vía gliceraldehído fosfato - ácido pirúvico, dependiendo de la clase
de terpenoides en cuestión.
15
a) Compuestos secundarios nitrogenados, alcaloides: Constituyen un grupo de
numerosos compuestos secundarios nitrogenados aislados tradicionalmente
de plantas vasculares, aunque actualmente se ha reportado también la
presencia de un número creciente de este tipo de metabolitos en algunos
animales, insectos y microorganismos. Estructuralmente contienen uno o
varios átomos de nitrógeno en su molécula, a menudo formando parte de un
anillo heterocíclico. (Ringuelet & Sonia, 2013)
Los núcleos nitrogenados de los alcaloides cíclicos en general son sencillos,
como se muestra en la figura 1:
Figura 1. Estructura de algunos de los núcleos alcaloides más sencillos
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
Según la composición elemental pueden clasificarse en ternarios o cuaternarios:
- Los ternarios o no oxigenados por lo general se presentan como líquidos
oleosos, volátiles y que son arrastrados por vapor de agua, características
16
que se tienen en cuenta para su determinación cuantitativa a través de
una destilación.
Figura 2. Estructura alcaloides ternarios no oxigenados
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
- Los ternarios oxigenados o cuaternarios (formados por C, H, N y O) son
sólidos a temperatura ambiente, fijos y cristalizables. A este grupo
corresponden la mayoría de los alcaloides.
Figura 3. Estructura alcaloides cuaternarios
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
b) Compuestos fenólicos: Los compuestos fenólicos son un grupo muy diverso
de metabolitos secundarios que se caracterizan por poseer uno o más grupos
hidroxilo (-OH), de reacción ácida, unidos a un anillo aromático (grupo
fenol). Los fenoles presentan comportamiento ácido dado que el oxígeno (-
O) del grupo hidroxilo está fuertemente unido al anillo fenilo, mientras que
el enlace relativamente débil entre el -O y el hidrógeno (-H) permite la
disociación de un protón (H+) que puede ser liberado al medio, originando
un ión fenolato cargado negativamente. (Ringuelet & Sonia, 2013)
- Compuestos fenólicos simples, abarcan a su vez tres grupos de
relevancia: los fenilpropanoides simples, las cumarinas y los derivados
del ácido benzoico.
17
Figura 4. Estructuras químicas de los ácidos: cinámico (A), p-cumárico (B),
cafeico (C), ferúlico (D) y sinápico (E)
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
- Flavonoides, Los flavonoides son un grupo muy diverso de compuestos
fenólicos, de los cuales se conocen más de 6.000 estructuras diferentes.
El esqueleto común a todos los integrantes del grupo consta de dos
anillos de seis átomos de carbono (designados con las letras A y B)
unidos mediante un puente de tres átomos de carbono que por lo común
forma un tercer ciclo (anillo C). (Ringuelet & Sonia, 2013)
Figura 5. Estructura general de compuestos flavonoides
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
Dentro de las principales clases de flavonoides están comprendidos: chalconas,
flavanonas, flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavan-3-oles y antocianidinas.
Asimismo, los compuestos flavonoides incluyen a las unidades monoméricas de los
denominados taninos condensados, las proantocianidinas o proantocianidoles.
18
c) Terpenoides: Un gran número de sustancias vegetales están incluidas en este
grupo de metabolitos secundarios o productos naturales denominados
terpenoides. Quizás es el grupo más numeroso, con varios miles de
estructuras descriptas. Todas tienen el mismo precursor biosintético
(isopentenil-PP) y tienen como unidad estructural básica a la molécula de
isopreno, de cadena abierta, ramificada e insaturada. Son liposolubles, o sea
solubles en solventes orgánicos, aunque algunos se encuentran solubles en el
contenido celular por estar formando parte de glicósidos o poseer alguna
transformación estructural.
2.2.4. Métodos de determinación
El método de muestro que se va a elegir depende mucho de la composición
química de los vegetales ya que esta varía entre especies, en las diferentes partes de la
planta y en sus estados fenológicos. La correcta identificación botánica del material es
muy importante en los análisis fitoquímicos, los métodos de análisis fitoquímicos
pueden ser:
a) Histológicos: consisten en la observación de cortes de tejidos que han
sido tratados con reactivos que producen reacciones de coloración o
precipitación ante la presencia de ciertos compuestos que quiere
investigarse. Un ejemplo es la identificación de almidón en tejidos
observando el color azul que se desarrolla ante la reacción con el
reactivo Lugol.
b) Químicos: generalmente comprenden el tratamiento de extractos con
reactivos que dan lugar a la producción de colores o precipitados
característicos.
c) Fisicoquímicos: como el uso de métodos cromatográficos y
espectrométricos u otros métodos a partir de los extractos obtenidos del
material en ensayo.
d) Biológicos: donde se observa el efecto de los extractos vegetales sobre
cultivos de microorganismos, células, tejidos o sobre animales.
(Ringuelet & Sonia, 2013)
La investigación fitoquímica de una planta comprende varios aspectos:
Extracción de los compuestos a analizar a partir de una muestra o
espécimen.
Separación y aislamiento de estos.
Identificación y/o caracterización de los compuestos aislados.
Investigación de las rutas biosintéticas de determinada molécula.
Determinación o valoración cuantitativa.
19
2.2.4.1. Extracción de compuestos orgánicos
La extracción de compuestos orgánicos se la realiza mediante la utilización de
solventes teniendo en cuenta que la estructura sea afín a las sustancias que se quieran
extraer, otro elemento es la polaridad en la cual se considera la solubilidad de un soluto
en un solvente dado, los solventes polares fuertes disuelven solutos iónicos mientras
que los solventes poco polares disuelven a los solutos de baja polaridad. (Ringuelet &
Sonia, 2013)
Desde el punto de vista general los solventes pueden clasificarse en polares y no
polares, existiendo además algunos de polaridad intermedia.
Disolventes polares: la polaridad de estos disolventes está vinculada no
sólo al tipo de uniones interatómicas (de tipo iónicas o covalentes
polares), sino también a la presencia de grupos funcionales polares
(hidroxilo, amino) y la capacidad de formar uniones de tipo puente
hidrógeno. Los compuestos con grupos funcionales polares son solubles
en este tipo de disolventes, siempre que el componente hidrocarbonado
no sea relativamente grande (no más de 4 átomos de carbono, como regla
general). Dentro de esta clase de disolventes encontramos al agua, los
alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol), la dimetilformamida
(DMF), el dimetilsulfóxido (DMSO) y algunos ácidos de bajo peso
molecular como el fórmico y el acético, aunque en este último caso hay
que tener en cuenta la reactividad de estos.
Disolventes no polares: poseen estructura de hidrocarburos, sin grupos
que confieran una marcada polaridad a la molécula. En su estructura
predominan las uniones químicas C-C. Entre éstos, y en orden de
polaridad creciente, encontramos al éter de petróleo, tetracloruro de
carbono, ciclohexano y benceno.
Disolventes de polaridad intermedia: Son, en general, aquellos
disolventes cuya estructura molecular es eléctricamente asimétrica. Es el
caso típico de la 13 molécula de cloroformo, donde la distribución de
polaridades creadas por los distintos tipos de uniones (de tipo covalente)
crea una zona con densidad de carga negativa (átomos de cloro) y otra
con densidad de carga positiva (átomo de hidrógeno) formando un
dipolo. Entre este tipo de disolventes se encuentran también ciertos
compuestos oxigenados que, al no poseer funciones hidroxilo como los
alcoholes, pueden actuar como aceptores, pero no como dadores en
uniones de tipo puente hidrógeno. Es el caso del éter etílico, la acetona y
el acetato de etilo. (Ringuelet & Sonia, 2013)
20
2.2.4.2. Selectividad de solventes de diferentes polaridades
En la obtención de los distintos constituyentes orgánicos existen varios métodos,
el método clásico consiste en una extracción continua del material pulverizado
mediante un equipo soxhlet con diferentes solventes, el cual va a permitir la extracción
de las sustancias de interés.
El material vegetal (seleccionado y pulverizado) es agotado en primer lugar con
un solvente de tipo no polar o de polaridad intermedia: éter de petróleo, benceno,
cloroformo, éter etílico, etc. Luego la muestra es tratada con distintos alcoholes como
etanol, metanol (solventes de tipo polar) y finalmente con agua (Ringuelet & Sonia,
2013). En la tabla 5 se puede observar los extractos que se obtienen y los compuestos
químicos que se pueden encontrar.
Tabla 5. Obtención de extractos y los compuestos químicos
Extracto Compuestos químicos
Etéreo
Materia grasa (lípidos)
Aceites esenciales
Esteroles (triterpenos)
Carotenoides (tetraterpenos)
Alcaloides (bases)
Clorofila
Vitaminas liposolubles
Alcohólico
Azucares simples
Glucósidos triterpénicos
Compuestos fenólicos (taninos, pigmentos flavonoides)
Acuoso
Glúcidos simples
Glucósidos
Alcaloides (sales)
Vitaminas hidrosolubles
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
2.2.4.3. Separación e identificación
La química analítica permite el estudio de componentes fitoquímicos a
través de una serie de diversas técnicas de análisis. Dentro de las técnicas
disponibles, los métodos cromatográficos guardan gran relevancia. Las técnicas
básicas de separación son: cromatografía sobre papel, cromatografía en capa
fina, cromatografía gaseosa (GC) y cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC). La elección de cada una de ellas depende principalmente de las
propiedades de solubilidad y volatilidad de los compuestos a separar. En la tabla
6 se observa las técnicas analíticas.
21
Tabla 6. Técnicas analíticas para el análisis de compuestos químicos vegetales
Técnicas de análisis
Cromatografía
Cromatografía en capa fina (TLC)
Cromatografía gaseosa (GC)
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Cromatografía líquida capilar (-LC)
Electroforesis
Electroforesis en capa fina (TLE)
Isotacoforesis (ITP)
Electroforesis capilar (CE)
Técnicas espectroscópicas
Espectroscopía UV
Espectroscopía infrarrojo (IR)
Espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIR)
Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR)
Espectroscopia de masas (MS)
Fuente: (Ringuelet & Sonia, 2013)
La cromatografía sobre papel es aplicable a los compuestos hidrosolubles de las
plantas, principalmente glúcidos sencillos, aminoácidos, ácidos orgánicos, compuestos
fenólicos. La cromatografía en capa fina se utiliza para separar lípidos, esteroles,
carotenoides, clorofilas. La cromatografía gaseosa se aplica para aislar compuestos
volátiles o que mediante una derivatización dan lugar a compuestos que resultan
volátiles bajo las condiciones de corrida, tales como ácidos grasos, mono y
sesquiterpenos, entre otros. Muchas veces estas técnicas se utilizan en forma
combinada, por ejemplo: cromatografía en capa fina-cromatografía gaseosa, para
separar una clase de compuestos en particular de las plantas. Una técnica muy común
de separación de compuestos en fitoquímica es la electroforesis. En un primer momento
esta técnica se aplicó sólo para separar sustancias con carga como aminoácidos, algunos
alcaloides, aminas, ácidos orgánicos y proteínas. Otras clases de compuestos neutros
(azúcares, fenoles) también pueden ser separados en un campo eléctrico previa
conversión de estos en complejos metálicos. (Ringuelet & Sonia, 2013)
2.2.5. Antibióticos
Los antibióticos constituyen un grupo heterogéneo de sustancias con diferente
comportamiento farmacocinético y farmacodinámico, ejercen una acción específica
sobre alguna estructura o función del microorganismo, tienen elevada potencia
biológica actuando a bajas concentraciones y la toxicidad es selectiva, con una mínima
toxicidad para las células de nuestro organismo. El objetivo de la antibioticoterapia es
controlar y disminuir el número de microorganismos viables, de modo que el sistema
inmunológico sea capaz de eliminar la totalidad de estos. De acuerdo con la interacción
germen-antibiótico, estos fármacos pueden dividirse en: a) bactericidas: su acción es
letal, llevando a la lisis bacteriana; b) bacteriostáticos: a las concentraciones que
22
alcanzan en el suero o tejidos impiden el desarrollo y multiplicación bacteriana, pero sin
llegar a destruir las células. (Seija & Vignoli, 2008)
2.2.5.1. Resistencia a los antibióticos
La resistencia a los antibióticos está aumentando en todo el mundo a niveles
peligrosos. Día tras día están apareciendo y propagándose en todo el planeta nuevos
mecanismos de resistencia que ponen en peligro nuestra capacidad para tratar las
enfermedades infecciosas comunes. Un creciente número de infecciones, como la
neumonía, la tuberculosis, la septicemia, la gonorrea o las enfermedades de transmisión
alimentaria, son cada vez más difíciles, y a veces imposibles, de tratar, a medida que los
antibióticos van perdiendo eficacia. Allí donde los antibióticos se pueden adquirir sin
receta médica para uso humano o veterinario, la aparición y propagación de la
farmacorresistencia empeora. En los países que carecen de directrices terapéuticas
normalizadas, el personal sanitario y veterinario tiene tendencia a prescribirlos, y la
población general a consumirlos, en exceso. La resistencia a los antibióticos se acelera
con el uso indebido y abusivo de estos fármacos y con las deficiencias de la prevención
y control de las infecciones. Se pueden adoptar medidas en todos los niveles de la
sociedad para reducir el impacto de este fenómeno y limitar su propagación. (OMS,
2017)
2.2.5.2. Valoración microbiológica de antibióticos
La actividad de los antibióticos se calcula comparando el grado de inhibición de
los microorganismos determinada por concentraciones conocidas del antibiótico
estudiado y con una sustancia de referencia. Al valorar microbiológicamente un
antibiótico se utilizan dos métodos, el método cilindro-placa (método de difusión en
agar) y el método turbidimétrico. Estos métodos comparan la respuesta del
microorganismo en estudio con una sustancia de referencia y las muestras de
concentraciones de antibióticos conocidas.
- Método de cilindro en placa (difusión en agar): se basa en la difusión del
antibiótico desde un cilindro vertical, a través de una superficie con agar
inoculado con el microorganismo de prueba. La difusión origina zonas
de inhibición del microorganismo cuyo tamaño (diámetro) está en
relación con la concentración del antibiótico. (FEUM, 2015)
- Método Turbidimétrico: se basa en medir espectrofotométricamente el
crecimiento del microorganismo de prueba en un medio de cultivo
líquido que permite su rápido crecimiento y en el que al adicionar
concentraciones crecientes del antibiótico se inhibe el crecimiento en
forma proporcional a la concentración adicionada. (FEUM, 2015)
23
2.2.5.3. Microorganismos de estudio
- Escherichia coli: La bacteria Escherichia coli fue inicialmente aislada y
descrita por el pediatra alemán Escherich en 1885, quien demostró su
existencia como huésped habitual del intestino, se caracteriza por poseer
bacilos Gram negativos, no esporulante, como todas las bacterias Gram -,
la cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana
citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio
periplásmico constituido por peptidoglucano. Esta última estructura
confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones
osmóticas ambientales relativamente elevadas. Es una bacteria mesófila,
su óptimo de desarrollo se encuentra en el entorno de la temperatura
corporal de los animales de sangre caliente (35-43 ºC). (Canet, 2016)
- Staphylococcus aureus: es un microorganismo que se encuentra
ampliamente diseminado en el ambiente ya que posee características
particulares de virulencia y resistencia contra antibióticos. los
estafilococos son un amplio grupo de bacterias Gram positivas, cuyo
diámetro oscila entre 0.5 y 1.5 micras. Se caracterizan porque se dividen
en agrupaciones que asemejan racimos de uva y, a la fecha, se han
reportado 35 especies conocidas con 17 subespecies en el género
Staphylococcus, dicho género tiene una gran capacidad de adaptación,
por lo cual afectan a todas las especies conocidas de mamíferos,
incluyendo a los roedores comunes de laboratorio. (Zendejas, Flores, &
Soto, 2014)
2.2.5.4. Control positivo
Ceftriaxona es un antibiótico bactericida, de acción prolongada para uso
parenteral, y que posee un amplio espectro de actividad contra organismos
grampositivos y gramnegativos como: S. pneumoniae, S. betahaemolyticus, E. coli, P.
mirabilis, K. pneumoniae, Enterobacter, Serratia, Pseudomonas, Borrelia crocidurae,
H. influenzae, S. aureus, S. pyogenes, H. parainfluenzae, H. aphrophilus, Actinobacillus
actinomicetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella
kingae, S. viridans, S. bovis, N. gonorrhoeae, B. fragilis, Clostridium, Peptostrep-
tococcus y N. meningitidis. (Pediamécum, 2015) La tabla 7 muestra la susceptibilidad
de la ceftriaxona frente a diferentes bacterias.
24
Tabla 7. Susceptibilidad antimicrobiana de Ceftriaxona frente a diferentes
bacterias.
Ceftriaxona
Cepas bacterianas
Difusión en disco
(mm) Concentración mínima inhibitoria
(µg/mL) S I R
Escherichia coli ≥23 20-22 ≤19 ≥0,125
Pseudomonas
aeruginosa ≥21 14-20 ≤13 ≥16
Staphylococcus aureus ≥14 11-13 ≤10 ≥4
Fuente: (Sarasti, 2018)
2.2.6. Antioxidantes
Un antioxidante puede ser definido, como cualquier molécula capaz de prevenir
o retardar la oxidación (pérdida de uno o más electrones) de otras moléculas,
generalmente sustratos biológicos como lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. La
oxidación de tales sustratos podrá ser iniciada por dos tipos de especies reactivas: los
radicales libres, y aquellas especies que, sin ser radicales libres, son suficientemente
reactivas para inducir la oxidación de sustratos como los mencionados. (CORFO, 2012)
2.2.6.1. Clasificación de los antioxidantes
Los antioxidantes se clasifican en endógenos, los cuales son fabricados por la
misma célula y los exógenos son los que ingresan al organismo en la dieta o a través de
suplementos como se observa en la tabla 8.
Tabla 8. Clasificación de los antioxidantes
Exógenos Endógenos
Vitamina E Glutatión
Vitamina C Coenzima Q
Betacaroteno Ácido tióctico
Flavonoides
Enzimas:
Superóxidodismutasa (SOD)
Catalasa
Glutatión peroxidasa
Licopeno
Fuente: (Criado & Moya, 2009)
a) Superoxidodismutasa (SOD): es una enzima que cataliza la conversión
de superóxido en peróxido de hidrógeno. Está presente en todas las
25
células, con una concentración diferente en los distintos tejidos
proporcional a la actividad metabólica de cada célula.
b) Catalasa: es una enzima que cataliza la conversión de peróxido de
hidrógeno en oxígeno y agua. Se presenta en forma de hemotetrámero y
se localiza en los peroxisomas.
c) Glutatión peroxidasa (GP): es una enzima selenio dependiente que
cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) a agua y alcohol,
utilizando como agente reductor el glutatión reducido. Existen al menos
3 formas de GP seleno dependientes que difieren en su ubicación y en su
especificidad de sustrato: una forma intracelular o celular, una
extracelular o plasmática y otra con actividad específica para los
fosfolipoperóxidos que, por lo general, está asociada a la membrana
celular.
d) Vitamina E: es un conjunto de compuestos fenólicos conocidos como
tocoferoles y tocotrienoles. El alfa tocoferol es el más común y
biológicamente el que tiene mayor acción vitamínica. Es un antioxidante
lipofílico que se localiza en las membranas celulares, cuya absorción y
transporte se hallan muy vinculados con el de los lípidos. Se considera el
más importante protector de las molé- culas lipídicas, ya que su acción
consiste en proteger de la peroxidación a los ácidos grasos
poliinsaturados de los fosfolípidos de la membrana celular y también en
inhibir la peroxidación de las LDL. Neutraliza el oxígeno singlete,
captura radicales libres hidróxilos, neutraliza peróxidos y captura anión
superóxido para convertirlo en formas menos reactivas.
e) Vitamina C o ácido ascórbico: es un importante antioxidante
hidrosoluble que actúa potenciando el efecto de otros antioxidantes tal
como sucede con la vitamina E y el selenio. No se sintetiza en el
organismo, por lo que debe ser aportada por la dieta. Sus principales
funciones son neutralizar el oxígeno singlete (O2), capturar radicales
hidróxilos y aniones superóxido y regenerar la forma oxidada de
vitamina E una vez que ha reaccionado con un RL. Actúa de forma
sinérgica con la vitamina E, y se ha comprobado que se absorbe mejor si
se encuentra en una formulación que contenga vitamina E.
f) Betacaroteno: es precursor de la vitamina A, importante antioxidante
lipofílico que neutraliza el oxígeno singlete. Su deficiencia puede
provocar queratosis, ceguera nocturna, sequedad ocular y mancha de
Bitot (depósitos blancos de epitelio queratinizado en la esclerótica), así
como disminución de la resistencia a infecciones. Tiene la propiedad de
capturar las ERO producidas en la piel por efecto de la radiación UV, por
lo que es un componente habitual de cremas protectoras solares para
prevenir fotodermatosis e incluso cáncer de piel. Además, es capaz de
regenerar la vitamina C una vez que ha reaccionado con un RL.
26
g) Coenzima Q 10: es un potente antioxidante liposoluble presente en todas
las células del cuerpo que procede de la dieta y también es sintetizado en
el organismo a partir de tirosina, fenilalanina y Acetil CoA. Se encuentra
en todas las membranas celulares, principalmente en la de la
mitocondria, donde participa en la cadena de respiración aeróbica.
Además, potencia la respuesta del sistema inmune (su capacidad de
producir anticuerpos), y como antioxidante es capaz de proteger el ADN
de la acción de radicales libres y también de impedir la peroxidación
lipídica.
h) Melatonina: considerada la principal hormona de la glándula pineal, es
un derivado químico de la serotonina, cuya producción y secreción
máxima tienen lugar durante la noche, es decir, en la oscuridad, y cuya
misión es entrar en todas las células del organismo para realizar en ellas
su función más básica, que consiste en actuar como un potente
neutralizador de radicales libres. La melatonina atrapa al radical OH-
además de estimular enzimas antioxidativas importantes (SOD, GPx y
GR), por lo que es considerada actualmente como un importante
antioxidante.
i) Glutatión: n es el principal antioxidante hidrosoluble en el citoplasma de
la célula. Es una proteína formada por tres aminoácidos: cisteína, glicina
y ácido glutámico. (Criado & Moya, 2009)
2.2.6.2. Valoración de antioxidantes
La mayor parte de los ensayos empleados para la determinación de la actividad
antioxidante de un alimento se basan en la medición de:
La capacidad que tienen los compuestos antioxidantes para reaccionar
con un radical libre determinado.
El potencial que tales compuestos tendrían para reducir un complejo
formado entre iones Fe (III) y el reactivo TPTZ (2, 4,6-tripiridil-s-
triazina).
Entre los ensayos que se basan en la medición de la capacidad de los
antioxidantes para reaccionar con un radical libre son los siguientes:
Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o Capacidad de
Absorción de Radicales de Oxígeno)
Ensayo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, o Capacidad
Antioxidante como Equivalentes Trolox)
Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).
2.2.6.2.1. Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).
27
Este método fue propuesto por Blois (1958) en el cual se demostró por primera
vez la capacidad del radical libre DPPH para aceptar un átomo de hidrógeno (H)
proveniente de una molécula de cisteína. La molécula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo
(DPPH) es conocida como un radical libre estable debido a la deslocalización de un
electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula no se
dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del
electrón también intensifica el color violeta intenso típico del radical, el cual absorbe en
metanol a 517 nm. Cuando la solución de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante
que puede donar un átomo de hidrógeno, el color violeta se desvanece. El cambio de
color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de
los parámetros para las propiedades antioxidantes. Después de aproximadamente tres
décadas este ensayo comenzó a utilizarse rutinariamente para la caracterización de las
propiedades antioxidantes. El procedimiento original para el ensayo DPPH ha sido
adoptado por muchos laboratorios y a pesar de que existen modificaciones a
conveniencia, una revisión detallada de la literatura ha revelado que la mayoría de los
estudios están basados en un tiempo de reacción de 20-30 min en vez de un tiempo de
reacción total de 120 minutos requerido para alcanzar el estado estacionario y completar
la reacción redox. (Tovar, 2013)
Figura 6. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el
antioxidante.
Fuente: (Tovar, 2013)
2.3. Marco legal
El presente trabajo de investigación está integrado con las políticas para el
cumplimiento del Plan Nacional del Buen Vivir.
Política 2.1. “Generar condiciones y capacidades para la inclusión económica, la
promoción social y la erradicación progresiva de la pobreza”
Política 7.2. “Conocer, valorar, conservar y manejar sustentablemente el
patrimonio natural y su biodiversidad terrestre, acuática continental, marina y costera,
con el acceso justo y equitativo a sus beneficios”
28
Política 7.8. “Prevenir, controlar y mitigar la contaminación ambiental en los
procesos de extracción, producción, consumo y postconsumo”
Política 10.1. “Diversificar y generar mayor valor agregado en la producción
nacional”.
Política 10.4. “Impulsar la producción y la productividad de forma sostenible y
sustentable, fomentar la inclusión y redistribuir los factores y recursos de la producción
en el sector agropecuario, acuícola y pesquero”.
La Constitución de la República del Ecuador señala en el Art. 15 que “El Estado
promoverá, en el sector público y privado, el uso de tecnologías ambientalmente
limpias y de energías alternativas no contaminantes y de bajo impacto”.
La Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria en el Art. 24 que “La
sanidad e inocuidad alimentarias tienen por objeto promover una adecuada nutrición y
protección de la salud de las personas; y prevenir, eliminar o reducir la incidencia de
enfermedades que se puedan causar o agravar por el consumo de alimentos
contaminados”.
La Ley Orgánica del Régimen de la Soberanía Alimentaria en el Art. 2 que “El
Estado prevendrá y controlará la introducción y ocurrencia de enfermedades de
animales y vegetales; asimismo promoverá prácticas y tecnologías de producción,
industrialización, conservación y comercialización que permitan alcanzar y afianzar la
inocuidad de los productos. Para lo cual, el Estado mantendrá campañas de erradicación
de plagas y enfermedades en animales y cultivos, fomentando el uso de productos
veterinarios y fitosanitarios amigables con el medio ambiente”.
2.4. Hipótesis
Hipótesis de trabajo (Hi):
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte tienen las mismas
características bromatológicas.
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte posee grupos de
compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antimicrobiana.
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte posee grupos de
compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antioxidante.
Hipótesis nula (Ho):
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte no tienen las mismas
características bromatológicas.
29
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte no posee grupos de
compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antimicrobiana.
- La cáscara de aguacate de la variedad Hass y Fuerte no posee grupos de
compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antioxidante.
2.5. Conceptualización de variables
2.5.1. Variables independientes
V1: Fracciones. Fracciones obtenidas con las diferentes marchas analíticas.
V2: Tipo de Bacterias. Se usarán dos tipos de bacterias, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, en las pruebas de actividad antimicrobiana.
V3: Variedad de aguacate. Se utilizaron dos variedades de aguacate Hass y
Fuerte.
2.5.2. Variables dependientes
V4: Composición proximal de la cáscara de aguacate. Análisis
bromatológicos (humedad, ceniza, proteína, grasa, fibra, carbohidratos) realizados a la
cáscara de aguacate.
V5: Actividad antimicrobiana de los extractos. Se expresa con el porcentaje
de inhibición que se evidencia en el crecimiento de los diferentes tipos de
microorganismos utilizados en los diferentes extractos o fracciones.
V6: Actividad antioxidante de los extractos. Se expresa en el porcentaje de
inhibición, utilizando el método de DPPH.
30
CAPITULO III
MARCO METODOLÓGICO
3.1. Diseño de la investigación
La investigación científica es una actividad en la cual se busca responder
interrogantes y resolver problemas, ayudando a verificar hipótesis que han sido
planteadas en el problema del trabajo de investigación. La investigación científica
consta de paradigmas los cuales son subjetivos, objetivos e intersubjetivo.
En el presente trabajo de investigación se va a trabajar con el paradigma
objetivo, el cual tiene un enfoque cuantitativo que se caracteriza por la recolección de
datos y el análisis de estos, con el que se va a poder contestar las preguntas de
investigación y verificar las hipótesis establecidas anteriormente.
La investigación científica cuenta con 6 niveles de investigación, en este caso el
trabajo de investigación cuenta con más de un nivel como lo es el descriptivo, en el que
se va a analizar y describir la composición del objeto de estudio mediante el análisis
bromatológico. El nivel exploratorio ya que con pruebas cualitativas se obtendrá
información sobre el tema. Por último, el nivel explicativo con el que se va a obtener la
relación entre las variables ya mencionadas.
3.2. Población y muestra
La población para este trabajo de investigación corresponde al aguacate (Persea
americana) de la variedad Hass y Fuerte en estado de maduración el cual proviene de la
finca del INIAP ubicada en Tumbaco, ver Anexo 3. Se tomaron 20 Kg de aguacate de
cada variedad, se utilizó 150 g para el análisis bromatológico. Para la identificación de
los compuestos fitoquímicos se tomó muestras de 150 g para la variedad Hass y Fuerte.
3.3. Materiales y métodos
El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Productos
Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,
ubicada en la Ciudadela Universitaria. El análisis bromatológico se realizó en el
Laboratorio de Análisis de Alimentos ubicado en la Facultad de Ciencias Químicas de
la Universidad Central del Ecuador.
31
3.3.1. Materiales
Tabla 9. Materiales, equipos y reactivos a utilizar en el trabajo de
investigación.
Proceso Materiales Equipos Reactivos
Análisis
Bromatológico
Pinzas para
manipulación de
cápsulas
Desecador con
sustancia
desecante activa
Espátula
Cápsulas de
aluminio
Tubos Kjeldahl de
300 ml
Erlenmeyers de
250 ml
Papel celofán
incoloro
Núcleos de
ebullición
Vasos de vidrio
Crisoles de
porcelana
Embudos de
vidrio
Balanza analítica
Scientech con
resolución de
0,0001 g
Estufa Precisión,
135±2°C
Equipo de
determinación de
proteína (Digestor
y Scrubber marca
Selecta, destilador
marca Velp)
Bureta digital de
50ml marca Brand
Sorbona
Equipo extractor
de grasa marca
Velp
Mufla, 600±20°C
Plancha de
calentamiento
Ácido sulfúrico
concentrado
Catalizador Kjeldahl
Solución de ácido
bórico al 4%
Solución de
hidróxido de sodio
al 40%
Solución valorada
de ácido clorhídrico
0,1N
Éter de petróleo
Agua destilada
Solución de ácido
sulfúrico al 1,25%
Solución de
hidróxido de sodio
al 1,25%
Extracción y
Fraccionamiento
Frascos ámbar de
vidrio de 500 ml
con tapa
Frascos ambar de
vidrio de 30 ml
con tapa
Papel filtro
Matraz Kitasato
Embudo butchner
Manguera
Bomba de vacío
Rotavapor BUCHI
Cámara
cromatográfica
Lámpara de luz
UV 254 y 396 nm
Solvente para la
extracción (etanol al
96%)
Solventes para las
marchas analíticas
(Hexano,
cloroformo, cloruro
de sodio, n- butanol,
acetato de etilo)
32
Tamizaje
Fitoquímico
Pipetas
volumétricas
Tubos de ensayo
Gradilla
Reactivo de
Dragendorff
Tricloruro de hierro
al 5%
Ácido clorhídrico
concentrado
Cinta de magnesio
metálico
Solución de cloruro
férrico al 5%
Ensayo de
actividad
antimicrobiana
Caldo nutritivo
Caldo BHI
Tubos de ensayo
Pipetas
automáticas
Mechero Bunsen
Hisopos
Asa de
inoculación
Placa de
microdilución
Equipo de
protección
personal
Incubadora
Cabina de
seguridad
biológica tipo II
Autoclave
Lector de
microplacas
multimodo híbrido
(Programa Gen
5TM)
Ensayo DPPH
Matraces aforados
Erlenmeyer
Probeta
Pipetas
Espectrofotómetro
UV-visible
Cubetas de cuarzo
2,2-difenil-1-
picrilhidrazil
(DPPH)
Metanol 80%
Ácido ascórbico
Elaborado por: Aymacaña A.
3.3.2. Métodos
3.3.2.1. Muestreo
Una vez identificada la población de estudio, así como el lugar de toma de
muestra, el proceso se llevó a cabo según los parámetros establecidos en la Norma
INEN 1750 correspondiente a “Hortalizas y frutas frescas. Muestreo”
33
3.3.2.2 Análisis bromatológico.
Antes de realizar el análisis bromatológico, las muestras de cáscara de aguacate
fueron sometidas a un proceso de limpieza, lavado, secado y reducción de tamaño de
partícula.
a) Determinación de humedad: el ensayo se realizó a mediante la NTE INEN
518
b) Determinación de proteína: el ensayo se realizó mediante la NTE INEN 519
c) Determinación de grasa: el ensayo se realizó mediante la NTE INEN 523
d) Determinación de cenizas: el ensayo se realizó mediante la NTE INEN 520
e) Determinación de fibra cruda: el ensayo se realizó mediante la NTE INEN
522
3.3.2.3 Extracción
El proceso de extracción consiste en una maceración para la obtención del
extracto.
1. Tratar la muestra con procesos de limpieza, lavado, secado y reducción de
tamaño de partícula.
2. Pesar 150 g de la muestra previamente tratada.
3. Añadir 200 ml de etanol al 96%
4. Macerar durante 48 horas a temperatura ambiente y con agitación constante.
5. Filtrar al vacío.
6. Concentrar el extracto en un rotavapor a 35°C y 40 rpm.
7. Medir volumen de extracto obtenido y almacenar en refrigeración.
8. Secar y pesar el residuo sólido obtenido de la filtración.
3.3.2.4. Fraccionamiento
Para la obtención de las fracciones se utilizaron tres diferentes fraccionamientos
basados en la polaridad de los solventes, esta técnica es una adaptación de la marcha
analítica de (Sarker, Latif, & Gray, 2006).
a) Primer fraccionamiento
1. Tomar 10 ml del extracto concentrado y transferirlo en un embudo de
separación y extraer con 10 ml de Hexano.
2. Separar las dos fases y a la fracción de etanol transferir en un
embudo de separación y extraer con 2 ml de agua y 10 ml de
cloroformo.
3. Separar las fases y la fracción de cloroformo transferir en un embudo
de separación y extraer con 10 ml de cloruro de sodio al 1%.
34
4. Almacenar todas las fracciones obtenidas en refrigeración.
b) Segundo fraccionamiento
1. Tomar 10 ml del extracto concentrado y transferirlo en un embudo de
separación y extraer con 10 ml de Hexano.
2. Separar las dos fases y a la fracción de etanol transferir en un
embudo de separación y extraer con 10 ml de butanol, 3 ml de agua y
15 ml de éter dietílico.
3. Separar las fases y almacenar las fracciones obtenidas en
refrigeración.
c) Tercer fraccionamiento
1. Tomar 10 ml del extracto concentrado y transferirlo en un embudo
de separación, llevar el extracto a un pH de 5 con ácido tartárico y
extraer con 10 ml de acetato de etilo saturado en agua.
2. Separar las dos fases y a la fracción acuosa transferir en un embudo
de separación y extraer con una solución de carbonato de sodio al
10% y 10 ml de acetato de etilo.
3. Almacenar todas las fracciones obtenidas en refrigeración.
3.3.2.5. Tamizaje Fitoquímico
Los solventes utilizados en el fraccionamiento sirven para la identificación de
las diferentes familias de compuestos químicos que se encuentran en la cáscara de
aguacate, en la tabla 10, 11 y 12 se indica los ensayos cualitativos que se van a utilizar
para cada fracción.
Tabla 10. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de
la primera fracción.
Fracción Grupo fitoquímico Ensayo
Hexano
Triterpenos y/o esteroides Ensayo de Libermand-Burchard
Lactonas y cumarinas Ensayo de Baljet
Compuestos grasos Ensayo de Sudan
Agua
Saponinas Ensayo de espuma
Flavonoides Ensayo de Shinoda
Aminas Ensayo de Ninhidrina
Quinonas Ensayo de Borntrager
Glicósidos cardiotónicos Ensayo de Kedde
35
Fenólicos y/o taninos Ensayo de Cloruro férrico
Cloruro de sodio Fenólicos y/o taninos Ensayo de Cloruro férrico
Cloroformo Alcaloides
Ensayo de Dragendorff
Ensayo de Mayer
Ensayo de Wagner
Elaborado por: Aymacaña A.
Tabla 11. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de
la segunda fracción
Fracción Grupo fitoquímico Ensayo
Hexano
Triterpenos y/o esteroides Ensayo de Libermand-Burchard
Lactonas y cumarinas Ensayo de Baljet
Compuestos grasos Ensayo de Sudan
Butanol Saponinas Ensayo de espuma
Éter dietílico
Fenólicos y/o taninos Ensayo de Cloruro férrico
Flavonoides Ensayo de Shinoda
Quinonas Ensayo de Borntrager
Glicósidos cardiotónicos Ensayo de Kedde
Elaborado por: Aymacaña A.
Tabla 12. Ensayos cualitativos para la identificación de grupos fitoquímicos de
la tercera fracción.
Fracción Grupo fitoquímico Ensayo
Acetato de etilo
Triterpenos y/o esteroides Ensayo de Libermand-Burchard
Lactonas y cumarinas Ensayo de Baljet
Compuestos grasos Ensayo de Sudan
Agua
Aminas Ensayo de Ninhidrina
Alcaloides
Ensayo de Dragendorff
Ensayo de Mayer
Ensayo de Wagner
Acetato de etilo Aminas Ensayo de Ninhidrina
Alcaloides Ensayo de Dragendorff
36
Ensayo de Mayer
Ensayo de Wagner
Elaborado por: Aymacaña A.
Ensayo de Shidona: del extracto tomar 10 ml y concentrar hasta 5 ml, al
concentrado añadir una laminilla de Magnesio metálico y 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Si se observa una coloración roja el ensayo es positivo
Ensayo de cloruro férrico: este ensayo permite identificar compuestos fenólicos
y taninos. Se toma una alícuota del extracto y se añade acetato de sodio para
neutralizar y 3 gotas de cloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. Si se
observa una coloración rojo-vino indica presencia de compuestos fenólicos, una
coloración verde intensa se trata de de taninos del tipo pirocatecólicos y si se
observa una coloración azul se trata de taninos del tipo pirogalotánicos.
Ensayo de tricloruro de hierro al 5%: Del extracto etanólico tomar 10ml,
concentrar a 5 mL, tomar 2 mL de la solución concentrada y agregar 5 gotas de
solución de tricloruro de hierro al 5%. Observar la formación del color azul-
negro.
Ensayo de Dragendorff: se toma una alícuota del extracto y se evapora en un
baño de agua, se añade 1ml de ácido clorhídrico al 1% en agua. Se adiciona 1
gota de ácido clorhídrico concentrado y 3 gotas del reactivo Dragendorff. El
ensayo es positivo si se observa turbidez o la formación de un precipitado.
Ensayo de espuma: se toma una alícuota del extracto disuelto en alcohol y se
diluye con veces su volumen de agua, se agita fuertemente por 5 a minutos. Si
se observa la formación de espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm
de altura y dura por más de dos minutos el ensayo es positivo.
La interpretación para los ensayos cualitativos se muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Criterios de interpretación de pruebas cualitativas.
+++ Abundante
++ Moderado
+ Medianamente
escaso
+/- Escaso
- Nada
Fuente: (Pilco, 2017)
3.3.2.6. Cromatografía en capa fina
La identificación de grupos o compuestos fitoquímicos se realizó por la técnica
de cromatografía en capa fina. En la tabla 14 se observa la fase móvil y revelador que se
utilizó en los diferentes grupos o compuestos fitoquímicos.
37
Tabla 14. Fase móvil y revelador utilizados en la cromatografía.
Grupo fitoquímico Fase móvil Revelador
Alcaloides
Acetato de etilo/
metanol/agua
(100:13,5:10)
Reactivo de Folin más
vapores de Amoniaco
Esteroles Éter de petróleo/acetona
(80:20)
Anhídrido acético + ácido
sulfúrico + etanol
Antraquinonas
Benceno/acetato de
etilo/ácido acético
(75:24:1)
Hidróxido de potasio al
10% en metanol
Naftoquinonas Benceno/ éter de petróleo
(2:1)
Hidróxido de potasio al
10% en metanol
Taninos Acetona/hexano
(4:1) Reactivo de Komarowsky
Fuente: (Wagner & Bladt, 1996)
3.3.2.7. Cuantificación de fenoles totales
1. Para la curva de calibración se preparó una solución madre de ácido
gálico de 1,3 mg/ml, de esta solución se preparó soluciones diluidas de
10 ml en las siguientes concentraciones 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3
mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml y 1,3 mg/ml.
2. Se tomó 100 μl de cada solución patrón de ácido gálico en tubos de
ensayo cubiertos de papel aluminio, se añadió 7,9 ml de agua destilada y
500 μl del reactivo Folin-Ciocalteu. Para el blanco se agregó 8 ml de
agua destilada y 500 μl del reactivo Folin-Ciocalteu.
3. Homogeneizar los tubos y dejar en reposo en la oscuridad por 2 horas a
temperatura ambiente.
4. Leer la absorbancia a 765 nm.
5. Para las muestras se colocó en un tubo de ensayo 100 μl de las fracciones
se añadió 7,9 ml de agua destilada y 500 μl del reactivo Folin-Ciocalteu,
repetir los pasos 3 y 4.
3.3.2.8. Cuantificación de flavonoides totales
1. Para la curva de calibración se preparó una solución de quercetina en
acetato de etilo pesando 1,5 mg y aforar en un balón de 10 ml.
38
2. Las diluciones se prepararon de acuerdo con la tabla 15, como blanco se
utilizó 4,8 ml de ácido acético metanol al 5% y 200 μl de AlCl3 al 2%.
Tabla 15. Diluciones para la curva de calibración de Quercetina.
Tubo Concentración
(mg/L)
Diluciones
(μl)
AlCl3 al 2%
(μl)
Ácido acético
metanol al
5% (ml)
1 1,5 50 200 4,75
2 3,0 100 200 4,70
3 4,5 150 200 4,65
4 6,0 200 200 4,60
5 7,5 250 200 4,55
6 9,0 300 200 4,50
7 10,5 350 200 4,45
Elaborado por: Aymacaña A.
3. Leer la absorbancia a 428 nm.
4. Para las muestras se colocó en los tubos 0,2 ml de las fracciones, 4,6 ml
ácido acético metanol al 5% y 200 μl de AlCl3 al 2%. Leer la
absorbancia a 428 nm.
3.3.2.9. Ensayo de actividad antioxidante.
El método que se utilizó para medir la capacidad antioxidante es el método
DPPH, los pasos a seguir son:
a) Preparación de los reactivos
1. Se preparó una solución 0,5 mM del reactivo DPPH en etanol absoluto.
2. Se pesó 49 mg del reactivo DPPH y aforar a 250 ml, el balón aforado
debe estar cubierto con papel aluminio para proteger al reactivo DPPH
de la luz.
3. Se almacenó en un frasco ámbar y refrigerar.
4. Se preparó una solución de 1000 ppm de ácido ascórbico (vitamina C).
b) Preparación de las diluciones
1. Las diluciones se prepararon en tubos de ensayo con la solución de
ácido ascórbico y las fracciones de acuerdo con la tabla 16. Los tubos
deben estar forrados con papel aluminio para protegerlos de la luz.
39
Tabla 16. Diluciones para el método DPPH
Tubo Ácido
ascórbico o
fracción (μl)
Solución de
DPPH (ml)
Etanol al
96% (μl)
1 - 2,9 100
2 2 5,8 198
3 4 5,8 196
4 10 5,8 190
5 20 5,8 180
6 40 5,8 160
7 100 5,8 100
8 160 5,8 40
Elaborado por: Aymacaña A.
2. Se colocó los tubos dentro de un frasco y se agitó a 200 rpm durante 30
minutos.
3. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 517 nm. Como blanco se
utiliza etanol al 96%.
4. Se calculó el porcentaje de inhibición de cada fracción de acuerdo con la
ecuación 7.
%𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 𝐷𝑃𝑃𝐻 = (1 − 𝐴𝑚/𝐴𝑏𝑚) ∗ 100 (Ecuación 7)
Donde:
Abm=la absorbancia de DPPH sin la fracción.
Am= la absorbancia de DPPH con la fracción o ácido ascórbico.
3.3.2.10. Ensayo de actividad antimicrobiana
En el ensayo de actividad antimicrobiana se utilizó el método de microdilución
en placa para el cual se realizaron los siguientes pasos:
a) Preparación de los medios de cultivo
Se prepararon dos medios de cultivo, caldo BHI (Infusión cerebro corazón) para
la activación de las cepas bacterianas y caldo nutritivo para la actividad
antimicrobiana en el método de microdilución en placa. Los caldos nutritivos se
prepararon de la siguiente manera:
1. Se pesó la cantidad necesaria para preparar 100 ml de caldo.
2. Se disolvió con agua destila.
40
3. Se calentó agitando suavemente hasta que esté completamente disuelto el
caldo.
4. Se esterilizó en la autoclave a 121° C por 20 minutos.
5. Se almacenó en refrigeración.
6. Se realizó el mismo proceso para la preparación del otro caldo.
b) Activación de las cepas ATCC bacterianas
1. Se dosificó 10 ml de caldo BHI en 3 tubos de ensayo.
2. Se tomó los crioviales con la cepa de Escherichia coli y con un asa de
inoculación se cogió dos perlitas y se colocó en los tubos de ensayo con
caldo BHI.
3. Se incubó los tubos de ensayo, con caldo BHI y las cepas, a 37°C y por
48 horas.
4. Se realizó el mismo proceso para la cepa de Staphylococcus aureus.
c) Preparación del inoculo
1. Se llevó las cepas activadas a un tubo con agua estéril.
2. El inoculo se ajustó a una turbidez 0,5 McFarland que equivale a 1.5 x
108 ufc/ml.
3. Se confirmó el valor de la escala McFarland, leyendo en un
espectrofotómetro la absorbancia a 594 nm y el valor debe estar entre
0,08 y 0,1.
d) Método de microdilución en placa
1. Se utilizó una placa de 96 pocillos, la cual se utilizó 9 pocillos para cada
fracción, 3 pocillos para el blanco el mismo que es el control negativo, 3
pocillos para el control positivo, 3 pocillos para el antibiótico y 7 pocillos
para el blanco de las fracciones, ver figura 8.
2. Se colocó 100 μl del extracto más 100 μl del medio de cultivo en un
pocillo, de este se tomó 100 μl y se le adicionó 100 μl del medio en el
pocillo siguiente, de este se tomó 100 μl y se adicionó 100 μl del medio,
repetir este proceso 2 veces. Al terminar se añadió a cada pocillo 100 μl
del inoculo.
3. Se añadió en los pocillos del blanco 300 μl del inoculo.
4. Se añadió en los pocillos del control positivo 200 μl del medio de cultivo
y 100 μl del inoculo.
5. Se añadió en los pocillos del antibiótico 100 μl de la solución de
Ceftriaxona, 100 μl del medio de cultivo y 100 μl del inoculo.
6. Se añadió en los pocillos del blanco de las fracciones 300 μl de las
fracciones.
7. Se incubó a 37°C por 24 horas.
8. Se leyó la absorbancia a 594 nm en el equipo Lector de microplacas
multimodo híbrido (Programa Gen 5TM).
41
9. Se calculó el porcentaje de inhibición de cada fracción de acuerdo a la
ecuación 8:
%𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠.𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜−𝐴𝑏𝑠.𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100 (Ecuación 8)
Figura 7. Esquema de distribución para el método de microdilución en placa.
Elaborado por: Aymacaña A.
Extracto total Hass Extracto total Fuerte
Fracción acuosa Hass Fracción acuosa Fuerte
Fracción éter dietílico Hass Fracción éter dietílico Fuerte
Fracción NaCl Hass Antibiótico
Blanco Control positivo
Blanco fracción NaCl Hass Blanco extracto total Fuerte
Blanco fracción acuosa Hass Blanco fracción acuosa Fuerte
Blanco fracción éter dietílico Hass Blanco fracción éter dietílico Fuerte
Blanco extracto total Hass
3.4. Operacionalización de las variables
Variable Dimensiones Indicadores Items
Variedad de aguacate
Composición
proximal
Porcentaje de humedad
-
Porcentaje de grasa
Porcentaje de ceniza
Porcentaje de proteína
Porcentaje de fibra cruda
Actividad
antimicrobiana
Microdilución en
placa Porcentaje de inhibición -
Actividad antioxidante Técnica DPPH Porcentaje de inhibición -
Elaborado por: Aymacaña A.
42
3.5. Diseño experimental
En el ensayo de la actividad antimicrobiana se realizó por el método de
microdilución en placa, midiendo el porcentaje de inhibición de cada tipo de
fracciones frente a cada cepa bacteriana. En la tabla 17 se indica los factores y el
nivel del diseño experimental.
Tabla 17. Factores y niveles del diseño experimental.
Factores Niveles Codificación
Tipo de bacteria Escherichia coli ATCC 8739 EC
Staphylococcus aureus ATCC 6538 SA
Tipo de fracción
Extracto original Hass EH
Fracción acuosa Hass FAH
Fracción éter dietílico Hass FEH
Fracción NaCl Hass FCH
Extracto original Fuerte EF
Fracción acuosa Fuerte FAF
Fracción éter dietílico Fuerte FEF
Elaborado por: Aymacaña A.
3.6. Técnicas e instrumentos de recolección de datos
En el presente trabajo de investigación como instrumento de recolección de datos se
utilizó un cuaderno de anotaciones.
3.7. Procesamiento de datos y análisis de datos
En las mediciones correspondientes para la determinación de la composición
bromatológica de la cáscara de aguacate de las dos variedades, se realizaron cuatro
repeticiones, por lo que se utilizó como herramienta estadística una comparación de
medias de los datos obtenidos para expresar el resultado.
Se plantea las hipótesis en la cual la hipótesis nula (H0) establece que las medias son
iguales y la hipótesis alterna (Hi) que las medias son diferentes:
𝐻𝑂: 𝑈1 = 𝑈2
𝐻𝑖: 𝑈1 ≠ 𝑈2
Se comparó las varianzas (S2) con F de Fisher experimental y F tabulada, la tabla se
encuentra en el Anexo 4. La ecuación 9 se utilizó para calcular F de Fisher
experimental.
43
𝐹𝑒𝑥𝑝 =𝑆1
2
𝑆22 (Ecuación 9)
Si las variaciones (s2) son iguales, se calcula t experimental (texp) con la ecuación
10.
𝑡𝑒𝑥𝑝 =𝑥1̅̅̅̅ −𝑥2̅̅̅̅
𝑆√1
𝑛1+
1
𝑛2
(Ecuación 10)
Se compara la texp con una ttab y si la 𝑡𝑒𝑥𝑝 ≤ 𝑡𝑡𝑎𝑏 acepto la hipótesis nula (H0). Si la
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏 rechazo la hipótesis nula (H0) y acepto la hipótesis alterna (Hi). La tabla de
ttab se encuentra en el Anexo 3.
Para procesar los datos obtenidos en la actividad antimicrobiana por el método de
microdilución en placa se utilizó un análisis de varianza ANOVA con dos factores, a un
nivel de confianza del 95%, el esquema se observa en la tabla 18.
Tabla 18. Tabla de ANOVA con dos factores.
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
medio
Razón F Valor P
Factor A 𝑆𝐶𝐴 𝑎 − 1 𝐶𝑀𝐴 𝐶𝑀𝐴
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐴)
Factor B 𝑆𝐶𝐵 𝑏 − 1 𝐶𝑀𝐵 𝐶𝑀𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐵)
Interacción AB 𝑆𝐶𝐴𝐵 (𝑎 − 1)(𝑏− 1)
𝐶𝑀𝐴𝐵 𝐶𝑀𝐴𝐵
𝐶𝑀𝐸
𝑃(𝐹 > 𝐹0𝐴𝐵)
Error 𝑆𝐶𝐸 𝑎𝑏(𝑛 − 1) 𝐶𝑀𝐸
Total 𝑆𝐶𝑇 𝑎𝑏𝑛 − 1
(Gutiérrez & de la Vara, 2008)
Para el análisis de varianza se plantearon dos hipótesis, la hipótesis nula
establece que no existe diferencia significativa entre las fuentes de la actividad
antimicrobiana (fracciones de las cáscaras de la variedad Hass y Fuerte) y el porcentaje
de inhibición, mientras que la hipótesis alterna dice que si existe una diferencia
significativa.
Hipótesis nula: 𝐻𝑂: 𝑈1 = 𝑈2 = 𝑈3
Hipótesis alterna: 𝐻𝑖: 𝑈1 ≠ 𝑈2 ≠ 𝑈3
Luego de realizar el análisis de varianza se determina que existe una diferencia
significativa en el factor A, se rechazó la hipótesis nula y se procedió a comparar las
44
medias del factor A, mediante el método DMS (diferencia mínima significativa) y con
un nivel de significancia del 0,05, utilizando la ecuación 11 tomada de (Gutiérrez & de
la Vara, 2008).
𝐷𝑀𝑆 = 𝑡∝/2, 𝑁 − 𝐾√2𝐶𝑀𝐸/𝑛 (Ecuación 11)
45
CAPITULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Análisis bromatológico
El análisis bromatológico se realizó luego de la limpieza, lavado, secado y
reducción de tamaño de las cáscaras de aguacate, para todos los análisis se realizó
cuatro repeticiones de cada variedad de cáscara de aguacate.
El porcentaje de humedad se determinó mediante el método de desecación en
estufa en el cual se calcula el contenido de agua debido a la pérdida de peso de la
muestra al ser sometida a temperaturas altas. La determinación de cenizas se realizó por
calcinación, eliminando el agua, así como los compuestos orgánicos, los compuestos
inorgánicos debido a la calcinación se convirtieron en cloruros, sulfatos, óxidos, etc. En
el análisis del porcentaje de proteína se utilizó el método Kjeldahl y como factor
proteico se usó el valor de 6,25 debido a que no existe un factor específico para la
cáscara de aguacate.
4.1.1. Análisis de comparación de medias
El análisis de comparación de medias se realizó en base seca para todos los
resultados de porcentaje de ceniza, proteína, grasa, fibra cruda y carbohidratos.
Comparación %Cenizas
Las hipótesis planteadas son las siguientes:
- El porcentaje de ceniza de la variedad Hass y Fuerte son iguales
𝐻𝑂: 𝑈1 = 𝑈2
- El porcentaje de ceniza de la variedad Hass y Fuerte son diferentes
𝐻𝑖: 𝑈1 ≠ 𝑈2
Calculo Fexp:
𝐹𝑒𝑥𝑝 =0,074
0,069
𝐹𝑒𝑥𝑝 = 1,07
𝐹𝑒𝑥𝑝 ≤ 𝐹𝑡𝑎𝑏
1,07 ≤ 15,44
Las varianzas son iguales, entonces se calcula texp
𝑡𝑒𝑥𝑝 =7,34 − 8,48
0,27√14 +
14
𝑡𝑒𝑥𝑝 = 5,99
46
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏
5,99 ≥ 2,44
Como la texp es mayor que la ttab se concluye que él % de Humedad de la cáscara
de aguacate de la variedad Hass y variedad Fuerte son diferentes.
Los resultados del análisis bromatológico en base seca se muestran en la tabla
19 con el análisis de comparación de medias, se concluye estadísticamente que en las
dos variedades el porcentaje de carbohidratos y humedad son iguales, a diferencia del
porcentaje de ceniza, proteína, grasa y fibra cruda que son diferentes en las dos
variedades de cáscara de aguacate.
Tabla 19. Resultados del análisis de comparación de medias en base seca.
Repeticiones % Humedad % Cenizas % Proteína % Grasa
% Fibra
cruda
%
Carbohidratos
Hass Fuerte Hass Fuerte Hass Fuerte Hass Fuerte Hass Fuerte Hass Fuerte
R1 9,55 9,24 7,28 8,61 8,19 7,03 15,14 22,25 51,14 43,15 18,14 18,79
R2 9,58 8,54 7,13 8,16 8,24 7,13 15,06 22,50 51,29 42,93 18,13 19,90
R3 9,23 9,30 7,74 8,37 7,92 7,00 15,15 22,73 51,96 43,14 17,49 18,55
R4 9,47 9,33 7,22 8,76 8,40 7,40 15,01 22,32 51,39 43,51 17,97 17,77
Media total 9,46 9,10 7,34 8,48 8,19 7,14 15,09 22,45 51,45 43,18 17,93 18,75
Desviación
estándar 0,16 0,38 0,272 0,263 0,202 0,185 0,068 0,211 0,356 0,237 0,307 0,882
Varianza 0,025 0,143 0,074 0,069 0,041 0,034 0,005 0,045 0,127 0,056 0,094 0,779
Comparació
n de medias
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≤ 𝑡𝑡𝑎𝑏
1,88 ≤ 2,44
Iguales
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏
5,99≥2,44
Diferentes
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏
7,68≥2,44
Diferentes
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏
74,53≥2,44
Diferentes
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≥ 𝑡𝑡𝑎𝑏
39,39≥2,44
Diferentes
𝑡𝑒𝑥𝑝 ≤ 𝑡𝑡𝑎𝑏
1,96≤2,44
Iguales
Elaborado por: Aymacaña A.
En una investigación realizada en Guatemala en el cual se realizó el análisis
bromatológico de la cáscara de aguacate de la variedad Hass obteniendo como
resultados 14,50% humedad, 8,28 %proteína, 9,14 %grasa, 6,05 % cenizas, 50,65%
fibra cruda y 62,03% carbohidratos (Bressani, 2006), los datos son similares a los q se
obtuvo en esta investigación excepto en el porcentaje de carbohidratos que fue de
16,24%. Debido a la cantidad de fibra y proteína este subproducto se podría utilizar
para la alimentación de animales.
4.2. Extracción
Las cáscaras de aguacate fueron tratadas previamente, separadas de la pulpa,
limpiadas, lavadas, secadas y reducidas su tamaño en un molino. Para la obtención del
extracto se utilizó etanol al 96%. Al terminar la maceración se filtró el extracto y se
concentró. El volumen final de los extractos se encuentra en la tabla 20.
47
Tabla 20. Datos obtenidos del proceso de extracción.
Muestra Peso (g) Volumen del
solvente (ml)
Volumen Final del
extracto
concentrado (ml)
Cáscara Hass 150 200 40
Cáscara Fuerte 150 200 73
Elaborado por: Aymacaña A.
El porcentaje de rendimiento se calculó con la siguiente ecuación, donde el peso
final es la diferencia entre el peso inicial con el peso de los residuos de la filtración.
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 (𝑔)
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑔)∗ 100
Para la variedad Hass se obtuvo un porcentaje de rendimiento de 6,0%.
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =9𝑔
150𝑔∗ 100
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 6,0
Para la variedad fuerte el porcentaje de rendimiento fue de11, 1 %.
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =16,65𝑔
150𝑔∗ 100
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 = 11,1
4.3. Fraccionamiento
Al realizar los fraccionamientos con los diferentes solventes utilizados se
obtuvieron las siguientes fracciones de las dos variedades de las cáscaras de aguacate,
como se puede observar en la tabla 21.
Tabla 21. Resultados del fraccionamiento.
Numero de Fraccionamiento Fracciones obtenidas
Primero
Fracción Hexano
Fracción Acuosa
Fracción NaCl
Fracción Cloroformo (libre de
taninos)
Segundo Fracción Hexano
Fracción Butanol
48
Fracción Éter dietílico
Tercero
Fracción Acetato de etilo 1
Fracción Acuosa
Fracción Acetato de Etilo 2
Elaborado por: Aymacaña A.
4.4. Tamizaje Fitoquímico
Se realizaron pruebas cualitativas a todas las fracciones obtenidas para la
identificación de grupos fitoquímicos de las dos variedades de cáscara de aguacate, los
resultados se detallan en la tabla 22.
49
Tabla 22. Resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico de las diferentes fracciones de la cáscara de aguacate.
Numero de
Fraccionamiento
Fracciones
obtenidas Ensayo
Grupo
fitoquímico
Hass Fuerte
Resultado
Observaciones
Resultado
Observaciones
Primero
Fracción
Hexano
Ensayo de
Libermand-
Burchard
Triterpenos
y/o
esteroides
+++ Coloración
verde intensa +++
Cambio de
coloración a
azul-morado
Ensayo de
Baljet
Lactonas y
coumarinas -
No hay cambio
de coloración
ni presencia de
precipitado
rojo
-
No hay cambio
de coloración
ni presencia de
precipitado
rojo
Ensayo de
Sudan
Compuestos
grasos +
Poca presencia
de gotas de
color rojo
+++
Presencia de
gotas de color
rojo
Fracción
Acuosa
Ensayo de
espuma Saponinas -
No hay
presencia de
espuma
+++ Presencia de
espuma
Ensayo de
Shinoda Flavonoides -
No hay cambio
de color -
No hay cambio
de color
Ensayo de
Ninhidrina Aminas +++
Presencia de
color azul
violáceo
+++
Presencia de
color azul
violáceo
Ensayo de
Borntrager Quinonas +++
Presencia de
coloración roja +++
Presencia de
coloración roja
50
en la fase
superior
en la fase
superior
Ensayo de
Kedde
Glicósidos
cardiotónicos -
No hay
coloración
violácea
-
No hay
coloración
violácea
Ensayo de
Cloruro
férrico
Fenólicos
y/o taninos +++
Presencia de
coloración
azul,
compuestos
taninos del tipo
pirogalotánicos
+++
Presencia de
coloración
azul,
compuestos
taninos del tipo
pirogalotánicos
Fracción
NaCl
Ensayo de
Cloruro
férrico
Fenólicos
y/o taninos +++
Presencia de
coloración
rojo-vino,
compuestos
fenólicos en
general.
-
No hay
presencia de
coloración
Fracción
Cloroformo
(libre de
taninos)
Ensayo de
Dragendorff
Alcaloides
-
No hay
presencia de
precipitado ni
turbidez
-
No hay
presencia de
precipitado ni
turbidez
Ensayo de
Mayer -
No hay
presencia de
precipitado ni
turbidez
-
No hay
presencia de
precipitado ni
turbidez
Ensayo de - No hay - No hay
51
Wagner presencia de
precipitado ni
turbidez
presencia de
precipitado ni
turbidez
Segundo
Fracción
Hexano
Ensayo de
Libermand-
Burchard
Triterpenos
y/o
esteroides
+++ Coloración
verde intensa +++
Coloración
verde intensa
Ensayo de
Baljet
Lactonas y
coumarinas -
Coloración
amarilla -
Coloración
amarilla
Ensayo de
Sudan
Compuestos
grasos +++
Presencia de
gotas de color
rojo
+++
Presencia de
gotas de color
rojo
Fracción
Butanol
Ensayo de
espuma Saponinas -
No hay
presencia de
espuma
+++ Presencia de
espuma
Fracción
Éter
dietílico
Ensayo de
Cloruro
férrico
Fenólicos
y/o taninos +++
Presencia de
color verde
intensa,
compuestos
taninos del tipo
pirocatecólicos
+++
Presencia de
color verde
intensa,
compuestos
taninos del tipo
pirocatecólicos
Ensayo de
Shinoda Flavonoides -
No hay cambio
de color -
No hay cambio
de color
Ensayo de
Borntrager Quinonas +++
Presencia de
coloración roja
en la fase
superior
+++
Presencia de
coloración roja
en la fase
superior
52
Ensayo de
Kedde
Glicósidos
cardiotónicos -
No hay
coloración
violácea
-
No hay
coloración
violácea
Tercero
Fracción
Acetato de
etilo 1
Ensayo de
Libermand-
Burchard
Triterpenos
y/o
esteroides
-
No hay cambio
en la
coloración
-
No hay cambio
en la
coloración
Ensayo de
Baljet
Lactonas y
coumarinas -
No hay cambio
en la
coloración
-
No hay cambio
en la
coloración
Ensayo de
Sudan
Compuestos
grasos +++
Presencia de
gotas de color
rojo
-
No hay
presencia de
gotas de color
rojo
Fracción
Acuosa
Ensayo de
Ninhidrina Aminas -
No hay cambio
de color -
No hay cambio
de color
Ensayo de
Dragendorff
Alcaloides
+++ Presencia de
precipitado +++
Presencia de
precipitado
Ensayo de
Mayer +++
Presencia de
precipitado ++
Presencia de
turbidez
definida
Ensayo de
Wagner ++
Presencia de
turbidez
definida
++
Presencia de
turbidez
definida
Fracción
Acetato de
Etilo 2
Ensayo de
Ninhidrina Aminas -
No hay cambio
de color -
No hay cambio
de color
Ensayo de Alcaloides + Presencia de - No hay
53
Dragendorff turbidez presencia de
precipitado ni
turbidez
Ensayo de
Mayer ++
Presencia de
turbidez
definida
+ Presencia de
turbidez
Ensayo de
Wagner ++
Presencia de
turbidez
definida
+ Presencia de
turbidez
Elaborado por: Aymacaña A.
54
Al comparar los resultados obtenidos de las pruebas cualitativas en las dos
variedades de cáscara de aguacate, se observa que los resultados son similares en las
tres fracciones, sin embargo, en los ensayos de espuma para identificar saponinas dio un
resultado positivo en la variedad Fuerte en la fracción acuosa y fracción butanol, en la
fracción NaCl presenta compuestos fenólicos y/o taninos de la variedad Hass. En la
tabla 23 se presentan los grupos de compuestos mayoritarios que se identificaron en las
fracciones de las dos variedades de cáscara de aguate con las posibles utilidades de
estos compuestos.
Tabla 23. Resumen del tamizaje fitoquímico.
Fraccionamiento Fracción Grupo
funcional
Observación Utilidades
Hass Fuerte
Primero
Fracción
Hexano
Triterpenos
y/o
esteroides
+++ +++
Son abundantes en la naturaleza,
particularmente en resinas, y puede aparecer
como ésteres o glucósidos. (Wagner & Bladt,
1996)
Compuestos
grasos + +++
Los ácidos grasos son importantes como
componentes de aceites vegetales, son
también componentes de las resinas y de
ceras en que están esterificados con alcoholes
de cadena larga. (Wagner & Bladt, 1996)
Fracción
acuosa
Saponinas - +++
Los materiales vegetales que contienen
saponinas se han usado durante mucho
tiempo en muchas partes del mundo por sus
propiedades detergentes. (Wagner & Bladt,
1996)
Aminas +++ +++
Las aminas son parte de los alcaloides de
origen natural. Los alcaloides típicos se
derivan de fuentes vegetales, son básicos,
contienen uno o más nitrógeno átomos
(generalmente en un anillo heterocíclico) y
generalmente tienen una marcada acción
fisiológica en el hombre u otros animales.
(Evans, 2009)
Quinonas +++ +++
Las quinonas desempeñan papeles vitales en
la bioquímica de las células y los organismos.
Ellas ejercen actividades biológicas
relevantes, siendo un ejemplo de ello la
Vitamina K1, que es un factor importante en
la coagulación sanguínea y la coenzima Q,
una quinona que interviene en la cadena de
transporte de electrones en las células.
(Evans, 2009)
Fenólicos
y/o taninos +++ +++
Los fenoles son componentes importantes de
algunas plantas medicinales y en la industria
55
alimentaria se utilizan como agentes
colorantes, aromatizantes, aromatizantes y
antioxidantes. (Wagner & Bladt, 1996)
Fracción
NaCl
Fenólicos
y/o taninos +++ -
Los fenoles son componentes importantes de
algunas plantas medicinales y en la industria
alimentaria se utilizan como agentes
colorantes, aromatizantes, aromatizantes y
antioxidantes. (Evans, 2009)
Segundo
Fracción
Hexano
Triterpenos
y/o
esteroides
+++ +++
Son abundantes en la naturaleza,
particularmente en resinas, y puede aparecer
como ésteres o glucósidos. (Wagner & Bladt,
1996)
Compuestos
grasos +++ +++
Los ácidos grasos son importantes como
componentes de aceites vegetales, son
también componentes de las resinas y de
ceras en que están esterificados con alcoholes
de cadena larga. (Wagner & Bladt, 1996)
Fracción
Butanol Saponinas - +++
Los materiales vegetales que contienen
saponinas se han usado durante mucho
tiempo en muchas partes del mundo por sus
propiedades detergentes. (Wagner & Bladt,
1996)
Fracción
Éter
dietílico
Fenólicos
y/o taninos +++ +++
Los fenoles son componentes importantes de
algunas plantas medicinales y en la industria
alimentaria se utilizan como agentes
colorantes, aromatizantes, aromatizantes y
antioxidantes. (Evans, 2009)
Quinonas +++ +++
Las quinonas desempeñan papeles vitales en
la bioquímica de las células y los organismos.
Ellas ejercen actividades biológicas
relevantes, siendo un ejemplo de ello la
Vitamina K1, que es un factor importante en
la coagulación sanguínea y la coenzima Q,
una quinona que interviene en la cadena de
transporte de electrones en las células
(Wagner & Bladt, 1996)
Tercero
Fracción
Acetato
de etilo 1
Compuestos
grasos +++ -
Los ácidos grasos son importantes como
componentes de aceites vegetales, son
también componentes de las resinas y de
ceras en que están esterificados con alcoholes
de cadena larga. (Evans, 2009)
Fracción
acuosa Alcaloides +++ +++
La mayoría de los alcaloides son
extremadamente tóxicos, siempre han sido
importantes en el alopático sistema donde la
dosificación es estrictamente controlada y en
la homeopatía donde la tasa de dosis es tan
baja que es inofensiva. (Evans, 2009)
Elaborado por: Aymacaña A.
56
La cromatografía se la realizó a las fracciones que dieron positivo en las pruebas
cualitativas de identificación de los grupos de compuestos, los resultados de la
cromatografía se encuentran en la tabla 24. Las fotografías de las placas se encuentran
en el Anexo 8.
Tabla 24. Resultados de la cromatografía de capa fina.
Fraccionamiento Fracción Grupo
fitoquímico
Observaciones
Hass Fuerte
Tercero
Acetato de etilo
Alcaloides
-
+-
Acuosa Manchas fluorescentes
en UV
Manchas fluorescentes
en UV
Primero Hexano
Esteroles
Aparición de manchas
de color rojo y verde
Aparición de manchas
de color rojo y verde
Segundo Hexano Aparición de manchas
de color rojo y verde
Aparición de manchas
de color rojo y verde
Primero Acuosa
Antraquinonas
- -
Segundo Éter dietílico Aparición de manchas
de color rojo y verde
Aparición de manchas
de color rojo
Primero Acuosa
Naftoquinonas
- -
Segundo Éter dietílico Aparición de manchas
de color rojo y verde
Aparición de manchas
de color rojo
Primero
Acuosa
Taninos
- -
NaCl Aparición de manchas
de color rojo -
Segundo Éter dietílico 2 Aparición de manchas
de color rojo
Aparición de manchas
de color rojo
Elaborado por: Aymacaña A.
En la tabla 25 se muestran los Rf obtenidos en la cromatografía de capa fina.
Tabla 25. Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina.
Grupo
fitoquímico Fraccionamiento Fracción
Rf Color en
UV
Color En
fluorescencia Hass Fuerte
Alcaloides Tercero Acuosa 0,80 0,80 Rojo Si
Esteroles
Primero Hexano
0,19 0,11 Rojo Si
0,30 0,16 Rojo Si
- 0,27 Verde Si
Segundo Hexano 0,11 0,13 Rojo Si
0,22 0,22 Rojo Si
57
0,31 0,31 Rojo Si
0,67 0,67 Verde Si
Antraquinonas Segundo Éter
dietílico
- 0,38 Rojo No
- 0,71 Rojo No
- 0,85 Rojo No
Naftoquinonas Segundo Éter
dietílico
0,16 0,16 Rojo No
0,18 0,18 Verde No
Taninos
Primero NaCl 0,89 - Rojo Si
Segundo Éter
dietílico 2 0,86 0,88 Rojo Si
Elaborado por: Aymacaña A.
4.5. Cuantificación de fenoles totales
Con los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico se determinó que 5
fracciones dieron positivo en los ensayos de cloruro férrico, en estas fracciones se
realizó la cuantificación de fenoles totales de la cáscara de aguate de la variedad Hass y
Fuerte.
Para la cuantificación de fenoles se realizó una curva de calibración de ácido
gálico al 99,5% de pureza.
Tabla 26. Datos de concentración y absorbancia de ácido gálico.
Concentración
(mg/ml) Absorbancia
0,0995 0,006
0,1990 0,028
0,2985 0,087
0,4975 0,201
0,5970 0,307
0,7960 0,411
1,1940 0,655
1,2935 0,740
Elaborado por: Aymacaña A.
58
Figura 8. Curva de calibración de ácido gálico.
Elaborado por: Aymacaña A.
De acuerdo con la curva de calibración se obtiene la ecuación 12 para calcular la
concentración de fenoles totales de las fracciones y extractos obtenidos, la
concentración se expresa en mg de ácido gálico/ml.
𝐴 = 𝑚𝐶 + 𝐵
𝐴 = 0,6282𝐶 − 0,0863
𝑪 =𝑨+𝟎,𝟎𝟖𝟔𝟑
𝟎,𝟔𝟐𝟖𝟐 (Ecuación 12)
En la tabla 27 se muestra los valores de absorbancia de las fracciones y los
extractos originales con el valor de la concentración de fenoles totales, la concentración
ya se encuentra corrida con el factor de dilución.
Tabla 27. Resultados de la concentración de fenoles totales.
Variedad Fracción o Extracto Absorbancia Concentración
(mg/ml)
Cáscara Hass
Extracto total 0,027 9,018
Fracción Acuosa 0,437 0,833
Fracción NaCl 0,012 3,130
Fracción Éter dietílico 0,019 3,352
Cáscara Fuerte
Extracto total 0,110 15,624
Fracción Acuosa 0,064 4,785
Fracción Éter dietílico 0,032 3,766
Elaborado por: Aymacaña A.
y = 0,6282x - 0,0863R² = 0,9955
-0,100
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 1,4000
Ab
sorb
anci
a
Concentracion (mg/ml)
Absorbancia vs Concentración
59
En las dos variedades de cáscara de aguacate se observa que la mayor cantidad
de fenoles totales se encuentran en el extracto original, por lo tanto, no hay resultado
significativo de concentración de fenoles en las fracciones, obteniéndose en la variedad
Hass una concentración mayor de 3, 35mg/ml en la fracción éter dietílico y en la
variedad Fuerte 4,78mg/ml en la fracción acuosa.
En un estudio realizado en México se determinó la cantidad de fenoles totales en
la cáscara de aguacate de la variedad Hass, en el cual se obtuvo como resultado
5367,27mg/ml (Salmerón, 2014), el resultado difiere con el que se obtuvo en esta
investigación, una de las causas de esta diferencia puede ser que el método de
extracción fue diferente ya que se Salmerón (2014) utilizó extractos metanólicos.
4.6. Cuantificación de flavonoides totales
A pesar de que los ensayos cualitativos para determinar la presencia de
flavonoides fueron negativos, se decidió realizar la cuantificación de flavonoides de las
mismas fracciones de la cuantificación de fenoles totales de la cascara de aguacate de la
variedad Hass y Fuerte.
Para la cuantificación de flavonoides se realizó una curva de calibración de
Quercetina con una pureza de 95,3%.
Tabla 28. Datos de concentración y absorbancia de Quercetina.
Concentración
(mg/ml) Absorbancia
1,4295 0,119
2,8590 0,229
4,2885 0,323
5,7180 0,391
7,1475 0,484
8,5770 0,571
10,0065 0,628
Elaborado por: Aymacaña A.
60
Figura 9.Curva de calibración de quercetina.
Elaborado por: Aymacaña A.
Al realizar la curva de calibración se obtiene la ecuación 13 de la curva la cual
nos permite calcular las concentraciones de las fracciones y los extractos, la
concentración se expresa en mg de quercetina/ml.
𝐴 = 𝑚𝐶 + 𝐵
𝐴 = 0,0593𝐶 + 0,0533
𝑪 =𝑨−𝟎,𝟎𝟓𝟑𝟑
𝟎,𝟎𝟓𝟗𝟑 (Ecuación 13)
Los valores de la absorbancia y las concentraciones de flavonoides totales se
muestran en la tabla 29.
Tabla 29. Resultados de la concentración de flavonoides totales.
Variedad Fracción o Extracto Absorbancia Concentración (mg/ml)
Cáscara Hass
Extracto total 0,283 38,7352
Fracción Acuosa 0,058 0,0793
Fracción NaCl 0,310 14,4295
Fracción Éter dietílico 0,481 7,2125
Cáscara Fuerte
Extracto total 0,224 28,7858
Fracción Acuosa 0,32 4,4975
Fracción Éter dietílico 0,215 9,0894
Elaborado por: Aymacaña A.
y = 0,0593x + 0,0533R² = 0,9945
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 2 4 6 8 10 12
Ab
sorb
anci
a
Concentración (mg/ml)
Absorbancia vs Concentración
61
4.7. Actividad antioxidante
Para la evaluación de la actividad antioxidante primero se realizó la lectura del
ácido ascórbico, en la tabla 30 se encuentran los valores de absorbancia medidos a
517nm y el porcentaje de inhibición. El porcentaje de inhibición se calculó con la
ecuación 7, el valor de la absorbancia de DPPH sin el extracto (Abm) es 2,1679.
Tabla 30. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición del ácido
ascórbico.
Concentración
ácido ascórbico
(mg/ml)
Absorbancia % de inhibición
0,002 1,725 20,43
0,004 1,666 23,15
0,010 1,645 24,12
0,020 1,479 31,78
0,040 1,241 42,76
0,100 0,736 66,05
0,160 0,123 94,33
Elaborado por: Aymacaña A.
Figura 10. Porcentaje de inhibición vs concentración de ácido ascórbico.
Elaborado por: Aymacaña A.
y = 458,17x + 21,24R² = 0,9958
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18
% In
hib
ició
n
Concentración (mg/ml)
% Inhibición vs Concentración
62
Tabla 31. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición del extracto
total de la variedad Hass y Fuerte.
Hass Fuerte
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
0,018 1,883 13,14 0,031 1,771 18,31
0,036 1,819 16,09 0,062 1,742 19,65
0,090 1,75 19,28 0,156 1,670 22,97
0,180 1,681 22,46 0,312 1,522 29,79
0,361 1,525 29,66 0,625 1,246 42,53
0,902 1,109 48,84 1,562 0,329 84,82
1,443 0,654 69,83 2,500 0,173 92,02
Elaborado por: Aymacaña A.
Figura 11. Porcentaje de inhibición vs volumen del extracto total de la variedad
Hass y Fuerte.
Elaborado por: Aymacaña A.
En la figura 11 se observan que el extracto total de la variedad fuerte tiene el
mayor porcentaje de inhibición de 92,02% a un volumen de 0,160ml a diferencia del
extracto total de la variedad Hass que tiene 69,83% al mismo volumen.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-0,100 0,400 0,900 1,400 1,900 2,400
% In
hib
ició
n
Concentración (mg/ml)
% Inhibición vs Concentración
Extracto total Hass
Extracto total Fuerte
63
Tabla 32.Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la fracción
acuosa de la variedad Hass y Fuerte.
Hass Fuerte
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
0,002 1,615 25,50 0,010 0,556 74,35
0,003 1,449 33,16 0,019 0,527 75,69
0,008 1,276 41,14 0,048 0,512 76,38
0,017 0,836 61,44 0,096 0,455 79,01
0,033 0,419 80,67 0,191 0,388 82,10
0,083 0,410 81,09 0,479 0,369 82,98
0,133 0,374 82,75 0,766 0,360 83,39
Elaborado por: Aymacaña A.
Figura 12. Porcentaje de inhibición vs concentración de la fracción acuosa de
la cáscara Hass.
Elaborado por: Aymacaña A.
En la figura 12 se observa que la fracción acuosa de la variedad Fuerte tiene el
porcentaje de inhibición muy alto a menor volumen y menor concentración ya que a un
volumen de 0,002ml se obtiene 74,35% de inhibición.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-0,010 0,090 0,190 0,290 0,390 0,490 0,590 0,690 0,790
%In
hib
ició
n
Concentración (mg/ml)
%Inhibición vs Concentración
Fracción acuosa Hass
Fracción acuosa Fuerte
64
Tabla 33. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la
fracción éter dietílico de la variedad Hass y Fuerte
Hass Fuerte
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
Concentración
extracto
(mg/ml)
Absorbancia %
Inhibición
0,007 2,130 1,75 0,008 2,140 1,29
0,013 2,117 2,35 0,015 2,123 2,07
0,034 2,114 2,49 0,038 2,114 2,49
0,067 2,098 3,22 0,075 2,104 2,95
0,134 2,092 3,50 0,151 2,025 6,59
0,335 1,990 8,21 0,377 1,654 23,70
0,536 1,613 25,60 0,603 1,196 44,83
Elaborado por: Aymacaña A.
Figura 13. Porcentaje de inhibición vs volumen de la fracción éter dietílico de
la variedad Hass y Fuerte.
Elaborado por: Aymacaña A.
En la figura 13 se observa que en la fracción éter dietílico de las dos variedades
de cáscara de aguacate tiene el menor porcentaje de inhibición a diferencia de las otras
fracciones.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
-0,025 0,075 0,175 0,275 0,375 0,475 0,575
% In
hib
ició
n
Concentración (mg/ml)
% Inhibición vs Concentración
Fracción éter dietílico Hass
Fracción éter dietílico Fuerte
65
Tabla 34. Resultados de la absorbancia y porcentaje de inhibición de la
fracción NaCl de la cáscara Hass.
Concentración
extracto (mg/ml) Absorbancia % de inhibición
0,006 1,968 9,22
0,013 1,955 9,82
0,031 1,948 10,14
0,063 1,876 13,46
0,125 1,830 15,59
0,313 1,578 27,21
0,501 1,461 32,61
Elaborado por: Aymacaña A.
Figura 14. Porcentaje de inhibición vs volumen de la fracción NaCl de la
cáscara Hass.
Elaborado por: Aymacaña A.
En la figura 15 se presentan todos los porcentajes de inhibición de todas las
fracciones y extractos originales de la cáscara de aguacate de las variedades Hass y
Fuerte, donde se observa que el extracto total de la variedad fuerte es el que presenta
mayor porcentaje de inhibición de 92,02% a un volumen de extracto de 0,160 ml pero
las fracciones acuosa de las dos variedades también tienen un buen porcentaje de
inhibición en el cual podemos decir que utilizando 0,040 ml del extracto se obtiene
82,10% de inhibición en el extracto acuoso de la variedad Fuerte, de igual forma sucede
en la cascara Hass con 0,040 ml presenta 80,67% de inhibición.
y = 49,176x + 9,4738R² = 0,9815
0
5
10
15
20
25
30
35
40
-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55
% In
hib
ició
n
Concentración (mg/ml)
% Inhibición vs Concentración
66
Figura 15. Resumen de las gráficas de la actividad antioxidante
Elaborado por: Aymacaña A.
4.8. Actividad antimicrobiana
El procedimiento se realizó frente a dos cepas bacterianas, Escherichia coli
ATCC 8739 y Staphylococcus aureus ATCC 6538, utilizando el método de
microdilución en placa en el cual se obtienen lecturas de absorbancia para calcular el
porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones, se realizó tres concentraciones
diferentes y cada una con tres repeticiones.
Tabla 35. Resultados de la absorbancia de los extractos y fracciones frente a
Escherichia coli.
Variedad Extracto o
fracción AC1 AC2 AC3 Ablanco Promedio
Hass
Extracto
total Hass
0,314 0,473 0,716
0,671
0,380
0,386 0,590 0,880 0,554
0,439 0,598 0,840 0,812
Fracción
Acuosa
0,593 0,466 0,574
0,107
0,584
0,531 0,468 0,538 0,459
0,629 0,444 0,541 0,551
Fracción
NaCl
0,235 0,388 0,419
0,142
0,229
0,291 0,498 0,418 0,385
0,160 0,270 0,317 0,385
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-0,005 0,045 0,095 0,145
% In
hib
ició
n
Volumen (ml)
% Inhibición vs Volumen
Extracto total Hass
Acuosa Hass
NaCl Hass
Eter dietilico Hass
Extracto total Fuerte
Acuosa Fuerte
Eter dietilico Fuerte
67
Fracción
Éter
dietílico
0,194 0,360 0,671
0,147
0,174
0,163 0,315 0,535 0,309
0,164 0,253 0,502 0,569
Fuerte
Extracto
total Fuerte
2,297 0,989 0,949
0,849
1,890
0,919 0,834 0,899 0,863
2,455 0,766 1,022 0,957
Fracción
Acuosa
0,436 0,525 0,789
0,116
0,402
0,378 0,566 0,694 0,520
0,391 0,469 0,523 0,669
Fracción
Éter
dietílico
0,488 0,721 0,982
0,759
0,459
0,439 0,839 0,923 0,851
0,451 0,994 0,922 0,942
Elaborado por: Aymacaña A
Tabla 36. Resultados de la absorbancia del blanco, control positivo y
antibiótico frente a Escherichia coli
Repeticiones Promedio
Control
positivo
0,478 0,429 0,512 0,473
Blanco 0,062 0,062 0,064 0,063
Antibiótico 0,244 0,28 0,255 0,260
Elaborado por: Aymacaña A.
El promedio de las repeticiones, así como el control positivo se procedió a restar
el promedio del blanco para realizar el cálculo del porcentaje de inhibición, los datos
del porcentaje de inhibición se presentan en la tabla 37. El porcentaje de inhibición del
antibiótico en la mínima concentración fue de 51,99%.
Tabla 37. Porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones frente a
Escherichia coli.
Variedad Extracto o fracción Porcentaje de inhibición
C1 C2 C3
Hass
Extracto total Hass 22,75% No inhibe No inhibe
Fracción Acuosa No inhibe 3,33% No inhibe
Fracción NaCl 59,55% 21,36% 21,53%
Fracción Éter dietílico 72,95% 39,89% No inhibe
Fuerte
Extracto total Fuerte No inhibe No inhibe No inhibe
Fracción Acuosa 17,38% No inhibe No inhibe
Fracción Éter dietílico 3,33% No inhibe No inhibe
Elaborado por: Aymacaña A.
68
En el procesamiento de datos se realizó un análisis de varianza ANOVA con dos
factores:
- Factor A con 4 niveles (fracciones o extractos)
- Factor B con 3 niveles (diluciones de las fracciones o extractos)
Para evaluar el porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones de la
variedad Hass frente a Escherichia coli donde se propusieron las siguientes hipótesis
sobre el tipo de fracción o extracto:
- Hipótesis nula: El porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli es
igual en todas las fracciones de la variedad Hass
- Hipótesis alternativa: El porcentaje de inhibición frente a Escherichia
coli es diferente en todas las fracciones de la variedad Hass
Tabla 38. Resultados del análisis de varianza frente a Escherichia coli en las
fracciones de la variedad Hass.
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
medio Fexp Ftab
Factor A 3 9365,39 3121,80 5,98 3,01
Factor B 2 569,79 284,89 0,55 3,4
Interacción AB 6 1731,96 288,66 0,55 2,51
Error 24 12540,38 522,52
Total 35 24207,51
Elaborado por: Aymacaña A.
Los datos obtenidos del análisis de varianza se observan en la tabla 38, donde se
concluye estadísticamente lo siguiente:
- Para las fracciones ya que la Fexp es mayor que la Ftab se acepta la
hipótesis alternativa, es decir que las fracciones o extractos de la
variedad Hass producen diferentes porcentajes de inhibición frente a
Escherichia coli.
- Para las diluciones ya que la Fexp es menor que la Ftab no existe una
diferencia significativa de las diferentes diluciones de los extractos o
fracciones de la variedad Hass sobre el porcentaje de inhibición frente a
Escherichia coli, es decir las diluciones del extracto son iguales.
- Para las interacciones entre las fracciones y diluciones ya que la Fexp es
menor que la Ftab no existe una diferencia significativa entre las
diferentes fracciones o extractos y las diluciones de la variedad Hass
sobre el porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli.
69
Para determinar las diferencias del factor A (fracciones o extractos) se realizó la
prueba de diferencia minina significativa (DMS), en la cual se concluyó que todas las
medias de las fracciones son iguales.
Para evaluar el porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones de la
variedad Fuerte frente a Escherichia coli donde se propusieron las siguientes hipótesis
sobre el tipo de fracción o extracto:
- Hipótesis nula: El porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli es igual en
todas las fracciones de la variedad Fuerte.
- Hipótesis alternativa: El porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli es
diferente en todas las fracciones de la variedad Fuerte.
Tabla 39.Resultados del análisis de varianza frente a Escherichia coli en las
fracciones de la variedad Fuerte.
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
medio Fexp Ftab
Factor A 2 169,17 84,58 2,08 3,55
Factor B 2 30,68 15,34 0,38 3,55
Interacción AB 4 19,67 4,92 0,12 2,93
Error 18 730,36 40,58
Total 26 949,88
Elaborado por: Aymacaña A.
Los datos obtenidos del análisis de varianza se observan en la tabla 39, en el
cual se acepta la hipótesis nula (Ho) en los dos factores:
- Para las fracciones ya que la Fexp es menor que la Ftab no existe una
diferencia significativa de las diferentes fracciones o extractos de la
variedad Fuerte sobre el porcentaje de inhibición frente a Escherichia
coli.
- Para las diluciones ya que la Fexp es menor que la Ftab no existe una
diferencia significativa de las diferentes diluciones de los extractos o
fracciones de la variedad Fuerte sobre el porcentaje de inhibición frente a
Escherichia coli.
- Para las interacciones entre las fracciones y diluciones ya que la Fexp es
menor que la Ftab no existe una diferencia significativa entre las
diferentes fracciones o extractos y las diluciones de la variedad Fuerte
sobre el porcentaje de inhibición frente a Escherichia coli.
En la tabla 40 se indican los datos obtenidos de las absorbancias frente a
Staphylococcus aureus.
70
Tabla 40. Resultados de la absorbancia de los extractos y fracciones frente a
Staphylococcus aureus.
Variedad Extracto o
fracción AC1 AC2 AC3 Ablanco Promedio
Hass
Extracto
Hass
0,759 0,545 0,829
0,698
0,590
0,555 0,699 0,995 0,729
0,455 0,942 1,233 1,019
Fracción
Acuosa
0,526 0,363 0,478
0,103
0,684
0,839 0,338 0,482 0,377
0,687 0,429 0,462 0,474
Fracción
NaCl
0,138 0,285 0,376
0,119
0,147
0,157 0,460 0,547 0,328
0,146 0,240 0,300 0,408
Fracción
Éter
dietílico
0,252 0,248 0,496
0,184
0,235
0,222 0,560 0,476 0,418
0,232 0,446 0,375 0,449
Fuerte
Extracto
Fuerte
1,811 0,817 0,986
0,967
1,855
2,049 1,491 1,521 1,067
1,706 0,894 0,921 1,143
Fracción
Acuosa
0,379 0,658 0,863
0,116
0,465
0,429 0,563 0,691 0,632
0,587 0,674 0,742 0,765
Fracción
Éter
dietílico
0,927 0,750 0,794
0,781
1,018
0,945 0,769 0,867 0,802
1,183 0,886 0,975 0,879
Elaborado por: Aymacaña A.
Tabla 41.Resultados de la absorbancia del blanco, control positivo y antibiótico
frente a Staphylococcus aureus
Repeticiones Promedio
Control
positivo
0,347 0,392 0,365 0,368
Blanco 0,063 0,063 0,065 0,064
Antibiótico 0,058 0,061 0,387 0,169
Elaborado por: Aymacaña A.
El promedio de las repeticiones, así como el control positivo se procedió a restar
el promedio del blanco para realizar el cálculo del porcentaje de inhibición, los datos
del porcentaje de inhibición se presentan en la tabla 42. El porcentaje de inhibición del
antibiótico en la mínima concentración fue de 65,50%.
71
Tabla 42.Porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones frente a
Staphylococcus aureus.
Variedad Extracto o fracción Porcentaje de inhibición
C1 C2 C3
Hass
Extracto Hass No inhibe No inhibe No inhibe
Fracción Acuosa No inhibe No inhibe No inhibe
Fracción NaCl 72,62% 13,03% No inhibe
Fracción Éter dietílico 43,59% No inhibe No inhibe
Fuerte
Extracto Fuerte No inhibe No inhibe No inhibe
Fracción Acuosa No inhibe No inhibe No inhibe
Fracción Éter dietílico No inhibe No inhibe No inhibe
Elaborado por: Aymacaña A.
En el procesamiento de datos se realizó un análisis de varianza ANOVA con dos
factores para evaluar el porcentaje de inhibición de los extractos y fracciones de la
variedad Hass frente a Staphylococcus aureus donde se propusieron las siguientes
hipótesis sobre el tipo de fracción o extracto:
- Hipótesis nula: El porcentaje de inhibición frente a Staphylococcus
aureus es igual en todas las fracciones de la variedad Hass
- Hipótesis alternativa: El porcentaje de inhibición frente a Staphylococcus
aureus es diferente en todas las fracciones de la variedad Hass
Tabla 43. Resultados del análisis de varianza frente a Staphylococcus aureus en
las fracciones de la variedad Hass.
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrado
medio Fexp Ftab
Factor A 3 7175,85 2391,95 5,05 3,01
Factor B 2 167,29 83,64 0,18 3,40
Interacción AB 6 840,76 140,13 0,30 2,51
Error 24 11370,55 473,77
Total 35 19554,46
Elaborado por: Aymacaña A.
Los datos obtenidos del análisis de varianza se observan en la tabla 43, donde se
concluye estadísticamente lo siguiente:
72
- Para las fracciones ya que la Fexp es mayor que la Ftab, se acepta la
hipótesis alternativa, es decir que si existe diferencia entre las fracciones
o extractos de la variedad Hass sobre el porcentaje de inhibición frente a
Staphylococcus aureus.
- Para las diluciones ya que la Fexp es menor que la Ftab no existe una
diferencia significativa de las diferentes diluciones de los extractos o
fracciones de la variedad Hass sobre el porcentaje de inhibición frente a
Staphylococcus aureus.
- Para las interacciones entre las fracciones y diluciones ya que la Fexp es
menor que la Ftab no existe una diferencia significativa entre las
diferentes fracciones o extractos y las diluciones de la variedad Hass
sobre el porcentaje de inhibición frente a Staphylococcus aureus.
Para determinar las diferencias del factor A (fracciones o extractos) se realizó la
prueba de diferencia minina significativa (DMS), en la cual se concluyó que todas las
medias de las fracciones son iguales.
En el caso de las fracciones de la variedad Fuerte frente a Staphylococcus
aureus no se pudo realizar el análisis de varianza ya que los resultados obtenidos en
todas las fracciones son cero, es decir las fracciones de la variedad Fuerte no tuvieron
ninguna inhibición frente a Staphylococcus aureus.
Los resultados obtenidos del porcentaje de inhibición en la variedad Hass se
comparan con una investigación realizada por Andrade (2010) en la cual se evaluó la
actividad antimicrobiana de cuatro extractos: metanólico, hexánico, cloroformo y
acetato de etilo. El extracto más efectivo fue el clorofórmico frente Escherichia coli y
Staphylococcus aureus, ya que presento muy buena actividad antimicrobiana, a
diferencia en esta investigación ya que la fracción más efectiva frente a Escherichia coli
fue la de éter dietílico.
73
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1.CONCLUSIONES
- Se realizó la caracterización bromatológica de la cáscara de aguacate (Persea
americana) de las variedades Hass y Fuerte, y posterior extracción e
identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana y antioxidante.
- Se determinó la composición proximal de la cáscara de aguacate (Persea
americana) en la variedad Hass se obtuvieron los siguientes resultados: 9,46%
humedad, 6,65% cenizas, 7,42% proteína, 13,64% grasa, 46,59% fibra cruda y
16,24% carbohidratos. En la variedad Fuerte: 9,10% humedad, 7,71% cenizas,
6,49% proteína, 20,41% grasa, 39,26% fibra cruda y 17,05% carbohidratos.
Estadísticamente se concluyó que el porcentaje de humedad y carbohidratos de
las dos variedades son iguales.
- Se realizó una extracción mediante una maceración con etanol al 96%, posterior
de la maceración se realizó tres fraccionamientos, obteniendo distintas
fracciones, donde se identificaron los grupos de compuestos fitoquímicos,
mediante pruebas cualitativas de tamizaje fitoquímico, en el primer
fraccionamiento de la variedad Hass se obtuvieron: en la fracción hexano
triterpenos y/o esteroides, en la fracción acuosa aminas, quinonas y compuestos
fenólicos y/o taninos, en la fracción NaCl compuestos fenólicos y/o taninos, en el
segundo fraccionamiento, en la fracción hexano triterpenos y/o esteroides y
compuestos grasos, fracción éter dietílico compuestos fenólicos y/o taninos y
quinonas, y en el tercer fraccionamiento, en la fracción acetato de etilo 1 se
evidenció la presencia de compuestos grasos y en la fracción acuosa alcaloides.
Para la variedad Fuerte en el primer fraccionamiento se obtuvieron: fracción
hexano triterpenos y/o esteroides y compuestos grasos, fracción acuosa
saponinas, aminas, quinonas y compuestos fenólicos y/o taninos, en el segundo
fraccionamiento, fracción hexano triterpenos y/o esteroides y compuestos grasos,
fracción butanol saponinas, fracción éter dietílico compuestos fenólicos y/o
taninos y quinonas.
- Se evaluó la actividad antioxidante de las fracciones obtenidas en donde se
determinó que la fracción con mayor capacidad de inhibir la actividad del DPPH
es la fracción acuosa, del primer fraccionamiento, de la variedad Fuerte ya que
con el menor volumen de extracto que fue de 0,002 ml se obtuvo 74,35% de
inhibición y con 0,160 ml la inhibición fue de 83,39%.
74
- Se evaluó la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas mediante el
ensayo de microdilución en placa, se puede concluir que la variedad donde se
obtuvo un porcentaje de inhibición considerable es en la variedad Hass, en el
cual el mayor porcentaje de inhibición fue de 72,95% en la primera
concentración de 1,68mg/ml frente a Escherichia coli en la fracción éter
dietílico, en cambio el porcentaje de inhibición frente a Staphylococcus aureus
fue de 72,62% en la primera concentración de 1,57mg/ml con la fracción NaCl
de la variedad Hass. Comparando los resultados obtenidos con la inhibición del
antibiótico (ceftriaxona) que fue de 51,99% para Escherichia coli y 65,50% para
Staphylococcus aureus se concluye que la inhibición de las fracciones de la
variedad Hass fue mejor.
- Se comparó los resultados de la actividad antioxidante y antimicrobiana entre las
cáscaras de aguacate de la variedad Hass y Fuerte en donde se concluyó que en la
variedad Fuerte la actividad antioxidante es mejor y en cuanto a la actividad
antimicrobiana la variedad Hass tuvo mejores resultados.
5.2.RECOMENDACIONES
- Realizar más estudios sobre la actividad antioxidante y antimicrobiana la cáscara
de aguacate utilizando otras variedades ya que en el Ecuador existen 32
variedades de aguacate.
- Para el ensayo de actividad antimicrobiana se recomienda realizar la
concentración mínima inhibitoria para identificar con mayor claridad la
concentración en la cual empieza la inhibición, además de realizar la validación
del método de microdilución en placa para determinar si es el adecuado para este
tipo de extractos y fracciones.
- Realizar un proceso de purificación de los extractos obtenidos para que el color
no interfiera en el ensayo de actividad antimicrobiana.
- Realizar un análisis del tipo de ácidos grasos del aceite ya que se obtuvo un
porcentaje aceptable de grasa en el análisis bromatológico.
- Realizar estudios sobre la utilización de la cáscara de aguacate de la variedad
Hass y Fuerte para alimentación de animales por su alto contenido de fibra cruda
y proteína.
75
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80
ANEXOS
Anexo 1. Árbol de problemas
Contaminación ambiental
Aumento de desechos en las industrias de
procesamiento de aguacate
Mal manejo de la
administración en el
tratamiento de desechos
Crecimiento de plagas
y enfermedades
Falta de conocimiento en el
tratamiento de desechos
Desconocimiento de los
compuestos antimicrobianos
de la cáscara de aguacate
Falta de aprovechamiento
de las propiedades
funcionales de la cáscara de
aguacate
Desconocimiento de los
compuestos antioxidantes de
la cáscara de aguacate
Ausencia de control
ambiental en las
industrias
Mayor cantidad de
residuos vegetales
Disminución de
ingresos
Subproductos del
aguacate desperdiciados
Deterioro de
ecosistemas
Acumulación de
material perjudicial
para la salud
81
Anexo 2. Categorización de variables
Aguacate
Cáscara de agucate
Analisis bromatologicos
Componentes químicos
Antibioticos AntioxidantesMétodos de determinación
Variedad de aguacate
82
Anexo 3. Certificación de la obtención de la muestra.
83
Anexo 4. Puntos críticos para la distribución T de Student.
84
Anexo 5. Valores críticos de F para una prueba de dos colas (p=0,05).
85
Anexo 6.Proceso de preparación de la muestra.
1. Aguacates maduros 2. Limpieza de la cáscara de
aguacate de la variedad Fuerte
3. Limpieza de la cáscara de aguacate variedad Hass
4. Secado de las cáscaras en la estufa
5. Reducción del tamaño de muestra en un molino
6. Muestras ya tratadas
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7. Almacenamiento de las muestras
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Anexo 7. Proceso de extracción.
1. Cáscara de aguacate Fuerte 2. Cáscara de aguacate Hass
3. Cáscara de aguacate Hass con etanol al 96%
4. Cáscara de aguacate Fuerte con etanol al 96%
5. Muestras en agitación por 24 horas
6. Filtración de los extractos
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7. Concentracción del extracto 8. Extracto original
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Anexo 8.Pruebas cualitativas para el tamizaje fitoquímico.
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Anexo 9. Resultados de placas de cromatografía en capa fina
1. Placa de Alcaloides 2. Placa de esteroles
3. Placa de antraquininas 4. Placa de naftoquinonas
5. Placa de taninos
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Anexo 10.Ensayo de la actividad antimicrobiana por el método de
microdilución en placa.
1. Placas listas para incubar2. Lecturas de absorbancia frente
a Escherichia coli
3. Lecturas de absorbancia frente a Staphylococcus aureus