“universidad central “marta de las villas
TRANSCRIPT
“Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas
Facultad Química‐Farmacia Departamento de Lic. Química
Título: “Estudio de Residuales del proceso de obtención de etanol a partir de bagazo”.
Autor: Luis Manuel Peralta González Tutores: Dr. José OrestesGuerra de León
M.Sc Edell Jiménez López
Curso 2008‐2009
Pensamiento
Pensamiento
“Nunca consideres el estudio como una obligación sino como una
oportunidad para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber.”
Albert Einstein
Dedicatoria
Dedicatoria
Le dedico mi Tesis de Grado a: La mujer más hermosa y más capaz nacida en la tierra, mi mamá, Susana González Pérez, muchísimas gracias por regañarme, darme tu cariño, tu amor, comprensión y felicidad, guiarme por el camino correcto en este mundo tan difícil de vivir. Para tí recíprocamente todo lo que tú siempre has querido y querrás. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.
El hombre que puso su granito en el lugar y momento preciso, mi padre, Luis Manuel Peralta Suárez, “El mejor en todo y de todos”, sin duda una persona magnífica. Muchísimas gracias por regañarme, darme tu cariño, amor, comprensión y felicidad, guiarme por el camino correcto en este mundo tan difícil de vivir. “Siempre vivirás convencido que yo viviré para ti”.
A mi hermana, mujer que para mi es y será un ejemplo a seguir como persona y profesional. Gracias a todas esas broncas que cuando éramos niños corríamos por toda la casa, que lo menos que surgió desde ese tiempo fue y seguirá siendo el gran cariño y amor que siento por tí. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.
No por ser la última es menos importante en mi vida, sino más especial y es a la mujer que amo, con la cual compartiré mis defectos, virtudes, felicidad y mi vida entera. A ella tan chiquita de tamaño pero con un corazón sin límites, te doy las gracias por permanecer a mi lado en los buenos y malos momentos en estos cuatro años que llevamos juntos, mi chiquitita Yoslainy Echevarría Valdés te amo con todo mi corazón y te deseo lo mejor en esta vida. “Siempre vivirás convencida que yo viviré para ti”.
Agradecimientos
Agradecimientos
Quiero agradecer a todas aquellas personas que de una forma u otra estuvieron presentes en mi
formación académica.
A mi tu tutor José Orestes Guerra de
León por su dedicación y esmero en el desarrollo
de la tesis, así como Edell Jiménez López por
su ayuda incondicional.
Agradezco a todos lo profesores del
departamento de Lic. en Química que
influyeron en mi formación profesional así
como a los técnicos de laboratorio.
A mi Mamá Susana Gonzáles Pérez, mi
Papá Luis Manuel Peralta Suárez, María
Josefa Peralta González y mis abuelos Rafael y
María guías de mi educación y formación en la
vida.
A mi otra familia entre ella a mi
chiquitita Yoslainy Echevarría Valdés que
estuvo presente en cuatro de los cinco años de
la carrera apoyándome en los buenos y malos
momentos, así como también a mis dos suegros
realmente no quiero conocer otros, para mi dos
personas magníficas que siempre me han
ayudado en todo lo que ha estado a su alcance.
No por ser los últimos son menos
importantes para mí sino que son más
especiales, me refiero al grupo que ha sido único
e inseparable en estos cinco años de la carrera,
ellos son: Yoslainy Echevarría Valdes, Lisdelys
González Rodríguez, Yoan Hidalgo Rosa,
Oscar Martínes Santiago, Reinier Tumbarell
Silva y Manuel Alejandro Treto Suárez. Para
ellos mis más humildes agradecimientos y les
deseo lo mejor del mundo tanto en sus vidas
cotidianas como profesional.
Índice
ĺndice
Resumen 1
Abstract 2
Introducción 3
Capítulo I: Revisión Bibliográfica 6
1.1 Hemicelulosa 6
1.1.1 Caracterización de Hemicelulosa 7
1.2 Xilanos 12
1.2.1 Caracterización de xilanos y xilooligosacáridos 15
Capítulo II: Materiales y Equipos 19
2.1. Principales equipos utilizados 19
2.2. Reactivos y disolventes 19
2.3. Tratamiento de los residuales del proceso industrial 20
2.4 Determinación de cenizas 22
2.5 Determinación cualitativa de azúcares 22
2.5.1 Hidrólisis de los polisacáridos 22
2.5.2. Obtención de derivados para la Cromatografía Gaseosa 22
2.5.2.1. Acetilación 22
2.5.2.2. Silalización 23
2.5.2.3 Preparación de los patrones. D-xilosa y D-arabinosa 23
Capítulo III: Resultados y Discusión 24
3.1 Estudio de los residuales acuosos R-1 y R-2 24
3.2. Estudio de los productos R’-1 y R’-2 27
3.3 Estudio de R’-1 y R’-2 mediante la técnica de cromatografía
gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas 29
Conclusiones 33
Recomendaciones 34
Bibliografía 35
Anexos
Resumen
Resumen
Resumen
Del proceso de obtención de etanol a partir de bagazo de caña se obtienen
residuales ricos en carbohidratos que fueron sometidos a un proceso de
neutralización y decoloración utilizando una columna de carbón activado,
hasta obtener productos con mayor grado de pureza. Utilizando
procedimientos químicos de hidrólisis y derivatización, en combinación con la
cromatografía gaseosa acoplada a la espectrometría de masas, junto a la
información ofrecida por la espectrometría infrarroja y de resonancia
magnética nuclear, nos permitió una caracterización parcial de uno de estos
productos, el cual está constituido fundamentalmente por polímeros de xilosa
y arabinosa, lo que le confiere a este proceso un valor adicional.
Palabras claves: Bagazo, carbohidratos, derivatización, Resonancia Magnética
Nuclear, Espectrometría IR, Cromatografía Gaseosa.
1
Abstract
Abstract
Abstract
They obtain themselves of the process of obtaining of ethanol as from
bagasse of cane residual rich in carbohydrates that they were subdued to a
process of neutralization and discoloration using a column of coal activated,
to get products with bigger degree from purity. Using chemical procedures of
hydrolysis and derivatization in combination with the gaseous coupled
chromatography to the spectrometry of mass, beside the information offered
by the infrared spectrometry and of magnetic nuclear resonance, you allowed
us to a partial characterization of one of these products, that is constituted
fundamentally from polymers of xylose and arabinose, that you confer this
process an additional value.
Key word: Bagasse, carbohydrates, derivatizatión, Spectrometry NMR,
IR Spectrometry, Gas Chromatography.
Introducción
Introducción
Introducción
El bagazo de caña de azúcar es un desperdicio lignocelulósico abundante
típicamente encontrado en países que procesan caña de azúcar como Brasil,
India, Cuba, y China (Martinez, 2003). En general, las fábricas de azúcar
generan aproximadamente 270 kg de bagazo por tonelada métrica de caña
de azúcar. El Bagazo generalmente contienen celulosa del 40-45% y 30-35%
de hemicelulosas (Sun, 2004). Esta biomasa es, por consiguiente, una
materia prima renovable para la elaboración de productos químicos de
valores agregados a partir de componentes lignocelulósicos, como
hemicelulosas, siendo el bagazo usualmente almacenado, constituyendo un
problema medioambiental, debido al riesgo de combustión espontánea del
bagazo (Baudel, 2005). El proceso de obtención de etanol a partir de bagazo
actualmente en fase de investigación y desarrollo, es una vía promisoria que
aporta soluciones a la problemática medio ambiental y energética. Una ruta
química es la conversión de celulosa y hemicelulosa a azúcares fermentables
a partir de los cuales es posible obtener el etanol por vía fermentativa. Los
azúcares fermentables obtenidos son glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y
manosa. En el proceso el bagazo transcurre por dos pre tratamientos los
cuales son necesarios para un mejor rendimiento de estos azúcares. La
biomasa se pre trata primeramente con ácido sulfúrico (1.25%) para dar
lugar a un residual ácido y un segundo tratamiento con hidróxido de sodio
(1.5-30 %) y Etanol (10-45 %) obteniéndose un residual básico,
posteriormente se realiza la hidrólisis enzimática y el producto obtenido se
fermenta, como muestra la figura 1.1.
Bagazo Tratamiento Tratamiento Hidrólisis Enzimática
R-1 R-2
Fermentación
Destilación
Figura 1.1. Proceso de obtención de alcohol a partir de bagazo.
H2O H2SO4 H2O EtOH NaOH
3
Introducción
Esta biomasa provee materias primas baratas para la producción biológica de
combustibles y productos químicos, el cual ofrece ventajas económicas,
medioambientales, y estratégicas. Después de la celulosa, la hemicelulosa es
la segunda familia del mundo más abundante de polímeros y así representan
un recurso renovable enorme que permanece casi completamente sin uso.
Sin embargo, en estos últimos años emerge interés para la aplicación de
hemicelulosas como polímeros y otro compuestos (Gatenholm, 2004). Por
ejemplo: xilanos, obtenidos a partir de madera o paja del cereal, han sido
probados como formadores de gel o para materiales termoplásticos (Rajesh,
2001), Además de los polímeros, la xilosa obtenida por la hidrólisis ácida
diluida, pueden ser convertidos a xilitol, un producto de alto valor específico
para la hidrogenación catalítica o enzimática (Mikkola, 2001). En el campo de
la alimentación se emplean como prebióticos, tales azúcares se denominan
ingredientes alimenticios no digestibles, que están presentes en
Xilooligosacáridos, Fructooligosacáridos, Glucooligosacáridos,
Galactooligosacáridos y son aplicados en dietas especiales de antiobesidad.
En el campo farmacéutico se utiliza en la prevención y tratamientos de
infecciones gastrointestinales, es agente activo en contra de Osteoporosis,
Otitis, Enfermedades en la piel y el pelo. En el campo de la agricultura es
utilizado como agente madurante, acelera y estimula el crecimiento,
logrando un aumento del rendimiento (Wang, 2009).
4
Introducción
Estos residuales, deben estar constituidos por alguno de los componentes
que originalmente tiene el bagazo, pero hasta el momento no se les da
ningún uso por tanto estamos en presencia del siguiente problema científico:
No se conoce la naturaleza y composición química de los residuales del
proceso de producción de etanol a partir de bagazo de caña, razón por
la cual estos constituyen un problema medioambiental y no se ha
evaluado la posibilidad de utilización para la obtención de otros
productos, que beneficien el balance económico del proceso.
Para resolver el mismo nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo:
Los residuales generados durante la producción de etanol a partir del
bagazo de caña están constituidos básicamente por polisacáridos de
los que podrían obtenerse productos de interés que confieren a este
proceso un valor adicional a la vez que se reduciría la carga
contaminante.
Para esto nos trazamos el siguiente objetivo general:
Determinar la composición y naturaleza química de los residuales obtenidos del proceso de obtención de alcohol a partir de bagazo.
Como objetivos específicos:
Implementar un procedimiento para el tratamiento de los residuales que permita obtener productos de mayor pureza.
Estudiar las condiciones de trabajo necesarias para la determinación de carbohidratos mediante la técnica de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas.
Utilizar las técnicas espectroscópicas de IR y RMN en el estudio estructural de los productos obtenidos.
5
Revisión Bibliográfica
Revisión Bibliográfica
Capítulo I
Revisión Bibliográfica
1.1 Hemicelulosa
La hemicelulosa contiene un grupo de polisacáridos complejos, son
biosintetizados en grandes cantidades, en la mayoría de árboles y plantas
terrestres. Una producción anual mundial estimada de hemicelulosas está
en el rango de 60 billones de toneladas. Basados en el estadio del
conocimiento actual, las hemicelulosas pueden estar divididas en cuatro
clases generales de diferentes estructuras de polisacáridos de la pared
celular: xilanos, mannanos, β-glucanos, xiloglucanos. Una estructura de la
hemicelulosa ha sido propuesta (Oraphin Chaikumpollerta, 2004). Ver figura
1.2.
6
Revisión Bibliográfica
1.1.1 Caracterización de Hemicelulosa
Un grupo de investigadores chinos estudiaron la hemicelulosa del bagazo de
caña de azúcar, mediante las extracciones obtenidas por el método de
extracción ultrasónico. Los resultados mostraron que las extracciones con
tratamiento ultrasónico, en medio alcalino y peróxido alcalino bajo las
condiciones dadas dieron para una liberación sobre el 90 % de
hemicelulosas y lignina originales. Este hecho así como también la
composición de azúcar y características estructurales de las siete fracciones
hemicelulósicas aisladas indicaron que la ultrasonificación atacó las paredes
celulares íntegramente, cortó los enlaces de éter entre la lignina y la
hemicelulosa, y aumentó accesibilidad y extracción de la hemicelulosa.
Aumentando la concentración alcalina de 0.5 al 2M y el porcentaje de
peróxido de hidrógeno (pH 11.5) de 0.5 % a 3.0 % dieron como resultado
degradación de la cadena principal hemicelulósica como se muestra por una
disminución en sus pesos moleculares de 43580 hasta 14470 g mol-1 y
30180 hasta 18130 g mol-1, respectivamente. Sin embargo, no hubo
diferencias significativas en las características estructurales de las siete
secuenciales fracciones de la hemicelulosa alcalina y solubles en peróxido,
las cuáles están compuestas principalmente de L-Arabino-(4-O-metil-D-
glucurono)-D-xilanos y se encontró que ácidos Ferúlico y p-coumárico están
químicamente vinculados con la hemicelulosa (Jing-Xia Sun, 2004).
Alrededor del 90 % de la hemicelulosa y lignina original en las paredes
celulares del bagazo fue secuencialmente extraído con agua destilada, 0.5M
de NaOH, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y H2O2 (3.0 %) a pH 11.5, y NaOH (2.0 M) a
55 ºC por 2 h. La composición química, las propiedades físico-químicas, y
las estructuras de las ocho hemicelulosa fueron elucidadas por una
combinación de análisis de azúcar, oxidación con nitrobenceno de lignina
enlazada, determinación molecular, espectroscopía infrarroja con
transformada de Fourier, RMN (1H y 13C) y análisis térmico.
7
Revisión Bibliográfica
Los resultados demostraron que los tratamientos secuenciales fueron muy
efectivos en el fraccionamiento y extracción de la hemicelulosa del bagazo,
la concentración de álcali y peróxido tuvieron gran influencia en las
características químicas y estructurales de la hemicelulosa del bagazo,
contenido de lignina asociado y el peso molecular. La fracción de la
hemicelulosa aislada en H2O2 (0.5%) a pH 11.5 por 2h bajo 55 ºC tiene una
cadena principal de xilosa enlazada β-(1-4) y se encontró residuos de
unidades de arabinofuranosil y 4-O-metilglucopiranosil como cadenas
laterales.
Un estudio comparativo de los polisacáridos de la hemicelulosa del bagazo
de la caña de azúcar en solubilidad alcalina y solubilidad en solvente
orgánico ácido fue estudiado por F. Xu y colaboradores. Se realizó un
tratamiento de dos etapas del bagazo de caña de azúcar en medio
ligeramente básico y 1,4-dioxano en medio ligeramente ácido.
Pretratamiento con solución acuosa NaOH (1 M) a 20, 25, 30, 35, y 40 °C
por 18h resultando 55.5 %, 57.3 %, 59.1 %, 60.9 %, y 62.1 % de la
hemicelulosa original, respectivamente. El post tratamiento del
correspondiente residuo con 1,4-dioxano y HCl (2M) (9:1, v/v) a 87 °C por
2h, respectivamente, degradó 11.6 %, 11.9 %, 11.4 %, 10.9 %, y 10.6 %
de hemicelulosa (% materia seca del material de partida). Fue encontrado
que las cinco preparaciones solubles en álcali de la hemicelulosa, contenía
mayor cantidad de xilosa (78.0-82.2%) y ligeramente alto los ácidos
urónicos (4.8-5.8%), principalmente de ácido 4-O-metil-D-
glucopiranosilurónico, pero fue inferiores en arabinosa (9.3-11.7%) y
glucosa (2.2-4.1%) que las cinco fracciones acídicas correspondientes a la
hemicelulosa degradada en dioxano, en las cuales: xilosa (44.9-46.8%),
arabinosa (35.9-38.1%) y glucosa (13.0-13.7%) fueron los componentes
principales de azúcar. Los estudios revelaron que las cinco preparaciones
solubles en álcali de la hemicelulosa fueron más lineales, tuvieron un peso
molecular más alto (35200-37430 g mol-1) que las fracciones de la
hemicelulosa degradada durante el post tratamiento acídico con dioxano
(12080-13320 g mol-1).
8
Revisión Bibliográfica
Esto demostró que el post tratamiento con dioxano acídico bajo las
condiciones usadas dio como resultado degradación sustancial de los
polímeros de la hemicelulosa. Las 10 muestras de hemicelulosa fueron más
allá caracterizadas por análisis FT-IR, espectroscopía de RMN (1H y 13C) y
análisis térmico (F. Xu, 2006).
La estructura de la hemicelulosa extraída a partir de hierbas Vetiver
(Vetiveria Zizanioides Nash) fue estudiada por Oraphin Chaikumpollert y
colaboradores. Las composiciones de monosacáridos y la posición de los
enlaces entre monosacáridos en la hemicelulosa fueron definidas por
hidrólisis con TFA y análisis de metilación, respectivamente. Los métodos
espectroscópicos 13C RMN y FT-IR dieron detalles de la configuración de los
enlaces anoméricos y confirmaron la estructura de la hemicelulosa. La
estructura propuesta de la hemicelulosa de esta materia prima es un
arabinoxilano principalmente consistente en (1-4)-β-D-xilano de cadena
principal substituida en O-2 y O-3 por residuo de α-L-arabinosa, residuo de
ácido α-D-glucurónico y las cadenas cortas de residuos de azúcares
conteniendo arabinosa, xilosa y galactosa. Además, los enlaces β-(1-4) de
los D-xilopiranosil residuos en la cadena principal pueden contener ácidos
fenólicos substituidos (por ejemplo ácido ferúlico y ácido p-coumárico). Los
ácidos fenólicos substituidos son esterificados por sus grupos carboxilos, por
el hidroxilo del C-5 de los residuos de α-L arabinofuranosil como cadena
lateral (Oraphin Chaikumpollerta, 2004).
Runcang Sun y equipo de trabajo estudiaron seis fracciones
hemicelulósicas, las cuales fueron extraídas sucesivamente de paja de trigo
ya descerada con hidróxido sódico en incremento de fortaleza de 0.25 hasta
2.OOM. La estructura de la fracción hemicelulósica 2 fue investigada usando
hidrólisis ácida, análisis de metilación y experimentos 13C-RMN. Se confirmó
que la hemicelulosa esta formada por (1-4)-β-D-xilanos enlazado con ácido
D-Glucopiranosilurónico (ácido 4-O-metil-α-D-glucopiranosilurónico) grupo
adjunto en posición 2, L-arabinofuranosil y grupos de D-Xilopiranosil
adjunto en posición 3. Para cada 26 residuos de D-Xilopiranosil en la cadena
principal, hubo una unidad de ácido urónico, para 13 residuos D-
xilopiranosil, hubo un grupo de L-Arabinofuranosil, y para 18 residuos de D-
Xilopiranosil, hubo un grupo de D-Xilopiranosil (Runcang Sun, 1996).
9
Revisión Bibliográfica
Youssef Habibi junto a colaboradores lograron aislar xilanos del pericarpio
de semillas de pera de Opuntia Ficus indica (OFI) por extracción alcalina,
fraccionada por precipitación y purificada. Seis fracciones fueron obtenidas
y caracterizadas por análisis de azúcares y espectroscópico de RMN. Fue
asumido para ser (4-O-metil-D-glucurono)-D-xilanos, con grupos de ácido
4-O-α-D-glucopiranosilurónico enlazados en C-2. La composición de azúcar
y los espectros de 1H, 13C RMN demostraron que sus estructuras químicas
fueron muy similares, pero con proporciones diferentes de D-Xilosa y ácido
4-O-Me-D-Glucorónico. Los resultados mostraron que, como promedio, los
xilanos solubles en agua tiene un residuo terminal poco reductor ácido 4-O-
metil-D-glucurónico por cada 11 hasta 14 unidades de xilosa, considerando
los xilanos poco solubles en agua cuando las unidades de xilosa pueden
variar de 18 hasta 65 residuos por un residuo terminal no reductor de ácido
4-O-metil-D-glucurónico (Youssef Habibi, 2002).
El material proveniente de la pared celular de arbustos chino Haloxylon
Ammodendron y Elaeagnus angustifolia fue fraccionado por extracciones
sucesivas con etanol/H2O (60:40, v/v) bajo condiciones acídicas (HCl 0.2N)
a 70 °C por 4h, y 2 % H2O2 a pH 11.5 por 16 h, respectivamente. El
tratamiento secuencial de dos etapas dio como resultado la disolución de
83.9 % y 87.6 % de la hemicelulosa original descerada de H. ammodendron
y E. angustifolia, respectivamente. Xilosa, glucosa, y galactosa fueron los
componentes principales de azúcar en las dos preparaciones acídicas de la
hemicelulosa soluble en solventes orgánicos. Las dos fracciones solubles en
peróxido de la hemicelulosa fueron mostradas para ser compuestas
primordialmente de xilosa, comprendiendo sobre 80 % de los azúcares
totales. Los resultados también mostraron que las dos fracciones
hemicelulósicas soluble en peróxido alcalino fue más lineal, y tuvo masa
molecular y estabilidad térmica mayor que las dos fracciones acídicas de la
hemicelulosa soluble en organosolvente. El post tratamiento de H2O2 (2 %)
no resultó en ningún cambio significativo en la estructura macromolecular
de la hemicelulosa aislada. Es probable que la lignina proteja a la
hemicelulosa y la celulosa fuese atacada por peróxido (Xiao-Feng Sun,
2002).
10
Revisión Bibliográfica
Los polisacáridos de Hemicelulosa fueron aislados de órganos de la palma
de Phoenix Dactylifera L. por extracción alcalina y fraccionados por
precipitación. Las investigaciones estructurales fueron logradas por
espectroscopía RMN y análisis de azúcares. Las fracciones solubles en agua
fueron asumidas para ser arabinoglucuronoxilanos, con grupos de ácido 4-
O-α-D-glucopiranosilurónico enlazado en C-2 y arabifuranosil en C-3. Las
fracciones no solubles en agua fueron asumidas para ser (1-4)-β-D-xilanos
enlazado con un grupo ácido 4-O-metil-α-D-glucopiranosilurónico enlazado
en C-2. La composición de azúcar y los espectros de 1H, 13C RMN
demostraron que sus estructuras químicas fueron muy similares, pero con
proporciones diferentes de 4-O-Me-D-GlcA (Abdelkader Bendahou, 2007).
Los polímeros principales de la matriz hemicelulósica, de la pared celular de
Aristida pungens, una hierba perenne ampliamente distribuida en las
regiones áridas argelinas fueron aislados de las hojas con solución acuosa
KOH (14%). El método de extracción produjo dos fracciones de la
hemicelulosa (A y B) dando razón de 3.5 y 10.1 % del material de partida
respectivamente. Los métodos GC y 13CRMN mostraron la presencia de
xilosa como el componente principal con residuos arabinosil. Ambos análisis
mostraron que la hemicelulosa de las hojas de A. pungens son
arabinoxilanos. Los materiales resultantes fueron caracterizados por FT-IR,
espectroscopía de 1HRMN y análisis termogravimétricos (Lahouari Chaa,
2008).
1.2 Xilanos
Los xilanos están ubicados a lo largo del crecimiento de la pared y forman la
masa de la fracción de la hemicelulosa de las angiospermas. La estructura
general de los xilanos en plantas más altas son de cadena principal de D-
xilopiranosa unidos por enlaces β-(1-4) (Oraphin Chaikumpollerta, 2004, F.
Xu, 2006, Paul Robert and LUC SAULNIER*, 2005). Los xilanos son
moléculas grandes con un grado de polimerización de 150-200. Adjunto a la
cadena carbonada están las cadenas laterales terminales pequeñas.
11
Revisión Bibliográfica
En las angiospermas éstas son unidades de ácido 4-0-metil-D-glucurónico
que están adjuntado a la xilosa de la cadena principal por enlaces α-(1-2), y
estos están distribuidos al azar a lo largo de la cadena principal.
Aproximadamente la relación en que se encuentran es un ácido urónico
para cada diez residuos del xilosa (Youssef Habibi, 2002) y en la mayoría
estos grupos ácidos están presentes como ésteres y no como ácidos libres
(Aline Barbat, 2008, ZHU, 2005). En la naturaleza cerca de la mitad de los
grupos de xilosa en la cadena del polisacárido están acetilados. La mayoría
de la acetilación ocurre en C-3 aunque hay una cierta cantidad en C-2, y
ciertos residuos de xilosa están acetilados en ambos, C-2 y C-3 (Debora
Nabarlatz, 2007). Cuando los xilanos acetilados están aislados se encuentra
que son solubles en agua, especialmente comparado con los polímeros
desacetilados obtenidos a partir de la pared celular por extracción alcalina.
Los grupos de acetilo son lo suficientemente numerosos para impedir
alineación de las cadenas moleculares, y la agregación molecular no puede
tener lugar. Así la presencia de los grupos de acetilo tiene influencia sobre
la asociación de estas cadenas con otras y con otros polisacáridos dentro de
la estructura de la pared celular (NORTHCOTE, 1972). La conformación de
la formación de xilanos han sido investigadas por análisis de rayos X, y la
presencia de enlaces de hidrógenos han sido estudiadas por investigaciones
infrarrojas polarizadas. Ha sido mostrado que las moléculas existen como
las cadenas extendidas en forma de tornillo, pero a diferencia de celulosa
las cadenas no están estabilizadas por enlaces intermoleculares de
hidrógeno. No obstante, los agrupamientos ocurridos de la cadena ha sido
mostrado para estar estabilizado por la inclusión de moléculas de agua en la
estructura cristalina, y hay un rango continuo de xilanos hidratados. La
estructura del hidrato de los xilanos pueden ser representada por un
enrejado cristalino en el cual un sitio dentro del enrejado es ocupado por
una columna de moléculas de agua que estabiliza la estructura
(NORTHCOTE, 1972). Este sitio hidrófilo dentro del enrejado también puede
acomodar el ácido 4-O-metil-D-glucurónico y las cadenas laterales de
arabinofuranosa que pueden sujetar las moléculas de agua en esta posición.
Diferentes tipos de xilanos así como sus oligómeros se han reportado en la
literatura: kenaf, hierbas, frutas, cereales, tallo del tabaco, del algodón, del
girasol. En la figura 4 se ilustran algunos ejemplos.
12
Revisión Bibliográfica
13
Revisión Bibliográfica
1.2.1 Caracterización de xilanos y xilooligosacáridos
Los diferentes desperdicios agrícolas, particularmente el tallo de tabaco
(TS), el tallo de algodón (CS), el tallo del girasol (SS), y la paja de trigo
(WS), sirvieron para la producción de xilooligosacáridos (XOs). La
producción de XOs fue realizada por hidrólisis ácida de xilanos, el cual fue
obtenido por extracción alcalina de estos desperdicios agrícolas. El
componente principal de estos desperdicios agrícolas fue determinado como
celulosa (30-42%), fue seguido por xilanos (20%) y lignina (20-27%). Los
xilanos de estos desperdicios tuvieron principalmente xilosa (85-96%) con
pequeñas cantidades de glucosa, mientras que los xilanos de la paja de
trigo contenían también arabinosa. La mejor conversión de xilanos en XOs
fue lograda con H2SO4 (0.25 M) con tiempo de reacción 30 min. En estas
condiciones, el rendimiento de XOs estaba entre 8 % y 13 %. El
rendimiento de XOs depende de ambos, el tiempo de hidrólisis y
concentración de ácido, pero el rendimiento de monosacárido depende de la
estructura y composición del xilano, además de la concentración de ácido y
el tiempo de reacción. El xilano más ramificado, WSX, dio el rendimiento de
monosacárido más alto (16 %) y furfural (49 mg/100 g xilano) (Ozlem
Akpinar *, 2009).
La producción de Xilooligosacáridos (XOs) fue realizada por hidrólisis
enzimática de xilano que fue obtenido por extracción alcalina del tallo de
tabaco (CS) del tallo de algodón (TS), y paja de trigo (WS). El xilano fue
hidrolizado usando Trichoderma Longibrachiatum Xilanasa, y los efectos de
pH, temperatura, tiempo de hidrólisis, las concentraciones de substrato y de
la enzima en el rendimiento de Xilooligosacáridos y el grado de
polimerización fueron investigados. Fue encontrado que estos tres
desperdicios agrícolas contenían cantidades diferentes de xilano, celulosa y
que la lignina y el xilano obtenido a partir de estas fuentes contenían
cantidades diferentes de azúcar y ácido urónico. Los xilanos de WS tuvieron
cantidades mayores de arabinosa mientras los otros xilanos principalmente
tuvieron xilosa y cantidades pequeñas de glucosa.
14
Revisión Bibliográfica
Trichoderma longibrachiatum xilanasa hidrolizó la paja de trigo donde los
xilanos estaban altamente ramificado (WSX) en mayor medida que los
xilanos del tallo de algodón (CSX) y del tallo de tabaco (TSX), bajo
condiciones favorables (tiempo de reacción de 8 h a pH 4.6 y 50 ºC). El
análisis TLC de los productos de hidrólisis indicó que el producto de
hidrólisis de T. longibrachiatum xilanasa contenía cantidades diferentes de
oligosacáridos (X2, X3, X4, X5, X6, X7) con algunos monosacáridos. A pesar
de las diferencias estructurales de los tipos del xilanos, todos generaron
XOs con grados diferentes de polimerización (Bostanci, 2009).
Un análisis de metilación y parcial hidrólisis ácida de xilanos del vástago y
corazón del kenaf (Hibisco cannabinus) mostró que la cadena principal de
estos xilanos consiste en residuos (1-4)-β-D-xilopiranosil (Xilp), algunas
unidades de la cadena principal llevan enlazados ácido α-(1-2)-4-O-metil-D-
glucopiranosilurónico (Me-GlcAp) y residuos de ácido glucopiranoslurónico
(GlcAp) de las cadenas laterales. La hidrólisis parcial de los xilanos del
kenaf le proporcionó dos series de ácidos aldourónico a partir de aldobio
hasta los ácidos aldotetraourónico. Los ácidos de la primera serie
compuesta de residuos de 4-O-Me-D-GlcAp y de D-Xilp: 4-O-Me GlcA-Xil3,
4-O-Me GlcA-Xil2 y 4-O-Me GlcA-Xil. Las segundas series compuestas de D-
GlcAp y D-Xilp: GlcA-Xil3, GlcA-Xil2 y GlcA-Xil. Además para estos ácidos,
otro ácido aldobiourónico, 4-O-(α-D-GalAp)-D-Xil fue encontrado para estar
presente en el parcial hidrolizado. La relación molar de GalA, GlcA, 4-O-Me-
GlcA, y los residuos de Xil calculados fueron 1.0:2.0:9.4:119 para los
xilanos del vástago y 1.0:1.3:7.9:99.4 para los del corazón del Kenaf (H.
Komiyama, 2008).
Seis diferentes residuos agrícolas de origen botánico, particularmente
mazorcas (CC), conchas de almendra (AS), semillas de olivo (OS), cáscaras
de arroz (RH), paja de trigo (WS), y paja cebadaza (BS), fueron probados
como materias primas para la producción de xilooligosacáridos (XOs) por
auto hidrólisis a 179 °C por 23 min. El rendimiento de XOs dependió del
contenido de xilanos y su accesibilidad y fue proporcional para el contenido
de acetilo de las materias primas.
15
Revisión Bibliográfica
El rendimiento fue mayor para CC (60 %) y AS (55 %), mientras RH
proveyó un rendimiento bajo (30 %) de acuerdo con su contenido mínimo
de acetilo. Los análisis de composición de los productos de hidrólisis
mostraron que contenían oligómeros parcialmente acetilados y fragmentos
de polímeros de xilanos, y algunos monosacáridos y productos de
degradación. Combinando los espectros RMN (13C y 1H) de 1D y 2D (HSQC)
de las muestras dializadas de XOs revelaron que los grupos de acetilo
estaban localizados en los residuos del xilosa principalmente en posición 3
(entre 60 y 67 mol%), considerando la ocurrencia de grupos de acetilo en
posición 2 y en ambas posiciones 2 y 3 fueron similares (19-30 mol% y 8-
25 mol%, respectivamente). El análisis de RMN mostró la presencia de
residuos de ácido 4-O-metilglucurónico (MeGA) en todas las pruebas de
XOs, como indicó la relación molar MeGA/Xil, 2.5:100 para CC hasta
9.1:100 para OS. A pesar de las diferencias estructurales de los tipos de
xilanos presente en los materiales de la planta de partida, todos los XOs
mostraron la característica estructural de un parcialmente O-acetilado 4-O-
metilglucuronoxilano (Debora Nabarlatz, 2007).
La zona de la huella dactilar en FT-IR de endosperma de arabinoxilanos de
trigo (AX) fue investigada usando un grupo de polisacáridos exhibiendo
variación de su grado de sustitución y unidades de xilosa que consisten de
xilooligosacáridos mono o disustituido por residuos de arabinosa. La
sustitución de la xilosa de la cadena principal por unidades laterales de
arabinosa fue más profundamente estudiada en la región espectral 1000-
800 cm-1, usando la segunda derivada. La región espectral 1020-920 cm-1
reveló dos bandas de absorción a 984 y 958 cm-1, las intensidades de las
cuales varió conforme al grado de sustitución, aumentando la intensidad de
la banda en 958 cm-1 y decreciendo la banda en 984 cm-1. Los datos
espectrales de la segunda derivada de los xilooligosacáridos señalaron que
estos cambios podrían ser atribuidos a la sustitución del xilano en la cadena
principal por residuos de arabinosa, y la banda en 958 cm-1 fue adscrita a la
presencia de residuos de xilosa disustituida.
16
Revisión Bibliográfica
Los componentes principales del análisis espectral FT-IR de modelos de
mezclas de AX, β-glucans, y arabinogalactanos sugirieron que cabe evaluar
las proporciones relativas de los polímeros y el grado de sustitución de AX
en mezclas complicadas como la pared celular de granos del cereal (Paul
Robert and LUC SAULNIER*, 2005).
De la planta medicinal Rudbeckia Fulgida, var sullivantii (Boynton Et Beadle)
un polisacárido de bajo peso molecular 4-O-metil-α-D-glucurono-D-xilano
fue aislado por extracción alcalina, seguido por precipitación con etanol, por
cromatografía del intercambio de iónico y filtración de gel. Los resultados de
composición y análisis de enlaces, sustentados por mediciones de 1H y 13C
RMN de oligómeros generados en la hidrólisis ácida parcial, mostró los
enlaces β-(1-4) de residuos D-xilopiranosil de la cadena principal con
aproximadamente 18 % de ácido α-(1-2)-4-O-metil-D-glucurónico enlazado
a los residuos de la xilosa. Se determinó que de cada seis unidades de D-
xilosa hay un residuo de ácido 4-O-metil-d-glucurónico (Alzbeta
KardosÏova *, 1998).
17
Materiales y Equipos
Materiales y Equipos
Capítulo II
Materiales y Equipos
2.1. Principales equipos utilizados.
Espectros IR: se realizaron en un equipo WQF-510 FTIR. Las
unidades se expresan en cm-1.
Espectros de RMN: Se registraron en equipos Varian INOVA-400. Los
disolventes utilizados fueron DMSO-d6 y D2O. Para el calibrado de los
desplazamientos químicos δ (expresados en ppm) y las constantes de
acoplamiento J (medidas en Hz) se referencia respecto a los picos
residuales de los disolventes que son 2.5 ppm (DMSO-d6) y 4.8 (D2O)
en 1H-RMN
Cromatogramas gaseosos: Se registraron en un Cromatógrafo gaseoso
acoplado a un espectrómetro de masas (CROM-MAS) SHIMADZU
GC/MSD GP5050 A.
2.2. Reactivos y disolventes
Todos los disolventes y reactivos utilizados son de las firmas MERCK,
Panreac y BDH.
Los disolventes de calidad técnica fueron destilados y secados antes de
ser utilizados.
18
Materiales y Equipos
2.3. Tratamiento de los residuales del proceso industrial.
Los residuales utilizados en el trabajo fueron muestras promedios de las
condiciones de trabajo en que se desarrolló el proceso de obtención de
etanol. Una porción de cada uno de ellos se evaporó a sequedad para realizar
las determinaciones de cenizas, contenido de sólidos y otros análisis
cualitativos.
Con el resto se siguieron los siguientes pasos:
Se ajustó el pH a 7 utilizando solución de NaOH (25%).
Se adicionaron a una columna cromatográfica (30 cm de altura por 5
cm de diámetro) conteniendo carbón activado como fase estacionaria y
se eluyó con agua destilada (proceso de decoloración).
Una vez decolorado, el residual fue evaporado a vacío hasta la
sequedad
De esta forma se obtuvo a partir del residual ácido R-1, el producto R’-1 y
del residual básico R-2, el producto R’-2.
19
Materiales y Equipos
Bagazo Tratamiento Tratamiento
H2O H2SO4 H2O EtOH NaOH
R-1 R-2
Carbón Activado
Bagacillo Bagacillo Residuo
Neutralizado
R’-1 R’-2
Figura 2.1. Diagrama de obtención de R’-1 y R’-2 a partir de los residuales ácido y básico.
Rotovaporador
20
Materiales y Equipos
2.4 Determinación de cenizas
Se determinó mediante la diferencia de peso de la muestra antes (1 g) y
después de la incineración a 500 ºC durante 4h.
2.5 Determinación cualitativa de azúcares.
Se realizó mediante el uso de los ensayos clásicos utilizados en la
determinación de azúcares (Daniel J. Pasto, 1995).
2.5.1 Hidrólisis de los polisacáridos.
0.1g de la muestra fueron suspendidos en 10ml de H2SO4 (0.25M),
calentando a ebullición durante 60 min. en un balón con un condensador en
posición de reflujo.
2.5.2. Obtención de derivados para la cromatografía gaseosa (Knapp,
1979).
2.5.2.1. Acetilación
100mg de la muestra se disolvieron en 3ml de Piridina y 1.5ml de Anhídrido
Acético, calentando a ebullición durante 60 min. en un balón con un
condensador en posición de reflujo. A partir de aquí se emplearon dos
procedimientos:
Procedimiento A: Se evaporó a sequedad y el sólido fue disuelto en
dimetilsulfóxido e inyectado en el CG-MSD.
Procedimiento B: La mezcla de reacción se extrajo con cloroformo y éste fue
inyectado en el CG-MSD.
21
Materiales y Equipos
2.5.2.2. Silalización
10mg de la muestra se disolvieron en 1ml de piridina, se adicionaron 10mg
de ácido tricloroacético y se calentó la mezcla durante 1h a 75 ºC.
2.5.2.3 Preparación de los patrones. D-xilosa y D-arabinosa.
Como patrones se utilizaron las pentosas D-xilosa y D-arabinosa, que fueron
derivatizadas siguiendo los procedimientos anteriormente descriptos.
22
Resultados y Discusión
Resultados y Discusión
Capitulo III
Resultados y Discusión
En este capítulo analizaremos lo concerniente a la purificación y
caracterización de los residuales del proceso de obtención de etanol para lo
cual empleamos procedimientos cromatográficos y espectroscópicos.
3.1 Estudio de los residuales acuosos R-1 y R-2
Del pretratamiento en medio ácido realizado sobre el bagazo en el proceso
industrial obtuvimos un licor oscuro (R-1) rico en hemicelulosa mientras que
del pretratamiento en medio básico se obtuvo un producto con la misma
apariencia (R-2) pero rico en materiales lignocelulósicos. En ambos casos los
resultados fueron positivos para los ensayos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina y
el reactivo de Benedit.
Algunas características determinadas en los mismos se muestran en la tabla
3.1
Tabla 3.1 Residuales pH % sólido % cenizas
R-1 2.39 58.69 10.57 R-2 6.16 58.25 10.57
En ambos casos estos productos presentan un alto contenido de cenizas y
casi un 60 % de sólidos. El pH de R-1 resultó muchos más bajo, teniendo en
cuenta que este residual procede de un tratamiento ácido, a diferencia de R-
2, que el residual procedente de la etapa del tratamiento básico.
Estos licores fueron llevados a pH neutro mediante adición de solución de
NaOH (25 %) y posteriormente se rotoevaporaron hasta la obtención de
residuos sólidos (R’-1 y R’-2) de color oscuro que fueron sometidos a un
proceso de decoloración utilizando una columna cromatográfica con carbón
activado. En ambos casos se registraron los espectros IR antes y después de
ser tratados en la columna.
23
Resultados y Discusión
Figura 3.1. Espectro IR de R-1 (rojo) y R’-1 (negro).
Los espectros IR de R-1 y R’-1 resultaron ser característicos de azúcares de
esta biomasa y se asemejan a los encontrados en la literatura (C.F. Liu,
2006, J.X. Sun, 2004), muestran entre las señales más importantes las
correspondientes a las vibraciones de valencia de los grupos hidroxilos (ע O-H
3402 cm-1), la vibración Csp3-H (ע C-H 2933 cm-1), así como el típico patrón de
compuestos aromáticos en 1604 y 1516 cm-1. Además, las señales en 1419
cm-1 y 1363 cm-1 son debidas a las vibraciones de deformación δ C-C y δ C-OH,
( o δ C-H) en el plano respectivamente (M. KacÏuraÂkovaÂ, 1999 ), así como
las bandas de mayor intensidad alrededor de 1120 cm-1 (ע C-O-C ) producto de
las vibraciones de valencia de los enlaces anoméricos y en 1051 cm-1 debido
a las vibraciones de valencia relacionadas con las conformaciones del anillo
hemiacetálico (ע C-C, ע C-O ). En la región anomérica (700-950 cm-1) una
banda resuelta a 897 cm-1 se debe a las vibraciones de deformación (δ C-H)
de los enlaces glicosídicos para la configuración β entre la unidades de
azúcares del polisacárido (Jing-Xia Sun, 2004, R. Singh, 2005, F. Xu, 2006,
C.F. Liu, 2006, J.X. Sun, 2004).
24
Resultados y Discusión
Es de señalar la similitud entre los espectros registrados antes y después del
proceso de decoloración excepto la aparición de una señal 619 cm-1 que
pudiera ser debida a vibraciones C-S (Dahlman, 2002) pero que
contradictoriamente no aparece en el espectro correspondiente a la muestra
antes de ser decolorada.
La banda ancha 1636cm-1 que aparece en el espectro IR de R’-1 y que es
debida al agua residual, pudiera enmascarar a las señales de los grupos
carboxilatos de las unidades de ácido glucorónico y posibles ácido. p-
coumárico o ácido ferúlico que están enlazados a azúcares de la cadena
principal y a azúcares de las cadenas laterales del polisacárido
respectivamente (Oraphin Chaikumpollerta, 2004).
Un análisis similar puede hacerse para el caso de R’-2, destacándose las
señales siguientes
los grupos hidroxilos (ע O-H 3454 cm-1),
grupos carboxílos (ע C=O 1714cm-1),
compuestos fenólicos (δ C-C 1662, 1629, 1448 cm-1)
otras vibraciones típicas de los carbohidratos en 1144, 1398, 1361,
995 y 876 cm-1.
Sin embargo, a diferencia del caso anterior, no hemos encontrado en la
literatura información suficiente que nos permita hacer comparaciones.
Ver figura 3.3.
25
Resultados y Discusión
Figura 3.3. Espectro IR correspondiente a R’-2.
3.2. Estudio de los productos R’-1 y R’-2.
Tanto los productos R’-1 como R’-2 resultaron ser sólidos blancos rindiendo
58.69 % y 58.25 % (m/v) respectivamente, dando resultados positivos para
los ensayos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina y el reactivo de Benedit. Estos, al
ser suspendidos en agua, muestran apariencia de dispersión coloidal.
Los espectros de 1H-RMN de ambos productos fueron registrados y los
mismos presentan las características típicas de estos compuestos. Del
análisis de la bibliografía conocemos que las señales más desapantalladas
(por encima de 4 ppm) corresponden a los protones anoméricos,
específicamente desde 4.0 a 4.7 ppm aparecen los protones de configuración
β, mientras que desde 4.7 a 5.6 ppm resuenan los de configuración α para
polisacáridos de la hemicelulosa del bagazo. Entre 2.0 y 4.0 ppm aparecen
los protones ecuatoriales y axiales de los azúcares que constituyen el
polímero (Jing-Xia Sun, 2004, F. Xu, 2006, J.X. Sun, 2004).
26
Resultados y Discusión
Al registrar el espectro de 1H-RMN de R’-1 en DMSO-d6 aparecen las
siguientes señales, que hemos asignado por comparación con datos que
aparecen en la literatura para la misma biomasa. Ver tabla 3.2 y 3.3. (Ver
espectros 1HRMN en el anexo 1).
Tabla 3.2.
R’-1 DMSO-d6
Señales Asignaciones de las señales por comparación
6.6 ppm H aromáticos del ácido p-coumárico o ácido ferúlico
6.2 ppm H aromáticos de residuos de la lignina
5.13 ppm (d, J=3.8) H-1 de α–arabinofuranosa (Señal muy poco intensa)
4.8 ppm (d, J=3.6) H-1 de α-xilopiranosa
4.2 ppm (d, J=7.6) H-1 de β-xilopiranosa
1.6 ppm (s) debido a grupos metoxilos del ácido glucorónico
Tabla 3.3.
R’-2 DMSO-d6
Señales Asignaciones de las señales por comparación
8.4 ppm (s) No ha podido ser asignada
4.8 ppm señal deformada que no ha podido ser asignada.
4.2 ppm (d, J=7.5) H-1 de β-xilopiranosa
1.6 ppm (s) debido a grupos metoxilos del ácido glucorónico
27
Resultados y Discusión
De acuerdo a estos resultados se evidencia, además de otros restos, la
presencia de xilosa en ambos productos y arabinosa en R’-1 pero a través de
una señal muy poco intensa por lo que decidimos repetir el espectro para
esta muestra, en este caso utilizando agua deuterada como disolvente; los
resultados fueron los mismos pero la señal en 5.13 ppm se intensificó.
3.3 Estudio de R’-1 y R’-2 mediante la técnica de cromatografía
gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas.
Con el objetivo de conocer características estructurales de estos polímeros
realizamos un estudio utilizando el procedimiento de cromatografía gaseosa
acoplada a un espectrómetro de masas y combinando procesos de
derivatización e hidrólisis. (Ver todos los cromatogramas correspondientes a
los diferentes experimentos en el anexo 2).
Inicialmente y con el objetivo de ir buscando las condiciones de trabajo,
utilizamos la reacción con anhídrido acético en piridina para obtener
derivados acetilados antes de la inyección en la columna del cromatógrafo.
En un primer experimento, este proceso se realizó directamente sobre los
productos (R’-1 y R’-2) y los resultados se muestran en la figura 3.4.
5.50 5.75 6.00 6.25 6.50 6.75 7.00 7.25
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
(x100,000)
Figura 3.4. Cromatograma correspondiente a R’-1 acetilado (rosado), R’-2 en las mismas condiciones (negro) utilizando como disolvente DMSO.
28
Resultados y Discusión
Para R’-1 se observan dos picos cuyos espectros de masas corresponden a
pentosas peracetiladas (probablemente isómeros alfa y beta) que se
encuentran en forma libre en la muestra (ver anexo 3). Para R’-2, en la
región de trabajo no se apreció señal alguna. Teniendo en cuenta los
resultados obtenidos hasta el momento y la poca cantidad que disponíamos
de este último producto, continuamos el trabajo solamente con R’-1.
En otro experimento, este compuesto fue primeramente hidrolizado y
posteriormente acetilado y el producto de reacción fue disuelto en DMSO
antes de ser inyectado en la columna. Por otra parte, patrones de D-xilosa y
D-arabinosa fueron derivatizados y cromatografiados utilizando el mismo
procedimiento. En la figura 3.5 aparecen de forma superpuesta los
cromatogramas de muestra y los patrones. Ver espectros de masa en el
anexo 4.
5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
(x1,000,000)
Figura 3.5. Cromatogramas de los patrones de D-xilosa, D-arabinosa y producto de hidrólisis de R’-1 peracetilados. Producto de hidrólisis (negro), patrón de D-xilosa (azul) y patrón de D-Arabinosa (rojo) usando como disolvente DMSO.
29
Resultados y Discusión
Para cada patrón aparecen varios picos, comportamiento éste que ha sido
anteriormente reportado (SARAH L. VALLANCE, 1998); estos son
coincidentes con los de la muestra por lo que de esta forma se confirma la
presencia de xilosa y arabinosa como constituyentes del polímero y que estos
se encuentran en una relación 0.38 (Ara/Xil) según la determinación relativa
de las áreas bajo la curva.
Con el objetivo de buscar una mayor calidad en los cromatogramas
repetimos éste último procedimiento pero, en lugar de utilizar DMSO como
disolvente, los productos de reacción fueron extraídos con cloroformo y éste
fue inyectado en la columna. Los resultados son similares a los descritos
anteriormente pero en este caso puede apreciarse una mejor resolución de
los picos así como mayor facilidad de comparación con los patrones
correspondientes. Se puede ver que la muestra está compuesta
fundamentalmente por dos azúcares, arabinosa y xilosa. Ver figura 3.6.
5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.30.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
(x100,000)
Figura 3.6. Cromatogramas correspondientes a R’-1 (hidrolizado y peracetilado) (rojo), patrón de xilosa peracetilada (negro) y patrón de Arabinosa peracetilada (azul) realizado después de extracción con CHCl3.
30
Resultados y Discusión
Por último, repetimos este procedimiento pero utilizando como derivado los
trimetilsilanos (TMS) en lugar de la acetilación.
La sililación es el método de derivatización más usado actualmente para
análisis por GC. Los reactivos son de fácil manejo en la formación de los
derivados. En la sililación, un hidrógeno activo es reemplazado por un grupo
del alquilsilil, como trimetilsilil. Comparados con otros derivados son más
volátiles, menos polares, y más termoestables. Como consecuencia, la
separación y detección es óptima.
El cromatograma de la figura 5.7 muestra el resultado del uso de este
derivado sobre el producto de hidrólisis de R’-1, en este caso los resultados
son similares a los mostrados anteriormente aunque la relación Ara/Xil fue de
O.55, aspecto éste en que debemos seguir profundizando. (Ver espectros de
masas en el anexo 5).
Por otra parte, a un tiempo de retención de alrededor de 5.46 aparecen dos
picos muy unidos que no hemos podido asignar.
5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0
0.5
1.0
1.5
2.0(x1,000,000)
Figura 3.7. Cromatograma correspondiente al producto de hidrólisis de R’-1 TMS (negro), patrón de D-xilosa TMS (rojo) y patrón de D-Arabinosa TMS (azul).
31
Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones:
Se estableció un procedimiento para el tratamiento de los
licores oscuros residuales (neutralización-decoloración) hasta
obtener los productos R’-1 y R’-2 de color blanco.
Utilizando el método de cromatografía gaseosa acoplada a la
espectroscopía de masas se montaron técnicas de
determinación de pentosas mediante el uso de derivados
acetilados y sililados.
Mediante el uso combinado de las técnicas de espectrometría
IR, RMN 1H y CROM-MASS se determinó en el residual ácido
(R’-1) la presencia de xilosa y arabinosa libres o formando
parte de sustancias poliméricas.
32
Recomendaciones
Recomendaciones
Recomendaciones.
Profundizar en los estudios para las determinaciones
cuantitativas de los azúcares encontrados.
Trabajar en el tamizaje de los polímeros de acuerdo a sus masas
moleculares.
Estudiar el uso de otras técnicas instrumentales en la
determinación de carbohidrato.
33
Bibliografía
Bibliografía
Bibliografía
ABDELKADER BENDAHOU, A. D., HAMID KADDAMI, YOUSSEF HABIBI (2007)
Isolation and structural characterization of hemicelluloses from palm of
Phoenix dactylifera L. Carbohydrate Polymers, 68, 601-608.
ALINE BARBAT, V. G., *,† CHARLOTTE MOINE,† ODILE SAINTE-CATHERINE,‡
MICHEL KRAEMER,‡ HE´LE`NE ROGNIAUX,§ DAVID ROPARTZ,§ AND
PIERRE KRAUSZ† (2008) Structural Characterization and Cytotoxic
Properties of a 4-O-Methylglucuronoxylan from Castanea satiWa. 2.
Evidence of a Structure-Activity Relationship. Natural Products, 71,
1404-1409.
ALZBETA KARDOSÏOVAÂ *, M. R. M., ANNA MALOVÕÂKOVA (1998) (4-O-
Methyl-alpha-d-glucurono)-d-xylan fromRudbeckia fulgida, var.
sullivantii(Boynton et Beadle). Carbohydrate Research, 308, 99105.
BAUDEL, H. M. Z., C.; ABREU, C. A. M. IND. (2005) Crops Prod., 21, 309–
315.
BOSTANCI, Ö. A. A. S. (2009) Xylooligosaccharide production from
lignocellulosic wastes with Trichoderma longibrachiatum xylanase.
Food, Agriculture & Environment, 7, 70-74.
C.F. LIU, R. C. S., J. YE (2006) Structural and thermal characterization of
sugarcane bagasse phthalates prepared with ultrasound irradiation.
Polymer Degradation and Stability, 91 280-288.
DAHLMAN, S. B. A. O. (2002) Chemical Compositions of Hardwood and
Softwood Pulps Employing Photoacoustic Fourier Transform Infrared
Spectroscopy in Combination with Partial Least-Squares Analysis
Analitical Chemistry, 74, 5851-5858.
DANIEL J. PASTO, C. R. J. (1995) Determinación de Estructuras Orgánicas.
DEBORA NABARLATZ, A. E., DANIEL MONTANÉ (2007) Autohydrolysis of
agricultural by-products for the production of xylo-oligosaccharides.
Carbohydrate Polymers, 69, 20-28.
34
Bibliografía
F. XU, J. X. S., C. F. LIUB AND R. C. SUNB (2006) Comparative study of
alkali- and acidic organic solvent-soluble hemicellulosic
polysaccharides from sugarcane bagasse. Carbohydrate Research,
341, 253-261.
GATENHOLM, P. T., M. (2004) ACS Symp. Ser., 864, 1–2.
H. KOMIYAMA, A. K. B., H. AIMI, J. OGIHARA, K. SHIMIZU (2008) Chemical
structure of kenaf xylan. Carbohydrate Polymers, 72, 638-645.
J.X. SUN, X. F. S., R.C. SUN, Y.Q. SU (2004) Fractional extraction and
structural characterization of sugarcane bagasse hemicelluloses.
Carbohydrate Polymers 56 195-204.
JING-XIA SUN, R.-C. S., XIAO-FENG SUNB AND YINQUAN SUA (2004)
Fractional and physico-chemical characterization of hemicelluloses
from ultrasonic irradiated sugarcane bagasse. Carbohydrate Research,
339, 291-300.
KNAPP, D. R. (1979) Handbook of Analytical Derivatization Reactions, New
York.
LAHOUARI CHAA, N. J., VINCENT LEQUART, CÉLINE FAUGERON, JEAN-
CLAUDE MOLLET, PATRICK MARTIN, HENRI MORVAN (2008) Isolation,
characterization and valorization of hemicelluloses from Aristida
pungens leaves as biomaterial. Carbohydrate Polymers, 74, 597-602.
M. KACÏURAÂKOVAÂ, N. W., A. EBRINGEROVAÂ, Z. HROMAÂDKOVAÂ, R.H.
WILSON, P.S. BELTON (1999 ) Characterisation of xylan-type
polysaccharides and associated cell wall components by FT-IR and FT-
Raman spectroscopies. Food Hydrocolloids, 13, 35-41.
MARTINEZ, E. A. S., S. S.; SILVA, J. B. A.; SOLENZAL, A. I. N.; FELIPE, M.
G. A. (2003a) Process Biochem., 38, 1677–1683.
MARTINEZ, E. A. S., S. S.; SILVA, J. B. A.; SOLENZAL, A. I.N.; FELIPE, M. G.
A. (2003b) Process Biochemistry, 38, 677–1683.
35
Bibliografía
MIKKOLA, J. P. S., T. (2001) Catal. Today, 64, 271–277.
NORTHCOTE, D. H. (1972) CHEMISTRY OF THE PLANT CELL WALL. Annu.
Rev. Plant. Physiol, 23, 113-132.
ORAPHIN CHAIKUMPOLLERTA, P. M., KRISDA SUCHIVA (2004) Structural
elucidation of hemicelluloses from Vetiver grass. Carbohydrate
Polymers, 57, 191-196.
OZLEM AKPINAR *, K. E., SEYDA BOSTA (2009) Production of
xylooligosaccharides by controlled acid hydrolysis of lignocellulosic
materials. Carbohydrate Research.
PAUL ROBERT, M. L. M., † CEÄ CILE BARRON,§ FABIENNE GUILLON,† AND &
LUC SAULNIER* (2005) FT-IR Investigation of Cell Wall
Polysaccharides from Cereal Grains. Arabinoxylan Infrared Assignment.
Agricultural and Food Chemistry, 53, 7014-7018.
R. SINGH, S. S., K.D. TRIMUKHE, K.V. PANDARE, K.B. BASTAWADE, D.V.
GOKHALE, A.J. VARMA (2005) Lignin–carbohydrate complexes from
sugarcane bagasse: Preparation, purification, and characterization.
Carbohydrate Polimers, 62 57–66.
RAJESH, K. J. S., M.; GLASSER, W. G. (2001) Cellulose, 7, 319–336.
RUNCANG SUN, J. M. L. W. B. B. (1996) Fractional and structural
characterization of wheat straw hemicelluloses. Carbohydrate
Polymers, 29, 325-331.
SARAH L. VALLANCE, B. W. S., S. M. HITCHEN, & J. H. TOWNSEND (1998)
THE DEVELOPMENT AND INITIAL APPLICATION OF A GAS
CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR THE CHARACTERIZATION OF GUM
MEDIA. JAIC, 37, 294-311.
SUN, J. X. X., F.; SUN, X. F.; SUN, R. C.; WU, S. B. (2004) Polymers Int.,
53, 1711–1721.
WANG, Y. (2009) Prebiotics: Present and future in food science and
technology Food Research International, 42, 8-12.
36
Bibliografía
XIAO-FENG SUN, R.-C. S., QI LU, FENG XU, AND LU LIN (2002) Fractional
Isolation and Physico-Chemical Characterization of Hemicelluloses by a
Two-Stage Treatment from Haloxylon ammodendron and Elaeagnus
angustifolia. Agricultural and Food Chemistry, 50, 6400-6407.
YOUSSEF HABIBI, M. M., MICHEL R. VIGNONA (2002) Isolation and structure
of D-xylans from pericarp seeds of Opuntia ficus-indica prickly pear
fruits. Carbohydrate Research, 337, 1593-1598.
ZHU, L. (2005) FUNDAMENTAL STUDY OF STRUCTURAL FEATURES
AFFECTING ENZYMATIC HYDROLYSIS OF LIGNOCELLULOSIC
BIOMASS.
37
Anexos
Anexos
Anexo 2
Espectro HRMN de R’-1 en DMSO
ppm (t1)0.05.0
0
50
100
150
200
250
Espectro HRMN de R’-2 en DMSO
ppm (f1)0.05.0
0
50
100
Anexos
Espectro HRMN de R’-1 en D2O
ppm (t1)0.05.010.0
0
50
100
Anexos
Anexo 2
Cromatogramas de R’-1 y R’-2 en los diferentes experimentos.
DMSO
R’-1 peracetilado
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5
0.5
1.0
1.5
2.0
(x1,000,000)
R’-2 peracetilado
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
(x1,000,000)
Anexos
Producto de la hidrólisis peracetilado
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25(x1,000,000)
CHCl3
Producto de hidrólisis de R’-1 peracetilado
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25(x1,000,000)
Anexos
TMS
Producto de hidrólisis de R’-1 TMS
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0(x1,000,000)
Anexo 3
Espectro de Masa de R’-1 acetilado.
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
68
128
63115
6086
977873
57 103 170114 157
Anexos
Anexo 4
Espectros de masa de R’-1 (hidrolizado y acetilado) para los picos 3 (xilosa) y
5 (arabinosa)
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
68
128
115
8660
97
73 10317057 157114
63 139100 14578 87
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
12869
11586
6097
1036373
17057 11478
139 157100
Anexos
Espectro de masa del patrón de D-Arabinosa peracetilada
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
128
115
6986 170
103
9773 157636157 78 139100 145113 17187
Espectro de masa del patrón de D-xilosa peracetilada
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
128
68114
9685
102
170
1577260 9956 139
6214577 19981 1711308652 111
Anexos
Anexo 5
Espectros de masa del producto de hidrólisis de R’-1 de los picos 4
(arabinosa) y 8 (xilosa) TMS
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
217147 204191756959 133 245103 218117 18983 23120614389 246134 305171155 259 333291
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
204
147 191 21775
103 1336959 189 218206117 143 292 30516989 243 259134 33315779 231 279194
Anexos
Espectro de masa del patrón de D-xilosa TMS
50 100 150 200 250 3000.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
204
191 217147456940 12959 192101 14811655 305259169 22176 23189 291243 27912767 333
Espectro de masa del patrón de D-arabinosa TMS
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00.0
25.0
50.0
75.0
100.0
%
73
217
191 20445 14712959 10369 192117 1485561 2158976 97 169 305243231157 259