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UNIVERSIDAD DE COLIMA
MAESTRIA EN CIENCIAS FISIOLOGICAS
ESTRUCTURA Y FUNCION DE LOS MICRODOMINIOS DE MEMBRANA.
MONOGRAFIA QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLOGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGIA
PRESENTA
BIOL. EDGAR OCTAVIO BONALES ALATORRE
ASESOR Dr. JOSE JESUS LARA CHAVEZ
CO-ASESOR
Dr. RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO
COLIMA, COL., OCTUBRE DE 2004
DE COLIMA
ESTUDIA
LUCHA
TRABAJA
2
Índice Páginas
Resumen 1
Abstract 1 Introducción 2
¿Qué es un microdominio de membrana? 4
Esfingolípidos y Colesterol: bloques conformacionales de los microdominios de membrana.
4
Fases de la membrana celular. 7 Balsas Lípidicas. 12
Las Caveolas. 13 Morfología de las caveolas. 14 Tipos de Caveolina. 15
Estructura de la Caveolina. 17
Dominio de adhesión a la membrana. 19
Dominio de oligomerización. 20
Dominio de Andamiaje. 23
Microdominios y Señalización: traducción de señales. 24
Señalización con proteínas GPI de anclaje. 26
Señalización de respuestas inmunes. 26
Señalización de los factores de crecimiento. 30
Canales iónicos y lipid rafts. 31
Importancia de los microdominios en las enfermedades. 36
Conclusiones 41
Anexo 1 42
Anexo 2 43
Bibliografía 44
3
Índice de tablas y figuras Página
Tabla 1 Propiedades físicas de algunos ácidos grasos. 8
Tabla 2 Componentes de señalización asociados con microdominios en células inmunes en estado de reposo y activado.
29
Tabla 3 Enfermedades en las cuales los microdominios y proteínas en microdominios se ven involucrados
36
Figura 1 Clasificación de los lípidos de membrana basada en su estructura. 6
Figura 2 Empaquetamiento de ácidos grasos. 9
Figura 3 Modelo de formación de los microdominios de membrana. 11
Figura 4 Clases de balsas lípidicas. 13
Figura 5 Definiciones Morfológicas y plasticidad de las Caveolas. 15
Figura 6 La caveola esta cubierta por caveolina. 16
Figura 7 Estructura y oligomerización de la caveolina. 18
Figura 8 Modelo de oligomerización de la caveolina-1. 22
Figura 9 Dominio de andamiaje. 23
Figura 10 Modos propuestos para la traducción de la señalización en microdominios de membrana.
25
Figura 11 Modelo para la señalización de MIRRs contenidos en microdominios de membranas.
27
Figura 12 La depleción del colesterol membranal altera el funcionamiento del canal Kv2.1.
34
4
Estructura y función de los microdominios de membrana.
Resumen El modelo de mosaico fluido de la membrana plasmática ha evolucionado considerablemente
desde su formulación original hace ya 30 años. Ahora se sabe que los lípidos de membrana no
forman una fase homogénea consistente de fosfolípidos, donde las proteínas asociadas a la
membrana se mueven aleatoreamente, si no que en un mosaico de dominios con una
composición bioquímica singular, hecha con esfingolípidos y colesterol, las proteínas
asociadas a la membrana parecen tener un movimiento especifico y no-aleatorio en la
membrana. Estos dominios llamados microdominios de membrana o “lipid rafts” parecen
tener un papel muy importante en la señalización celular, transcitosis, endocitosis de
moléculas y patógenos, e incluso, recientes trabajos han demostrado que estos microdominios
de membrana están involucrados en el funcionamiento de algunos canales iónicos. Además,
debido al papel tan importante que los microdominios desempeñan en los procesos
mencionados, las alteraciones, mutaciones, ausencia o presencia de estos microdominios de
membrana puede ser factor de diversas enfermedades tales como Alzheimer, Parkinson, VIH,
distrofias musculares, arritmias cardiacas, cáncer, entre otras.
Abstract
The fluid mosaic model of plasma membrane has evolved considerably since its original
formulation 30 years ago. Now is known that membrane lipids do not form a homogeneous
phase consisting of phospholipids, where membrane-associated proteins move randomly, but a
mosaic of domains with unique biochemical composition made of sphigolipids and
cholesterol, in this domains the membrane seems to have an specific and non-random
movement in the membrane. This domains named membrane microdomains or “lipid rafts”
seems to be involved in an important role in cell signalling, transcytosis, endocytosis of
molecules and pathogens and even, recently works has demonstrated this lipid rafts are
involved in ion channel function. Furthermore, cause the important role of lipid rafts in the
processes mentioned, they can be involved in several diseases like, Alzheimer´s disease,
Parkinson´s Syndrome, HIV, muscular dystrophies, cardiac arrhythmias, cancer and many
more.
5
Introducción.
Durante los últimos 30 años, el modelo de mosaico fluido de la membrana celular propuesto
por Singer y Nicolson en 1972, ha provisto las bases fundamentales del entendimiento de la
estructura y organización de la membrana. Este modelo propone que la bicapa lipídica
funciona como un solvente neutro bidimensional, que tiene poca influencia en las funciones
de las membranas (Fantini, Garmy, Mahfoud y Yahi, 2002, Pike, 2003, Simons y Toomre,
2000). Este modelo enfatiza la libre movilidad y autonomía de los lípidos y proteínas de la
membrana. Sadava en 1992 dijo que este modelo carecía de una organización lateral lo que
hacia pensar que las moléculas en difusión podían colisionar e interactuar en el plano de la
membrana (Tang y Edidin, 2001).
Ciertamente este modelo probo ser una hipótesis muy útil para explicar la estructura de la
membrana, pero ahora se sabe, que la libertad de movimiento de las proteínas y los lípidos esta
lejos de ser irrestringida y aleatoria. Una de las primeras evidencias de una distribución no-
aleatoria de las proteínas fue dada por el descubrimiento del “cocaping” hecho por Goding y
Layton en 1976. Con el tiempo fueron emergiendo mas evidencias, como la existencia de
grupos complejos de proteínas (“clusters”) y distintos tipos de dominios de membrana
(Vereb y Damjanovich, 2003), además que en 1985 Thompson y Tillack demostraron el
potencial de los glicoesfingolipidos para formar dominios (Dietrich, et al., 2001, Holthuis,
Pomorski, Raggers, Sprong y Van Meer, 2001), lo que contradice lo propuesto por el modelo
de Singer y Nicolson. Esto propicio la creación de otras hipótesis para explicar la
organización de la membrana, una de estas dio origen a un segundo modelo de organización
de la membrana, el cual ha venido desarrollándose e implementándose durante las dos
décadas pasadas (Tang y Edidin, 2001), desde que van Meer y Simons en 1988 postularon
que los microdominios de similar composición lipídica en el aparato de Golgi regulaba el
ordenamiento de esfingomielina y glicoesfingolipidos en membranas de células epiteliales
polarizadas (Anderson y Jacobson, 2002).
Entonces, apoyándose en éste y algunos otros experimentos, fue cuando se empezó a hablar de
la hipótesis de los “Lipid Rafts” llamados también “Balsas Lipidicas” o “Microdominios de
Membrana” (en esta revisión es correcto referírseles de las tres maneras pero de preferencia se
6
les refirió como microdominios). Esta hipótesis propone que ciertos lípidos se agregan
naturalmente en el plano de la membrana llevados solamente por distintas interacciones
intermoleculares, incluyendo interacciones de Van der Waals entre las largas y saturadas
cadenas de esfingomielina y glicoesfingolípidos, así como también ligaduras de hidrógeno
entre los residuos glicosil adyacentes de los glicoesfingolipidos vecinos (Dietrich, et al.,
2001). Hasta la fecha dichas interacciones y la formación de los microdominios no se conocen
con exactitud por lo que los autores se limitan a decir que la hipótesis de los “Lipid Rafts”
propone que el ensamblaje dinámico en la organización lateral de la membrana celular de
colesterol con esfingolípidos, da lugar a la formación de microdominios los cuales están
involucrados en la traducción de señales, transporte membranal y ordenamiento de las
proteínas (Gaus, et al., 2003, Sowa, Pypaert y Sessa, 2001) entre otras funciones que se van
descubriendo conforme avanzan los estudios sobre estas balsas lípidicas.
La investigación hecha sobre los microdominios de membrana, junto con observaciones
clínicas ha dado gran relevancia a este modelo, pues se ha visto que una gran variedad de
enfermedades humanas afectan el almacenaje, transporte y traficó de esfingolípidos (Lai,
2003), pero también en los últimos años ha ocurrido una explosión de reportes publicados
sobre la función que desempeñan los microdominios en procesos tan diversos como traducción
de señales, endocitosis, exocitosis, motilidad celular y como estos procesos se ven
involucrados en algunas enfermedades, igualmente importante se ha hecho el estudio de su
estructura y el desarrollo de nuevas tecnologías que redefinen nuestro entendimiento de los
microdominios, tanto como los aspectos que los involucran (Brown y Jacobson, 2001). En este
trabajo se revisa la estructura y función de los microdominios de membrana, así como
también los aspectos que se conocen de su participación en las vías de señalización, canales
iónicos y enfermedades que los involucran. Además, esta revisión tiene el propósito de
aprender bases fundamentales sobre los microdominios, para posteriormente realizar una tesis
doctoral donde se utilicen herramientas electrofisiológicas y sustancias depletoras de
colesterol para observar el posible efecto que la desorganización de los microdominios pueda
tener sobre los canales de tejido cardiaco o neuronal.
7
¿Que es un microdominio de membrana?
Un dominio es una región distintiva marcada por algunas características que la diferencian del
paisaje a su alrededor. Por lo tanto, un dominio en una membrana celular, es una región con
características físicas y químicas que la diferencian de la membrana contigua (Anderson y
Jacobson, 2002). Como sabemos las membranas celulares están compuestas por diversos
arreglos de lípidos que adoptan como arquitectura central la bicapa; los lípidos que
principalmente componen la membrana son (Fig.1): 1) Los glicerofosfolípidos (GPLs) la
familia mas grande de lípidos membranales (también conocidos como fosfolípidos o
fosfoglicéridos), en los cuales las regiones hidrofóbicas están compuestas por dos cadenas de
ácidos grasos unidas al glicerol; 2) Los esfingolípidos (SLs) que componen la segunda familia
más grande de lípidos membranales y al igual que los fosfolípidos tienen una cabeza polar
(glucosa, fosfocolina, etc.) y dos colas no polares, pero a diferencia de estos no contienen
glicerol, sino una molécula del amino alcohol de cadena larga denominada esfingosina o uno
de sus derivados, una de sus colas es una molécula de ácido graso de cadena larga y saturada
y la otra es una cadena hidrocarbonada que forma parte de la esfingosina y está unida a ella
mediante un enlace glicosídico o fosfodiester. Y finalmente 3) Los esteroles que son
compuestos caracterizados por un sistema rígido de cuatro anillos de hidrocarburos fusionados
y su principal representante es el colesterol (Nelson y Cox, 2000).
Esfingolípidos y Colesterol: bloques conformacionales de los microdominios
de membrana.
Cuando los esfingolípidos fueron descubiertos ya hace un siglo, por el fisicoquímico Johann
Thudichum, su función biológica parecía tan enigmática como una esfinge de donde se origino
su nombre, típicamente son encontrados en células eucariontes donde comprenden una
pequeña, pero vital porción del 10 al 20% de los lípidos que componen la membrana. En
humanos al menos se han identificado 60 esfingolípidos diferentes en membranas celulares
(Holthuis, et al., 2001), muchos de estos sobresalen en la membrana plasmática de algunos
tipos de células y solo algunos de estos son claramente sitios de reconocimiento en la
superficie de la célula, pero para solo pocos de estos esfingolípidos se ha descubierto su
función especifica; por ejemplo la parte carbohidrato de los SLs determina los grupos
8
sanguíneos humanos y por lo tanto confiere el tipo de sangre que un individuo puede recibir
sin riesgo alguno en una transfusión (Nelson y Cox, 2000).
Hay 3 clases de esfingolípidos, todos derivados de la ceramida (ácido graso unido por un
enlace amino al segundo carbono de la esfingosina) pero son diferentes en sus cabezas polares,
las esfingomielinas (SMs) son la primera clase, tienen fosfocolina o fosfoetanolamina como su
cabeza polar, por lo que son los mas parecidos a los GPLs, la segunda clase son los
glicoesfingolípidos (GSLs) tienen una cabeza polar compuesta por una o mas azucares
conectadas directamente al –OH del primer carbono de la ceramida y no contienen el grupo
fosfato, esta clase tiene dos subclases los Cerebrósidos y los Globósidos que usualmente son
llamados glicolípidos neutrales ya que no tienen carga, los primeros tienen un azúcar sencilla
ligada a la ceramida, aquellos con galactosa son característicamente hallados en la membrana
de células provenientes de tejido neuronal, mientras que aquellos con glucosa provienen de
membranas de células en tejidos no neuronales; los Globósidos son GSLs con dos o mas
azúcares, que usualmente son D-glucosa, D-galactosa o N-acetil-D-galactosamina (Holthuis,
et al., 2001, Nelson y Cox, 2000). La tercera clase son los Gangliósidos, tienen oligosacáridos
como cabezas polares y uno o mas residuos de ácido N-acetilneuroaminico (Neu5Ac) -
también llamado ácido sálico- en la parte carbohidratada, dicho componente les confiere a los
Gangliósidos la carga negativa a pH 7 (Fantini, 2003, Fantini, et al., 2002, Holthuis, et al.,
2001, Nelson y Cox, 2000).
Los esteroles también están presentes en la mayoría de las membranas de células eucariontas,
están caracterizados por estructuras llamadas núcleos esteroideos consistentes de 4 anillos
fusionados, 3 con 6 carbonos y 1 con 5, tal fusión de anillos no permiten rotación entre las
ligaduras carbonono-carbono (C-C) y le confieren a la molécula una estructura rígida. El
colesterol es el principal de los esteroles presente en las células, es amfipático con un grupo
hidroxilo como cabeza polar en el C-3 del núcleo esteroideo y una cadena hidrocarbonada en
C-17 (Nelson y Cox, 2000) como se puede ver en la figura 1.
9
Figura 1.- Clasificación de los lípidos de membrana basada en su estructura. Específicamente los lípidos
membranales pueden categorizarse como glicerofosfolípidos (GPLs), Esfingolípidos (SLs) y Colesteroles. a) Los
GPLs han sido erróneamente llamados fosfolípidos, su estructura base es el glicerol (verde). Los GPLs son los
principales componentes de las membranas, su grupo alcohol es eterificado en el carbono 3 del glicerol, los
principales alcoholes presentes en los GPLs son colina, etanolamina, serina, glicerol e inositol. El ácido graso
(AG) en le C-1 (sn-1) del glicerol siempre tiene una cadena saturada con 16 o 18 átomos de carbono, en el C-2
(sn-2) el AG es generalmente más largo (al menos 18 carbones) y es siempre insaturado con una o más dobles
ligaduras cis y C-3 (sn-3), con un grupo fosfato ligado a un alcohol. b) Los SLs formados a partir de una unidad
de esfingosina –la cual ya tiene incorporada una cadena saturada de ácido graso- (verde) y una cadena saturada
larga de ácido graso (negro) -de mas de 24 átomos de carbono- ligado a la esfingosina por un enlace amida, los
10
diferentes compuestos formados por la esfingosina acilada con las diferentes cadenas de ácidos grasos son
llamados ceramidas (en negro y verde). Cuando un grupo fosfato ligado a un alcohol es ligado al primer -OH de
la ceramida, resulta en una esfingomielina y cuando un azúcar o un oligosacárido se liga a través de un enlace
glicosídico a la ceramida, resulta en un glicoesfingolípido (GSL) y los GSLs que contienen ácido sálico en su
parte carbohidratada son llamados Gangliósidos. c) El grupo polar del colesterol es solo un -OH en el carbono 3
del núcleo esteroideo, mientras que la parte hidrofóbica esta compuesta por una cadena de carbonos iso-octil en el
carbono 17 (modificado de Fantini 2002).
Fases de la Membrana Celular.
Los ácidos grasos (AG), componentes esenciales de los lípidos membranales son ácidos
carboxílicos con cadenas hidrocarbonadas de 4 a 36 carbonos de largo. En algunos ácidos
grasos esta cadena es completamente saturada es decir que no contiene doble ligaduras, en
otros la cadena contiene una o más dobles ligaduras lo que hace que el ácido graso sea
insaturado. Una nomenclatura simplificada especifica la longitud de la cadena y número de
dobles ligaduras separado por dos puntos, así el ácido palmítico de 16 carbonos y cero dobles
ligaduras se representa 16:0, mientras que el ácido oleico de 18 carbonos y una doble ligadura
se representa 18:1, ahora, para indicar la posición de cualquier doble ligadura se especifica por
números superescritos después de la letra griega � (delta), de esta manera el ácido linoleico de
18 carbonos y con dos dobles ligaduras una entre los carbonos 9 = 10 y otra entre 12 = 13 se
designa 18:2 (�9,12 ) (Nelson y Cox, 2000).
Las propiedades físicas de los ácidos grasos y los componentes que las contienen (tal es el
caso de los lípidos de la membrana), están ampliamente determinadas por su grado de
insaturación y la longitud de su cadena hidrocarbonada, por ejemplo su solubilidad en agua,
mientras la cadena hidrocarbonada del ácido graso sea mayor, y menor su número de dobles
ligaduras, menor es su solubilidad en agua (tabla 1). El punto de fusión también es
influenciado por estas propiedades, ya que como se ha visto a temperatura ambiente (25ºC) los
ácidos saturados de 12:0 a 24:0 carbonos tienen una consistencia cerosa mientras que los
insaturados son líquidos aceitosos y como se nota en la tabla 1 su punto de fusión (Tm)
también esta determinado por su longitud y grado de instauración, propiedades que
influencian el grado de empaquetamiento de los ácidos grasos (Nelson y Cox, 2000).
11
Tabla 1.- Propiedades físicas de algunos ácidos grasos (modificada de Leningher).
Nombre del Ácido Nomenclatura Tf (ºC) Solubilidad a 30 ºC (mg/g de
H2O)
Laurico 12:0 44.2 0.063
Miristico 14:0 53.9 0.024
Palmítico 16:0 63.1 0.0083
Esteárico 18:0 69.6 0.0034
Araquídico 20:0 76.5
Lignocérico 24:0 86.0
Palmitoleico 16:1(�9 ) -0.5
Oleíco 18:1(�9) 13.4
Linoleico 18:2 (�9,12 ) -5
á-Linoleico 18:3 (�9,12,15 ) -11
Araquidónico 20:4 (�5,8,11,14 ) -49.5
De esta manera la diferencia en los puntos de fusión es debida a los diferentes grados de
empaquetamiento de las moléculas de ácidos grasos (Fig.2). Los componentes completamente
saturados, tienen su conformación más estable en su forma extendida de manera que, un grupo
de solo AG completamente saturados pueden empacarse tan estrechamente y tan cerca que
casi asemejan un arreglo sólido un tanto gelatinoso, ya que los átomos a lo largo de sus
cadenas entran en contacto con fuerzas de atracción de Van der Waals con átomos de
moéculas vecinas (Holthuis, et al., 2001, Moffett, Brown y Linder, 2000, Nelson y Cox,
2000). Por otra parte en los AG insaturados, una doble ligadura tipo cis presente en la cadena
insaturada provoca un doblez de la misma (Fig. 2b), de modo que un grupo mixto de AG
saturados e insaturados no puede empacarse tan estrechamente como si solo fueran AG
saturados lo que provoca que las interacciones entre cadenas vecinas sean mas débiles (Figs.
2c, 2d) (Nelson y Cox, 2000).
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Figura 2.- Empaquetamiento de ácidos grasos. La extensión de los AG depende del grado de saturación. a) dos
tipos de representaciones de el ácido esteárico que es completamente saturado, cada línea segmentada del zig-
zag representa una ligadura sencilla entre carbonos adyacentes pertenecientes a la cadena hidrocarbonada del AG.
b) La doble ligadura cis en el ácido oleico no permite rotación y origina una curva rígida en la cola
hidrocarbonada. c) AG completamente saturados en forma extendida se empaquetan en forma sólida y estable. d)
La presencia de una o más ligaduras cis interfiere con el empaquetamiento mencionado en (c), haciéndolo un
agregado menos estable.
Extrapolando los arreglos de los ácidos grasos previamente mencionados a arreglos de lípidos
membranales obtenemos interacciones semejantes, donde se pueden diferenciar varias fases en
el estado físico de la membrana. A temperaturas fisiológicas ≈ 36ºC, los lípidos que contienen
largas y saturadas cadenas hicrocarbonadas tienden a existir en una fase parecida a un gel
(Lβ), mientras que lípidos con dobles ligaduras en sus colas adoptan una existencia en estado
líquido cristalino (fase fluida, Lc) y desordenada (Brown y London, 1998, Mukherjee y
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Maxfield, 2000), de ahí que los dominios membranales formados por esfingolípidos coexisten
en una fase Lβ y los formados por fosfolípidos en Lc a temperaturas fisiológicas.
Como hemos mencionado los SLs difieren de los fosfolípidos biológicos en contener cadenas
ácil largas y saturadas lo que les confiere una temperatura de transición de fase (Tm) más alta,
todas estas propiedades les permite tener a los dominios conformados por SLs una fase en
estado ordenado mientras que los dominios conformados por GPLs prevalecen a temperaturas
fisiológicas en un estado desordenado (Fig.3) (Brown y London, 2000, Fantini, et al., 2002,
Kronke, 1999). Además el colesterol tiene importantes efectos en el comportamiento de fase,
por ejemplo es bien sabido que al adicionar colesterol a una bicapa de fosfolípidos éste le
confiere a la membrana una fase intermedia como la que se daría en la temperatura de
transición entre las fases Lβ y Lc (Fig.3a) dándole a estos dominios un carácter cuasi-
ordenado. Al principio este efecto sugirió que los dominios en estados ordenados y
desordenados no podían coexistir –debido a la presencia de puros dominios ordenados- en
presencia de altas concentraciones de colesterol, pero después, evidencias experimentales
mostraron que un diferente tipo de fase podía ocurrir en estas mezclas binarias de lípidos y
colesterol, donde dominios en fase Lc coexiste con un nuevo estado, la fase liquida-ordenada
(Lo) (Fig.3b) (Brown y London, 2000, de Almeida, Fedorov y Prieto, 2003, Fantini, et al.,
2002), donde se observó, que las cadenas ácil de los lípidos en fase Lo son extendidas y
estrechamente empacadas, al igual que en la fase gel Lβ , solo que con un mayor grado de
movilidad lateral que en Lβ . Mas adelante se descubrió que estos dominios estaban
compuestos por SPLs y colesterol, además que tenían un tamaño pequeño por lo que se
llamaron microdominios de membrana (Brown y London, 2000, de Almeida, et al., 2003,
Moffett, et al., 2000), Además, ya que el colesterol tiene un poco más afinidad por los
esfingolípidos que por los fosfolípido, el colesterol libre prefiere interactuar, aunque no
exclusivamente con los esfingolípidos (Li, Momsen, Smaby, Brockman y Brown, 2001), es
por esto, que existen más interacciones colesterol-SPL que colesterol-GPL, como se puede
apreciar en la figura 3b.
14
Figura 3.- Modelo de formación de los microdominios de membrana. a) En bicapas de GPLs por debajo de Tm
las moléculas pueden estar empacadas de modo que las cadenas acil están inclinadas en la bicapa normal para
formar una fase cristalina Lβ, pero a 37ºC por encima de la Tm, la bicapa se convierte a una fase fluida líquida-
cristalina (Lc, a veces referida como Lα). La adición de colesterol a estos dominios de GPLs anula la transición
térmica normal de la fase Lβ a la fase Lc, dando a la membrana propiedades intermedias entre las dos fases.
Sugiriendo una fase homogénea de los lípidos membranales a temperaturas fisiológicas. b) En contraste, un
dominio de SPLs forma una fase gel Lβ a 37ºC, con un empaquetamiento estrecho de cadenas saturadas. El
colesterol interactúa preferentemente (aunque no exclusivamente) con esfingolípidos y favorece la separación de
fases entre SPLs y GPLs. En la membrana plasmática, los GPLs forman un dominio relativamente pobre en
colesterol en fase Lc mientras que los SPLs forman una fase líquida ordenada Lo altamente enriquecida con
colesterol. De ahí que los microdominios existen en una fase Lo o en un estado con propiedades similares
(Modificada de Fantini 2002).
15
Balsas Lípidicas.
Históricamente, las balsas lípidicas fueron definidas por su baja densidad y insolubilidad en el
detergente Tritón X-100, lo que les hizo ganar muchos acrónimos, tales como: membranas
resistentes a detergentes (DRM), membranas insolubles en tritón (TIM), fracciones flotantes
insolubles en tritón (TIFF) (Pike, 2003) y membranas enriquecidas en glicolipidos insolubles a
detergentes (DIG) (Brown y London, 1998, Simons y Ikonen, 1997) con tantos nombres
propuestos para los microdominios uno debía prevalecer, entonces basándose en las
características de la fase ordenada Lo de los dominios compuestos por esfingolípidos y
colesterol, que es más estable en comparación a la fluida fase presentada por la membrana
compuesta por fosfolípidos que esta presente en la mayor parte de la membrana celular,
parecería que los pequeños dominios de esfingolípidos flotaran en un mar de fosfolípidos, de
ahí el nombre balsas lípidicas (o en inglés lipid rafts) (Simons y Ikonen, 1997).
En las balsas lípidicas los esfingolípidos generalmente se integran a la bicapa en la cara
extracelular de la membrana, mientras que el colesterol puede estar presente en ambas caras de
la membrana (citoplasmática y extracelular) funcionando como espaciador, la naturaleza de
los fosfolípidos presentes en la cara citoplasmática (Fig.4) del microdominio de membrana es
aún desconocida, pero probablemente también carguen cadenas de ácidos grasos saturados que
optimicen el empaquetamiento (Simons y Ikonen, 1997). Morfológicamente se podrían
distinguir dos clases de balsas lípidicas (Fig.4) las caveolares (caveolas) y las no caveolares.
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Figura 4.- Clases de balsas lípidicas. Loa esfingolípidos se sitúan generalmente en la cara extracelular del
microdominio de membrana, los fosfolípidos en la cara citoplasmática y el colesterol puede encontrarse en ambas
caras de la bicapa. En A) se muestra una balsa lipídica no caveolar o lineal. En B) se muestra una balsa lipídica
caveolar que a diferencia de las no caveolares tiene una proteína llamada caveolina. (Modificado de Razani,
2002).
Las Caveolas.
Mucho antes de la era de la biología molecular, los microscopistas electrónicos de los 50´s
describieron los componentes estructurales de la célula. Entre estos componentes se
encontraban caveolas intracelulares que se definieron como invaginaciones de la membrana
plasmática de 50 a 100 nm de largo (Razani, Woodman y Lisanti, 2002). Estas estructuras en
1953 fueron descritas por George Palade en unas micrografías electrónicas de células
endoteliales, dos años mas tarde utilizando células endoteliales de la vejiga Yamada describió
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estructuras similares a las que nombro caveolae que significa “pequeña caverna”. A pesar de
que Palade fue el primero en describirlas, y debido a que Yamada fue quien les puso nombre,
a ambos se les considera como los primeros en descubrilas (Hnasko y Lisanti, 2003,
Zajchowski y Robbins, 2002).
Morfología de las caveolas. La definición clásica de las caveolas resulta ser inadecuada, ya que ahora se sabe que las
caveolas son estructuras dinámicas que pueden ser invaginaciones o pueden ser planas, estas
últimas no son detectables morfológicamente por lo que no son mencionadas en las primeras
descripciones. Además las caveolas puede adquirir la forma de vesículas que han sido
desplazadas desde la membrana al citoplasma, como se ha demostrado en algunas condiciones
experimentales (Brown y London, 1998). Por otra parte, también se ha observado que las
caveolas se pueden fusionar en grupos para formar estructuras en forma de racimos o rosetas,
e incluso túbulos elongados o canales trans-celulares de tamaño significantemente más largo al
tamaño de las caveolas más grandes de 100 nm (Fig. 5A) (Razani, et al., 2002, Smart, et al.,
1999).
Intrigantemente estas formas “no tradicionales” de caveolae son encontradas mas comúnmente
que la forma tradicional en ciertos tejidos, por ejemplo: racimos de caveolas son muy
abundantes en células musculares esqueléticas en desarrolló, las rosetas en adipositos y las
vesículas caveolares en células endoteliales (Fig.5B) (Razani, et al., 2002), además se ha visto
que las caveolas son comunes en células epiteliales pulmonares y recientes estudios revelan
que formaciones parecidas a las caveolas están presentes en células del sistema nervioso
(Smart, et al., 1999). Debido a tal dinámica en su morfología, las caveolas ya no pueden ser
consideradas como invaginaciones estáticas, ya que como se ha observado pueden tomar
formas tan variadas, aunque los procesos involucrados en el desarrollo de las formas
caveolares son ampliamente desconocidos (Anderson, 1998, Razani, et al., 2002).
18
Figura 5.- Definiciones morfológicas y plasticidad de las caveolas. A) las caveolas pueden existir en muchas
formas además de la forma tradicional. Pueden encontrarse con una forma vesícular o en agregados en racimos,
rosetas o en túbulos, incluso los túbulos pueden elongarse a lo largo de la célula para formar canales
transcelulalers. B) Dos micrografías electrónicas tomadas con una magnificación de 16,000x, a la izquierda un
adiposito en los cuales se observan frecuentemente rosetas caveolares y a la derecha una célula endotelial donde
se pueden observar caveolas en todos los estados de asociación a la membrana (modificado de Razani, et al.,
2002).
Tipos de Caveolina.
Ya que la caveolae es considerada como una balsa lipídica, su estructura base esta formada
fundamentalmente por colesterol y esfingolípidos como se menciono anteriormente, pero
además, esta cubierta de ciertas proteínas que son especificas a caveolas (Fig. 6). También
pueden formar dominios con fase liquido ordenada (Lo) resistente a la solubilidad inducida
por detergentes. Los cuales pueden ser llamados dominios caveolares o dominios relacionados
con caveolas (Smart, et al., 1999).
19
Figura 6.- La caveola esta cubierta por caveolina. A la izquierda, Micrográfica electrónica de un fibroblasto
humano rico en caveolas (nótese la forma clásica de la caveola). En el fractal a la derecha, el esquema de una
caveola cubierta en la parte citoplasmática por dímeros de caveolina (rojo). En el fractal a la derecha abajo,
molécula de caveolina insertada en la membrana de la caveola, Hasta ahora solo se han identificado tres genes
pertenecientes a la familia de las caveolas (modificado de (Parton, 2001).
La superficie citoplasmática de la caveolae esta cubierta con proteínas integrales membranales
pertenecientes a una familia de 21 a 25 kDa llamadas caveolinas (Fig.6). Se han identificado
tres genes miembros de la familia de las caveolinas, el primero codifica para la Caveolina-1
(Cav-1), en humanos el gen precursor de esta proteína esta localizado en el brazo largo del
cromosoma 7 en la banda 31.1 (7q31.1). Cav-1 fué identificada como proteína tirosina
fósforilada de fibroblasto infectado con el virus Rous de sarcoma, más tarde se determinó que
era un componente estructural de las caveolas. Cav-1 esta compuesto por tres exones, y al
menos se han podido determinar dos isoformas Cav-1α y Cav-1β las cuales se expresan
mediante splicing alternativo, la primera es la expresión de los 178 residuos de aminoácidos
(aa) que componen esta proteína, mientras que Cav-1β es la expresión del residuo 32 al 178
debido a que hay una iniciación interna de la traducción en el residuo 32. El segundo codifica
para caveolina-2 (Cav-2), en humano su gen precursor al igual que cav-1 se localiza en 7q31.1
y fué identificada en membranas ricas en adipositos, esta compuesta por tres exones que
20
codifican para 162 residuos de proteína, su secuencia es la mas divergente entre las tres
(anexo1), no obstante a veces es coexpresada con Cav-1 y están distribuidas en células del
mismo tipo de tejido. La expresión de los 162 residuos completos es Cav-2α; se han
identificado dos isoformas adicionales Cav-2β y Cav-2γ que aun no han sido caracterizadas
(Hnasko y Lisanti, 2003, Parton y Richards, 2003, Zajchowski y Robbins, 2002). El tercer gen
de esta familia codifica para la caveolina-3 (Cav-3) la cual es músculo especifica (Zajchowski
y Robbins, 2002), su gen precursor en humanos esta localizado en el brazo corto del
cromosoma 3 en la banda 25 (3p25), se encuentra predominantemente en músculo esquelético
y cardiaco (Parton y Richards, 2003), debido a su semejanza con la caveolina-1 (anexo1), fue
identificada buscando genes homólogos de Cav-1; Cav-3 esta compuesta de dos exones que
codifican para una proteína de 151 residuos. El grado mas alto de identidad entre los tres tipos
de caveolina y sus isoformas en las especies analizadas fue una secuencia de nueve
aminoácidos “FEDEVIAEP” (Hnasko y Lisanti, 2003, Razani, et al., 2002), que es conocida
como “Marca motivo de las caveolinas”. La importancia funcional y estructural de esta
secuencia motif permanece desconocida (Razani, et al., 2002). La presencia de la caveolina es
tan esencial para la formación de caveolas de manera que en su ausencia no se observa
formación caveolar, no obstante cuando se hace expresar caveolina en células que típicamente
no presentan caveolas, la formación caveolar es inducida (Pelkmans y Helenius, 2002).
Estructura de la Caveolina.
Básicamente la estructura de las caveolinas está conformada por seis dominios y grupos
palmitoilados (Fig.7A): Uno es el dominio de oligomerización (OD), que es mediante el cual
la caveolina mantiene su asociación dimérica con otra caveolina (Hnasko y Lisanti, 2003), los
dominios de adhesión, que son dos, uno es el dominio N-terminal de adhesión a la membrana
(N-MAD) y el otro dominio C-terminal de adhesión a la membrana (C-MAD); el dominio de
andamiaje (SD) el cual no esta compuesto por una parte de secuencia continua de caveolina, si
no que su funcionamiento depende de una porción en la secuencia de OD, N-MAD y
CMAD.
21
Figura 7.- Estructura y oligomerización de la caveolina. A) Debido a su dominio transmembranal (rojo) la
caveolina es capaz de penetrar la membrana. La proteína esta también unida a la membrana por asociaciones con
los dominios N-MAD y C-MAD. La oligomerización entre los monómeros de Cav es mediada por una región de
40 aa (residuos del 61-101) conocida como Dominio de Oligomerización (OD) la cual se traslapa con N-MAD.
En púrpura el dominio terminal (TD) interactúa con oligómeros adyacentes para formar una cadena (Modificado
de Razani,2002). B) Esquema de la oligomerización de la caveolina, de izquierda a derecha, un monomero de
cualquiera de las caveolinas puede formar un dímero con caveolina del mismo tipo a excepción de Cav-1 que
puede reclutar a Cav-2, formación de oligómeros, ya sean homo -oligomeros de Cav-1 o Cav-3, o hetero-
oligomeros de Cav-1 con Cav-2. Unión de los oligomeros a través del dominio terminal para formar un filamento
o red de caveolinas (Modificado de Gumbleton, 2000).
22
Otro dominio, el dominio terminal (TD) del cual no se sabe mucho, se creía que podía
participar en la unión con la membrana o posiblemente como un lugar de señalización, aunque
no se ha probado que participe en estas funciones, pero estudios recientes han demostrado su
participación en la oligomerización. Y por último el dominio transmembranal (TM) que esta
compuesto por 32 aminoácidos de la secuencia de la caveolina (residuos 102-134 en Cav-1), al
principio se creyó que por su forma y hidrofóbicidad estaba relacionado en la inserción de la
caveolina en la membrana, pero después se observo que su tamaño no era lo suficientemente
largo como para completar un asa a través de la membrana lípidca, tal observación puso de
vuelta la función de este dominio en un acertijo (Razani y Lisanti, 2001). Después de una serie
de experimentos hechos por Kurzchalia y Parton (1999), simplificaron esta incógnita al
descubrir que la Cav-1 es insertada a la membrana vía la translocación clásica del retículo
endoplásmico (ER) y red trans-Golgi, además este proceso era dependiente de un residuo
hidrofóbico de 32 aa correspondiente al dominio transmembranal, el cual actúa como péptido
de señalización. Los grupos palmitoilados son tres por cada caveolina, estos colaboran en la
asociación de la proteína con la membrana celular, en la Cav-1 están dispuestos en los
residuos de cisteina 133, 143 y 156 (Razani y Lisanti, 2001).
Dominio de adhesión a la membrana.
A principios de los 90’s trabajos de Kurzchalia y Parton (1999) y del grupo de Sargiacomo (et
al., 1995) demostraron que la caveolina es resistente a la extracción con carbonato de sodio, lo
que es indicativo que la caveolina esta asociada integralmente con la membrana plasmática;
Para entonces no se sabia como era esta asociación pues tal interacción proteína-membrana
resulto un tanto no convencional ya que como ahora es bién aceptado los dominios C-MAD y
N-MAD permanecen citoplasmáticos (como se puede ver en la Fig.7A) tal aseveración se
demostró tras una serie de experimentos; primero utilizando anticuerpos que reconocen estos
dominios de adhesión, se observo que solo se podían unir a sus blancos cuando la célula era
solubilizada por detergentes, además poco tiempo después se identificaron sitios de
fosforilación y palmitoilación en N-MAD y C-MAD respectivamente. Por otra parte
subsecuentes análisis de la secuencia de las caveolinas demostraron que Cav-1 contenía solo
una región hidrofóbica en los residuos 102-134, por lo tanto en la estructura de la caveolina
esta era la única parte transmembranal la que se denomino dominio transmembranal y no
23
formaba parte de los dominios de adhesión, lo que confirmo que en efecto estos dominios
permanecían en el citoplasma (Razani, et al., 2002).
Posteriores análisis utilizando deleciónes y mutaciones en la secuencia de las caveolinas,
demostraron que el dominio C-MAD dirigía la localización del aparato de Golgi cuando la
caveolina era transportada, mientras que N-MAD dirigía específicamente la localización de las
membranas caveolares y que además participaba en la oligomerización con otras caveolinas
(Kurzchalia, Dupree y Monier, 1994, Razani y Lisanti, 2001).
Dominio de oligomerización.
Las proteínas de la caveolina interactúan entre ellas para formar homo- y hetero-oligomeros
que se unen directamente al colesterol a través de su dominio TM; Los oligomeros de
caveolina pueden incluso interactuar con glicoesfingolípidos. Estas interacciones proteína-
proteína y proteína-lípido, se piensa que establecen la fuerza que conduce la formación de
caveolas (Anderson, 1998, Okamoto, Ninomiya, Miwa y Masaki, 2000).
La capacidad de Cav-1 para oligomerizar esta bien documentada, se ha determinado que hay
dos aspectos para el proceso de oligomerización: 1) Un péptido de fusión, Glutation S-
transferasa (GST) situado en el dominio N-MAD citoplasmático de Cav-1, forma oligomeros
espontáneamente in vitro, pero cuando los aa 81-101 de la secuencia correspondiente a este
péptido son removidos, no se observa oligomerización. Por otra parte 2) la oligomerización
parece ser estabilizada por la palmitoilación de la cisteina en los residuos 133, 143 y 156, de
hecho la deleción de los aa 134-154 debilita la oligomerización, asi como el transporte trans-
Golgi de cav-1 a la superficie de la membrana (Fernandez, Ying, Albanesi y Anderso, 2002) lo
que hace pensar que esta secuencia funciona como péptido de señalización.
Hacia los finales de los 90’s se consideraba que la unidad estructural de la caveolina estaba
conformada por 14 o 16 monómeros de esta proteína, los cuales se oligomerizaban formando
una unidad de alto peso molecular (aprox. 400kDa), y consecuentemente estas unidades se
unían para formar un filamento de caveolinas (Fig. 7B) (Gumbleton, Abulrob y Campbell,
2000). Ahora, recientes estudios han indicado que una secuencia N-terminal de los aa 1-101
24
de Cav-1, a través de una oligomerización in vitro, forman ensamblajes heptaméricos que
parecen ser los bloques de construcción de cada filamento (Liu, Rudick y Anderson, 2002).
Hasta la fecha se sabe que la Cav-1 y cav-3 son capaces de llevar un proceso de homo-
oligomerización comprendiendo oligomeros de solo puros monómeros de Cav-1 o Cav-3,
respectivamente, la Cav-2 existe solo en forma monomérica y homo-dimérica, sin participar
en estructuras de alto peso molecular. Sin embargo, se ha observado que Cav-1 es capaz de
reclutarla para formar complejos hetero-oligoméricos de alto peso molecular (Gumbleton, et
al., 2000).
La utilización de programas informáticos para predecir la estructura de las caveolinas, ha
propiciado el desarrollo de modelos más acertados de la estructura e interacciones de estas
moléculas, uno de los más recientes es el propuesto por Fernández y colaboradores, donde
propone que la secuencia de los aa 79-96 de Cav-1 es muy parecida a una α helice (Fig. 8A) y
al parecer los dominios comprendidos en la secuencia 1-79 interactuan junto con esta
estructura secundaria para formar anillos heptaméricos de caveolina (Fig. 8B). Entonces la
unión de estos anillos a través de sus dominios terminales que forman un filamento de 10 nm
de ancho, el cual acoplado con otros filamentos terminaran formando la cubierta caveolar (Fig.
8C).
25
Figura 8.- Modelo de oligomerización de la caveolina-1. A) Los aa 79-96 de la secuencia de la caveolina
conforman una α hélice. Se muestra una región envolviendo la hélice la cual esta conformada por los aa 1-80 de
la secuencia de la cav-1, se sabe que ambas secuencias interactúan pero no se sabe ¿cómo? ni ¿para que? B)
Evidencias dadas observando subunidades de los filamentos caveolina, sugieren que las subunidades
corresponden a un anillo heptamérico formado por la interacción de las α hélices de 7 monómeros de Cav-1. C)
Se muestra como podrían relacionarse los anillos heptamericos para conformar un filamento y a su vez como
este puede estar predispuesto para formar la cubierta caveolar (Modificado de Fernández, 2002).
26
Dominio de Andamiaje.
Tal vez este dominio sea el más estudiado debido a su importancia en la interacción con
proteínas. Estudios de mapeo de la secuencia de la caveolina-1, revelaron que las diversas
interacciones de esta con moléculas de señalización es mediado por una región de las
caveolinas denominado dominio de andamiaje (Razani, Schlegel y Lisanti, 2000), definir este
dominio en términos de que secuencia abarca es complicado, ya que en parte esta implícito
dentro del dominio de oligomerización (Fig.9) el cual a su vez contiene el N-MAD, al mismo
tiempo las ciertas regiones de C-MAD actúan como puente para permitir la interacción de las
proteínas con el dominio de andamiaje comprendido en el dominio de oligomerización. Por lo
tanto ambas regiones están participando en la formación de una plataforma en la cubierta
caveolar, para que las proteínas puedan interactuar en eventos de señalización y endocitosis
de moléculas especificas (Okamoto, Schlegel, Scherer y Lisanti, 1998, Razani, et al., 2000,
Smart, et al., 1999).
Figura 9.- Dominio de andamiaje. En la figura se puede observar la participación de los ácidos palmiticos de C-
MAD con los ácidos miristicos y palmiticos para la fijación de proteínas de señalización tales como: kinasas Src
y Subunidades α de las proteínas G, al microdominio. Una vez fijadas estas proteínas pueden interactuar con el
dominio de andamiaje incluido en dominio de oligomerización.
27
A través de estos dominios, las caveolinas pueden interactuar con subunidades α de proteínas
G, H-Ras (que es un oncogeno), proteínas tirosina kinasas de la familia Scr, proteínas kinasas
C (PKC), EGF-R (Receptor del factor de crecimiento epitelial), Enzima sintetasa de oxido
nítrico (NOS o eNOS), etc. En muchos casos, la activación debida a una mutación inducida de
estas moléculas de señalización (e.g. proteínas G, H-Ras y Kinasas Src) previene la
interacción con la caveolina; y se ha observado que estas mismas mutaciones incluyendo
variantes de H-Ras y proteínas G son encontradas en diversos canceres humanos (Harder y
Engelhardt, 2004, Razani, et al., 2000).
Microdominios y señalización: Traducción de señales.
Análisis bioquímicos de las proteínas llevados a cabo en microdominios de membrana
purificados pertenecientes a diversos tipos celulares, han mostrado una sorprendente
concentración de moléculas de señalización contenidas dentro de estos (Zajchowski y
Robbins, 2002). La existencia de diferentes clases de microdominios (Pike, 2003) y su
organización lateral confiere una gran ventaja para la señalización (Harder y Engelhardt, 2004,
Simons y Ikonen, 1997), ya que los diferentes tipos de proteínas o componentes de
señalización pueden ser confinados a diferentes microdominios de membrana. Contrariamente,
otros análisis han mostrado que los microdominios de membrana son muy pequeños, débiles y
no son lo suficientemente específicos para organizar los ensamblajes con tales proteínas. Por
eso proteínas de andamiaje que estabilizan estas interacciones (como: caveolina, flotillina,
anexina II, proteínas GPI de anclaje, etc) entran en juego para formar una plataforma que
soporte tales procesos celulares de señalización (Harder y Van Meer, 2003).
De esta manera, a grosso modo, los microdominios de membrana pueden ser vistos como
plataformas de señalización que sirven para colocalizar los componentes requeridos,
facilitando su interacción y apoyando su señalización (Magee, Pirinen, Adler, Pagakis y
Parmryd, 2002, Pike, 2003). Así, receptores, factores de acople, enzimas efectoras y substratos
están colocalizados en un solo microdominio.
De esta manera la traducción de activar con la unión de una señal (ya sea: hormona, péptido,
transmisor, etc.) ocurrirá rápida y efectivamente, debido a la proximidad espacial de sus
28
componentes (Matko y Szollosi, 2002, Prior, Muncke, Parton y Hancock, 2003). La
especificidad de la señalización puede ser restringida con la localización del receptor en cierta
clase de microdominio, el cual contenga una disposición específica de los componentes de
señalización. Por lo tanto esta restricción, limitará el acceso de la señal a los componentes o
receptores correspondientes de cada diferente vía de señalización, de esta manera se impide la
señalización no específica (Foster, De Hoog y Mann, 2003, Pike, 2003).
En base a estas observaciones, se han propuesto varias maneras de modulación de la
traducción de señales por microdominios de membranas (Fig. 10).
Figura 10.- Modos propuestos para la traducción de la señalización en microdominios de membrana. A) El
receptor puede estar incluido en el microdominio, iniciando la señalización ahí mismo. La señalización por
proteínas GPI asociadas a proteínas como CD59 o efrina A5, vía microdominios relacionados con adaptadores
transmembranales y kinasas Src probablemente ocurran de esta manera. Por otra parte, B) El receptor puede
residir fuera del microdominio, pero se transloca hacia adentro del microdominio una vez que su ligando se une a
el. Parece que la señalización de la proteína CD20 de las células B sucede de este modo. C) La unión de un
ligando a un receptor situado en un raft, puede emitir una señal compartamentalizada en el raft que
subsecuentemente es regulada a la baja cuando el complejo del receptor migra fuera del raft; este modelo es
propuesto para la señalización de EGFR y PDGFR, al desacoplarse el ligando, el receptor puede migrar hacia
29
fuera del raft e interaccionar con moléculas no encontradas en el microdominio. D) El receptor no se encuentra
incluso en el lipid raft, sin embargo al activarse puede comunicar una señal al interior del raft para iniciar una vía
de señalización. En C) y D) SP representa cualquier proteína de señalización (kinasa Src, proteinas G,
Calmodulina, MAPK, ENOS, etc.) que sea correspondiente a la traducción de la señal (Modificado de
Zajchowski, 2002).
Señalización con proteínas GPI de anclaje.
En ciertos tipos de señalización los componentes y complejos de las vías de señalización están
incluidos en los microdominios, asi responde eficiente y específicamente, este es el caso de
las proteínas glicosilfosfatidilinositol de anclaje (proteína GPI de anclaje a la membrana) (Fig.
10A). Para lograr una asociación estable con la membrana, las proteínas requieren de un
anclaje hidrofóbico, el cual es incorporado durante la traducción de la mayoría de las proteínas
de los eucariontes, generalmente este anclaje esta compuesto por una secuencia de aa; pero
para cierto grupo de proteinas (las GPI) un anclaje glicolipidico es adicionado justo después de
la de la traducción, esto esta basado en el fosfatidilinositol, de ahí el nombre de las proteinas
GPI de anclaje. Estas proteínas de anclaje pueden ser especificas para un vasto rango de
proteínas de la superficie membranal, ya que estas se unen a su extremo C-terminal y son
distribuidas a la membrana provistas de una base de fijación membranal (Field y Menon,
2001). Las proteínas que pueden unirse a la base de anclaje que es proporcionada en las
proteínas GPI pueden ser exoenzimas (ej.fosfatasas alcalinas), moléculas de adhesión como
NCAM y proteínas reguladoras como DAF (factor de decaimiento acelerado), tales
combinaciones logran una gran heterogeneidad (Pike, 2004) para la señalización de este tipo.
Señalización de respuestas inmunes.
En ocasiones la translocación del receptor unido al ligando hacia dentro o fuera del
microdominio puede controlar la capacidad de las células para responder a varios estímulos
(Fig. 10B), esto es, que un receptor puede residir alrededor de los limites del microdominio
pero al acoplarse con el ligando se transporta (no se sabe con exactitud como ocurre el
movimiento de los receptores, pero estudios hechos por (Kanzaki y Pessin, 2002), han
demostrado que hay asociación de las caveolinas en los microdominios con filamentos de
actina) hacia dentro del microdominio para unirse al componente de señalización correcto, en
este caso con una tirosin kinasa de la familia Scr (Zajchowski y Robbins, 2002).
30
Otro ejemplo de este tipo de señalización mediada por lipid rafts es el modelo propuesto por
(Dykstra, Cherukuri, Sohn, Tzeng y Pierce, 2003) para los receptores MIRR (Receptores
multicadena de reconocimiento inmune) (Tabla 2), a esta familia de receptores pertenecen los
receptores de células B (BcR), los de células T (TcR) y los Fc epsilon R1 (FcεR1), los cuales
no son modulados mediante proteínas GPI u otro proceso de traducción de señales asociado
con microdominios de membrana (Matko y Szollosi, 2002).
El principal dogma del modelo de Dykstra (Fig. 11), es que el microdominio (Md) sirve para
proporcionar eficientemente una distribución espacial de los componentes de traducción en la
membrana plasmática y lograr una eficaz iniciación y prolongación de la traducción (Dykstra,
et al., 2003), ya sea debido a que en los microdominios se concentran diversas proteínas
adaptadoras esenciales para la propagación fluida de la activación de la cascada de
señalización o a la capacidad de agregación (por su capacidad de movimiento lateral en la
membrana) que tienen estas balsas lípidicas (Alonso y Millan, 2001, Matko y Szollosi, 2002).
Figura 11.- Modelo para la señalización de MIRRs contenidos en microdominios de membranas. Se describe la
progresión desde la célula en estado de reposo, es decir que no ha detectado ningún ligando correspondiente a
una respuesta inmunológica, pasando por la unión del ligando e iniciación de la cascada de señalización, donde se
crea un estado de residencia, en el cual los receptores activados se internalizan en el microdominio (Md)
31
conllevando un oligomerización entre ellos, posteriormente los Md tienden a agruparse, y finalmente la
agregación de los grupos de Md forman una sinapsis inmunológica (modificado de Dykstra, et al., 2003).
En el modelo, al principio la célula se encuentra en reposo, es decir que no ha recibido
ninguna señal de iniciación. En este estado los MIRRs están excluidos de los Md, por lo que
no están en contacto o próximos a kinasas Src y componentes adicionales indispensables para
la señalización, los cuales se encuentran concentrados por la cara citoplasmática de los
microdominios. Aunque lo propone este modelo, la exclusión de los MIRRs monoméricos de
los Md no es absoluta, si no que es usada para reflejar un equilibrio del receptor con el
microdominio, con fines ilustrativos. Enseguida, al detectar la presencia de un ligando
eventualmente los MIRRs se asocian con Mds. Sin embargo, la afinidad entre estos es muy
débil como para permitir una residencia lo suficientemente larga para propagar la señal, no
obstante la unión multivalente de los ligandos con los MIRRs induce la oligomerización entre
los receptores activados. En este modelo se propone que el olígomero tiene una alta afinidad
por los microdominios, haciendo de esta manera el tiempo de residencia mas largo 1.
Posteriormente si el oligomero es lo suficientemente estable, lo que depende de la afinidad y
de la valencia del ligando como ya vimos, el receptor permanecerá residente el tiempo
suficiente como para ensamblarse a un “señalosoma” (no se muestra en la figura) el cual esta
asociado con filamentos de actina en el citoesqueleto y esta compuesto de adaptadores y otros
componentes de señalización que contribuyen a la agrupación de microdominios. Si el
receptor no es estable, se difundirá hacia fuera del Md y la señalización cesara (Dykstra, et al.,
2003).
Por ultimo, en recientes estudios se ha observado que en células T el acople con antígenos
desencadena una dramática reorientación en los receptores TcR, moléculas de adhesión y
moléculas de señalización en una estructura con un diámetro del orden de micrones llamada
sinapsis inmunológica. Recientemente también se han descrito estructuras análogas para
células B. Parece ser que estas estructuras son esenciales para la estabilidad y persistencia de
la señalización necesaria para una activación completa (Dykstra, et al., 2003).
1 El modelo de Dykstra, no hace predicción del número receptores activados que se requieren para iniciar y sostener la señalización.
32
Debido a la trascendencia de tales hallazgos en el modelo se propone la formación de
sinapsis inmunológicas, en el cual se asume que la formación de agrupaciones de
microdominios precede a la formación de estas sinapsis. Sin embargo, el hecho de que los
Mds jueguen un papel en la formación de estas estructuras inmunológicas o sean pieza clave
para organizar los componentes de estas sinapsis todavía queda a ser demostrado (Dykstra, et
al., 2003).
Tabla 2.- Componentes de señalización asociados con microdominios en células inmunes en estado de reposo y activado. 2, 3 (Modificada de Dykstra, 2003)
MIRR REPOSO ACTIVADO
BcR Lyn c-Abl Cbp
Syk Btk Vav SHIP PLC-γ 2 PI3-K BLNK
TcR Lck Fyn *Itk Rlk Syk *LAT Cbp Csk Cbl *PI3-K (algunas isoformas) Ras Grb-2 PKA PIP2
*ZAP-70 *Vav Slp-76 Shc *PLC-γ 1 SHP-1 Hpk-1 Gads *PKC α/θ *PI3-K (algunas isoformas) IKK *Grb-2
FcεR *Lyn LAT Rac1
*Syk Gab-2 PLC- γ1 Grb-2 Plc-γ 2 Slp-76 Vav1 PI3K
2 En la tabla 3 solo se enlistan las moléculas que han sido estudiadas lo suficiente y se ha demostrado que están incluidas o son reclutadas por los microdominios pertenecientes a células T, B y Receptores Fcε. 3 Un asterisco indica que la molécula es encontrada fosforilada en rafts durante la activación.
33
Señalización de los factores de crecimiento. Se ha observado que componentes de diversas vías de señalización en cascada para los
factores de crecimiento tales como EGF (Factor de crecimiento epitelial) (Smart, Ying, Mineo
y Anderson, 1995), PDGF (Factor de crecimiento derivado de plaquetas) (Liu, Ying, Ko y
Anderson, 1996) e insulina (Bickel, 2002), están concentrados en microdominios de
membrana. Los lipid rafts se encuentran enriquecidos con receptores para EGF (EGFR) y
para PDGF (PDGFR) en células no estimuladas y se puede observar la activación por la
fosforilación en cascada de la tirosina cuando se tratan con EGF y PDGF. Las primeros
eventos de señalización inducidos por EGF y PDGF, incluyendo la activación de la tirosina
kinasa, la fosforilación de proteínas, y en el caso de la vía del EGF, el reclutamiento de
proteínas adaptadoras y la activación MAPK (Proteína kinasa activada por mitogenos),
ocurren dentro del microdominio (Anderson, 1998, Zajchowski y Robbins, 2002). Esto sugiere
que la señalización vía EGF o PDGF es iniciada en los rafts, y que porciones significantes de
las vías de señalización están organizadas y colocalizadas en los lipid rafts. La regulación a la
baja de las señales que median a estos factores, junto con la disminución de receptores EGF y
PDGF contenidos en los microdominios, sugieren un modelo en el cual la migración de
receptores hacia fuera de los rafts, que ocurre después de la estimulación del factor de
crecimiento, es requerida para la subsecuente internalización por endocitosis, la migración
hacia fuera del raft capacita la asociación de los receptores con moléculas de activación no
presentes en microdominios (Fig.10C). Por otra parte se ha observado que la estimulación de
PDGFR en fracciones de los microdominios causa una fosforilación de la tirosina de EGFRs
presentes en la misma fracción del microdominio, resultando en un marcada disminución en la
capacidad de EGF para unirse a EGFR. En contraste, el tratamiento con EGF no causo una
fosforilación reciproca de PDGFRs, estas observaciones sugieren que las interacciones
regulatorias entre estas dos vías PDGFR y EGFR son especificas y unidireccionales, estos es
facilitado por la colocalización de ambas vías de señalización (Zajchowski y Robbins, 2002).
El tratamiento de FGF-2 (factor de crecimiento de fibroblasto 2) en células humanas LAN-1
con neuroblastoma, también resulta en una fosforilación de la tirosina de muchas proteínas
presentes en los microdominios, como la activación de Fyn y Lyn, dos kinasas pertenecientes
a la familia Src localizadas en microdoniminios. A pesar de que en las células LAN-1 se
34
expresa FGFR-2 (receptor para FGF-2), a la hora de hacer análisis de colocalización, ni este
receptor ni otros tres de la familia de los FGFRs fueron encontrados en fracciones purificadas
de microdominios. Esto sugiere que es posible que el desarrollo de la traduccion de la señal
sea disparada por la unión de FGF-2 y FGFR-2, lo que genera una primera señal (señal 1) que
interactuará con un receptor alterno que se transloca o reside habitualmente en el raft,
consecuentemente tal unión podría iniciar la cascada de señalización y resultar una segunda
señal (señal 2) (Fig. 10 D) (Zajchowski y Robbins, 2002).
Canales iónicos y lipid rafts.
Trabajos de colocalización con inmunoflorescencia y aislamiento de rafts, combinado con
herramientas de análisis de biología molecular (western blot), han podido demostrar que hay
canales iónicos asociados a las balsas lípidicas en forma tan diversa y en diferentes tejidos que
resulta muy interesante la dinámica con la que interactúan canal con microdominio (Barbuti, et
al., 2004, Frank, Woodman, Park y Lisanti, 2003, Martens, Sakamoto, Sullivan, Grobaski y
Tamkun, 2001, Martens, et al., 2000, Yarbrough, Lu, Lee y Shibata, 2002b). Yarbrough y
colaboradores (2002) demostraron que las caveolas están involucradas en la regulación de
canales cardiacos de sodio (esenciales en el mantenimiento y propagación del impulso
eléctrico cardiaco) por medio de un mecanismo que involucra la subunidad α de la proteína G
heterotrimerica (Gs), vía estimulación del receptor β-adrenergico en la superficie celular. Dos
años mas adelante Barbuti y colaboradores (2004) descubrieron que los canales marcapasos
del nodo seno auricular (SAN) importantes en el origen y propagación de los potenciales de
acción espontáneos, por lo tanto indispensables en la determinación del ritmo cardiaco, están
localizados en microdominios de membrana, además demostraron que la disrupción de los
rafts causa una modificación en la cinética del canal, dando como resultado un aumento en la
despolarización diastólica. Por otra parte se ha encontrado que en células de ovario de
hamster, el factor neuronal de adhesión molecular (NCAM), modula proteínas G que regulan
canales rectificadores entrantes de K+ (Kir3) y se demostró que NCAM y Kir3 están
localizados en microdominios de membrana (Delling, et al., 2002), También en células de
ovario de hamster se demostró que la caveolina-3 junto con una proteína guanilato kinasa
asociada a la membrana, forman un complejo de andamiaje que regula el canal dependiente de
voltaje Kv1.5 localizado en un microdominio (Folco, Liu y Koren, 2004).
35
Entre otros canales que se asocian con lipid rafts: están los canales dependientes de
nucleótidos cíclicos (CNG), los cuales son blancos primarios de señalizaciones inducidas por
luz y odorantes en fotorreceptores y neuronas olfatorias, recientemente se reporto que la
subunidad α de canales olfatorios CNG A2 presentes en células de epitelio olfatorio de rata,
se encontraban asociados a microdominios de membrana, lo que deja la interrogante si otros
canales CNG se encuentra asociados a microdominios de membrana (Brady, et al., 2004).
También se demostró canales epiteliales de sodio (ENaC) presentes en el ducto colectivo del
riñón, colon distal y pulmón, responsables de la reabsorción de sal y la regulación del volumen
corporal, están presentes en microdominios de membrana y que además la disrupción de estos
microdominios con ciclodextrina causa una redistribución de los canales ENaC afectando su
funcionamiento (Hill, An y Johnson, 2002). En células humanas de cáncer de colon (Caco-2) y
de pecho (MCF-7, T47D), se ha observado que canales aniónicos de regulación del volumen
(VRACs) los cuales se expresan en la mayoría de tipos de células en mamíferos y que además
están involucrados en funciones básicas de la célula como control del volumen celular y
electrogénesis; La corriente evocada por estos canales, ICl,swell, se estudio en tres líneas
celulares deficientes de Cav-1 (Caco-2, MCF-7 y T47D), donde los análisis electrofisiológicos
mostraron que la corriente ICl,swell era muy pequeña, pero esta corriente se restauraba cuando
se inducía la expresión de Cav-1β y no Cav-1α lo que indica que el efecto es especifico de la
isoforma β de la caveolina-1, estos hallazgos llevaron a proponer a los autores que la
caveolina incrementa la disponibilidad de los canales VRAC en la membrana plasmática o que
alternamente la Cav-1β juega un papel importante en la cascada de señalización de los VRAC
(Trouet, et al., 1999). Como se ha mencionado los canales iónicos juegan un papel muy
importante en fisiología celular y aun que no todos se asocien con lipid rafts se han propuesto
debido al dinamismo de las balsas lípidicas, que la asociación de canales con microdominios
pueden estar involucrados en la regulación de la barrera funcional endotelial, debido a que los
canales iónicos están involucrados en la regulación de permeabilidad celular, trancitosis,
angiogénesis, respuesta al estrés (Frank, Woodman, Park y Lisanti, 2003) y apoptosis (Szabo,
Adams y Gulbins, 2004).
Algunos trabajos mas sobresalientes son los estudios hechos por Martens y colaboradores
(2000) que demostraron que los canales de potasio voltaje dependiente Kv2.1 estan presentes
36
en microdominios no caveolares en células transfectadas y células de cerebro de rata, situación
que no ocurre con el Kv4.2, para hacer estas conclusiones posibles, ellos utilizaron células de
cerebro de rata que establemente expresaban los canales Kv2.1 y Kv4.2, dichas células (ver
técnica de aislamiento de microdominios Anexo2) fueron solubilizadas con el detergente
Triton X-100 al 1% (este detergente es capaz de disrumpir los fosfolípidos de la membrana
dejando intactos los esfingolípidos que componen los microdominios y con ello los
componentes de señalización y proteínas transmembranales que se encuentran incluidos en las
balsas lípidicas), después con la técnica de gradiente de sucrosa (Anexo2), se aislaron las
fracciones de la membrana pertenecientes a los rafts, los cuales fueron colectados del
sobrenadante del tubo de ensayo donde se practico esta técnica, después se analizaron con
western blot, donde se dividió en 20 columnas el gel y se determino que las columnas 4-8
pertenecían a rafts y se marco con anticuerpos para Kv2.1, Kv4.2 y caveolina. Se encontró que
Kv2.1 y la caveolina se encontraban en columnas de rafts mientras que Kv4.2 no, esto hizo
suponer que que el canal Kv2.1 se encontraba inserto en un microdominio de membrana, para
demostrar si Kv2.1 se encontraba en un microdominio caveolar, Martens y colaboradores
(2000), utilizaron técnicas de inmunoflorescencia para detectar si existía colocalización entre
la caveolina y Kv2.1, estos experimentos mostraron que la colocalización entre ambos era
incompleta, lo que sugiere que Kv2.1 esta localizado en un raft que no tiene caveolina, es
decir en un microdominio no caveolar. Justificando estos resultados, los mismos experimentos
fallaron para demostrar una asociación entre Kv2.1 y caveolina en celulas L y miocardiocitos
de rata, en las cuales se ha demostrado que expresan ambas proteínas.
Una vez que se demostró que Kv2.1 se localizaba en un microdominio no caveolar. Resultaba
de gran importancia comprender como el microdominio estaba involucrado en le
funcionamiento del canal. En un esfuerzo por contestar esta interrogante Martens et. al. (2000)
trataron a las células que expresan establemente kv2.1 con 2% de 2-hidroxipropil-β-
ciclodextrina durante 1 hr, este tratamiento depleta colesterol y como consecuencia
desorganiza los microdominios y produce una alteración en la fluctuación del canal en la balsa
lipídica. Las células tratadas fueron analizadas utilizando la técnica de patch clamp en su
configuración de célula completa, para determinar el funcionamiento del canal. La densidad
de corriente y cinética de activacion no se vieron afectadas (comparar Fig. 12 A y B). Incluso
37
la sensitividad al voltaje tampoco se vio afectada (Fig.12 C), sin embargo, el tratamiento con
ciclodextrina altero significantemente el estado estable de la inactivación de Kv2.1, esto se
evidencia en la figura 12D por un corrimiento hiperpolarizante a la derecha de 36 mV en la
curva de inactivación. Es importante mencionar que los efectos de la ciclodextrina no fueron
debidos a una interacción directa de la droga con el canal, ya que al aplicar directamente 2%
de ciclodextrina al baño no se observo efecto en el funcionamiento del canal, lo que descarta
cualquier interacción de las moléculas de ciclodextrina con las proteínas que conforman el
canal. Por lo tanto, interesantemente, el tratamiento no modifica la apertura del canal ni la
expresión del canal en la superficie membranal, si no que específicamente altera la
inactivación (Martens, et al., 2000).
Figura 12.- La depleción del colesterol membranal altera el funcionamiento del canal Kv2.1. A) registro de la
corriente en células control que expresan establemente Kv2.1. B) Corriente de una célula tratada con 2% de
ciclodextrina, no se muestran cambios con las células control. C) grafica mostrando la dependencia de voltaje de
38
la curva de activación de Kv2.1, determinado por la magnitud de corriente de cola, en el cuadro en blanco las
células (n=13) control y el punto negro para las células (n=9) con el tratamiento de ciclodextrina, nótese que el
tratamiento no altera la activación del canal. D) en la grafica se muestra la curva de inactivación, de células
control (n=12) líneas con cuadro blanco y las células tratadas (n=5) líneas con puntos negros. Se observa
claramente un corrimiento hiperpolarizante hacia la derecha causado por el tratamiento con la ciclodextrina.
Un año después Martens y colaboradores (2001) demostraron que los canales Kv se insertan
en distintas poblaciones de lipid rafts, ya que encontraron que Kv1.5 se encuentra
específicamente en caveolas y que Kv2.1 se encuentra en rafts no caveolares como lo habían
demostrado con anterioridad. También observaron que la depleción de colesterol y la
inhibición de la sintésis de esfingolípidos alteraban la función del Kv1.5 ya que,
interesantemente en este canal se inducía un cambio hiperpolarizante en la dependencia de
voltaje de la activación y la inactivación.
Se sabe que los canales Kv son modulados por la activación de varias vías de señalización y
comúnmente contienen múltiples sitios de fosforilación, debido al conocimiento de que en los
microdominios se localizan diversas proteínas de señalización, se propone que la asociación
de canales con rafts sirva principalmente para agrupar moléculas de señalización con canales
iónicos (Martens, et al., 2000), de esta manera eficientando el funcionamiento del canal.
Además el hecho de que los canales Kv pueden ser específicos a un tipo de raft, sugiere que
debe haber un mecanismo que diferencie la distribución de las diferentes isoformas de canales
Kv a microdominios específicos (Martens, et al., 2001).
Por otra parte, la localización de canales de potasio Kv1.3 en la sinapsis inmunológica (Panyi,
et al., 2004) y el descubrimiento de la distribución no aleatoria de Kv1.3 (Panyi, et al., 2003)
junto con el modelo que propuso Dykstra et al (2003) sugiere un posible asociación muy
interesante (la cual no ha sido demostrada) de este canal con microdominios. En cuanto al
crecimiento de nervios se ha demostrado que canales de sodio son importantes en la inserción
de nueva membrana en el cono de crecimiento en los nervios (Wood, DeBin, Strichartz y
Pfenninger, 1992), pero además se ha propuesto que los microdominios son requeridos para la
migración de los conos de crecimiento de los nervios (Nakai y Kamiguchi, 2002) lo que hace
suponer una asociación de canales de sodio con microdominios en la membrana de estos conos
39
de crecimiento nervioso. También se ha observado que al enriquecer las células aorticas
endoteliales de bovino con colesterol provoca que la densidad de corriente en canales Kir
disminuya, mientras que la depleción de colesterol causa un aumento, esto sugiere que puede
existir una asociación entre balsas lípidicas y canales Kir (Romanenko, Rothblat y Levitan,
2002). También resulta importante notar que varios canales de calcio estan localizados en
caveolas y como consecuencia pueden jugar un papel importante en la regulación de la
activación de eNOS (Frank, et al., 2003). Otros canales que pueden estar asociados con
microdominios son canales de cloro, canales mitocondriales, bombas de intercambiadoras de
Na+/K+ (Szabo, et al., 2004) y bombas de Ca+ que juegan un papel importante en el control
de calcio libre citoplasmático (Fujimoto, 1993).
Importancia de los microdominios en las enfermedades.
Redes complejas de señalización son responsables en el control de importantes funciones
celulares, tales como desarrollo, diferenciación, adhesión, motilidad, etc. La regulación
incorrecta de las señales puede ocasionar muchas enfermedades. No es sorpresa que los
microdominios, debido a su importancia en la regulación de señales, estén involucrados en una
amplia variedad de desordenes (tabla 3).
Tabla 3.- Enfermedades en las cuales los microdominios y proteínas en
microdominios se ven involucrados (Simons y Ehehalt, 2002).
• Enfermedad de Alzheimer.
• Enfermedad de Parkinson.
• Distrofias Musculares.
• Polineuropatias, enfermedades
desmielizantes
• Enfermedades autoinmunes, inflamación
cronica, respuesta vacilar.
• Respuesta de células B
• Respuesta de células T
• Asma y respuestas alérgicas
• Neoplasias
• Arteroesclerosis
• Infecciones bacteriales
Escherichia coli
Mycobacteria tuberculosis and bovis
Campylobacter jejuni
Vibrio cholerae
Clostridium difficile
(pseudomembranous colitis)
Clostridium tetani
Salmonella, Shigella
• Infecciones virales
Virus de la influenza
40
• Hipertension, regulación hemodinámica
• Diabetes
• Hiperparatiroidismo
• Osteoartritis
• Ulceraciones gastrointestinales
• Hemoglobinuria paroxismal nocturna
• Almasenaje lisosomal
• Enfermedad de Niemann-Pick
• Enfermedad de Tay-Sachs, Leucodistrofia
metacromática
• Enfermedad de Pilzaeus-Merzbacher
• Desordenes en la biosíntesis de colesterol
• Pore-forming toxins (gas gangrene)
• Sepsis, choque séptico
HIV-1
Virus Measles
Virus sincicial respiratorio
Filoviridae (Ebolavirus, Marburgvirus)
Papillomaviridae and polyomaviridae
Virus de Epstein-Barr
Echovirus 1
Otros patógenos
Plasmodium (malaria)
Trypanosoma (enfermedad del sueño)
Leishmania
Prions (Enfermedad Creutzfeldt-Jakob,
Kuru, Sindrome Gerstmann-Sträussler-
Scheinker)
Toxoplasma gondii
Deleciónes en la región q31 del cromosoma humano 7 (justo donde residen Cav-1 y Cav-2)
implican la patogénesis de muchas formas diferentes de canceres humanos (Freeman y
Solomon, 2004, Razani, et al., 2000, Stahlhut, Sandvig y van Deurs, 2000), tales deleciónes
han sido detectadas usando marcadores microsatelitales con largas repeticiones de cisteina-
adenosina C-A y pequeñas repeticiones cisteina-guanina C-G, de los cuales el D7S522 ha sido
el más útil, ya que las deleciónes normalmente se distribuyen alrededor del locus donde marca
D7S522, se ha observado que cuando se pierde este locus ocurre una amplia variedad de
canceres epiteliales, incluyendo el cáncer primario de pecho, de próstata, ovario, colon y
carcinomas renales. Además, D7S522 se empareja con un sitio muy frágil (FRA7G), que
reside en 7q31.1; con estas bases y algunos estudios de carcinogénesis, se ha propuesto que un
gen supresor de tumores reside en 7q31.1. Con este incentivo se realizaron estudios de mapeo
genético en el DNA de Cav-1 y Cav-2 humano, revelando que D7S522 esta localizado más o
menos a 67 kilobases (kb) rió arriba de Cav-2, y que Cav-2 esta más o menos a 19 kb rio
arriba de Cav-1, esto da bases para proponer que Cav-1 y no Cav-2, debido a la superior
dinámica mostrada por Cav-1 sobre Cav-2 en la estructuración de la cubierta caveolar como se
menciono anteriormente, que Cav-1 es un gen supresor de tumores en el locus D7S522 del
41
cromosoma 7 humano (Razani, et al., 2000). No obstante todavía se desconoce cual es el
mecanismo utilizado por la caveolina 1 para actuar de tal manera.
Por otra parte, Cav-3 esta localizada en el sarcolema de tejidos esqueléticos, cardiacos y lisos.
Su distribución coincide con la de otra proteína marcadora músculo-especifica de la membrana
plasmática, la distrofina, incluso se ha demostrado que Cav-3 es capaz de formar complejos
físicos con la distrofina y sus glicoproteínas asociadas (Song, et al., 1996), lo que sugiere que
Cav-3 juega un papel esencial en la fisiología del músculo. Recientemente evidencias
genéticas realzaron la importancia de Cav-3 en el funcionamiento muscular, cuando Minetti y
colegas (1998) identificaron la forma autosomal dominante de distrofia muscular de la parte
inferior del cuerpo (Limb girdle muscular disthrophy (LGMD)) la cual es debido a una
deficiencia en la expresión de Cav-3 (Galbiati, et al., 2001), análisis de este DNA mostraron
dos distintas mutaciones en Cav-3: la primera es una pequeña deleción de 9 pares de bases que
remueve la secuencia de los aa del 63-65 correspondientes a TFT (treonina, fenilalanina,
treonina) en el dominio de andamiaje; la segunda es una mutación sin sentido que cambia una
prolina por una leucina en secuencia 105 (P105L) correspondiente al dominio
transmembranal. Ambas mutaciones causan una perdida de un 95% de caveolina-3 (Razani, et
al., 2000, Smart, et al., 1999). Una hipótesis para el padecimiento de LGMD es que la
mutación en el dominio de andamiaje impide un ensamblaje correcto en la oligomerización de
Cav-3, lo que conllevaría a esta proteína a una vía degradativa.
Recientemente la localización de lipid rafts en tejidos cardiacos (Barbuti, et al., 2004, Feron,
et al., 1996, Gratton, Bernatchez y Sessa, 2004) y vasculares,(Mason y Jacob, 2003) ha
despertado un gran interés en el papel que tienen los microdominios en estas patologías. El
nodo senoatrial (SAN) es la región del corazón de la cual potenciales de acción espontáneos se
originan y propagan a determinado ritmo cardiaco, la reciente localización de Cav-3 en SAN
hecha por Barbuti y colegas (2003) demostró que la disrupción de los microdominios hecha
por metil-β-ciclodextrina (MβCD) causa un gran incremento en el declive y ritmo de la
despolarización diastólica, incluso se demostró que la cinética de desactivación de HCN4 y
canales f nativos se hizo mas lenta después de la desorganización de los microdominios, en
conclusión este trabajo indica que los canales marcapasos residen en lipid raft y que la
42
desorganización de estas balsas lípidicas causa que los canales se redistribuyan en la
membrana y modifiquen las propiedades de estos canales (Barbuti, et al., 2004).
Los canales de sodio voltaje dependiente presentes en células miocárdicas, juegan un papel
clave en la excitabilidad del miocardio y en la propagación del impulso cardiaco. Mutaciones
observadas en este canal han sido ligadas a la patogénesis de ciertas cardiopatías como el
síndrome QT largo y el síndrome de Brugada. Shibata y colegas (Yarbrough, Lu, Lee y
Shibata, 2002a) demostraron que la aplicación de péptidos derivados de la subunidad α de la
proteína Gs (Gαs) (la cual regula la canales de sodio) potencia la corriente de sodio evocada
por isoprotenol, lo cual se atribuye a un aparente incremento en canales funcionando, Shibata
y colaboradores propusieron que la fuente de estos nuevos canales podría ser la caveola, ya
que utilizando anticuerpos dirigidos a la Cav-3, estos investigadores fueron capaces de
bloquear el efecto del isoproterenol en los canales de Na+. Interesantemente estos efectos son
específicos, pues otros anticuerpos dirigidos a otros tipos de caveolina no tuvieron el mismo
efecto. Por otra parte se ha documentado, que en miocitos cardiacos, parece ser que
preferencialmente hay un enriquecimiento de canales de Na+ y Gαs en microdominios
caveolares, estos datos llevaron a concluir que un incremento en la actividad del sistema
nervioso simpático conlleva al reclutamiento de canales de Na+ de los microdominios
caveolares hacia el sarcolema, de esta manera incrementando la corriente de Na+ (Feron y
Kelly, 2002).
Las caveolinas incluso regulan el nivel de colesterol intra- y extracelular. Animales
genéticamente diseñados para que no expresen Cav-1, muestran marcados defectos en
relajación arterial, tono biogénico e intolerancia al ejercicio como resultado de anormalidades
en la señalización celular (Mason y Jacob, 2003) y en el metabolismo del NO (Frank, et al.,
2003). La expresión de caveolina es marcadamente elevada en condiciones de
hipercolesterolemia y en la arterosclerosis, se ha mostrado que los microdominios juegan un
papel importante ya que la acumulación de colesterol en células vasculares tiene efectos
depletorios en la función de la membrana, incluyendo el transporte iónico y la traducción de
señales (Mason y Jacob, 2003). En células endoteliales, el excesivo incorporamiento de
colesterol a la membrana durante un padecimiento de hiperlipidemia, puede interferir con el
43
transporte activo de aminoácidos, tales como L-arginina. Como resultado, la activación de
eNOS provoca una sobreproducción de súper oxido, que puede ser factor de modulación de
propiedades fisicoquímicas en los lípidos de membrana, el enriquecimiento de colesterol
también disturba la función de otras proteínas de transporte, incluyendo canales sensibles a
voltaje, como el canal de K+ activado por calcio, en el cual el enriquecimiento en colesterol
favorece el estado cerrado del canal, resultando en un estrés estructural y energético del canal.
Por otra parte, en la formación de microdominios precede cualquier evidencia de formación
de cristales de colesterol extracelulares, lo que sugiere que los rafts pueden representar un
papel fundamental en la génesis de estos cristales. Prevenir la formación de cristales de
colesterol es una meta importante, ya que estas macromoléculas rígidas contribuyen en los
mecanismos de lesión y muerte celular, incluyendo apoptosis (Mason y Jacob, 2003).
A nivel neuronal los microdominios de membrana también se involucran en unos
padecimientos, uno de los ejemplos mas estudiados es en la enfermedad de Alzheimer (AD),
donde el péptido amiloide-Aβ (Aβ) se ha identificado como el componente patológico de esta
enfermedad. Aβ provoca el disparo de una cascada de señalización que eventualmente
conlleva a una neurodegeneración. AD es un padecimiento ligado a mutaciones en genes de la
proteína precursora de amiloide (APP), presenilina-1 y presenilina-2, todas estas mutaciones
resultan en el aumento en la producción de Aβ . Estudios han mostrado que el colesterol
modula el procesamiento de APP en neuronas de hipocampo de rata. Se observó que la
producción y secreción de Aβ se reducía dramáticamente si los niveles de colesterol eran
reducidos utilizando estatinas solas o en combinación de MβCD, después se observó que se
obtenía el mismo resultado solo utilizando MβCD. Lo que incito a estudiar si APP estaba
relacionado con lipid rafts, recientes estudios mostraron que cierta parte del procesamiento de
amiloides de APP se lleva acabo en rafts, pero interesantemente, el Aβ en los rafts parece
promover la fibrilogénesis del Aβ soluble, lo que sugiere que Aβ asociado a rafts adopta una
conformación diferente, aun que todavía no se sabe ¿Como los raft pueden cambiar la
conformación de Aβ? (Simons, Keller, Dichgans y Schulz, 2001a, Simons, et al., 2001b)).
44
Conclusiones.
Debido a que los conocimientos sobre las proteínas que interactúan con la membrana esta
basado en el modelo de Singer-Nicolson del Mosaico fluido de la membrana, ya el modelo de
los microdominios de membrana modifica a este ultimo, es lógico que los microdominios se
encuentren interactuando en una vasta gamma de funciones celulares. El modelo original de
Simons y Wandinger-Ness de los lipid rafts fue formulado para explicar el transporte de
lípidos y glicoproteínas en las células polarizadas, fue tal su impacto que se extendió a
procesos de traducción de señales, endocitosis (incluyendo la entrada de patógenos),
regulación de canales iónicos, transporte trans-celular y transmembranal, etc. Sin embargo
todavía queda mucho por comprender, desconocemos ciertas cosas de su estructura, tal es
como ¿Qué diferencia a un microdominio de otro, para que este sea especifico a la
distribución de ciertos tipos de proteínas? o ¿Cómo esta dirigida la inserción en la membrana
de los esfingolípidos y el colesterol que conforman los microdominios?. Ya sea esta al azar o
mediante vesículas específicamente dirigidas. Por otra parte todavía quedan isoformas de
caveolina por identificar, además de otra nueva proteína que es específica a lipid rafts la
flotillina. También es importante identificar que nuevas proteínas de señalización se asocian
con lipid rafts y con que padecimientos puedan estar relacionadas estas asociaciones.
Se han identificado muy pocos canales iónicos relacionados con lipid raft, pero la importancia
que esta asociación tiene con padecimientos cardiacos, neuronales e incluso de muerte celular
es un gran incentivo para un disparo en la producción de estudios en este tema. Además queda
la parte practica ya que los canales iónicos en los microdominios parecen ser muy atractivos
como blancos farmacológicos, lo que impulsa el desarrollo de fármacos que trabajen en
padecimientos asociados a los microdominios. Y por último queda la pregunta de que ¿Si los
medicamentos depletores de colesterol administrados en la actualidad, son benéficos? o
¿podrían empeorar las cosas? Ya que estos pueden desorganizar los microdominios, y con ello
interrumpir las funciones que estos realizan.
45
Anexo 1
En el anexo se muestra las secuencias alineadas de la familia de genes de la caveolina. Se
alinean la secuencia de la Cav-1, Cav-2 y Cav-3, los residuos idénticos son resaltados rojo,
nótese que la caveolina 1 y 3 tinen un mayor grado de similitud, mientras que Cav-2 es mas
divergente. Los sitios de iniciación están resaltados en un círculo púrpura. Además se resaltan
las secuencias pertenecientes al dominio transmenbranal o segmemto que traspasa la
membrana (verde), dominio de oligimerización (azul) y el dominio de andamiaje (azul con
rallado negro).
46
47
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