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UNIDAD 3: Endonucleasas o Enzimas de Restricción
Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado
UNIVERSIDAD DE SONORA
POSGRADO EN BIOCIENCIAS
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
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Introducción:
Endonucleasas de restricción (restrictasas)
Descubiertas simultáneamente entre 1968 y 1970 por Werner Arber y Hamilton Smith.
W. Arber
H. Smith
Las endonucleasas de restricción son un mecanismo de defensa de las bacterias frente a la entrada de ADN foráneo.
• Degradan el ADN extraño• No degradan el ADN propio de la bacteria
Arber&Linn,1969
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Tipo I: Cortan en sitios cercanos al de reconocimiento.Tipo II: Cortan justo en el sitio de reconocimiento.
Las endonucleasas de restricción supusieron un enorme avance en el campo de la ingeniería genética. El uso de las enzimas restrictasas con estos fines fue propuesto y desarrollado por Nathans y Danna en 1971.
D. Nathans
K. Danna
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Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:
1. Cohesivos (protuberantes)En 5’
En 3’
ATCGGTGGTACCTGC KpnI ATCGGTGGTAC CTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACCATGGACG TAGCCAC CATGGACG
ATCGGTGAATTCTGC EcoRI ATCGGTG AATTCTGC||||||||||||||| ||||||| ||||TAGCCACTTAAGACG TAGCCACTTAA GACG
5’
3’
3’
5’3’
5’3’
5’
3’
5’5’
3’
5’
3’
3’
5’3’
5’
5’
3’ 5’5’
3’
3’
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Las endonucleasas de restricción cortan dentro de la secuenciade ADN, dejando extremos que pueden ser:
2. Romos
ATCGGTGATATCTGC EcoRV ATCGGTGAT ATCTGC||||||||||||||| ||||||||| ||||||TAGCCACTATAGACG TAGCCACTA TAGACG
5’
3’
3’
5’3’
5’
3’
5’
5’
3’
Roberts,1976
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Nucleasas
Endonucleasas Exonucleasas
Modificado deRoberts,1976
Cortesinternos Cortesexternos
ADN ADN
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TipoI Mg2+
EcoKIModificado dePray,2008
cofactor
Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte
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Endonucleasas de tipo II: Son enzimas endonucleasas, que cortan internamente el ADN de doble cadena, en sitios de reconocimiento específico (dianas de restricción).
La mayoría de las secuencias diana son simétricas en ambas
hebras del ADN(dianas palindrómicas)
LewinB.GenesIX(2009)
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TipoIIMg2+
93%detodas lasenzimasconocidas
EcoRI BamHI HindIII
Modificado dePray,2008
Sitiodereconocimiento,en elmismo sitiodecorte
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Las metilasas (o metil-transferasas) modifican el ADN bacteriano, añadiendo un grupo metilo a las bases A ó C del ADN recién sintetizado
La metilación en los sitios diana de las enzimas endonucleasas de restricción bloquean la acción de las mismas sobre el ADN propio
Permite a las bacterias defenderse contra el ataque de los bacteriófagos y hacen de barrera frente al ADN foráneo.
Metilasas
citosina 5-metil-citosina
grupo metilo
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TipoIII
EcoPIModdePray,2008
Sitiodereconocimiento,diferente alsitiodecorte
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• Isoesquizomeros:tienen lamisma secuencia dereconocimiento yelmismo sitio decorte.
SphI ->CGTA/CBbul ->CGTA/C
• Neoesquizomeros:tienen elmismo sitio dereconocmiento,perocortan elADNen diferente lugar.
SmaI ->CCC/GGGXmaI ->C/CCGGG
Chandrasegaran,2001
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Tiposdecortes
• Cortes“pegajosos”
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Tiposdecortes
• Cortes“romos”
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Mecanismo deacción
• Unsolocorte en cada una delascadenas deazucar-fosfato deladoble helice,hidrolizando elenlacefosfodiester
Chandrasegaran,S.2001
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Enzima Fuente Sitio de restricción
BamHI Bacillus amyloliquefaciens G G A T C C C C T A G G
EcoRI Escherichia coli G A A T T CC T T A A G
HindIII Haemophilus influenzaeA A G C T TT T C G A A
PstI Providencia stuartiiC T G C A GG A C G T C
BalI Brevibacterium albidumT G G C C AA C C G G T
SmaI Serratia marcescensC C C G G GG G G C C C
Ejemplos de endonucleasas de restricción comerciales y sus secuencias de reconocimiento
Extr
emos
coh
esiv
osE.
rom
os
LewinB.GenesIX(2009)
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Usoenellaboratorio
• Estudiarlasdiferenciasentrelalongituddelosfragmentosdediferentesindividuos(RFLP)
• Clonacióndegenes• ConstruccióndelibreríasdeADNc• Secuenciación
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RFLP• Distinguir individuos homocigotos yheterocigotos• Deteccion deenfermedades• Estudios dediversidad
Pray, L. (2008)
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Clonación
Chandrasegaran,S.2001
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Librerías genómicas
Pray, L. (2008)
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Actividaddelasenzimasderestricción
• Seexpresaentérminosdeunidades• Unidad:cantidaddeenzimaqueseuniráatodossitiosespecíficosen1microgramsdeADNmuestraen1ha37ºC
Stephenson,2016
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Stephenson,2016
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CantidaddeHindIII
Stephenson,2016
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DigestioninsilicoSepretende digerirvirtualmente elplasmidopGEM – 3Z
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Sepuede buscar elvectoren NEBcutter,conelcodigo deGenBank
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Obtenemos unmapa delasenzimas conlasquepodemos abrir elvector
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Incluso podemos realizar unaelectroforesis insilicoyvercomo severia elvectordigeridoconlasenzimas elegidas
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Digestión invitro
• Leerespecificaciones delaenzima
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Digestióninvitro
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Recetadedigestión
Incubar:37◦Cx1-16horas
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Actividad ”estrella”
• Laenzima seune asitios similares pero noidenticos alsitio dereconocimiento correspondiente.
• Bajo condiciones extremas• Temperatura incorrecta• pHelevado• Bajafuerza ionica• Altas concentraciones deglicerol (>5%)
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Ligación
• SielADNdeinterés yelvectorsoncortados conlamisma enzima,yesta crea cortes “pegajosos”,sepuede incubar conuna ADNligasa.
• Molécula deADNrecombinante.
Pray, L. (2008)
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Resumen
• Conforman un“sistema inmune”primitivo en procariotas
• Clasificacion• Sitios deanclaje• Sitio decorte• Tipos decorte
• Importancia biotecnologica
• Es imprescindible conocer lasespecificaciones delaenzima queseesta utilizando
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Bibliografía recomendada
• ArberW,LinnS(1969)."DNAmodificationandrestriction". AnnualReviewofBiochemistry. 38:467–500.
• RobertsRJ(Nov1976)."Restrictionendonucleases". CRCCriticalReviewsinBiochemistry. 4(2):123–64.
• Pray, L. (2008) Restrictionenzymes. NatureEducation• Chandrasegaran,S.2001.RestrictionEnzymes.eLS..• JohnW.Pelley,18- RecombinantDNAandBiotechnology,InElsevier'sIntegratedBiochemistry,Mosby,Philadelphia,2007,Pages159-167,ISBN9780323034104
• FrankH.Stephenson,Chapter10- RecombinantDNA,InCalculationsforMolecularBiologyandBiotechnology(ThirdEdition),AcademicPress,Boston,2016,Pages321-373,ISBN9780128022115