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UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“EFECTO ANTIMICROBIANO DEL EXTRACTO DE HOJAS DE
Aloysia citriodora Palau (CEDRÓN) SOBRE Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida
albicans ATCC 10231, AREQUIPA, 2018”
PRESENTADA POR:
Bach. Molleapaza Picha, Andreina Beatriz
Bach. Quispe Surco, Miriam Amparo
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
ASESORA:
Mg. Celia Choquenaira Quispe
AREQUIPA – PERÚ
2019
UNIVERSIDAD PRIVADA AUTONOMA DEL SUR
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS
“EFECTO ANTIMICROBIANO DEL EXTRACTO DE HOJAS DE
Aloysia citriodora Palau (CEDRÓN) SOBRE Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida
albicans ATCC 10231, AREQUIPA, 2019”
PRESENTADA POR:
Bach. Molleapaza Picha, Andreina Beatriz
Bach. Quispe Surco, Miriam Amparo
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
APROBADO POR:
PRESIDENTE DEL JURADO ……………………………………
PRIMER MIEMBRO DEL JURADO ……………………………………
SEGUNDO MIEMBRO DEL JURADO .………………………………..
i
DEDICATORIA
La presente tesis está dedicada a Dios, ya que gracias a él he
logrado concluir mi carrera.
A mis padres, porque ellos siempre estuvieron a mi lado
brindándome su apoyo y sus consejos para hacer de mí una mejor
persona.
A mi hermana y familia entera, por sus palabras y compañía, a
mi abuela Julia aunque no esté físicamente con nosotros, pero sé
que desde el cielo siempre me cuida y me guía para que todo me
salga bien.
Andreina Beatriz Molleapaza Picha
ii
DEDICATORIA
A mis padres Dominga y Mario, por su constancia y su amor en
todo momento. Por cada palabra de amor y aliento que han
dejado guiar mis pasos a lo largo de la vida. Por los sacrificios que
juntos hemos pasado y por ser los mejores padres del mundo.
A mi amigo especial que es Dios, que esta conmigo en las buenas y
malas, en las noches frías y largas se lo debo todo.
A mis hermanos, por lo que representan para mí y por ser parte
importante de una hermosa familia unida.
A mi amigo incondicional Giancarlo, que siempre estuvo
apoyándome en todo momento.
A mi compañera y amiga Andreina, que a pesar de las
dificultades que tuvimos, salimos adelante.
Y a mí misma, porque en cada caída supe levantarme a pesar de
los problemas, dificultades, de personas que no sumaron a mi vida
sigo aquí luchando por un futuro mejor.
Miriam Amparo Quispe Surco
iii
AGRADECIMIENTO
A Dios, porque me ha hecho sentir su sabiduría y su amor infinito
en cada etapa de mi vida. “Todo lo puedo en cristo que me
fortalece” (Filipenses 4:13).
Gracias Papito Pascual, usted es la mano que me sostiene el sol que
calienta mi alma y la estrella que vela mi sueño.
A nuestra asesora Mg.QF Celia Choquenaira Quispe por todo el
apoyo brindado a lo largo de esta investigación, por su tiempo y
por los conocimientos que nos transmitió.
A nuestro docente Mg.QF Elvis Gilmar Gonzales Condori por su
consejo, amistad y apoyo para la realización de este trabajo de
investigación.
Andreina Beatriz Molleapaza Pich
iv
AGRADECIMIENTO
A Dios todo poderoso por darme la oportunidad de obtener un
triunfo personal, por darme salud, sabiduría, y entendimiento
para lograr esta meta.
A mi querida madre Dominga Natalia, por ser tan dulce y buena
Dios te bendiga siempre mamita.
A mi padre José Mario, en el cielo los ángeles se regocijan con tu
presencia. Te agradezco infinitamente por haber hecho una buena
hija, siempre guiándome, y corrigiéndome.
Mi Alma Mater; me siento orgullosa de haber recibido mi
formación académica en sus aulas, siempre estaré eternamente
agradecida de haber egresado de la Universidad Privada
Autónoma del Sur.
A los asesores Académicos de la Universidad los profesores Mg.
QF Celia Choquenaira Quispe, y Mg. QF Elvis Gilmar Gonzales
Condori por todo el apoyo brindado a lo largo de esta
investigación, por su tiempo y por sus conocimientos, por su
consejo, amistad y apoyo para la realización de este trabajo de
investigación.
A mi compañera y amiga Andreina, que a pesar de las
dificultades que tuvimos, salimos adelante, augurando una vida
profesional exitosa.
A mi jefe Renato Antonio Sejuro Riveros, por darme el apoyo
incondicional.
Gracias a las personas que de una forma u otra han sido claves en
mi vida profesional.
Y agradecerme a mí misma, porque en cada caída supe
levantarme a pesar de los problemas, dificultades, de personas que
no sumaron a mi vida sigo aquí luchando por un futuro mejor.
Miriam Amparo Quispe Surco
v
RESUMEN
Actualmente, existen reportes en la literatura de que numerosas
investigaciones están encaminadas a la búsqueda de nuevos
compuestos con actividades biológicas a partir de fuentes naturales,
mientras otras, están destinadas a verificar las propiedades que se les
atribuyen, en tal sentido el presente trabajo de investigación tuvo como
objetivo principal evaluar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC
10231.
Como resultado del desarrollo del trabajo se identificó la presencia de
flavonoides y taninos condensados. La cuantificación de fenoles totales
fue de 50,43 ± 1,041 mg equivalentes a ácido gálico (GAE) por el
método de Folin Ciocalteu.
La determinación del efecto antimicrobiano se realizó a través del
método de microdilución en caldo y el análisis por discos de difusión en
cuyos resultados se determinó que la Concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas
sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 fue de 6,25 mg/mL
equivalente a una concentración final de 0,63 % y 6,25 µl/ml equivalente
a una concentración final de 0,63% respectivamente, en relación a la
sensibilidad sobre Escherichia coli ATCC 25922 y Cándida albicans
ATCC 10231, no se logró determinar la CMI ni la CMB - CMA debido
que a las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no tuvo
efecto antimicrobiano.
Finalmente, la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC
25923 se produjo a las concentraciones de 0,31 al 100 %, para el caso
de Escherichia coli ATCC 25922 la sensibilidad fue a las concentración
de 100%, para Candida albicans ATCC 10231 la sensibilidad fue a una
concentración de 100% del extracto etanólico de Aloysia citriodora Palau
(Cedrón).
Palabras clave: A. citriodora, E. coli, S. aureus, C. albicans, CMI, CMB,
CMA.
vi
ABSTRACT
Currently, there are reports in the literature that many investigations are
aimed at finding new compounds with biological activities from natural
sources, while others are designed to verify the properties attributed to
them, in this sense the present research work The main objective of this
study was to evaluate the antimicrobial effect of leaf extract of Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) on Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC 10231.
As a result of the development of the work, the presence of flavonoids
and condensed tannins was identified. The quantification of total phenols
was 50,43 ± 1,041 mg equivalent to galic acid (GAE) by the Folin
Ciocalteu method.
The determination of the antimicrobial effect was made through the
method of microdilution in broth and the analysis by diffusion discs in
whose results it was determined that the Minimum Inhibitory
Concentration (CMI) and Minimum Bactericidal Concentration (CMB) of
the leaf extract on Staphylococcus aureus ATCC 25923 was 6,25 mg /
mL equivalent to a final concentration of 0,63% and 6,25 μl / ml
equivalent to a final concentration of 0,63% respectively, in relation to the
sensitivity on Escherichia coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC
10231, it was not possible to determine the CMI or the CMB - CMA
because, at the concentrations that were worked on, the extract had no
antimicrobial effect.
Finally, the antimicrobial sensitivity of leaf extract of Aloysia citriodora
Palau (Cedrón) on Staphylococcus aureus ATCC 25923 occurred at
concentrations of 0,31 to 100%, for the case of Escherichia coli ATCC
25922 the sensitivity was at the concentration 100% and for Candida
albicans ATCC 10231 the sensitivity was at a 100% concentration of the
ethanolic extract of Aloysia citriodora Palau (Cedrón).
Key words: A. citriodora, E. coli, S. aureus, C. albicans, CMI, CMB,
CMA.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA i
AGRADECIMIENTO iii
RESUMEN v
ABSTRACT vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS vii
ÍNDICE DE TABLAS x
ÍNDICE DE FIGURAS xi
ÍNDICE DE ANEXOS xii
INTRODUCCIÓN xiii
CAPÍTULO I 1
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 1
1.1. Descripción de la realidad problemática 1
1.2. Formulación del problema 3
1.2.1. Problema principal 3
1.2.2. Problemas secundarios 3
1.3. Objetivos 4
1.3.1. Objetivo general 4
1.3.2. Objetivos específicos 4
1.4. Justificación 5
CAPÍTULO II 7
MARCO TEÓRICO 7
2.1. Antecedentes investigativos 7
2.1.1. A nivel internacional 7
2.1.2. A nivel nacional 8
2.1.3. A nivel local 9
2.2. Base Teórica 11
2.2.1. Cedrón 11
2.2.2. Infecciones 15
2.2.3. Métodos de evaluación del efecto antimicrobiano 18
2.2.4. Antibiograma 19
2.3. Hipótesis 22
viii
2.3.1. Hipótesis principal 22
2.3.2. Hipótesis secundarias 22
2.4.- Variables 23
2.4.1. Identificación de variables 23
2.4.2. Definición conceptual de variables 23
2.4.3. Definición operacional de variables 23
CAPÍTULO III 25
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN 25
3.1. Tipo y nivel de investigación 25
3.1.1. Nivel de la investigación 25
3.1.2. Tipo de investigación 25
3.1.3. Diseño de la investigación 25
3.2. Descripción del ámbito de la investigación 25
3.2.1. Ubicación espacial 25
3.2.2. Ubicación temporal 25
3.3. Población, muestra y muestreo 25
3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos 26
3.4.1. Material biológico 26
3.4.2. Materiales 26
3.4.3. Recolección, almacenamiento e identificación hojas Aloysia citriodora
Palau 29
3.4.4. Obtención del extracto seco de Aloysia citriodora Palau 30
3.4.5. Escala de Mc Farland 31
3.4.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana 32
3.4.7. Análisis de datos 34
CAPÍTULO IV 35
RESULTADOS 35
4.1. Recolección y determinación taxonómica 35
4.2. Rendimiento de la extracción etanólico 35
4.3. Extracto etanólico de hojas Aloysia citriodora Palau (Cedrón) 36
4.4. Identificación de taninos 37
4.5. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda 37
4.6. Cuantificación de fenoles totales 38
ix
4.7. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 39
4.7.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Escherichia coli ATCC 25922 39
4.7.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau
frente a Escherichia coli ATCC 25922 43
4.7.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau en Escherichia coli ATC 25922 comparada
con ciprofloxacino 44
4.8. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. 49
4.8.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923. 49
4.8.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53
4.9. Evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau
frente a Candida albicans ATCC 10231. 59
4.9.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Cepas de Candida albicans ATCC 10231 59
4.9.2 Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora Palau
frente a Candida albicans ATCC 10231 62
4.9.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231
comparada con clotrimazol 1 %. 63
CAPÍTULO V 69
DISCUSIÓN 69
CONCLUSIONES 74
SUGERENCIAS 76
BIBLIOGRAFÍA 77
ANEXOS 86
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica 12
Tabla 2. Variables 24
Tabla 3. Determinación de CMI por microdilución en caldo peptonado 33
Tabla 4. Identificación y tipificación de hojas de cedrón recolectadas 35
Tabla 5. Valores del gráfico de calibración de concentración de
ácido gálico vs absorbancia promedio 38
Tabla 6. Concentración de fenoles totales equivalente en ácido gálico
por gramos de extracto 39
Tabla 7. Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI)
de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 42
Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Minima Bactericida
de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922 43
Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones
del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau. 45
Tabla 10. Análisis de sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922
a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 46
Tabla 11. Test de Tukey de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922
a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 47
Tabla 12. Resultados de la determinación de la concentración inhibitoria de
Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 52
Tabla 13. Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora
Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53
Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 55
Tabla 15. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 56
Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcu
aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 57
Tabla 17. Resultados de la determinación de Concentración Mínima Inhibitoria
de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 61
Tabla 18. Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia
citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 62
Tabla 19. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Candida
albicans ATCC 10231 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 64
Tabla 20. Análisis de varianza de la prueba de la sensibilidad de Candida
albicans ATCC 10231 al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 65
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Aloysia citriodora Palau (Cedrón) 11
Figura 2. Composición química del Cedrón 13
Figura 3. Hojas de Aloysia citriodora Palau 29
Figura 4. Reacción química en la prueba de Shinoda 30
Figura 5. Cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus
ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 KwikStik 32
Figura 6. Extracción por Soxhlet 36
Figura 7. Rotaevaporador 36
Figura 8. Identificación de taninos condensados en Aloysia citriodora Palau 37
Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavanonas
en Aloysia citriodora Palau 37
Figura 10. Gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles
totales por el método de Folin Ciocalteu 38
Figura 11. Ensayo de determinación de concentración mínima inhibitoria
de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli 41
Figura 12. Siembra en placa (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a
Escherichia coli ATCC 2592 43
Figura 13. Sensibilidad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau frente a
Escherichia coli ATCC 25922 44
Figura 14. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia
coli a concentraciones de hojas de Aloysia citriodora Palau 48
Figura 15. Siembra en placa para determinar la (CMB) de Aloysia citriodora
Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 53
Figura 16. Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysi
citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 54
Figura 17. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de
Staphylococcus a concentraciones de Aloysia citriodora Palau 58
Figura 18. Ensayo de determinación de concentración mínima
inhibitoria frente a Cándida albicans ATCC 10231 60
Figura 19. Siembra en placa (CMA) de Aloysia citriodora
Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 62
Figura 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad
frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau 66
Figura 22. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad a
concentraciones hojas de Aloysia citriodora Palau . 68
xii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Constancia de identificación taxonómica del cedrón 87
Anexo 2. Recolección de Aloysia citriodora Palau 88
Anexo 3. Pesando la muestra triturada de hojas de cedrón 88
Anexo 4. Elaboración de cartuchos 89
Anexo 5. Armado del Equipo Soxlhet 89
Anexo 6. Momento preciso de la extracción de Aloysia citriodora Palau 90
Anexo 7. Obtención del extracto de Aloysia citriodora Palau 90
Anexo 8. Preparación de medios de cultivo 91
Anexo 9. Pesando los Medios de Cultivo 92
Anexo 10. Preparación del Agar Müeller Hinton 92
Anexo 11. Preparación de placas con el Agar Müeller Hinton 92
Anexo 12. Preparación de las placas para el sembrado
de Staphyloccocus aureus en Agar Manitol salado 93
Anexo 13. Colocando los Discos de difusión con el extracto de
cedrón en placas con Agar Manitol salado 93
Anexo 14. Resultados en los diferentes medios de cultivos(Agar
Müeller Hinton, Manitol salado y Sabouraud) 94
Anexo 15. Preparación de la solución madre 94
Anexo 16. Adición del inoculo preparado 95
Anexo 18. Proceso del método de la concentración mínima
bactericida (CMB) en Agar manitol salado 95
Anexo 17. Autoclavado final en donde se esterilizo todo material
y desecho que se usó en todo procedimiento 96
xiii
INTRODUCCIÓN
“La utilización de sustancias naturales en el tratamiento de diferentes
enfermedades, incluidas las de etiología infecciosa, constituye en la actualidad
un desafío en la medicina y se ofrece como una alternativa, especialmente en
aquellas dolencias para las que no existe un remedio adecuado.”1 “Después de
un período en que la industria farmacéutica se dedicó exclusivamente a la
fabricación de fármacos de síntesis, dejando atrás las antiguas medicinas que
tenían como base los extractos de plantas medicinales, hay un cambio
cualitativo en los programas industriales con dedicación a la búsqueda de
nuevos medicamentos de origen herbario. Un número creciente de personas
recurren a sus propiedades curativas basándose en su uso tradicional. No
obstante, ciertas plantas medicinales no han mostrado las propiedades que les
atribuye la medicina popular, e incluso han resultado peligrosas.”2 Existen
reportes en la literatura de que numerosas investigaciones están encaminadas
a la búsqueda de nuevos compuestos con actividades biológicas a partir de
fuentes naturales, mientras otras están destinadas a verificar las propiedades
que se les atribuyen.
“El estudio científico de las plantas medicinales es una fuente relevante para el
descubrimiento de nuevos fármacos que luego se sintetizan, pero también
permite un conocimiento más profundo de los vegetales que conduce a que
muchos productos naturales sean reconocidos como fitofármacos, es decir,
compuestos que igualan el nivel de los fármacos de síntesis.”1 Actualmente,
uno de los problemas más comunes es que existen plantas medicinales que
tienen una actividad antimicrobiana conocida por la población, sin embargo no
han sido analizadas a fondo, para determinar cuáles son sus beneficios,
pasando muchas veces desapercibidas.
El cedrón es una especie muy popular y ampliamente distribuida, esto es por
su propagación facilitada por matas. Además, se le han atribuido propiedades
diuréticas, antimicóticas y antimicrobianas a causa de su aceite esencial de
aroma cítrico. Es por este uso potencial que la extracción y posterior estudio
del mismo es importante; ya que existe un amplio mercado de interés en la
industria farmacológica y cosmética. En tal sentido, el presente trabajo de
investigación tuvo como objetivo principal evaluar el efecto antimicrobiano del
xiv
extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC
10231. Debido a que estos microorganismos son los responsables de las
principales infecciones que afectan la salud de las personas y animales con
enfermedades como infecciones urinarias, osteomielitis, sinusitis, furúnculos,
queratitis, onicomicosis entre otros.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1. Descripción de la realidad problemática
“Se sabe que, las infecciones ocupaban los primeros puestos en cuanto a
mortandad, sin embargo, en la actualidad, son la segunda causa de muerte tras
las enfermedades cardiovasculares. Así pues, durante el siglo XX la mortandad
por enfermedades infecciosas descendió de forma drástica aumentando así la
expectativa de vida. Estos cambios se debieron principalmente a la aparición
de los antibióticos y al desarrollo en técnicas diagnósticas y terapéuticas
medico quirúrgicas. Además, es necesario saber que, a las infecciones
comunitarias se agregan las infecciones nosocomiales (IN) que, en general,
perjudican a los pacientes más graves. La IN, en su definición habitual, es
aquella que aparece durante el ingreso hospitalario, aunque en la actualidad se
extiende también a la que se relaciona con los cuidados sanitarios en un
sentido amplio. Estas infecciones son unas veces motivo de ingreso en las
unidades de cuidados intensivos (UCI) y otras, consecuencia de la estancia en
éstas.” 3
“En Perú, un estudio en el año 2000 realizado en 70 hospitales con más de
1500 egresos por año, se evidenció una prevalencia de 3,7 % de infecciones
intrahospitalarias, siendo las áreas más afectadas la UCI y neonatología” 4; “por
otro lado, un segundo estudio realizado en un hospital de la Seguridad Social
nivel cuatro presentó una prevalencia de 7,5 % siendo en su mayoría pacientes
de cuidados intermedios.” 5
“Como responsables de los casos de infección de tracto urinario asociado a
catéter permanente en la UCI-Emergencia se halló Klebsiella sp. y
Acinetobacter sp ambos con 7,7 %.”6 7 “Para la UCI-Medicina los
microorganismos aislados fueron Pseudomona sp. y Staphylococcus aureus
ambos con 6,6 %.” 6 8 “Finalmente, en la UCI-Quirúrgica el agente más
frecuente fue Candida sp. Con el 50 %”.” 9 10
“En la actualidad, el gran reto para los países ricos en biodiversidad es poder
vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en
compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte
2
del aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en
beneficio de la sociedad.” 11
“El uso de extractos vegetales para el tratamiento de enfermedades a nivel
hospitalario es limitado, se supone que las bacterias no han desarrollado
mecanismos de resistencia en su contra, es por esto que se pretende que los
extractos pudieran ser una opción importante para el tratamiento de estas
afecciones.” 12
“Un estudio revela que, a partir de la valoración de los extractos íntegros de las
diferentes partes de la planta, así como multiples compuestos aislados en
extractos han evidenciado significativa actividad biológicas como son:
antihelmíntica, antibacteriana, vermífuga, antidiarreica y antidisentérica.” 13
3
1.2. Formulación del problema
1.2.1. Problema principal
− ¿Cuál es el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231?
1.2.2. Problemas secundarios
− ¿Cuál es el resultado de la identificación de flavonoides y taninos del
extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)?
− ¿Cuál es la concentración de fenoles totales en el extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)?
− ¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración
Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923?
− ¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración
Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922?
− ¿Cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración
Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231?
− ¿Cuál es la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC
25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231?
4
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivo general
− Determinar el efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231
1.3.2. Objetivos específicos
− Identificar flavonoides y taninos en el extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón).
− Cuantificar fenoles totales en el extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) por el método de Folin Ciocalteu.
− Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC
25923.
− Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922.
− Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la
Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231.
− Evaluar la sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus ATCC
25923, Escherichia coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231.
5
1.4. Justificación
“Según datos obtenidos por la Universidad de Santander de Colombia, en los
últimos años, el fallecimiento de niños menores a cinco años de edad han
disminuido; no obstante, las cifras aún son alarmantes. Entre las primeras
causas de muerte por infecciones se encuentran la neumonía, seguida por
diarrea y malaria. Datos adquiridos de los análisis sistemáticos, evidencio que
entre los años 2010 y 2011 se presentaron entre 7,6 y 6,9 millones de muertes
de niños bajo cinco años de edad, respectivamente. El 9,9% de esas muertes
fue a causa de la diarrea producida por Rotavirus, calicivirus, Escherichia coli
enteropatógena y E. coli enterotoxigénica.”60
“En relación a Staphylococcus aureus, comunico que en los trabajos publicados
en la revista cubana de pediatría, mencionan que esta bacteria es oportunista,
debido a que ocasiona enfermedades al humano, principalmente cuando éste
atraviesa lapsos de debilidad asociados a circunstancias anómalas que
disminuyen la competencia de su sistema inmunológico.”2
Bajo tales condiciones, Staphylococcus aureus es capaz de provocar
afecciones en casi cualquier región anatómica, lo cual refleja su amplio bagaje
en cuanto a genes de virulencia que lo habilitan para establecerse,
reproducirse, sobrevivir y extenderse en diversas clases de tejidos,
ciertamente, S. aureus es una causa común de piodermitis, intoxicaciones
alimentarias y toda una gran variedad de afecciones entre la población general;
no obstante, el "blanco" preferido de esta especie se ubica predominantemente
dentro de los hospitales, en donde entra en contacto con numerosos pacientes
debilitados, ya sea debido a que éstos padecen de enfermedades graves,
traumatismos o quemaduras serios u otras lesiones, incluyendo las provocadas
por alguna cirugía, o bien, porque han sido sometidos a tratamientos que
abaten la inmunidad celular o a la implantación inapropiada de dispositivos
médicos, tales como prótesis, catéteres u otros materiales plásticos.
“Por otro lado, las especies del género Candida sp. son hongos en forma de
levaduras ovales que conviven como microorganismos comensales, en el
individuo inmunodeprimido, ya que hacen parte de la flora normal de la piel y
mucosa en la mayoría de sistemas del cuerpo humano (gastrointestinal,
respiratorio y genitourinario); este microorganismo es el más habitualmente
6
implicado en las infecciones por hongos en pacientes críticos y las especies
patógenas más frecuentes de Candida sp son: C. albicans, C. tropicalis, C.
glabrata, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. orthopsilosis, C. metapsilosis, C.
krusei, C. famata, C. guilliermondii y C. Lusitania.”38
Con todo lo mencionado, actualmente la utilización de antibióticos plantea
problemas debido al inconveniente de elegir el antibiótico adecuado entre un
gran número de ellos. La enorme incremento de antibióticos con la
consecuente incapacidad de conocer las características de cada uno, y la
sensación de seguridad que crea el prescribir aquellos que tienen un amplio
espectro de acción, conduce en muchas ocasiones a una utilización masiva e
indiscriminada de antibióticos y, lo cual es peor, así, el consumo de antibióticos
supone la primera o segunda partida económica de los gastos de farmacia de
un hospital. Este enorme volumen de consumo se traduce en cifras de
utilización inadecuada de antibioticos, en la aparición de efectos secundarios,
el desarrollo de resistencias bacterianas, colonizaciones o infecciones graves.
Una alternativa al uso, a veces indiscriminado, de antibióticos reside en la
utilización de plantas medicinales o fitoterapia, la cual ha sido empleada en
todo el mundo desde épocas remotas. En la actualidad las infecciones
nosocomiales en Perú y hospitales de Arequipa son causadas por especies de
Staphylococcus aureus meticilino resistente (SAMR), Pseudomona aeruginosa,
así mismo, las infecciones del tracto gastrointestinal a menudo se dan por
Escherichia coli, en cuanto a infecciones vaginales o dérmicas también pueden
estar asociadas Candida albicans.
En tal sentido, en el presente trabajo de investigación se busca evaluar el
efecto antimicrobiano del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 y
Candida albicans ATCC 10231.
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes investigativos
2.1.1. A nivel internacional
“Ricco, Wagner y Gurni en su investigación titulada “Dinámica de
polifenoles de “Cedrón” (Aloysia citrodora Palau -Verbenaceae-) en
relación al desarrollo foliar” en el año 2011 expuso que; se examinaron las
infusiones realizadas a partir de las hojas de Aloysia citrodora Palau –
Verbenaceae-, conocida holgadamente como “cedrón”, con el objeto de
establecer la influencia del grado de desarrollo foliar en el perfil de
polifenoles. Se obtuvieron los perfiles cromatográficos y se cuantificaron
los fenoles totales, taninos totales, flavonoides totales y ácidos
hidroxicinámicos totales provenientes de los extractos acuosos de las
hojas jóvenes y adultas. Se examinó diferencias cuali-cuantitativas en el
perfil de polifenoles cuando se comparan las hojas jóvenes con las hojas
adultas. En las hojas jóvenes, las concentraciones de fenoles totales,
flavonoides totales y ácidos hidroxicinámicos totales resultaron ser
significativamente superiores a las determinadas en las hojas adultas. Los
estudios realizados sugieren que la variable aquí analizada debe ser
considerada al momento de elaborar productos en base a hojas de
cedrón, dado que las diferentes concentraciones detectadas podrían
traducirse en diferentes actividades biológicas.” 17
“En Ecuador ejemplares de las especies vegetales Lippia citriodora K
(cedrón), Ambrosia artemisifolia L (altamisa), Taraxacum officinale Weber
(diente de león), Ageratum conyzoides L (mastrante), Piper carpunya Ruiz
& Pav (guaviduca), Borago officinalis L (borraja), Coriandrum sativum L
(cilantro), Melissa officinalis L (toronjil), Cymbopogon citratus S (hierba
luisa), Artemisia absinthium L (ajenjo), Momordica charantia L (achochilla)
y Moringa oleífera Lam (moringa) se recolectaron al azar en las
localidades de Machala y Santa Rosa, Ecuador. Las hojas fueron lavadas,
secadas, molidas y extraídas por maceración con metanol; los filtrados
concentrados por evaporación a presión reducida. Para determinar la
8
actividad antimicrobiana de los extractos metanólicos obtenidos, se utilizó
la técnica de difusión en agar, mediante la cual éstos se probaron frente a
cepas de bacterias Gram positiva (Staphyloccocus aureus) y Gram
negativa (Escherichia coli y P. aeruginosa), y una cepa del hongo
(Candida albicans). Todos los extractos analizados, a excepción de los de
L. citriodora y A. conyzoides, manifestó una acción bactericida contra
todas las cepas bacterianas ensayadas, lo cual refleja la gran importancia
de estas especies en la producción de fitofármacos antibióticos. T.
officinale y P. carpunya presentaron un efecto antibacteriano alto contra
E. coli; sin embargo, S. aureus no presentó sensibilidad frente los
extractos de L. citriodora y P. carpunya. El bioensayo de actividad
antifúngica realizado a los extractos de las especies estudiadas contra C.
albicans, mostró que todos tienen acción fungicida alta, a excepción de T.
officinale con un menor efecto inhibitorio del crecimiento fúngico. Se
puede inferir que estas plantas constituyen una fuente promisoria de
compuestos químicos antimicrobianos de gran valor farmacológico.”1
2.1.2. A nivel nacional
“Chicoma y Malca” 18, “en su investigación titulada efecto antibacteriano in
vitro del aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la
Región Cajamarca, frente a las bacterias patógenas Escherichia coli
ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, tuvieron como
objetivo demostrar el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de
hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la región Cajamarca, frente a las
bacterias patógenas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923. El material vegetal se obtuvo de la zona de Huacariz
(Región Cajamarca), del cual se obtuvo el aceite esencial por
hidrodestilación utilizando el destilador de caldera de acero inoxidable.
Las cepas estandarizadas fueron obtenidas del Instituto Nacional de
Salud, Lima- Perú. Para analizar la actividad antibacteriana se utilizaron
los métodos de Kirby Bauer y los pocillos. En el método de Kirby Bauer se
utilizó un grupo problema constituido por discos embebidos con 20 µL del
aceite esencial de Aloysia triphylla P. “cedrón” diluido con etanol de 70º
(diluciones de 10%, 50% y 100%), un grupo control constituido por discos
9
con etanol de 70º, 5 µg de ciprofloxacino y 30 µg de cloranfenicol para la
cepa de Escherichia coli y 15 µg de eritromicina y 2 µg de clindamicina
para la cepa de Staphylococcus aureus. Para el método de los Pocillos se
utilizó un grupo problema con 40 µL del aceite esencial de Aloysia triphylla
P. “cedrón” diluido con etanol de 70º (diluciones de 10%, 50% y 100%), un
grupo control constituido por 40 µL de las diluciones de cloranfenicol y
ciprofloxacino (10 mg/ml, 50 mg/ml y 100 mg/ml) para la cepa de
Escherichia coli, diluciones de eritromicina y clindamicina (10 mg/ml, 50
mg/ml y 100 mg/ml) para la cepa de Staphylococcus aureus y 40 µL de
etanol de 70º para ambas cepas, llevando a incubar las placas a 37 °C
durante 24 horas. Luego se procedió a observar, medir y analizar los
halos de inhibición obtenidos sobre las cepas en estudio. Los resultados
se analizaron con el método estadístico no paramétrico de Mann -
Whitney, obteniendo un valor de p=0,034 para Escherichia coli y para
Staphylococcus aureus p=0,046, por el método de los discos de
sensibilidad y por el método de los Pocillos, Escherichia coli p=0,010 y
p=0,016 Staphylococcus aureus siendo menor que p<0,05, lo que hace
que el estudios sea significativo. Según los resultados se concluye que el
aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” tiene efecto
antibacteriano sobre las cepas de Staphylococcus aureus pero no contra
Escherichia coli.” 18
2.1.3. A nivel local
Sabiendo que la capacidad antioxidante de un extracto está relacionado
con la actividad antimicrobiana y debido a que no hay referencias
bibliográficas de estudios realizados en el tema a nivel local se cita a
“Alpaca” 19 “que en evaluación de la capacidad antioxidante del extracto
de cedrón (Aloysia triphylla) para la realización de una bebida funcional
plantea que; las plantas han formado parte de la medicina tradicional de
muchos países. En Perú, son ampliamente utilizadas en el alivio de
numerosas enfermedades. Una de estas plantas es el cedrón (Aloysia
triphylla), el cual posee propiedades analgésicas y antiespasmódicas.
Dicho trabajo tuvo como objeto evaluar la capacidad antioxidante y
fenoles totales de los extractos de cedrón a través de un método
10
espectrofotométrico y sus características organolépticas con la finalidad
de elaborar una bebida funcional como una nueva alternativa para el
mercado. Para lo cual la materia prima fue sometida a análisis para
conocer la calidad de ella, además se realizó como experimento
preliminar el método de secado del cedrón, bajo sombra (T max: 22°C, T
min: 11°C) por un tiempo de 40 hrs, alcanzando una humedad promedio
final de 9,99% y artificialmente en cámara de aire caliente (T: 40+5°C )
por un tiempo 4 hrs y 30 min, alcanzando una humedad promedio final de
9,41% de estas muestras se llevaron al experimento de extracción con el
cedrón con un porcentaje de humedad de 65.64% para ver cómo estas
variables influyen en las características tanto sensoriales como en sus
compuestos antioxidantes. Los parámetros para la extracción por infusión
en cuanto al estado del cedrón y la proporción (cedrón: agua) son: cedrón
deshidratado bajo sombra a temperatura ambiente, a una proporción de
1:50 respectivamente, obteniendo los mejores resultados en cuanto a sus
compuestos antioxidantes y características sensoriales. Los parámetros
para la pasteurización son: a 92°C por 5 minutos, con el fin de mantener
su capacidad antioxidante y fenoles totales, sin afectar las características
sensoriales y asegurar una eliminación microbiana que garantice la
inocuidad del producto. Se efectuaron los análisis de sus compuestos
antioxidantes en la bebida funcional, los cuales fueron: 5797,940 μmol
TR/L de su capacidad antioxidante y 5902,258 μmol TR/L de fenoles
totales., también se le realizaron sus análisis físico – químico, químico –
proximal, sensorial y microbiológico al producto final. La bebida funcional
elaborado a base de extracto de cedrón, es altamente aceptado por los
consumidores.”19
“El tiempo de vida útil de la bebida funcional es de 4 meses y 10 días a
una T=5°C. En el capítulo IV, se evaluó la propuesta a nivel industrial
realizando los cálculos de ingeniería y especificaciones de la planta, la
ubicación de la planta estará en la Provincia de Arequipa, en el distrito de
Characato, tendrá un periodo operativo de 300 días al año, con un turno
de 8 horas/día; y una capacidad de producción de 288 000 lt/año.”19
11
2.2. Base Teórica
2.2.1. Cedrón
A. Descripción
“La Aloysia triphylla, pertenece a la familia de las Verbenáceas y es
también conocida botánicamente con los nombres de Lippia citriodora
Kunth, Lippia triphylla Kuntze, Aloysia citriodora Ortega. Habitualmente,
se le conoce en Colombia como “Cidrón”; en Perú “Cedrón”, en Argentina,
“Cedrón”, “Hierba Luisa”; “María Luisa” y “Hierba de la princesa”, en
España. Es apreciada como planta engalanada en los jardines y solares,
debido al intenso y agradable olor a limón que desprenden sus hojas.” 20
“El Cedrón (Aloysia triphylla) es un arbusto que crece en forma natural,
puede medir más de 1.50 m de altura, es muy olorosa, de hojas opuestas
y trifoliadas, con flores blancas y verdosas. Sus frutos son drupas
pequeñas, de color verde y sus semillas son de color gris.” 21
“Hojas: Su nombre “triphylla” se debe a que sus hojas simples, rugosas e
insertadas en cada nudo, están reunidas en vértices de tres.” 22
Figura 1. Aloysia citriodora Palau (Cedrón)
12
“Flores: Son pequeñas, blancas por fuera y violáceas por dentro. Esta
planta es originaria de la región montañosa del norte de Argentina (la
Rioja, Salta), donde crece silvestre.” 22
“Habitad: La planta se adapta bien en climas templado y templado-cálido.
Con frío riguroso suele perder las hojas. Prospera bien en buenos suelos,
de consistencia media, sueltos, permeables, profundos, con pH entre 6,5
y 7,2 más bien frescos, pero no húmedos, pues el exceso de agua
favorece la podredumbre de raíces.”22
B. Clasificación taxonómica
En la Tabla 1 se presentan la clasificación taxonómica correspondiente a
Aloysia citriodora Palau (Cedrón)
Tabla 1. Clasificación taxonómica
F
u
e
n
t
e
:
R
a
m
o
s
Fuente: “Ramos” 23
C. Composición
“La fracción volátil es la característica más destacada del cedrón. Su
rendimiento en aceite esencial fluctúa entre 0,2 y 1,0% dependiendo de
diversos factores endógenos y exógenos. El principal componente de la
calidad habitual del cedrón es el citral (mezcla de los isómeros geranial y
Categoria Taxonómíca Descripción
Reino Vegetal – Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Lamiales
Familia Verbenaceae
Género Aloysia
Especie Triphylla
Nombres comunes Aloysia citriodora, Hierba Luisa o Verbena de Indias
13
neral) como se observa en la Figura 2. El rendimiento mínimo requerido
de aceite esencial en la Farmacopea Francesa X (1996) es de 0,4%.
Existe también una norma IRAM-SAIPA (1970) para su esencia, donde se
exige un contenido de compuestos carbonilicos expresados como citral de
20 al 40%.” 24
Figura 2. Composición química del Cedrón
Fuente: “Adaptado de García” 21
14
“En cuanto a otros compuestos identificados en el cedrón, destacan los
flavonoides como salvigenia, eupafolina, cirsiol, eupatorina, hispidulina,
apigenina, diosmetina, 7-O-glucosil-luteolina y 7-O-diglucuronil-luteolina.
Además, el cedrón contiene irioides heterosidicos, como el
acidogeniposidico; derivados del acidohidroxicinamico (7%),
especialmente verbascosido (5%), mucilagos, taninos, alcaloides, nonanal
y fitoesteroles.”21 “monoterpenos (8-17%), sesquiterpenos (8-10%),
monoterpenos oxigenados (60-77%) y sesquiterpenos oxigenados (5-
13%) y limoneno.”60
D. Usos
“Andoni (1988), indica que el cedrón es utilizado para trastornos
digestivos tales como, diarrea, cólicos, indigestión, náusea, vómitos y
flatulencia; en trastornos del sistema nervioso como sedante en insomnio
y ansiedad; en estados gripales (resfriados con fiebre).”25
“La infusión se prepara con 1 cucharada de la planta para I litro de agua
recién hervida, dejar reposar y beber de 3 a 4 tazas al día. Efectos:
antiespasmódico (calma los retortijones estomacales), carminativo
(previene y favorece la expulsión de gases), sedante suave (modera la
actividad del sistema nervioso).”25
“Posee una importante cantidad de melatonina, sustancia que se usa
como relajante natural y que favorece el sueño nocturno, ayuda al
descanso total de la memoria.”25
“Estudios científicos han demostrado importantes propiedades
antimicrobianas de A. triphylla. El extracto acetónico de las partes aéreas
evidenció significativa actividad contra Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris” 26; “el
extracto etanólico fue activo contra Listeria monocytogenes” 27; “por otra
parte, el aceite esencial mostró actividad contra Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterobacter aerogenes, Klebsiella
ozaenae, Enterococcus sp, Bacillus subtilis, Candida albicans” 28 “y
produjo inhibición in vitro de la replicación de cuatro serotipos del virus del
dengue.”29
15
2.2.2. Infecciones
“Una infección primaria es una infección aguda que causa la enfermedad
inicial. Una infección secundaria es la causada por un patógeno
oportunista después de que la infección primaria debilito las defensas del
organismo.”30
“Las infecciones nosocomiales son resultados de las interacciones de
varios factores como son; los microorganismos presentes en el ambiente
hospitalario, así como, el estado comprometido (debilitado) del huésped y
finalmente la cadena de trasmisión en el hospital. Así pues, la interacción
de los tres factores expuestos plantea un riesgo significativo de una
probable infección nosocomial.” 30
A. Staphylococcus aureus
“Los Staphylococcus son cocos Gram positivos cuyo diámetro varía de
0,8 a 1,0 µm. En cultivo sólidos, se desarrollan formando racimos, sin
embargo, en medios líquidos forman a menudo cadenas cortas.”31 “Las
colonias de Staphylococcus son circulares de 2 a 8 mm de diámetro,
convexas, desde traslucidas a opacos grises blanquecinas, amarillas.” 32
“Staphylococcus aureus, produce varias enzimas y toxinas que pueden
contribuir a su virulencia.” 33
a. Enzimas
− “Catalasa: La producción de catalasa por parte de estos
microorganismos puede ejercer la inactivación del peróxido de
hidrogeno y los radicales libres tóxicos formados por el sistema
mieloperoxidasa dentro de la célula fagocitas después de la ingestión
de estos microrganismos.” 33
− “Coagulasa: Tanto la coagulasa libre como la unida (también
denominada factor de agregación) pueden revestir las células
bacterianas con fibrina y trasformarlas resistentes a la ozonización y
la fagocitosis.” 33
− “Fibrinolisinas (Estafiloquinasa): Estas pueden degradar coágulos
de fibrina y permitir la dispersión de la infección a los tejidos
contiguos.” 33
16
− “Hialuronidasa: Hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacáridos
en los tejidos y por lo tanto puede actuar diseminando los
microorganismos a zonas aledañas.” 33
− “Lipasa: Las cuales son activas sobre una variedad de sustratos
incluyendo plasma, grasas y aceites que se acumulan en la superficie
del cuerpo, lo cual explica la intensa repoblación del Staphylococcus
por las áreas sebáceas de mayor actividad.” 33
− “Nucleasas: La elaboración de una nucleasa resistente al calor
parece estar asociada con cepas Staphylococcus aureus. Se halla en
la célula o en la superficie de ella.” 33
− “Lactamasas: La producción de estas enzimas puede ser inducibles
es decir se producen solo en presencia de antibióticos β-Lactámicos
o constitutiva es decir se producen continuamente y hace que estos
microorganismos sean resistentes a la penicilina y la ampicilina.” 33
− Otros: “Los estudios inmunológicos y de especificidad indican que
Staphylococcus aureus producen por lo menos tres tipos
diferentes.”33
b. Toxinas
− “Toxinas citolíticas: Existen varias de ellas.” 34
− “Alfa hemolisina: Es una proteína que puede producir lisis de los
eritrocitos y lesionar las plaquetas.” 34
− “Beta hemolisina: Esta degrada la hemolisina y es toxica para
muchas clases de células, incluso los eritrocitos.” 34
− “Leucosidinas: Toxina que puede extinguir a los leucocitos
expuestos de muchos animales.” 34
− “Enterotoxinas: Hay por lo menos seis toxinas solubles designadas
de la A-F producidas por el Staphylococcus aureus, estas son
termoestables resistente a cocción por 30 minutos y a la acción de la
enzima intestinales; son causas importantes de intoxicación con
alimentos.” 34
− “Toxina exfoliativa o epidermolítica: Esta toxina está constituidas
por lo menos dos proteínas que producen eczema generalizada del
síndrome estafilocócico de piel escaldada.” 34
17
c. Patogenicidad de Staphylococcus aureus
“Staphylococcus aureus interviene en la mayor parte de los procesos
infecciosos de heridas en el hombre. Puede localizarse en cualquiera de
los tejidos corporales, por lo que es el germen que con más frecuencia
produce piemía. En el hombre es uno de los agentes etiológicos de
osteomielitis, sinusitis, tonsilitis, forúnculos, mastoiditis, endocarditis y
queratitis ulcerativa. Como agente secundario interviene en la angina
séptica, escarlatina, tuberculosis y neumonía.” 34
“La adquisición puede ser exógena o endógena. Es un agente de gran
relevancia intrahospitalaria, donde ha adquirido resistencia a la Oxacilina.
La contaminación intrahospitalaria se lleva a cabo a través de las manos
del personal a cargo.” 34
B. Escherichia coli
“Es una de las primeras especies que coloniza al mamífero recién nacido,
adquiriendo las primeras cepas del canal de parto y de las heces de su
madre. Las invasiones posteriores se deben por lo general a la deglucion
de alimentos contaminados. Las especies pertenecientes a este género
son bastones rectos de 1,1 – 1,5 x 2,0 - 6,0 µm, que se encuentran tanto
aislados como en parejas. Algunas de las cepas pueden presentar
cápsula o microcápsula. Móviles por flagelos perítricos o inmóviles. Son
Gram negativos, anaerobios facultativos y presentan tanto un
metabolismo fermentativo como oxidativo.”35
“E. coli es un organismo quimioorganotrofo, oxidasa negativa y catalasa
positiva, cuya temperatura óptima de crecimiento es de 37 ºC y cuyas
colonias, aisladas en agar nutritivo, pueden ser tanto lisas como
rugosas.”35
a. Patogenicidad de Escherichia coli
“Las infecciones más frecuentes debidas a E. coli son las urinarias.
Asimismo puede originar infecciones de las vías biliares, peritonitis,
meningitis neonatal, neumonía, y gastroenteritis entre otras.”36 “Aunque
E. coli es parte de la flora comensal puede causar infecciones en
determinada condición, como son la emigración desde el intestino al
tracto urinario, produciendo infecciones urinarias bajas y eventualmente
18
bacteriemia o infecciones focales por vía hematógena, aunque la vía de
entrada más común es la urinaria, ello no significa que sea la única que
permite el acceso del germen a la circulación.” 37
“Son muchos los síndromes clínicos que pueden estar causados por E.
coli entre ellos destacan los siguientes:” 37
− Infecciones urinarias
− Gastroenteritis
− Meningitis neonatal
− Bacteriemia
− Otras infecciones: neumonía, infecciones de las vías biliares,
− infecciones localizadas
C. Candida albicans
Candida albicans es el agente más común y patógeno dentro del género
Candida principal promotor de la Candidiasis vaginal.
“Candida es un organismo común en la flora vaginal, lo que ocurre es que
se puede presentar bajo dos formas. En su forma como fermento (no
patógena, blastoporo) y en su forma micelar donde desarrolla una especie
de raíces, pseudohifas (forma patógena) que se entrelazan entre sí y con
las que traspasan y se fijan a las células de la mucosa vaginal.” 38
a. Patogenicidad de Candida albicans
“La adherencia de C. albicans es el primer paso es la colonización y
penetración de los tejidos mucocutáneos, la cual es probablemente
mediada por la interacción de las glicoproteínas de superficie del fermento
con la célula epitelial del hospedero. Luego se produce la aparición de
tubos germinativos, micelio o pseudomicelio (según la especie), los cuales
ingresan directamente en la célula epitelial. La adherencia continúa con la
obtención de enzimas hidrofílicas como proteinasas, fosfatasas, y
fosfolipasas.”38
2.2.3. Métodos de evaluación del efecto antimicrobiano
A. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
“La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se define como la mínima
concentración de antimicrobiano (en µg/mL) que impide el crecimiento
visible de un microorganismo después de 24 horas de inoculación a 37°C.
19
La CMI se ha establecido como “gold Standard” frente a otros métodos
que evalúan sensibilidad antimicrobiana; además de confirmar
resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado
obtenido por otros métodos es impreciso.”39
B. Concentración Mínima Bactericida (CMB)
“La Concentración Mínima Bactericida (CMB), se define como la mínima
concentración de antimicrobiano que mata a más del 99,9% de los
microorganismos viables después de un tiempo determinado de
inoculación (generalmente 24 horas).” 40 41 “En ocasiones se hace
necesario determinar la actividad bactericida de un agente antimicrobiano,
como es el caso de endocarditis, osteomielitis, meningitis o infecciones
en pacientes inmunosuprimidos, existe la necesidad de establecer
métodos de laboratorio que definan la actividad de estos agentes.” 40
2.2.4. Antibiograma
A. Generalidades
“La realización de un antibiograma se basa en el patrón de resistencia de
cada bacteria. Así, los antibióticos a los que esa bacteria es
intrínsecamente resistente o cuya sensibilidad puede inferirse por otros,
no suelen informarse en el antibiograma. Los patrones de antibiograma
poco frecuentes o imposibles requieren confirmación, ya que no
responden a mecanismos de resistencia conocidos.” 42
“Los métodos fenotípicos (antibiograma) son los más utilizados. Consisten
en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a
diferentes concentraciones de antibiótico. La interpretación de los
resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en
categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes. Hay que tener en
cuenta que no siempre un valor de CMI más bajo indica mayor actividad
de este antimicrobiano, ya que las CMI que definen la sensibilidad o
resistencia son diferentes para cada especie bacteriana y cada
antimicrobiano. Si un microorganismo es sensible indica que con las dosis
habituales se espera una evolución favorable de la infección, siempre que
se alcancen valores adecuados en el lugar de la infección, lo que en
ocasiones no es posible (p. ej., en el sistema nervioso central).” “Por el
contrario, si el microorganismo es intermedio o resistente, es probable
20
que la evolución sea desfavorable. La interpretación de la sensibilidad
pronostica mejor el fracaso (cuando es resistente) que el éxito de un
tratamiento. Entre los métodos fenotípicos, las técnicas de dilución
determinan la CMI utilizando un medio líquido (dilución en caldo) o un
medio sólido (dilución en agar) para disolver las diferentes
concentraciones del antimicrobiano.”42
“El medio estandarizado para la realización del antibiograma es el medio
Müeller Hinton, al que se le incorpora sangre u otros suplementos para
bacterias que no crecen en él. La CMI es la dilución más baja de
antimicrobiano en la que no se examina crecimiento bacteriano. La
dilución en caldo suele realizarse en micrométodo (microdilución), en
paneles multipocillos, y es el sistema mayoritariamente adoptado por los
sistemas automáticos comerciales para determinar la sensibilidad a los
antimicrobianos. En estos sistemas, la lectura de los valores de CMI y la
interpretación de resultados se realizan de forma automática.” 42
B. Lectura interpretada del antibiograma
“El análisis de los resultados de sensibilidad es un aspecto esencial para
una correcta información del antibiograma y tiene una gran trascendencia
clínica.” 43 “En tal sentido, la lectura interpretada del antibiograma analiza
los fenotipos de sensibilidad y permite interpretar posibles mecanismos de
resistencia.” 44 “Además, este proceso permite inducir la sensibilidad de
antibióticos no estudiados en el antibiograma y la corrección, en su caso,
de ficticias sensibilidades analizadas in vitro, como ocurre en el caso del
antibiograma de una enterobacteria con una BLEE, en el que no siempre
aparecen como resistentes todas las cefalosporinas, si bien, en la práctica
debe evitarse su uso. Asimismo, favorece el acondicionamiento del
tratamiento, el control de las políticas de antimicrobianos, la
descubrimiento de nuevos mecanismos de resistencia y el conocimiento
de su epidemiología.” 44
“Un requisito esencial para poder realizar una correcta lectura interpretada
es conocer la identificacion del microorganismo estudiado, tanto el género
como la especie, ya que sin ella el resultado puede llevar a errores en la
utilización de los antimicrobianos. Así, una cepa de S. aureus con CMI de
21
cloxacilina de 1 mg/l es sensible a cloxacilina y a todos los β-lactámicos,
mientras que si se trata de un estafilococo coagulasa negativa la CMI de 1
mg/l indica resistencia a cloxacilina.”42 “Otro requisito para poder realizar
correctamente la lectura interpretada del antibiograma es conocer el
fenotipo de sensibilidad de un microorganismo, ya que hay bacterias que
siempre son resistentes a determinados antibióticos y otras que siempre
son sensibles, y la desviación de estos patrones indica si el patrón del
antibiograma corresponde a un fenotipo habitual, raro o imposible.” 45 46
“Los fenotipos habituales son los aislamientos con mecanismos de
resistencia cuya presencia es epidemiológicamente normal en el medio
donde se realiza el antibiograma. Un ejemplo de ello son la resistencia a
penicilina y sensibilidad a cloxacilina en un aislado de S. aureus. Los
fenotipos raros son los que presentan resistencias poco habituales, bien
porque han sido recientemente caracterizadas o porque son muy poco
frecuentes en nuestro medio. Un ejemplo de los primeros es la resistencia
a imipenem en Enterobacter cloacae” 47, “y de los segundos las cepas de
enterococo resistentes a la vancomicina.” 48
“Finalmente, los fenotipos imposibles no responden a mecanismos de
resistencia conocidos y, por tanto, es necesaria su comprobación. Estos
fenotipos imposibles, en muchas ocasiones, representan un error en la
identificación del microorganismo o bien problemas técnicos en la
realización del antibiograma, pero también hay que tener en cuenta que la
repetición de estos fenotipos en bacterias correctamente identificadas
puede suponer un nuevo mecanismo de resistencia, tal es el caso de la
resistencia a linezolid en enterococos.”49
22
2.3. Hipótesis
2.3.1. Hipótesis principal
Dado que el cedrón, es utilizado como agente terapéutico en la medicina
tradicional y según estudios bibliográficos presenta en su composición
química taninos y flavonoides como eupatorina, apigenina, diosmetina, ,
es probable que, el extracto de hojas de dicha droga vegetal presente
efecto antimicrobiano del sobre cepas de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli y Candida albicans.
2.3.2. Hipótesis secundarias
− Es posible que el extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau
presente flavonoides y taninos
− Es probable cuantificar fenoles totales en el extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón) por el método de Folin Ciocalteu
− Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y
la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC
25923
− Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y
la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau sobre Escherichia coli ATCC 25922
− Es probable determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y
la Concentración Mínima Antimicótica (CMA) del extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231
− Es probable que Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia
coli ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231 presenten
sensibilidad al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.
23
2.4.- Variables
2.4.1. Identificación de variables
− Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Aloysia
citriodora Palau.
− Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922
y Candida albicans ATCC 10231.
2.4.2. Definición conceptual de variables
− Variable independiente: Extracto etanólico de hojas de Aloysia
citriodora Palau.
− Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922
y Candida albicans ATCC 10231.
Actividad antimicrobiana evaluada mediante la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI), Concentración Mínima Bactericida (CMB),
Concentración Mínima Antimicótica (CMA) y sensibilidad por el
método de Antibiograma.
2.4.3. Definición operacional de variables
− Variable independiente: Extracto etanólico de Aloysia citriodora
Palau.
Gramos de extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau obtenido
por el método de extracción por Soxhlet.
− Variable dependiente: Actividad antimicrobiana sobre
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922
y Candida albicans ATCC 10231
Actividad antimicrobiana evaluada por la determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima
Bactericida y por el método del antibiograma midiendo los halos de
inhibición.
24
Tabla 2. Variables
VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR
Variable Independiente
Extracto etanólico de hojas
de Aloysia citriodora Palau
(Cedrón)
Extracto etanólico de
hojas de Aloysia
citriodora Palau.
%
Variable Dependiente
Actividad antimicrobiana
sobre Staphylococcus
aureus ATCC 25923,
Escherichia coli ATCC
25922 y Candida albicans
ATCC 10231
Concentración
inhibitoria mínima µL/Ml
Concentración
bactericida mínima µL/Ml
Sensibilidad
bacteriana
Halo de inhibición
(mm) medidos con un
vernier
Fuente: Elaboración propia
25
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. Tipo y nivel de investigación
3.1.1. Nivel de la investigación
Experimental
3.1.2. Tipo de investigación
Según manipulación de variables: Experimental
Según número de mediciones: Transversal
Según la temporalidad: Prospectivo
Enfoque: Cuantitativo
Por el propósito o finalidad: Aplicada
Paradigma: Positivista
3.1.3. Diseño de la investigación
Experimental
3.2. Descripción del ámbito de la investigación
3.2.1. Ubicación espacial
El presente trabajo se realizó en la región, provincia y
departamento de Arequipa, en la Universidad Privada Autónoma
del Sur.
3.2.2. Ubicación temporal
Universidad Privada Autónoma del Sur; periodo septiembre 2018 a
enero del 2019.
3.3. Población, muestra y muestreo
Muestreo: No probabilístico
26
3.4. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos
3.4.1. Material biológico
− Cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli
ATCC 25922 y Candida albicans ATCC 10231
− Hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón)
3.4.2. Materiales
Insumos
• Agua destilada
Materiales de Laboratorio
• Asa de Kolle
• Gradilla para tubos
• Guantes
• Matraz
• Mechero
• Micropipeta de 1000 l
• Micropipeta de 100 l
• Papel filtro rápido
• Piceta
• Pinza
• Puntas para micropipeta azul (1000 l)
• Puntas para micropipeta amarillas (100 l)
• Termómetro
• Tubos de ensayo
Material de vidrio
• Beaker de 100 ml
• Probeta de 100 ml
• Frasco de tapa azul
• Embudo
Reactivos químicos
27
• Etanol de 96°
• Etanol de 70°
• Mix de antibióticos
• Suero fisiológico
• Idopovidona
• Ron de quemar
Medios de cultivo
• Agar Müeller Hinton (Merck)
• Agar Manitol Salado (Merck)
• Agar Sabouraud (Merck)
• Caldo peptonado (Merck)
Equipos de laboratorio
• Autoclave
• Balanza analítica
• Cocina eléctrica
• Equipo de Extracción Soxhlet
• Estufa
• Refrigerador
• Rota vapor
Otros materiales
• Aguja
• Algodón
• Bolsas Ziploc
• Cinta masking
• Fosforo
• Gasa
• Hilo
• Jeringa de 5 ml
• Marcador indeleble
• Pabilo
• Papel aluminio
28
• Papel kraft
• Pinzas metálicas
• Strech film
• Tijeras
• Vernier metálico
29
3.4.3. Recolección, almacenamiento e identificación hojas Aloysia
citriodora Palau
Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) recolectadas fueron
cubiertas con papel kraft para ser trasportadas a los laboratorios de la
Universidad Privada Autónoma del Sur ubicada en la ciudad de Arequipa,
donde fueron almacenadas en ausencia de luz, para luego ser
determinadas en el Herbarium Areqvipense, Departamento Académico de
Biología de la Universidad Nacional de San Agustín (Anexo 1).
Para el trabajo en el laboratorio, la muestra fue estabilizada a temperatura
ambiente de la siguiente manera: procedimos a limpiar y liberarlas de
polvo y cualquier otro contaminante, luego continuamos con el lavado con
abundante agua destilada 2 L para después sumergirlas por unos
segundos en etanol de 70° y luego sacarlas de esta manera poder
eliminar todo microorganismo que podrían descomponer el material
biológico y sus metabolitos secundarios a través de una degradación
enzimática. Finalmente dejamos secar la planta en un lugar con sombra,
bien aireada y exenta del polvo, sobre papel kraft encima de una mesa.
Figura 3. Hojas de Aloysia citriodora Palau
Fuente: Elaboración propia
30
3.4.4. Obtención del extracto seco de Aloysia citriodora Palau
A. Obtención del extracto seco
“Para la obtención del extracto etanólico de Aloysia citriodora Palau se
pesaron 20 g de hojas trituradas para ser empaquetadas en un cartucho
de extracción y se llevaron a la cámara de extracción de un equipo
Soxhlet adaptado en el balón con 150 ml de etanol absoluto.”50
B. Identificación de Taninos
Los taninos fueron identificados con cloruro férrico al 5%: Resultando
positivo cuando se examina un cambio como sigue a continuación:
Interpretación
− Taninos hidrolizables o gálicos: Dan coloración azul negruzco
− Taninos condesados: Dan coloración verde a marrón
C. Identificación de Flavonoides
“La identificación de flavonoides fue realizada por la prueba de Shinoda
que se basa en la oxidación del magnesio en medio ácido. El hidrogeno
liberado produce por perdida el ion flavilio de color rojo escarlata que
varía de un rosa pálido hasta escarlata.”52
Figura 4. “Reacción química en la prueba de Shinoda”
En un tubo de ensayo se colocó una cantidad adecuada de extracto para
luego agregar etanol en presencia de magnesio metálico y dos gotas
ácido clorhídrico concentrado.
31
Interpretación
− La coloración de naranja al rojo indica la presencia de flavonas
− La coloración rojo carmesí, purpura y azul indican presencia de
flavononas
− El color amarillo pálido o incoloro indica presencia de flavonas y
flavonoles
− Una coloración de amarillo rojizo indica presencia de isoflavonas.
D. Determinación de fenoles totales
“La determinación de polifenoles totales se llevó a cabo utilizando el
método utilizado por Singleton, Orthofer y Lamuela-Raventos, cuyo
reactivo está compuesto por una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y
fosfomolíbdico en medio básico, los que sufren disminucion al oxidar los
compuestos fenólicos, originando un complejo wolframio-molibdeno de
color azul cuya absorbancia es dependiente de la concentración de los
polifenoles de la muestra y se midió en un espectrofotómetro a 725 nm.
Los resultados se expresan como mg equivalentes de ácido gálico/100 g
de muestra.”52
Procedimiento
En fiolas de 10 mL se preparará una curva de calibración adicionando
concentraciones de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µL de ácido gálico luego se
adicionaron 4 mL de agua destilada, posteriormente de agregaron 0,25
mL del reactivo de Folin Ciocalteu y finalmente 2 mL de carbonato de
calcio al 20 % y se dejó reaccionar 2 horas en la oscuridad. Luego de las
2 horas se leyeron en el espectrofotómetro a 725 nm.
En cuanto a la muestra 0,2 mL fueron medidos en una fiola de 10 mL y se
desarrolló de la misma forma que el ácido gálico.
3.4.5. Escala de Mc Farland
“Fue preparada mediante la formación de un precipitado de sulfato de
bario (BaSO4) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (BaCl2) al
1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36 N).” 51
32
3.4.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana
A. Reactivación de las cepas
Las cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 fueron adquiridas de
KwikStik y almacenadas para su conservación en un intervalo de
temperaturas entre 2 a 8°C.
Figura 5. Cepas de Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus
aureus ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231 adquiridas de
KwikStik
Fuente: Elaboración propia
Luego para la activación de las cepas de Escherichia coli ATCC 25922 se
sembró el contenido del vial en agar Müeller Hinton y Staphylococcus
aureus ATCC 25923 en Agar Manitol Salado para luego ser incubados a
37 °C por 24 horas, en cambio la cepa de Candida albicans ATCC 10231
se sembró el contenido del vial en agar Sabouraud y fue incubado a 37 °C
por 48 horas.
33
B. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
“Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria se
acondiciono una solución madre de 500 mg/ml del extracto seco en
etanol.”51
“Posteriormente, el inoculo con una concentración de 108 UFC/ml fue
preparado tomando con un asa de kolle estéril una cantidad adecuada de
colonias para luego sumergir el asa de kolle en 5 ml del caldo peptonado,
hasta obtener una turbidez del medio similar a la del tubo N°5 de la escala
de Mac Farland, la cual corresponde, a una concentración de 15x108
UFC/ml. Se Incubará a 37°C por 24 horas.” 51
“Luego se procedió a realizar una dilución de 1:100 del inoculo ya
preparado para obtener una solución de 106 UFC /ml.”53 Las diluciones se
observan a continuación en la Tabla 3.
Finalmente, se prepararon diluciones a estudiar cómo se observa en la
Tabla 3, donde se presentan las concentraciones de 25, 12,5, 6,25,
1,562, 0,781, 0,39, 0,195 de extracto que fueron puestas en contacto con
el inóculo preparado para luego observar la turbidez en un tiempo de 24 a
48 horas.
Tabla 3. Determinación de CMI por microdilución en caldo peptonado
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+)
T10 (-)
SOLUCIÓN MADRE (500 mg/mL) 100 500 500 500 500 500 500 500 _ 500
CALDO PEPTONADO (μL) 900 500 500 500 500 500 500 500 500 _
CONCENTRACIÓN INICIAL 50 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,78 0,39 _
INÓCULO (μL) 500 500 500 500 500 500 500 500 500 _
VOLUMEN FINAL (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,5
CONCENTRACIÓN FINAL (μL/mL) 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 _ 500
Fuente: Elaboración propia
34
C. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)
“De los tubos estudiados en la tabla precedente se sembró un volumen de
50 µL en agar Manitol Salado, Müeller Hinton y Sabouraud para S.
aureus, E. coli y C. albicans respectivamente, incubando de 24 a 48 horas
para luego evaluar el crecimiento.” 53
D. Determinación de la sensibilidad antimicrobiana
“El principio básico de este método consiste en que el disco este
empapado con el extracto para luego poner en contacto con la placa de
microorganismos a evaluar, El resultado es una zona de inhibición del
desarrollo con borde delineado (halo de inhibición); los cuales se
expresan como sensible (S), intermedio (I), y resistente (R). Siendo entre
30 y 35 mm altamente sensible, de 20 a 30 mm sensibles, de 15 a 20
intermedio y menores a 15 mm resistentes.” 51
“Se elaboraron discos de papel filtro de 6 mm de diámetro, los cuales
fueron esterilizados en la autoclave por 15 minutos a 121°C,
posteriormente fueron almacenados en un frasco previamente
esterilizado, posteriormente con la ayuda de una micropipeta los discos
serán empapado con las diferentes concentraciones del extracto.” 51
3.4.7. Análisis de datos
Para la presente investigación se utilizó el software Microsoft Excel y
Minitab 16 para la comparación de grupos utilizando la técnica de análisis
de varianza (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
35
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1. Recolección y determinación taxonómica
Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) recolectadas fueron
identificadas en el Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional
de San Agustín de Arequipa, identificándose como Aloysia citriodora Palau
(Cedrón). Los resultados de la identificación son detallados a continuación en la
Tabla 4. (Anexo 1)
Tabla 4. Identificación y tipificación de hojas de cedrón recolectadas
Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San
Agustín de Arequipa
4.2. Rendimiento de la extracción etanólico
Fuente: Elaboración propia
Categoría Taxonómica Descripción
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsidae
Subclase Asteridae
Orden Lamiales
Familia Verbenaceae
Género Aloysia
Especie Aloysia citriodora Palau
Extracto Rendimiento
Extracto seco 1 21,6105
Extracto seco 2 20,7245
Extracto fluido 3 20ml
36
4.3. Extracto etanólico de hojas Aloysia citriodora Palau (Cedrón)
Los extractos fueron obtenidos por el método de extracción por Soxhlet usando
20 gramos de hojas pulverizadas de Aloysia citriodora Palau. (Ver Figura 6).
Figura 6. Extracción por Soxhlet
Fuente: Elaboración propia
Posteriormente se concentraron los extractos usando un rotaevaporador a
70°C hasta obtener aproximadamente 20 mL del extracto fluido (Figura 7).
Figura 7. Rotaevaporador
Fuente: Elaboración propia
37
4.4. Identificación de taninos
Figura 8. Identificación de taninos condensados en Aloysia citriodora
Palau
Fuente: Elaboración propia
En la Figura 8 se observa el tubo de la izquierda que corresponde al blanco con
cloruro férrico al 5 %, el tubo del medio al extracto sin tratamiento y finalmente
el tubo del extremo derecho corresponde a la reacción de identificación de
taninos dando una coloración marrón lo cual indica la presencia de taninos
condensados (Figura 8).
4.5. Identificación de flavonoides por la prueba de Shinoda
La identificación de flavonoides realizada mediante la prueba de Shinoda, dio
como resultado la aparición de un color rojizo a azul tenue (Figura 9).
Figura 9. Identificación de flavonoides. Presencia de flavanonas en
Aloysia citriodora Palau
Fuente: Elaboración propia
38
4.6. Cuantificación de fenoles totales
En la Tabla 5 se observan los datos de la curva de calibración donde las
absorbancias promedio para concentraciones de ácidos gálico de 1, 2, 3, 4, 5, y
6 mg/L (ppm) son 0,125, 0,275, 0,422, 0,578, 0,718 y 0,887 respectivamente.
Tabla 5. Valores del gráfico de calibración de concentración de ácido
gálico vs absorbancia promedio
Concentración de ácido gálico
(ppm) Absorbancia 725 nm
1 0,125
2 0,275
3 0,422
4 0,578
5 0,718
6 0,887
Fuente. Elaboración Propia
Posteriormente, en la Figura 10 se calculó el coeficiente de regresión lineal R2
de 0,9996 que indica que el método es lineal al ser superior a 0,995.
1 2 3 4 5 6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Absorb
ancia
Concentración (ppm)
y = 0.1513 x - 0.0287
R2 = 0.9996
Figura 10. Gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles totales
por el método de Folin Ciocalteu a una longitud de onda de 725nm
Fuente: Elaboración propia
39
En la Tabla 6 se observa la concentración de fenoles totales por el método
Folin Ciocalteu donde se observa que el extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau presento una concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg
equivalentes a ácido gálico (GAE).
Tabla 6. Concentración de fenoles totales equivalente en ácido gálico por gramos de extracto
N Extracto (g) Absorbancia 725 nm mg GAE/g
1 0,4 0,4208 51,12
2 0,4 0,4042 49,23
3 0,4 0,4192 50,94
�̅� 50,43
S 1,041
DSR (%) 2,070
*�̅�= Promedio, s= Desviación estándar, DSR= Desviación estándar relativa,
GAE= equivalente a ácido gálico
Fuente: Elaboración propia
4.7. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922
4.7.1 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Escherichia coli ATCC 25922
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó por el método de
microdilución en caldo evaluando concentraciones finales de 0,195, 0,390,
0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 µL/mL de extracto de Aloysia citriodora
Palau.
Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con 900
µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se
adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC/mL lográndose una
concentración final de 25 mg/mL (2,5 %) de extracto.
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
40
tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 12,5 mg/mL (1,25 %) de extracto.
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 4, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6,25 mg/mL (0,63 %) de extracto.
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 5, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3,125 mg/mL (0,31 %) de extracto.
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 6, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1,562 mg/mL (0,16 %) de extracto.
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 7, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,781 mg/mL (0,08 %) de extracto.
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 8, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,39 mg/mL (0,04 %) de extracto.
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta solución
se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
concentración final 0,195 mg/mL (0,02 %) de extracto.
El tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de caldo peptonado
con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro lado, el tubo 10 se
tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL de solución madre
(500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 24 horas a 37 °C.
41
Figura 11. Ensayo de determinación de concentración mínima inhibitoria
(CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922
En la Tabla 7 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de
incubación, encontrándose que en todos los tubos se encontró crecimiento de
Escherichia coli ATCC 25922 interpretándose que el extracto no presenta
actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922 hasta una
concentración máxima de 25 mg /mL por el método de micro dilución en caldo.
42
Tabla 7. Determinación de concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922
DESCRIPCIÓN
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)
CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04 0,02 0 50
Escherichia coli ATCC 25922 ENSAYO 1 + + + + + + + + + -
Escherichia coli ATCC 25922 ENSAYO 2 + + + + + + + + + -
Escherichia coli ATCC 25922 ENSAYO 3 + + + + + + + + + -
*(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia
43
4.7.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau
frente a Escherichia coli ATCC 25922
La concentración mínima bactericida (CMB) realizada por el método de siembra
en placas con agar Müeller Hinton de los tubos del 1 al 5 con el fin evaluar el
crecimiento bacteriano.
Figura 12. Siembra en placa (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a
Escherichia coli ATCC 2592
En la Tabla 7 y Figura 12 se evidencia que en todas las placas existe
crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922.
Tabla 8. Resultados de la determinación de la Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922
DESCRIPCIÓN
PLACAS
T1 T2 T3 T4 T5
CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16
Escherichia coli ENSAYO 1 + + + + +
Escherichia coli ENSAYO 2 + + + + +
Escherichia coli ENSAYO 3 + + + + +
*(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo
44
4.7.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de
hojas de Aloysia citriodora Palau en Escherichia coli ATCC 25922
comparada con ciprofloxacino
Se determinó la sensibilidad antimicrobiana de concentraciones de 0,31, 0,63,
1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de extracto por el método de dilución
en discos en placas con agar Müeller Hinton (Figura 13).
Figura 13. Sensibilidad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau frente a
Escherichia coli ATCC 25922
Los halos de inhibición correspondiente a los ensayos por el método de dilución
en discos fueron desarrollados por triplicado a las concentraciones ya
indicadas, además se evaluó un disco con etanol y otro con ciprofloxacino. Los
resultados se observan en la Tabla 9 donde se presentan los ensayos por
triplicado con halos de inhibición en mm de cada concentración.
45
Tabla 9. Sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.
Concentración Halos de inhibición (mm)
(%) E1 E2 E3 Promedio
100 14,3 9,2 9,2 10,9
80 7,2 7,3 7,5 7,3
60 7,0 7,7 7,2 7,3
40 7,0 6,5 6,0 6,5
20 6,9 6,3 6,3 6,5
10 6,9 6,2 6,4 6,5
5 6,6 6,7 6,8 6,7
2,50 6,5 6,5 6,3 6,4
1,25 6,2 6,1 6,0 6,1
0,63 6,1 6,5 6,4 6,3
0,31 6,1 6,0 6,1 6,1
Etanol 96° 0,0 0,0 0,0 0,0
Ciprofloxacino 0,3% 44,1 44,2 44,5 44,3
Fuente. Elaboración propia
El disco impregnado con etanol no presentó halo de inhibición por lo que no
presenta actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922. Sin
embargo, a partir de una concentración de 80 % se puede observar halos de
inhibición desde de 7,33 a 10,90 mm de diámetro. Ciprofloxacino mostró halos
46
de inhibición de aproximadamente 44,3 mm en promedio. Por otro lado, para
poder comparar la sensibilidad bacteriana de las diversas concentraciones del
extracto de Aloysia citriodora Palau, etanol y ciprofloxacino frente a Escherichia
coli ATCC 25922 se procedió a realizar un análisis de varianza, obteniendo
como resultado que el valor crítico para F es menor al valor de F experimental
(Fc:2,4<Fexp:501,11), por la cual, se concluye que al menos un grupo es
diferente al 95 % de confianza (Tabla 10).
Tabla 10. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.
Origen de las
variaciones
Suma de cuadrados
GL Promedio
de los cuadrados
F Probabili
dad
Valor crítico para F
Entre
grupos 4162,74
12 364,89
477,3
8
2,74x10-
27 2,14
Dentro de
los grupos 18,89
26 0,726
Total 4181,63 38
* Fc:2,14<Fexp: 477,38; p<0,05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)
Para poder evaluar que grupos son iguales en cuanto a la sensibilidad
bacteriana y que grupos son diferentes se aplicó un test de Tukey como se
observa en la Tabla 11.
Por otro lado, la sensibilidad de la concentración del 100 % difiere de todas las
concentraciones estudiadas, sin embargo, existe diferencia significativa entre
los halos de inhibición generados por las concentraciones de 0,31, 0,63, 1,25,
2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 % del extracto.
47
Tabla 11. Test de Tukey de la compasión de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau.
FACTOR N PROMEDIO GRUPO
Ciprofloxacino 0.3% 3 44,3 A
100,00% 3 10,9 B
80,00% 3 7,3 C
60,00% 3 7,3 C
40,00 % 3 6,5 C
20,00% 3 6,5 C
10,00% 3 6,5 C
5,00% 3 6,7 C
2,50% 3 6,4 C
1,25% 3 6,1 C
0,63% 3 6,3 C
0,31% 3 6,1 C
Etanol 96° 3 0,0 D
Fuente. Elaboración propia adaptado de Minitab 17
En la Figura 13 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente a
los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad bacteriana de
las diversas concentraciones de extracto seco de hojas de Aloysia citriodora
Palau, etanol y ciprofloxacino ensayados frente a Escherichia coli ATCC 25922,
dando como resultado que ninguna concentración de extracto se iguala a la
potencia antibacteriana del ciprofloxacino.
48
Figura 14. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 25922 a concentraciones del extracto
de hojas de Aloysia citriodora Palau.
Cipro
floxa
cino
Etano
l
0.31%
0.63
%
1.25%
2.50
%
5.00
%
10.0
0%
20.0
0%
40.00%
60.00%
80.00
%10
0%
50
40
30
20
10
0
Halo
de i
nh
ibic
ión
49
4.8. Evaluación de la actividad antimicrobiana del extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
4.8.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó por el método de
microdilución en caldo evaluando concentraciones finales de 0,195, 0,390,
0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 mg/mL de extracto de Aloysia citriodora
Palau.
Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con 900
µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2, se
adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
concentración final de 25 mg/mL (2,5 %) de extracto.
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 12,5 mg/mL (1,25 %) de extracto.
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 4, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6,25 mg/mL (0,63 %) de extracto.
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 5, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3,125 mg/mL (0,31 %) de extracto.
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 6, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1,562 mg/mL (0,16 %) de extracto.
50
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 7, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,781 mg/mL (0,08 %) de extracto.
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 8, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,39 mg/mL (0,04 %) de extracto.
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta solución
se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
concentración final 0,195 mg/mL (0,02 %) de extracto.
Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de
caldo peptonado con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro
lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL
de solución madre (500 mg/mL) de extracto con 500 L de suero fisiológico. Se
dejó incubar por 24 horas a 37 °C.
Figura 15. Ensayo de determinación de concentración mínima inhibitoria
(CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC
25923
51
En la Tabla 12 se observan los resultados obtenidos luego de las 24 horas de
incubación, encontrándose que no existe turbidez en los tubos 1, 2 y 3, en
cambio en el tubo 4 si existe crecimiento debido a la presencia de turbidez
correspondiendo como punto de corte y como Concentración Mínima Inhibitoria
a la concentración de 6,25 mg/mL (0,63 %) de extracto que corresponde al
tubo 3.
52
Tabla 12. Resultados de la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
DESCRIPCIÓN
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)
CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04 0,02 0 50
Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + + + + + + -
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + + + + + + -
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + + + + + + -
*(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo
Fuente. Elaboración propia
53
4.8.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
Para la determinación de Concentración Mínima Bactericida (CMB) se
sembraron en placas de agar Manitol Salado los tubos del 1 al 5 con el fin
evaluar el crecimiento bacteriano como se observa en la Figura 15.
Figura 16. Siembra en placa para determinar la (CMB) de Aloysia
citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
En la Tabla 13 y Figura 16 se evidencia que en las placas 1,2 y 3
correspondientes a los tubos 1,2 y 3 de la prueba de CMI no existe crecimiento
a diferencia de las placas 4 y 5 que si presentaron crecimiento de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 por lo que la Concentración Mínima
Bactericida es de 6.25 µL/mL equivalente al 0.63 % de extracto de hojas de
Aloysia citriodora Palau.
Tabla 13. Concentración Minima Bactericida (CMB) de Aloysia citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
DESCRIPCIÓN PLACAS
T1 T2 T3 T4 T5
CONCENTRACION FINAL (μL/ml) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16
Staphylococcus aureus ATCC 2592 3ENSAYO 1 - - - + +
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 2 - - - + +
Staphylococcus aureus ATCC 25923 ENSAYO 3 - - - + +
*(+) crecimiento bacteriano positivo; (-) crecimiento bacteriano negativo
Fuente: Elaboración propia
54
4.8.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de
hojas Aloysia citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923
comparada con ceftriaxona y ampicilina
Para la determinación de la sensibilidad antimicrobiana se utilizó el método de
dilución en discos en placas con agar Manitol Salado. Las concentraciones
evaluadas fueron de (100,00, 80,00, 60,00, 40,00, 20,00, 10,00, 5,00, 2,50,
1,25, 0,63 y 0,31) % de extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau en discos.
Figura 17. Sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau sobre Staphylococcus aureus ATCC 25923 frente a
Ceftriaxona
En la Tabla 14 se observan los halos de inhibición correspondiente a los
ensayos por el método de dilución en discos los cuales fueron desarrollados
por triplicado a las concentraciones ya indicadas, además se evaluó un disco
con etanol, ceftriaxona y ampicilina.
55
Tabla 14. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau.
Concentración Halos de inhibición (mm)
(%) E1 E2 E3 Promedio
100% 15,1 18,1 16,1 16,43
80% 14,1 13,5 14,95 14,18
60% 13,15 10,25 11,14 11,51
40% 12,85 10,2 10,2 11,08
20% 11,8 10,1 11,1 11,00
10% 11,2 10,3 9,45 10,32
5% 10,2 10,1 8,9 9,73
2.50% 10,1 10,2 10,9 10,40
1.25% 9,3 9,3 9,2 9,27
0.63% 8,5 8,2 8,8 8,50
0.31% 7,2 7,1 7,5 7,27
Etanol 96° 0 0 0 0,00
Ampicilina 1g 19,45 18 20 19,15
Ceftriaxona 1g 21,55 19 20 20,18
Fuente: Elaboración propia
No se encontraron halos de inhibición en los discos impregnados con etanol,
por otro lado, se obtuvieron halos de inhibición entre 7,27 a 16,43 mm en el
rango de concentraciones de 0,31 al 100 % y realizando el análisis estadístico
mediante un análisis de varianza, se obtuvo que, el valor crítico para F es
menor al valor de F experimental (Fc:2,09<Fexp:88,88) y la probabilidad es
56
menor a 0,05 razón por la cual se concluye que al menos un grupo es diferente
al 95 % de confianza.
Tabla 15. Análisis de varianza de la prueba de sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau
Origen de las variaciones
Suma de cuadrado
s GL
Promedio de los
cuadrados F
Probabilidad
Valor crítico para F
Entre grupos 1006,49 13 77,42 88,88 4,46 x10-19 2,09
Dentro de los
grupos 24,95 28 0,89
Total 1031,44 41
* Fc:2.09<Fexp:165.47; p<0.05: (al menos un grupo difiere al 95 % de confianza)
Para poder evaluar que grupos son iguales en cuanto a la sensibilidad
bacteriana y que grupos son diferentes se aplicó un test de Tukey.
En la Tabla 16 se evidencia que al 95 % de confianza:
− No hay diferencia significativa entre los halos de inhibición de ceftriaxona y
ampicilina
− No hay diferencia significativa entre los halos de inhibición obtenidos con
Ampicilina y la concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora
Palau
− No hay diferencia significativa en cuanto a los halos de inhibición obtenidos
con 80 a 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau.
57
Tabla 16. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau
FACTOR N PROMEDIO GRUPO
Ceftriaxona 1g 3 20,183 A
Ampicilina 3 19,150 A B
100,00% 3 16,433 B C
80,00% 3 14,183 C D
60,00% 3 11,513 D E
40,00% 3 11,083 E F
20,00% 3 11,000 E F
10,00% 3 10,400 E F G
5,00% 3 10,317 E F G
2,50% 3 9,733 E F G
1,25% 3 9,2667 E F G
0,63% 3 8,500 F G
0,31% 3 7,267 G
Etanol 96° 3 0,000 H
Fuente: Elaboración propia adaptado de MINITAB 16
En la Figura 18 se observa el gráfico de cajas y bigotes donde se observa que
el extracto al 100 % presenta valores semejantes a la ampicilina. Finalmente, el
Staphylococcus aureus ATCC 25923 es sensible a la concentración de 100 % y
resistente a las demás concentraciones de extractos estudiadas.
58
Figura 18. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Staphylococcus aureus ATCC 25923 a concentraciones de
Aloysia citriodora Palau
Ceftr
iaxo
na
Ampici
l ina
Etan
ol
0.31%
0.63
%
1.25%
2.50
%
5.00
%
10.0
0%
20.0
0%
40.0
0%
60.0
0%
80.0
0%
100.0
0%
20
15
10
5
0
Hal
o d
e in
hib
ició
n (
mm
)
59
4.9. Evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia citriodora Palau
frente a Candida albicans ATCC 10231.
4.9.1 Concentración mínima inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau
frente a Cepas de Candida albicans ATCC 10231
La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó por el método de
microdilución en caldo evaluando concentraciones finales de 0,195, 0,390,
0,781, 1,562, 3,125, 6,25, 12,5 y 25 µL/mL de extracto de Aloysia citriodora
Palau.
Tubo 1: se llevaron 100 µL de solución madre (Extracto de 500 mg/mL) con 900
µL de caldo peptonado, retirando 500 µL de esta solución al tubo 2 se
adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
concentración final de 25 mg/mL (2,5 %) de extracto.
Tubo 2: A los 500 µL retirados del tubo 1 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 3, luego se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 12,5 mg/mL (1,25 %) de extracto.
Tubo 3: A los 500 µL retirados del tubo 2 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 4, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 6,25 mg/mL (0,63 %) de extracto.
Tubo 4: A los 500 µL retirados del tubo 3 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 5, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final de 3,125 mg/mL (0,31 %) de extracto.
Tubo 5: A los 500 µL retirados del tubo 4 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 6, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 1,562 mg/mL (0,16 %) de extracto.
60
Tubo 6: A los 500 µL retirados del tubo 5 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 7, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,781 mg/mL (0,08 %) de extracto.
Tubo 7: A los 500 µL retirados del tubo 6 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Retirando 500 µL de esta solución al
tubo 8, se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL
lográndose una concentración final 0,39 mg/mL (0,04 %) de extracto.
Tubo 8: A los 500 µL retirados del tubo 7 antes de adicionar el inóculo, se le
adicionaron 500 µL de caldo peptonado. Desechando 500 µL de esta solución
se adicionaron 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL lográndose una
concentración final 0,195 mg/mL (0,02 %) de extracto.
Por otro lado, un tubo 9 fue el control positivo al cual se le agregó 500 µL de
caldo peptonado con 500 µL de inoculo bacteriano de 106 UFC /mL. Por otro
lado, el tubo 10 se tomó como control negativo en el cual se agregaron 500 µL
de solución madre (500 mg/mL) de extracto. Se dejó incubar por 48 horas a 37
°C.
Figura 19. Ensayo de determinación de concentración mínima inhibitoria
(CM) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231
En la Tabla 17 se observan los resultados obtenido luego de las 48 horas de
incubación, hallando presencia de turbidez en todos los tubos.
61
Tabla 17. Resultados de la determinación de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231
Descripción
TUBOS
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 (+) T10 (-)
CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6,25 3,125 1,562 0,781 0,39 0,195 0 500
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04 0,02 0 50
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 + + + + + + + + + -
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 2 + + + + + + + + + -
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 3 + + + + + + + + + -
*(+) crecimiento microbiano positivo; (-) crecimiento microbiano negativo
62
4.9.2 Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora
Palau frente a Candida albicans ATCC 10231
La Concentración Mínima Antimicótica (CMA) fue realizada por el método de
siembra en placa a partir de los tubos del ensayo de CMI, por lo cual, se
sembraron en agar Sabouraud los tubos del 1 al 5 con el fin de evaluar el
crecimiento fúngico.
Figura 20. Siembra en placa (CMA) de Aloysia citriodora Palau frente a
Candida albicans ATCC 10231
En la Tabla 18 se presentan los resultados los cuales mostraron crecimiento de
Candida albicans en todas las placas, mostrando que el extracto no presenta
actividad antimicótica por el método de microdilución en caldo y su posterior
estudio en placa.
Tabla 18. Concentración Mínima Antimicótica (CMA) de Aloysia citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231
DESCRIPCIÓN PLACAS
T1 T2 T3 T4 T5
CONCENTRACION FINAL (mg/mL) 25,0 12,5 6.25 3,125 1,562
CONCENTRACIÓN PORCENTUAL (%) 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 1 + + + + +
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 2 + + + + +
Candida albicans ATCC 10231 ENSAYO 3 + + + + +
*(+) crecimiento microbiano positivo; (-) crecimiento microbiano negativo
63
4.9.3 Determinación de la sensibilidad antimicrobiana del extracto de
hojas de Aloysia citriodora Palau sobre Candida albicans ATCC 10231
comparada con clotrimazol 1 %.
Se determinó la sensibilidad microbiana de Candida albicans ATCC 10231 a
concentraciones de 0,31, 0,63, 1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 % de
extracto por el método de dilución en discos en placas con agar Sabouraud
(Figura 21).
Figura 21. Sensibilidad antimicrobiana al extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231 comparada con
clotrimazol 1 %.
En la Tabla 19 se observan los halos de inhibición correspondiente a los
ensayos por el método de dilución en discos los cuales fueron desarrollados
por triplicado a las concentraciones ya indicadas, además se evaluó un disco
con etanol y otro con clotrimazol al 1%.
64
Tabla 19. Resultados de la determinación de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 a concentraciones de Aloysia citriodora Palau
Concentración Halos de inhibición (mm)
(%) E1 E2 E3 Promedio
100% 10,5 10,5 10,5 10,50
80% 6,1 6,1 6,0 6,07
60% 6,0 6,2 6,0 6,07
40% 6,0 6,0 6,0 6,00
20% 6,0 6,0 6,0 6,00
10% 6,0 6,0 6,0 6,00
5% 6,0 6,0 6,0 6,00
2.50% 6,0 6,0 6,0 6,00
1.25% 6,0 6,0 6,0 6,00
0.63% 6,0 6,0 6,0 6,00
0.31% 6,0 6,0 6,0 6,00
Etanol 96° 0,0 0,0 0,0 0,00
Clotrimazol 1% 29,0 27,0 27,0 27,67
Fuente. Elaboración propia
65
En la Tabla 19 se observa que en cuanto a los halos de inhibición obtenidos de
las concentraciones de 0,31% hasta el 80% presentan valores promedio de
6,07 mm, por lo que los extractos a esas concentraciones no tienen efecto
antimicótico, sin embargo, el extracto al 100% presenta un tamaño de halo de
10,5 mm de diámetro demostrando así que, si existe efecto antimicótico, a
dicha concentración, finalmente el clotrimazol 1% (control positivo) también
presenta efecto antimicótico. Por otro lado, se procedió a realizar un análisis de
varianza, obteniendo como resultado que el valor crítico para F es menor al
valor de F experimental (Fc: 2,14<Fexp: 1189,27) y la probabilidad es menor a
0,05 razón por la cual se concluye que al menos un grupo es diferente al 95 %
de confianza (Tabla 20).
Tabla 20. Análisis de varianza de la prueba de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados GL
Promedio
de los
cuadrados
F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 1482,01 12 123,50 1189,27 2,02x10-32 2,14
Dentro de los grupos
2,7 26 0,104
Total 1484,71 38
* Fc:2,14<Fexp: 1189,27; p<0,05: (al menos un grupo difiere al 95 % de
confianza)
Para poder evaluar que grupos son iguales o diferentes en cuanto a la
sensibilidad microbiana se aplicó un test de Tukey como se observa en la Tabla
21.
66
Tabla 21. Test de Tukey de la determinación de la sensibilidad de Candida
albicans ATCC 10231 frente al extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau
FACTOR N PROMEDIO GRUPO
Clotrimazol 1% 3 27,667 A
100.00% 3 10,50 B
80.00% 3 6,067 C
60.00% 3 6,067 C
40.00 % 3 6,000 C
20.00% 3 6,000 C
10.00% 3 6,000 C
5.00% 3 6,000 C
2.50% 3 6,000 C
1.25% 3 6,000 C
0.63% 3 6,000 C
0.31% 3 6,000 C
Etanol 96° 3 0,000 D
Fuente: Minitab 17
En la Figura 22 se observa el diagrama de cajas y bigotes correspondiente a
los datos obtenidos luego de realizar los ensayos de sensibilidad
antimicrobiana de las diversas concentraciones de extracto seco de hojas de
Aloysia citriodora Palau, etanol y clotrimazol 1% ensayados frente a Candida
67
albicans ATCC 10231, dando como resultado que ninguna concentración de
extracto se iguala a la potencia antimicótico del clotrimazol 1%.
Por otro lado, la sensibilidad de la concentración del 100 % difiere de todas las
concentraciones estudiadas, sin embargo, no existe diferencia significativa
entre los halos de inhibición generados por las concentraciones de 0,31, 0,63,
1,25, 2,50, 5, 10, 20, 40, 60, 80 % del extracto.
Finalmente, Candida albicans ATCC 10231, resulto resistente a todas las
concentraciones de extracto evaluadas.
68
Figura 22. Boxplot Data de la evaluación de la sensibilidad de Candida albicans ATCC 10231 a concentraciones del
extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau .
Clotrim
azol
Etano
l
0.31%
0.63
%
1.25%
2.50
%
5.00
%
10.0
0%
30.0
0%
50.00%
70.00%
80.00
%10
0%
30
25
20
15
10
5
0
Halo
de i
nh
ibic
ión
(m
m)
69
CAPÍTULO V
DISCUSIÓN
“La información etnofarmacológica refiere diversos usos de la Aloysia
triphylla (cedrón) en la medicina popular; la ingesta por vía oral de la
infusión o decocción de las partes aéreas de esta planta se utiliza en
Sudamérica como antiespasmódico, tranquilizante, calmante nervioso,
expectorante y estomacal; además de este uso, en Bolivia se utiliza
también para la hipertensión arterial; en Ecuador para tratar fiebre, dolor
de cabeza y como diurético. En Asia también se utiliza tradicionalmente
para tratar espasmos gastrointestinales, resfrío común y como sedativo.”
54
“Los taninos son compuestos polifenólicos, más o menos complejos, de
origen vegetal, masa molecular relativamente elevada y sabor
astringente, se trata de compuestos hidrosolubles, dando a veces
disoluciones coloidales en agua, solubles también en alcohol y en
acetona e insolubles en disolventes orgánicos apolares. Dentro de los
vegetales los taninos suelen encontrarse en las vacuolas celulares,
combinados con alcaloides, proteínas u osas.”11
“Tras el análisis fitoquímico del extracto etanólico de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón), se logró la identificación de taninos
condensados (coloración marrón), el cual, según kuklinski se conocen
también como no hidrolizables, ya que se hidrolizan con dificultad y por
el contrario, el tratamiento con calor y ácidos minerales origina polímeros
de alto peso molecular (flobáfenos). Además, Este tipo de taninos se
producen en el metabolismo normal de los vegetales por lo que se
consideran fisiológicos y se encuentran ampliamente repartidos en el
reino vegetal.”31
“La aparición de un color rojo a azul tenue tras la prueba de Shinoda
para la identificación de flavonoides, indica que el extracto etanólico de
hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) presenta este metabolito
70
secundario, además, algunas investigaciones indican que varios tipos de
flavonoides son conocidos por conferir resistencia frente al ataque de
microorganismos 55 y que la mayor inhibición en el desarrollo bacteriano
de Escherichia coli la presentaron las flavanonas, estructuras que no
poseen un doble enlace entre C-2 y C-3.” 55
“Por otro lado, el extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau presenta
una concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg equivalentes a
ácido gálico (GAE), estos metabolitos secundarios son de gran
importancia ya que durante el estudio realizado con tinturas de las hojas
de cedrón, en la década de los años 90, Balbuena planteó que los
flavonoides, producto de su estructura, podrían ser los responsables del
efecto de inhibición de crecimiento bacteriano por la inducción de la
ruptura de su DNA en un sitio determinado; por bloqueo del complejo
aminoacil transferasa, por intercalación entre bases de DNA alterando la
síntesis de ácido nucleico o por la formación de dímeros de timina.” 56
“También consideró que otros mecanismos provocados por los
flavonoides pudieran propiciar resultados semejantes, alterando la
composición de las membranas y el metabolismo celular por medio de
inhibición de la fosforilación de proteínas o por la formación de
complejos con proteínas solubles de la pared de las células bacterianas.”
56
“Sin embargo, años después, Domingo y López-Brea. Plantearon que la
actividad de las flavonas frente a los microorganismos probablemente se
debe a que forman complejos con las proteínas solubles y extracelulares
y con las células de la pared bacteriana, de forma similar a las quinonas,
lo que refuerza el efecto observado y resulta concordante con alguna de
las especulaciones realizadas en relación con el posible mecanismo de
acción.” 56 57
“En cuanto a la evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia
citriodora Palau frente a Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus
71
aureus ATCC 25923 y Candida albicans ATCC 10231, Estudios
científicos han demostrado importantes propiedades antimicrobianas de
A. triphylla. y reportan que el extracto acetónico de las partes aéreas
evidenció significativa actividad contra Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus vulgaris” 54, en
tal sentido, tras el análisis de la concentración inhibitoria mínima CIM
determinado por el método de microdilución en caldo, el extracto de
Aloysia citriodora Palau (Cedrón).
No presenta actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC
25922 hasta una concentración máxima de 25 mg/mL, en relación a la
Concentración Mínima Bactericida realizada por el método de siembra
en placa con agar Müeller Hinton se evidencia que en todas las placas
existe crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 por lo cual, se puede
mencionar que el extracto de Cedrón no tiene efecto bactericida y
finalmente, en relación a la determinación de la sensibilidad por el
método de disco difusión, se observó que a partir de una concentración
de 80 % hasta el 100% se puede observar halos de inhibición desde de
7,3 a 10,90 mm de diámetro, el Ciprofloxacino mostró halos de inhibición
de aproximadamente 44,3mm en promedio, además ninguna
concentración de extracto se iguala a la potencia antibacteriana del
ciprofloxacino (control positivo), dichos resultados guardan relación con
“el trabajo de investigación titulado efecto antibacteriano in vitro del
aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P. “cedrón” de la Región
Cajamarca, frente a las bacterias patógenas Escherichia coli ATCC
25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 en cuyos resultados se
concluye que el aceite esencial de las hojas de Aloysia triphylla P.
“cedrón” tiene efecto antibacteriano sobre las cepas de Staphylococcus
aureus, pero no contra Escherichia coli .”18
En cuanto a la evaluación de la actividad antimicrobiana de Aloysia
citriodora Palau frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, tras el
análisis de la concentración mínima inhibitoria CMI determinado por el
método de microdilución en caldo se observó que no existe turbidez en
72
los tubos 1, 2 y 3, en cambio en el tubo 4 si existe crecimiento debido a
la presencia de turbidez correspondiendo como punto de corte y como
Concentración Mínima Inhibitoria a la concentración de 6,25 mg/mL
(0,63 %), en relación a la concentración mínima bactericida CMB, esta
es de 6,25 µL/ mL equivalente al 0,63 % de extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau, en relación a la determinación de la sensibilidad por el
método de disco difusión se observa que se obtuvieron halos de
inhibición entre 7,27mm a 16,43 mm en el rango de concentraciones de
0,31 al 100 %. Además, no hubo diferencia significativa entre los halos
de inhibición obtenidos con Ampicilina (Control positivo) y la
concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau.
En cuanto a la evaluación de la actividad antimicótica de Aloysia
citriodora Palau frente a Candida albicans ATCC 10231, Tras el análisis
de la concentración mínima inhibitoria CMI determinado por el método
de microdilución en caldo, el extracto no presenta actividad antimicótica
frente a Candida albicans ATCC 10231 hasta una concentración máxima
de 25 mg /mL por el método de micro dilución en caldo, en cuanto a los
halos de inhibición obtenidos de las concentraciones de 0,31% hasta el
80% presentan valores promedio de 6 mm, por lo que los extractos a
esas concentraciones no tienen efecto antimicótico, sin embargo el
extracto al 100% presenta un tamaño de halo de 10,5 mm de diámetro
demostrando así que si existe efecto antimicótico , a dicha
concentración, finalmente el clotrimazol 1% (control positivo) también
presenta efecto antimicótico. Este efecto antimicótico a una
concentración del 100 % del extracto de Aloysia citriodora Palau puede
ser explicada y guarda relación con el trabajo de investigación realizado
por “Oliva”58 “de quien determinó la actividad antimicrobiana y el efecto
sobre la estructura celular del aceite esencial de Aloysia triphylla contra
Candida sp aislada de enfermedades humanas, en dicho trabajo Oliva
reportó que los aceites esenciales de Aloysia triphylla mostraron
actividad antifúngica contra todas las levaduras: C. albicans, C.
dubliniensis, C. glabrata, C. krusei, C. guillermondii, C. parapsilosis y C.
tropicalis que eran resistentes al fluconazol (150 mg / ml).” “El rango de
73
valores de MIC reportado fue de: 35 a 140 ug/mL y MFC: 1842 a 2300
ug/mL. El tiempo de muerte en el MFC contra C. albicans (3 x 10 (5)
UFC/mL) fue de 140.”58
“Oliva”58 “menciona que los resultados del estudio demuestran
claramente que A. triphylla es una alternativa prometedora para el
tratamiento de la candidiasis y nuestros resultados a las concentraciones
indicarían lo mismo.” 58
Finalmente todos los resultados antes mencionados del uso del extracto
etanólico de Aloysia citriodora Palau (cedrón) , se puede deber a que
“Ramirez y colaboradores en su trabajo de investigación reportaron que
los principales componentes de Aloysia citriodora Palau (Cedron) son
neral, geranial, limoneno, espatulenol, y variaciones intrínsecas en la
cantidad y calidad del resto de terpenos como α-tujeno, α-pineno,
camfeno, mirceno, p-cimeno, γ-terpineno, linalol, camferol,
dihidrolinalool, citronelol, mentona, isoborneol, α-terpineol, carvona,
etc.”59
“Además, según el componente principal en relación al origen de la
planta, se han identificado cinco quimiotipos: I, mircenona (37%) y α-
tujona (17%); II, α-tujona (23%) y cis-carveol (18%), ambos en Argentina;
III, 1,8-cineol (12%) y geranial (10%), en Marruecos; IV, limoneno (37%),
geranial (14%) y neral (11%), en Turquía; V, neral (10%) y geranial
(40%), es el más abundante en el mundo y se encuentra principalmente
en Colombia, Chile, Brasil, Eslovenia, Portugal, Francia y Grecia” 54, “por
otro lado, los resultados del estudio de RMN de 1H ,mostraron que tanto
en el extracto acuoso como en acetato de etilo de las hojas de cedrón,
se encuentran presentes los compuestos citral, neral y limoneno los
cuales podrían tener efecto antimicrobiano.” 59
74
CONCLUSIONES
PRIMERO: Se logró identificar flavonoides y taninos el extracto de hojas
de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) tras la visualización de
un color rojo a azul tenue a la prueba de Shinoda y una
coloración marrón para taninos condensados
respectivamente.
SEGUNDO: Las hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) presenta una
concentración de fenoles totales de 50,43 ± 1,041 mg
equivalentes a ácido gálico (GAE) por el método de Folin
Ciocalteu.
TERCERO: La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto de
hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre
Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de 6,25 mg/mL
equivalente a una concentración final de 0,63 % en relación
a La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del extracto
de hojas de Aloysia citriodora Palau (Cedrón) sobre
Staphylococcus aureus ATCC 25923 es de 6,25 µl/ml
equivalente a una concentración final de 0,63%
CUARTO: No se logró determinar la concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau
(Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922 debido que a
las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no
tuvo efecto inhibitorio ,del mismo modo no se logró
determinar la determinar la Concentración Mínima
Bactericida (CMB) del extracto de hojas de Aloysia citriodora
Palau (Cedrón) sobre Escherichia coli ATCC 25922 debido
que a las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto
no tuvo efecto Bactericida.
QUINTO: No se logró determinar la concentración Mínima Inhibitoria
(CMI) del extracto de hojas de Aloysia citriodora Palau
(Cedrón) sobre Candida albicans ATCC 10231 debido que a
las concentraciones a las cuales se trabajó, el extracto no
tuvo efecto inhibitorio, del mismo modo no se logró
determinar la determinar la Concentración Mínima
75
Antimicótica (CMA) del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) sobre Candida albicans ATCC
10231 debido que a las concentraciones a las cuales se
trabajó, el extracto no tuvo efecto antimicótico.
SEXTO: La sensibilidad antimicrobiana del extracto de hojas de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) sobre Staphylococcus aureus
ATCC 25923 se produjo a las concentraciones de 0,31 al
100 %, para el caso de Escherichia coli ATCC 25922 la
sensibilidad fue a las concentraciones de 100% y para
Candida albicans ATCC 10231 la sensibilidad ocurrió a una
concentración del 100% del extracto etanólico de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón).
76
SUGERENCIAS
PRIMERO: Realizar estudios de la sensibilidad antibacteriana de Aloysia
citriodora Palau (Cedrón) frente a otro tipo de bacterias y/o
hongos.
SEGUNDO: Realizar estudios de toxicidad de Aloysia citriodora Palau
(Cedrón) para promover su uso en tratamientos
antiinfecciosos.
TERCERO: Realizar estudios de la CMI y CMB a diferentes
concentraciones de las estudiadas en el presente trabajo de
investigación frente a otro tipo de bacterias u hongos.
77
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file:///C:/Users/pc/Downloads/Dialnet-
EstudioComparativoDeLaComposicionQuimicaDeLosAceit-4815186.pdf
86
ANEXOS
87
Anexo 1. Constancia de identificación taxonómica del cedrón
88
Anexo 2. Recolección de Aloysia citriodora Palau
Fuente. Elaboración propia
Anexo 3. Pesando la muestra triturada de hojas de cedrón
Fuente. Elaboración propia
89
Anexo 4. Elaboración de cartuchos
Fuente. Elaboración propia
Anexo 5. Armado del Equipo Soxlhet
Fuente. Elaboración propia
90
Anexo 6. Momento preciso de la extracción de Aloysia citriodora Palau
Fuente. Elaboración propia
Anexo 7. Obtención del extracto de Aloysia citriodora Palau
Fuente. Elaboración propia
91
Anexo 8. Preparación de medios de cultivo
Agar Manitol Salado
Se añadió 55,5 gramos de Agar Manitol Salado en 500 ml de agua destilada,
calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto, para
disolver completamente. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos dejando enfriar a
temperatura ambiente antes de su utilización.
Agar Sabouraud
Se añadió 32,5 gramos de Agar Sabouraud en 500 ml de agua destilada.
Calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto para
disolver completamente los ingredientes. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos,
dejando enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización.
Agar Müeller Hinton
Se añadió 19 gramos de Agar Müeller Hinton en 500 ml de agua destilada.
Calentando y agitando frecuentemente hasta hervir durante 1 minuto para
disolver completamente los ingredientes. Se esterilizo a 121°C por 15 minutos,
dejando enfriar a temperatura ambiente antes de su utilización.
Anexo 9. Pesando los Medios de Cultivo
Fuente. Elaboración propia
92
Anexo 10. Preparación del Agar Müeller Hinton
Fuente. Elaboración propia
Anexo 11. Preparación de placas con el Agar Müeller Hinton
Fuente. Elaboración propia
93
Anexo 12. Preparación de las placas para el sembrado de Staphyloccocus aureus en Agar Manitol salado
Fuente. Elaboración propia
Anexo 13. Colocando los Discos de difusión con el extracto de Aloysia citriodora Palau (cedrón) en placas con Agar Manitol salado
Fuente. Elaboración propia
94
Anexo 14. Resultados en los diferentes medios de cultivos (Agar Müeller Hinton, Manitol salado y Sabouraud)
Fuente. Elaboración propia
Anexo 15. Preparación de la solución madre
Fuente. Elaboración propia
95
Anexo 16. Adición del inoculo preparado
Fuente. Elaboración propia
Anexo 17. Proceso del método de la concentración mínima bactericida (CMB) en Agar manitol salado
Fuente. Elaboración propia
96
Anexo 18. Autoclavado final en donde se esterilizo todo material y desecho que se usó en todo procedimiento
Fuente. Elaboración propia