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UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
ALINE TURATTI
Ribeiratildeo Preto
2006
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E
COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Ribeiratildeo Preto
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Patologia Experimental
2006UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
ALINE TURATTI
Ribeiratildeo Preto
2006
Turatti Aline
Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos
52 p il 29 cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea Patologia Experimental
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
1 CD34 ndash 2 CD68 ndash 3 α-SMA ndash 4 COX-2 - 5 estroma pericriptal ndash 6 carcinogecircnese colocircnica ndash 7 DMH
Autorizo a reproduccedilatildeo e divulgaccedilatildeo total ou parcial deste trabalho por meio convencional ou eletrocircnico para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Dedico este Trabalho
Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem
Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim
Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E
COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Ribeiratildeo Preto
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Patologia Experimental
2006UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
ALINE TURATTI
Ribeiratildeo Preto
2006
Turatti Aline
Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos
52 p il 29 cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea Patologia Experimental
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
1 CD34 ndash 2 CD68 ndash 3 α-SMA ndash 4 COX-2 - 5 estroma pericriptal ndash 6 carcinogecircnese colocircnica ndash 7 DMH
Autorizo a reproduccedilatildeo e divulgaccedilatildeo total ou parcial deste trabalho por meio convencional ou eletrocircnico para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Dedico este Trabalho
Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem
Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim
Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
2006UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRAtildeO PRETO
Departamento de Patologia
EXPRESSAtildeO PRECOCE DE CD34 CD68 α-ACTINA DE MUacuteSCULO LISO E COX-2 NO ESTROMA PERICRIPTAL DURANTE CARCINOGEcircNESE COLOcircNICA
INDUZIDA QUIMICAMENTE EM RATOS
ALINE TURATTI
Ribeiratildeo Preto
2006
Turatti Aline
Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos
52 p il 29 cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea Patologia Experimental
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
1 CD34 ndash 2 CD68 ndash 3 α-SMA ndash 4 COX-2 - 5 estroma pericriptal ndash 6 carcinogecircnese colocircnica ndash 7 DMH
Autorizo a reproduccedilatildeo e divulgaccedilatildeo total ou parcial deste trabalho por meio convencional ou eletrocircnico para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Dedico este Trabalho
Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem
Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim
Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Turatti Aline
Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos
52 p il 29 cm
Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo PretoUSP ndash Aacuterea Patologia Experimental
Orientador Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
1 CD34 ndash 2 CD68 ndash 3 α-SMA ndash 4 COX-2 - 5 estroma pericriptal ndash 6 carcinogecircnese colocircnica ndash 7 DMH
Autorizo a reproduccedilatildeo e divulgaccedilatildeo total ou parcial deste trabalho por meio convencional ou eletrocircnico para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte
FICHA CATALOGRAacuteFICA
Dedico este Trabalho
Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem
Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim
Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Dedico este Trabalho
Aos meus pais Lecircda e Turattipor serem meus maiores e melhores exemplos de amor uniatildeo e coragem
Minha irmatilde Wendy Tia-Lu e Voacute Idapor tudo que significam pra mim
Voiaacute Vocirc Careca e Juju que tantas saudades nos deixaram
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
ldquoDe tudo ficam trecircs coisas
A certeza de que estamos sempre
comeccedilando
A certeza de que precisamos continuar
A certeza de que seremos interrompidos
antes de terminar
Portanto devemos
Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo
Da queda um passo de danccedila
Do medo uma escada
Do sonho uma ponte
Da procura um encontrordquo
[Fernando Pessoa]
AGRADECIMENTO ESPECIAL
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
ldquoA felicidade natildeo estaacute na partida nem na
chegada mas na travessiardquo
[Guimaratildees Rosa]
Ao meu orientador e amigo
Prof Dr Seacutergio Britto Garcia
Por sua incomparaacutevel capacidade de extrair das pessoas o que de melhor
elas podem oferecer Obrigada pela oportunidade de aprendizado constante e pela
enorme participaccedilatildeo em minha formaccedilatildeo cientiacutefica eacutetica e profissional
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
A CAPES pela bolsa concedida
Agrave Rosangela Orlandin Lopes pela amizade carinho e por todo auxiacutelio teacutecnico
Agrave Rosangela M Castania de Paiva pela amizade fraterna
Agrave Neide Terezinha Gonccedilalves Luciara T Santana e Edna Pio pela atenccedilatildeo e gentileza
A todos os funcionaacuterios do Departamento de Patologia em especial Adriana Luisa Gonccedilalves de Almeida Antonio de Paacutedua Martins Daniel Barcelini Deise Luacutecia Chesca Simotildees e Maria Aparecida Apolinaacuterio Caetano pela boa vontade e amizade constante
Agrave Tacircnia M Beltramini Trevilato por me direcionar para o caminho cientiacutefico
Agrave Maria Capelini Turatti por estar presente em todos os momentos e por me guiar profissionalmente desde a Graduaccedilatildeo (este eacute o fruto do nosso trabalho)
Ao Prof Dr Miguel Angel Sala Di Matteo pelo auxiacutelio na etapa estatiacutestica
Aos amigos Marcelo Viniacutecius Oliveira Vespuacutecio e Patriacutecia Modiano pela amizade e colaboraccedilatildeo incondicional
Agrave querida Juliana Rodrigues da Costa pelo carinho e companheirismo desde as primeiras etapas desta caminhada
Ao quarteto Mariana Marggiori Camila S Rosa Daniella L Nunes e Daniel Kelly por poder compartilhar meus sonhos fracassos e sucessos mais profundos sem reserva
Aos meus anjos-da-guarda Priscilla e Marcelo Rezende
Aos amigos em especial agrave Maacutercia Cristina M Guimaratildees Renata Toscano Simotildees Waynice N Garcia Cleverson Rodrigues Karina Magalhatildees Alves da Mata Marcela Kazue Hassumi Luane Taiacutesa da Costa Barros e Lisandra Vanessa Martins
A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram incentivaram e colaboraram para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho pois cada pessoa eacute uacutenica
e nenhuma substitui outra
Cada um que passa em nossa vida
passa sozinho mas natildeo vai soacute
nem nos deixa soacutes
Leva um pouco de noacutes mesmos
deixa um pouco de si mesmo
Haacute os que levam muito
mas haacute os que natildeo levam nada
Essa eacute a maior responsabilidade de nossa vida
e a prova de que duas almas
natildeo se encontram ao acaso
[Antoine de Saint-Exupeacutery]SUMAacuteRIO
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Lista de Abreviaturas i
Lista de Figuras e Tabelas ii
Resumo iii
Abstract iv
1INTRODUCcedilAtildeO 1
11 Cacircncer Colorretal 1
12 Carcinogecircnese
2
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
4
14 Focos de Criptas Aberrantes 9
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal 10
2 OBJETIVOS 13
3 MATERIAL amp MEacuteTODOS
15
31 Animais 15
32 Delineamento experimental 15
33 Preparo da DMH 16
34 Coleta e Processamento do material 17
35 Imunohistoquiacutemica 18
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica 19
37 Anaacutelise Estatiacutestica 20
4 RESULTADOS 22
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
41 Observaccedilotildees Gerais
22
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA 22
5 DISCUSSAtildeO
32
6 CONCLUSAtildeO 38
7 REFEREcircNCIAS 40
8 ANEXOS 51
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
LISTA DE ABREVIATURAS
AOM Azoximetano
APC Adenomatous polyposis coli
ASMA α-actina de muacutesculo liso
BM Membrana basal
CAFs Fibroblastos associados ao cacircncer
CF Criptas filhas
CFi Iacutendice de fissatildeo de criptas
COX Ciclooxigenase
DAB 33-diaminobenzidina tetrahidroclorido
DMH 12-dimetilhidrazina
DNA Aacutecido desoxirribonucleacuteico
DP Desvio Padratildeo
FAP Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar
FCA Focos de Criptas Aberrantes
FEA Foco de estroma ativado
HampE Hematoxilina amp Eosina
INCA Instituto Nacional do Cacircncer
kDa K Dalton
K-ras Kirsten rat sarcoma
mRNA Aacutecido ribonucleacuteico mensageiro
MIN Neoplasia intestinal muacuteltipla
MVD Densidade microvascular
NACM Mucosa colocircnica de aparecircncia normal
NMU N-metil-N-nitrosoureacuteia
PMFs Miofibroblastos pericriptais
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68 COX-2 e
ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampE
Mucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos
delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de
Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na
Figura B e o limite da mucosa normal e ASF na Figura C ()
(A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras
brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma
de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas
MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal e no FEA
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2)
densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de
Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A
ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34
no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta)
C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo
CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas
positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA e COX-2 da mucosa colocircnica (200X)
A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal
com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo
ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas
positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de
aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D -
imuno-marcaccedilatildeo COX-2 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande
nuacutemero de ceacutelulas positivas (setas)
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos
experimentais
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
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-
Turatti A Expressatildeo precoce de CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2 no estroma pericriptal durante carcinogecircnese colocircnica induzida quimicamente em ratos 2006 52 f Dissertaccedilatildeo de Mestrado Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2006
RESUMO
Diversos estudos tecircm demonstrado que a atividade coordenada das ceacutelulas
epiteliais com o estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em
situaccedilotildees fisioloacutegicas e patoloacutegicas inclusive no cacircncer Vaacuterios relatos acentuam a
importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e indicam fortemente
que interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas estromais (resultando em
regulamento e modulaccedilatildeo reciacuteproca) satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento
e progressatildeo de carcinomas Comparativamente pouca informaccedilatildeo estaacute disponiacutevel
sobre as caracteriacutesticas e o papel do estroma durante o processo carcinogecircnico e a
maioria dos dados satildeo baseados em estudos isolados Nos animais tratados com o
carcinoacutegeno Dimetilhidrazina foi identificado na mucosa colocircnica o aparececimento
de ldquoFocos de Estroma Ativadordquo (FEA) que diferem do foco inflamatoacuterio esporaacutedico
encontrado na mucosa normal dos animais controles devido agrave imuno-expressatildeo
aumentada de ceacutelulas CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso (ASMA) COX-2
positivas e densidade microvascular Aleacutem disso o FEA cercou um nuacutemero
aumentado de criptas colocircnicas em fissatildeo que frequumlentemente apresentavam
ceacutelulas epiteliais com nuacutecleos hipercromaacuteticos Este uacuteltimo achado pode sugerir
correlaccedilatildeo entre as alteraccedilotildees estromais e epiteliais dentro dos FEA Embora esses
achados sejam novos satildeo consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma
tem um papel significante na carcinogecircnese Juntamente com dados da literatura
este trabalho sugere que no coacutelon a ldquofield cancerizationrdquo epitelial pode ser
acompanhada atraveacutes de alteraccedilotildees estromais e isto pode apontar novos
marcadores de transformaccedilatildeo neoplaacutesica
Palavras-chave CD34 CD68 alfa-actina de muacutesculo liso COX-2 estroma pericriptal carcinogecircnese colocircnica 12 ndash Dimetilhidrazina (DMH)
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Turatti A Early Expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin and COX-2 in pery-crypt stroma during chemically-induced rat colonic carcinogenesis 2006 52 f Faculdade de Medicina de Ribeiratildeo Preto Universidade de Satildeo Paulo
Ribeiratildeo Preto 2006
ABSTRACT
There has been considerable that the activity of epithelial cells with their
stroma is fundamental in controlling growth and differentiation in normal and
pathological situations including cancer A number of reports stress the
importance of the stromal compartment in malignant tumors and strongly indicate
that continuous interactions between the carcinoma and stromal cells (resulting in
their reciprocal regulation and modulation) are prerequisites for carcinoma
development and progression Comparatively less information is available about
the features and role of the stroma for the carcinogenic process In animals treated
with the carcinogen Dimethyl-hydrazine we identified the appearing of mucosal
ldquoActivated Stromal Focirdquo (ASF) that differ from the sporadic inflammatory foci found
in the normal mucosa of the control animals because of the presence of increased
immune-expression of CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2
positive cells and microvessel density Furthermore the ASF surrounded a
increased number of colonic crypts in fission when compared to areas of normal
stroma This last finding suggests that stromal activation and epithelial changes
may be correlated These findings are novel but expected and consistent with
previous observations that the stroma has a significant role in carcinogenesis
Taken together with literature data our findings suggest that in the colon the
epithelial field cancerization may be accompanied by stromal changes and this
may point to the finding of new markers of neoplastic transformation
Keywords CD34 CD68 α-smooth muscle actin (ASMA) COX-2 pery-crypt stroma
colonic carcinogenesis 12-Dimethylhydrazine dihydrochloride (DMH)
1 Introduccedilatildeo
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
11 Cacircncer Colorretal
Embora conhecido haacute seacuteculos somente nas uacuteltimas deacutecadas o cacircncer se
tornou um evidente problema de sauacutede puacuteblica mundial Esta doenccedila se
desenvolve essencialmente em consequumlecircncia do acuacutemulo de mutaccedilotildees nos genes
de ceacutelulas somaacuteticas que desempenham papel criacutetico no controle da proliferaccedilatildeo
crescimento sinalizaccedilatildeo adesatildeo e morte celulares juntamente com uma seacuterie de
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas (FEARON amp VOGELSTEIN 1990 VENITT 1994
EVAN amp LITTLEWOOD 1998)
O intestino grosso eacute um dos locais de maior frequumlecircncia de neoplasias
primaacuterias no corpo humano podendo estas lesotildees ter um caraacuteter benigno
(adenomas) ou maligno (adenocarcinomas) Praticamente 98 de todos os
cacircnceres do intestino grosso satildeo adenocarcinomas sendo que estes representam
ainda 70 de todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal (MORSON et
al1974) O cacircncer de coacutelon esporaacutedico corresponde agrave 85 do total de neoplasias
malignas colorretais e a forma hereditaacuteria compreende 15 do total de casos
deste tipo de lesatildeo O cacircncer colorretal hereditaacuterio apresenta duas subdivisotildees a
Siacutendrome da Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) totalizada por menos de 1
de todos os casos e o cacircncer colorretal hereditaacuterio sem polipose (HNPCC) que
corresponde a cerca de 10 do total de casos (COTTI et al 2000)
A incidecircncia e a mortalidade por cacircncer de coacutelon tecircm apresentado tendecircncia
ao crescimento no mundo todo em especial em paiacuteses desenvolvidos e aacutereas
urbanas de paiacuteses menos desenvolvidos O carcinoma colorretal eacute o terceiro tipo de
cacircncer mais comum em termos de casos novos (PARKIN 2004) e a maior causa
de morte por cacircncer nos paiacuteses ocidentais (SAIKALI et al 2004)
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
No Brasil com o aumento da expectativa de vida da populaccedilatildeo as
neoplasias vecircm ganhando cada vez mais importacircncia As regiotildees sul e sudeste
demonstram maiores taxas de morbimortalidade por cacircncer de coacutelon (Datasus
2005) O Instituto Nacional do Cacircncer (INCA) estima que o cacircncer de colorretal
para o ano de 2006 no Brasil seraacute o 5ordm tumor maligno mais frequumlente entre homens
(com 11390 casos novos) e 4ordm entre as mulheres (13970 casos novos) A maior
incidecircncia de casos ocorre na faixa etaacuteria entre 50 e 70 anos mas as
possibilidades de desenvolvimento jaacute aumentam a partir dos 40 anos (INCA -
Ministeacuterio da Sauacutede 2006)
A incidecircncia de cacircncer colorretal apresenta acentuada variaccedilatildeo em todo o
mundo mas manteacutem iacutentima correlaccedilatildeo com os padrotildees socioeconocircmicos em vaacuterios
paiacuteses Os mais importantes determinantes padrotildees de ocorrecircncia de cacircncer em
diferentes populaccedilotildees satildeo os fatores ambientais e o estilo de vida Os fatores de
risco relacionados agrave dieta e outros como obesidade e atividade fiacutesica parecem
atuar por muacuteltiplas e diferentes vias que podem se sobrepor (POTTER 1996)
Outros fatores de risco satildeo presenccedila de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (retocolite
ulcerativa e doenccedila de Crohn) cirurgias preacutevias (gaacutestricas colicistectomia
ureterossigmoidostomia) e tambeacutem a geneacutetica individual (WILLIAMS 1993)
12 Carcinogecircnese
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de
neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um
processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas
de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de
alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
Na deacutecada de 1940 pesquisadores que estudavam a carcinogecircnese em
camundongos demonstraram a existecircncia de dois estaacutegios distintos a iniciaccedilatildeo e a
promoccedilatildeo (ROUS amp KIDD 1941 MOTTRAM 1944 BERENBLUM amp SHUBIK
1947) Estes experimentos claacutessicos permitiram a compreensatildeo das caracteriacutesticas
das fases de iniciaccedilatildeo e promoccedilatildeo o que resultou em um modelo sequumlencial do
desenvolvimento neoplaacutesico dividido em trecircs estaacutegios iniciaccedilatildeo promoccedilatildeo e
progressatildeo (MOOLGAVKAR 1986 DRAGAN et al 1993) O primeiro estaacutegio da
carcinogecircnese conhecido como etapa da iniciaccedilatildeo caracteriza-se por alteraccedilatildeo
permanente e irreversiacutevel do DNA celular resultante de alteraccedilotildees geneacuteticas
inerentes ou mais comumente de alteraccedilotildees epigeneacuteticas induzidas por
carcinoacutegenos A ceacutelula iniciada pode transforma-se em maligna se receber ou natildeo
estiacutemulos promotores de malignidade (HEMMINK 1993) A etapa subsequumlente agrave
iniciaccedilatildeo eacute representada pela promoccedilatildeo que por sua vez apresenta longa duraccedilatildeo
O estaacutegio de promoccedilatildeo tumoral eacute caracterizado pela expansatildeo clonal de ceacutelulas
iniciadas pela accedilatildeo de um agente promotor devido a alteraccedilotildees na expressatildeo de
genes geralmente relacionados agrave proliferaccedilatildeo apoptose e inflamaccedilatildeo celular
Diferentemente da iniciaccedilatildeo a promoccedilatildeo eacute reversiacutevel desde que tirado o agente
promotor (KLAUNIG et al 2000) Aleacutem disso as ceacutelulas preacute-neoplaacutesicas podem
progredir para neoplasia benigna ou maligna (BANNASCH 1986) No uacuteltimo
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
estaacutegio durante a progressatildeo do tumor aleacutem da irreversibilidade as ceacutelulas preacute-
neoplaacutesicas se tornam invasivas e mais expansivas devido agrave progressiva
instabilidade genocircmica (PITOT amp DRAGAN 1991)
13 Alteraccedilotildees Estromais na Carcinogecircnese
Eacute bem aceito que a atividade coordenada das ceacutelulas epiteliais com o
estroma eacute fundamental no crescimento e diferenciaccedilatildeo em situaccedilotildees fisioloacutegicas e
patoloacutegicas inclusive o cacircncer (DONJACOUR amp CUNHA 1991) Em contraste com
a ideacuteia convencional de que o desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo
autocircnomo da ceacutelula e que os maiores participantes satildeo as proacuteprias ceacutelulas
neoplaacutesicas novas evidecircncias atribuem importante papel aos componentes
estromais como os fibroblastos onde a neoplasia eacute vista como uma mistura
heterogecircnea de diferentes tipos celulares Estes diferentes tipos de ceacutelulas sendo
ceacutelulas neoplaacutesicas fibroblastos ceacutelulas endoteliais e outras interagem
reciprocamente e atuam com quase a mesma importacircncia na manifestaccedilatildeo de
determinados aspectos do fenoacutetipo maligno (KIARIS et al 2004) Todos estes
relatos acentuam a importacircncia do compartimento estromal nos tumores malignos e
indicam fortemente que as interaccedilotildees contiacutenuas entre o carcinoma e as ceacutelulas
estromais satildeo condiccedilotildees preacutevias para desenvolvimento e progressatildeo do carcinoma
embora anaacutelise experimental destes mecanismos seja muito difiacutecil (MUumlELLER amp
FUSENIG 2002)
Os patologistas foram os primeiros a perceberem que os fibroblastos
estromais sofriam mudanccedilas quantitativas e morfoloacutegicas durante a progressatildeo do
cacircncer Relativo agraves mudanccedilas quantitativas eles notaram que tumores humanos
como o de mama coacutelon estocircmago e pacircncreas exibiram aumento no conteuacutedo de
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
fibroblastos que em certos casos chegavam a 90 da massa tumoral (SCHURCH
et al 1981 HOWLETT amp BISSELL 1993) Isso indica que os fibroblastos
adjacentes agraves ceacutelulas neoplaacutesicas satildeo alvos de certos sinais que resultam em
respostas proliferativas A proliferaccedilatildeo aumentada dos fibroblastos constitui
somente o aspecto mais comum da resposta estromal chamada resposta
desmoplaacutesica a qual eacute caracterizada por alteraccedilotildees na matriz extracelular como o
aumento da produccedilatildeo de colaacutegenos especiacuteficos fibronectina glicosaminoglicanas e
proteoglicanas (MAHFOUZ et al 1987 HOWLETT amp BISSELL 1993)
Estes fibroblastos modificados denominados miofibroblastos ou fibroblastos
associados ao cacircncer (CAFs) desempenham uma funccedilatildeo central no complexo
processo de interaccedilatildeo tumor-estroma e consequumlentemente na tumorigecircnese Os
miofibroblastos representam o tipo predominante de fibroblastos no tumor
(SAPPINO et al 1988 RONNOV-JESSEN et al 1996) Esta denominaccedilatildeo reflete
o estado intermediaacuterio entre as ceacutelulas musculares lisas e fibroblastos (GABBIANI
et al 1997 DEWEVER amp MAREEL 2002) Satildeo ceacutelulas que participam da
cicatrizaccedilatildeo atraveacutes da migraccedilatildeo proliferaccedilatildeo e produccedilatildeo de fatores criacuteticos na
regulaccedilatildeo dos processos patoloacutegicos Deve ser mencionado que os miofibroblastos
natildeo satildeo ceacutelulas patoloacutegicas por si soacute mas que estatildeo presentes em vaacuterios tecidos
sob condiccedilotildees anormais (POWELL et al 1999)
Eles podem ser identificados atraveacutes de imunohistoquiacutemica pela expressatildeo
de marcadores mesenquimais como α-actina de muacutesculo liso ASMA (42 KD) e
vimentina (52-58 KD) (RONNOV-JESSEN et al 1996 DEWEVER amp MAREEL
1999) A ativaccedilatildeo do programa de diferenciaccedilatildeo parcial do muacutesculo liso
exemplificada pela expressatildeo das proteiacutenas acima mencionadas resultando na
geraccedilatildeo do miofibroblasto tambeacutem tem sido notada nos miofibroblastos que regem
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
a resposta de reparo na inflamaccedilatildeo (SAPPINO et al 1990) A presenccedila ou
ausecircncia de outros filamentos celulares como desmina (50-54 KD) calponina
caldesmona e miosina de muacutesculo liso (460 kD) tambeacutem foi usada para melhor
caracterizar estas mas dependendo de sua localizaccedilatildeo e condiccedilatildeo patoloacutegica o
padratildeo de expressatildeo pode marcar diferentemente (GRUPP et al 1997 POWELL
et al 1999 SERINI amp GABBIANI 1999)
A proliferaccedilatildeo dos fibroblastos estromais parece natildeo somente uma
caracteriacutestica chave em diversas condiccedilotildees inflamatoacuterias mas tambeacutem no cacircncer
(POWELL et al 1999) A suposiccedilatildeo que a inflamaccedilatildeo crocircnica estaria envolvida na
tumorigecircnese foi postulada por Virchow quando observou que mediadores quiacutemicos
decorrentes da inflamaccedilatildeo estimulavam a proliferaccedilatildeo celular (BALKWILL amp
MANTOVANI 2001) Esta hipoacutetese foi mais tarde suportada por similaridades
surpreendentes da reaccedilatildeo tecidual das ceacutelulas inflamatoacuterias vasos sanguiacuteneos
tecido conjuntivo e fibroblastos ativados na cicatrizaccedilatildeo e no cacircncer (COUSSENS amp
WERB 2002) A grande diferenccedila notada eacute que o tecido de reparaccedilatildeo em
contraste com o tumoral tem crescimento autolimitado sustentando o conceito do
tumor como ldquoferidas que natildeo cicatrizamrdquo (DVORAK 1986)
Diversos estudos tecircm quantificado os miofibroblastos no estroma de
diferentes tipos de cacircncer No cacircncer de mama invasivo estes fibroblastos foram
encontrados em proporccedilotildees muito maiores que em carcinomas ldquoin siturdquo
(SCHUumlRCH 1999) Na neoplasia intraepitelial prostaacutetica o estroma tumoral eacute
caracterizado por muitos fibroblastos e uma reduccedilatildeo radical das ceacutelulas musculares
lisas tipo celular proeminente no estroma de proacutestata normal (TUXHORN et al
2002) No coacutelon os miofibroblastos aparecem dispostos em forma de malha
circundando as criptas sendo denominados miofibroblastos pericriptais (PMFs) e
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
parecem estar envolvidos juntamente com as ceacutelulas epiteliais na produccedilatildeo da
membrana basal (BM) do epiteacutelio colocircnico (HIGAKI et al 1999) Nos poacutelipos
neoplaacutesicos colocircnicos os fibroblastos intersticiais satildeo substituiacutedos por um grande
nuacutemero de PMFs (ADEGBOYEGA et al 2004)
Outro ponto importante eacute o crescimento de novos capilares por ser uma
etapa essencial no desenvolvimento tecidual A angiogecircnese associada aos
tumores soacutelidos eacute um processo em que novos capilares satildeo formados no estroma
tumoral a partir de ceacutelulas endoteliais do hospedeiro (LIOTTA et al 19741976
DICKINSON et al 1994 FOLKMAN 1995) Haacute muitas deacutecadas foi percebido que
os tecidos tumorais apresentam uma vascularizaccedilatildeo bastante proeminente em
relaccedilatildeo aos tecidos normais Existem suficientes evidecircncias hoje de que a presenccedila
desta vascularizaccedilatildeo exacerbada eacute uma condiccedilatildeo essencial para que ocorra o
desenvolvimento neoplaacutesico Isto se deve ao desenvolvimento de microvasos a
partir de ceacutelulas endoteliais pertencentes a capilares situados proacuteximos agraves ceacutelulas
neoplaacutesicas O conteuacutedo de sangue na microvasculatura do coacutelon mostrou-se
aumentado nas fases mais precoces da carcinogecircnese colocircnica tanto em roedores
quanto em humanos de acordo com estudo de Wali et al (2005)
Ao contraacuterio da ciclooxigenase-1 (COX-1) a qual eacute uma enzima usualmente
expressa em tecidos normais e envolvida em diversas funccedilotildees celulares a
ciclooxigenase-2 (COX-2) eacute uma proteiacutena expressa como resposta agrave presenccedila de
mediadores locais liberados em consequumlecircncia de vaacuterios estiacutemulos que fazem parte
de uma resposta inflamatoacuteria Diversos estudos demonstram que sua expressatildeo
nos tecidos colorretais eacute normalmente baixa e que sua superexpressatildeo pode alterar
o potencial tumorigecircnico das ceacutelulas intestinais (DuBOIS et al 1996) Aleacutem disso a
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
COX-2 tambeacutem estaacute associada a fatores angiogecircnicos e formaccedilatildeo de novos vasos
no processo de carcinogecircnese (WU et al RAO et al 2004)
Hull et al (1999) notaram um aumento da expressatildeo de COX-2 na mucosa
intestinal normal de ratos ApcMin+ e Kishimoto et al (2002) tambeacutem
demonstraram aumento da expressatildeo de COX-2 jaacute em 4 semanas apoacutes a primeira
exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno azoxymetano em ratos normais Foi relatado o aumento
da expressatildeo de COX-2 nos miofibroblastos subepiteliais intestinais em adenoma
esporaacutedico do coacutelon (ADEGBOYEGA et al 2004)
Apesar destes relatos natildeo haacute nenhum estudo com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da
morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases mais precoces da
carcinogecircnese do coacutelon para um maior conhecimento Aleacutem disso eacute muito provaacutevel
que as ceacutelulas do estroma pericriptal possam desempenhar algum papel no
processo de fissatildeo de criptas o qual inicia-se assimetricamente em relaccedilatildeo ao eixo
da cripta (WRIGHT 2000) por uma bifurcaccedilatildeo na regiatildeo basal seguida por uma
divisatildeo longitudinal ateacute que existam duas criptas filhas A fissatildeo de criptas eacute
estabelecida como um importante mecanismo de crescimento regeneraccedilatildeo (PARK
et al 1997) e reparo intestinal (CHENG et al 1986) Haacute evidecircncia crescente que a
fissatildeo de cripta tambeacutem eacute um evento chave no crescimento de lesotildees neoplaacutesicas
Um aumento relevante na fissatildeo de criptas foi observado no intestino normal de
humanos com FAP e em ratos com neoplasia intestinal muacuteltipla (MIN) (WASSAN e
et al 1988)
Segundo Preston et al (2003) a proporccedilatildeo de criptas em fissatildeo no caso de
adenomas eacute significativamente maior quando comparada agrave fissatildeo envolvida no
processo de desenvolvimento normal da mucosa
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Garcia et al (1999) demonstraram que a fissatildeo de criptas poderia explicar o
espalhamento de clones mutantes no epiteacutelio colocircnico em um processo chamado
ldquofield cancerizationrdquo Recentemente Greaves et al (2006) demonstraram em
relevantes experimentos que a fissatildeo de criptas eacute o mecanismo pelo qual mutaccedilotildees
se esparramam no coacutelon humano normal
14 Focos de Criptas Aberrantes
Os focos de criptas aberrantes (FCA) inicialmente descritos por Bird (1987)
satildeo encontrados no coacutelon de ratos tratados com 12-Dimetilhidrazina (DMH) de
forma dose-dependente e tecircm sido postulados como precursores do processo
carcinogecircnico sendo considerados lesotildees preacute-neoplaacutesicas que se desenvolveratildeo
em cacircncer colorretal ao longo do tempo (BIRD 1995 SHIVAPURKAR et al 1997)
Os estudos experimentais utilizando os FCA vecircm sendo largamente
empregados para detectar possiacuteveis fatores que possam influenciar a
carcinogecircnese colorretal nos seus estaacutegios iniciais Essas alteraccedilotildees relacionadas
ao processo de transformaccedilatildeo neoplaacutesica podem ser caracterizadas quantificadas
e utilizadas como biomarcadores indicadores da provaacutevel progressatildeo para cacircncer
(McLELLAN et al 1991 THORUP et al 1994) As primeiras descriccedilotildees dos FCA
mencionaram a presenccedila de hiperplasia estromal ao redor das criptas colocircnicas
alteradas (BIRD 1987)
Os FCA satildeo facilmente visiacuteveis em exames microscoacutepicos do coacutelon corado
com azul de metileno Estas lesotildees preacute-neoplaacutesicas se caracterizam
morfologicamente por apresentarem criptas com aberturas terminais alteradas
espessamento epitelial com ceacutelulas proeminentes e tamanho maior que as criptas
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
adjacentes (BIRD 1987) Este tipo de lesatildeo eacute tambeacutem encontrada na mucosa
colocircnica humana com maior frequumlecircncia em pacientes portadores de Polipose
Familial de Coacutelon (PRETLOW et al 1991)
Natildeo se conhecem os mecanismos da transformaccedilatildeo de FCA em neoplasias
mas sabe-se da existecircncia de relaccedilatildeo entre alteraccedilotildees de oncogenes e de
mecanismos geneacuteticos com a formaccedilatildeo de FCA Assim por exemplo mutaccedilotildees no
gene K-ras e na proteiacutena p53 envolvidos no desenvolvimento de cacircncer de coacutelon
estatildeo associadas com o aumento do nuacutemero de FCA por campo e desenvolvimento
de tumores colocircnicos (SHIVAPURKAR et al 1997)
Apoacutes a constataccedilatildeo dos FCA muitos estudos foram realizados para estimar
o seu nuacutemero tamanho e distribuiccedilatildeo no coacutelon de roedores submetidos agrave accedilatildeo de
carcinoacutegenos (BIRD 1987 PRETLOW et al HARDMAN et al 1991 PARK et al
1997) Graccedilas a estes estudos hoje eacute possiacutevel avaliar o papel de diversos
nutrientes drogas e outros fatores individuais e ambientais na predisposiccedilatildeo ou
proteccedilatildeo ao desenvolvimento do cacircncer de coacutelon intestinal
15 Modelos Experimentais de Carcinogecircnese Colorretal
O cacircncer de coacutelon e reto pode ser induzido em modelos experimentais
utilizando-se carcinoacutegenos quiacutemicos de accedilatildeo direta (por exemplo a N-metil-N-
nitrosoureacuteia ou NMU) ou indireta como a DMH que possui alto grau de
especificidade para o coacutelon de variadas espeacutecies de roedores (OLIVEIRA et al
2001) sendo dependente da dose espeacutecie sexo e idade para exercer o seu efeito
(McLELLAN amp BIRD 1988ordf)
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Estes modelos tecircm sido de grande importacircncia em estudos sobre diversos
aspectos da morfologia e patogecircnese da doenccedila contribuindo para o
aperfeiccediloamento do seu diagnoacutestico prevenccedilatildeo e tratamento
A DMH tem sido o carcinoacutegeno colocircnico mais utilizado em estudos
experimentais em razatildeo de sua (1) alta especificidade na induccedilatildeo de aberraccedilotildees
nucleares e de criptas aberrantes natildeo afetando outros oacutergatildeos (McLELLAN amp BIRD
1988b) (2) estabilidade quiacutemica e (3) alta taxa de obtenccedilatildeo de tumores em um
pequeno periacuteodo de latecircncia Isto pode ser conseguido com uma uacutenica injeccedilatildeo de
DMH ou com uma seacuterie semanal de injeccedilotildees desde que a dose total da droga
injetada seja equivalente O periacuteodo de latecircncia depende do tipo de lesatildeo que se
quer obter e da via de administraccedilatildeo A administraccedilatildeo da DMH em ratos produz
metaboacutelitos ativos os quais promovem a metilaccedilatildeo do DNA das ceacutelulas epiteliais
colocircnicas substituiccedilatildeo do grupo metil pelo grupo etil gerando tumores apoacutes um
periacuteodo de latecircncia (GREENE et al 1987 PORIES et al 1993)
2 Objetivos
Os objetivos deste trabalho satildeo caracterizaccedilatildeo e anaacutelise de expressatildeo de
marcadores imunohistoquiacutemicos (CD34 CD68 α-actina de muacutesculo liso e COX-2)
do tecido conjuntivo que circunda as criptas da mucosa do coacutelon de ratos Wistar
quando submetidos agrave accedilatildeo de carcinoacutegeno quiacutemico pois natildeo haacute nenhum estudo
com uma avaliaccedilatildeo criacutetica da morfologia do estroma pericriptal colocircnico nas fases
mais precoces da carcinogecircnese do coacutelon
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
3 Material amp Meacutetodos
31 Animais
Foram utilizados 48 ratos da linhagem Wistar machos pesando em meacutedia
250g no iniacutecio do experimento provenientes do Bioteacuterio Central da Faculdade de
Medicina de Ribeiratildeo Preto da Universidade de Satildeo Paulo e mantidos no Bioteacuterio
do Departamento de Patologia em gaiolas plaacutesticas em sala com controle de
temperatura (entre 24 - 28ordmC) e ciclo de luz de 12 horas com dieta padratildeo Purinareg
e aacutegua ad libitum Os animais foram mantidos segundo as normas da Comissatildeo de
Eacutetica em Experimentaccedilatildeo Animal da FMRP-USP
32 Delineamento Experimental
Como pode ser observado na Figura 1 apoacutes um periacuteodo inicial de
adaptaccedilatildeo os animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito
animais cada Cinco grupos receberam uma uacutenica injeccedilatildeo intra peritonial de 125
mgKg de peso corporal de 12-Dimetilhidrazina (DMH) como descrito
anteriormente (McLELLAN et al 1991) Estes animais foram entatildeo subdivididos em
cinco grupos de acordo com o tempo de sacrifiacutecio (1 2 6 12 e 24 semanas apoacutes
receberem a injeccedilatildeo de carcinoacutegeno) e denominados G1 G2 G6 G12 e G24
respectivamente O ultimo grupo foi o grupo controle (GC) Este grupo recebeu
uma injeccedilatildeo de salina e foi eutanaziado apoacutes 12 semanas Os animais foram
mortos pela aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
33 Preparo da DMH
Foi utilizada Symetrical Dimethyldydrazine Dihydrochloride (Sigma-Aldrich
Inc USA) dissolvida em aacutegua destilada A soluccedilatildeo de DMH foi preparada no dia
de sua administraccedilatildeo e seu pH foi ajustado para 70 pela adiccedilatildeo de hidroacutexido de
soacutedio Por seguranccedila a droga foi manipulada em pequenas quantidades utilizando-
se aventais maacutescaras e luvas Apoacutes a manipulaccedilatildeo a vidraria foi imersa em
soluccedilatildeo aquosa de permanganato de potaacutessio e o restante do carcinoacutegeno natildeo
aplicado foi encaminhado para incineraccedilatildeo As excretas foram eliminadas como lixo
hospitalar atraveacutes da limpeza das gaiolas
Figura 1 Esquema do delineamento experimental
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
34 Coleta e Processamento do Material
Os ratos foram sacrificados por aspiraccedilatildeo de dioacutexido de carbono e
submetidos imediatamente ao procedimento de laparotomia mediana com
cuidadoso isolamento e retirada do coacutelon distal Os coacutelons foram abertos
longitudinalmente lavados cuidadosamente em salina e medidos com reacutegua
graduada em miliacutemetros Em seguida foram estendidos entre placas de papelatildeo
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submersos em
formalina tamponada a 10 por um periacuteodo de 24 horas
Os tecidos foram retirados da formalina recortados e processados As peccedilas
foram desidratadas por submersatildeo em banho de aacutelcool em concentraccedilotildees
crescentes Posteriormente para a diafanizaccedilatildeo das peccedilas as mesmas foram
submersas em banho de xilol por duas horas e 30 minutos
Em seguida as amostras foram incluiacutedas em parafina fluida Parte do coacutelon
foi incluiacuteda horizontalmente com a mucosa voltada para baixo e parte verticalmente
para obtenccedilatildeo de cortes longitudinais e transversais respectivamente Os blocos
foram cortados em microacutetomo para obtenccedilatildeo de cortes com 5 microm de espessura e
montados em lacircmina
A coloraccedilatildeo foi realizada com Hematoxilina de Harris por 3 minutos e a
contra-coloraccedilatildeo com soluccedilatildeo de Eosina Floxina alcooacutelica por 10 segundos Para
posterior desidrataccedilatildeo a lacircmina foi submersa em concentraccedilotildees crescentes de
aacutelcool e em seguida diafanizadas em xilol que eacute o meio misciacutevel do entelan (Merck
amp Co Inc USA) utilizado para montagem das lacircminas
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
35 Imunohistoquiacutemica
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemicas foram realizadas nos cortes histoloacutegicos
de coacutelon atraveacutes de reaccedilatildeo antiacutegeno-anticorpo seguida de revelaccedilatildeo da reaccedilatildeo
com marcador visiacutevel ao microscoacutepio As lacircminas desparafinadas e hidratadas
foram recuperadas antigenicamente atraveacutes de incubaccedilatildeo em panela a vapor em
meio tamponado por 40 minutos Apoacutes resfriamento do material as peroxidases
teciduais endoacutegenas foram removidas pela adiccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e
ligaccedilotildees inespeciacuteficas do anticorpo primaacuterio foram evitadas por adiccedilatildeo de soro de
cavalo As lacircminas foram entatildeo incubadas com anticorpo primaacuterio (Tabela 1) por
12 horas em cacircmara uacutemida Em seguida houve a incubaccedilatildeo com anticorpo
secundaacuterio e por uacuteltimo a etapa com avidina-biotina A reaccedilatildeo foi identificada apoacutes
a revelaccedilatildeo por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc USA) por cinco minutos e
contra coloraccedilatildeo com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lacircminas
As reaccedilotildees de imunohistoquiacutemica foram avaliadas com microscopia de luz e a
imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloraccedilatildeo no
citoplasma das ceacutelulas O iacutendice de marcaccedilatildeo foi determinado pela relaccedilatildeo entre o
nuacutemero total de ceacutelulas e o nuacutemero de ceacutelulas fortemente coradas ao longo de cada
cripta Foram contadas 10 criptas por corte sendo um corte para cada animal
Tabela 1 Caracteriacutesticas dos Anticorpos Primaacuterios
Anticorpo Marca Clone Localizaccedilatildeo celular Diluiccedilatildeo
α-ASMA Novocastra RBC21B6 citoplasma 1100
CD34 Novocastra QBEnd10 citoplasma e membrana celular 150
CD68 Novocastra KP1 citoplasma 1200
COX-2 Novocastra 4H12 citoplasma 1100
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
36 Anaacutelise Morfomeacutetrica
Em cada corte histoloacutegico foi realizada a contagem celular de todos
marcadores e a medida da aacuterea ocupada por estas ceacutelulas com a utilizaccedilatildeo de um
microscoacutepio Zeiss equipado com uma ocular graduada em microcircmetros (05 times 05)
Para tanto foram observados em meacutedia dez campos microscoacutepicos aleatoacuterios e
utilizados ateacute dois blocos de diferentes segmentos distais do coacutelon para cada
animal
Primeiramente foram analisados com baixa luminosidade em pequeno
aumento os cortes histoloacutegicos corados por HampE a fim de identificar aacutereas com
intensa neovascularizaccedilatildeo (hot-spots)
Nos cortes histoloacutegicos imuno-marcados com CD34 foram contados quatro
ldquohot-spots de vasos na mucosa colocircnica de aparecircncia normal (NACM) e nos focos
de estroma ativado (FEA) e calculadas as meacutedias A densidade dos microvasos foi
quantificada nos ldquohot-spots com a ocular graduada sob aumento de 200 vezes Os
vasos foram identificados baseados na presenccedila de caracteriacutesticas endoteliais
Quatro aacutereas aleatoacuterias adjacentes agrave margem e dentro dos FEA tambeacutem foram
avaliadas sob aumento de 200 vezes para se calcular a meacutedia da densidade dos
microvasos Cada coacutelon teve entatildeo duas contagens de densidade de microvasos
intra-FEA e no tecido adjacente O mesmo procedimento foi usado para quantificar
ceacutelulas ASMA CD68 e COX-2 positivas
O nuacutemero de criptas filhas (CF) pares de criptas simeacutetricas tambeacutem foi
contado Como proposto por Greaves et al (2006) as CF foram interpretadas como
criptas que sofreram recentemente o processo de fissatildeo O iacutendice de fissatildeo de
criptas (CFi) foi subsequentemente estimado pelo nuacutemero de criptas em fissatildeo
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
somado ao nuacutemero de CF em relaccedilatildeo ao nuacutemero total de criptas contado por
campo microscoacutepico A anaacutelise foi executada por dois observadores independentes
Nenhum vieacutes significante foi encontrado
37 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise estatiacutestica dos resultados foi realizada utilizando-se a anaacutelise de
variacircncia (ANOVA) e o teste de Mann Whitney Uma probabilidade menor que 5
(plt005) foi considerada estatisticamente significante Os resultados foram
expressos em meacutedia plusmn DP O software utilizado foi o GraphPad Prism USA v40
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
4 Resultados
41 Observaccedilotildees Gerais
Os animais natildeo mostraram sinal cliacutenico de deficiecircncia nutricional durante o
periacuteodo experimental Os pesos dos animais ao teacutermino do experimento estatildeo
resumidos na Tabela 2 Nenhum tumor foi observado na mucosa colocircnica dos
ratos No G24 somente trecircs animais sobreviveram ao periacuteodo experimental e por
isso este grupo natildeo foi incluiacutedo na anaacutelise estatiacutestica tenham sido mostrados com
base descritiva
Tabela 2 Meacutedias plusmn DP dos pesos (g) dos animais de todos grupos experimentais ao fim do
experimento
GC G1 G2 G6 G12 G2451250 plusmn
3664
29938 plusmn
728
29875 plusmn
954
39875 plusmn
4189
49500 plusmn
5879
44333 plusmn
4041
42 Caracteriacutesticas Histoloacutegicas e Anaacutelise Sequumlencial dos FEA
Os Focos de Estroma Ativado (FEA) foram detectados nos ratos tratados
com carcinoacutegeno a partir do primeiro ponto (semana 1) Tanto a meacutedia do tamanho
dos FEA quanto a meacutedia do nuacutemero de ceacutelulas marcadas por aacuterea aumentaram
com o tempo sendo significante em 6 e 12 semanas (plt00001) apoacutes o tratamento
com carcinoacutegeno (Figuras 2 e 6)
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
O aumento da densidade celular foi observado assim como o espessamento
do espaccedilo extracelular (Figura 3B) Estas caracteriacutesticas natildeo foram encontradas
somente no foco inflamatoacuterio onde normalmente satildeo presentes mas tambeacutem na
mucosa colocircnica normal Frequumlentemente mas natildeo sempre o epiteacutelio cercado por
FEA mostrou citoplasma basofiacutelico e nuacutecleos hipercromaacuteticos (Figura 3C) e
tambeacutem um nuacutemero aumentado de criptas filhas (Figura 3D)
Figura 2 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por ceacutelulas CD34 CD68
COX-2 e ASMA positivas no ldquofoco de estroma ativadordquo
CD34 G6 lt G12 (plt005)
CD68 G1 = G2 = G6 lt G12 (plt005)
COX-2 G2 = G6 lt G12 (plt005)
G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
O CFi foi maior no FEA do que no tecido normal e aumentou com tempo
sendo significante em 12 semanas (Plt00001) (Figura 4) assim como a densidade
microvascular (MVD) sendo significante em 6 e 12 semanas (Plt00001) ambos
apoacutes o tratamento com DMH (Figura 5)
Figura 2
Figura 3 Mucosa colocircnica corada por HampEMucosa colocircnica com aparecircncia normal (A) com vasos sanguiacuteneos delicados (seta) e pequeno nuacutemero de ceacutelulas estromais Foco de Estroma Ativado (B C D) Grandes vasos sanguiacuteneos (seta) na Figura B e o limite da mucosa normal e FEA na Figura C () (A e B = 400X C e D = 200X)
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Figura 4 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas na mucosa de aparecircncia normal (barras brancas) e no ldquofoco de estroma ativadordquo (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Figura 5 Aacuterea de mucosa colocircnica ocupada por vasos sanguiacuteneos no estroma de aparecircncia normal (barras brancas) e no FEA (barras pretas)N C = G1 = G2 = G6 = G12 (plt005)FEA G6 lt G12 (plt005) G24 natildeo incluso na anaacutelise estatiacutestica
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Os resultados da contagem de ceacutelulas imuno-marcadas CFi e MVD do
estroma de aparecircncia normal e dos FEA foram resumidos na Figuras 6 e 7 e
representados nas Figuras 8 e 9 No coacutelon normal um pequeno nuacutemero de
miofibroblastos e ceacutelulas estromais CD68 positivas foram encontradas em
pequenos focos de inflamaccedilatildeo da mucosa (Figura 8A) Nos animais tratados com
carcinoacutegeno o nuacutemero dessas ceacutelulas aumentou com tempo (Figura 8B) assim
como as ceacutelulas CD34 positivas que exibiram um platocirc na 6ordf semana apoacutes o
tratamento com DMH
Nos animais controles as ceacutelulas ASMA positivas mostraram-se organizadas
como uma malha cercando as criptas colocircnicas (Figura 9A) Nos FEA dos animais
do G12 foi observado um aumento no nuacutemero de ceacutelulas ASMA positivas embora
com aparente desorganizaccedilatildeo enquanto no grupo G24 a maioria destas ceacutelulas foi
encontrada em focos bastante desorganizados (Figura 9B)
Na mucosa colocircnica normal a expressatildeo de COX-2 foi descoberta em
macroacutefagos e ceacutelulas endoteliais da lacircmina proacutepria em todos os animais (Figura
9C) A expressatildeo de COX-2 tambeacutem aumentou notadamente nas ceacutelulas
endoteliais macroacutefagos e miofibroblastos nos grupos G6 G12 e G24 (Figura 9D)
Aleacutem disso algumas ceacutelulas epiteliais passaram a expressar COX-2 (Figura 9D)
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Figura 6 Nuacutemero de ceacutelulas ASMA (A) CD34 (B) CD68 (C) e COX-2 (D) positivas MVD (E) e CF1 (F) no estroma de aparecircncia normal (N) e no FEAASMA (A) G6 lt G12 (plt005)CD34 (B) G6 lt G12 (plt005)CD68 (C) G1 lt G2 lt G6 lt G12 (plt005)COX-2 (D) G2 lt G6 lt G12 (plt005)MVD (E) G6 lt G12 (plt005)CFi (F) G6 lt G12 (plt005)No estroma de aparecircncia normal natildeo houve diferenccedila estatiacutestica significante para todos marcadores G24 natildeo incluso em nenhuma anaacutelise estatiacutestica
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Figura 7 Evoluccedilatildeo das imuno-marcaccedilotildees (ASMA CD34 CD68 e COX-2) densidade microvascular (MVD) e Fissatildeo de Criptas nos Focos de Estroma Ativado
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Figura 8 Imunohistoquiacutemica para CD34 e CD68 da mucosa colocircnica (200X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo CD34 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com delicados vasos sanguiacuteneos (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo CD34 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grandes vasos sanguiacuteneos (seta) C - imuno-marcaccedilatildeo CD68 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo CD68 no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com maior nuacutemero de ceacutelulas positivas
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Figura 9 Imunohistoquiacutemica para ASMA (200X) e COX-2 da mucosa colocircnica (400X) A ndash imuno-marcaccedilatildeo ASMA na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) B - imuno-marcaccedilatildeo ASMA no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo com grande nuacutemero de ceacuteulas positivas (seta) C ndash imuno-marcaccedilatildeo COX-2 na mucosa colocircnica de aparecircncia normal com pequeno nuacutemero de ceacutelulas positivas (seta) D - imuno-marcaccedilatildeo de um grande nuacutemero de ceacutelulas COX-2 positivas no ldquoFoco de Estroma Ativadordquo e nas criptas (setas)
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
5 Discussatildeo
No presente estudo foram identificados Focos de Estroma Ativado (FEA)
ao redor das criptas nos animais tratados com carcinoacutegeno Estes FEA diferem dos
focos inflamatoacuterios esporaacutedicos encontrados na mucosa normal dos animais
controles devido ao aumento da MVD CFi e imuno-expressatildeo de ceacutelulas CD34
CD68 ASMA e COX-2 positivas
Houve um aumento no tamanho dos FEA com tempo Em geral o FEA teve
um aumento progressivo e gradual na MVD e o nuacutemero de ceacutelulas positivas para
expressatildeo de COX-2 CD34 CD68 e ASMA Um aumento gradual na MVD tambeacutem
foi observado durante a transiccedilatildeo de displasia de baixo grau para displasia de alto
grau e para o cacircncer de coacutelon por AOTAKE et al (1999)
Entre os numerosos anticorpos primaacuterios endoteacutelio-especiacuteficos disponiacuteveis
destaca-se o anti-CD 34 O CD34 eacute uma glicoproteiacutena transmembrana de 110 kDa
(VAN de RIJN et al 1994) O nuacutemero de ceacutelulas CD34 positivas no FEA alcanccedilou
um platocirc no grupo G6 De maneira interessante Nakayama et al (2000) notaram
positividade para CD34 aumentada em adenomas e virtualmente ausente em
adenocarcinomas de coacutelon Os autores propuseram que eacute possiacutevel que ceacutelulas
estromais CD34 positivas se transformem em miofibroblastos no estroma de
adenocarcinomas Sendo assim eacute plausiacutevel que eventual transformaccedilatildeo pudesse
explicar a estabilizaccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas estromais CD34 positivas neste
trabalho
Os FEA frequumlentemente circundaram com forma e tamanho heterogecircneo as
criptas colocircnicas apresentando aumento no CFi e frequumlente hipercromasia nuclear
nas ceacutelulas epiteliais Estes achados sugerem que as ceacutelulas epiteliais podem ter
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
perdido o controle homeostaacutetico e a coincidente presenccedila de alteraccedilotildees estromais
pode sugerir algum papel na carcinogecircnese Estes achados satildeo novos embora
consistentes com observaccedilotildees preacutevias que o estroma tem um papel significante na
carcinogecircnese
Cada vez mais novas evidecircncias indicam que diversos fenocircmenos
bioloacutegicos dependem da accedilatildeo combinada de ceacutelulas epiteliais e estromais Isto eacute
particularmente evidente durante o desenvolvimento de processos patoloacutegicos
(DESMOULIERE et al 2004) A importacircncia das ceacutelulas estromais e os fatores que
elas expressam durante iniciaccedilatildeo e progressatildeo do cacircncer foi destacada em recente
literatura Eacute bem conhecido o papel de suporte na carcinogecircnese dos componentes
celulares estromais dos tecidos epiteliais
Sabe-se que as mutaccedilotildees iniciais de um tumor se originam nas ceacutelulas
epiteliais embora alguns modelos experimentais apontem que as mutaccedilotildees nos
fibroblastos estromais tambeacutem possam iniciar tumores epiteliais por alteraccedilotildees de
fatores de crescimento paraacutecrino que atuam nos epiteacutelios (BHOWMICK amp MOSES
2005) Interessantemente Okada et al (2000) demonstraram que o estroma
associado agrave inflamaccedilatildeo promoveu a conversatildeo de ceacutelulas de adenoma colocircnicos
para ceacutelulas de adenocarcinoma Aleacutem disso a alteraccedilatildeo no microambiente
estromal foi mostrada suficientemente capaz de promover a transformaccedilatildeo maligna
de ceacutelulas epiteliais prostaacuteticas humanas (CUNHA et al 2002)
O presente estudo demonstrou expressatildeo aumentada de ceacutelulas ASMA e
CD68 positivas nos FEA nos animais tratados com carcinoacutegeno comparados aos
animais controles No FEA as ceacutelulas CD68 positivas mostraram-se aumentadas
precocemente (1 semana) enquanto as ceacutelulas ASMA positivas foram as de
aparecimento mais tardio (12 semanas) Miofibroblastos ASMA positivos jaacute foram
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
observados aumentados em lesotildees preacute-neoplasicas do coacutelon (HIGAKI et al 1999)
e sabe-se que macroacutefagos CD68 positivos estatildeo aumentados no cacircncer de coacutelon
Miofibroblastos e macroacutefagos podem expressar grandes quantidades de COX-2 no
cacircncer de coacutelon e isto pode estimular a angiogecircnese (SHEEHAN et al 2005)
Um mecanismo importante pelo qual o estroma influencia a carcinogecircnese eacute
a expressatildeo da enzima COX-2 Esta proteiacutena eacute frequumlentemente indetectaacutevel em
tecidos normais mas eacute induzida por citocinas inflamatoacuterias fatores de crescimento
espeacutecies reativas de oxigecircnio e promotores tumorais Eacute bem conhecido que a
superexpressatildeo de COX-2 estaacute associada agrave tumorigecircnese no epiteacutelio
gastrointestinal ativando a angiogecircnese e agindo diretamente nas ceacutelulas epiteliais
Nosso estudo verificou um aumento gradual da expressatildeo de ceacutelulas COX-2
positivas no FEA a partir da segunda semana apoacutes exposiccedilatildeo ao carcinoacutegeno De
maneira interessante experimentos envolvendo deleccedilatildeo geneacutetica ou inibiccedilatildeo
farmacoloacutegica da COX-2 demonstraram que esta enzima representa um papel
importante na tumorigecircnese intestinal (OSHIMA et al 1996 JACOBY et al 2000)
BOOLBOL et al (1996) notaram que a proteiacutena COX-2 e os niacuteveis de
Prostaglandina E2 estavam elevados na mucosa normal de animais heterozigotos
em comparaccedilatildeo com a mucosa de ratos sem alteraccedilatildeo gecircnica para a FAP Em
outra pesquisa com camundongos knockout heterozigotos para APC e
heterozigotos ou homozigotos para COX-2 foi demonstrada expressatildeo diminuiacuteda
para COX-2 Os animais desenvolveram menos poacutelipos intestinais e colocircnicos
comparados aos animais controles sendo que os homozigotos para o knockout de
COX-2 apresentaram um decreacutescimo de 86 em comparaccedilatildeo aos controles
Adicionalmente todos os poacutelipos eram significativamente menores como um
resultado da reduccedilatildeo da COX-2 Por sua vez quando os animais heterozigotos
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
7 Referecircncias
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
para APC mas apresentando COX-2 normal foram tratados com um inibidor
especiacutefico da atividade enzimaacutetica de COX-2 apresentaram 50 a 60 de reduccedilatildeo
no nuacutemero de poacutelipos (OSHIMA et al 1996) Esses estudos concluiram que a COX-
2 apresenta um impacto direto no desenvolvimento de poacutelipos colocircnicos e
cacircnceres
Estaacute estabelecido que a expressatildeo do gene COX-2 eacute ldquoup-regulatedrdquo nos
cacircnceres colorrectais humanos e os niacuteveis de COX-2 tambeacutem satildeo elevados nos
tumores colocircnicos induzidos por carcinoacutegeno quiacutemico em roedores (DuBOIS et al
1996) Haacute forte evidecircncia que a COX-2 eacute ldquodown-regulatedrdquo pelo APC e eacute ldquoup-
regulatedrdquo pelo acuacutemulo nuclear de β-catenina o que adicionalmente implica a via
de transduccedilatildeo de sinal Wnt na carcinogecircnese do coacutelon e do fiacutegado (ARAKI et al
2003) Conforme relato de KISHIMOTO et al (2003) o carcinoacutegeno AOM causa
um aumento na COX-2 e uma diminuiccedilatildeo na expressatildeo de mRNA do APC em
mucosa colocircnica de aparecircncia normal em ratos
A partir das consideraccedilotildees encontradas na literatura e dos resultados deste
trabalho as seguintes hipoacuteteses satildeo propostas para explicar a relaccedilatildeo epiteacutelio-
estroma na carcinogecircnese colocircnica
(1) mutaccedilotildees simultacircneas no epiteacutelio e nas ceacutelulas estromais poderiam
acontecer e isto facilitaria a transformaccedilatildeo neoplaacutesica do epiteacutelio
(2) mutaccedilotildees nas ceacutelulas epiteliais poderiam induzir o aparecimento dos
FEA por sinalizaccedilatildeo molecular o que pode ter alterado o estroma facilitando a
transformaccedilatildeo neoplaacutesica epitelial
(3) mutaccedilotildees nas ceacutelulas estromais ou em seus precursores poderiam
influenciar o epiteacutelio e assim prejudicar seus mecanismos de regulaccedilatildeo o que
iniciaria a carcinogecircnese epitelial
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
Finalizando pode-se considerar que estas trecircs hipoacuteteses satildeo plausiacuteveis e
que necessitam de investigaccedilotildees adicionais atraveacutes de outros experimentos para
confirmaccedilatildeo e ampliaccedilatildeo dos resultados aqui apresentados Tendo em vista a
complexidade da carcinogecircnese colocircnica o estudo dos mecanismos envolvidos na
formaccedilatildeo e crescimento dos FEA pode elucidar a natureza do interaccedilatildeo entre
epiteacutelio e estroma
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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a study of tar tumors in rabbits J Exp Med v73 p369-390 1941
SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
1 Conclusatildeo
Nas condiccedilotildees em que esta investigaccedilatildeo foi realizada pode-se concluir que
1 Nos animais tratados com carcinoacutegeno quiacutemico foram identificados grupos
de ceacutelulas estromais ao redor das criptas do coacutelon que apresentavam aumento da
MVD FCi e imuno-expressatildeo de CD34 CD68 ASMA eou COX-2
2 Estes grupos de ceacutelulas foram denominados Focos de Estroma Ativado
(FEA)
3 Estudos mais detalhados sobre a formaccedilatildeo e evoluccedilatildeo dos FEA podem
ser uacuteteis para compreensatildeo do papel do estroma na carcinogecircnese do coacutelon
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2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
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8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
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8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
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the Min mouse model of adenomatous polyposis Cancer Res v60 p5040-5044
2000
KIARIS H CHATZISTAMOU I KAOFOUTIS CH KOUTSELINI H PIPERI
CH KALOFOUTIS A Tumour-stroma interactions in carcinogenesis basic aspects
and perspectives Mol Cell Biochem v261 n1-2 p117-122 2004
KISHIMOTO Y YASHIMA K MORISAWA T SHIOTA G KAWASAKI H
HASEGAWA J Effects of cyclooxygenase-2 inhibitor NS-398 on APC and c-myc
expression in rat colon carcinogenesis induced by azoxymethane J
Gastroenterol v37 n3 p186-193 2002
KLAUNIG JE KAMENDULIS LM XU YEpigenetic mechanisms os chemical
carcinogenesis Human amp Experimental Toxicology v19 p 543-555 2000
LIOTTA LA KLEINERMAN J SAIDEL GM Quantitative relationship of
intravascular tumor cells tumor vessels and pulmonary metastasis following tumor
implantation Cancer Research v34 p997-1004 1974
LIOTTA LA KLEINERMAN J SAIDEL GM The significance of hematogenous
tumor cell clumps in the metastatic process Cancer Research v36 p889-894
1976
MAHFOUZ SM CHEVALLIER M GRIMAUD JA Distribution of the major
connective matrix components of the stromal reaction in breast carcinoma An
immunohistochemical study Cell Mol Biol v33 p453ndash467 1987
McLELLAN EA MEDLINE A BIRD R Dose response and proliferative
characteristics of aberrant crypt foci putative preneoplastic lesions in rat colon
Carcinogenesis v12 p2093ndash2098 1991
McLELLAN EA amp BIRD RP Specificity study to evaluated induction aberrant
crypts in murine colons Cancer Research v48 p 6183-6186 1988a
McLELLAN EA amp BIRD RP Aberrant cryots potential pre-neoplastic lesions in
murine colon Cancer Research v48 p 6187-6192 1988b
MOOLGAVKAR SH Carcinogenesis modeling from molecular biology to
epidermiology Annu Rev Public Health v7 p151-169 1986
MORSON BC Evolution of cacircncer of the colon and rectum Cancer v34 9845-
849 1974
MOTTRAM JC A developing factor in experimental glastogenesis J athol Bacteriol v56 p181-187 1994
MUELLER MM amp FUSENIG NE (2002) Tumor-stroma interactions directing
phenotype and progression of epithelial skin tumor cells Differentiation v70 n9-
10 p486-497 2002
OKADA F KAWAGUCHI T HABELHAH H KOBAYASHI T TAZAWA H
TAKEICHI N KITAGAWA T HOSOKAWA M Conversion of human colonic
adenoma cells to adenocarcinoma cells through inflammation in nude mice Lab Invest v80 n11 p1617-1628 2000
OLIVEIRA EC LEITE MSB MIRANDA JAR ANDRADE ALSM GARCIA
SB LUQUETTI AO and MOREIRA H Cronic Trypanossoma cruzi infection
associated with low incidence of 12-dimetylhidrazine-induced colon cancer in rats
Carcinogenesis v22 p 737-740 2001
OSHIMA M DINCHUK JE KARGMAN SL OSHIMA H HANCOCK B
KWONG E TRZASKOS JM EVANS JF TAKETO MM Suppression of
intestinal polyposis in Apc∆716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2
(COX-2) Cell v87 p803-809 1996
PARK HS GOODLAD RA WRIGHT NA The incidence of aberrant crypt foci
and colonic carcinoma in dimethylhidrazine-treated rats varies in a site-specific
manner and depends on tumor histology Cancer Research v57 p4507-4510
1997
PARK HS GOODLAD RA AHNEN DJ WINNETT A SASIENI P LEE
CY WRIGHT NA Effects of epidermal growth factor and dimethylhidrazine on
crypt size cell proliferation and crypt fission in the rat colon American Journal of Pathology v151 n3 p843-852 1997
PARKIN DM International variation Oncogene v23 p6329-6340 2004
PITOT HC amp DRAGAN YP Facts and theories concerning the mechanisms of
carcinogenesis FASEB J v5 n9 p 2280-2286 1991
PORIES SE RAMCHURREN N SUMMERHAYES I STEELE G Animal
models for colon carcinogenesis Arch Surg v128 p647- 653 1993
POTTER JD Nutrition and colorectal cancer Cancer Causes and Control v7
p127-146 1996
POWELL DW MIFFLIN RC VALENTICH JD CROWE SE SAADA JI
WEST AB Myofibroblasts I Paracrine cells important in health and disease Am J Physiol v277 pC1ndash9 1999
PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
GOODLAD R MANDIR N ELIA G NOVELLI M BODMER WF
TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
Foci in Human Colonic Mucosa Cancer Research v51 p1564-1567 1991
RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
in the angiogenesis of colorectal cancer Int J Colorectal Dis v19 n1 p1-11
2004
RONNOV-JESSEN L PETERSEN OW BISSELL MJ Cellular changes involved
in conversion of normal to malignant breast Importance of the stromal reaction
Physiol Rev v76 p 69ndash125 1996
ROUS P amp KIDD JG Conditional neoplasms and subthershold neoplastic states
a study of tar tumors in rabbits J Exp Med v73 p369-390 1941
SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
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McLELLAN EA amp BIRD RP Aberrant cryots potential pre-neoplastic lesions in
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PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
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TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
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PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
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RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
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in conversion of normal to malignant breast Importance of the stromal reaction
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SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
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1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
GARCIA SB PARK HS NOVELLI M WRIGHT NA Field cancerization
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and perspectives Mol Cell Biochem v261 n1-2 p117-122 2004
KISHIMOTO Y YASHIMA K MORISAWA T SHIOTA G KAWASAKI H
HASEGAWA J Effects of cyclooxygenase-2 inhibitor NS-398 on APC and c-myc
expression in rat colon carcinogenesis induced by azoxymethane J
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MAHFOUZ SM CHEVALLIER M GRIMAUD JA Distribution of the major
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McLELLAN EA MEDLINE A BIRD R Dose response and proliferative
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Carcinogenesis v12 p2093ndash2098 1991
McLELLAN EA amp BIRD RP Specificity study to evaluated induction aberrant
crypts in murine colons Cancer Research v48 p 6183-6186 1988a
McLELLAN EA amp BIRD RP Aberrant cryots potential pre-neoplastic lesions in
murine colon Cancer Research v48 p 6187-6192 1988b
MOOLGAVKAR SH Carcinogenesis modeling from molecular biology to
epidermiology Annu Rev Public Health v7 p151-169 1986
MORSON BC Evolution of cacircncer of the colon and rectum Cancer v34 9845-
849 1974
MOTTRAM JC A developing factor in experimental glastogenesis J athol Bacteriol v56 p181-187 1994
MUELLER MM amp FUSENIG NE (2002) Tumor-stroma interactions directing
phenotype and progression of epithelial skin tumor cells Differentiation v70 n9-
10 p486-497 2002
OKADA F KAWAGUCHI T HABELHAH H KOBAYASHI T TAZAWA H
TAKEICHI N KITAGAWA T HOSOKAWA M Conversion of human colonic
adenoma cells to adenocarcinoma cells through inflammation in nude mice Lab Invest v80 n11 p1617-1628 2000
OLIVEIRA EC LEITE MSB MIRANDA JAR ANDRADE ALSM GARCIA
SB LUQUETTI AO and MOREIRA H Cronic Trypanossoma cruzi infection
associated with low incidence of 12-dimetylhidrazine-induced colon cancer in rats
Carcinogenesis v22 p 737-740 2001
OSHIMA M DINCHUK JE KARGMAN SL OSHIMA H HANCOCK B
KWONG E TRZASKOS JM EVANS JF TAKETO MM Suppression of
intestinal polyposis in Apc∆716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2
(COX-2) Cell v87 p803-809 1996
PARK HS GOODLAD RA WRIGHT NA The incidence of aberrant crypt foci
and colonic carcinoma in dimethylhidrazine-treated rats varies in a site-specific
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PARK HS GOODLAD RA AHNEN DJ WINNETT A SASIENI P LEE
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POWELL DW MIFFLIN RC VALENTICH JD CROWE SE SAADA JI
WEST AB Myofibroblasts I Paracrine cells important in health and disease Am J Physiol v277 pC1ndash9 1999
PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
GOODLAD R MANDIR N ELIA G NOVELLI M BODMER WF
TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
Foci in Human Colonic Mucosa Cancer Research v51 p1564-1567 1991
RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
in the angiogenesis of colorectal cancer Int J Colorectal Dis v19 n1 p1-11
2004
RONNOV-JESSEN L PETERSEN OW BISSELL MJ Cellular changes involved
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ROUS P amp KIDD JG Conditional neoplasms and subthershold neoplastic states
a study of tar tumors in rabbits J Exp Med v73 p369-390 1941
SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
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microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
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SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
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SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
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TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
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WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
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WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
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LIOTTA LA KLEINERMAN J SAIDEL GM The significance of hematogenous
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MAHFOUZ SM CHEVALLIER M GRIMAUD JA Distribution of the major
connective matrix components of the stromal reaction in breast carcinoma An
immunohistochemical study Cell Mol Biol v33 p453ndash467 1987
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phenotype and progression of epithelial skin tumor cells Differentiation v70 n9-
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TAKEICHI N KITAGAWA T HOSOKAWA M Conversion of human colonic
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SB LUQUETTI AO and MOREIRA H Cronic Trypanossoma cruzi infection
associated with low incidence of 12-dimetylhidrazine-induced colon cancer in rats
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OSHIMA M DINCHUK JE KARGMAN SL OSHIMA H HANCOCK B
KWONG E TRZASKOS JM EVANS JF TAKETO MM Suppression of
intestinal polyposis in Apc∆716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2
(COX-2) Cell v87 p803-809 1996
PARK HS GOODLAD RA WRIGHT NA The incidence of aberrant crypt foci
and colonic carcinoma in dimethylhidrazine-treated rats varies in a site-specific
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origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
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RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
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Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
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218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
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52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
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88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
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0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
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0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
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10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
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2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
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McLELLAN EA amp BIRD RP Specificity study to evaluated induction aberrant
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McLELLAN EA amp BIRD RP Aberrant cryots potential pre-neoplastic lesions in
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10 p486-497 2002
OKADA F KAWAGUCHI T HABELHAH H KOBAYASHI T TAZAWA H
TAKEICHI N KITAGAWA T HOSOKAWA M Conversion of human colonic
adenoma cells to adenocarcinoma cells through inflammation in nude mice Lab Invest v80 n11 p1617-1628 2000
OLIVEIRA EC LEITE MSB MIRANDA JAR ANDRADE ALSM GARCIA
SB LUQUETTI AO and MOREIRA H Cronic Trypanossoma cruzi infection
associated with low incidence of 12-dimetylhidrazine-induced colon cancer in rats
Carcinogenesis v22 p 737-740 2001
OSHIMA M DINCHUK JE KARGMAN SL OSHIMA H HANCOCK B
KWONG E TRZASKOS JM EVANS JF TAKETO MM Suppression of
intestinal polyposis in Apc∆716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2
(COX-2) Cell v87 p803-809 1996
PARK HS GOODLAD RA WRIGHT NA The incidence of aberrant crypt foci
and colonic carcinoma in dimethylhidrazine-treated rats varies in a site-specific
manner and depends on tumor histology Cancer Research v57 p4507-4510
1997
PARK HS GOODLAD RA AHNEN DJ WINNETT A SASIENI P LEE
CY WRIGHT NA Effects of epidermal growth factor and dimethylhidrazine on
crypt size cell proliferation and crypt fission in the rat colon American Journal of Pathology v151 n3 p843-852 1997
PARKIN DM International variation Oncogene v23 p6329-6340 2004
PITOT HC amp DRAGAN YP Facts and theories concerning the mechanisms of
carcinogenesis FASEB J v5 n9 p 2280-2286 1991
PORIES SE RAMCHURREN N SUMMERHAYES I STEELE G Animal
models for colon carcinogenesis Arch Surg v128 p647- 653 1993
POTTER JD Nutrition and colorectal cancer Cancer Causes and Control v7
p127-146 1996
POWELL DW MIFFLIN RC VALENTICH JD CROWE SE SAADA JI
WEST AB Myofibroblasts I Paracrine cells important in health and disease Am J Physiol v277 pC1ndash9 1999
PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
GOODLAD R MANDIR N ELIA G NOVELLI M BODMER WF
TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
Foci in Human Colonic Mucosa Cancer Research v51 p1564-1567 1991
RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
in the angiogenesis of colorectal cancer Int J Colorectal Dis v19 n1 p1-11
2004
RONNOV-JESSEN L PETERSEN OW BISSELL MJ Cellular changes involved
in conversion of normal to malignant breast Importance of the stromal reaction
Physiol Rev v76 p 69ndash125 1996
ROUS P amp KIDD JG Conditional neoplasms and subthershold neoplastic states
a study of tar tumors in rabbits J Exp Med v73 p369-390 1941
SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
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83
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8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
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0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
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10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
OKADA F KAWAGUCHI T HABELHAH H KOBAYASHI T TAZAWA H
TAKEICHI N KITAGAWA T HOSOKAWA M Conversion of human colonic
adenoma cells to adenocarcinoma cells through inflammation in nude mice Lab Invest v80 n11 p1617-1628 2000
OLIVEIRA EC LEITE MSB MIRANDA JAR ANDRADE ALSM GARCIA
SB LUQUETTI AO and MOREIRA H Cronic Trypanossoma cruzi infection
associated with low incidence of 12-dimetylhidrazine-induced colon cancer in rats
Carcinogenesis v22 p 737-740 2001
OSHIMA M DINCHUK JE KARGMAN SL OSHIMA H HANCOCK B
KWONG E TRZASKOS JM EVANS JF TAKETO MM Suppression of
intestinal polyposis in Apc∆716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase 2
(COX-2) Cell v87 p803-809 1996
PARK HS GOODLAD RA WRIGHT NA The incidence of aberrant crypt foci
and colonic carcinoma in dimethylhidrazine-treated rats varies in a site-specific
manner and depends on tumor histology Cancer Research v57 p4507-4510
1997
PARK HS GOODLAD RA AHNEN DJ WINNETT A SASIENI P LEE
CY WRIGHT NA Effects of epidermal growth factor and dimethylhidrazine on
crypt size cell proliferation and crypt fission in the rat colon American Journal of Pathology v151 n3 p843-852 1997
PARKIN DM International variation Oncogene v23 p6329-6340 2004
PITOT HC amp DRAGAN YP Facts and theories concerning the mechanisms of
carcinogenesis FASEB J v5 n9 p 2280-2286 1991
PORIES SE RAMCHURREN N SUMMERHAYES I STEELE G Animal
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POTTER JD Nutrition and colorectal cancer Cancer Causes and Control v7
p127-146 1996
POWELL DW MIFFLIN RC VALENTICH JD CROWE SE SAADA JI
WEST AB Myofibroblasts I Paracrine cells important in health and disease Am J Physiol v277 pC1ndash9 1999
PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
GOODLAD R MANDIR N ELIA G NOVELLI M BODMER WF
TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
Foci in Human Colonic Mucosa Cancer Research v51 p1564-1567 1991
RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
in the angiogenesis of colorectal cancer Int J Colorectal Dis v19 n1 p1-11
2004
RONNOV-JESSEN L PETERSEN OW BISSELL MJ Cellular changes involved
in conversion of normal to malignant breast Importance of the stromal reaction
Physiol Rev v76 p 69ndash125 1996
ROUS P amp KIDD JG Conditional neoplasms and subthershold neoplastic states
a study of tar tumors in rabbits J Exp Med v73 p369-390 1941
SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
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CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
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COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
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83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
POTTER JD Nutrition and colorectal cancer Cancer Causes and Control v7
p127-146 1996
POWELL DW MIFFLIN RC VALENTICH JD CROWE SE SAADA JI
WEST AB Myofibroblasts I Paracrine cells important in health and disease Am J Physiol v277 pC1ndash9 1999
PRESTON SL WONG WM CHAN AO POULSOM R JEFFERY R
GOODLAD R MANDIR N ELIA G NOVELLI M BODMER WF
TOMLINSON IA WRIGHT NA Bottom-up histogenesis of colorectal adenomas
origin in the monocryptal adenoma and initial expansion by crypt fission Cancer Research v63 p3819-3825 2003
PRETLOW TP BARROW BJ ASHTON WS OrsquoRIORDAN MA PRETLOW
TG JURCISEK JA STELLATO TA Aberrant Crypts Putative Preneoplastic
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RAO M YANG W SEIFALIAN AM WINSLET MC Role of cyclooxygenase-2
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2004
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ROUS P amp KIDD JG Conditional neoplasms and subthershold neoplastic states
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SAIKALI J PICARD C FREITAS M HOLT P Fermented milks probiotics
cultures and colon cancer Nutrition Cancer v49 p 14-24 2004
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
SAPPINO AP SCHURCH W GABBIANI G Differentiation repertoire of
fibroblastic cells Expression of cytoskeletal proteins as marker of phenotypic
modulations Lab Invest v63 p144ndash161 1990
SAPPINO AP SKALLI O JACKSON B SCHURCH W GABBIANI G
Smoothmuscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast
tissues Int J Cancer v41 p707ndash712 1988
SCHURCH W SEEMAYER TA LAGACE R Stromal myofibroblasts in primary
invasive and metastatic carcinomas A combined immunological light and electron
microscopic study Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol v391 p125ndash139
1981
SCHUumlRCH W The myofibroblast in neoplasia Curr Top Pathol v93 p135ndash148
1999
SERINI G amp GABBIANI G Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic
modulation Exp Cell Res v250 p273ndash283 1999
SHEEHAN KM STEELE C SHEAHAN K OrsquoGRADY A LEADER MB
MURRAY FE KAY EW Association between cyclooxygenase-2-expressing
macrophages ulceration and microvessel density in colorectal cancer
Histopathology v46 p287ndash295 2005
SHIVAPURKAR N HUANG L SWALSKY PA BAKKER A FINKELSTEIN S
FROST A SILVERBERG S K-ras and p53 mutations in aberrant crypt foci and
colonic tumors from colon cancer patients Cancer Letters v115 p39-46 1997
THORUP I MEYER O KRISTIANSEN E Influence of a dietary fiber on
development of dimethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and colon tumor
incidence in Wistar rats Nutr Cancer v21 p177ndash182 1994
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
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52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
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88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
TUXHORN JA AYALA GE SMITH MJ SMITH VC DANG TD ROWLEY
DR Reactive stroma in human prostate cancer induction of myofibroblast
phenotype and extracellular matrix remodeling Clin Cancer Res v8 p2912ndash
2923 2002
VAN de RIJN M HENDRICKSON MR ROUSE RV CD34 expression by
gastrointestinal tract stromal tumorsHum Pathol v25 n8 p766-771 1994
VENITT S Mechanism of carcinogenesis and individual susceptibility to cancer
Clin Chem v40 n7 p1421-1425 1994
WALI RK ROY HK KIM YL LIU Y KOETSIER JL KUNTE DP
GOLDBERG MJ TURZHITSKY V BACKMAN V Increased microvascular blood
content is an early event in colon carcinogenesis Gut v54 n5 p654-660 2005
WASSAN HS PARK HS LIU KC MANDIR NK WINNETT A SASIENI P
BODMER WF GOODLAD RA WRIGHT NA APC in the regulation of intestinal
crypt fission J Pathol v185 p246-255 1998
WILLIAMS NS Colorectal cancer epidemiology etiology pathology clinical
features and diagnosis In KEIGHLEY MRB WILLIAMS NS Surgery of the anus
rectum and colon London WB Saunders p831-885 1993
WRIGHT NA Intestinal stem-cell repertoire from nomal gut development the
origins of colonic cancer Int J Exp Pathol v81 n2 p117-143 2000
WU AW GU J LI ZF JI JF XU GW COX-2 expression and tumor
angiogenesis in colorectal cancer World J Gastroenterol v 10 n16 p2323-
2326 2004
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
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883
CD68meacutedia plusmn DP n
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50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
95500 plusmn 1158996375 plusmn 10716111125 plusmn 10453156125 plusmn 35686190667 plusmn 13868
88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
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883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
-
8 Anexos
81 Contagem de ceacutelulas imuno-marcadas
ASMAmeacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 76250 plusmn 35317 8G1 69625 plusmn 19899 8G2 65625 plusmn 17840 8G6 72000 plusmn 16300 8G12G24
67625 plusmn 19078100000 plusmn 11135
218000 plusmn 48270403667 plusmn 53631
83
CD34meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 38750 plusmn 5650 8G1 25625 plusmn 8484 8G2 26750 plusmn 9467 8G6G12G24
34250 plusmn 1068733625 plusmn 1143843000 plusmn 11148
52250 plusmn 955878250 plusmn 1711973000 plusmn 3605
883
CD68meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 50500 plusmn 9574 8G1G2G6G12G24
50875 plusmn 2061550750 plusmn 20865 42000 plusmn 1047435500 plusmn 1063658333 plusmn 18230
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88883
COX-2meacutedia plusmn DP n
N FEA N-FEAGC 1625 plusmn 1407 8G1 2125 plusmn 2295 8G2G6G12G24
0500 plusmn 0755 2500 plusmn 20002000 plusmn 20003000 plusmn 1000
7750 plusmn 305812625 plusmn 250313250 plusmn 148820667 plusmn 1527
8883
82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
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82 Iacutendice de Fissatildeo de Criptas
CFimeacutedia plusmn DP n
N FEA N-ASFGC 0225 plusmn 0104 8G1 0213 plusmn 0099 8G2 0200 plusmn 0110 8G6G12G24
0200 plusmn 01060213 plusmn 00640267 plusmn 0208
0538 plusmn 01500913 plusmn 00991300 plusmn 0400
883
83 Densidade Microvascular
MVDmeacutedia plusmn DP n
N ASF N-ASFGC 4000 plusmn 2203 8G1 2250 plusmn 1488 8G2 2250 plusmn 1581 8G6G12G24
5125 plusmn 22325625 plusmn 21336666 plusmn 2516
10000 plusmn 370317375 plusmn 350238000 plusmn 3502
883
84 da Aacuterea Estromal ocupada pelas ceacutelulas imuno-marcadas
meacutedia plusmn DPASMA CD34 CD68 COX-2
G1G2G6G12G24
1650 plusmn 54962833 plusmn 6658
4825 plusmn 33551650 plusmn 54962500 plusmn 6557
150 plusmn 2070225 plusmn 2604650 plusmn 2764600 plusmn 50423633 plusmn 2081
2500 plusmn 16034250 plusmn 22511050 plusmn 27251500 plusmn 3000
- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
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- Carcinogecircnese eacute um termo geral que denota o desenvolvimento de neoplasia (PITOT amp DRAGAN 1991) Este desenvolvimento neoplaacutesico eacute um processo de muacuteltiplos estaacutegios exemplificado pelo acuacutemulo de mutaccedilotildees somaacuteticas de uma ceacutelula resultando na alteraccedilatildeo de suas propriedades e na aquisiccedilatildeo de alteraccedilotildees que manifestam do fenoacutetipo maligno (HAHN amp WEINBERG 2002)
- HAHN WC amp WEINBERG RA Modelling the molecular circuitry of cancer Nat Rev Cancer v2 p331ndash341 2002
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