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UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
LUDMILA GUIMARÃES SOUZA
EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu E POR DUAS MIOTOXINAS
ISOLADAS DESSE VENENO
São José dos Campos, SP
2010
LUDMILA GUIMARÃES SOUZA
“Efeito da fototerapia na reação inflamatória induzida pelo veneno da serpente
Bothrops jararacussu e por duas miotoxinas isoladas desse veneno”
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientadora: Profa. Dra. Stella Regina Zamuner e Profa. Dra. Maricilia Silva Costa
São José dos Campos, SP
2010
s7t6Souza LufuilaGuimarães
Efeito da fototerryirr m ra@ inflmatória inúlzida pelo veneno da serpenteBothrops jararacassu e 1nr duas miotoxinas isoladas desse veneno / LudmilaGuimarães Souzq Oriedora: Profa. Dra. StellaRegina 74mrm€r e Proã. Dra.Maricilia Silva Costa - São Jose dos Campos, 2009..
I Disco laser: color-
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengeúria doInstiürto de Pesqúsa e Desenvolvimento daUniversidade do Vale do Paraiba2009.
l. Bothrops jworacassa 2.Bjierrla 3. Inflamação 4. Terapia a Laserde Baixalntensidade I. Zamuner, StellaRegin4 Orient.II. Cost4 MaÍicili4 ori€ní ItrTítnlo
CDU:615.8
Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução tetal ou paÍcial
desta dissertação, por processos fotocopiadores ou transmissão eletrônicq desde que
citada à fonte.
zs/as/zotaData da defesa
LUDMILA GUIManÃns souzA
66EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO fNn'f,,q.iu,lfÓnfA INDUZIDA PELO
VENENO DA SERPENTE Bothropsiararücussu E POR DUAS MIOTOXINAS
ISOLADAS DESSE VENENO''
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica, do programa de pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa
e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora:
prof. Dra. MARICÍLIA SILVA COSTA (UNIVAP)
Prof. Dra. STELLA REGINA ZAMUNER (UNICAMP
Prof. Dra. CLAUDIA BARBOSA LADEIRA DE CAM
PTof. DTa. CATARINA DE FÁTIMA PEREIRA TEIXEIRA (BUTANTA)
Profl. Dra. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretor do IP&D - UniVaP
São José dos Campos, 23 de março de 2010'
A Deus,
presença constante em minha vida.
Aos meus queridos Pais,
meu eterno agradecimento pelo amor e esforço dispensado para
minha formação pessoal e profissional,
pelo constante incentivo e apoio incondicional.
A meu marido,
meu agradecimento pelo amor, companheirismo e incentivo.
A todos que sempre estiveram ao meu lado me apoiando e
torcendo pelo meu sucesso.
Dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Ao fim de mais uma etapa de minha vida, quero agradecer a todos aqueles que de uma
forma ou de outra participaram junto comigo dessa caminhada.
Em especial a professora Dra. Stella Regina Zamuner que me recebeu em seu
laboratório no início da minha vida científica, pelos seus ensinamentos, incentivo,
receptividade, paciência e amizade, em todos os momentos.
À Profa. Dra. Maricilia Silva Costa, pela imprescindível colaboração, não só pela
disponibilização de seu laboratório para a realização dos trabalhos, como também, pelo
incentivo e atenção.
À Dra. Ana Maria Barbosa pelo seu imenso carinho, disponibilidade e amizade, tantas
vezes demonstrado, não somente durante a realização da parte experimental desta pesquisa,
mas em todos os momentos.
Às amigas do laboratório, Nikele e Isabella, que muito me ajudaram.
À amiga Jéssie, um verdadeiro anjo em minha vida, que com muito carinho e
dedicação, me ajudou no momento que mais precisei.
Ao Prof. Dr. José Carlos Cogo por colaborar com essa pesquisa fornecendo o veneno
e permitindo o acesso ao seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Andreimar Martins Soares, da FCFRP-USP (Universidade de São Paulo)
- Ribeirão Preto, SP pela importante colaboração me fornecendo as miotoxinas.
À Profa. Dra. Catarina de Fátima Pereira Teixeira, do Laboratório de Farmacologia do
Instituto Butantã, que disponibilizou seu laboratório para realização de parte desse projeto,
muitíssimo obrigada.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia do Instituto Butantã: Marlos, Eduardo e
Cristina, por toda atenção e colaboração, muito obrigada.
Às secretárias: Sra. Ivone V. Monteiro, Sra. Neuza de Moraes Macias Delgado,
Valéria Maeda e Vanessa Aparecida de Oliveira por estarem sempre disponíveis nas horas
que precisei.
Às bibliotecárias: Rubia Gravito C. Gomes e Rosangela Regis Cavalcanti, pela
contribuição, revisando essa dissertação e adequando-a de acordo com as normas da
UNIVAP.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram e acreditaram na realização desta
pesquisa.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da Bolsa de Mestrado (processo 2007/07137-0)
“Só sei que nada sei”
Sócrates 470-399 a.c
EFEITO DA FOTOTERAPIA NA REAÇÃO INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO VENENO DA SERPENTE Bothrops jararacussu E POR DUAS MIOTOXINAS
ISOLADAS DESSE VENENO
RESUMO
O veneno das serpentes do gênero Bothrops induzem uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por formação de edema e migração leucocitária. Neste trabalho avaliamos a atividade edematogênica e a migração leucocitária induzidos pelo veneno da serpente Bothrops jararacussu (VBjussu) e por duas toxinas isoladas deste veneno, as BthTX I e II. Ainda, utilizamos a terapia Laser de baixa potência (LBP) e Light Emitting Diode (LED) como um possível tratamento alternativo na neutralização do edema podal e na inibição da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal, causado pelo veneno e toxinas. Utilizou-se camundongos Swiss machos (n=5). O efeito edematogênico foi avaliado por pletismografia, nos tempos 15, 30 min, 1, 3, 6 e 24 h após a injeção de 0,04; 0,1; 0,2 mg/kg/i.pl do veneno e 0,4 mg/kg/i.pl das toxinas ou salina (controle). Para a avaliação do efeito edematogênico foi escolhida a dose de 0,1 mg/kg por ser a dose que melhor caracterizou o edema. O veneno de VBjussu foi capaz de causar um efeito edematogênico com pico máximo na 1ª hora, assim como as toxinas. O influxo leucocitário foi avaliado no tempo de 6 h, na cavidade peritoneal após injeção de 0,2 mg/kg para o veneno, 1,6 mg/kg e 0,8 mg/kg para a BthTX I e II, respectivamente. A curva temporal da migração celular mostra que o VBjussu causou aumento significativo de leucócitos na sexta hora, bem como as toxinas. O LBP foi utilizado no comprimento de onda de 685 nm, potência 30 mW, densidade de energia 2,2 J/cm2, área 0,2 cm2, tempo 15” e os LEDs nos comprimentos de onda de 635 e 945 nm, potência 110 e 120 mW, densidade de energia 4 J/cm2 , área 1,2 cm2, tempo de 41” e 38” para o LED vermelho (LEDv) e infravermelho (LEDinf) respectivamente, sendo feita duas aplicações, nos tempos: 30 min e 3 h após a injeção do veneno, toxinas ou salina. O LBP e os LEDs nos parâmetros utilizados reduziram o edema e a migração celular. No edema causado pelo VBjussu a redução no pico máximo de formação deste foi de 39, 41 e 46%; pela BthTX I de 49, 54 e 67% e pela BthTX II de 51, 61 e 58% com o (LBP), (LEDinf) e (LEDv), respectivamente. O tratamento com o Laser e LEDs causaram redução de células Polimorfonucleares (PMN), na 6ª hora na ordem de 88, 90 e 84% após a injeção do VBjussu de 54, 83 e 70% após a BthTX I e de 55, 78 48% após a injeção de BthTX II, com o (LBP), (LEDinf) e (LEDv), respectivamente. O laser e LED não foram capazes de inibir a liberação de PGE2 causada pelo veneno ou miotoxinas. Portanto, estes resultados demonstram o benefício que o LBP e os LEDs oferecem como terapia alternativa no processo inflamatório induzido pelo veneno botrópico.
Palavras-chave: Bothrops jararacussu, edema, inflamação, miotoxinas, laserterapia.
EFECCT OF FOTOTERAPY IN THE INFLAMMATORY REACTION INDUCED BY Bothrops jararacussu SNAKE VENOM AND BY TWO MYOTOXYNS ISOLATED
THIS VENOM
ABSTRACT
The venom of the snakes of the genus Bothrops induces a local inflammatory reaction characterized by intense edema formation and leukocyte migration. This work evaluated the edematogenic activity and leukocyte migration induced by the venom of the snake Bothrops jararacussu (BjussuV) and two myotoxins isolated from this venom, the BthTX I and II. We also used the low level laser therapy (LLLT) and the Light Emitting Diode (LED) as an alternative treatment to the neutralization of paw oedema and inhibition of leukocytes migration to the peritoneal cavity, caused by venom and toxins. Swiss male mice was used (n = 5). The edematogenic effect was assessed by plethysmography, 15, 30 min, 1, 3, 6 and 24 hours after the venom injection of 0,04; 0,1; 0,2 mg/kg/i.pl and for the toxins we used 0,4 mg/kg/i.pl or saline (control). For the assessment of the edematogenic effect the dose of 0,1 mg/kg/i.pl was chosen to be the best dose that characterized oedema formation. VBjussu venom caused an edematogenic peak at 1 h, as well as the toxins. The leukocyte influx was evaluated 6 h after venom (0,2 mg/kg) or myotoxins (1,6 and 0,8 mg/kg for BthTX I and II, respectively) injection, in the peritoneal cavity. BjussuV caused a significant increase of leukocytes in the sixth hour, as well as the toxins. The LBP was used in the wavelength of 685 nm, power 30 mW power density; 2,2 J/cm2; area 0,2 cm2; time 15 "and the LEDs in wavelengths of 635 and 945 nm, power 110 and 120 mW; power density 4 J/cm2; area 1,2 cm²; time 41" and 38 "for the Red led (LEDv) and infrared (LEDinf) respectively. The LBP and LEDs reduced oedema formation and cell migration. In the oedema caused by BjussuV, the reduction was 39, 41 and 46%; by BthTX I it was 49, 54 and 67% and by BthTX II of 51, 61 and 58% with (LBP), (LEDinf) and (LEDv), respectively. The treatment with Laser and LEDs caused a reduction of Polymorphonuclear cells (PMN), at 6 h in the order of 88, 90 and 84% after the injection of BjussuV; 54, 83 and 70% after BthTX I injection and 55, 78 48% after the injection of BthTX II, with the (LBP), (LEDinf) and (LEDv), respectively. The Laser and LED were not effective in decrease the concentration of PGE2. Therefore, these results demonstrate the benefit that of the LBP and LEDs as an alternative therapy in inflammatory process induced by botropic venom.
Key words: Bothrops jararacussu, edema, inflammation, myotoxins, lasertherapy.
Lista de Figuras
Figura 1: Serpente Bothrops jararacussu. ...................................................................... 19
Figura 2: Distribuição geográfica da serpente Bothrops jararacussu. ........................... 20
Figura 3: Efeitos físicos da interação Laser-tecido ........................................................ 27
Figura 4: Efeitos biológicos da interação Laser-tecido .................................................. 30
Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência................................................................... 38
Figura 6: Aparelho LED................................................................................................. 38
Figura 7: Pletismógrafo .................................................................................................. 40
Lista de Tabelas
Tabela 1: Protocolo da Irradiação Laser......................................................................... 37
Tabela 2: Protocolo da Irradiação LED.......................................................................... 37
Lista de Gráficos
Figura 1: Decurso temporal da resposta edematogênica induzida pelo veneno de B. jararacussu na pata de camundongos............................................................................. 44
Figura 2: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos .................................................................................... 45
Figura 3: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs no edema induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. .................................................................................................... 46
Figura 4: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na redução do edema induzido pela Bothropstoxina I e II....................................................................................................... 47
Figura 5: Perfil temporal da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu. ............................... 48
Figura 6: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritôneo de camundongos .................................................................... 50
Figura 7: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu........................................................................................................................... .............52
Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX I........................................ 54
Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX II....................................... 56
Figura 10: Efeito do Laser e do LED infravermelho na liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pelas BthTX I e II .............................................................. 58
Lista de Abreviaturas e Símbolos
B. jararacussu – Bothrops jararacussu
VBjussu – veneno da Bothrops jararacussu
BthTX - I – Bothropstoxina I
BthTX – II – Bothropstoxina II
PLA2 – Fosfolipase A2
PAF – Fator ativador de plaquetas
PGE2 – Prostaglandina E2
TNF-α – Fator de necrose tumoral α
TXA2 – Tromboxano A2
LTB4 – Leucotrieno B4
IL-6 – Interleucina 6
NO – Óxido nítrico
AINEs – Antiinflamatórios não esteroidais
IASP – International Association for the Study of Pain
ATP – Adenosina trisfofato
LAP – Laseres cirúrgicos de alta potência
LBP – Laseres de baixa potência
TLBP – Terapia Laser de baixa potência
GaAs – Arseneto de Gálio
LED – Light Emitting Diode
i.p. – via intraperitoneal
i.pl. – via intraplantar
MN – Monomorfonuclear
PMN – Polimorfonuclear
Sumário
1 Introdução............................................................................................................................... 16
1.1 As Serpentes da fauna Brasileira ...................................................................................... 16
1.2 Epidemiologia................................................................................................................... 16
1.3 Acidente botrópico e sinais clínicos ................................................................................. 17
1.4 Bothrops jararacussu ....................................................................................................... 19
1.5 Miotoxinas com estrutura de fosfolipase A2 (PLA2)....................................................... 21
1.6 Resposta Inflamatória aguda no envenenamento ............................................................. 22
1.7 Laser ................................................................................................................................. 25
1.8 Interação Laser-tecido ...................................................................................................... 26
1.9 Efeitos da radição laser..................................................................................................... 28
1.10 Light Emitting Diode (LED) .......................................................................................... 31
1.11 Laser e acidente ofídico.................................................................................................. 31 2 Objetivos................................................................................................................................. 34 3 Material e métodos ................................................................................................................. 36
3.1 Animais............................................................................................................................. 36
3.2 Protocolo de Ética............................................................................................................. 36
3.3 Veneno e toxinas .............................................................................................................. 36
3.4 Protocolo de eutanásia ...................................................................................................... 37
3.5 Laser e LED...................................................................................................................... 37
3.6 Avaliação do edema ......................................................................................................... 39
3.7 Indução da reação inflamatória na cavidade peritoneal de camundongos........................ 40
3.8 Coleta e contagem dos leucócitos..................................................................................... 41
3.9 Determinação da concentração de prostaglandina E2 (PGE2)......................................... 41
3.10 Análise estatística ........................................................................................................... 42 4 Resultados............................................................................................................................... 44
4.1 Padronização da dose do veneno de B. jararacussu, através da curva dose-resposta...... 44
4.2 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos. ........................................................................................................... 45
4.3 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pelo veneno de B. jararacussu em camundongos. ............................................................................................... 46
4.4 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pela Bothropstoxina I e II em camundongos.............................................................................................................. 47
4.5 Perfil temporal do influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na cavidade peritoneal de camundongos. .................................................................................... 48
4.6 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritônio de camundongos...................................................................................................... 49
4.7 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de B. jararacussu. .................................. 51
4.8 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina I.................................................. 53
4.9 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu. ............................................................................................................................ 55
4.10 Efeito do Laser e do LED infravermelho sobre a liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pela Bothropstoxina I e II. ......................................................... 57
5 Discussão................................................................................................................................ 60 6 Conclusão ............................................................................................................................... 68 Referências ................................................................................................................................ 70
INTRODUÇÃO
Introdução 16
1 Introdução
Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem um importante problema
de Saúde Pública em regiões tropicais do mundo. São considerados de grande importância
médica em virtude do grande número de pessoas atingidas e pela própria natureza do acidente,
caracterizado por graves manifestações sistêmicas e/ou locais que podem levar o indivíduo a
óbito ou ainda deixar sequelas como: deficiências, deformações ou até mesmo a perda do
membro afetado.
1.1 As Serpentes da fauna Brasileira
Há atualmente, cerca de 2.900 espécies de serpentes no mundo, distribuídas em 465
gêneros e 20 famílias. No Brasil, temos representantes de 9 famílias, 75 gêneros e 321
espécies, ou seja, cerca de 10% do total das espécies (FRANCO, 2003). Dentre todas as
serpentes peçonhentas existentes no Brasil destacam-se as pertencentes às famílias: Elapidae
onde o único gênero desta família no Brasil é o Micrurus, cujas espécies são conhecidas como
corais; e Viperidae na qual estão inseridas os gêneros: Crotalus cujas espécies são
popularmente conhecidas por cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia,
maracá e outras denominações populares; gênero Lachesis (surucucu, surucucu-pico-de-jaca,
surucutinga, malha-de-fogo) e gênero Bothrops (jararaca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira,
jararaca-do-rabo-branco, malha-de-sapo, patrona, surucucurana, combóia, caiçara, e outras
denominações), sendo que este gênero compreende cerca de 30 espécies, distribuídas por todo
o território nacional (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
1.2 Epidemiologia
O verdadeiro número de mortes e a incidência por picadas de serpentes, no mundo todo,
são desconhecidos. A literatura mostra que no Brasil, o gênero da serpente peçonhenta,
responsável pelo maior número de acidentes é o gênero Bothrops (90,5%), seguido dos
Introdução 17
gêneros Crotalus (7,7%); Lachesis (1,4%) e Micrurus (0,4%). Quanto ao gênero responsável
pelo maior índice de letalidade, destaca-se o gênero Crotalus com 1,87%, seguido dos
gêneros Lachesis (0,95%); Micrurus (0,36%) e Bothrops (0,31%). A epidemiologia dos
acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas do sexo masculino (70%), atingidos, sobretudo,
nos membros inferiores. Estes acidentes, em geral, estão relacionados a fatores climáticos e
aumento da atividade humana no campo (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
1.3 Acidente botrópico e sinais clínicos
As serpentes peçonhentas são capazes de sintetizar e secretar uma grande quantidade de
substâncias biologicamente ativas, compostas principalmente de proteínas e polipeptídeos
(FURTADO; COLLETO;DIAS DA SILVA, 1991) e ainda, seus venenos compreendem uma
mistura complexa de enzimas tóxicas e proteínas, como fosfolipases A2 (PLA2),
metaloproteinases, serinoproteases, neurotoxinas, citotoxinas, cardiotoxinas entre outras
(BRAUD; BOM;WISNER,2000; GUTIÉRREZ, 2002; OWNBY, 1990; SOARES et al.,
2004b). A fisiopatologia do envenenamento por serpentes, envolve uma complexa série de
eventos que vai depender da ação de uma dessas toxinas ou da combinação desses
componentes do veneno (GUTIÉRREZ, 2002).
De um modo geral, o veneno das diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops
induz a um quadro fisiopatológico semelhante, mas, variações na composição química e nas
atividades biológicas podem ocorrer entre famílias, gêneros, espécies e subespécies
(CHIPPAUX; WILLIAMS; WHITE, 1991; MOURA da SILVA et al., 1991).
Considerando os sinais e sintomas predominantemente relatados nos acidentes ofídicos,
o envenenamento botrópico pode ser dividido em sistêmico e local (ROSENFELD, 1971). As
manifestações sistêmicas são evidenciadas, principalmente, por alterações na homeostasia,
caracterizados por deficiência da coagulação, da agregação plaquetária e depleção de
fibrinogênio (HATI et al., 1999). A maioria dos venenos botrópicos ativa a cascata da
coagulação sanguínea, por atuarem sobre o fibrinogênio, a protrombina (Fator II), o fator X
(NAHAS; KAMIGUTI;BARROS, 1979) e o Fator VIII (NISHIDA et al., 1994), podendo
causar o completo consumo de fatores de coagulação (KAMIGUTI; CARDOSO, 1989). A
coagulopatia de consumo, consequente à ativação da cascata de coagulação, determina a
Introdução 18
incoagulabilidade sanguínea, caracterizada clinicamente por sangramentos espontâneos,
como, gengivorragia. Também são observados alterações do sistema cardiovascular, que
podem levar ao choque hipovolêmico, bem como à insuficiência renal aguda em casos mais
graves (AMARAL et al., 1985). Os efeitos sistêmicos como a insuficiência renal aguda
(AMARAL et al., 1985), sangramento em órgãos vitais e choque (KOUYOUMDJAIN et al.,
1991), estão relacionados às principais causas de óbito no envenenamento botrópico.
Os venenos botrópicos apresentam, ainda, a importante peculariedade de induzir sérias
reações locais. No local da picada, observa-se dor forte, edema intenso, além de hemorragia e
mionecrose (ROSENFELD, 1971; GUTIERREZ; LOMONTE, 1989; 1995). Segundo dados
da literatura, a hemorragia resulta da ação de metaloproteases, que contém zinco, de peso
molecular relativamente alto, as quais parecem atuar diretamente na membrana do endotélio
vascular (OHSAKA et al., 1973). A mionecrose é causada por uma família de proteínas
denominadas miotoxinas, as quais possuem características de fosfolipase A2 e atuam
diretamente sobre a membrana da célula muscular, causando dano tecidual proeminente
(GUTIERREZ; LOMONTE, 1995).
Ainda, o recrutamento e ativação de leucócitos induzido pelo envenenamento botrópico
foi relatado por diversos autores. Flores et al (1993) demonstraram que a administração dos
venenos de B. erythromelas e B. alternatus causam migração de leucócitos para a cavidade
peritoneal de ratos e Acosta de Pérez et al (1996) mostraram um infiltrado leucocitário,
composto principalmente de neutrófilos, em músculo gastrocnêmio de ratos, após a injeção do
veneno de B. jararaca da Argentina. Ademais, foi demonstrado que os venenos botrópicos
induzem a liberação de mediadores inflamatórios, como as citocinas interleucina-6 (IL-6) e
fator de necrose tumoral (TNF-α) e mediadores lipídicos como prostaglandina E2 (PGE2),
tromboxano A2 (TXA2) e leucotrieno B4 (LTB4) (OLIVO et al., 2007; ZAMUNER et al.,
2002, 2005). Os venenos botrópicos, além de induzirem a liberação de mediadores
inflamatórios, podem, eventualmente, ativar mecanismos intracelulares naquelas células, que
induzem a geração de substâncias capazes de ampliarem seu efeito lesivo (ZAMUNER et al.,
2001).
O tratamento utilizado no caso dos acidentes botrópicos é a soroterapia, em que, os
efeitos sistêmicos do veneno botrópico são normalmente revertidos, diminuindo assim o
coeficiente de letalidade decorrente desses acidentes. Entretanto, os antivenenos, apesar de
sua ação eficaz sobre o quadro sistêmico, dificilmente neutralizam as reações locais. Assim
Introdução 19
sendo, os estudos voltados para o esclarecimento dos mecanismos responsáveis pelos efeitos
fisiopatológicos locais do veneno, revestem-se de importância.
1.4 Bothrops jararacussu
A Bothrops jararacussu (Figura 1) é uma serpente de grande porte, podendo atingir até
2,20 m de comprimento. Diferencia-se das jararacas comuns pelo porte, padrão de desenho
em seu corpo e por possuir uma parte da cabeça negra. Há um acentuado dimorfismo sexual
entre fêmeas e machos, sendo que as fêmeas são marcadamente amarelas e pretas, enquanto
que os machos são marrons e pretos, além de serem menores e mais delgados. Estas serpentes
apresentam hábito noturno ou crepusculares. Geralmente são encontradas em florestas
tropicais, bancos de rios e pântanos (MILANI JUNIOR et al., 1997).
Figura 1. Bothrops jararacussu Fonte: http:// www.mundoreptil.com.br
Esta espécie está distribuída geograficamente em quase todo o território sul-americano:
Bolívia, Paraguai, norte da Argentina e Brasil (Figura 2). No Brasil, a espécie B. jararacussu
é predominantemente encontrada no estado do Mato Grosso, extremo sul da Bahia, sul de
Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e noroeste do
Rio Grande do Sul (CAMPBELL; LAMAR, 1989; MELGAREJO, 2003).
Introdução 20
Figura 2. Distribuição geográfica da serpente Bothrops jararacussu Fonte: Milani JunioR et al. (1997)
O envenenamento causado pela B. jararacussu tem grande mortalidade quando
comparada com outras serpentes do mesmo gênero e com a Crotaluss durissus terrificus
(SANCHES et al., 1992), sendo responsável por 0,8 a 10% dos acidentes ofídicos registrados
no Brasil (MILANI JUNIOR et al., 1997). O grande nível de letalidade, é atribuído aos 30%
de miotoxinas encontradas no veneno total (HOMSI-BRANDEBURGO,1988; RODRIGUES-
SIMIONI et al., 1983), e a componentes hemorrágicos (DA SILVA et al., 2007; QUEIROZ et
al., 1984).
Milani Junior et al (1997), fizeram um estudo clínico-patológico em 29 casos, atendidos
em um período de 20 anos, em dois hospitais do Estado de São Paulo. Este estudo mostrou a
importância e a gravidade dos acidentes causados pela serpente Bothrops jararacussu. Foram
encontrados sinais de necrose local, abscessos, coagulopatia, choque, necrose tubular renal e
morte. Este estudo ressalta a importância dos acidentes causados por esta serpente.
Introdução 21
1.5 Miotoxinas com estrutura de fosfolipase A2 (PLA2)
As fosfolipases A2 são enzimas que possuem baixo peso molecular (13-18 KDa), e
constituem uma família de proteínas que hidrolizam fosfolipídeos de membrana na posição
sn-2, de maneira cálcio-dependente, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos (DENNIS,
1994). Ainda, por hidrolisarem a 1-o alquil, 2 araquidonil-glicerofosfocolina, algumas
enzimas geram o liso-PAF, precursor do fator ativador de plaquetas (PAF). Devido à
capacidade dessas PLA2 de promoverem a liberação do ácido araquidônico que é o substrato
para a biossíntese de vários mediadores lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e
leucotrienos, muito interesse se tem demonstrado, no estudo dessa família de enzimas, pois,
os derivados do ácido araquidônico e o PAF, além de mediadores de fenômenos fisiológicos
estão envolvidos em vários processos inflamatórios (FLAMAND et al., 2006; REID, 2005).
A literatura mostra que as fosfolipases A2 estão abundantemente presentes nos venenos
de serpentes. Venenos viperídicos e crotalídicos contém PLA2s com a habilidade de causar
rápida necrose das fibras do músculo esquelético (PLA2s miotóxicas) (HARRIS; CULLEN,
1990). Em adição ao seu papel catalítico primário, as PLA2s dos venenos de serpentes
mostram ainda, outros importantes efeitos toxicos/farmacológicos, incluindo mionecrose,
neurotoxicidade, cardiotoxicidade e hemolítico, hemorrágico, hipotensivo, anticoagulante,
inibição da agregação plaquetária e indução da atividade edematogênica (GUTIÉRREZ;
LOMONTE, 1997; ANDRIÃO-ESCARSO et al., 2000). Algumas destas atividades são
correlacionadas com a atividade enzimática, mas outras são completamente independentes
(KINI et al., 1989; SOARES et al., 2004a).
Foi caracterizado como PLA2s básica os tipos Asp49 e Lys49 (HARRIS; CULLEN,
1990; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995). Além da miotoxicidade, a Asp49 e a Lys49,
promoveram eventos inflamatórios distintos em modelos experimentais (GUTIÉRREZ;
LOMONTE, 1995). É sabido que a Asp49 apresenta variável atividade enzimática, enquanto
que a Lys49 possui pouco ou nenhuma atividade enzimática. Esta variação na atividade
catalítica se deve a substituição do amino ácido na alça de ligação do cálcio, particularmente
na posição 49, onde a substituição da Asp49 pela Lys49 afeta drasticamente a catalise (para
revisão vide TEIXEIRA et al., 2003).
Introdução 22
Foram purificadas, do veneno de B. jararacussu, as miotoxinas BthTX-I e BthTX-II
(HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988). A BthTX-I é uma PLA2 Lys49, uma proteína
dimérica miotóxica, é a mais abundante miotoxina isolada do veneno de B. jararacussu e
pode ser considerada um modelo molecular que apresenta desafios, porque possui
miotoxicidade elevada e, no entanto apresenta pouca ou nenhuma atividade PLA2
(GUTIÉRREZ; OWNBY, 2003), danifica a membrana através de um mecanismo cálcio-
independente, capaz de induzir uma severa mionecrose (FLETCHER et al., 1996;
GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; OWNBY et al.,
1999). Além da mionecrose, a BthTX-I causa diversos efeitos farmacológicos que incluem o
edema, degranulação do mastócito, o bloqueio irreversível da contração do músculo,
interrupção de lipossoma e citotoxidade em células endoteliais (ANDRIÃO-ESCARSO et al.,
2000; HOMSI-BRANDEBURGO et al., 1988; LANDUCCI et al., 1998).
A BthTX-II é uma Asp49, com estrutura homóloga ao da Lys49. Segundo Corrêa et al,
(2008), a BthTX II tem ação de uma Asp49 (desempenhando sua atividade catalítica) e de
uma Lys49 (sendo miotóxica e citotóxica), e ainda, esta proteína além de miotóxica, mostra
efeitos edematogênico e hemolítico (GUTIÉRREZ et al., 1991; HOMSI-BRANDEBURGO et
al., 1988). Foi demonstrado também que a BthTX II induz agregação plaquetária
(GUTIÉRREZ et al., 1991).
1.6 Resposta Inflamatória aguda no envenenamento
A inflamação é a reação protetora do tecido frente a uma injúria, tendo como finalidade,
proteger o organismo contra uma agressão local do tecido conjuntivo. Esta resposta do
organismo tem como característica fundamental, manifestar-se de forma estereotipada, ou
seja, ela obedece a um padrão semelhante, independente da natureza do estímulo lesivo. Após
o desencadeamento da inflamação, observa-se uma primeira fase, denominada de fase aguda,
evidenciada pelos sinais clássicos da inflamação: rubor, tumor, calor e dor, que são a
expressão de fenômenos estruturais e funcionais que ocorrem na microcirculação e no tecido
intersticial adjacente (FLOREY, 1970). A inflamação aguda pode dar origem a uma
inflamação crônica. Essa transição ocorre quando a resposta inflamatória aguda não pode ser
resolvida devido à persistência do agente lesivo ou a alguma interferência no processo normal
Introdução 23
de cicatrização. Se houver eliminação do agente lesivo, podem ocorrer fenômenos de
regeneração e reparo (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1992).
A resposta imediata ao agente agressor inclui: alteração no calibre vascular e no fluxo
sanguíneo, mudanças estruturais na microvasculatura que favorecem o extravasamento de
proteínas do plasma e leucócitos, migração de leucócitos para a microcirculação e, sua
acumulação no foco da injúria, seguido de fagocitose pelas células competentes (GARCIA-
LEME et al., 1973; RYAN; MAJNO, 1977; GRANGER; KUBES, 1994).
Os sinais da resposta inflamatória induzida pelo veneno botrópico são característicos de
um quadro de inflamação aguda, que se caracteriza por três eventos principais: 1) alterações
no calibre vascular, que levam ao aumento do fluxo sanguíneo, surgindo sintomas como:
eritema e calor; 2) mudanças estruturais na microvasculatura, permitindo que fluídos e
proteínas plasmáticas, deixem a circulação, resultando em quadros álgicos e edematogênicos;
3) migração de leucócitos da microcirculação e sua acumulação no foco da injúria
(COLLINS, 1999).
Os diferentes eventos inflamatórios decorrem, em grande parte, da ação de mediadores
inflamatórios pré-formados e armazenados em grânulos ou recém sintetizados, que são
liberados no decorrer da resposta inflamatória (GARCIA-LEME, 1989). Esses mediadores
podem ser de origem plasmática (cininas e fatores do sistema complemento) ou celular
(histamina, serotonina, eicosanóides, óxido nítrico, fator ativador de plaquetas, citocinas e
neurocininas) (DIROSA et al., 1971; DOWNEN et al., 1999; PALMER et al., 1987; LYONS,
1995).
O componente celular da reação inflamatória é representado, primordialmente, pelos
leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e mononucleares
(monócitos e linfócitos) que migram dos vasos para o local da lesão. A migração de
leucócitos dos vasos para o local da lesão ocorre por entre as células endoteliais, e isso só é
possível devido a um movimento orientado desses leucócitos que depende da ação de
substâncias quimiotáticas e da expressão de moléculas responsáveis pela interação leucócito-
endotélio. Estas células locomovem-se orientadamente no sítio extravascular, em resposta a
um gradiente de concentração de mediadores inflamatórios, num processo conhecido como
quimiotaxia e acumulam-se no local da lesão para destruírem o agente lesivo (atividade
fagocítica e microbicida) (FLOREY, 1970).
Na inflamação aguda, os neutrófilos migram primeiro e os monócitos depois. Como
também há muito mais neutrófilos que monócitos no sangue, nas primeiras 24 a 48 horas a
Introdução 24
maioria do infiltrado inflamatório agudo é predominantemente neutrofílica (COTRAN;
KUMAR; ROBBINS, 1992).
A formação do edema ocorre devido a uma série de eventos que ocorrem na
microcirculação. Iniciando por uma breve vasoconstrição, seguido da dilatação, do aumento
do fluxo local e da permeabilidade vascular, com conseqüente extravasamento do material
protéico do plasma para o interstício. O edema inflamatório apresenta-se de forma localizada
e é composto de água, eletrólitos e proteínas (GARCIA-LEME et al., 1973). A essa ação
edematogênica dos venenos botrópicos, até o momento, não foi atribuída nenhuma proteína
isolada, por se tratar, possivelmente, da somatória de efeitos de várias toxinas presentes
nesses venenos. Há evidências quanto à participação de toxinas hemorrágicas, proteases,
fosfolipases A2, componentes dos venenos que causam a liberação de histamina de mastócitos
e substâncias que ativam o sistema complemento (GUTIERREZ; LOMONTE, 1989; DIAS da
SILVA et al., 1995). De fato, TREBIEN; CALIXTO (1989) demonstraram que o edema
induzido pelo veneno de B. jararaca em ratos é multimediado e resulta da ação de mediadores
e -adrenérgicos, de eicosanóides, PAF, além de serotonina e histamina. Por outro lado,
CHAVES et al (1995) observaram a participação de eicosanóides e de mediadores -
adrenérgicos, mas não de histamina e mediadores -adrenérgicos no edema induzido pelo
veneno de B. asper em camundongos. Essas discrepâncias podem dever-se aos diferentes
modelos animais utilizados experimentalmente, e/ou a variações nos componentes
edematogênicos presentes nos dois venenos estudados, justificando estudos adicionais.
A literatura mostra que os venenos botrópicos são capazes de induzir a liberação de
mediadores pró-inflamatórios como as citocinas interleucina-6 (IL-6), o fator de necrose
tumoral (TNF-), o interferon gama (IFN-) e mediadores lipídicos como a prostaglandina E2
(PGE2), tromboxano A2 (TXA2), leucotrieno B4 (LTB4) e prostaglandina D2 (PGD2) (OLIVO
et al., 2007; ZAMUNER 2001; 2005). Ainda, os venenos botrópicos, além de induzirem a
liberação de mediadores inflamatórios, podem, eventualmente, ativar mecanismos
intracelulares naquelas células que induzem a geração de substâncias capazes de ampliarem
seu efeito lesivo (ZAMUNER et al., 2001).
As lesões locais induzidas por venenos de serpentes do gênero Bothrops têm sido
amplamente investigadas, possibilitando o entendimento dos mecanismos farmacológicos e
fisiopatológicos envolvidos na gênese desses fenômenos e a caracterização das substâncias
presentes nestes venenos, responsáveis pelo quadro local. No entanto, ainda há uma série de
Introdução 25
incógnitas com relação à patogênese destes efeitos, que ainda permanecem como um desafio
para a pesquisa toxinológica na América Latina (GUTIERRÉZ ; LOMONTE, 2003).
1.7 Laser
A laserterapia tem sido muito utilizada nas últimas décadas, inclusive nas áreas médicas
e paramédicas. Embora o uso do laser nestas áreas venha crescendo, o conhecimento básico
de seu funcionamento, ainda é muito deficiente.
A palavra Laser é um acrônimo para “Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation” (amplificação da luz pela emissão estimulada da radiação), e designa atualmente,
uma vasta série de dispositivos com emissão de radiação eletromagnética em diversas faixas
do espectro eletromagnético, desde raios X até a microonda. As características que
diferenciam a luz laser das outras fontes luminosas são: monocromaticidade, colimação,
coerência espacial e temporal. A monocromaticidade significa que a luz laser emitida
apresenta apenas um único comprimento de onda, o qual é definido pelo meio ativo e pela
refletividade dos espelhos do laser e esta característica é considerada de grande importância,
pois determina quais moléculas absorverão a radiação e, portanto, a interação fotobiológica e
os efeitos terapêuticos específicos (BAXTER, 1997). A maioria dos laseres apresenta feixes
colimados, a colimação, refere-se ao alto grau de paralelismo do feixe laser (BAXTER, 1997),
com um mínimo ângulo de divergência. A coerência é a sincronicidade das ondas de luz, onde
as ondas propagam-se com a mesma fase no espaço e no tempo (KITCHEN; PARTRIDE,
1991; BAXTER, 1997; TUNER; HODE, 2002).
Quanto aos parâmetros que descrevem o laser: tipo, comprimento de onda, densidade de
potência e densidade de energia, duração da exposição e o modo de entrega da energia para o
tecido alvo (KITCHEN; PARTRIDGE, 1991; MISERENDINO; PICK, 1995; BAXTER,
1997; TUNER; HODE, 2002). A interação da luz com o tecido é determinada pelo
comprimento de onda da emissão laser e pelas características ópticas do tecido alvo
(MISERENDINO; PICK, 1995). O comprimento de onda define a profundidade de
penetração no tecido alvo (FULLER, 1983). Diferentes comprimentos de onda apresentam
diferentes coeficientes de absorção para um mesmo tecido. As radiações emitidas nas regiões
do ultravioleta e do infravermelho médio apresentam alto coeficiente de absorção pela pele,
fazendo com que a radiação seja absorvida na superfície, no entanto, nas regiões do vermelho
Introdução 26
e infravermelho próximo, constata-se baixo coeficinte de absorção, implicando em máxima
penetração no tecido (KARU, 1987). A densidade de potência (irradiância), é definida como
sendo a potência óptica de saída do laser em Watts, dividida pela área irradiada em cm2. A
energia total entregue sobre a área da superfície irradiada é denominada densidade de energia
ou fluência.
Por ser uma radiação óptica, o laser está incluído no espectro eletromagnético, tendo
como intervalo espectral, mais usado na prática clínica e laboratorial, os comprimentos de
onda de 630 a 1300 nm, incluindo a luz visível e a parte próxima do espectro infravermelho,
chamado de “janela terapêutica” para tecidos biológicos (BAXTER, 1997).
Os laseres podem ser classificados em: laseres cirúrgicos de alta potência (LAP) e não
cirúrgicos de baixa potência (LBP). A aplicação do LAP tem por base, os seus efeitos
fototérmicos e fotoablativos sobre o tecido, portanto são utilizados para cortar, destruir
tecidos, soldar, entre outros efeitos e a aplicação do LBP baseia-se nas interações atérmicas da
luz do laser com o tecido, produzindo efeitos de biomodulação (TURNÉR; HODE, 1998;
OSHIRO, 1991) ou seja, a terapia com o LBP, ocorre por meio de reações atérmicas da luz
com o tecido ocasionando efeitos fotoquímicos (SCHAFER et al., 2000; HONMURA et al.,
1993). Os laseres LBP, estão situados na região do vermelho e infravermelho próximo onde
emitem radiações com potência inferior a 1 W, desta forma, não vão induzir efeitos térmicos,
nem ablação (BRUGNERA; PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000).
O laser Arseneto de Gálio (GaAs) é um dos laseres mais utilizados nas aplicações de
terapias com laser de baixa potência. Quando o aparelho laser se encontra com seus
parâmetros ajustados, o laser é gerado polarizando diretamente um diodo constituído de
Arseneto de Gálio. Este diodo, quando polarizado diretamente e submetido a uma elevada
corrente de circulação, desprende ondas eletromagnéticas com comprimentos de onda em nm
e estas ondas são guiadas a uma janela de onde o feixe é emitido (DOURADO et al., 2003),
produzindo radiação na faixa situada entre 630 nm e 950 nm (vermelho visível até o
infravermelho próximo) (KITCHEN; BAZINI, 1996).
1.8 Interação Laser-tecido
Introdução 27
A luz laser ao incidir em um meio, pode ser refletida, espalhada, transmitida ou
absorvida. O laser fornece uma quantidade elevada de fótons que em parte são: refletidos,
dispersos e transmitidos ao atingir o tecido biológico e o restante é absorvido em diferentes
camadas da epiderme e da derme, de acordo com os constituintes de cada camada (Figura 3).
Para que a radiação laser produza em efeito terapêutico no corpo humano, é necessário que
ela seja absorvida para que ocorra a interação com as estruturas moleculares e celulares
(BRUGNERA; PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000; LOW; REED, 2001).
Figura 3. Efeitos físicos da interação Laser-tecido Fonte: Albertini (2006)
A primeira interação da luz com a pele acontece na superfície do extrato córneo, onde
cerca de 5 a 7% da radiação incidente é refletida. A aplicação em contato perpendicular do
aparelho laser com a superfície do tecido tegumentar durante a irradiação, irá aumentar a
profundidade de penetração em razão da redução da reflexão e dispersão. Dessa forma a
dispersão e a absorção são dependentes do tipo de tecido por meio do qual a luz está
passando, assim como comprimento da luz incidente. Assim que a luz é absorvida e
dispersada pelos tecidos do corpo, ocorre uma redução no efeito da radiação em relação a
penetração, atenuando a luz em diferentes frequências e graus. Por isso, a penetração da luz
nos tecidos, é determinada especialmente pelo comprimento de onda e potência, além dos
fenômenos de dispersão e absorção (BAXTER, 1997).
Introdução 28
Os cromóforos, como por exemplo: hemoglobina, melanina e água, exercem
significativa influência sobre a interação laser-tecido, pois estes elementos teciduais
apresentam alto coeficiente de absorção para um comprimento de onda específico ou espectro
de energia (MISERENDINO; PICK, 1995; BAXTER, 1997). Os cromóforos absorvem luz na
região visível do espectro, já os aminoácidos e os ácidos nucleicos têm alta absorção na faixa
intermediária do espectro vermelho-visível (BAXTER, 1997).
Os fotorreceptores presentes nas células, através de sua capacidade de absorver os fótons
da radiação, provocam variações no metabolismo celular. Assim, estas ações, determinarão
mudanças fotodinâmicas em cadeias complexas e moléculas básicas de processos fisiológicos
com conotações terapêuticas (KARU, 1999).
1.9 Efeitos da radição laser
O princípio básico da laserterapia é a capacidade de alterar o comportamento celular, na
ausência de aquecimento (SCHINDL et al., 2000). A radiação com o LBP promove
modificações ou efeitos na zona irradiada ou zona circundante. Esta radiação faz com que a
energia possa provocar mudanças nas moléculas, que por sua vez, promoveriam respostas
biológicas. Um aspecto importante da terapia com o LBP é a necessidade de que o tecido
biológico esteja de alguma forma em desequilíbrio homeostático, ou seja, alguns autores
relatam que o LBP não apresenta efeitos sobre células ou tecidos que não apresentam algum
tipo de alteração fisiopatológica (TURNÉR; HODE, 1998).
Vários efeitos da radiação laser podem ser encontradas na literatura. Estudos mostram,
que a forma de energia utilizada pelas células é o ATP; as células absorvem os fótons e
transformam sua energia em ATP, que é então utilizado para gerar processos metabólicos,
sintetizar DNA, RNA, proteínas, enzimas e outros produtos necessários para reparar ou
regenerar os componentes celulares e restaurar a homeostase (ENWEMEKA, 2007). Ainda, a
irradiação laser exerce um estímulo sobre as mitocôndrias celulares provocando um aumento
na produção de adenosina trifosfato (ATP) no interior das células e consequente aceleração da
mitose. Assim, ocorrerá um aumento do consumo de oxigênio e ativação da respiração
celular, eliminando as atividades anaeróbicas ocorridas em um processo inflamatório (KARU;
PYATIBRAT; KALENDO, 1995; PASSARELO et al., 1984; WILDEN; KARTHEIN, 1998).
Introdução 29
O incremento de ATP, favorece também, o aporte energético para funções importantes como
o transporte da membrana, síntese de proteínas e contração muscular (PASSARELO et al.,
1984).
Vladimirov et al (2004) relatam os efeitos observados em clínicas como a ação
antiinflamatória da radiação laser, a regeneração acelerada de tecidos danificados, e a melhora
da circulação do sangue em órgãos, que podem estar associados com o efeito do laser, obtidos
nos experimentos: 1) aumento da atividade de certas células como leucócitos e fagócitos, bem
como o aumento de íons cálcio no citoplasma destas células; 2) aumento da divisão celular e
crescimento de células; 3) ativação de síntese de proteínas e citocinas e 4) melhora da
circulação do sangue na circulação sanguínea, devido ao relaxamento das paredes dos vasos
(vasodilatação).
Segundo Basford et al (1995), a luz laser estimula a atividade energética, induzindo
processos de bioestimulação, conduzindo a liberação de fatores de crescimento por
macrófagos (YONG et al, 1989), proliferação de queratinócitos (HAAS et al., 1990), aumento
da população e degranulação de mastócitos (EL SAYED; DISON, 1996) e angiogênese
(SCHINDL et al., 2000) e ainda, aceleram o processo cicatricial de feridas (RABELO et al.,
2006).
Além destes efeitos bioquímicos, podem ocorrer efeitos bioelétricos caracterizados pela
manutenção do potencial de membrana celular, o que impede que os estímulos dolorosos se
propaguem a centros nervosos, isso devido a eficiência da bomba de sódio e potássio
ocasionada pela maior disponibilidade de ATP resultante do efeito bioquímico (RICCI, 2003).
Existe um grande número de hipóteses sobre o possível mecanismo da radiação laser:
hipóteses baseada na idéia de uma ação específica da radiação coerente (laser) em tecidos
humanos e animais, em estruturas biológicas; hipóteses baseada na ação fotoquímica da luz,
incluindo a radiação de laseres, LEDs, e outros tipos de luz na região do visível e
infravermelho próximo.
Karu (1999), sugere que a absorção da luz realizada pelos componentes
(fotorreceptores) da cadeia respiratória, tais como as flavinas e os citocromos, resultam em
uma aceleração de tranferência de elétrons em partes da cadeia respiratória ocorrendo assim a
produção de ATP. Uma pequena quantidade de radicais livres ou forma de oxigênio reativo é
produzido como parte desse processo, e os íons cálcio (Ca+2) e as enzimas da cadeia
respiratória também desempenham importantes funções (Figura 4).
Introdução 30
Figura 4. Efeitos biológicos da Interação Laser-tecido
Os mecânismos primários, dizem respeito a interação entre os fótons e moléculas em tecidos, enquanto que os mecânismos secundários referem-se aos efeitos das alterações químicas induzidas pelos efeitos primários. A estimulação da produção de ATP celular tem sido apontada como um dos efeitos mais importantes da terapia laser. Os mecânismos secundários incluem efeito sobre a dor, sobre a circulação sanguínea, sobre mecânismos estimuladores e reguladores e os efeitos sobre o sistema imunitário. Adaptado e modificado a partir do texto original de Tuner e Hode (2002). Apesar de existir uma grande quantidade de estudos mostrando os efeitos do LBP sobre
as células, vale ressaltar que as informações sobre o mecanismo de ação do laser sobre os
tecidos biológicos, ainda não são conclusivas, portanto estudos adicionais são necessários.
Introdução 31
1.10 Light Emitting Diode (LED)
O LED é um diodo emissor de luz, que quando energizado emite luz monocromática e
não coerente. É uma luz com alto grau de pureza que permite a sua utilização sem que haja a
necessidade de filtros ópticos coletores. São dispositivos semicondutores, apresentam grande
eficiência de conversão de energia elétrica em óptica, dissipando pouca potência. Tem como
característica principal, conduzir a corrente elétrica em um único sentido, apresentando duas
regiões distintas, sendo a primeira receptora de elétrons denominada por “p” e a segunda
doadora de elétrons, denominada “n” (MEDEIROS, 2001). Quando polarizados
adequadamente esses dispositivos semicondutores emitem luz na faixa visível ou invisível,
dependendo de seus componentes (ZANIN et al., 2005). O processo de emissão de luz pela
aplicação de uma fonte elétrica é denominado “eletroluminescência”. A luz emitida se dá
devido ao diodo (junção de P-N) energizado (REBELLO, 2005). Segundo alguns autores, a
terapia com o LED em baixa potência pode gerar efeitos semelhantes aos obtidos com a
TLBP (terapia a laser de baixa potência), pois, o aumento da atividade celular, tanto em
divisão como em síntese, tem sido relacionados ao comprimento de onda e com a dose, e não
especificamente à fonte de luz (KARU, 2003). O processo de absorção luminosa por
cromóforo tecidual está relacionado ao comprimento de onda do fóton. Este deve possuir um
pacote energético específico para que promova reações moleculares. Quando ocorre a
absorção de fótons por um cromóforo, um estado molecular eletronicamente excitado se
estabelece, resultando em aumento ou redução de atividade celular. A fotobiomodulação tem
como característica a possibilidade de aplicação em vários métodos terapêuticos empregando
diferentes fontes emissoras (KARU, 2003) e o baixo custo do LED contribuiu para que ele se
tornasse uma fonte de luz alternativa neste processo.
Ainda que a literatura ateste o efeito benéfico da terapia com o LED (VINCK et al.,
2003), não há estudos sobre a avaliação do efeito local causado por veneno de serpente e
tratamento com o LED. Portanto, este estudo pode contribuir como medida terapêutica
complementar de baixo custo.
1.11 Laser e acidente ofídico
Introdução 32
Na literatura há poucos trabalhos utilizando o laser de baixa potência para o tratamento
do efeito local causado por veneno ofídico. DOURADO et al. (2003), estudaram o efeito da
irradiação laser Ga-As (Arseneto de Galium), na mionecrose do músculo gastrocnêmio de
camundongo, causado pela injeção intramuscular de veneno de serpente Bothrops moojeni.
Esses autores observaram que o tratamento com esse laser diminuiu consideravelmente a
mionecrose, inibindo a habilidade do veneno em desfazer a integridade da membrana
plasmática. Também, Barbosa et al (2008, 2009), utilizando o laser Ga-As, verificaram que o
tratamento com o laser de baixa potência inibiu o edema, a migração de leucócitos e a
mionecrose, no músculo gastrocnêmio de camundongos, causada após a injeção do veneno de
B. jararacussu. Além disso, esses autores observaram que o tratamento com o laser de baixa
potência, juntamente com o antiveneno, foi capaz de causar uma inibição significativa, maior
do que o tratamento com o laser apenas. De acordo com os dados obtidos, estes autores
sugerem que o tratamento com o laser em acidentados ofídicos possa ser um instrumento
complementar para o tratamento de acidentes com serpentes botrópicas.
Dessa maneira, evidencia-se a importância do estudo do envenenamento botrópico bem
como o terapia com o laser de baixa potência, como uma alternativa no tratamento de
acidentados por serpentes botrópicas. Assim sendo, este estudo avaliou alguns efeitos pró-
inflamatórios causados pelo veneno da serpente Bothrops jararacussu e suas principais
miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II), no que se refere a inflamação local e à eficácia da terapia
laser de baixa potência frente ao edema e o influxo de leucócitos e a liberação do mediador
inflamatório PGE2, induzido pelo veneno ou toxinas.
OBJETIVOS
____ Objetivos 34
2 Objetivos
I) Caracterizar a reação inflamatória induzida pelo veneno de Bothrops jararacussu e
pelas duas miotoxinas (Bothropstoxina I e II), isoladas deste veneno, em
camundongos, analisando:
- a formação do edema podal (cinética)
- o influxo leucocitário, no que se refere ao número, tipos celulares e cinética;
- a liberação do mediador inflamatório prostaglandina E2 (PGE2).
II) Avaliar o efeito do tratamento dos animais com a terapia com o Laser de Baixa
Potência e LEDs na evolução do edema podal, na migração celular e na liberação
da PGE2, induzidos pelo veneno ou miotoxinas.
MATERIAL E MÉTODOS
_____ Material e Métodos 36
3 Material e métodos
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss machos, pesando entre 22-25 g, provenientes do
Biotério da Anilab (Animais de Laboratório) Paulínia, São Paulo. Inicialmente os animais
foram pré-tratados com antiparasitários e receberam água e alimentação ad libitun, foram
mantidos em sala com temperatura e umidade constante (24oC – 60%), com ciclo claro/escuro
(12/12 horas).
3.2 Protocolo de Ética
A condução científica desta pesquisa seguiu as normas e registros da resolução CNS
196/96 do Conselho Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) e foi realizada somente após
aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UNIVAP, sob o número
A028/2007/CEP.
3.3 Veneno e toxinas
O veneno total liofilizado de Bothrops jararacussu foi gentilmente cedido pelo Prof.
Dr. José Carlos Cogo do Serpentário do CEN (Centro de Estudos da Natureza) da UNIVAP.
A bothropstoxina-I e a bothropstoxina-II foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Andreimar
M. Soares, do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina, USP,
Ribeirão Preto. O veneno e as toxinas, liofilizados, foram mantidos a 10C e preparados (p/v)
em solução estéril de NaCl 0,9%, no momento do uso.
_____ Material e Métodos 37
3.4 Protocolo de eutanásia
Os animais foram anestesiados com 10 mg/kg de xilazina (Virbaxyl 2% injetável; 0,1
mg/kg i.p.) + 100 mg/kg de ketamina (Dopalen injetável; 1 ml/Kg i.p.). Em seguida, sob o
efeito do anestésico, foi administrada overdose de cloreto de potássio a 10% (intracardíaco).
3.5 Laser e LED
O tratamento foi realizado com a utilização do laser de baixa potência (LBP),
semicondutor (modelo Theralaser D.M.C., São Carlos, S.P. Brazil) e LED (SANSEN
Tecnologia, SP Brasil).
Tabela 1 – Protocolo de irradiação laser
Parâmetros Valores
Comprimento de onda 685 nm
Densidade de energia (DE) 2,2 J/cm2
Potência 30 mW Tempo 15 ''
Área Irradiada 0,2 cm2
Tabela 2 – Protocolo de irradiação LED
LED vermelho LED Infravermelho Parâmetros
Valores Valores
Comprimento de onda 635 nm 945 nm
Densidade de energia (DE) 4 J/cm2 4 J/cm2
Potência 110 mW 120 mW Tempo 41 '' 38 ''
Área Irradiada 1,2 cm2 1,2 cm2
_____ Material e Métodos 38
O aparelho laser e LEDs foram cedidos gentilmente pelo professor Dr. Carlos José de
Lima do laboratório de Instrumentação Optobiomédica do Instituto de Pesquisa da Univap.
Foram utilizados dois protocolos de irradiação para o laser e os LEDs: 1) imediatamente, 1ª e
3ª hora após a administração do veneno ou salina (controle); 2) 30 minutos e 3 horas após a
administração do veneno e/ou miotoxinas.
Figura 5: Aparelho Laser de baixa potência
Figura6: Aparelho LED Fonte: Ludmila Guimarães Souza (2007)
_____ Material e Métodos 39
Tratamento:
3.6 Avaliação do edema
O veneno de Bothrops jararacussu (0,1 mg/kg) ou toxinas (0,4 mg/kg) foram
injetados, por via i.pl., em uma das patas posteriores dos camundongos. A pata contralateral
recebeu igual volume de salina (controle).
Para a avaliação do edema, o volume das patas posteriores, até a articulação tíbio-
társica, foram medidas antes e 15 e 30 min, e 1, 3, 6 e 24 horas após a administração do
_____ Material e Métodos 40
veneno; 15 e 30 min e 1, 3, 6 horas após a administração das miotoxinas, com o auxílio de
pletismógrafo (Plethysmometer Ugo Basile, Itália), de acordo com a técnica descrita por Van
Arman et al., (1965). O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão:
(Vf - Vi) E (%) = ------------------- x 100
Vi onde, E (%) = aumento percentual do volume da pata Vi = volume inicial Vf = volume final
Figura 7: Pletismógrafo UGO BASILLE 7140.
Fonte: Danielle Monteiro Pereira (2008).
3.7 Indução da reação inflamatória na cavidade peritoneal de camundongos
O veneno bruto, diluído em solução fisiológica, foi filtrado em filtros esterilizantes, de
poro de 0,22 m de diâmetro e injetado na cavidade peritoneal dos animais (via i.p.), na dose
(0,2 mg/kg) e as miotoxinas nas doses (1,6 mg/kg e 0,8mg/kg) em volume constante de 0,5
_____ Material e Métodos 41
mL/cavidade. Os animais dos grupos controles receberam volume equivalente de solução
fisiológica apirogênica, por via i.p..
3.8 Coleta e contagem dos leucócitos
Os leucócitos foram coletados da cavidade peritoneal 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a
injeção i.p. do veneno de B. jararacussu ou solução fisiológica apirogênica e 1, 3 e 6 horas
após a injeção i.p. das miotoxinas, através da lavagem da cavidade peritoneal com 2 mL de
PBS contendo heparina (10 UI/mL). Alíquotas dos lavados foram usadas para a determinação
do número de leucócitos totais em hemocitômetro de Neubauer, em microscópio de luz, após
diluição (1:20, v/v) em líquido de Turk. Para a contagem diferencial das células, preparações
realizadas em citocentrífuga foram coradas com o corante Instant Prov. Foram contadas pelo
menos 100 células, ao microscópio de luz, classificadas como células polimorfonucleares ou
mononucleares, com base em critérios de morfologia convencional.
3.9 Determinação da concentração de prostaglandina E2 (PGE2)
A concentração de PGE2 foi mensurada no líquido peritoneal nos tempos de 1, 3 e 6
horas após a injeção do veneno, toxinas ou salina apirogênica. Os lavados peritoneais foram
coletados, centrifugados a 1000 rpm por 6 min. e o sobrenadante coletado para a
determinação dos níveis de PGE2 por ensaio imunoenzimático específico (EIA). Para isso, o
eicosanóide de cada amostra foi extraído em colunas Sep Pak C18, previamente ativadas com
10 mL de etanol absoluto, seguido de 20 mL de água deionizada. As amostras foram
acidificadas (pH 3,5) com HCl 0,1 N e adicionadas às colunas. Posteriormente, as colunas
foram lavadas com água, etanol-água (35%) e, finalmente, com etanol absoluto para eluição
da PGE2. Os eluatos foram conservados em atmosfera de nitrogênio e posteriormente
ressuspensos em tampão de ELISA e analisados por EIA, utilizando Kit comercial (Kit
monoclonal Prostaglandinas PGE-2 EIA. Caym- 514010-96 wells-LI - Cayman Chemicals).
Alíquotas contendo 50 µl de cada amostra foram adicionados a placas de 96 poços, e
_____ Material e Métodos 42
incubados com igual volume de eicosanóide conjugado à acetilcolinesterase e antisoro
específico de coelho. Após a adição do substrato, a absorbância das amostras foi determinada
em leitor de ELISA – 412 nm e as concentrações de PGE2 foram estimadas a partir da curva
padrão específica representadas em ng/mL.
3.10 Análise estatística
Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de análise de variância a 5%
ANOVA. Os dados coletados foram processados de forma a expressar os resultados em
gráficos.
RESULTADOS
____ Resultados 44
4 Resultados
4.1 Padronização da dose do veneno de B. jararacussu, através da curva dose-resposta
A atividade edematogênica foi avaliada após a injeção intraplantar do veneno de B.
jararacussu, em três doses diferentes (0,04; 0,1 e 0,2 mg/kg, por via i.pl.) ou salina (controle).
A cinética do edema foi avaliada nos tempos 15 e 30 min, 1, 3, 6 e 24 h, após a injeção do
veneno ou salina. A curva temporal do edema induzido pelo veneno de B. jararacussu,
demonstra que o efeito desse veneno é dose-tempo dependente, causando edema já aos 15
min após a sua aplicação intraplantar, seguida de um efeito máximo na 1ª hora, persistindo em
níveis elevados até 6 horas, retornando aos níveis basais em 24 horas (figura 1). Todas as
doses estudadas causaram aumento de formação do edema, sendo que na maior dose (0,2
mg/kg) ocorreu hemorragia. Dessa maneira, para os experimentos seguintes determinou-se a
dose de 0,1mg/kg/i.pl. como a dose edematogênica que melhor caracterizou o edema sem a
presença de hemorragia visível.
0
50
100
150
200
250
0,04 mg/kg
0,1 mg/kg
0,2 mg/kg
15 30 60 180 360 1440
Tempo (min)
Ed
ema
(%)
Figura 1: Decurso temporal da resposta edematogênica induzida pelo veneno de B. jararacussu na pata de camundongos. O edema foi avaliado por pletismografia após a injeção i.pl do veneno (0,04; 0,1 e 0,2 mg/kg) ou solução fisiológica (controle). O edema foi expresso como aumento percentual do volume em relação à pata controle. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais.
____ Resultados 45
4.2 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos.
A atividade edematogênica foi avaliada após a injeção intraplantar do veneno de B.
jararacussu (0,1 mg/kg) e das Bothropstoxinas I e II (0,4 mg/kg), isoladas deste veneno. A
dose utilizada para as miotoxinas tiveram como base os estudos de Pereira et al (2009), que
verificaram que essas miotoxinas, nessas doses, induziram edema de pata em camundongos.
O veneno e as miotoxinas induziram um aumento do edema podal que foi significativamente
maior que o controle a partir dos 30 minutos e se manteve diferente do controle até 6 horas
após sua injeção. A BthTX II causou um aumento significativamente maior, no tempo de 3
horas, quando comparado com a BthTX I e o veneno (figura 2).
0
50
100
150
200
Controle
VBjussu - 0,1 mg/kg
BthTX I - 0,4 mg/kg
*
*
**
*
#
15 30 60 180 360
BthTX II - 0,4 mg/kg
*+
*
Tempo (min)
Ed
em
a (
%)
Figura 2: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II na formação do edema de pata em camundongos. O veneno, miotoxinas e/ou controle salina, foram injetados no músculo plantar de camundongos. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais *p<0,05 em relação ao controle; #p<0,05 quando comparado com o veneno; +p<0,05 quando comparado com o veneno e a Bothropstoxina I (ANOVA).
____ Resultados 46
4.3 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pelo veneno de B. jararacussu em camundongos
Para melhor avaliar a eficácia do laser no tratamento do edema induzido pelo veneno de
B. jararacussu, foram utilizados dois protocolos experimentais, no qual o laser foi aplicado
em diferentes tempos. No primeiro protocolo, o laser e os LEDs foram aplicados em três
tempos (imediatamente, 1 e 3 horas após a injeção do veneno), onde houve redução no pico
máximo de formação do edema (1 h) na ordem de 56% com o Laser 635 nm, 76% com o LED
945 nm (infravermelho) e 26% com o LED 635 nm (vermelho) (figura 3A), no segundo
protocolo, o laser e LEDs foram aplicados em dois tempos (30 minutos e 3 horas após a
injeção do veneno), onde também houve uma redução significativa na ordem de 39%, 41% e
46% com o Laser, LED infravermelho e LED vermelho, respectivamente (figura 3B). No
acidente ofídico, dificilmente o paciente chega ao local de atendimento logo após o acidente,
assim sendo, para os experimentos seguintes, o segundo protocolo, com a irradiação laser e
LEDs, 30 minutos e 3 horas após a injeção do veneno ou miotoxinas, foi o escolhido pois
seria o que melhor caracteriza o acidente ofídico.
0
50
100
150
200
VBjussu - 0,1 mg/kg
Ven + Laser 685 nm
Ven + LED 945 nm
Ven + LED 635 nm
15 30 60 180 360
*
*
**
*
A
Tempo (min)
Ed
em
a (
%)
0
50
100
150
200
15 30 60 180 360
*
*
VBjussu - 0,1 mg/kgVen + Laser 685 nmVen + LED 945 nmVen + LED 635 nm
Tempo (min)
Ed
em
a (
%)
B
Figura 3: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs no edema induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. A terapia com o laser e os LEDs foram aplicadas diretamente no local da injeção de veneno e/ou solução salina. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). A figura (A) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs com três aplicações através da fibra óptica: imediatamente, 1 e 3 horas após a injeção do veneno. A figura (B) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs com duas aplicações através da fibra óptica: 30 minutos e 3 horas após a injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).
____ Resultados 47
4.4 Efeito do Laser de baixa potência e dos LEDs no edema induzido pela Bothropstoxina I e II em camundongos.
O efeito do tratamento com o laser e LEDs sobre o edema induzido pelas
Bothropstoxinas I e II (0,4 mg/kg), foi avaliado no período de 6 horas após sua injeção. Os
resultados demonstram que o Laser e LEDs reduzem significativamente o edema induzido no
pico máximo do edema causado pela Bothropstoxina I (BthTX-I), na ordem de 49%, 54% e
67% (figura 4A), e para a Bothropstoxina II (BthTX-II) (figura 4B), na ordem de 51%, 61% e
58% com o Laser 685 nm, LED 945 nm (infravermelho) e LED 635 nm (vermelho),
respectivamente.
0
50
100
150
BthTX I - 0,4 mg/kgBthTX + Laser 685 nmBthTX + LED 945 nmBthTX + LED 635 nm
15 30 60 180 360
*
*
*
*
Tempo (min)
Ed
ema
(%)
A
0
50
100
150
15 30 60 180 360
*
**
BthTX II - 0,4 mg/kgBthTX II + Laser 685 nmBthTX II + LED 945 nmBthTX II + LED 635 nm
Tempo (min)
Ed
ema
(%)
B
Figura 4: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na redução do edema induzido pela Bothropstoxina I e II. A terapia laser e LEDs foram aplicadas diretamente no local da injeção da Bothropstoxina I ou II (0,4 mg/kg) e/ou solução salina. O edema foi avaliado por pletismografia e expresso como aumento percentual do volume da pata direita em relação à pata esquerda (controle). A figura (A) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs sobre o edema induzido pela Bothropstoxina I. A figura (B) mostra os resultados da irradiação laser e LEDs sobre o edema induzido pela Bothropstoxina II. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação as Bothropstoxinas (ANOVA).
____ Resultados 48
4.5 Perfil temporal do influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na cavidade peritoneal de camundongos.
A caracterização da reação inflamatória induzida pelo veneno de B. jararacussu foi feita
após a injeção intraperitoneal deste veneno (0,2 mg/kg/i.p.). A cinética da migração de
leucócitos foi avaliada nos tempos 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração do veneno ou
solução fisiológica (controle). A curva temporal da migração celular mostra que o veneno de
B. jararacussu causou aumento significativo da concentração de leucócitos na sexta hora.
(figura 5).
Total
0
5
10
15
20
Controle
VBjussu - 0,2 mg/kg
1 3 6 12 24
*
Tempo (h)
*
*
nº
célu
las
x 10
6/m
L
PMN
0
5
10
15
20
*
1 3 6 12 24
Tempo (h)
*
nº
célu
las
x 10
6/m
L
MN
0
5
10
15
20
Tempo (h)
1 3 6 12 24
nº
célu
las
x 10
6/m
L
* *
*
Figura 5: Perfil temporal da migração de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu. O veneno foi injetado na cavidade peritoneal dos camundongos na dose de 0,2 mg/kg via i.p. O total de leucócitos, polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) foi determinada através da contagem de células obtidas do lavado peritoneal nos tempos de 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a injeção do veneno de Bothrops jararacussu e/ou solução salina (controle), conforme descrito em Materiais e Métodos. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).
____ Resultados 49
4.6 Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritônio de camundongos.
A migração celular foi avaliada após a injeção intraperitoneal do veneno de B.
jararacussu (0,2 mg/kg/i.p.) e das Bothropstoxina I e II (1,6 e 0,8 mg/kg/i.p.,
respectivamente). A figura 6A demonstra que tanto o veneno (11,590±1,26x106/mL), quanto
as Bothropstoxinas I (7,240±1,02x106/mL) e II (11,079±0,83x106/mL) isoladas do veneno de
B. jararacussu causaram influxo de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos
que foi significativamente diferente do controle (salina) (3,8±0,22x106/mL). A BthTX I
causou influxo leucocitário significativamente menor quando comparado com o veneno e a
BthTX II. A contagem diferencial mostra que as células polimorfonucleares são as
predominantes na 6ª hora após a injeção do veneno ou miotoxinas (figura 6B), VBjussu
(7,146±1,24 x106/mL), Bothropstoxinas I (3,920±1,05 x106/mL) e II ( 6,094±0,99 x106/mL),
controle (0,584±0,21 x106/mL). A figura 6C demostra que somente a Bothropstoxina II
causou um aumento das células mononucleares (MN): VBjussu (4,443±0,51 x106/mL),
Bothropstoxinas I (4,017±0,77 x106/mL) e II ( 4,985±0,36 x106/mL) e controle (3,181±0,39
x106/mL).
____ Resultados 50
0
5
10
15
Controle
VBjussu - 0,2 mg/kg
BthTX I - 1,6 mg/kg
BthTX I I - 0,8 mg/kg
6 horas
**
#
*
Total
nº
célu
las
x 10
6/m
L
A
PMN
0
5
10
15
6 horas
*
*
*
nº
célu
las
x 10
6 /mL
B
MN
0
5
10
15
nº
célu
las
x 10
6/m
L
*
6 horas
C
Figura 6: Efeito do veneno de B. jararacussu e da Bothropstoxina I e II no influxo leucocitário no peritôneo de camundongos. Os animais receberam injeção i.p. do veneno, miotoxinas ou salina, Decorrido 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao controle; #p<0,05 quando comparado com o veneno e com BthTX II (ANOVA).
____ Resultados 51
4.7 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de B. jararacussu.
Foram utilizados o laser e os LEDs, conforme descrito em Materiais e Métodos, para
determinar a sua capacidade de redução sobre a migração de leucócitos, induzida pelo veneno
de B. jararacussu (0,2 mg/kg/i.p). O Laser e os LEDs reduziram o número de leucócitos na
cavidade peritoneal de camundongos na 6ª hora de aplicação do veneno: 11,6±1,26 x 106/mL;
2,2±0,19 x 106/mL (Laser 685 nm); 3,4±0,45 x 106/mL (LED 945 nm); 2,8±0,41 x 106/mL
(LED 635 nm) (figura 7A). A contagem diferencial mostrou que tanto o laser quanto os LEDs
reduziram significativamente o influxo de leucócitos polimorfonucleares (PMN): 7,146 ± 1,24
x 106/mL (VBjussu); 0,818±0,12 x 106/mL (Laser 685 nm); 0,737±0,20 x 106/mL (LED 945
nm); 1,131±0,30 x 106/mL (LED 635 nm) (figura 7B). A figura 7C mostra que o laser e os
LEDs também causaram uma redução das células mononucleares (MN): 4,443±0,51 x
106/mL; 1,465±0,25 x 106/mL; 2,652±0,33 x 106/mL; 1,659±0,16 x 106/mL, para o VBjussu,
Laser 685 nm; LED 945 nm e LED 635 nm, respectivamente.
____ Resultados 52
Total
0
5
10
15VBjussu - 0,2 mg/kg
Ven + Laser 685 nm
Ven + LED 945 nm
Ven + LED 635 nm
** *
6 horas
nº
célu
las
x 10
6/m
L
A
PMN
0
5
10
15
* **
nº
célu
las
x 10
6/m
L
6 horas
B
MN
0
5
10
15
* **
6 horas
nº
célu
las
x 10
6 /mL
C
Figura 7: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu. Os animas receberam injeção i.p. do veneno. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação ao veneno (ANOVA).
____ Resultados 53
4.8 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina I.
Como terapia alternativa no tratamento da reação inflamatória induzida pela
Bothropstoxina I, o laser e os LEDs foram utilizados conforme descrito em Materiais e
Métodos. A figura 8A mostra que o Laser e os LEDs causaram a redução de leucócitos totais
na cavidade peritoneal de camundongos, na 6ª hora após a injeção da BthTX I (7,240±1,06 x
106/mL); 3,840±0,27 x 106/mL (Laser 685 nm); 3,000±0,12 x 106/mL (LED 945 nm);
3,460±0,10 x 106/mL (LED 635 nm). A contagem diferencial mostrou que tanto o laser
quanto o LED reduziram significativamete o influxo de polimorfonucleares (PMN):
4,919±0,48 x 106/mL (BthTX I); 2,270±0,46 x 106/mL (Laser 685 nm); 0,831±0,06 x 106/mL
(LED 945 nm); 1,422±0,23 x 106/mL (LED 635 nm), sendo que o tratamento com LED
Infravermelho foi mais eficiente quando comparado com o tratamento com o Laser (figura
8B); e leucócitos mononucleares (MN): 4,017±0,77 x 106/mL; 1,780±0,33 x 106/mL;
2,199±0,08 x 106/mL; 2,038±0,21 x 106/mL; para a BthTX I, Laser 685 nm, LED 945 nm e
LED 635 nm, respectivamente (figura 8C).
____ Resultados 54
Total
0
2
4
6
8
10
BthTX I - 1,6 mg/kg
BthTX I + Laser 685 nm
BthTX I + LED 945 nm
BthTX I + LED 635 nm
***
6 horas
nº
célu
las
x 10
6/m
L
A
PMN
0
2
4
6
8
10
*
**#n
º cé
lula
s x
106/m
L6 horas
B
MN
0
2
4
6
8
1 0
* * *
6 horas
nº
célu
las
x 10
6/m
L
C
Figura 8: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX I. Os animas receberam injeção i.p. da BthTX I. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação a BthTX I; #p<0,05 quando comparado com o tratamento Laser. (ANOVA).
____ Resultados 55
4.9 Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzida pela Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu.
Como terapia alternativa no tratamento da reação inflamatória induzida pela
Bothropstoxina II isolada do veneno de Bothrops jararacussu, o laser e os LEDs foram
utilizados conforme descrito em Materiais e Métodos. O Laser e os LEDs causaram a redução
de leucócitos totais na cavidade peritoneal de camundongos, na 6ª hora após a injeção da
BthTX II (11,079±0,83 x 106/mL); 6,319±0,06 x 106/mL (Laser 685 nm); 4,269±0,12 x
106/mL (LED 945 nm); 6,170±0,33 x 106/mL (LED 635 nm) (figura 9A). A contagem
diferencial mostrou que tanto o laser quanto os LEDs reduziram significativamete o influxo
de polimorfonucleares (PMN): 6,094±0,99 x 106/mL (BthTX II); 2,762±0,86 x 106/mL (Laser
685 nm); 1,347±0,11 x 106/mL (LED 945 nm); 3,192±0,20 x 106/mL (LED 635 nm) (figura
9B) e leucócitos mononucleares (MN): 4,985±0,36 x 106/mL; 3,663±0,45 x 106/mL;
2,922±0,14 x 106/mL e 2,946±0,38 x 106/mL, para a BthTX II, Laser 685 nm, LED 945 nm e
LED 635 nm, respectivamente (figura 9C).
____ Resultados 56
Total
0
5
10
15
BthTX I I - 0,8 mg/kg
BthTX I I + Laser 685 nm
BthTX I I + LED 945 nm
BthTX I I + LED 635 nm
*
*
*
6 horas
A
nº
célu
las
x 10
6/m
L
PMN
0
5
10
15
*
*
*
6 horas
nº
célu
las
x 10
6/m
L
B
MN
0
5
10
15
**
6 horas
nº
célu
las
x 10
6/m
L
C
Figura 9: Efeito do Laser de baixa potência e LEDs na concentração de leucócitos na cavidade peritoneal de camundongos induzido pela BthTX II. Os animas receberam injeção i.p. da BthTX II. Decorrida 6 h, efetuou-se a lavagem da cavidade peritoneal para a contagem de A: leucócitos totais, B: polimorfonucleares (PMN) e C: mononucleares (MN). A terapia laser e os LEDs foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno. Os dados representam a média ± E.P.M. de 5 animais. *p<0,05 em relação a BthTX II (ANOVA).
____ Resultados 57
4.10 Efeito do Laser e do LED infravermelho sobre a liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pela Bothropstoxina I e II.
A PGE2 é um mediador importante para a formação de edema e esta relacionada ao
aumento da hiperalgesia, dessa maneira, a concentração de PGE2 na cavidade peritoneal dos
camundongos foi avaliada no sobrenadante do lavado peritoneal coletado 1, 3 e 6 horas da
injeção i.p. do veneno ou miotoxinas.
A Figura 10A mostra que o tratamento dos animais com o laser ou o LED causou um
aumento significativo da concentração de PGE2 1 hora da injeção i.p. do veneno de B.
jararacussu, se comparado ao grupo veneno sem tratamento. No período de 3 e 6 horas não
houve diferença significativa entre os grupos. A bothropstoxina I causou um aumento da
concentração de PGE2 no período de 1 hora da injeção i.p da miotoxina, no período de 3 horas
houve uma significativa redução desse mediador, tanto para o tratamento com o laser quanto
para o LED, no período de 6 horas não houve diferença significativa da concentração da PGE2
(figura 10B).
A figura 10C mostra que o tratamento com o laser ou LED não causou mudança
significativa na concentração da PGE2 após a injeção de bothropstoxina II em nenhum
período de tempo estudado.
____ Resultados 58
0
5
10
15
20
25
VBjussu - 0,2 mg/kg
Ven + Laser 685 nm
Ven + LED 945 nm
*
A
*PG
E2
(ng
/mL
)
0
5
10
15
20
25
BthTX I - 1,6 mg/kg
BthTX I + Laser 685 nm
BthTX I + LED 945 nm
* *
**
B
PG
E2
(ng
/mL
)
0
5
10
15
20
25
BthTX I I - 0,8 mg/kg
BthTX I I + Laser 685 nm
BthTX I I + LED 945 nm
1 3 6
Tempo (h)
C
PG
E2
(ng
/mL
)
Figura 10: Efeito do Laser e do LED infravermelho na liberação de PGE2 induzida pelo veneno de B. jararacussu e pelas BthTX I e II. Os animais receberam injeção i.p. de VBjssu ou BthTX I ou II). A concentração de PGE2 foi avaliada por EIA, em lavados peritoneais coletados 1, 3 e 6 horas após as injeções. A terapia laser e o LED foram aplicados diretamente no local da injeção do veneno ou miotoxinas. Os dados representam a média E.P.M. de 4-5 animais. *p< 0,05 relação ao veneno (ANOVA).
DISCUSSÃO
_____ Discussão 60
5 Discussão
A serpente jararacussu pertence ao gênero Bothrops sendo uma espécie de serpente
viperídica muito encontrada no sudeste do Brasil, sul da Bolívia, no leste do Paraguai e norte
da Argentina (CAMPBELL; LAMAR, 1989). O envenenamento pelas serpentes deste gênero
induzem um quadro fisiopatológico caracterizado por efeitos locais e sistêmicos, devido às
diferentes enzimas e toxinas presentes neste veneno (OWNBY et al., 1982; GUTIERREZ;
LOMONTE, 1995; TREBIEN; CALIXTO, 1989). Dentre estas enzimas estão as fosfolipases
A2, largamente presentes nos venenos das serpentes. Estas enzimas têm a habilidade de
causar rápida necrose das fibras do músculo esquelético, sendo portanto, reportadas como
PLA2 miotóxicas (HARRIS; CULLEN, 1990). Além disto, desde a descoberta das
fosfolipases A2 como enzimas-chave na liberação do ácido araquidônico, substrato para a
biosíntese de vários mediadores lipídicos da inflamação, como prostaglandinas e leucotrienos,
muito interesse foi demonstrado por esta família de enzimas no estudo da inflamação
(TEIXEIRA et al., 2003).
A picada pela serpente Bothrops jararacussu frequentemente produz um pronunciado
envenenamento local e sistêmico, sendo que as principais causas de óbitos estão relacionadas
aos efeitos sistêmicos, como choque, hemorragia sistêmica e falência renal (MILANI
JUNIOR et al., 1997). Embora a inflamação local seja uma característica proeminente do
envenenamento por picadas de serpentes viperidícas entre outras (DENNIS, 1994), os efeitos
locais não são neutralizados pelo uso do antiveneno convencional (CAMEY et al., 2002).
Em geral, em envenenamentos botrópicos observa-se no local da picada edema intenso
(ROSENFELD, 1971) e em picada de serpentes, o edema é o resultado da síntese de potentes
autacóides ou eicosanóides provocada por componentes enzimáticos do veneno, bem como
por danos na microcirculação com extravasamento do plasma e a liberação de citocinas
(NÚÑEZ et al., 2004). O estudo desta reação local no envenenamento reveste-se de
importância, visto que a formação do edema resulta em quadros álgicos por promover a
distenção dos tecidos adjacentes atingindo assim terminações nociceptivas aí presentes,
quando não promove a perda do membro afetado devido à síndrome compartimental em que o
quadro pode evoluir para necrose (ROSENFELD, 1971).
Nosso resultado, demonstrou que, em camundongos, o veneno de B. jararacussu na
dose de 0,1 mg/kg/i.pl., causou a formação do edema de forma dose-tempo dependente, com
_____ Discussão 61
resposta máxima em 1 hora. Este perfil temporal apresenta características análogas aos dados
obtidos por Pereira et al (2009) ao investigar a atividade edematogênica induzida pelo veneno
da B. jararacussu em camundongos, e também, outros autores obtiveram dados semelhante,
como Olivo et al (2007), que demonstraram a formação do edema podal máxima entre 30 min
e 1 hora após a administração do veneno de B. asper e B. jararaca, respectivamente. Também
as PLA2 administradas exógenamente podem gerar respostas inflamatórias locais, e esta
habilidade das PLA2s, foi reportada primeiramente por Brain e Whittle (1977), eles
mostraram que a PLA2s isoladas dos venenos de Vipera russelli e Crotalus durissus terrificus,
induzem edema de pata em ratos e liberação de histamina por mastócitos in vitro. De acordo
com Andrião-Escarso et al (2000), foram purificadas do veneno de Bothrops jararacussu, as
miotoxinas Bothropstoxin I (BthTX-I) e a Bothropstoxin II (BthTX-II). Desde que foram
isoladas do veneno de Bothrops jararacussu a BthTX-I e a BthTX-II têm sido intensamente
investigadas. Landucci et al (1998), mostraram que as PLA2 Lys 49 e Asp 49 (BthTX-I e
BthTX-II, respectivamente) isoladas do veneno de B. jararacussu induzem edema de pata e
de pele em ratos. No presente estudo, dados semelhantes foram obtidos, ao verificarmos que
as miotoxinas administradas na dose de 0,4 mg/kg/i.pl, causaram um proeminente efeito
edematogênico no músculo plantar de camundongos.
A permeabilidade vascular aumentada e o edema estão entre os eventos mais precoces
da resposta inflamatória, seguida pela infiltração dos leucócitos. Estes eventos são iniciados e
mantidos por uma sequência de mediadores inflamatórios de origem celular e plasmática
(VANE, 1993).
A infiltração de leucócitos para o foco inflamatório foi outro evento importante da
resposta inflamatória avaliada neste estudo. Na infiltração de leucócitos, leucócitos
circulantes – neutrófilos, linfócitos, monócitos e eosinófilos – migram, seletivamente e em
número significativo, para o tecido inflamado (ALBELDA et al., 1994). Nos estágios iniciais
de uma resposta inflamatória aguda, há acúmulo predominantemente de neutrófilos
(ISSEKUTZ; MOVAT, 1980). Estas células representam a primeira linha de defesa do
organismo e apresentam uma alta capacidade fagocitária e microbicida para a eliminação e/ou
neutralização do agente agressor. Os leucócitos mononucleares são observados na fase mais
tardia dessa resposta e em processos crônicos (ISSEKUTZ et al., 1981). A infiltração de
leucócitos polimorfonucleares (neutrófilos) em tecidos inflamados é um sinal da reação
inflamatória aguda e tambem reflete uma resposta imunológica primária a invasão de
patógenos (BEZERRA et al., 2007).
_____ Discussão 62
Para avaliar o influxo leucocitário induzido pelo veneno de B. jararacussu na dose de
0,2 mg/kg, fizemos uma cinética da migração de leucócitos onde houve avaliações nos
tempos 1, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração do veneno ou solução fisiológica
(controle). A curva temporal da migração celular mostrou que o veneno de B. jararacussu
causou aumento significativo da concentração de leucócitos na sexta hora, e estes dados são
semelhantes aos obtidos por Zamuner et al (2001), que ao estudar o influxo de leucócitos
induzido pelo veneno da B. asper e B.jararaca nessa mesma dose, verificaram que esses
venenos causaram aumento da concentração de leucócitos na sexta e na décima segunda hora,
respectivamente. Também Pereira et al (2009), demostraram que o veneno da B. jararacussu
causa influxo de leucócitos para a cavidade peritoneal de camundongos, com predomínio
dessas células na sexta hora, dados estes que corroboram com nosso resultado. Neste estudo,
também foi avaliado o influxo de leucócitos induzido pela BthTX-I e BthTX-II. As doses
utilizadas para as Bothropstoxina I (1,6 mg/Kg) e Bothropstoxina II (0,8 mg/Kg), bem como o
tempo de 6 horas para avaliação da migração celular foram baseados nos estudos de Zuliani et
al, 2005 (que mostrou um aumento da migração de leucócitos, causado pelas miotoxinas MT-
II e III, isoladas do veneno de B. asper, nestas doses). Nossos resultados demonstraram que
tanto a BthTX-I, destituída de atividade enzimática quanto a BthTX-II, enzimaticamente
ativa, foram capazes de induzir o influxo de leucócitos para o local de sua injeção. A literatura
documenta a presença de infiltrados de polimorfonucleares e mononucleares após a injeção de
PLA2 miotóxicas dos venenos de Bothrops nummifer (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989) e
Bothrops jararacussu (GUTIÉRREZ et al., 1991) em músculo esquelético de camundongos, e
após a administração intrapleural de miotoxinas similares, isoladas dos venenos de Bothrops
jararacussu e Bothrops pirajai (CASTRO et al., 2000). Desse modo, é possível sugerir que as
PLA2 presentes nesses venenos contribuam para tal efeito e que a BthTX-I e BthTX-II sejam
um fator relevante para o recrutamento leucocitário evocado pelo veneno de B. jararacussu.
O Laser de Baixa Potência (LBP) vêm ganhando espaço como alternativa de
tratamento antiinflamatório por oferecer vantagens à terapia medicamentosa devido aos
menores efeitos adversos produzidos por esta terapia física (ALBERTINI, 2006), e por ser
uma terapia efetiva na dor inflamatória e não inflamatória (KAMIKAWA, 1989;
HONMURA, 1992), não somente reduzindo o processo inflamatório, como também
melhorando a reparação tecidual de uma maneira mais eficiente do que o uso de corticóides
(BJORDAL et al., 2006). Embora a literatura descreva o efeito da terapia com LBP sobre
_____ Discussão 63
doenças inflamatórias, o seu mecanismo de ação antiinflamatória ainda é pouco explorado
(AL-WATBAN, 1999; CAMPANA et al., 1998; MIZUTANI et al., 2004).
Atualmente os LEDs (Light Emitting Diodes) estão sendo investigados na área
biológica como alternativa para terapias que utilizam LBP, tendo em vista o seu baixo custo,
praticidade e baixo consumo de energia (KARU, 2007; ANDRADE et al., 2001). Dessa
forma, neste trabalho, propusemos o tratamento de grupos de animais com o LBP e LED,
para avaliar o efeito destes na redução do processo inflamatório caracterizado pela formação
do edema podal e da migração leucocitária induzido pelo veneno de Bothrops jararacussu ou
suas miotoxinas, em camundongos.
Quando utilizamos o aparelho laser, temos de escolher o comprimento de onda e
ajustar alguns parâmetros para obter os efeitos fisiológicos desejados. Dos parâmetros que
descrevem o laser, o comprimento de onda é extremamente importante, pois é ele quem
define a profundidade de penetração no tecido alvo (FULLER, 1983). Segundo Basford
(1989); Yew; Ling; Chan (1982), a densidade de energia é o parâmetro mais importante, pois,
esta determina a energia entregue ao tecido biológico, uma vez que a resposta fisiológica é
dose-dependente. Neste estudo, o Laser utilizado foi o Arseneto de Gálio (Ga-As), na região
do vermelho (685 nm) com densidade de energia de 2,2 J/cm2 e os LEDs utilizados, um na
região do vermelho (635 nm) e o outro na região do infravermelho próximo (945 nm), ambos
com uma densidade de 4 J/cm2. A escolha destes parâmetros foram feitas com base na
literatura que mostra que a irradiação mais efetiva está na escala do vermelho e infravermelho
próximo ao espectro onde as fontes mais utilizadas são o laser de helio-neôneo (HeNe com
radiação até 632,8 nm), laser Galio-Alumíneo (Ga-Al – 630-685nm), laser Arseneto de helio-
neôneo (He-Ne-As – 780-870 nm) e o laser Arseneto de Galio (Ga-As – 904 nm), assim como
para o LED, onde a faixa de emissão se encontra em uma larga região do espectro (670 a 950
nm) (KARU, 2003). A principal razão para se utilizar diferentes irradiações na região do
vermelho e infravermelho próximo, está no fato de que a hemoglobina não absorve nesta
região e a luz pode penetrar profundamente no tecido (VLADIMIROV et al.; 2004). Na
literatura, encontramos diversos estudos prévios que descrevem diferentes densidades de
energia utilizadas em diferentes afecções, como exemplo, densidade de energia de 1 a 3 J/cm2
(efeito antiinflamatório) e de 2 a 4 J/cm2 (efeito antiálgico) (COLLS, 1984). Lopes-Martins et
al (2005), constataram que o LBP foi capaz de reduzir a migração de células inflamatórias
(neutrófilos) para o lavado pleural, quando os animais foram tratados com o LBP com
densidades de energia de 3, 7,5 e 10 J/cm2. Também no que diz respeito aos tempos da
_____ Discussão 64
aplicação da radiação LBP e LED, encontramos na literatura diferenças, como por exemplo,
Barbosa et al (2008), estudando o efeito do LBP na resposta inflamatória induzida pelo
veneno de B. jararacussu, aplicou a irradiação laser imediatamente, 1, 3 e 12 horas após a
administração do veneno e ainda Morais et al (2008), estudando o efeito antiinflamatório do
LBP e LED em osteoartrite induzida por zymosan em ratos, aplicou a irradiação laser e LED,
imediatamente, 1 e 2 horas após a administração do zymosan. Todos estes dados comprovam
que na laserterapia encontram-se ainda muitos parâmetros em fase de análise experimental
para a aplicação em cada afecção específica, justificando, assim, as densidades de energia e os
tempos de irradiação utilizados neste trabalho. Vale lembrar que, neste estudo, aplicamos a
irradiação laser e LEDs imediatamente, 1 e 3 horas após a administração do veneno bruto de
B. jararacussu, com base nos tempos encontrados na literatura. Posteriormente determinou-se
que seria aplicada a irradiação laser e LEDs nos tempos de 30 minutos e 3 horas após a
administração do veneno bruto ou miotoxinas isoladas do veneno da serpente B .jararacussu,
tendo em vista que, embora seja importante o atendimento precoce, dificilmente este ocorre
imediatamente à picada, devido a alguns fatores como a distância da zona rural (onde ocorre
o maior número de acidentes), que leva ao atendimento depois de um longo tempo da
ocorrência do mesmo e a dificuldade de acesso aos serviços de saúde (BRASIL.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001).
Para verificar se o LBP e os LEDs eram capazes de reduzir o edema no músculo
plantar de camundongos, avaliamos esse efeito no decorrer de 6 h após a injeção de B.
jararacussu ou miotoxinas, sendo que o pico do edema foi em 1 hora para ambos. Nossos
resultados demonstraram claramente que a radiação laser e LEDs nos parâmetros utilizados
diminuem significativamente o edema da primeira até a terceira hora da inflamação, quando
aplicados imediatamente, 1 e 3 horas após a administração do veneno, promovendo uma
redução do pico de formação de edema pelo veneno na ordem de 56% com o Laser 685 nm;
76% com o LED 945 nm (infravermelho) e 26% com o LED 635 nm (vermelho). Também
quando feita somente duas aplicações, houve significativa redução do edema no pico de
formação do edema pelo veneno na ordem de 39% com o Laser 685 nm; 41% com o LED 945
nm (infravermelho) e 46% com o LED 635 nm (vermelho). Honmura et al (1992), estudando
o modelo inflamatório de pata induzido por carragenina, mostraram um redução do edema de
20-30%, ao analisar o efeito terapêutico do LBP (AsGaAl). Em relação às miotoxinas, os
resultados da redução do edema também foram muito significativos sendo que, o LBP e os
LEDs apresentaram efeito antiinflamatório, causando redução do edema no pico de formação
_____ Discussão 65
do edema pela Bothropstoxina I (BthTX I), na ordem de 49, 54 e 67% , e para a
Bothropstoxina II (BthTX II), na ordem de 51, 61 e 58% para o Laser, LED infravermelho e
LED vermelho respectivamente. Barbosa et al (2010), investigou a capacidade da terapia laser
de reverter o efeito local ocasionada pelas miotoxinas (BthTX I e II) isoladas do veneno de B.
jararacussu e constatou que ambas as toxinas causaram um proeminente efeito
edematogênico no músculo gastrocnêmio de camundongos e que a terapia laser foi capaz de
reduzir este efeito, dados estes que corroboram com nossos resultados. Alguns autores
sugerem que os componentes celulares (fotorreceptores) podem absorver fótons fornecidos
através da energia do LBP e acelerar a produção do ATP, fornecendo assim, energia para a
célula modulando a resposta inflamatória (BREITBART et al., 1996; LUBART et al., 2005;
MANTEIFEL et al., 1997).
A prostaglandina E2 (PGE2) é um dos mediadores-chave da inflamação aguda e a
inibição desse mediador, através da inibição da COX-2, é amplamente usado como opção de
tratamento em diversos doenças inflamatórias (EGAN et al., 2002). De acordo com a
literatura, a terapia laser age reduzindo os níveis de PGE2 e a expressão de COX-2 (SHIMIZU
et al., 1995; CAMPANA et al., 1998). Ainda, Olivo et al., (2007) relataram que os venenos
de B. jararaca e B. asper causam a formação de edema podal e que este aumento é devido, ao
menos em parte, ao aumento da concentração de PGE2, via expressão de COX-2, no músculo
plantar. Ademais, o veneno de B. jararaca causa um aumento da concentração deste mediador
no peritôneo dos animais (MOREIRA et al., 2007). Neste sentido, avaliamos a capacidade do
laser e do LED de inibir a liberação de PGE2 causada pelo veneno e pelas miotoxinas. Nossos
resultados mostraram que o laser foi capaz de inibir a liberação de PGE2 somente no período
de 3 horas após a injeção de Bothropstoxina I. O tratamento com o laser e o LED causou
aumento desse mediador no período de 1 h quando o veneno e a Bothropstoxina I foram
injetados, nos demais períodos não houve diferença significativa entre os grupos estudados. É
possível que nos períodos iniciais da resposta inflamatória causada pelo veneno, o laser
causou um aumento de ATP e consequente aumento da produção de mediadores. Ainda, o
tratamento com o laser e LED foram capazes de inibir a migração de neutrófilos para o
peritônio. Pode ser, que as células responsáveis pela liberação de PGE2 sejam os neutrófilos,
e por esse motivo não conseguimos detectar esse mediador. A falta de inibição por parte do
laser e LED não exclui a possibilidade do laser e LED inibirem esse mediador quando
iniciado o tratamento em períodos mais precoces, vale lembrar que utilizamos o tratamento 30
minutos após a injeção do veneno, hipótese que necessita estudos adicionais.
_____ Discussão 66
Os efeitos do LBP e dos LEDs foram avaliados quanto à migração celular para a
cavidade peritoneal do camundongo. Nossos resultados demonstraram claramente que a
radiação laser e LEDs na mesma dosagem anteriormente utilizada, diminuem
significativamente a migração de leucócitos polimorfonucleares na sexta hora de inflamação,
quando aplicados 30 minutos e 3 horas após a administração do veneno no peritôneo de
camundongos na ordem de 88, 90 e 84% e no pico máximo de migração causado pela
Bothropstoxina I (BthTX I), na ordem de 54, 83 e 70% , e para a Bothropstoxina II (BthTX
II), na ordem de 55, 78 e 48% para o Laser 685 nm, LED 945 nm (infravermelho) e LED 635
nm (vermelho) respectivamente. Estes dados nos levam a sugerir que o Laser e os LEDs
inibem mais algum componente do veneno, além da miotoxinas, pois a redução do influxo
leucocitário pelo Laser e LED foi maior para o veneno bruto de B. jararacussu do que para
estas miotoxinas.
A migração de leucócitos da circulação para o tecido requer diferentes fatores, tais
como: moléculas de adesão, da família das selectinas, integrinas e imunoglobulinas. A
ativação e a ''up-regulação'' dos membros da família CD integrinas (CD 11/CD 18) são a
chave da ligação das moléculas de adesão intracelular (ICAM 1 e 2) na superfície das células
endoteliais (PETERS et al., 2006; MIZGERD et al., 1997), assim é possível que a eficácia da
terapia com o LBP sobre o modelo de inflamação aguda possa estar relacionada ao efeito do
laser sobre algum dos eventos relacionados as moléculas de adesão (ALBERTINI, 2006). Um
outro possível mecanismo de ação para o LBP sobre o processo inflamatório pode estar
relacionado à modulação no mecanismo de produção de citocinas inflamatórias liberados
pelas células já presentes no tecido e as que migram para o foco da lesão, essa hipótese ainda
requer estudos adicionais.
Portanto, os dados apresentados vêm reforçar o benefício que o LBP e LED oferecem
como terapia alternativa no tratamento do envenenamento botrópico.
CONCLUSÃO
_____ Conclusão 68
6 Conclusão
O veneno bruto de B. jararacussu e as miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II), nas doses
utilizadas, foram capazes de induzir uma intensa atividade edematogênica em pata de
camundongos.
O veneno e as miotoxinas (BthTX-I e BthTX-II) de B jararacussu , induziram
importante influxo de leucócitos para cavidade peritoneal de camundongos. Houve
predomínio de polimorfonucleares 6 horas após a injeção do veneno e das miotoxinas.
A radiação Laser e LEDs, nos parâmetros utilizados, promoveram redução do edema
podal induzida pelo veneno, e BthTX-I e II de forma significativa.
A radiação Laser e LEDs, promoveram a inibição da migração de leucócitos para a
cavidade peritoneal induzida pelo veneno e BthTX-I e II também de forma
significativa.
O laser e o LED não foram eficientes em inibirem a liberação de PGE2 induzida pelo
veneno ou miotoxinas.
REFERÊNCIAS
_____ Referências 70
Referências
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Certifiçamos que o Protocolo n."A*2&Í2SE'I/C!1F, sobre "Es'sssér da
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p*r tfat*s wei*ísxiftses tssísd&s ãesfe veÍesÉer" sob a responsabilidarle de Profa.
Dra. SÉeííe Regirs* ZazçEilner faí eprovado por esta Comissão ds Étiça em
Pesquisa por estar cle acordo com os Princípios Eticos seguindo as Dketrizes
Nacionais e Internacionais da pesquisa envolvendo animais.
Inf.ormamos que o pesquisador responsável por este Protocolo de Pesqi-iisa
deverá apresentar a este Comitê de Etíca um relatório das atividades
desenvalvidas no período de 12 meses a çontar dadatade sua aprovação.
São José dos Campos, 01 de setembro de20A7.
PR.OF EË,LA. R.EGINA ZAMUÏqER.
Preiideste do Comitê de Etica em Pesquisa
Universidade do Vale do Paraíba - Univap
Av.ShishimaHifimi,2gll-ÌJRBANOVL-CE?-12.2+14A0-PÁBX(12)39+7.ll2l-FÁX(I2)3917.1149- CaixaPstal 82- S-LCamPorsP