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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CRISTIANE DE OLIVEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O
MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA
CAMPINAS
2017
CRISTIANE DE OLIVEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE GENES DE SUSCETIBILIDADE HERDADA PARA O
MELANOMA CUTÂNEO POR GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual
de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Doutora em Ciências.
ORIENTADOR: PROFA. DRA.CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA CRISTIANE DE OLIVEIRA, E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
CRISTIANE DE OLIVEIRA
ORIENTADOR: PROFA. DRA. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
COORIENTADOR: PROF. DR. GUSTAVO JACOB LOURENÇO
MEMBROS:
1. PROF. DR. CARMEN SILVIA PASSOS LIMA
2. PROF. DR. ROGER CHAMMAS
3. PROF. DR. SÉRGIO VICENTE SERRANO
4. PROF. DR. CARMEN SILVIA BERTUZZO
5. PROF. DR. FÁBIO ROSSI TORRES
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 22 de fevereiro de 2017
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha amada família, pelo constante
apoio e compreensão em todos os momentos.
E aos pacientes que participaram da elaboração deste
trabalho, por doarem um pouco de si, em momento tão
delicado em suas vidas
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, pela orientação, apoio, amizade,
compreensão e profissionalismo, sem os quais eu não teria terminado minha dissertação.
Ao meu grande amigo e co-orientador Prof. Dr. Gustavo Jacob Lourenço pela amizade,
apoio e ajuda imensurável em todas as etapas desse trabalho, principalmente por me nortear
nas etapas mais difíceis.
Ao Dr. José Augusto Rinck Júnior, do ambulatório de Oncologia Clínica, e à Profa. Dra.
Aparecida Machado de Moraes, do ambulatório de Dermatologia do Hospital de Clínicas da
UNICAMP, pelo apoio e enorme ajuda na obtenção das amostras de pacientes.
À Maria Eugênia do Laboratório de Biociências do LNSBio do CNPEN pela paciência
e prontidão para me ajudar nos momentos delicados.
Ao Miguel e a Dra Maria Carolina do Laboratório de Pesquisa do Fleury pela ajuda e
gentileza em disponibilizar o uso da plataforma Affymetrix.
Ao Fábio Rossi do Laboratório de Genética Molecular da FCM pela ajuda, amizade e
compreensão nos momentos de grande dificuldade durante parte dos experimentos e no uso
do equipamento.
Ao Dr. Benilton Carvalho pela ajuda e competência com as análises de bioinformática.
À Stela, do Registro Hospitalar do Câncer, pela obtenção dos prontuários, a todos os
funcionários do ambulatório de Oncologia Clínica e de Dermatologia do Hospital de Clínicas
da UNICAMP, pela ajuda na coleta do sangue de pacientes.
Aos meus amigos Anderson, Raquel e Alessandro pela amizade, foram fundamentais no
desenvolvimento do meu trabalho, mesmo que distante.
Ao Laboratório de Genética do Câncer (LAGECA), por me proporcionar momentos
únicos e de grande aprendizado profissional e pessoal, um lugar que tenho um carinho enorme
que cuidei como se fosse a minha “primeira” casa e que já sinto saudades imensas.
À Leisa, Éricka e Angelo pela ajuda e pelos altos papos do dia-a-dia (científicos ou não)
que foram de grande valia no decorrer desse trabalho e no meu aprendizado.
Ao pessoal do LAGECA, Carla, Gabriela, Juliana, Gabriela Tortorelli, Vanessa, João
Pedro, Guilherme Rossi pela ajuda e coleguismo.
Ao João pelo companheirismo, carinho e atenção especial, pela insistência em me
mostrar o lado bom das coisas, por não me deixar desanimar e por me fazer acreditar que tudo
dará certo (basta respirar e acreditar!)
Aos meus pais, Lourdes e Luiz, alicerces da minha existência e formação, meu porto
seguro em todos os momentos; à minha avó Jovina, à minha irmã Elaine e ao meu cunhado
Mendes pelo amor e apoio incondicional sem os quais eu não teria chegado aqui.
A todos os pacientes, que diante de tantos problemas, aceitaram participar deste estudo,
doando um pouco de si e me permitindo mesmo que por alguns minutos ouvir e compartilhar
suas histórias de vida.
Às agências de fomento FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo) pela concessão de bolsa (nº 2012/16617-4) e auxílio pesquisa (nº 2012/1588-3), CNPq
(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo auxílio Pesquisa
Processo nº 479529/2012-4 e FAEPEX (Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão
pelo auxílio Pesquisa Processo 191/14.
A minha eterna gratidão a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram
para a realização, desenvolvimento e conclusão desse trabalho!
RESUMO
As associações de alterações genéticas herdadas, como polimorfismos gênicos de base única
(SNPs) com o risco de melanoma cutâneo (MC), com suas manifestações clinicopatológicas e
prognóstico de portadores do tumor não foram estabelecidas e, desta forma, estes foram os
objetivos do presente estudo. O DNA genômico de sangue periférico de 103 pacientes com
MC e de 103 controles foi analisado por meio de lâminas com microarranjos de DNA (SNPs).
As frequências de 12.994 SNPs foram distintas entre pacientes e controles; 6.814 SNPs
(52,4%) estiveram localizados em regiões regulatórias da transcrição do DNA (regiões 5’ e 3’
não traduzidas e intergênicas), 26 (0,2%) em regiões codificantes de aminoácidos, 6.042
(46,5%) em íntrons e 112 (0,9%) em regiões não identificadas. Dez SNPs localizados em
regiões regulatórias da expressão de genes, relacionados com a melanogênese, WNT8B c.-
101T>C (rs rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T
(rs2079162), ADCY3 c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085),
PRKCA c.205+407G>A (rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2
g.47384601A>G (rs11884600), CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF
c.938-325A>G (rs7623610), foram considerados de interesse para o estudo e foram utilizados
para a validação dos resultados obtidos na GELE por meio da reação em cadeia da polimerase
em tempo real com ensaios TaqMan® (Applied Biosystems®). Todos os SNPs isolados e em
combinações específicas de dois a dois alteraram o risco de ocorrência de MC. Os SNPs
ADCY3 c.675+9196T>G e MITF c.938-325A>G merecem destaque entre os demais. Os
genótipos isolados ADCY3 TT e MITF AA e o genótipo combinado TT+GG + AA+AG dos
SNPs estiveram associados a riscos 4,86, 3,13 e 19,17 vezes maiores de ocorrência de MC do
que os demais genótipos. Aos 60 meses de observação, os pacientes com o genótipo MITF
AA e com o genótipo combinado ADCY3 + MITF TT+AA apresentaram menor SLP (44,5%
versus 68,2%, P= 0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) e menor SG (67,7% versus 81,7%,
P= 0,009; 44,4% versus 72,5%, P= 0,006) do que os pacientes com os outros genótipos dos
genes (Estimativas de Kaplan-Meier). Pacientes com os repectivos genótipos estiveram sob
riscos 2,40 e 3,53 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e 2,85 e 3,84 vezes
maiores de apresentarem evolução para o óbito (análise univariada de Cox). Nossos resultados
indicam, pela primeira vez, que SNPs em genes de melanogênese podem contribuir para
identificar indivíduos com alto risco de MC e de pacientes com prognóstico desfavorável, que
mereçam maior atenção na prevenção, diagnóstico precoce ou terapêutica do tumor.
Palavras chave: Melanoma, Técnicas de genotipagem, Polimorfismo genético, Melaninas,
Análise de microarranjos
ABSTRACT
Combinations of inherited genetic alterations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) in
association with cutaneous melanoma (CM) risk, clinical manifestation and prognosis in patients have
not been clarified. Therefore, this was the aim of the present study. Genomic DNA was extracted of
the peripheral blood samples of 103 CM patients and 103 controls. Each sample was genotyped using
DNA high-resolution microarrays (Affymetrix® SNP 6.0). We observed 12.994 SNPs differentially
between patients and controls groups. Among them, 6.814 SNPs (52.4%) were located in regulatory
regions of DNA transcription (in 3’ and 5’ untranslated), 26 (0.2%) in coding sequence of amino acids
regions, 6.042 (46.5%) in introns and 112 (0.9%) unidentified regions. Ten SNPs, located in
regulatory regions of gene associated with melanogenesis pathway, WNT8B c.-101T>C (rs
rs3793772), KIT c.67+12766T>C (rs rs2017472), GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), ADCY3
c.675+9196T>G (rs11900505), PLCB1 g.8908966C>A (rs4295085), PRKCA c.205+407G>A
(rs12601850), PRKCA c.288+33994A>G (rs1806448), CALM2 g.47384601A>G (rs11884600),
CREB1 c.303+373G>A (rs10932201) e MITF c.938-325A>G (rs7623610), were considered of interest
for the study and validated by polymerase chain reaction in real time using TaqMan assays (Applied
Biosystems®). All SNPs isolated and combined alter the risk for CM. SNPs ADCY3 c.675+9196T>G
and MITF c.938-325A>G deserves highlight. The isolated genotypes ADCY3 TT and MITF AA and
TT+GG + AA+AG combined were associated with 4,86, 3,13 and 19,17-fold increased risk for CM.
During 60 months of observation, patients with MITF AA genotypes and ADCY3 + MITF TT+AA
combined genotypes were associated with poor progression free survival (44,5% versus 68,2%, P=
0,007; 22,2% versus 61,3%, P= 0,006) and lower overall survival (67,7% versus 81,7%, P= 0,009;
44,4% versus 72,5%, P= 0,006) than the patients with others genotypes (Kaplan-Meier estimates).
Carriers of the same genotypes had 2,40 and 3,53 more chances of disease progression and 2,85 and
3,84 more chances to evolve to death, respectively (Cox univariate). Our results suggest, for the first
time, that SNPs related in melanogenesis pathway may contributed for identify people with high risk
for CM and patients with poor prognosis, that need to receive more attention on preventing, early
diagnosis or treatment.
Key words: Melanoma, Genotyping techniques, Polymorphism, Genetic, Melanins, Microarray
analysis
Lista de Figuras
Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas
camadas da pele e critérios previamente definidos para as espessuras
de Breslow e os níveis de Clark
23
Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância, média e
baixa associados com maior predisposição ao melanoma cutâneo
31
Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma
cutâneo e controles
39
Figura 4. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma
cutâneo e controles
40
Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide
Human SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de
pacientes com melanoma cutâneo e controles
43
Figura 6. Imagem padrão gerada pela excitação dos fluoróforos contidos em
lâmina de um indivíduo controle capturada por scanner para a
genotipagem em larga escala
50
Figura 7. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-
Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios clínicos
90
Figura 8. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
91
Figura 9. Sobrevida livre de progressão e sobrevida global, estimadas pelo
método de Kaplan-Meier, de pacientes com melanoma cutâneo
estratificados por genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G
94
Figura 10. Sobrevida livre de progressão, estimadas pelo método de Kaplan-
Meier, de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por
genótipos combinados dos polimorfismos ADCY3 e MITF, GNAI1 e
PLCB1, GNAI1 e MITF e CALM e MITF
97
Figura 11. Sobrevida global, estimadas pelo método de Kaplan-Meier, de
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos
combinados dos polimorfismos KIT e MITF e ADCY3 e MITF
98
Figura 12. Representação esquemática da via da melanogênese de acordo com as
funções conhecidas ou presumidas das proteínas codificadas pelos
genes polimórficos identificados neste estudo
115
Lista de Tabelas
Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com risco de melanoma
cutâneo em estudos de genotipagem em larga escala
30
Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em
lâminas por fluoróforos para a genotipagem em larga escala
42
Tabela 3. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo e controles de
acordo com a idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cor dos
cabelos, presença de sardas, presença de nevos e exposição solar
48
Tabela 4. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a
localização do tumor, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios
clínicos do tumor
49
Tabela 5. Regiões do DNA que albergam os polimorfimos com frequências
genotípicas distintas em pacientes com melanoma cutâneo e controles
51
Tabela 6. Distribuições dos dez polimorfismos gênicos localizados em genes
relacionados com a melanogênese
52
Tabela 7. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT,
GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF,
identificados por genotipagem em larga escala e reação em cadeia da
polimerase em tempo real, em pacientes com melanoma cutâneo e
controles
53
Tabela 8. Teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg dos dez polimorfismos gênicos
selecionados em pacientes com melanoma cutâneo e controles
55
Tabela 9. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos
polimorfismos WNT8B c.-101T>C e KIT C.67+12766T>C em pacientes
com melanoma cutâneo e controles
56
Tabela 10. Distribuições dos alelos selvagem e variante dos polimorfismos GNAI1
g.80130766C>T e ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com
melanoma cutâneo e controles
57
Tabela 11. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos
polimorfismos PLCB1 g.8908966C>A e PRKCA c.205+407G>A em
pacientes com melanoma cutâneo e controles
59
Tabela 12. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos
polimorfismos PRKCA c.288+33994A>G e CALM2 g.47384601A>G
em pacientes com melanoma cutâneo e controles
60
Tabela 13. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos
polimorfismos CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em
pacientes com melanoma cutâneo e controles
61
Tabela 14. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT,
GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados
dois a dois, em pacientes melanoma cutâneo e controles
63
Tabela 15. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
66
Tabela 16. Distribuições dos genótipos do polimorfismo no gene KIT
C.67+12766T>C em pacientes com melanoma cutâneo estratificados
por idade mediana, sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de
efélides, presença de nevos e exposição solar
67
Tabela 17. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
68
Tabela 18. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
69
Tabela 19. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
70
Tabela 20. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
71
Tabela 21. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
72
Tabela 22. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
73
Tabela 23. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
74
Tabela 24. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de
nevos e exposição solar
75
Tabela 25. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos nos genes
WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1,
MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
estratificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos
e presença de efélides e nevos
77
Tabela 26. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
79
Tabela 27. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT C.67+12766T>C em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
80
Tabela 28. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
81
Tabela 29. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
82
Tabela 30. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
83
Tabela 31. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
84
Tabela 32. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
85
Tabela 33. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
86
Tabela 34. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A
em pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
87
Tabela 35. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
88
Tabela 36. Distribuições diferenciadas dos genótipos de polimorfismos nos genes,
WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3, PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1,
MITF, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
estratificados por localização, espessuras de Breslow, níveis de Clark e
estágios do tumor
89
Tabela 37. Impacto de aspectos clínicos de pacientes e biológicos do tumor na
sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com
melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
92
Tabela 38. Impacto de polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3 e
PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1 e MITF na sobrevida livre de
progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo na
análise univariada de Cox
95
Tabela 39. Associação dos polimorfismos nos genes WNT8B, KIT, GNAI1, ADCY3,
PLCB1, PRKCA, CALM2, CREB1, MITF, combinados dois a dois, na
sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com
melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
99
Tabela 40.
Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos
da via da melanogênese isolados no risco de ocorrência, nos aspectos
clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo
100
Tabela 41. Resumos dos principais resultados de associação dos dez polimorfismos
da via da melanogênese combinados no risco de ocorrência, nos
aspectos clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma
cutâneo
101
Lista de Abreviaturas
ADCY3 Adenilato ciclase tipo 3
AJCC American Joint Committee on Cancer
BRAF Protoncogene B-RAF
BSA Albumina bovina sérica
CALM2 Calmodulina 2
cAMP AMP ciclíco
CDKN2A Gene inibidor de ciclina dependente de quinase
CQ Controle de qualidade
CREB1 Elemento de ligação 1 de AMPc
crlmm Algoritmo corrected robust linear model with maximum likelihood
classification
CT Tumografia computadorizada
DAVID Database for annotation, visualization and integrated discovery
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etilenodiamino tetracético
GELE Genotipagem em larga escala
GNAI1 Proteína G sub unidade alfa i1
HCl Ácido clorídrico
kDA Kilodaltons
KIT Proto oncogene receptor de tirosina quinase
M Molar
MC Melanoma cutâneo
MC1R Receptor de melanocortina
MES Ácido 4-morpholineethanesulfonic
mg Miligrama
MITF Fator de transcrição associado a microftalmia
ml Mililitro
mM Mili molar
n Número de indivíduos
N Número total de indivíduos
ng Nanograma
OCR Oligo control reagent
OR Risco de ocorrência
PA Poder da análise
Pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase
PLCB1 Fosfolipase tipo 1 beta
PRKCA Proteina quinase C alfa
RAS Oncogene RAS
RCF Força centrífuga relativa
RFLP RFLP
RNA Ácido ribonucléico
RR Risco relativo
rs Número de referência do SNP
RT Tempo real
SG Sobrevida global
SLP Sobrevida livre de progressão
SNP Polimorfismo de troca de base única
TdT Enzima terminal deoxynucleotidyl transferase
TE Tampão Tris EDTA
U Unidades
UV Raios ultravioleta
Wnt8B Proteína transmembrana wingless 8 beta
α-MSH Alfa hormônio estimulante de melanócito
μl Microlitro
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................... 08
ABSTRACT............................................................................................................ 09
INTRODUÇÃO...................................................................................................... 21
1. Considerações gerais ...................................................................................... 21
2. Aspectos clínico patológicos .......................................................................... 22
3. Aspectos ambientais e constitucionais ........................................................... 24
4. Aspectos genéticos ......................................................................................... 25
5. Justificativa do estudo .................................................................................... 31
OBJETIVOS .......................................................................................................... 33
PACIENTES E MÉTODOS ................................................................................. 34
1. Avaliação clínica ............................................................................................ 34
2. Terapêutica ..................................................................................................... 35
3. Genotipagem em larga escala ......................................................................... 35
4. Genotipagem dos polimorfismos gênicos ..................................................... 44
5. Análise estatística da genotipagem em larga escala ....................................... 44
6. Seleção dos polimorfismos gênicos .............................................................. 45
7. Validação dos resultados ............................................................................... 45
8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos ... 46
9. Aspectos éticos ............................................................................................... 46
RESULTADOS ..................................................................................................... 47
1. Avaliação clínica ............................................................................................ 47
2. Aspectos do tumor ......................................................................................... 49
3. Terapêutica dos pacientes .............................................................................. 50
4. Determinação dos polimorfismos gênicos .................................................... 50
5. Identificação dos polimorfismos gênicos por genotipagem em larga escala 51
6. Seleção dos polimorfismos gênicos ............................................................... 51
7. Validação dos resultados ................................................................................ 52
8. Polimorfismos em genes da via da melanogênese em pacientes e controles 54
9. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos clínicos de pacientes 65
10. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos do tumor de
paciente.
78
11. Polimorfismos em via da melanogênese e prognóstico dos pacientes ......... 89
12. Resumo dos resultados ................................................................................. 100
DISCUSSÃO .......................................................................................................... 103
CONCLUSÕES ..................................................................................................... 114
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 115
ANEXOS ................................................................................................................ 129
21
INTRODUÇÃO
1. Considerações gerais
O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações
genéticas que se acumulam progressivamente no material genético (DNA) de uma célula
normal (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Dessa forma, o câncer é uma doença genética e a
identificação e a caracterização dos genes alterados são fundamentais para a compreensão
da sua fisiopatologia (Wunsch Filho & Gattás, 2001). Além disso, o aumento da
expectativa de vida, a urbanização e a globalização são alguns dos fatores que podem
explicar aumento de novos casos de câncer no mundo (GLOBOCAN, 2012).
O melanoma cutâneo (MC) é um tumor de baixa incidência (corresponde a 5% dos
tumores de pele) mas de alta letalidade devido ao alto potencial metastático (corresponde a
60% das mortes causadas por esta neoplasia) (Instituto Nacional do Câncer, 2016). O MC
resulta da transformação maligna dos melanócitos cutâneos, que são células responsáveis
pela produção da melanina, pigmento protetor natural da pele, e que estão localizados na
camada basal da epiderme (Slingluff et al., 2011).
A incidência do MC dobrou nas últimas décadas e aumentou rapidamente em
comparação à de outros tipos de cânceres (American Cancer Society, 2011). O aumento da
incidência da doença foi observado em países com população de pele clara como a
Austrália, a Nova Zelândia, os Estados Unidos da América (EUA), o Canadá, e a Europa
central e norte (Jemal et al., 2011; Godar, 2011). Além disso, esse aumento também foi
observado na população do Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016).
Estima-se que anualmente, ocorram cerca de 232 mil novos casos desse tumor no
mundo, com cerca de 55 mil óbitos (GLOBOCAN, 2012). Foi estimado para o ano de
2015, nos EUA, a ocorrência de 74 mil casos novos de MC (43 mil homens e 31 mil
mulheres) com cerca de 10 mil mortes (6.700 homens e 3.300 mulheres). O tumor acomete
preferencialmente indivíduos caucasianos, com proporções de 1:40 em brancos, 1:200 em
hispânicos e 1:1.000 em negros (American Cancer Society, 2011). Estima-se a ocorrência
de 5.670 casos novos de MC no Brasil nos anos de 2016 e 2017 (Instituto Nacional do
Câncer, 2016).
O MC é considerado um grave problema de saúde pública na maioria dos países do
mundo, incluindo o Brasil (Instituto Nacional do Câncer, 2016). A magnitude do problema
encontra-se no diagnóstico da doença em fases avançadas e, muitas vezes, com metástases,
especialmente em indivíduos de classes sócio-econômicas menos privilegiadas, quando o
tratamento é pouco efetivo e as chances de cura são mínimas (Livingstone et al., 2012).
22
2. Aspectos clínicopatológicos
O MC acomete predominantemente indivíduos com pele, cabelos e olhos claros,
com incapacidade de bronzeamento, presença de efélides e nevos atípicos (Leiter et al.,
2014). Portadores da síndrome xeroderma pigmentoso, caracterizada pela deficiência
herdada de reparo de lesões de DNA, apresentam elevada fotossensibilidade nas regiões
expostas à luz solar, tendo o câncer de pele, incluindo o MC, como consequência (Leiter et
al., 2014).
A incidência do MC aumenta com o passar dos anos, sendo 50 anos a mediana de
idade ao diagnóstico (Jemal et al., 2004; Leiter et al., 2014).
O MC usualmente se apresenta como uma lesão de pele com algumas das seguintes
características: assimetria, bordas irregulares, variações de cor e aumento ou regressão de
tamanho ao longo do tempo (Giorgi et al., 2012). Em homens caucasianos, os locais mais
acometidos de melanoma são o dorso e os membros superiores, em mulheres caucasianas,
o dorso e os membros inferiores são os locais de maior exposição solar (Caini et al., 2009).
O diagnóstico do MC é realizado com a exérese da lesão e a avaliação histológica
de fragmentos tumorais incluídos em parafina (Slingluff JR et al., 2011).
O crescimento vertical da lesão é o principal fator prognóstico para os portadores
de MC, quanto mais o tumor se aprofunda nas camadas da pele, pior é o prognóstico
(Balch et al., 2009; Mrazek & Chao, 2014). A espessura de Breslow, que corresponde à
profundidade de infiltração do tumor na pele (Breslow, 1970) e o nível de Clark, que
corresponde ao comprometimento das camadas cutâneas pelo tumor (Clark et al., 1969),
são utilizados na rotina para avaliar o crecimento vertical da lesão.
São cinco os níveis de Clark: no nível I, as células tumorais estão confinadas à
epiderme; no nível II, o tumor invade a derme papilar, atravessando a membrana basal;
nível III, o tumor preenche a derme papilar e estende-se entre a derme papilar e reticular;
no nível IV, o tumor invade a derme reticular e nível V, o tumor invade o tecido
subcutâneo (Clark et al., 1969). São quatro as espessuras de Breslow: menor do que 0,75
mm, entre 0,76 e 1,5 mm, entre 1,51 e 4 mm e maior do que 4 mm de infiltração da pele
(Breslow, 1975). Os níveis de Clark e os índices de Breslow são considerados fatores
isolados de maior impacto no prognóstico dos pacientes com o tumor (Spatz et al., 2010)
(Figura 1). A sobrevida global (SG) dos pacientes em cinco anos de acordo com o nível de
Clark II, III, IV e V corresponde a 100%, 93%, 89% e 82%, e a sobrevida livre de doença
(SLD) corresponde a 85%, 88%, 77% e 55%, respectivamente. A SG em cinco anos dos
23
pacientes com tumores com Breslow menor ou igual a 1,0 mm, entre 1,01 a 2,00 mm, 2,01
a 4,00 mm e maior que 4,0 mm correspondem a 97%, 94%, 86% e 78%, respectivamente, e
a SLD corresponde a 94%, 87%, 72% e 62%, respectivamente (Elsaeber et al., 2012). A
ulceração é um fator prognóstico importante para portadores do tumor. A frequência de
ulceração aumenta conforme a espessura do tumor: em melanomas finos é de apenas 6% e
em espessos pode chegar a 63%. A SG em cinco anos para pacientes com tumor ulcerado é
de cerca de 66% e para aqueles com tumor sem ulceração é de cerca de 92% (Mervic,
2012). O envolvimento linfonodal também constituiu fator prognóstico para portadores do
tumor, tendo influência tanto o número de linfonodos envolvidos como a forma de invasão
dos mesmos, micro ou macroscópica (Paxton et al., 2011). Apenas 54% dos casos com
comprometimento linfonodal pelo tumor sobrevivem por cinco anos (Elsaeber et al.,
2012).
Figura 1. Representação esquemática da infiltração do melanoma cutâneo nas camadas
da pele e critérios previamente definidos para as espessuras de Breslow e os
níveis de Clark
O sistema de estagiamento do MC é o TNM, determinado por critérios do American
Joint Committee on Cancer (AJCC). O sistema considera a extensão do tumor na pele e
tecidos adjacentes (T) com a presença ou não de ulceração no tumor (a, b) e a identificação
de metástases linfonodais (N) ou à distância (M). Dez estágios do tumor são identificados
(0, Ia, Ib, IIa, IIb, IIc, IIIa, IIIb, IIIc e IV) (Balch et al., 2009; Boland et al., 2016).
A única terapêutica curativa para pacientes com o MC até o momento é a remoção
cirúrgica da lesão com margens livres de tumor; a quimioterapia, a radioterapia e a
24
imunoterapia atuam como tratamento complementares ao cirúrgico (Testori et al., 2009;
Livingstone et al., 2012; Hamid et al., 2013). Medicamentos alvo específicos, como o
vemurafenibe e o mesilato de imatinibe têm indicação precisa para pacientes com
mutações no gene BRAF (Chapman et al., 2011) e no gene cKIT (Carvajal et al., 2011),
respectivamente. Outros medicamentos que merecem destaque, na atualidade, são aqueles
que estimulam o sistema imunológico, como o anti-CTLA4 ipilimumabe (Fellner, 2012) e
os antiPD1 nivolumabe isolado (Robert et al., 2015) ou associado a pembrolizumabe
(Ascierto e Marincola, 2015), para que este reconheça o tumor como algo a ser combatido
3. Aspectos ambientais e constitucionais
O MC é um tumor heterogêneo, determinado pela interação entre fatores ambientais
e genéticos. O principal fator de risco é a exposição solar aos raios ultravioleta A (UVA),
B (UVB) e C (UVC) (Gandini et al., 2011). Os raios UV na pele induzem dano genético às
células (Thompson et al., 2005). A radiação UVA corresponde a mais de 90% da radiação
solar e causa dano indireto ao DNA por meio da formação de espécies reativas de oxigênio
(ERO) com quebras na dupla fita (Svobodova et al., 2011; Mouret et al., 2012).
As radiações UVB e UVC alteram diretamente a estrutura do DNA pela formação
de dímeros de ciclobutano pirimidina e fotoprodutos de pirimidina-pirimidona (Svobodova
et al., 2011). A exposição consistente ao sol, principalmente na infância, e as queimaduras
solares em qualquer fase da vida estão associadas com maior risco de desenvolvimento do
MC.
Estima-se que 65% dos tumores estão relacionados à exposição solar de alguma forma,
seja crônica ou intermitente (Armstrong et al., 1993).
Outro fator de risco para o tumor é o fototipo cutâneo, que considera a coloração da
pele e o tipo de reação diante da exposição ao sol. Fitzpatrick (1975 e 1988) descreveu seis
fototipos cutâneos: I, pele branca, muito sensível ao sol, que nunca brônzeia; II, pele
branca sujeita a bronzeado; III, pele morena clara; IV, pele morena moderada; V, pele
morena escura e VI, pele negra. Indivíduos com o fototipo I têm risco 2,27 vezes maior de
desenvolver o MC, enquanto que os com o fototipo II e III têm riscos de 1,99 vezes e 1,35
vezes, respectivamente (Gandini et al., 2005). Outros fatores constitucionais, como cabelos
ruivos (risco 2,6 vezes maior) e loiros (risco 2,0 vezes maior) (Lotze et al., 2001), olhos
azuis (risco 1,6 vezes maior) e verdes (risco 1,5 vezes maior) (Gandini et al., 2005), a
presença de sardas (risco 2,0 vezes maior) (Grulich et al., 2007) e nevos congênitos
25
melanocíticos e displásicos (risco 6,4 vezes maior) (Ernst et al., 2014) foram também
associados à ocorrência do tumor.
A proteção contra a radiação UV é feita pela melanina que previne danos ao DNA,
pela absorção e espalhamento da radiação. A formação de fotoprodutos estimula a
produção do alfa-hormônio estimulante de melanócito (α-MSH), que se liga ao receptor de
melanocortina 1 (MC1R) nos melanócitos, com consequente aumento na produção de
melanina. Esse hormônio induz o aumento da concentração de AMP cíclico (cAMP) nos
melanócitos, que ativa a proteína quinase A (PKA), que desencadeia o aumento da
expressão do fator de transcrição associado a microftalmia (MITF) (Prusis et al., 1997). O
gene MITF é crucial na regulação de proliferação e síntese de melanina em melanócitos
(Moan et al., 2014) e anormalidades nestes processos foram associados com o surgimento
do MC (Hartman & Czyz, 2015).
4. Aspectos genéticos
O conceito para o risco genético de MC é dinâmico e multifacetado devido à
heterogeneidade do tumor.
Anormalidades em genes específicos relacionados com a origem do MC incluem,
predominantemente, as mutações gênicas (Zhang et al., 2016; Read et al., 2016).
As mutações gênicas são mudanças na sequência do DNA dos genomas nucleares e
mitocondriais, variando desde uma pequena mudança, como em um único nucleotídeo, até
alterações que podem afetar milhões de pares de base. Quando uma variante é tão comum
que é encontrada em mais de 1% de cromossomo na população geral, a variante consitui o
que é conhecido como polimorfismo genético. Em contrapartida, os alelos com frequência
menor que 1% são, por convenção, chamado de variantes raras. Embora muitos tipos de
mutações deletérias sejam variantes raras, não há uma simples correlação entre frequência
de alelos e o efeito do alelo sobre a saúde. Muitas variantes raras parecem não ter efeitos
deletérios, enquanto algumas variantes bastante comuns para serem polimórficas são
conhecidas por predisporem a sérias doenças (Nussbaum, 2008).
Há vários tipos de polimorfismos que podem ser devidos a variantes que consistem
em deleções, duplicações, triplicações e assim por diante de centenas de milhões de pares
de bases de DNA, e não estão associados a qualquer fenótipo de doença conhecida; outras
alterações de grandeza semelhante são variantes raras que claramente causam sérias
doenças.
26
Os mais simples e mais comuns de todos os polimorfismos são os polimorfismos de
troca de base única, denominado de single nucleotide polymorphisms (SNPs). Os SNPs
possuem dois alelos correspondendo a duas diferentes bases que ocupam uma localização
em particular no genoma (Nussbaum, 2008).
Os SNPs alteram tanto aspectos físicos, como a cor da pele, olhos e cabelos, o
desenvolvimento de efélides e nevos, como aspectos metabólicos, incluindo o controle do
ciclo celular, o reparo de DNA, a apoptose, a angiogênese, a capacidade de metabolizar
carcinógenos e a síntese de melanina (Seal et al., 2014).
A avaliação de SNPs em pacientes com MC e controles por métodos
convencionais, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão
enzimática (RFLP), constitui uma avaliação lenta e trabalhosa, por possibilitar a avaliação
de pequeno número de variações genéticas em um estudo (Ward et al., 2012).
Com a conclusão do Projeto Genoma Humano (www.genome.gov), que possibitou
o mapeamento genético, e o início do Projeto Internacional HapMap, que identificou
variantes genéticas entre as pessoas (www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov), os pesquisadores
puderam desfrutar de um conjunto de ferramentas como banco de dados de sequências do
genoma humano do projeto denominado Ensembl (Herrero et al., 2016), catálogos de
variações genéticas, como o GenBank (Banson et al., 2013) e um conjunto de novas
tecnologias de alto rendimento de genotipagem disponibilizadas pelas empresas Affymetrix
e Illumina que possibilitaram a investigação dessas variantes em diferentes populações.
Diante desse cenário, foi descrito o método de genotipagem em larga escala
(GELE), que permitiu analisar centenas ou milhares de SNPs com rapidez e confiabilidade
em estudo único. O método tem como base a análise de microarranjos de DNA de cada
indivíduo separadamente (Mao et al., 2007; Xing et al., 2008). Com isso, estudos de
associação do genoma completo permitiram a descoberta de novos marcadores genéticos
associados com doenças, incluindo tumores (Waddell et al., 2008).
Além de mutações, a interação de múltiplos eventos genéticos e epigenéticos foram
descritos como responsáveis pelo surgimento e agressividade do tumor (Slingluff JR et al.,
2011).
Mutações em genes associados com o MC foram classificados como de alta, média
e baixa penetrância, considerando a probabilidade de portadores de anormalidades
genéticas desenvolverem o tumor ao longo do tempo (Read et al., 2016).
27
4.1. Genes de alta penetrância
Mutações genéticas podem provocar grandes mudanças na função de um gene,
podendo ocasionar a inativação do gene. Quando uma mutação hereditária tem um grande
efeito na função de um gene a ponto de causar uma doença ou uma alteração perceptível na
maioria das pessoas que as têm, essa mutação é chamada de alta penetrância (Read et al.,
2016).
Genes de alta penetrância estão relacionados com a ocorrência de melanoma
hereditário, particularmente em oncogenes ou supressores tumorais, desenvolvem em idade
precoce e acometem parentes de primeiro grau (Read et al., 2016).
O gene CDKN2A está localizado no cromossomo 9p21 é um gene supressor de
tumor responsável por codificar a proteína p16 (Gray-Schopfer et al., 2007). A p16 é
considerada inibidora específica das quinases dependentes de ciclina (CDK), CDK4 e
CDK6, sendo estas as principais CDKs que se ligam às ciclinas D, colaborando no controle
da transição da fase G1 para S (Gray-Schopfer et al., 2007). Deleções ou mutações
pontuais no gene CDKN2A foram identificadas em linhagens celulares de melanoma,
indicando a importância desse gene no desenvolvimento do tumor, inibindo o ciclo celular
ou permitindo o acúmulo de danos no DNA e induzindo a proliferação celular (Goldstein
et al., 2008). Aproximadamente 20 a 40% das mutações no gene CDKN2A estão
implicadas no risco do melanoma hereditário, e as frequências dessas mutações são
variáveis em diferentes populações étnicas (Barrett et al., 2015). Mutações no gene CDK4,
localizado no cromossomo 12q14, impactam na mesma via de atuação do gene CDKN2A,
determinando efeito oncogênico no controle do ciclo celular (Puntervoll et al., 2013)
4.2. Genes de média penetrância
Algumas mutações hereditárias não parecem afetar a função dos genes e muitas
vezes não provocam alterações evidentes. Essas mutações são chamadas de média e baixa
penetrância, dependo da sua frequência de ocorrência e o risco relativo associado. Essas
mutações, podem afetar o risco de câncer através de efeitos sutis em determinados
mecanismos, além de interagir com outros fatores de risco para doença (Read et al., 2016).
SNPs em genes de média penetrância são prevalentes na população em geral, mas
não conduzem ao desenvolvimento de MC de forma isolada. No entanto, a interação de
vários SNPs pode aumentar o risco de ocorrência do tumor (Read et al., 2016).
28
Dois genes de média penetrância, o MC1R, e o MITF, relacionados com o processo
de pigmentação da pele, foram associados com maior risco de MC (Read et al., 2016).
O gene melanocortin receptor gene (MC1R), codifica uma proteína receptora que
tem como principal ligante o hormônio alfa estimulante de melanócitos (α-MSH). O α-
MSH se liga ao receptor MC1R, que ativa as proteínas adenilatos ciclases, com
consequente aumento dos níveis intracelulares de monofosfato cíclico de adenosina
cíclicos (AMPc) (Read et al., 2016). O aumento do AMPc ativa a via de sinalização do
gene MITF, que codifica um fator de transcrição associado à microftalmia, e proteínas
tirosinases, que promovem a proliferação de melanócitos e a síntese do pigmento
eumelanina (preto/marrom) em melanócitos (Beaumont et al., 2007). Existe um balanço na
síntese dos tipos de melanina eumelanina (coloração preto/marrom) e feomelanina
(coloração vermelho/amarelo) (Read et al., 2016). O aumento da síntese de eumelanina,
que possui efeito protetor dos raios UV, inibe a síntese do pigmento feomelania que é
pouco efetivo na proteção dos raios UV. O tipo e a quantidade de pigmento a ser
sintetizado determina o fenótipo da pele (cor e sensibilidade ao sol), dos cabelos e dos
olhos (Read et al., 2016). O MC1R é altamente polimórfico. Variações nesse gene foram
associados com redução da capacidade de ligação do α-MSH, causando a redução dos
níveis de AMPc e aumento da síntese de feomelanina e foram também associadas ao
fenótipo ruivo (Beaumont et al., 2007).
O gene MITF, codifica um fator de transcrição que tem como principal função a
regulação da síntese de melanina e o desenvolvimento e a diferenciação dos melanócitos
(Ploper & Robertis, 2015). Esse gene é polimórfico e encontra-se hiperexpresso em 20%
dos MC, particularmente em tumores metastáticos, e esteve associado também com pior
sobrevida global (Hartman & Czyz, 2015).
4.3. Genes de baixa penetrância
Os genes de baixa penetrância seguem as mesmas definições dos genes de média
penetrância, alterando somente as frequências e o risco relativo dessas variantes genéticas
na ocorrência da doença (Read et al., 2016).
Associações de inúmeros genes de baixa penetrância como MC foram identificadas
na meta-análise conduzida por Law et al. (2015). Onze estudos conduzidos por GELE em
MC e controles saudáveis foram incluídos na meta-análise, sendo que sete foram
previamente publicados (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009, Amos et al., 2011; Barrett et
al., 2011; McGregor et al., 2011; Iles et al., 2013; Law et al., 2015) e cinco ainda não
29
foram publicados. Foram avaliados 15.990 casos de MC e 26.409 controles da Europa,
Austrália e EUA. Esse estudo faz parte do GENOMEL, um consórcio sem fins lucrativos
de grupos de pesquisa de todo o mundo e que tem como objetivos a identificação de genes
associados com aumento do risco de MC e a interação entre genes e ambiente na
ocorrência do tumor (http://www.biogenomel.eu) (Law et al., 2015).
Foram identificados na meta-análise, loci de genes relacionados com o processo de
pigmentação, síntese de melanina, reparo de DNA, manutenção dos telômeros e outros
mecanismos desconhecidos em associação com o risco de MC ou de suas manifestações
clinicopatológicas (Tabela 1).
SNPs nos genes TERT e OBFC1, relacionados com comprimento do telômero,
estiveram associados a risco de MC (Barret et al., 2011; Law et al., 2015). Os genes Agouti
signalling protein (ASIP), Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) e
Oculocutaneous albinism type II (OCA2) estão envolvidos com o mecanismo de
pigmentação; o gene ASIP codifica um antagonista do hormônio α-MSH que
competitivamente se liga ao receptor MC1R, bloqueando a síntese de eumelanina (Bishop
et al., 2009; Nan et al., 2009; Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes ASIP e
MC1R foram associados com o fenótipo ruivo, presença de sardas e risco de MC (Bishop
et al., 2009). A proteína codificada pelo gene TYR influencia na síntese de eumelanina para
feomelanina; SNPs nos genes TYR e TYRP1 foram associados com o fenótipo de olhos
claros, pele sensível ao sol e risco de MC (Bishop et al., 2009; Nan et al., 2009). SNPs
localizado nos genes HERC2 ou OCA2, com papéis na pigmentação cutânea, estiveram
associados a risco de MC (Amos et al., 2011; Law et al., 2015). SNPs nos genes PLA2G6,
CASP8 (Bishop et al., 2009; Barrett et al., 2011), AGR3 (Law et al., 2015) e FTO (Iles et
al., 2013) foram associados com a quantidade de nevos e risco de MC. Outros quatro loci
que estão localizados os genes ARNT/SETDB1, CYP1B1, MX2 e TEMEM38B/RAD23B
foram associados a risco de MC, mas por mecanismos ainda desconhecidos (Barrett et al.,
2011; Mcgregor et al., 2011; Law et al., 2015).
30
Tabela 1. Polimorfismos de base única associados com o risco de melanoma cutâneo
em estudos de genotipagem em larga escala de acordo com o gene,
localização cromossômica, número de referência, risco de ocorrência,
envolvimento com pigmentação, presença de nevos e seus respectivos autores
(adaptado Law et al., 2015 e Read et al., 2016)
31
As localizações cromossômicas dos genes de alta, média e baixa penetrância
envolvidos com o MC estão apresentadas na Figura 2.
Figura 2. Localização cromossômica dos genes de alta penetrância (preto), média (azul)
e baixa (vermelho) associados com predisposição ao melanoma cutâneo
(adaptado de Read et al., 2016.)
Até onde atinge o nosso conhecimento, estudos por GELE em MC foram
conduzidos apenas em caucasianos (Law et al., 2015). É fundamental comentar que as
frequências dos genótipos dos SNPs variam substancialmente em diferentes populações
étnicas (Chung & Chanock, 2011) e, desta forma, suas relações com a origem ou
manifestações clínicas de doenças não podem ser generalizadas para todas as populações.
5. Justificativa do estudo
O problema do câncer no Brasil ganha relevância pelo perfil epidemiológico que a
doença apresenta e o número de casos aumenta a cada ano no país (INCA). É esperado o
aumento no número casos de MC no estado de São Paulo e no Brasil. Merece destaque o
32
fato de que vivemos em país tropical, sob os efeitos intensos da radiação UV (Instituto
Nacional do Câncer, 2016).
Além disso, a nossa população é altamente heterogênea e miscigenada, composta
por imigrantes da Europa, Ásia e África (Mendes et al., 2010), com possíveis diferenças na
suscetibilidade aos efeitos deletérios dos raios UV na pele e diferentes suscetibilidades ao
MC.
Até onde atinge o nosso conhecimento, não há estudos de GELE para identificação
de SNPs associados com o risco de MC na população brasileira. Assim, nos pareceu
relevante identificar novos SNPs ou confirmar papéis de SNPs já identificados em outras
populações em associação com o MC em nossa população.
33
OBJETIVOS
Avaliar pacientes com MC atendidos nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de
Dermatologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP e indivíduos saudáveis do Centro de
Hematologia e Hemoterapia (HEMOCENTRO) da UNICAMP, que servirão como
controles, tendo como objetivos:
Identificar SNPs envolvidos com o risco para o MC por meio de microarranjos de
DNA da empresa Affymetrix®, utilizando a GELE;
Validar SNPs localizados em genes de interesse identificados no estudo por meio
da técnica de PCR em tempo real (RT-PCR);
Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados estão associados aos aspectos
clínicos dos pacientes (idade, sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos, cor dos cabelos,
presença de sardas, presença de nevos e tipo de exposição solar), e aos aspectos
biológicos do tumor (localização, espessura de Breslow, nível de Clark e estágio
TNM);
Verificar se os genótipos dos SNPs selecionados influenciam a sobrevida livre de
progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) dos pacientes com MC.
34
PACIENTES E MÉTODOS
Foram avaliados 103 pacientes não aparentados com MC atendidos ao diagnóstico
ou durante o seguimento clínico, nos ambulatórios de Oncologia Clínica e de Dermatologia
do Hospital de Clínicas da UNICAMP, sob supervisão da Profa. Dra. Carmen Silvia Passos
Lima e da Profa. Dra. Aparecida Machado de Moraes. Foram excluídos os pacientes sem
tumor primário definido, tumor localizado em mucosas e na região ocular, e aqueles que
não aceitaram participar do estudo.
Foi também avaliado um grupo controle, constituído por 103 doadores de sangue
atendidos no HEMOCENTRO da UNICAMP, pareado aos pacientes por sexo. Foram
excluídos os pacientes que não aceitaram participar do estudo.
1. Avaliação clínica
Os dados relativos à identificação, à idade, ao sexo, ao fototipo cutâneo, cor dos
olhos e dos cabelos, presença de sardas e nevos e o tipo de exposição solar foram obtidos
no momento da aplicação do questionário específico em pacientes e controles, pelo
pesquisador responsável pelo estudo (Anexo 1).
Os pacientes e controles foram classificados de acordo com o fototipo cutâneo, cor
dos olhos e cor dos cabelos. O fototipo foi definido usando critérios já definidos por
Fitzpatrick que considera a cor e o grau de sensibilidade da pele quando exposta ao sol.
Indivíduos com fototipo I possuem pele clara, se queimam com facilidade e nunca se
bronzeiam; fototipo II são indivíduos com pele clara, se queimam com facilidade e
bronzeiam-se pouco; fototipo III indivíduos com pele morena, se queimam e bronzeiam-se
de forma moderada; fototipo IV indivíduos de pele morena que se queimam pouco e
bronzeiam-se com facilidade; fototipo V indivíduos de pele morena que se queimam pouco
e sempre se bronzeiam; e fototipo VI indivíduos de pele negra que nunca se queimam
quando expostos ao sol (Fitzpatrick, 1988). Foram considerados portadores de olhos claros
os indivíduos com olhos azuis e verdes e portadores de olhos não claros aqueles com olhos
castanhos e pretos. Foram considerados portadores de cabelos claros os indivíduos com
cabelos loiros e ruivos naturais e indivíduos com cabelos castanhos e pretos naturais foram
classificados como portadores de cabelos não claros (Fitzpatrick, 1988).
Foram considerados portadores de nevos aqueles com pelo menos um nevo
melanocítico maior que 2 mm de diâmetro em qualquer área do corpo (exceto no couro
cabeludo, púbis e região perineal, que não foram avaliadas ao exame físico). Os pacientes
35
foram categorizados de acordo com protocolo de identificação da International Agency for
Research on Cancer (IARC) em: sem nevos ou com poucos nevos (≤ 20), e com moderado
número de nevos ou muitos nevos (>20) (English e Mac Lennan, 1990). Foram
classificados como portadores de efélides, os indivíduos que apresentam manchas
hipercrômicas pequenas (até 5 mm de diâmetro) e de limites bem nítidos (Gandini et al.,
2005).
Indivíduos expostos ao sol por mais de duas horas ao dia e por mais de 10 anos
foram considerados expostos ao sol, sendo a exposição classificada como intermitente
(exposição solar relacionada a atividades recreativas em menos de 50% na semana ou
férias) ou crônica (atividade laboral ou domiciliar em mais de 50% do tempo sob a
exposição solar), e sem exposição (não enquadramento nas definições anteriores) (Gordon
et al., 2015)
O diagnóstico de MC foi realizado por exame histopatológico realizado em cortes
de fragmentos do tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina. Os
dados da localização primária (classificados em cabeça, tronco, dorso e membros),
espessura de Breslow (classificados em ≤ 1,5 mm ou >1,5 mm) e níveis de Clark foram
coletados do laudo do exame anatomopatológico.
O estágio do tumor foi determinado com base nos resultados obtidos do exame
histológico da peça cirúrgica, dos exames de imagem e da dosagem da lactato
desidrogenase (LDH). Os exames de imagem realizados foram a radiografia do tórax,
ultrassonografia do abdome, ressonância magnética ou computed tomography (CT) do
tórax e ou abdome, positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), e
ainda ressonância magnética de crânio e cintilografia óssea em casos com suspeita clínica
de infiltração de sistema nervoso central ou óssea, para a definição da presença ou ausência
de metástases distantes. O estágio do tumor foi classificado de acordo com os critérios do
American Joint Comitee on Cancer (Edge et al., 2010). Essas informações foram obtidas
dos prontuários médicos pelo pesquisador do estudo.
2. Terapêutica
Ampliação de margem cutânea foi realizada quando a excisão inicial foi um
procedimento apenas diagnóstico (Gillgren et al., 2011). A pesquisa de linfonodo
sentinela teve indicação em pacientes com índice de Breslow maior que 1 mm, porém
36
não foi um procedimento obrigatório pois sua realização não melhora a curva de
sobrevida específica em estudo prospectivo e randomizado (Morton et al., 2014).
O tratamento adjuvante com interferon alfa 2b (IFN alfa 2b) constitui modalidade
terapêutica com questionável benefício na sobrevida global (SG) de pacientes com MC
(apenas 11% de aumento) (Mocellin et al., 2010), mas com ganho real na sobrevida livre
de recidiva (SLR) (aumento de 18%), especialmente em esquemas de longa duração (1 a
5 anos) e com doses intermediárias ou altas do fármaco (Mocellin et al., 2010). Por
serem tratamentos com alta toxicidade, utilizamos em nosso serviço a estratégia de
discutir os riscos e benefícios do tratamento adjuvante com cada paciente, cabendo uma
decisão conjunta médico-paciente, sobre a sua realização. A discussão do tratamento
adjuvante com IFN alfa 2b ocorreu em especial com pacientes com linfonodos
acometidos ou com tumores com índice de Breslow maior que 4 mm (Kirkwood et al.,
1996).
Os pacientes com metástase única ou recidiva operável foram submetidos à
remoção cirúrgica com objetivo de ressecção completa do tumor (Sondak & Guibney
2014). Aqueles com recidivas inoperáveis ou com metástases múltiplas receberam a
monoquimioterapia com dacarbazina (Sasse et al., 2007).
A radioterapia foi utilizada no tratamento local de pacientes com impossibilidade
cirúrgica, pois apresenta pouco impacto no tratamento do MC, tendo apenas papel
paliativo, principalmente em lesões com sangramentos, metástases ósseas ou cerebrais
(Burmeister et al., 2012).
A SLP foi definida como a data da ampliação de margem e a data da primeira
progressão ou recidiva, ou óbito de causas decorrente da doença. A SG foi definida como
o intervalo entre a data do diagnóstico e a data do óbito por qualquer causa ou data do
último segmento.
3. Genotipagem em larga escala (GELE)
As etapas de extração do DNA de amostras de leucócitos do sangue periférico dos
pacientes e dos controles, digestão enzimática, PCR, purificação, fragmentação e marcação
foram realizadas nas instalações do Laboratório de Genética do Câncer da Faculdade de
Ciências Médicas da UNICAMP.
As etapas de hibridização, lavagem e escaneamento das lâminas de microarranjos
foram realizadas na plataforma de GELE da empresa Affymetrix® disponível no
Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e
37
Materiais de Campinas, São Paulo; na plataforma disponível no Laboratório de Pesquisa e
Desenvolvimento do Grupo Fleury de São Paulo, São Paulo; e no Laboratório Multiusuário
de Genética Molecular do Câncer da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, de
Campinas, São Paulo. A referida plataforma de GELE é composta de um forno de
hibridização, estação de lavagem e escaner acoplados a um computador.
Foram utilizadas 206 lâminas (103 para pacientes e 103 para controles) com
microarranjos de DNA contendo 906.000 SNPs (Genome Wide Human SNP Array 6.0) e o
kit de reagentes compatíveis (Genome Wide Human SNP Nsp/Sty Assay Kit 6.0). Os
procedimentos para a identificação dos SNPs foram realizados de acordo com o protocolo
do fabricante, descrito sucintamente abaixo.
3.1. Extração do DNA a partir dos leucócitos
O DNA genômico foi obtido de amostras de sangue periférico dos pacientes com
MC e dos controles com a utilização do kit de extração de DNA QIAamp DNA Blood Kit
(QIAGEN, Hilden, Germany). A concentração do DNA foi determinada por meio de
espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA). O DNA foi diluído
em tampão TE (0,01 mM ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), 10 mM Tris HCl, pH
8,0) para 50 ng/μl e foi armazenado a -20 ºC até o próximo passo.
3.2. Digestão com a enzima StyI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles foram submetidos à digestão com a enzima StyI
para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada uma reação de
5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10X), 0,2 μl de albumina
bovina sérica (BSA) (100 X, 10 mg/ml) e 1,0 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi
incubadas no termociclador (Eppendorf, Hamburg, Germany) por duas horas a 37 ºC e 20
minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão foram armazenados a -20 ºC até o próximo
passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos
com a reação de 0,75 μl de adaptador StyI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10 X) e 2,0 μl da
enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas
a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de
água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
38
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores StyI foram submetidos a três PCRs
realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10 X), 20 μl de
potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5
mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq
DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30
segundos), a 60º C (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Foram obtidos fragmentos de
250 a 1100 pares de bases (pb). A presença dos fragmentos foi analisada por eletroforese
em gel de agarose 2% (Figura 3A). Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até
o próximo passo.
3.3. Digestão com a enzima NspI, ligação a adaptadores e amplificação
Os DNAs dos pacientes e controles também foram submetidos à digestão com a
enzima NspI para a obtenção de fragmentos de DNA de tamanhos variados. Foi utilizada
uma reação de 5 μl de DNA (50 ng/μl), 11,5 μl de água estéril, 2 μl de tampão (10 X), 0,2
μl de BSA (100 X, 10 mg/ml) e 1 μl da enzima (10 U/μl). A seguir, a reação foi incubada
no termociclador por duas horas a 37 ºC e 20 minutos a 65 ºC. Os produtos da digestão
foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
A seguir, foi realizada a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores específicos
com a reação de 0,75 μl de adaptador NspI (50 μM), 2,5 μl de tampão (10X) e 2 μl da
enzima T4 DNA ligase (400 U/μl). A reação foi incubada em termociclador por três horas
a 16 ºC e 20 minutos a 70 ºC. Os produtos da reação e ligação foram diluídos com 75 μl de
água estéril e armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores NspI foram submetidos a quatro
PCRs realizadas com a utilização de 39,5 μl de água estéril, 10 μl de tampão (10X), 20 μl
de potencializador para PCR (5 M), 14 μl de dNTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato) (2,5
mM cada), 4,5 μl do iniciador específico (100 μM) e 2 μl da enzima TITANIUMTM Taq
DNA polimerase (50 X). As reações compreenderam 30 ciclos de incubação a 94 ºC (30
segundos), a 60 ºC (45 segundos) e a 68 ºC (15 segundos). Os fragmentos de 250 a 1100
pares de bases (pb) foram analisados em eletroforese em gel de agarose 2% (Figura 3B).
Os produtos das PCRs foram armazenados a -20 ºC até o próximo passo.
39
Figura 3. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma
cutâneo e controles. Produtos da amplificação dos fragmentos obtidos das
digestões com a enzima StyI (A) NspI (B) de DNA genômico visualizados em
gel de agarose 2% corado com brometo de etídio, para a hibridização em
lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA de 100 pares de
bases (pb), estão representados nas colunas L. Os fragmentos de 250 a 1100 pb,
que correspondem à amplificação dos fragmentos da digestão enzimática, estão
representados nas demais colunas. Os resultados obtidos de controles negativos
estão representados nas colunas B.
3.4. Reação dos produtos das PCRs, purificação e quantificação
Os produtos das PCRs das enzimas StyI e NspI foram misturados. A reação
compreendeu 100μl do produto de cada uma das três PCRs da enzima StyI e 100 μl do
produto de cada uma das quatro PCRs da NspI. Em seguida, os produtos misturados
(volume final de 700 μl) foram purificados por meio do método de precipitação de ácidos
nucléicos com isopropanol. A purificação consistiu na adição de 12 μl de EDTA 0,5 M em
cada amostra, seguida de incubação por 10 minutos em temperatura ambiente.
Posteriormente, foram adicionados 200 μl de acetato de amônio 7,5 M e 700 μl de
isopropanol em cada amostra, em seguida, elas foram centrifugadas a 2.250 RCF (força
centrífuga relativa) por 30 minutos e apenas o precipitado foi mantido. A ele, foram
acrescentados 1,6 ml de etanol 75%, com posterior homogeneização e centrifugação a
2.250 RCF por 5 minutos. Após, o sobrenadante foi retirado por inversão cuidadosamente
40
do tubo e o precipitado de ácidos nucleicos foi ressuspenso em 55 μl de tampão de eluição,
com agitação vigorosa durante 30 minutos. A concentração dos ácidos nucleicos foi
determinada em espectrofotômetro (Nanodrop ND100, Wilmington, Delaware, USA), por
leitura da densidade óptica no comprimento de onda de 260 nanômetros. As amostras com
concentrações entre 450-600 μg/μl foram armazenadas a -20 ºC até o próximo passo.
3.5. Fragmentação dos produtos das PCRs
Foram adicionados 5 μl do tampão de fragmentação aos 45uL dos produtos
purificados de cada amostra. Em seguida, foram adicionados a cada amostra 14,4 μl da
enzima DNase I (2,5 U), 36 μl do tampão de fragmentação e 309,6 μl de água estéril. A
reação foi incubada no termociclador por 35 minutos a 37 ºC e 15 minutos a 95 ºC. A
fragmentação foi observada pela presença de fragmentos menores que 180 pb em
eletroforese em gel de agarose 4% corado com brometo de etídeo (Figura 4). Os
fragmentos obtidos foram utilizados imediatamente.
Figura 4. Método de genotipagem em larga escala em portadores de melanoma
cutâneo e controles. Produtos da fragmentação visualizados em gel de agarose
corado com brometo de etídio. A reação de fragmentação foi realizada
utilizados os produtos das PCRs obtidos da digestão enzimática para a
hibridização em lâminas de microarranjos. Os marcadores do tamanho do DNA
de 50 pares de bases (pb), estão representados nas colunas L e na coluna B está
representada a reação com água estéril, tida como controle negativo da reação.
Os fragmentos menores que 180 pb, correspondem à fragmentação das
amostras.
41
3.6. Marcação do DNA fragmentado com biotina
Inicialmente foi preparado a reação de marcação com 14 μl de tampão terminal
deoxynucleotidyl transferase (TdT) (5X), 2 μl de reagente de marcação de DNA (30 mM)
(biotina) e 3,5 μl da enzima TdT (30 U/μl). A marcação foi realizada com 53,5 μl de DNA
fragmentado e 19,5 μl da reação de marcação. A reação foi incubada em um termociclador
por quatro horas a 37ºC e 15 minutos a 95ºC. O DNA marcado com biotina foi armazenado
a -20ºC até o próximo passo.
3.7. Hibridização
Primeiramente foi preparado a reação de hibridização com 165 μl do reagente de
hibridização parte I, 15 μl do reagente de hibridização parte II, 7 μl do reagente de
hibridização parte III, 1 μl do reagente de hibridização parte IV e 2 μl do reagente de
controle interno (OCR 0100). Esta reação foi aquecida em termociclador a 95 °C por 10
minutos e resfriada a 49 ºC até o próximo passo. Após estes procedimentos, 200 μl da
reação desnaturada foi depositada em lâminas de vidro com os oligonucleotídeos pré-
arranjados. As lâminas e o material com o DNA foram hibridizados a 50 ºC durante 17
horas a 60 rpm (rotação por minuto).
3.8. Lavagens das lâminas e marcação com fluoróforos
Após as 17 horas de hibridização, as lâminas foram submetidas as sucessivas
lavagens com tampão de lavagem “A”, “B” e água destilada para remoção de excesso de
amostras que não se ligaram nas sondas e de reagentes. Em seguida foram realizadas as
lavagens com estreptavidina e ficoeritrina (reagente de marcação 1), seguida do anticorpo
biotinilado antiestreptavidina (reagente de marcação 2) e finalmente com MES (reagente
de marcação 3).
As lavagens e marcações foram realizadas com a utilização da estação de lavagem
GeneChip Fluidics Station 450. As sequências de lavagens e marcações dos microarranjos
contidos nas lâminas por fluoróforos estão descritas na Tabela 2.
42
Tabela 2. Sequências de lavagens e marcações dos microarranjos contidos em lâminas
por fluoróforos para a genotipagem em larga escala de polimorfismos gênicos
de base única em pacientes com melanoma cutâneo e controles
Etapas Descrição
Primeira lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com
tampão de lavagem “A” a 25 ºC
Segunda lavagem pós-hibridização Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com
tampão de lavagem “B” a 45 ºC
Primeira marcação
(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 1 a 25 ºC
Lavagem pós-marcação Seis ciclos (cinco reações por ciclo) com
tampão de lavagem “A” a 25 ºC
Segunda marcação
(anticorpo biotinilado antiestreptavidina) Dez minutos em solução de marcação 2 a 25 ºC
Terceira marcação
(estreptavidina e ficoeritrina) Dez minutos em solução de marcação 3 a 25 ºC
Lavagem final Dez ciclos (seis reações por ciclo) com tampão
de lavagem “A” a 25 ºC
A representação esquemática da sequência de todos os passos técnicos envolvidos
no procedimento está apresentada na Figura 5.
43
Figura 5. Representação esquemática do protocolo Affymetrix® Genome-Wide Human
SNP Array 6.0 para a genotipagem em larga-escala de pacientes com
melanoma cutâneo e controles. O DNA genômico dos indivíduos foi digerido
com as enzimas StyI e NspI, em seguida, foi realizada a reação ligação de
adaptadores específicos para os fragmentos obtidos após a digestão enzimática. As
reações de amplificação, de mistura e purificação desses fragmentos foi seguida
pela fragmentação e marcação dos fragmentos de DNA com biotina. Após, o
DNA biotinilado foi hibridizado na lâmina de microarranjo seguido das etapas de
lavagens, marcações com estreptavidina ligada a ficoeritrina, e leitura dos
resultados por meio da captação de fluorescência pelo scanner
3.9. Captação de imagens e controle de qualidade dos experimentos
As lâminas com microarranjos foram inseridas no GeneChip Scanner 3000 7G,
gerenciado pelo programa computacional GeneChip® Command Console (versão 3.2.4,
Affymetrix, Santa Clara, CA USA). As imagens geradas pela excitação dos fluoróforos
(ficoeritrina) captadas pelo scanner foram submetidas primeiramente à análise de controle
44
de qualidade geral (CQC), que utiliza como base os controles de qualidade dos fragmentos
clivados e hibridizados das enzimas StyI (CQ StyI) e NspI (CQ NspI) e dos gragmentos
totais (CQ) por meio do programa Genotyping Console (versão 4.1.3, Affymetrix, Santa
Clara, CA, USA). Só foram e serão consideradas adequadas para análise as lâminas que
obtiverem taxas iguais ou maiores que 0,40 de contraste CQ.
4. Genotipagem dos SNPs
A identificação dos genótipos dos pacientes com MC e dos controles foi realizada
por meio do algoritmo computacional corrected robust linear mixture model (crlmm)
(Carvalho et al., 2010), disponível gratuitamente no programa Bioconductor (versão 3.3,
linguagem R) (www.bioconductor.org). O algoritmo crlmm permitiu realizar o
processamento das imagens obtidas, convertendo as intensidades das sondas dos
microarranjos em quantidades proporcionais à quantidade de DNA de cada amostra
associada com cada alelo, A e B, de cada SNP. O processamento consistiu nas seguintes
etapas: 1) normalização, que permitiu ajustar e corrigir as intensidades das sondas de cada
SNP, 2) sumarização, que consistiu nos valores numéricos associados à intensidade da
sonda de cada SNP e 3) genotipagem, que possibilitou a identificação dos genótipos
homozigoto selvagem (AA), heterozigoto (AB) e homozigoto variante (BB) (Carvalho et
al., 2010). (Carvalho et al., 2007).
5. Análises estatísticas da GELE
O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por
meio de modelos elásticos e da regressão logística múltipla, utilizando o algoritmo lasso
and elastic-net regularized generalized linear models (glmnet). O glmnet emprega
estratégias computacionais e estatísticas que maximizam a adequacidade de ajustes entre
marcadores e informações clínicas nos diferentes grupos de pacientes e controles
(Friedman et al., 2010). Para isso, utilizou-se a área sob a curva característica como
estatística de adequacidade do modelo, a fim de determinar o melhor modelo preditivo. Por
meio da validação cruzada, as observações disponíveis foram divididas em dois grupos:
treino e teste. Com o grupo de treino, o método ajusta o melhor modelo, cujo desempenho
foi avaliada no grupo de teste. Este procedimento foi repetido diversas vezes para a final
determinação do modelo que melhor se adequou aos dados. As características clínicas que
45
foram significativas no modelo preditivo foram utilizadas como ajustes nas análises de
regressão logística, considerando valores significativos P <0,01.
6. Seleção dos polimorfismos de base única
Com o intuito de restringir os SNPs identificados por meio da GELE, nós
analisamos os resultados obtidos por meio dos bancos de dados Database for Annotation,
Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (Huang et al., 2009a; Huang et al.,
2009b) e do National Center for Biotechonology Information (NCBI) (Geer et al., 2010) e
selecionamos apenas os SNPs localizados em genes relacionados com o processo de
melanogênese.
A seguir, selecionamos os SNPs em que os genótipos dos indivíduos controles
estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e cujos tamanhos amostrais calculados
por normas definidas por Beiguelman (Beiguelman, 1995) tendo como base as frequências
genotípicas observadas em indivíduos saudáveis do International HapMap 3 Consortium
(International HapMap 3 Consortium et al., 2010), estavam disponíveis no Biorrepositório
do nosso laboratório (n= 110).
Selecionamos, a seguir, apenas os SNPs que estiveram localizados em regiões
regulatórias da expressão gênica. Para isso, utilizamos os programas Variant Effect
Predictor (Mclaren et al., 2010) e SNP Function Prediction (Xu & Taylor, 2009).
7. Validação dos resultados obtidos pela genotipagem em larga escala
Os resultados obtidos por meio da GELE foram validados utilizando a RT-PCR,
considerado o padrão ouro para a genotipagem de SNPs. Os genótipos dos SNPs
selecionados anteriormente foram obtidos por meio de ensaios para genotipagem TaqMan®
(Applied Biosystems®, Carlsbad, CA, USA), de acordo com o protocolo do fabricante.
Sucintamente, a RT-PCR foi realizada com a utilização de cerca de 20 ng de DNA, 0,5 µL
de ensaio específico para cada SNP e 5 µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix, que
contém a AmpliTaqGold® DNA polimerase, dNTPs e tampão com componentes
otimizadores. As condições de amplificação consistiram na ativação inicial da AmpliTaq
Gold® a 95 °C por 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de incubação a 92 °C por 15
segundos e a 60°C por 1 minuto.
46
8. Análise estatística de associações de SNPs e aspectos clinicopatológicos
O teste de verificação do equilíbrio de HW foi realizado com o intuito de verificar
se ocorreu distribuição preferencial de algum dos genótipos avaliados no grupo de
pacientes e controles utilizados no estudo (Beiguelman, 1995).
O significado estatístico das diferenças dos SNPs entre os grupos foi calculado por
meio do teste de Fisher ou χ2 e pelo modelo de regressão logística múltipla. As
determinações dos riscos de ocorrência entre os grupos foram obtidas por meio das razões
das chances (ORs) e calculadas considerando um intervalo de confiança (IC) de 95%. O
poder da análise (PA) foi calculado a fim de verificar o tamanho do efeito mínimo
suscetível de ser detectado em um estudo utilizando o tamanho amostral. Os resultados
foram selecionados utilizando-se nível de significância de 5% (P< 0,05).
Os tempos de SLP e SG foram estimados por meio da curva de Kaplan-Meier e a
comparação entre as curvas de sobrevida foi realizada por meio do teste de log rank. O
fator prognóstico de cada variável (características clínicas e do tumor e cada SNP) foi
avaliado por meio da análise univariada de Cox. Após a análise univariada, todas as
características que apresentaram valore de P <0,10 foram incluídas na análise multivariada
de Cox. Foram considerados significativos os valores de P <0,05.
9. Aspectos éticos
O estudo molecular foi realizado em amostras de sangue periférico obtidas por
ocasião da punção venosa realizada para a coleta de exames necessários para os exames
pré-operatórios e de estagiamento no momento do diagnóstico ou acompanhamento clínico
dos pacientes e de uma única punção venosa em controles.
O raio-X de tórax e a tomografia computadorizada foram exames realizados de
rotina para o estagiamento da doença e para as determinações do prognóstico e da
terapêutica a ser administrada. Nenhum material adicional foi coletado dos pacientes ou
controles.
Todos os procedimentos inerentes ao estudo foram realizados após aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (Processo
nº 424/2006) (Anexo 2) e após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido por pacientes e controles (Anexos 3 e 4).
47
RESULTADOS
1. Avaliação clínica
As características demográficas e clínicas de pacientes e controles individualizados
estão apresentadas nos Anexos 5 a 7.
Já as distribuições dos 103 pacientes com MC e 103 dos controles estratificados por
idade, sexo, fototipo, cor dos olhos e cabelos, presença de efélides e nevos e exposição
solar estão apresentadas na Tabela 3.
Os pacientes apresentaram idade entre 19 e 88 anos (média ± desvio padrão: 55
anos ± 16 anos; mediana: 54 anos). Cerca de dois terços dos pacientes eram do sexo
masculino, do fototipo cutâneo I ou II, apresentaram com olhos e cabelos escuros e muitas
efélides e nevos, e se expuseram ao sol crônicamente.
Já os controles apresentaram idade entre 20 e 63 anos (média ± desvio padrão: 45 ±
8,4 anos; mediana: 47 anos). Cerca de metade do número de controles era do sexo
masculino e dos fototipos cutâneos III a VI. A maioria dos controles apresentaram olhos e
cabelos escuros.
Os pacientes foram mais velhos do que os controles; pele clara, olhos claros e
cabelos claros foram mais comuns em pacientes do que em controles. Assim, todas as
análises subsequentes envolvendo pacientes e controles, foram ajustadas por estas
variáveis.
48
Tabela 3. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo e controles de acordo
com a idade, o sexo, o fototipo cutâneo, a cor dos olhos e a cor dos cabelos, a
presença de efélides e nevos e a exposição solar
Variáveis Pacientes
(%)
Controles
(%)
Valor
de P
OR (IC95%)
Idade (anos)
< 54 53 (51,4) 89 (86,4) <0,001 5,99 (3,02-11,87)
≥ 54 50 (48,6) 14 (13,6)
Sexo
Masculino 61 (59,2) 55 (53,4) 0,48 1,26 (0,73-2,20)
Feminino 42 (40,8) 48 (46,6)
Fototipo cutâneo
I+II 69 (67,0) 53 (51,5) 0,03 1,91 (1,08-3,36)
III+IV+V+VI 34 (33,0) 50 (48,5)
Cor dos olhos
Verdes ou azuis 37 (35,9) 19 (18,4) 0,007 2,47 (1,30-4,70)
Castanhos ou pretos 66 (64,1) 84 (81,6)
Cor dos cabelos
Loiros ou ruivos 29 (28,1) 10 (9,8) 0,001 3,64 (1,66-7,95)
Castanhos ou pretos 74 (71,9) 93 (90,2)
Presença de efélides
Nenhuma/poucas 40 (38,8) NA
Muitas 63 (61,2)
Presença de nevos
≤ 20 40 (38,8) NA
> 20 63 (61,2)
Exposição solar
Crônica 49 (47,6)
NA
Intermitente ou nenhuma 37 (35,9)
Não obtido 17 (16,5)
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelas; IC:
intervalo de confiança; valores de P< 0,05 estão destacados; NA: não avaliado
49
2. Aspectos do tumor
2.1 Tipo histológico, grau de diferenciação e estágio do tumor
As distribuições individualizadas dos 103 pacientes com MC de acordo com a
localização do tumor, espessuras de Breslow, os níveis de Clark e estágios clínicos TNM
estão apresentados no Anexo 8. As distribuições dos 103 pacientes com MC incluídos no
estudo, de acordo com os aspectos do tumor estão apresentadas na Tabela 4.
Tabela 4. Distribuições dos pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a
localização do tumor, espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios
clínicos
Variáveis Pacientes (%)
Localização tumoral
Axial 59 (57,2)
Membros 31 (30,0)
Não avaliado 13 (12,8)
Breslow
< 1,5mm 42 (40,7)
≥ 1,5mm 49 (47,6)
Não avaliado 12 (11,7)
Clark
I+II+III 56 (54,4)
IV+V 46 (44,6)
Não avaliado 1 (1,0)
Estágio clínico
IS+I+II 58 (56,3)
III+IV 45 (43,7)
Axial: cabeça, face, pescoço e tronco
Cerca de metade dos nossos pacientes apresentaram tumores axiais, com espessuras
de Breslow maiores que 1,5 mm, restritos à derme (Clark I, II ou III) e em estágios iniciais.
50
3. Terapêutica dos pacientes
Dos 103 pacientes incluídos, 98 (95,2%) foram submetidos ao tratamento cirúrgico
com remoção da lesão e 62 (60,2%) realizaram ampliação de margens cirúrgicas. A
pesquisa do linfonodo sentinela foi realizada em 22 (21,3%) e aqueles com
comprometimento linfonodal foram submetidos a linfadenectomia. Onze pacientes (10,6%)
receberam tratamentos complementares, sendo que seis receberam quimioterapia com
dacarbazina, dois foram submetidos a radioterapia e três receberam a imunoterapia com
interferon.
4. Determinação dos polimorfismos gênicos
Foram utilizadas 206 lâminas de microarranjos para a GELE de amostras de DNA
de 103 pacientes e 103 controles. Todas as imagens obtidas após os procedimentos
técnicos apresentaram os controles de qualidade das reações adequados. As distribuições
individualizadas dos 103 pacientes com MC e dos 103 controles de acordo com os valores
de CQC, de CQ StyI, CQ NspI e CQ estão apresentadas no Anexo 9.
Todas as lâminas apresentaram o controle de qualidade (CQC) adequado para
análise de SNPs (maiores que 0,40).
Figura 6. Imagem padrão gerada pela excitação dos fluoróforos contidos em lâmina
de um indivíduo controle capturada por scanner para a genotipagem em
larga escala. Os quatro quadrados (A, B, C e D) representam a hibridização
adequada da amostra com as sondas que contêm os polimorfismos de base
única. A imagem mais clara em forma de cruz representa a hibridização
adequada da amostra em sondas para a variação do número de cópias do DNA.
A imagem no centro (→) representa um controle interno da lâmina
51
5. Identificação dos SNPs por meio da genotipagem em larga escala
Observamos que 12.994 SNPs apresentaram frequências genotípicas distintas
(maiores ou menores) em pacientes com MC e controles (P< 0,001). As regiões do DNA
onde estiveram localizados estes SNPs estão apresentadas na Tabela 5.
Tabela 5. Regiões do DNA que albergam os 12.994 polimorfismos gênicos de base única
com frequências genotípicas distintas em pacientes com melanoma cutâneo e
controles
Região do DNA Número de SNPs (%)
Regulatória da transcrição 6.814 (52,4)
Codificadora de
aminoácidos 26 (0,2)
Íntron 6.042 (46,5)
Não identificada 112 (0,9)
Total 12.994 (100,0)
SNPs: polimorfismos gênicos de base única
As regiões regulatórias e intrônicas foram as que apresentam maiores números de
SNPs com frequências genotípicas distintas em pacientes e controles. As regiões
regulatórias compreendem SNPs localizados nas regiões 3’ e 5’ não traduzidas.
6. Seleção dos polimorfismos gênicos
Oitenta e dois dos 12.994 SNPs, que apresentaram frequências genotípicas distintas
entre pacientes e controles, estiveram localizados em 32 genes distintos que atuam na via
da melanogênese.
As distribuições individualizadas dos 82 SNPs localizados em genes relacionados
com a melanogênese de acordo com seu número de referência, símbolo do gene, o tamanho
amostral, o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg do grupo de controles e a sua
localização na cadeia de DNA estão apresentadas no Anexo 10.
Quarenta e sete dos 82 SNPs apresentaram o tamanho amostral menor que 110
indivíduos e 16 deles estão localizados em regiões regulatórias da expressão gênica.
Os genótipos dos 16 SNPs estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg em controles.
52
Dez SNPs localizados em genes que atuam de forma conjunta na via da melanogênese
foram selecionados para validar os resultados obtidos na GELE.
As distribuições dos dez SNPs selecionados de acordo com o número de referência
do SNP, o símbolo do gene, a mudança da base nitrogenada, a localização genômica e o
tamanho amostral estão apresentadas na Tabela 6.
Tabela 6. Distribuições dos dez polimorfismos de base única (SNPs) localizados em
genes relacionados com a melanogênese de acordo com o número de referência
do SNP, o símbolo do gene, a mudança da base nitrogenada, a região do gene e
o tamanho amostral estimado
rs do SNP Símbolo do
gene
Mudança de base
nitrogenada
Região
genômica
Tamanho
amostral
3793772 WNT8B c.-101T>C Regulatória 93
2017472 KIT c.67+12766T>C Íntron 109
2079162 GNAL1 g.80130766C>T Regulatória 51
11900505 ADCY3 c.675+9196T>G Íntron 60
4295085 PLCB1 g.8908966C>A Íntron 65
12601850 PRKCA c.205+407G>A Íntron 68
1806448 PRKCA c.288+33994A>G Íntron 79
11884600 CALM2 g.47384601A>G Regulatória 59
10932201 CREB1 c.261+1161G>A Íntron 93
7623610 MITF c.635-325A>G Íntron 61
rs: número de referência do polimorfismo de base única (SNP)
7. Validação dos resultados obtidos pela genotipagem em larga escala
As frequências dos genótipos dos SNPs selecionados por GELE e RT-PCR em
pacientes e controles estão apresentados nas Tabelas 7 e 8.
53
Tabela 7. Distribuições dos genótipos dos polimorfismos WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CREB1
c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, identificados por genotipagem em
larga escala e reação em cadeia da polimerase em tempo real, em pacientes
com melanoma cutâneo e controles
Genótipos Nº de pacientes
GELE/RT-PCR
Nº de controles
GELE/ RT-PCR
Porcentagem
de
concordância
WNT8B c.-101T>C
TT 55 / 56 78 / 78
TC 45 / 44 23 / 23 99%
CC 3 / 3 2 / 2
KIT c.67+12766T>C
TT 40 / 40 24 / 24
TC 50 / 50 49 / 50 99%
CC 13 / 13 30 / 29
GNAL1 g.80130766C>T
CC 5 / 5 17 / 17
CT 35 / 35 41 / 41 100%
TT 63 / 63 45 / 45
ADCY3 c.675+9196T>G
TT 38 / 37 32 / 32
TG 65 / 66 46 / 46 99%
GG 10 / 10 25 / 25
PLCB1 g.8908966C>A
CC 24 / 24 38 / 35
CA 60 / 61 42 / 45 98%
AA 19 / 18 23 / 23
PRKCA c.205+407G>A
GG 24 / 24 36 / 36
GA 56 / 56 54 / 54 100%
AA 23 / 23 13 / 13
PRKCA c.288+33994A>G
AA 57 / 57 71 / 71
AG 41 / 41 26 / 26 100%
GG 5 / 5 6 / 6
54
CALM2 g.47384601A>G
AA 19 / 19 39 / 39
AG 51 / 52 42 / 46 95%
GG 34 / 33 22 / 18
CREB1 c.261+1161G>A
GG 28 / 28 49 / 49
GA 54 / 55 42 / 42 99%
AA 21 / 20 12 / 12
MITF c.635-325A>G
AA 35 / 35 16 / 15
AG 43 / 43 51 / 52 99%
GG 25 / 25 36 / 36
GELE: genotipagem em larga escala; RT-PCR: reação em cadeia da polimerase
em tempo real
Observamos concordância de genótipos identificados pelos dois métodos em
95% a 100% dos casos. Informamos que apenas os genótipos dos SNPs identificados
por
RT-PCR (padrão ouro) serão considerados nas próximas análises.
8. Polimorfismos em genes da melanogênese em pacientes e controles
Os resultados das avaliações do equilíbrio de Hardy-Weinberg para os lóci dos
SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3
c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA
c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-
325A>G em amostras de pacientes com MC e controles estão apresentados na Tabela 8.
55
Tabela 8. Teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg de dez polimorfismos selecionados em
amostras de pacientes com melanoma cutâneo e controles
Equilíbrio de Hardy-Weinberg
SNP Pacientes Controles
WNT8B c.-101T>C χ2= 2,70; P= 0,10 χ2= 0,04; P= 0,84
KIT c.67+12766T>C χ2= 0,18; P= 0,67 χ2= 0,03; P= 0,86
GNAL1 g.80130766C>T χ2= 0,002; P= 0,96 χ2= 2,02; P= 0,15
ADCY3 c.675+9196T>G χ2= 2,89; P= 0,08 χ2= 1,08; P= 0,29
PLCB1 g.8908966C>A χ2= 3,66; P= 0,06 χ2= 1,34; P= 0,24
PRKCA c.205+407G>A χ2= 0,78; P= 0,37 χ2= 1,05; P= 0,30
PRKCA c.288+33994A>G χ2= 0,48; P= 0,48 χ2= 2,67; P= 0,10
CALM2 g.47384601A>G χ2= 0,008; P= 0,92 χ2= 0,47; P= 0,40
CREB1 c.261+1161G>A χ2= 0,57; P= 0,45 χ2= 0,41; P= 0,52
MITF c.635-325A>G χ2= 2,54; P= 0,11 χ2= 0,29; P= 0,59
SNP: polimorfismo de base única, χ2= qui quadrado, Valores de P maiores que
0,05 indicam que a amostra encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg
Observamos que as amostras de pacientes com MC e controles estiveram em
equilíbrio de Hardy-Weinberg nos lóci dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF c.635-325A>G.
As frequências dos genótipos dos dez SNPs selecionados em pacientes com MC e
controles estão apresentados nas Tabelas 9 a 13.
56
Tabela 9. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos
WNT8B c.-101T>C e KIT c.67+12766T>C em pacientes com melanoma
cutâneo e controles
Genótipos Pacientes
n (%)
Controles
n (%) OR (IC 95%)
Valor de
P PA
WNT8B c.-101T>C
Alelo T 76% 87% referência
Alelo C 24% 13% 2,25 (1,27-3,98) 0,005
TT 56 (54,4) 78 (75,7) referência
TC 44 (42,7) 23 (22,4) 2,56 (1,30-5,03) 0,006 88%
CC 3 (2,9) 2 (1,9) 3,74 (0,53-26,34) 0,18
TT 56 (54,4) 78 (75,7) referência
TC+CC 47 (45,6) 25 (24,3) 2,46 (1,27-4,77) 0,008 90%
TT+TC 100 (97,1) 101 (98,1) referência
CC 3 (2,9) 2 (1,9) 2,85 (0,42-19,10) 0,28
KIT c.67+12766T>C
Alelo T 63% 48% 2,08 (1,34-3,21) 0,001
Alelo C 37% 52% referência
TT 40 (38,8) 24 (23,3) 5,35 (1,92-14,85) 0,001 68%
TC 50 (48,6) 50 (48,5) 3,35 (1,38-8,11) 0,07 5%
CC 13 (12,6) 29 (28,2) referência
TT 40 (38,8) 24 (23,3) 2,28 (1,15-4,51) 0,01 68%
TC+CC 63 (61,2) 79 (76,7) referência
TT+TC 90 (87,4) 74 (71,8) 3,67 (1,60-8,40) 0,001 80%
CC 13 (12,6) 29 (28,2) referência
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:
intervalo de confiança, PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados
As frequências do alelo C, do genótipo TC e do genótipo TC ou CC do SNP
WNT8B c.-101T>C foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os
referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,25, 2,56 e 2,46 vezes maiores de
ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelo e genótipos, respectivamente.
57
As freqüências do alelo T, do genótipo TT e do genótipo TT ou TC do SNP KIT
c.67+12766T>C foram maiores em pacientes com MC do que em controles. Indivíduos
com os referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,08, 5,35 e 3,67 vezes maiores
de ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelo e genótipos,
respectivamente.
Tabela 10. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos
GNAI1 g.80130766C>T e ADCY3 c.675+9196T>G em pacientes com
melanoma cutâneo e controles
Genótipos Pacientes
n (%)
Controles
n (%) OR (IC 95%)
Valor
de P PA
GNAI1 g.80130766C>T
Alelo C 22% 36% Referência
Alelo T 78% 64% 2,05 (1,27-3,30) 0,003
CC 5 (4,9) 17 (16,5) Referência
CT 35 (33,9) 41 (39,8) 5,99 (1,51-23,74) 0,01 14%
TT 63 (61,2) 45 (43,7) 6,34 (1,85-21,66) 0,003 72%
CC 5 (4,9) 17 (16,5) Referência
CT+TT 98 (95,1) 86 (83,5) 6,30 (1,85-21,44) 0,003 77%
CC+CT 40 (38,8) 58 (56,3) Referência
TT 63 (61,2) 45 (43,7) 3,67 (1,60-8,40) 0,002 72%
ADCY3 c.675+9196T>G
Alelo T 63% 53% 1,52 (1,01-2,34) 0,04
Alelo G 37% 47% Referência
TT 37(35,9) 32 (31,0) 4,86 (1,66-14,18) 0,004 12%
TG 56 (54,4) 46 (44,8) 4,28 (1,66-11,03) 0,003 28%
GG 10 (9,7) 25 (24,2) Referência
TT 37(35,9) 32 (31,0) 1,08 (0,56-2,05) 0,81
TG+GG 66 (64,1) 71 (69,0) Referência
TT+TG 93 (90,3) 78 (75,8) 3,99 (1,64-9,73) 0,002 80%
GG 10 (9,7) 25 (24,2) Referência
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:
intervalo de confiança; PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados
58
As frequências do alelo T, do genótipo CT, do genótipo TT e do genótipo CT ou TT
do SNP GNAI1 g.80130766C>T foram maiores em pacientes do que em controles.
Portadores dos referidos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,05, 5,99, 6,34 e 6,30
vezes maiores de ocorrência do MC do que os indivíduos com os demais alelos e
genótipos, respectivamente.
As freqüências do alelo T, do genótipo TT, do genótipo TG e do genótipo TT ou TG
do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foram maiores em pacientes do que em controles.
Individuos portadores do referido alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,52, 4,86, 4,28
e 3,99 vezes maiores de ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos,
respectivamente.
59
Tabela 11. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos
PLCB1 g.8908966C>A e PRKCA c.205+407G>A em pacientes com
melanoma cutâneo e controles
Genótipos Pacientes
n (%)
Controles
n(%) OR (IC 95%)
Valor
de P PA
PLCB1 g.8908966C>A
Alelo C 47% 56% Referência
Alelo A 53% 44% 1,24 (0,81-1,91) 0,30
CC 24 (23,3) 35 (34,0) referência
CA 61 (59,2) 45 (43,7) 2,42 (1,18-4,96) 0,01 61%
AA 18 (17,5) 23 (22,3) 1,38 (0,55-3,45) 0,49
CC 24 (23,3) 35 (34,0) Referência
CA+AA 79 (76,7) 68 (66,0) 1,98 (1,00-3,93) 0,04 40%
CC+CA 85 (82,5) 80 (77,7) Referência
AA 18 (17,5) 23 (22,3) 1,34 (0,61-2,92) 0,45
PRKCA c.205+407G>A
Alelo G 50% 61% Referência
Alelo A 50% 39% 1,76 (1,14-2,71) 0,01
GG 24 (23,3) 36 (35,0) Referência
GA 56 (54,4) 54 (52,4) 2,00 (0,97-4,12) 0,05
AA 23 (22,3) 13 (12,6) 3,85 (1,37-10,83) 0,01 45%
GG 24 (23,3) 36 (35,0) Referência
GA+AA 79 (76,7) 67 (65,0) 2,38 (1,17-4,83) 0,01 46%
GG+GA 80 (77,7) 90 (87,4) Referência
AA 23 (22,3) 13 (12,6) 2,12 (0,93-4,82) 0,07
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:
intervalo de confiança; PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados
As frequências do genótipo CA e do genótipo CA ou AA do SNP PLCB1
g.8908966C>A foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os
respectivos genótipos estiveram sob riscos de 2,42 e 1,98 vezes maiores de desenvolver MC
do que indivíduos com os demais genótipos.
60
As freqüências do alelo A, do genótipo AA e do genótipo GA ou AA do SNP PRKCA
c.205+407G>A foram maiores em pacientes do que em controles. Individuos com os
respectivos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,76, 3,85 e 2,38 vezes maiores de
ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos.
Tabela 12. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos
PRKCA c.288+33994A>G e CALM2 g.47384601A>G em pacientes com
melanoma cutâneo e controles
Genótipos Pacientes
n (%)
Controles
n (%) OR (IC 95%)
Valor
de P PA
PRKCA c.288+33994A>G
Alelo A 75% 82% Referência
Alelo G 25% 18% 1,36 (0,81-2,28) 0,23
AA 57 (55,3) 71 (68,9) Referência
AG 41 (39,8) 26 (25,3) 2,00 (1,00-3,92) 0,04 61%
GG 5 (4,9) 6 (5,8) 1,10 (0,27-4,36) 0,89
AA 57 (55,3) 71 (68,9) Referência
AG+GG 46 (44,7) 32 (31,1) 1,80 (0,95-3,52) 0,07
AA+AG 98 (95,1) 97 (94,2) Referência
GG 5 (4,9) 6 (5,8) 1,40 (0,36-5,43) 0,62
CALM2 g.47384601A>G
Alelo A 43% 60% Referência
Alelo G 57% 40% 2,21 (1,43-3,41) 0,001
AA 19 (18,4) 39 (37,9) Referência
AG 51 (49,6) 46 (44,6) 2,41 (1,12-5,18) 0,02 12%
GG 33 (32,0) 18 (17,5) 4,75 (1,90-11,87) 0,001 68%
AA 19 (18,4) 39 (37,9) Referência
AG+GG 84 (81,6) 64 (62,1) 3,32 (1,58-6,97) 0,001 88%
AA+AG 70 (68,0) 85 (82,5) Referência
GG 33 (32,0) 18 (17,5) 2,77 (1,33-5,77) 0,52
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:
intervalo de confiança; PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados
61
A frequência do genótipo AG do SNP PRKCA c.288+33994A>G foi maior em
pacientes do que em controles. Indivíduos com o referido genótipo estiveram sob risco de
ocorrência de de MC duas vezes maior do que os com os demais genótipos.
As frequências do alelo G, do genótipo AG, do genótipo GG e do genótipo AG ou
GG do SNP CALM2 g.47384601A>G foram maiores em pacientes do que em controles.
Portadores dos respectivos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 2,21, 2,41, 4,75 e 3,32
vezes maiores de ocorrência do MC do que índividuos com os demais genótipos.
Tabela 13. Distribuições dos alelos selvagem e variante e genótipos dos polimorfismos
CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes com melanoma
cutâneo e controles
Genótipos Pacientes
n (%)
Controles
n (%) OR (IC 95%)
Valor
de P PA
CREB1 c.261+1161G>A
Alelo G 54% 68% Referência
Alelo A 46% 32% 1,98 (1,27-3,09) 0,002
GG 28 (27,2) 49 (47,6) Referência
GA 55 (53,4) 42 (40,7) 2,93 (1,48-5,79) 0,002 45%
AA 20 (20,4) 12 (11,7) 3,99 (1,37-11,63) 0,001 40%
GG 28 (27,2) 49 (47,6) Referência
GA+AA 75 (72,8) 54 (52,4) 2,93 (1,52-5,64) 0,001 87%
GG+GA 83 (79,6) 91 (88,3) Referência
AA 20 (20,4) 12 (11,7) 1,33 (0,55-3,24) 0,52
MITF c.635-325A>G
Alelo A 55% 40% 1,69 (1,10-2,59) 0,01
Alelo G 45% 60% Referência
AA 35 (34,0) 15 (14,6) 3,13 (1,33-7,34) 0,009 91%
AG 43 (41,7) 52 (50,4) 1,10 (0,54-2,24) 0,78
GG 25 (24,3) 36 (35,0) Referência
AA 35 (34,0) 15 (14,6) 2,77 (1,30-5,88) 0,008 91%
AG+GG 68 (66,0) 88 (84,4) Referência
AA+AG 78 (75,7) 67 (65,0) 1,42 (0,73-2,77) 0,30
GG 25 (24,3) 36 (35,0) Referência
OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC:
intervalo de confiança; PA: poder da análise; valores de P< 0,05 estão destacados
62
A frequência do alelo A, do genótipo GA, do genótipo AA e do genótipo GA ou AA
do SNP CREB1 c.261+1161G>A foram maiores em pacientes do que em controles.
Portadores dos alelo e genótipos estiveram sob riscos de 1,98, 2,93, 3,99 e 2,93 vezes
maiores de ocorrência do MC do que portadores dos demais genótipos, respectivamente.
A frequência do alelo A e do genótipo AA do SNP MITF c.635-325A>G foram
maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos portadores do referido alelo e
genótipo estiveram sob riscos de 1,69 e 3,13 vezes maiores de ocorrência do MC do que
indivíduos com os demais genótipos.
As frequências diferenciadas de genótipos dos dez SNPs combinados dois a dois
em pacientes e controles foram estão apresentadas na Tabela 14.
63
Tabela 14. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos WNT8B
c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3
c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA
c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF
c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
e controles
SNPs combinados Pacientes
n (%)
Controles
n (%) Valor de P OR (IC 95%)
WNT8B + PRKCA1
CC+ TC + AA+GA 36 (73,5) 17 (37,8) 0,001 5,08 (1,88-13,67)
TT + GG 13 (26,5) 28 (62,2) Referência
WNT8B + PRKCA2
CC+CT + GG+AG 23 (41,1) 9 (14,1) 0,004 4,20 (1,57-11,19)
TT + AA 33 (58,9) 55 (85,9) Referência
WNT8B + MITF
CC+CT + AA+GA 35 (72,9) 16 (37,2) 0,004 4,29 (1,59-11,52)
TT + GG 13 (27,1) 27 (62,8) Referência
KIT + PRKCA1
TT+TC + AA+GA 68 (97,1) 49 (81,7) 0,004 17,30 (2,46-121,55)
CC + GG 2 (2,9) 11 (18,3) Referência
KIT + PRKCA2
TT+TC + GG+AG 41 (83,7) 24 (53,3) 0,002 5,27 (1,84-15,09)
CC + AA 8 (16,3) 21 (46,7) Referência
KIT + MITF
TT + AA 11 (22,0) 5 (6,8) 0,03 3,80 (1,08-13,36)
TC+CC + GG+GA 39 (78,0) 69 (93,2) Referência
GNAI1 + PLCB1
TT+TC + AA+CA 75 (98,7) 62 (84,9) 0,006 22,86 (2,45-212,48)
CC + CC 1 (1,3) 11 (15,1) Referência
GNAI1 + MITF
TT + AA 22 (44,9) 6 (10,9) 0,001 6,93 (2,27-21,21)
CC+CT + GG+GA 27 (55,1) 49 (89,1) Referência
ADCY3 + CREB1
TT+TG + AA+GA 69 (94,5) 42 (76,4) 0,002 7,23 (2,02-25,84)
GG + GG 4 (5,5) 13 (23,6) Referência
ADCY3 + PRKCA1
TT+TG + AA+AG 72 (96,0) 52 (83,9) 0,009 7,67 (1,66-35,38)
GG + GG 3 (4,0) 10 (16,1) Referência
ADCY3 + PRKCA2
TT+TG + GG+AG 41 (89,1) 26 (57,8) 0,001 8,93 (2,50-31,83)
GG + AA 5 (10,9) 19 (42,2) Referência
ADCY3 + MITF
TT+TG + AA+AG 70 (97,2) 52 (83,9) 0,01 19,17 (1,97-186,35)
GG + GG 2 (2,8) 10 (16,1) Referência
PRKCA1 + PRKCA2
AA+GA + GG+AG 33 (75,0) 21 (45,7) 0,004 4,64 (1,62-13,30)
GG + AA 11 (25,0) 25 (54,3) Referência
PRKCA2 + PLCB1
GG+AG + AA+CA 37 (71,2) 22 (46,8) 0,009 3,71 (1,39-9,93)
AA + CC 15 (28,8) 25 (53,2) Referência
64
PRKCA2 + MITF
GG+AG + AA+GA 34 (72,3) 21 (45,7) 0,03 2,74 (1,09-6,88)
AA + GG 13 (27,7) 25 (54,3) Referência
CALM2 + CREB1
GG + AA 10 (14,3) 2 (2,6) 0,03 5,83 (1,08-31,21)
AA+AG + GG+GA 60 (85,7) 75 (97,4) Referência
CALM2 + PRKCA1
GG+AG + AA+GA 64 (94,1) 42 (75,0) 0,004 7,35 (1,89-28,50)
AA+GG 4 (5,9) 14 (25,0) Referência
CALM2 + PRKCA2
GG+GA + GG+AG 42 (73,7) 21 (42,9) <0,001 6,43 (2,28-18,13)
AA + AA 15 (26,3) 28 (57,1) Referência
CALM2 + PLCB1
GG+AG + AA+CA 63 (95,5) 41 (77,4) 0,003 9,87(2,14-45,55)
AA + CC 3 (4,5) 12 (22,6) Referência
CREB1 + WNT8B
AA+GA + CC+TC 32 (71,1) 9 (21,4) <0,001 9,93 (3,24-30,38)
GG+TT 13 (28,9) 33 (78,6) Referência
CREB1 + PRKCA2
AA+GA + GG+AG 36 (66,7) 17 (33,3) 0,001 4,83 (1,89-12,32)
GG+AA 18 (33,3) 34 (66,7) Referência
CREB1 + PLCB1
AA+GA + AA+CA 59 (96,7) 40 (81,6) 0,03 5,91 (1,14-30,64)
GG + AA 2 (3,3) 9 (18,4) Referência
CREB1 + MITF
AA+GA + AA+GA 57 (89,1) 34 (68,0) 0,004 5,06 (1,67-15,28)
GG + GG 7 (10,9) 16 (32,0) Referência
SNP: polimorfismo de base única, OR: razão das chances ajustada por idade, fototipo
cutâneo, cor dos olhos e cabelos; IC: intervalo de confiança; PA: poder da análise; PRKCA1:
se refere ao SNP PRKCA c.205+407G>A; PRKCA2: se refere ao SNP PRKCA
c.288+33994A>G
65
As frequências dos genótipos combinados dos diversos SNPs acima apresentados
foram maiores em pacientes do que em controles. Indivíduos com os respectivos genótipos
combinados estiveram sob riscos substancialmente maiores (2,74 a 22,86) de ocorrência de
MC do que os demais. Frequências similares das combinações dos demais genótipos foram
observadas em pacientes e controles. Indivíduos com os distintos genótipos dos referidos
SNPs estiveram sob riscos similares de MC do que os demais.
9. Polimorfismos em genes da melanogênese em aspectos clínicos de pacientes
As frequências dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1
g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA
c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1
c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes estratificados por idade mediana,
sexo, fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos, presença de efélides e nevos e exposição
solar estão apresentadas nas Tabelas 15 a 24.
66
Tabela 15. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes
com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de
olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
Genótipos WNT8B c.-101T>C
Variável TT
n (%)
TC+CC
n (%)
Valor
de P
TT+TC
n (%)
CC
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 30 (56,6) 23 (43,4) 0,69 51 (96,2) 2 (3,8) 1,00
≥54 anos 26 (52,0) 24 (48,0) 49 (98,0) 1 (2,0)
Sexo
Masculino 34 (55,7) 27 (44,3) 0,84 59 (96,7) 2 (3,3) 1,00
Feminino 22 (52,4) 20 (47,6) 41 (97,6) 1 (2,4)
Fototipo
I+II 35 (53,0) 31 (47,0) 0,67 64 (97,0) 2 (3,0) 1,00
III+IV+V+VI 20 (58,8) 14 (41,2) 33 (97,1) 1 (2,9)
Cor dos olhos
Claros 22 (59,5) 15 (40,5) 0,53 37 (100) 0 (0,0) 1,00
Não claros 33 (52,4) 30 (47,6) 60 (95,2) 3 (4,8)
Cor dos cabelos
Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,12 29 (100) 0 (0,0) 0,55
Não claros 43 (60,6) 28 (39,4) 68 (95,8) 3 (4,2)
Presença de efélides
Sim 30 (47,6) 33 (52,4) 0,10 61 (96,8) 2 (3,2) 1,00
Não 26 (65,0) 14 (35,0) 39 (97,5) 1 (2,5)
Presença de nevos
>20 33 (52,4) 30 (47,6) 0,68 60 (95,2) 3 (4,8) 1,00
≤20 23 (57,5) 17 (42,5) 40 (100) 0 (0,0)
Exposição solar
Crônica 28 (57,1) 21 (42,9) 1,00 47 (95,9) 2 (4,1) 1,00
Intermitente/ nenhuma 22 (59,5) 15 (40,5) 36 (97,3) 1 (2,7)
67
Tabela 16. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT c.67+12766T>C em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos KIT c.67+12766T>C
Variável TT
n (%)
TC+CC
n (%)
Valor
de P
TT+TC
n (%)
CC
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 18 (34,0) 35 (66,0) 0,31 48 (90,6) 5 (9,4) 0,38
≥54 anos 22 (44,0) 28 (56,0) 42 (84,0) 8 (16,0)
Sexo
Masculino 25 (41,0) 36 (59,0) 0,68 53 (86,9) 8 (13,1) 1,00
Feminino 15 (37,5) 27 (64,3) 37 (88,1) 5 (11,9)
Fototipo
I+II 22 (33,3) 44 (66,7) 0,08 57 (86,4) 9 (13,6) 1,00
III+IV+V+VI 18 (52,9) 16 (47,1) 30 (88,2) 4 (11,8)
Cor dos olhos
Claros 11 (29,7) 26 (70,3) 0,14 29 (78,4) 8 (21,6) 0,06
Não claros 29 (46,0) 34 (54,0) 58 (92,1) 5 (7,9)
Cor dos cabelos
Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 1,00 25 (86,2) 4 (13,0) 1,00
Não claros 28 (39,4) 43 (60,6) 62 (87,3) 9 (12,7)
Presença de efélides
Sim 25 (39,7) 38 (60,3) 0,83 54 (85,7) 9 (14,3) 0,76
Não 15 (37,5) 25 (62,5) 36 (90,0) 4 (10,0)
Presença de nevos
>20 24 (38,1) 39 (61,9) 1,00 54 (85,7) 9 (14,3) 0,76
≤20 24 (38,1) 39 (61,9) 36 (90,0) 4 (10,0)
Exposição solar
Crônica 23 (46,9) 26 (53,1) 0,51 42 (85,7) 7 (14,3) 1,00
Intermitente/nenhuma 14 (37,8) 23 (62,2) 32 (86,5) 5 (13,5)
68
Tabela 17. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos GNAL1 g.80130766C>T
Variável CC
n (%)
CT+TT
n (%)
Valor
de P
CC+CT
n (%)
TT
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 1 (1,9) 52 (98,1) 0,19 24 (45,3) 29 (54,7) 0,22
≥54 anos 4 (8,0) 46 (92,0) 16 (32,0) 34 (68,0)
Sexo
Masculino 4 (6,6) 57 (93,4) 0,64 22 (36,1) 39 (63,9) 0,54
Feminino 1 (2,4) 41 (97,6) 18 (42,9) 24 (57,1)
Fototipo
I+II 2 (3,0) 64 (97,0) 0,33 22 (33,3) 44 (66,7) 0,13
III+IV+V+VI 3 (8,8) 31 (91,2) 17 (50,0) 17 (50,0)
Cor dos olhos
Claros 1 (2,7) 36 (97,3) 0,64 13 (35,1) 24 (64,9) 0,67
Não claros 4 (6,3) 59 (93,7) 26 (41,3) 37 (58,7)
Cor dos cabelos
Claros 2 (6,9) 27 (93,1) 0,62 13 (44,8) 16 (55,2) 0,50
Não claros 3 (4,2) 68 (95,8) 26 (36,6) 45 (63,4)
Presença de efélides
Sim 4 (6,3) 59 (93,7) 0,64 25 (39,7) 38 (60,3) 0,83
Não 1 (2,5) 39 (97,5) 15 (37,5) 25 (62,5)
Presença de nevos
>20 3 (4,8) 60 (95,2) 1,00 23 (36,5) 40 (63,5) 0,67
≤20 2 (5,0) 38 (95,0) 17 (42,5) 23 (57,5)
Exposição solar
Crônica 3 (6,1) 46 (93,9) 0,63 20 (40,8) 29 (59,2) 0,36
Intermitente/nenhuma 1 (2,7) 36 (97,3) 11 (29,7) 26 (70,3)
69
Tabela 18. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos ADCY3 c.675+9196T>G
Variável TT
n (%)
TG+GG
n (%)
Valor
de P
TT+TG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 19 (35,8) 34 (64,2) 50 (94,3) 3 (5,7) 0,19
≥54 anos 18 (36,0) 32 (64,0) 1,00 43 (86,0) 7 (14,0)
Sexo
Masculino 22 (36,1) 39 (63,9) 1,00 56 (91,8) 5 (8,2) 0,73
Feminino 15 (35,7) 27 (64,3) 37 (88,1) 5 (11,9)
Fototipo
I+II 25 (37,9) 41 (62,1) 0,66 61 (92,4) 5 (7,6) 0,30
III+IV+V+VI 11 (32,4) 23 (67,6) 29 (85,3) 5 (14,7)
Cor dos olhos
Claros 17 (45,9) 20 (54,1) 0,13 34 (91,9) 3 (8,1) 0,74
Não claros 19 (30,2) 44 (69,8) 56 (88,9) 7 (11,1)
Cor dos cabelos
Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,49 27 (93,1) 2 (6,9) 0,71
Não claros 24 (33,8) 47 (66,2) 63 (88,7) 8 (11,3)
Presença de efélides
Sim 26 (41,3) 37 (58,7) 0,20 57 (90,5) 6 (9,5) 1,00
Não 11 (27,5) 29 (72,5) 36 (90,0) 4 (10,0)
Presença de nevos
>20 20 (31,7) 43 (68,3) 0,29 60 (95,2) 3 (4,8) 0,04
≤20 17 (42,5) 23 (57,5) 33 (85,5) 7 (17,5)
Exposição solar
Crônica 16 (32,7) 33 (67,3) 0,65 42 (85,7) 7 (14,3) 0,28
Intermitente/nenhuma 14 (37,8) 23 (62,2) 35 (94,6) 2 (5,4)
A diferença entre grupos está destacada
70
Tabela 19. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos PLCB1 g.8908966C>A
Variável CC
n (%)
CA+AA
n (%)
Valor
de P
CC+CA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 12 (22,6) 41 (77,4) 1,00 42 (79,2) 11 (20,8) 0,44
≥54 anos 12 (24,0) 38 (76,0) 43 (86,0) 7 (14,0)
Sexo
Masculino 10 (16,4) 51 (83,6) 0,06 52 (85,2) 9 (14,8) 0,43
Feminino 14 (33,3) 28 (66,7) 33 (78,6) 9 (21,4)
Fototipo
I+II 14 (21,2) 52 (78,8) 0,45 52 (78,8) 14 (21,2) 0,16
III+IV+V+VI 10 (29,4) 24 (70,6) 31 (91,2) 3 (8,8)
Cor dos olhos
Claros 8 (21,6) 29 (78,4) 0,81 29 (78,4) 8 (21,6) 0,41
Não claros 16 (25,4) 47 (74,6) 54 (85,7) 9 (14,3)
Cor dos cabelos
Claros 8 (27,6) 21 (72,4) 0,61 23 (79,3) 6 (20,7) 0,56
Não claros 16 (22,5) 55 (77,5) 60 (84,5) 11 (15,5)
Presença de efélides
Sim 17 (27,0) 46 (73,0) 0,34 52 (82,5) 11 (17,5) 1,00
Não 7 (17,5) 33 (82,5) 33 (82,5) 7 (17,5)
Presença de nevos
>20 12 (19,0) 51 (81,0) 0,23 53 (84,1) 10 (15,9) 0,60
≤20 12 (30,0) 28 (70,0) 32 (80,0) 8 (20,0)
Exposição solar
Crônica 11 (22,4) 38 (77,6) 0,80 41 (83,7) 8 (16,3) 0,78
Intermitente/nenhuma 10 (27,0) 27 (73,0) 30 (81,1) 7 (18,9)
71
Tabela 20. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos PRKCA c.205+407G>A
Variável GG
n (%)
GA+AA
n (%)
Valor
de P
GG+GA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 8 (15,1) 45 (84,9) 0,06 44 (83,0) 9 (17,0) 0,23
≥54 anos 16 (32,0) 34 (68,0) 36 (72,0) 14 (28,0)
Sexo
Masculino 15 (24,6) 46 (75,4) 0,81 52 (85,2) 9 (14,8) 0,06
Feminino 9 (21,4) 33 (78,6) 28 (66,7) 14 (33,3)
Fototipo
I+II 15 (22,7) 51 (77,3) 1,00 51 (77,3) 15 (22,7) 1,00
III+IV+V+VI 8 (23,5) 26 (76,5) 27 (79,4) 7 (20,6)
Cor dos olhos
Claros 8 (21,6) 29 (78,4) 1,00 30 (81,1) 7 (18,9) 0,62
Não claros 15 (23,8) 48 (76,2) 48 (76,2) 15 (23,8)
Cor dos cabelos
Claros 6 (20,7) 23 (79,3) 0,79 23 (79,3) 6 (20,7) 1,00
Não claros 17 (23,9) 54 (76,1) 55 (77,5) 16 (22,5)
Presença de efélides
Sim 19 (30,2) 44 (69,8) 0,05 49 (77,8) 14 (22,2) 1,00
Não 5 (12,5) 35 (87,5) 31 (77,5) 9 (22,5)
Presença de nevos
>20 15 (23,8) 48 (76,2) 1,00 52 (82,5) 11 (17,5) 0,15
≤20 9 (22,5) 31 (77,5) 28 (70,0) 12 (30,0)
Exposição solar
Crônica 15 (30,6) 34 (69,4) 0,31 36 (73,5) 13 (26,5) 0,30
Intermitente/nenhuma 7 (18,9) 30 (81,1) 31 (83,8) 6 (16,2)
72
Tabela 21. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos PRKCA c.288+33994A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 30 (56,6) 23 (43,4) 0,84 50 (94,3) 3 (5,7) 1,00
≥54 anos 27 (54,0) 23 (46,0) 48 (96,0) 2 (4,0)
Sexo
Masculino 30 (49,2) 31 (50,8) 0,16 57 (93,4) 4 (6,6) 0,64
Feminino 27 (64,3) 15 (35,7) 41 (97,6) 1 (2,4)
Fototipo
I+II 35 (53,0) 31 (47,0) 0,67 63 (95,5) 3 (4,5) 1,00
III+IV+V+VI 20 (58,8) 14 (41,2) 32 (94,1) 2 (5,9)
Cor dos olhos
Claros 20 (54,1) 17 (45,9) 1,00 36 (97,3) 1 (2,7) 0,64
Não claros 35 (55,6) 28 (44,4) 59 (93,7) 4 (6,3)
Cor dos cabelos
Claros 17 (58,6) 12 (41,4) 0,66 28 (96,6) 1 (3,4) 1,00
Não claros 38 (53,5) 33 (46,5) 67 (94,4) 4 (5,6)
Presença de
efélides
Sim 40 (63,5) 23 (36,5) 0,05 59 (93,7) 4 (6,3) 0,64
Não 17 (42,5) 23 (57,5) 39 (97,5) 1 (2,5)
Presença de nevos
>20 36 (57,1) 27 (42,9) 0,68 58 (92,1) 5 (7,9) 0,15
≤20 21 (52,5) 19 (47,5) 40 (100) 0 (0,0)
Exposição solar
Crônica 25 (51,0) 24 (49,0) 0,51 46 (93,9) 3 (6,1) 1,00
Intermitente 22 (59,5) 15 (40,5) 35 (94,6) 2 (5,4)
73
Tabela 22. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos CALM2 g.47384601A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 10 (18,9) 43 (81,1) 1,00 35 (66,0) 18 (34,0) 0,67
≥54 anos 9 (18,0) 41 (82,0) 35 (70,0) 15 (30,0)
Sexo
Masculino 16 (26,2) 45 (73,8) 0,02 45 (73,8) 16 (26,2) 0,14
Feminino 3 (7,1) 39 (92,9) 25 (59,5) 17 (40,5)
Fototipo
I+II 11 (16,7) 55 (83,3) 0,78 46 (69,7) 20 (30,3) 0,65
III+IV+V+VI 7 (20,6) 27 (79,4) 22 (64,7) 12 (35,3)
Cor dos olhos
Claros 4 (10,8) 33 (89,2) 0,18 27 (73,0) 10 (27,0) 0,50
Não claros 14 (22,2) 49 (77,8) 41 (65,1) 22 (34,9)
Cor dos cabelos
Claros 6 (20,7) 23 (79,3) 0,77 23 (79,3) 6 (20,7) 0,15
Não claros 12 (16,9) 59 (83,1) 45 (63,4) 26 (36,6)
Presença de efélides
Sim 14 (22,2) 49 (77,8) 0,29 41 (65,1) 22 (34,9) 0,51
Não 5 (12,5) 35 (87,5) 29 (72,5) 11 (27,5)
Presença de nevos
> 20 13 (20,6) 50 (85,5) 0,60 43 (68,3) 20 (31,7) 1,00
≤ 20 6 (15,0) 34 (79,4) 27 (67,5) 13 (32,5)
Exposição solar
Crônica 9 (18,4) 40 (81,6) 1,00 32 (65,3) 17 (34,7) 0,64
Intermitente/nenhuma 7 (18,9) 30 (81,1) 26 (70,3) 11 (29,7)
74
Tabela 23. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G em pacientes
com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo, fototipo, cor de
olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e exposição solar
Genótipos CREB1 c.261+1161G>A
Variável GG
n (%)
GA+AA
n (%)
Valor
de P
GG+GA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 14 (26,4) 39 (73,6) 1,00 43 (81,1) 10 (18,9) 1,00
≥54 anos 14 (28,0) 36 (72,0) 40 (80,0) 10 (20,0)
Sexo
Masculino 17 (27,9) 44 (72,1) 1,00 51 (83,6) 32 (76,2) 0,44
Feminino 11 (26,2) 31 (73,8) 10 (16,4) 10 (23,8)
Fototipo
I+II 18 (27,3) 48 (72,7) 0,81 52 (78,8) 14 (21,2) 0,16
III+IV+V+VI 10 (29,4) 24 (70,6) 31 (91,2) 3 (8,8)
Cor dos olhos
Claros 13 (35,1) 24 (64,9) 0,25 29 (78,4) 8 (21,6) 0,41
Não claros 15 (23,8) 48 (76,2) 54 (85,7) 9 (14,3)
Cor dos cabelos
Claros 10 (34,5) 19 (65,5) 0,46 21 (72,4) 8 (27,6) 0,08
Não claros 18 (25,4) 53 (74,6) 62 (87,3) 9 (12,7)
Presença de efélides
Sim 16 (25,4) 47 (74,6) 0,65 51 (81,0) 12 (19,0) 1,00
Não 12 (30,0) 28 (70,0) 32 (80,0) 8 (20,0)
Presença de nevos
>20 15 (23,8) 48 (76,2) 0,36 49 (77,8) 14 (22,2) 0,44
≤20 13 (32,5) 27 (67,5) 34 (85,0) 6 (15,0)
Exposição solar
Crônica 49 (77,8) 14 (22,2) 0,44 13 (26,5) 36 (73,5) 0,63
Intermitente/nenhuma 34 (85,0) 6 (15,0) 12 (32,4) 25 (67,6)
75
Tabela 24. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade mediana, sexo,
fototipo, cor de olhos e cabelos, presença de efélides, presença de nevos e
exposição solar
Genótipos MITF c.635-325A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 18 (34,0) 35 (66,0) 1,00 36 (67,9) 17 (32,1) 0,06
≥54 anos 17 (34,0) 33 (66,0) 42 (84,0) 8 (16,0)
Sexo
Masculino 21 (34,4) 40 (65,6) 1,00 47 (77,0) 14 (23,0) 0,81
Feminino 14 (33,3) 28 (66,7) 31 (73,8) 11 (26,2)
Fototipo
I+II 26 (39,4) 40 (60,6) 0,12 46 (69,7) 20 (30,3) 0,14
III+IV+V+VI 8 (23,5) 26 (76,5) 29 (85,3) 5 (14,7)
Cor dos olhos
Claros 14 (37,8) 23 (62,2) 0,66 28 (75,7) 9 (24,3) 1,00
Não claros 20 (31,7) 43 (68,3) 47 (74,6) 16 (25,4)
Cor dos cabelos
Claros 12 (41,4) 17 (58,6) 0,35 24 (82,8) 5 (17,2) 0,31
Não claros 22 (31,0) 49 (69,0) 51 (71,8) 20 (28,2)
Presença de
efélides
Sim 19 (30,2) 44 (69,8) 0,39 46 (73,0) 17 (27,0) 0,48
Não 16 (40,0) 24 (60,0) 32 (80,0) 8 (20,0)
Presença de nevos
>20 23 (36,5) 40 (63,5) 0,53 47 (74,6) 16 (25,4) 0,81
≤20 12 (30,0) 28 (70,0) 31 (77,5) 9 (22,5)
Exposição solar
Crônica 20 (40,8) 29 (59,2) 0,36 38 (77,6) 11 (22,4) 1,00
Intermitente 11 (29,7) 26 (70,3) 28 (75,7) 9 (24,3)
76
Frequências similares dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAL1 g.80130766C>T, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA
c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-
325A>G foram observadas em pacientes estratificados pelas referidas características
clínicas.
A frequência dos genótipos TT ou TG do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foi maior
em pacientes com número de nevos maior que 20 do que naqueles com menor número de
nevos. Já a frequência dos genótipos AG ou GG do SNP CALM2 g.47384601A>G foi
maior em mulheres do que em homens.
As frequências diferenciadas dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, associados dois a dois,
somente em pacientes com MC de acordo com as características clínicas como idade, sexo,
fototipo cutâneo, cor de olhos e cabelos estão apresentadas na Tabela 25.
77
Tabela 25. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos WNT8B c.-
101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3
c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA
c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A, MITF
c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma cutâneo
estratificados por fototipo cutâneo, cor dos olhos e cabelos e presença de
efélides e nevos
SNPs combinados Características clínicas Valor de P
Fototipo
GNAI1 + MITF I+II n (%) III+IV+V+VI n (%)
TT + AA 17 (56,7) 5 (26,3) 0,04
CC+CT + GG+GA 13 (43,3) 14 (73,7)
Cor dos olhos
ADCY3 + CREB1 Claros n (%) Não claros n (%)
TT + AA 6 (25,0) 2 (5,1) 0,04
TG+GG + GA+GG 18 (75,0) 37 (94,9)
Cor dos cabelos
ADCY3 + CREB1 Claros n (%) Não claros n (%)
TT + AA 5 (26,3) 3 (6,8) 0,04
TG+GG + GA+GG 14 (73,7) 41 (93,2)
ADCY3 + MITF
TT + AA 7 (36,8) 3 (9,7) 0,03
TG+GG + AG+GG 12 (63,2) 28 (90,3)
CREB1 + MITF
AA + AA 7 (30,4) 4 (8,3) 0,03
GG+GA + GG+GA 16 (69,6) 44 (91,7)
Efélides
PRKCA1+PRKCA2 Sim n (%) Não n (%)
AA+GA + GG+AG 13 (59,1) 20 (90,9) 0,03
GG + AA 9 (40,9) 2 (9,1)
PRKCA1 + PLCB1
AA+GA + AA+CA 33 (24,6) 28 (100) 0,03
GG + CC 6 (15,4) 0 (0,0)
Nevos
ADCY3 + WNT8B >50 n (%) ≤50 n (%)
TT+TG + CC+CT 28 (96,6) 15 (75,0) 0,03
GG + TT 1 (3,4) 5 (25,0)
78
ADCY3 + PRKCA1
TT + AA 9 (31,0) 2 (5,6) 0,009
TG+GG + GA+GG 20 (69,0) 34 (94,4)
SNP: polimorfismo gênico de base única; PRKCA1: se refere ao PRKCA
c.205+407G>A; PRKCA2: se refere PRKCA c.288+33994A>G. As diferenças entre
grupos estão destacadas
A frequência do genótipo combinado GNAI1 TT + MITF AA foi maior em
pacientes com fototipo I+II do que em pacientes com os demais fototipos. O genótipo
combinado ADCY3 TT + CREB1 AA foi mais comum em pacientes com olhos claros do
que pacientes com olhos escuros. As frequências dos genótipos combinados ADCY3 TT
CREB1 AA, ADCY3 TT + MITF AA e CREB1 AA + MITF AA foram maiores em
pacientes com cabelos claros do que pacientes com cabelos escuros. Os genótipos
combinados PRKCA1 AA+GA + PRKCA2 AG+GG e PRKCA1 AA+GA + PLCB1
AA+CA foram mais comuns em pacientes com efélides do que em pacientes sem efélides.
As frequências do genótipos combinados ADCY3 TT+TG + WNT8B CC+CT e ADCY3 TT
+ PRKCA1 AA foram maiores em pacientes com número de nevos maior que 50 do que
em pacientes com número menor de nevos.
10. Polimorfismos em genes da melanogênese e aspectos do tumor em pacientes
As frequências dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C,
GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA
c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1
c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G em pacientes estratificados por localização,
espessuras de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor estão apresentadas nas
Tabelas 26 a 35.
79
Tabela 26. Distribuições dos genótipos do polimorfismo WNT8B c.-101T>C em pacientes
com melanoma cutâneo estratificados pela localização, espessuras de Breslow,
níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos WNT8B c.-101T>C
Variável TT
n (%)
TC+CC
n (%)
Valor
de P
TT+TC
n (%)
CC
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 30 (50,8) 29 (49,2) 1,00 57 (96,6) 2 (3,4) 0,54
Membros 16 (51,6) 15 (48,4) 31 (100) 0 (0,0)
Breslow
>1,5mm 26 (53,1) 23 (46,9) 0,83 48 (98,0) 1 (2,0) 0,59
≤1,5mm 24 (55,8) 19 (44,2) 41 (95,3) 2 (4,7)
Clark
I+II 28 (50,0) 28 (50,0) 0,40 54 (96,4) 2 (3,6) 1,00
III+IV+V 24 (60,0) 16 (40,0) 39 (97,5) 1 (2,5)
Estágio TNM
0+I+II 35 (60,3) 21 (46,7) 0,23 56 (96,6) 2 (3,4) 1,00
III+IV 21 (46,7) 24 (53,3) 44 (97,8) 1 (2,2)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
80
Tabela 27. Distribuições dos genótipos do polimorfismo KIT c.67+12766T>C em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados pela localização, espessuras
de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos KIT c.67+12766T>C
Variável TT
n (%)
TC+CC
n (%)
Valor
de P
TT+TC
n (%)
CC
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 22 (37,3) 37 (62,7) 1,00 47 (79,7) 12 (20,3) 0,03
Membros 11 (35,5) 20 (64,5) 30 (96,8) 1 (3,2)
Breslow
>1,5mm 16 (32,7) 33 (67,3) 0,28 41 (83,7) 8 (16,3) 0,36
≤1,5mm 19 (44,2) 24 (55,8) 39 (90,7) 4 (9,3)
Clark
I+II 22 (39,3) 34 (60,7) 1,00 48 (85,7) 8 (14,3) 1,00
III+IV+V 15 (37,5) 25 (62,5) 35 (87,5) 5 (12,5)
Estágio TNM
0+I+II 23 (39,7) 35 (60,3) 1,00 50 (86,2) 8 (13,8) 0,77
III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 40 (88,9) 5 (11,1)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco; a diferença entre grupos
está destacada
81
Tabela 28. Distribuições dos genótipos do polimorfismo GNAL1 g.80130766C>T em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras
de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos GNAL1 g.80130766C>T
Variável CC
n (%)
CT+TT
n (%)
Valor
de P
CC+CT
n (%)
TT
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 4 (6,8) 55 (93,2) 0,65 22 (37,3) 37 (62,7) 1,00
Membros 1 (3,2) 30 (96,8) 12 (38,7) 19 (61,3)
Breslow
>1,5mm 4 (8,2) 45 (91,8) 0,36 20 (40,8) 29 (59,2) 1,00
≤1,5mm 1 (2,3) 42 (97,7) 18 (41,9) 25 (58,1)
Clark
I+II 2 (3,6) 54 (96,4) 0,64 19 (33,9) 37 (66,1) 0,20
III+IV+V 3 (7,5) 37 (92,5) 19 (47,5) 21 (52,5)
Estágio TNM
0+I+II 2 (3,4) 56 (96,6) 0,65 21 (36,2) 37 (63,8) 0,54
III+IV 3 (6,7) 42 (93,3) 19 (42,2) 26 (57,8)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
82
Tabela 29. Distribuições dos genótipos do polimorfismo ADCY3 c.675+9196T>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras
de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos ADCY3 c.675+9196T>G
Variável TT
n (%)
TG+GG
n (%)
Valor de
P
TT+TG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 19 (32,2) 40 (67,8) 0,64 53 (89,8) 6 (10,2) 0,73
Membros 12 (38,7) 19 (61,3) 27 (87,1) 4 (12,9)
Breslow
>1,5mm 17 (34,7) 32 (65,3) 1,00 43 (87,8) 6 (12,2) 0,49
≤1,5mm 14 (32,6) 29 (67,4) 40 (93,0) 3 (7,0)
Clark
I+II 18 (32,1) 38 (67,9) 0,51 52 (92,9) 4 (7,1) 0,48
III+IV+V 16 (40,0) 24 (60,0) 35 (87,5) 5 (12,5)
Estágio TNM
0+I+II 20 (34,5) 38 (65,5) 0,83 54 (93,1) 4 (6,9) 0,32
III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 39 (86,7) 6 (13,3)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
83
Tabela 30. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PLCB1 g.8908966C>A em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de
Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos PLCB1 g.8908966C>A
Variável CC
n (%)
CA+AA
n (%)
Valor
de P
CC+CA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 11 (18,6) 48 (81,4) 0,43 49 (83,1) 10 (16,9) 0,40
Membros 8 (25,8) 23 (74,2) 23 (74,2) 8 (25,8)
Breslow
>1,5mm 10 (20,4) 39 (79,6) 0,62 39 (79,6) 10 (20,4) 0,78
≤1,5mm 11 (25,6) 32 (74,4) 36 (83,7) 7 (16,3)
Clark
I+II 12 (21,4) 44 (78,6) 0,80 46 (82,1) 10 (17,9) 1,00
III+IV+V 10 (25,0) 30 (75,0) 33 (82,5) 7 (17,5)
Estágio TNM
0+I+II 16 (27,6) 42 (72,4) 0,34 47 (81,0) 11 (19,0) 0,79
III+IV 8 (17,8) 37 (82,2) 38 (84,4) 7 (15,6)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
84
Tabela 31. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.205+407G>A em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de
Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos PRKCA c.205+407G>A
Variável GG
n (%)
GA+AA
n (%)
Valor
de P
GG+GA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 14 (23,7) 45 (76,3) 1,00 48 (81,4) 11 (18,6) 0,19
Membros 7 (22,6) 24 (77,4) 21 (67,7) 10 (32,3)
Breslow
>1,5mm 14 (28,6) 35 (71,4) 0,63 43 (87,8) 6 (12,2) 0,04
≤1,5mm 10 (23,3) 33 (76,7) 30 (69,8) 13 (30,2)
Clark
I+II 12 (21,4) 44 (78,6) 0,35 40 (71,4) 16 (28,6) 0,08
III+IV+V 12 (30,0) 28 (70,0) 35 (87,5) 5 (12,5)
Estágio TNM
0+I+II 14 (24,1) 44 (75,9) 1,00 43 (74,1) 15 (25,9) 0,35
III+IV 10 (22,2) 35 (77,8) 37 (82,2) 8 (17,8)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco; a diferença entre grupos
está destacada
85
Tabela 32. Distribuições dos genótipos do polimorfismo PRKCA c.288+33994A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de
Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos PRKCA c.288+33994A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 32 (54,2) 27 (45,8) 0,82 55 (93,2) 4 (6,8) 0,65
Membros 16 (51,6) 15 (48,4) 30 (96,8) 1 (3,2)
Breslow
>1,5mm 26 (53,1) 23 (46,9) 1,00 46 (93,9) 3 (6,1) 1,00
≤1,5mm 23 (53,5) 20 (46,5) 41 (95,3) 2 (4,7)
Clark
I+II 30 (53,6) 26 (46,4) 1,00 53 (94,6) 3 (5,4) 1,00
III+IV+V 21 (52,5) 19 (47,5) 38 (95,0) 2 (5,0)
Estágio TNM
0+I+II 31 (53,4) 27 (46,6) 0,69 54 (93,1) 4 (6,9) 0,38
III+IV 26 (57,8) 19 (42,2) 44 (97,8) 1 (2,2)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
86
Tabela 33. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CALM2 g.47384601A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de
Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos CALM2 g.47384601A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 11 (18,6) 48 (81,4) 1,00 41 (69,5) 18 (30,5) 0,48
Membros 6 (19,4) 25 (80,6) 19 (61,3) 12 (38,7)
Breslow
>1,5mm 11 (22,4) 38 (77,6) 0,79 37 (75,5) 12 (24,5) 0,25
≤1,5mm 8 (18,6) 35 (81,4) 27 (62,8) 16 (37,2)
Clark
I+II 11 (19,6) 45 (80,4) 1,00 37 (66,1) 19 (33,9) 0,65
III+IV+V 8 (20,0) 32 (80,0) 29 (72,5) 11 (27,5)
Estágio TNM
0+I+II 11 (19,0) 47 (81,0) 1,00 41 (70,7) 17 (29,3) 0,52
III+IV 8 (17,8) 37 (82,2) 29 (64,4) 16 (35,6)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
87
Tabela 34. Distribuições dos genótipos do polimorfismo CREB1 c.261+1161G>A em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras
de Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos CREB1 c.261+1161G>A
Variável GG
n (%)
GA+AA
n (%)
Valor
de P
GG+GA
n (%)
AA
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 17 (28,8) 42 (71,2) 0,62 51 (86,4) 8 (13,6) 0,05
Membros 7 (22,6) 24 (77,4) 21 (67,7) 10 (32,3)
Breslow
>1,5mm 12 (24,5) 37 (75,5) 0,48 37 (75,5) 12 (24,5) 0,29
≤1,5mm 14 (32,6) 29 (67,4) 37 (86,0) 6 (14,0)
Clark
I+II 17 (30,4) 39 (69,6) 0,48 46 (82,1) 10 (17,9) 0,45
III+IV+V 9 (22,5) 31 (77,5) 30 (75,0) 10 (25,0)
Estágio TNM
0+I+II 17 (29,3) 41 (70,7) 0,65 47 (81,0) 11 (19,0) 1,00
III+IV 11 (24,4) 34 (75,6) 36 (80,0) 9 (20,0)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
88
Tabela 35. Distribuições dos genótipos do polimorfismo MITF c.635-325A>G em
pacientes com melanoma cutâneo estratificados por localização, espessuras de
Breslow, níveis de Clark e estágios do tumor
Genótipos MITF c.635-325A>G
Variável AA
n (%)
AG+GG
n (%)
Valor
de P
AA+AG
n (%)
GG
n (%)
Valor
de P
Localização
Axial 17 (28,8) 42 (71,2) 0,24 44 (74,6) 15 (25,4) 1,00
Membros 13 (41,9) 18 (58,1) 24 (77,4) 7 (22,6)
Breslow
>1,5mm 21 (42,9) 28 (57,1) 0,07 39 (79,6) 10 (20,4) 0,33
≤1,5mm 10 (23,3) 33 (76,7) 30 (69,8) 13 (30,2)
Clark
I+II 15 (26,8) 41 (73,2) 0,12 38 (67,9) 18 (32,1) 0,06
III+IV+V 17 (42,5) 23 (57,5) 34 (85,0) 6 (15,0)
Estágio TNM
0+I+II 18 (31,0) 40 (69,0) 0,53 41 (70,7) 17 (29,3) 0,24
III+IV 17 (37,8) 28 (62,2) 37 (82,2) 8 (17,4)
Axial: tumores localizados na região da cabeça e tronco
Frequências similares dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, GNAL1
g.80130766C>, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA
c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-
325A>G foram observadas em pacientes com MC estratificados por aspectos do tumor.
A frequência dos genótipo TT ou TC do KIT c.67+12766T>C foi maior em
pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais.
A frequência do genótipo AA do SNP PRKCA c.205+407G>A foi maior em pacientes com
tumores menos espessos (Breslow < 1,5 mm) do que em pacientes com tumores mais
profundos (Breslow > 1,5 mm).
As frequências diferenciadas dos genótipos dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF c.635-325A>G, combinados dois a
89
dois, em pacientes com MC estratificados pelos aspectos do tumor estão apresentados na
Tabela 36.
Tabela 36. Distribuições diferenciadas dos genótipos dos polimorfismos ADCY3
c.675+9196T>G, PRKCA c.205+407G>A, CREB1 c.261+1161G>A e MITF
c.635-325A>G, combinados dois a dois, em pacientes com melanoma
cutâneo estratificados por localização do tumor
SNPs combinados Localização do tumor Valor de P
ADCY3 + CREB1 Axial n (%) Membros n (%)
TT + AA 2 (5,6) 34 (94,4) 0,04
TG+GG + GA+GG 6 (28,6) 15 (71,4)
PRKCA1 + MITF
AA + AA 2 (5,7) 5 (27,8) 0,03
GG+GA + GG+GA 33 (94,3) 13 (72,2)
SNP: polimorfismo gênico de base única; PRKCA1: se refere ao SNP PRKCA
c.205+407G>A; as diferenças entre grupos estão destacadas
Os genótipos combinados ADCY3 TT +CREB1 AA e PRKCA1 AA MITF AA foram
mais comuns em pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes
com tumores axiais.
11. Polimorfismos em genes da melanogênese e prognóstico dos pacientes
11.1. Impacto de aspectos clinicopatológicos no prognóstico dos pacientes
Foram avaliados 86 pacientes para a SLP e a SG. A mediana de seguimento desses
pacientes foi de 43 meses (variação: 6-184). Ao final do estudo, 62 (72%) pacientes
estavam vivos, sendo 57 (92%) vivo sem a doença e 5 (8%) vivo com a doença; 24 (28%)
pacientes foram a óbito, sendo 4 (17%) óbitos sem a doença e 20 (83%) óbitos devido a
complicações do MC.
Aos 60 meses de observação, menor SLP foi observada em pacientes com
espessura de Breslow ≥ 1,5 mm (39,8% versus 90,4%, P< 0,001), nível de Clark III, IV ou
V (34,3% versus 84,2%, P< 0,001) e estágio III ou IV do tumor (29,1% versus 82,4%, P<
0,001) (Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 7).
90
Figura 7. Sobrevida livre de progressão de pacientes com melanoma cutâneo estratificados
por espessuras de Breslow (A), níveis de Clark (B) e estágios clínicos (C)
(Estimativas de Kaplan-Meier)
A SG foi menor em pacientes com idade >54 anos (66,8% versus 89,4%, P=
0,001), do sexo masculino (68,7% versus 89,8%, P= 0,001), com tumor com espessura de
Breslow ≥ 1,5 mm (63,6% versus 96,4%, P= 0,001), com nível de Clark III, IV ou V
(63,4% versus 92,3%, P= 0,001) e tumor nos estágio III ou IV (57,2% versus 90,9%, P<
0,001) aos 60 meses de observação (Estimativa de Kapan-Meier; Figura 8).
n= 39
n= 47
n= 54
n= 32
n= 51
n= 35
91
Figura 8. Sobrevida global de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por idade
mediana (A), sexo (B), espessuras de Breslow (C), níveis de Clark (D) e estágios
do tumor (E) (Estimativas de Kaplan-Meier)
O fototipo cutaneo, a cor dos olhos e dos cabelos, a presença de efélides e nevos, o
tipo de exposição solar e a localização do tumor não alteraram a SLP e a SG dos pacientes
com MC (Estimativas de Kaplan-Meier).
Os impactos dos aspectos clínicos e biológicos do tumor na SLP e SG em análise
univariada de Cox estão apresentados na Tabela 37.
n= 40
n= 46
n= 33
n= 53
n= 54
n= 32
n= 39
n= 47
n= 51
n= 35
92
Tabela 37. Impacto des aspectos clínicos de pacientes e biológicos do tumor na sobrevida
livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com melanoma cutâneo
na análise univariada de Cox
Características n/N SLP
RR (IC 95%)
Valor
de P n/N
SG
RR (IC 95%)
Valor
de P
Idade
<54 anos 16/40 Referência 0,66 5/40 Referência 0,003
>54 anos 20/46 1,15 (0,59-2,23) 19/46 4,45 (1,64-12,02)
Sexo
Feminino 13/33 Referência 0,77 4/33 Referência 0,02
Masculino 23/53 1,10 (0,55-2,18) 20/53 3,44 (1,17-10,10)
Fototipo
I+II 22/56 1,11 (0,56-2,22) 0,74 13/56 1,63 (0,72-3,70) 0,24
III+IV+V+VI 14/30 Referência 11/30 Referência
Cor olhos
Claros 12/32 1,03 (0,51-2,09) 0,91 9/32 1,02 (0,44-2,37) 0,95
Não claros 24/54 Referência 15/54 Referência
Cor cabelos
Claros 9/25 1,15 (0,53-2,47) 0,71 8/25 1,14 (0,48-2,72) 0,75
Não claros 27/61 Referência 16/61 Referência
Efélides
Nenhuma/poucas 13/32 Referência 0,63 6/32 Referência 0,31
Muitas 23/54 1,18 (0,58-2,37) 18/54 1,60 (0,63-4,04)
Nevos
<50 13/35 Referência 0,42 12/35 Referência 0,36
>50 23/51 1,32 (0,66-2,61) 12/51 1,45 (0,65-3,23)
Exposição solar
Crônica 14/41 Referência 0,70 12/41 Referência 0,94
Intermitente/nenhuma 12/30 1,26 (0,37-4,23) 8/30 1,03 (0,42-2,53)
Localização do tumor
Axial 25/57 1,12 (0,53-2,34) 0,75 19/57 2,32 (0,79-6,86) 0,12
Membros 10/28 Referência 4/28 Referência
Breslow
<1,5 mm 3/39 Referência <0,001 2/39 Referência 0,004
≥1,5 mm 33/47 11,44 (3,45-37,91) 22/47 8,47 (1,95-36,93)
Clark
I+II 13/54 Referência <0,001 9/54 Referência 0,002
III+IV+V 23/32 6,05 (2,68-13,64) 15/32 4,86 (1,75-13,47)
Estágio clínico TNM
I+II 8/51 Referência <0,001 6/51 Referência 0,001
III+IV 28/35 7,98 (3,61-17,60) 18/35 4,97 (1,92-12,34)
N: número de pacientes; SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR:
risco relativo; IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados
93
Os pacientes com tumores com espessura de Breslow maior 1,5 mm, nível de Clark
III, IV ou V e estágio III ou IV estiveram sob riscos 11,44, 6,05 e 7,98 vezes maiores de
apresentar progressão do tumor do que os demais pacientes, respectivamente (Análise
univariada de Cox). A espessura de Breslow (P= 0,002) e o estágio clínico (P= 0,001)
também influenciaram a SLP em análise multivariada de Cox; os pacientes com tumores
com espessura de Breslow maior 1,5 mm e estágio III ou IV estiveram sob riscos 6,81 (IC
95%: 1,97-23,52) e 3,92 (IC 95%: 1,69-9,05) vezes maiores de apresentar progressão do
tumor do que os demais pacientes, respectivamente
Os pacientes com idade maior 54 anos, do sexo masculino, com tumor com
espessura de Breslow maior 1,5mm, nível de Clark III, IV ou V e estágio clínico III ou IV
estiveram sob riscos 4,45, 3,44, 8,47, 4,86 e 4,97 maiores de evoluírem para óbito do os
demais pacientes, respectivamente (Análise univariada de Cox). A idade (P= 0,04) e a
espessura de Breslow
(P= 0,02) também influenciaram a SG em multivariada de Cox; pacientes com idade maior
54 anos e com tumor com espessura de Breslow maior 1,5 mm estiveram sob riscos 5,90
(IC 95%: 1,26-27,54) e 2,93 (IC 95%: 1,05-8,20) de evoluir para o óbito do que os demais.
11.2. Impacto dos polimorfismos gênicos no prognóstico dos pacientes
Aos 60 meses de observação, apenas os pacientes com o genótipo AA do SNP
MITF
c.635-325A>G apresentaram menor SLP (44,5% versus 68,2%, P= 0,007) e menor SG
(67,7% versus 81,7%, P= 0,009 do que os pacientes com os outros genótipos do gene
(Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 9).
94
Figura 9. Representação gráfica das curvas de sobrevida livre de progressão (A) e sobrevida
global (B) de pacientes com melanoma cutâneo estratificados por genótipos do
polimorfismo MITF c.635-325A>G (Estimativas de Kaplan-Meier)
A SLP e a SG dos pacientes com MC não foram influenciadas pelos SNPs WNT8B
c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G,
PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
.47384601A>G e CREB1 c.261+1161G>A isolados (Estimativas de Kaplan-Meier).
Os impactos dos SNPs na SLP e SG dos pacientes com MC em análise univariada
de Cox estão apresentados na Tabela 38.
n= 57
n= 29
n= 57
n= 29
95
Tabela 38. Impacto dos SNPs WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAI1
g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G e PLCB1 g.8908966C>A na
sobrevida livre de progressão e sobrevida global de pacientes com
melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
Polimorfismos n/N SLP RR
(IC 95%)
Valor
de P n/N
SG RR
(IC 95%)
Valor
de P
WNT8B c.-101T>C
TT 19/44 10/44
TC+CC 17/42 1,13 (0,58-2,18) 0,70 14/42 1,40 (0,62-3,17) 0,41
TT+TC 36/84 24/84
CC 0/2 21,55 (NC) 0,45 0/82 21,26 (NC) 0,56
KIT c.67+12766T>C
TT 11/33 10/33
TC+CC 25/53 1,51 (0,74-30,7) 0,25 14/53 1,35 (0,60-3,06) 0,46
TT+TC 30/73 19/73
CC 6/13 1,25 (0,52-3,01) 0,61 5/13 1,92 (0,71-5,17) 0,19
GNAI1 g.80130766C>T
CC 3/5 2/5
CT+TT 33/81 1,05 (0,31-3,47) 0,93 22/81 1,03 (0,24-4,43) 0,96
CC+CT 13/33 10/33
TT 23/53 1,24 (0,63-2,47) 0,52 14/53 1,03 (0,45-2,33) 0,94
ADCY3 c.675+9196T>G
TT 13/31 8/31
TG+GG 23/55 1,05 (0,53-2,09) 0,86 16/55 1,16 (0,50-2,73) 0,71
TT+TG 32/79 21/79
GG 4/7 1,47 (0,52-4,18) 0,46 3/7 1,80 (0,53-6,07) 0,33
PLCB1 g.8908966C>A
CC 8/19 4/19
CA+AA 28/67 1,04 (0,47-2,28) 0,92 20/67 1,60 (0,54-4,72) 0,38
CC+CA 27/68 17/68
AA 9/18 1,78 (0,83-3,82) 0,13 7/18 1,97 (0,81-4,77) 0,13
PRKCA c.205+407G>A
GG 6/21 7/21
GA+AA 30/65 1,89 (0,78-4,56) 0,15 17/65 1,13 (0,46-2,73) 0,78
GG+GA 31/67 21/67
AA 5/19 2,08 (0,81-5,37) 0,12 3/19 2,02 (0,60-6,78) 0,25
PRKCA c.288+33994A>G
AA 21/57 13/47
AG+GG 15/39 1,32 (0,68-2,58) 0,40 11/39 1,05 (0,47-2,36) 0,89
AA+AG 25/82 23/82
GG ¼ 2,14 (0,29-15,70) 0,45 1/4 1,24 (0,16-9,23) 0,83
CALM2 g.47384601A>G
AA 8/17 5/17
AG+GG 28/69 1,30 (0,59-2,86) 0,51 19/69 1,08 (0,40-2,91) 0,87
AA+AG 25/58 18/58
GG 11/28 1,01 (0,49-2,09) 0,96 6/28 1,21 (0,47-3,08) 0,68
CREB1 c.261+1161G>A
GG 8/24 6/24
GA+AA 28/62 1,53 (0,69-3,37) 0,28 18/62 1,13 (0,44-2,86) 0,78
GG+GA 29/70 20/70
AA 7/16 1,34 (0,58-3,07) 0,48 4/16 1,05 (0,35-3,10) 0,92
96
MITF c.635-325A>G
AA 2,40 (1,24-4,65) 0,009 2,85 (1,25-6,34) 0,01
AG+GG
AA+AG
GG 2,23 (0,86-5,75) 0,09 2,37 (0,70-7,97) 0,16
SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR: risco relativo;
IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados
Apenas os pacientes com o genótipo AA do SNP MITF c.635-325A>G estiveram
sob riscos 2,40 e 2,85 vezes maiores de apresentar progressão da doença e de evoluir para
o óbito do que os pacientes com os demais genótipos do gene, respectivamente (análise
univariada de Cox). Todos os dez SNPs avaliados não influenciaram a SLP e SG dos
pacientes com MC após análise multivariada de Cox.
Aos 60 meses de observação, os pacientes com os genótipos combinados ADCY3
TT + MITF AA (22,2% versus 61,3%, P= 0,006), GNAI1 TT + PLCB1 AA (36,4% versus
63,9%, P= 0,04), GNAI1 TT + MITF AA (41,6% versus 73,2%, P= 0,01) e CALM2 GG +
MITF AA (45,0% versus 64,1%, P= 0,04) apresentaram menor SLP do que os demais
pacientes (Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 10). A SG foi menor em pacientes com os
genótipos combinados dos SNPs KIT TT + MITF AA (62,2% versus 87,3%, P= 0,02) e
ADCY3 TT + MITF AA (44,4% versus 72,5%, P= 0,006) do que nos demais pacientes
(Estimativas de Kaplan-Meier; Figura 11).
97
Figura 10. Sobrevida livre de progressão de pacientes com melanoma cutâneo
estratificados por genótipos combinados dos polimorfismos (A) ADCY3
c.675+9196T>G + MITF c.635-325A>G, (B) GNAI1 g.80130766C>T +
PLCB1 g.8908966C>A, (C) GNAI1 g.80130766C>T + MITF c.635-325A>G e
(D) CALM g.47384601A>G + MITF c.635-325A>G (Estimativas de Kaplan-
Meier)
n= 35
n= 9
n= 26
n= 11
n= 21
n= 17
n= 37
n= 8
98
Figura 11. Sobrevida global de pacientes com melanoma cutâneo de acordo com os
genótipos combinados dos polimorfismos (A) KIT c.67+12766T>C + MITF
c.635-325A>G e (B) ADCY3 c.675+9196T>G + MITF c.635-325A>G
(Estimativas de Kaplan-Meier)
Os impactos dos SNPs combinados na SLP e na SG de pacientes com MC na
análise univariada de Cox estão apresentados na Tabela 39.
n= 33
n= 9
n= 35
n= 9
99
Tabela 39. Associação dos polimorfismos de genes da melanogênese, combinados dois a
dois, na sobrevida livre de progressão e sobrevida global dos pacientes com
melanoma cutâneo na análise univariada de Cox
Polimorfismos
combinados n/N
SLP RR
(IC 95%)
Valor
de P n/N
SG RR
(IC 95%)
Valor
de P
ADCY3 + MITF
TG+GG + AG+GG 13/35 9/35
TT + AA 7/9 3,53 (1,35-9,19) 0,01 6/9 3,84 (1,35-10,89) 0,01
GNAI1 + PLCB1
CC+CT + CC+CA 11/26 7/26
TT+AA 7/11 2,67 (1,00-7,23) 0,04 4/11 1,68 (0,48-5,83) 0,41
GNAI1 + MITF
CC+CT + AG+GG 6/21 3/21
TT + AA 10/17 3,58 (1,21-10,60) 0,02 6/17 3,33 (0,82-13,54) 0,09
CALM + MITF
AA+AG + AG+GG 13/37 8/37
GG + AA 5/8 2,87 (1,00-8,25) 0,04 3/8 3,05 (0,75-12,33) 0,11
KIT + MITF
TC+CC + AG+GG 13/33 5/33
TT + AA 5/9 2,04 (0,71-5,81) 0,18 4/9 4,07 (1,08-15,35) 0,03
N: número de pacientes; SLP: sobrevida livre de progressão; SG: sobrevida global; RR: risco
relativo; IC: intervalo de confiança; Valores de P< 0,05 estão destacados
Os pacientes com o genótipo combinado ADCY3 TT + MITF AA apresentaram
riscos 3,53 e 3,84 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e evolução para o
óbito do que os pacientes com os demais genótipos dos genes, respectivamente. Os
pacientes com os genótipos combinados GNAI1 TT + PLCB1 AA, GNAI1 TT + MITF AA
e CALM GG + MITF AA estiveram sob riscos 2,67, 3,58 e 2,87 vezes maiores de
apresentarem progressão da doença do que pacientes com os demais genótipos combinados
dos genes. Os pacientes com o genótipo combinado KIT TT + MITF AA apresentaram
riscos 2,04 e 4,07 vezes maiores de apresentarem progressão da doença e evolução para o
óbito do que os pacientes com os demais genótipos dos genes, respectivamente (Análise
univariada de Cox).
Apenas o genótipo combinado influenciou a SLP na análise multivariada de Cox
(P= 0,01); pacientes com o genótipo GNAI1 TT + PLCB1 AA estiveram sob risco 18,53
(3,38-101,35) vezes maior de apresentar progressão da doença do que os pacientes com os
demais genótipos combinados dos genes.
100
12. Resumo dos resultados principais obtidos no estudo
As principais associações dos SNPs com o risco de ocorrência, aspectos
clinicopatológicos do tumor e com a sobrevida de pacientes com MC encontradas no
presente estudo estão apresentadas na Tabela 40.
Tabela 40. Resumos dos principais resultados obtidos dos dez polimorfismos da via da
melanogênese isolados no risco de ocorrência, dados clínicopatológicos e
prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo
SNPs Resumo dos resultados
WNT8B T>C • Genótipos TC ou TC+CC estiveram associados com aumento do risco de MC
KIT T>C
• Genótipos TT ou TT+TC estiveram associados com aumento do risco de MC
• Pacientes com os genótipos TT+TC foram mais frequentes tumores localizados nos
membros
GNAI1 C>T • Genótipos TT ou CT+TT estiveram associados com aumento do risco de MC
ADCY3 T>G • Genótipos TT ou TT+TG estiveram associados com aumento do risco de MC
• A frequência dos genótipos TT+TG foi maior em pacientes com mais de 20 nevos
PLCB1 C>A • Genótipos CA ou CA+AA estiveram associados com aumento do risco de MC
PRKCA G>A
• Genótipos AA ou CA+AA estiveram associados com aumento do risco de MC
• A frequência do genótipo AA foi maior em pacientes com tumores mais finos
(Breslow <1,5mm)
PRKCA A>G • Genótipo AG esteve associado com aumento do risco de MC
CALM2 A>G • Genótipos AG ou GG isolado ou AG+GG estiveram associados com aumento do
risco de MC
CREB1 G>A • Genótipos GA ou AA isolado ou GA+AA estiveram associados com aumento do
risco de MC
MITF A>G
• Genótipo AA foi associado com aumento do risco de MC
• Pacientes com o genótipo AA estiveram pior sobrevida livre de progressão e
sobrevida global na análise de Kaplan-Meier e após análise univariada de Cox, sendo
características de prognóstico desfavorável.
101
As principais associações dos SNPs combinados com o risco de ocorrência,
aspectos clinicopatológicos do tumor e com a sobrevida de pacientes com MC encontradas
no presente estudo estão apresentadas na Tabela 41.
Tabela 41. Resumos dos principais resultados obtidos dos dez polimorfismos da via da
melanogênese combinados no risco de ocorrência, nos dados
clínicopatológicos e prognóstico de pacientes com melanoma cutâneo
SNPs combinados Resumo dos resultados
WNT8B + PRKCA1 Genótipos CC+TC + AA+GA foram associados com aumento do risco
WNT8B + PRKCA2 Genótipos CC+CT + AA+GA foram associados com aumento do risco
WNT8B + MITF Genótipos CC+CT + AA+GA foram associados com aumento do risco
KIT + PRKCA1 Genótipos TT+TC + AA+GA foram associados com aumento de risco
KIT + PRKCA2 Genótipos TT+TC + AA+GA foram associados com aumento de risco
KIT + MITF Genótipos TT + AA foram associados com aumento do risco e pacientes com
esse genótipo estiveram associados com pior sobrevida global
GNAI1 + PLCB1
Genótipos TT+TC + AA+CA foram associados com aumento de risco
Pacientes com os genótipos TT+AA tiveram pior sobrevida livre de
progressão
GNAI1 + MITF
Genótipos TT + AA foram associados com aumento do risco
A frequência desses genótipos foi maior em pacientes com fototipo I+II e foi
associado com pior sobrevida livre de progressão
ADCY3 + WNT8B A frequência dos genótipos TT+TG + CC+CT foi maior em pacientes com a
presença de mais de 50 nevos
ADCY3 + CREB1
Genótipos TT+TG + AA+GA foram associados com aumento de risco
A frequência dos genótipos combinados TT + AA foi maior em pacientes
com olhos e cabelos claros
ADCY3 + PRKCA1
Genótipos TT+TG + AA+AG foram associados com aumento de risco
A frequência dos genótipos TT + AA foi maior em pacientes com a presença
de mais de 50 nevos
ADCY3 + MITF
Genótipos TT+TG + AA+AG foram associados com aumento de risco
A frequência dos genótipos TT + AA foi maior em pacientes com cabelos
claros
Os pacientes com os genótipos TT+AA apresentaram pior sobrevida livre de
progressão e global
102
PRKCA1 +
PRKCA2
Genótipos AA+GA + GG+AG foram associados com aumento de risco
A frequência desses genótipos foi maior em pacientes com presença de
efélides
PRKCA2 + PLCB1
Genótipos GG+AG + AA+CA foram associados com aumento de risco
A frequência desses genótipos também foi maior em pacientes sem a
presença efélides
PRKCA2 + MITF Genótipos GG+AG + AA+GA foram associados com aumento de risco
CALM2 + CREB1 Genótipos GG + AA foram associados com aumento do risco
CALM2 + PRKCA1 Genótipos GG+AG + AA+GA foram associados com aumento de risco
CALM2 + PRKCA2 Genótipos GG+AG + GG+AG foram associados com aumento de risco
CALM2 + PLCB1 Genótipos GG+AG + AA+CA foram associados com aumento de risco
CALM2 + MITF Pacientes com os genótipos GG+AA tiveram pior sobrevida livre de
progressão
CREB1 + WNT8B Genótipos AA+GA + CC+TC foram associados com aumento de risco
CREB1 + PRKCA2 Genótipos AA+GA + GG+AG foram associados com aumento de risco
CREB1 + PLCB1 Genótipos AA+GA + AA+CA foram associados com aumento de risco
CREB1 + MITF
Genótipos AA+GA + AA+GA foram associados com aumento de risco
A frequência do genótipo AA + AA foi maior em pacientes com cabelos
claros
103
DISCUSSÃO
A incidência do MC aumenta rapidamente, superando qualquer outro tipo de câncer
(Schaffer et al., 2004; Niezgoda et al., 2015). O MC é um tumor com altas taxas de
mortalidade devido ao seu potencial metastático e ausência de resposta ao tratamento.
Além disso, vários de seus aspectos, como a etiologia e a fisiopatologia, ainda estão por
serem determinados com exatidão, o que em nossa opinião, justificou a realização desse
estudo.
O rápido crescimento da incidência do MC está possivelmente relacionado à
combinação dos seguintes fatores: maior exposição da pele aos raios UV da luz solar, à
depleção da camada de ozônio e aumento da longevidade com deficiências nos sistemas
associados com a carcinogênese (Rauterberg & Jung, 1993; Leiter et al., 2014).
Observamos que a idade mediana de nossos pacientes foi de 54 anos, semelhante a
de estudo prévio conduzidos em brasileiros (Naser, 2011) e as de estudos conduzidos em
outros países (Leiter et al., 2014).
A distribuição dos nossos pacientes por sexo foi semelhante: números similares de
homens e mulheres foram acometidos pelo tumor em nossa amostra. O tumor
habitualmente é mais agressivo em homens (Mackie et al., 2009). Já o aumento da
incidência do tumor em mulheres parece ter relação com hormônios reprodutivos, que
determinam aumento de pigmentação da pele (Lea et al., 2007).
Observamos que a maior parte dos nossos pacientes apresentou fototipo cutâneo
I+II e olhos e cabelos escuros. Entre as características fenotípicas mais comuns de
portadores de MC estão a de pele clara, olhos claros (verdes e azuis) e cabelos claros (loiro
e ruivo) (Gandini et al., 2005). Indivíduos com perfil “claro” para pele, olhos e cabelos,
são considerados mais fotossensíveis do que indivíduos com perfil “não claro” devido a
menor quantidade de melanina. Há ainda um padrão conhecido de inter-relação entre essas
características, ou seja, indivíduos ruivos possuem tendência para a presença de efélides e
olhos claros, enquanto indivíduos com cabelos escuros, raramente possuem efélides e
frequentemente possuem olhos escuros. O fator de risco mais importante relacionado com
o surgimento do MC é a cor da pele, uma vez que está relacionada com deficiência na
capacidade de reparar danos dos raios UV do sol. Vale comentar também, que olhos e
cabelos claros são pouco frequentes em indivíduos de nossa população, na qual europeus
foram miscigenados com ameríndios, asiáticos e negróides (Pena et al., 2011; Bakos et al.,
2013). Características como presença de efélides (em mais que uma parte do corpo), nevos
104
(mais que 25 nevos pelo corpo) e exposição solar crônica aumentam o risco de MC
possuem forte impacto no surgimento do MC (Bakos et al., 2013).
Observamos que os nossos casos apresentaram tumores predominantemente axiais
(cabeça, face, pescoço e tronco), com índices de Breslow maiores que 1,5 milímetros,
tumores com níveis de Clark I+II+III (restritos a epiderme) e estágios iniciais do tumor,
como previamente descrito (Niezgoda et al., 2015). Os aspectos do tumor estão
intimamente relacionadas com o prognóstico dos pacientes, uma vez que lesões iniciais
foram associadas com o melhor prognóstico e maior sobrevida dos pacientes (Berrocal et
al., 2014).
O MC está sendo extensivamente estudado nos últimos anos, particularmente em
suas características genéticas, por meio de métodos de identificação de mutações
adquiridas em oncogenes como BRAF, RAS, NF1 e KIT que possam auxiliar no
prognóstico e terapêutica de pacientes com o tumor (Cancer Genome Atlas Network,
2015).
Atualmente, os polimorfismos genéticos são considerados fatores importantes para
a predisposição herdada de um indivíduo a tumores, incluindo o MC (Bishop et al., 2009;
Amos et al., 2011; Barret et al., 2011; Macgregor et al., 2011; Iles et al., 2013; Law et al.,
2015). Essas variações genéticas determinam a capacidade distinta de cada indivíduo
metabolizar carcinógenos, controlar o mecanismo relacionados com a carcinogênese e
outros mecanismos fisiológicos, como a melanogênese. Assim, a constituição genética
pode predispor um indivíduo ao câncer.
Os SNPs mais estudados em MC foram aqueles localizados em genes que
codificam enzimas relacionados no reparo de DNA (Mocellin et al., 2009, Oliveira et al.,
2013), na apoptose (Jiang et al., 2011; Oliveira et al., 2014), ciclo celular (Udayakumar &
Tsao, 2009) e na síntese de melanina (Chatziasinou et al., 2011). Ainda, é possível que
outros SNPs envolvidos na via da melanogênese, na síntese de fatores de crescimento e
citocinas, hormônios, neuropeptídeos e neurotransmissores associados ao MC (Wellbrock
et al., 2015) possam ter papéis importantes na origem do tumor.
A GELE, baseada em microarranjos de DNA, possibilitou analisar milhares de
polimorfismos genéticos em um único estudo. A GELE proporciona a varredura de
diversos marcadores genéticos, localizados em uma única lâmina com microarranjos de
DNA, que podem estar relacionados com o surgimento e a agressividade de tumores. Além
disso, ela proporciona maior rapidez e confiabilidade para a avaliação de SNPs quando
comparada com métodos tradicionais, como a PCR-RFLP e PCR em tempo real.
105
Atualmente, o procedimento de GELE só é possível devido a avanços na área de
bioinformática. As sequências ordenadas de regras e cálculos determinados por algoritmos
computacionais possibilitam avaliar lâminas com microarranjos de DNA que possuem alta
densidade de marcadores genéticos em um pequeno espaço físico (Carvalho et al., 2010).
O algoritmo de análise da GELE de SNPs utilizado em nosso estudo foi o crlmm,
disponível no programa computacional Bioconductor, cujo código fonte está disponível
para qualquer pesquisador, sem custo. A sequência básica de regras deste algoritmo que
possibilita a genotipagem de SNPs de microarranjos de DNA consiste na normalização e
sumarização das intensidades das sondas contidas nas lâminas de microarranjos seguido da
genotipagem. O algoritmo crlmm foi descrito por possuir uma melhor acurácia quando
comparado com o algoritmo brlmm, descrito previamente (Carvalho et al., 2010).
Observamos que as frequências dos genótipos de 12.994 SNPs foram distintas entre
pacientes com MC e controles. Mais de 50% dos SNPs identificados estavam localizados
em regiões regulatórias da expressão gênica e a outra metade esteve localizada em regiões
de íntron. Aproximadamente 1% deles estavam em regiões que codificam proteínas. Esses
números foram considerados adequados, uma vez que foi observado em estudos prévios
que regiões regulatórias da expressão gênica são altamente polimórficas (Zhang et al.,
2007).
A seguir, agrupamos os SNPs considerando a função das proteínas codificadas
pelos genes que os albergam, integrando a via da melanogênese. Selecionamos psete SNPs
localizados em regiões intrônicas e três localizados em regiões regulatórias para a
continuidade do estudo.
Os SNPs localizados nos íntrons podem alterar o mecanismo de “splicing”
alternativo, que consiste na remoção dos íntrons e a união dos éxons a fim de síntetizar o
RNA mensageiro que será traduzido em proteína. Sua ocorrência permite que informações
específicas de um único gene se modifiquem dependendo de sinais do ambiente, gerando
transcritos maduros distintos, e conferindo assim uma maior plasticidade à expressão
gênica. Esse mecanismo é um mecanismo natural que ocorre em células eucariotas,
determinando a biodiversidade de proteínas que podem ser codificadas pelo genoma.
Alterações causadas por SNPs em íntrons podem gerar novos sítios para ocorrência do
“splicing” resultando na alteração da sequência de leitura do RNA mensageiro, podendo
alterar a quantidade ou qualidade das proteínas codificadas (Pagani & Baralle, 2004). Já os
SNPs localizados nas regiões 3' e 5' não traduzidas do DNA (região regulatória) controlam
a expressão gênica por meio da capacidade de manter a estabilidade do RNA mensageiro,
106
além de possuírem informações de posicionamento do RNA mensageiro nos ribossomos
para o início da tradução da sequência de nucleotídeos para aminoácidos e proteínas
(Hollams et al., 2002; Chen et al., 2006).
Vale salientar que, até onde atinge o nosso conhecimento, não há descrições de
associações e das funções dos SNPs selecionados neste estudo com o MC.
As amostras de pacientes e controles estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg
para os lóci dos genes WNT8B c.-101T>C, KIT c.67+12766T>C, GNAL1 g.80130766C>T,
ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1 g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA
c.288+33994A>G, CALM2 g.47384601A>G, CREB1 c.261+1161G>A e MITF
c.635-325A>G, o que sugere que a amostra de controles é representativa da nossa
população e que as frequências dos diferentes genótipos dos dez SNPs foram similares em
pacientes e controles.
O gene WNT8B está localizado no cromossomo 10q24, possui seis éxons,
transcreve um RNA mensageiro de 1.996 pares de bases (PB) e uma glicoproteína rica em
cisteína de
38 kDa. O WNT8B faz parte de uma família de genes que codifiam proteínas ligantes do
receptor Frizzled que desempenham papel fundamental na regulação e diferenciação e
desenvolvimento dos melanócitos (Bellei et al., 2011). Hiperativação da via Wnt está
associado com MC, além disso, a hiperexpressão do gene WNT foi associado à
potencialização da expressão do gene MITF, com consequente aumento da proliferação
celular em melanoma (Ploper et al., 2015). Foi descrito um SNP no gene WNT8B
localizado na região 5’ não traduzida c.-101T>C (rs3793772) e as frequências dos
genótipos observadas em diferentes populações étnicas foram 60% a 77% para o genótipo
selvagem TT, 24% a 36% para o genótipo heterozigoto TC e 1% a 12% para o genótipo
variante CC (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos em nosso
estudo que os indivíduos que apresentaram os genótipos TC ou CC estiveram sob risco de
cerca de 2,5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais
genótipos. É sabido que o aumento da expressão de genes da família Wnt foram associados
com maior agressividade e invasão em células de melanoma (Weeraratna et al., 2002).
Diante disso, nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo alelo C esteja associada
com maior expressão do gene WNT8B.
O gene KIT está localizado no cromossomo 4q12 possui 21 éxons, transcreve um
RNA mensageiro de 5.190 pb e codifica uma proteína tirosina quinase que é um receptor
transmembrana de 110 kDA. Esta proteína está envolvida no processo de proliferação,
107
diferenciação e sobrevida de melanócitos (Wehrle-Haller et al., 2003). Alta exposição aos
raios UV ativam a via da melanogênese aumentando o número de melanócitos acelerando
a síntese de pigmento na derme que é mediado pela ativação do gene KIT. O KIT ativado
irá estimular a proteína quinase ativadora de mitose (MAP kinase) que terá como alvo o
gene MITF (Kawaguchi et al., 2001). A expressão do KIT pode ser modulada pela
hiperexpressão do gene PRKCA, por meio de modificações pós traducionais (Ogawa et al.,
1995). Além disso, a ativação desta proteína está associada com o crescimento tumoral
(Slipicevic & Herlyn, 2015). Por esta razão, esse gene tem sido foco de estudos para o
desenvolvimento de novas terapêuticas para portadores de MC (Berrocal et al., 2014). Foi
descrito um SNP no gene KIT, localizado no íntron c.67+12766T>C (rs2017472), e as
frequências dos genótipos observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a
67% para o genótipo selvagem TT, 30% a 54% para o genótipo heterozigoto TC e 2% a
24% para o genótipo variante (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010).
Observamos, em nosso estudo, que o genótipo TT foi associado com aumento de risco de
cerca de 5,5 vezes maior de ocorrência do MC do que indivíduos com os demais genótipos.
A frequência dos genótipo TT ou TC do KIT c.67+12766T>C foi maior em pacientes com
tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais. Assim nós
hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja associada com ganho de
atividade do gene.
O gene GNAI1 está localizado no cromossomo 7q21, possui nove éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 3.181 pb e codifica uma proteína G heterodímero da classe α que
é um elemento crucial de múltiplas vias atuando como sinal de transdução, incluindo
ativação da cAMP e consequente aumento da proliferação celular (Gupta et al., 1992). As
proteínas G desempenham um papel importante na biologia dos melanócitos por estarem
acopladas ao receptor de membrana MC1R, especificamente na síntese de melanina
regulada pela ativação desse receptor que é estimulada pelo α-MSH (hormônio estimulador
dos melanócitos), que desencadeará a ativação do AMP cíclico e consequente ativação do
MITF (Valverde et al., 1995). O aumento da expressão do GNAI1 também ativa a
expressão de ADCY3 (Beavo et al., 1995). Foi descrito o SNP g.80130766C>T
(rs2079162) localizado na região upstream do gene GNAI, e as frequências observadas em
diferentes populações étnicas foram de 4% a 46% para o genótipo selvagem CC, 34% a
58% para o genótipo heterozigoto CT e 11% a 55% para o genótipo variante TT
(International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os
indivíduos portadores do genótipo TT isolado ou do genótipo CT ou TT estiveram sob
108
risco de cerca de 6,5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os
demais genótipos. Nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja
associada com maior expressão do gene GNAI1.
O gene ADCY3 está localizado no cromossomo 2p23.3, possui 26 éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 4.410 pb que será traduzido em uma proteína de 129 kDa. A
proteína codificada é uma adenilato ciclase tipo 3 que catalisa a formação da adenosina
monofosfato cíclico (AMPc), uma molécula importante na transdução de sinal e um
segundo mensageiro universal. A Os padrões de expressão desse gene é importante na
regulação do ciclo celular (Pierre et al., 2009). O aumento da expressão da proteína Adcy3
foi observado em linhagens de células de melanoma B16-F10 (Cho et al., 2000). O mesmo
foi observado por Hong et al., (2013) em tumores gástricos. No entanto, a superexpressão
da proteína adcy3 foi associada com promoção da tumorigênese, como aumento de
migração, invasão e proliferação celular devido a consequente ativação da via do gene
CREB. Foi descrito o SNP c.675+9196T>G (rs11900505) localizado no íntron do gene
ADCY3. As frequências observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a 44%
para o genótipo selvagem TT, 22% a 56% para o genótipo heterozigoto TG e 11% a 80%
para o genótipo variante GG (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010).
Observamos, em nosso estudo, que os indivíduos que apresentaram o genótipo selvagem
TT isolado ou o genótipo TT ou TG estiveram sob risco de cerca de 5 vezes maior de
ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. A frequência dos
genótipos TT ou TG do SNP ADCY3 c.675+9196T>G foi maior em pacientes com número
de nevos maior que 20 do que naqueles com menor número de nevos. Assim, nós
hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo TT esteja associada com ganho de
atividade do gene.
O gene PLCB1 está localizado no cromossomo 20p12, possui 36 éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 7.103 pb e codifica um proteína 138 kDa. A proteína codificada é
da classe das fosfolipases C que são dependentes de cálcio e a sua ativação é feita pela
proteína G da classe α. Ativação desse gene pode contribuir para a progressão do câncer
devido ao descontrole do ciclo celular e diferenciação celular (Fiume et al., 2012). Além
disso o gene PLCB1 pode atuar como ativador do gene PRKCA (Linger et al., 2008) Foi
descrito o SNP g.8908966C>A (rs4295085) localizado no íntron do gene PLCB1. As
frequências observadas em diferentes populações étnicas foram de 10% a 44% para o
genótipo selvagem CC, 37% a 51% para o genótipo heterozigoto CA e 15% a 38% para o
genótipo variante AA (International Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Nós observamos
109
que os indivíduos que apresentaram o genótipo heterozigoto CA isolado e o genótipo CA
ou AA estiveram sob risco de cerca de 2,5 vezes maior de ocorrência do MC do que
aqueles que apresentaram os demais genótipos. Nós hipotetizamos que a proteína
codificada pelo alelo A esteja associada com ganho de atividade.
O gene PRKCA (PKC-alfa) está localizado no cromossomo 17q24.2, possui 21
éxons, transcreve um RNA mensageiro de 8.787 pb e uma proteína citoplasmática de 77
kDa.
A proteína codificada é uma proteína kinase C-alfa dependente de cálcio que foi descrita
por participar em processos como adesão, transformação, ponto de checagem do ciclo
celular e controle celular (Timár et al., 1996). O papel da expressão dessa proteína ainda é
controverso em células de MC. Lahn et al. (2004) observaram que o aumento da expressão
da proteína esteve associado a proliferação e invasão de células de MC (Lahn & Sundell et
al., 2004; Krasagakis et al., 2004). Por outro lado, a ativação da proteína Pkc se dá pelo
AMPc, com consequente redução da expressão do gene MITF e inibição da melanogênese
(Bertolotto et al., 1998). Além disso, Ogawa et al. (1995) observaram que a inibição da
expressão do gene KIT pode ser modulada pelo aumento da expressão do gene PRKCA
(Ogawa et al., 1995). Dois SNPs foram descritos nesse gene o c.205+407G>A
(rs12601850) e c.288+33994A>G (rs1806448) ambos localizados em íntrons.
As frequências observadas em diferentes populações étnicas do SNP
c.205+407G>A foram de 17% a 53% para o genótipo selvagem GG, 38% a 60% para o
genótipo heterozigoto GA e 1% a 44% para o genótipo variante AA (International
Hapmap 3 Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os indivíduos
com o genótipo AA isolado e o genótipo CA ou AA estiveram sob risco de cerca de 4
vezes maior de ocorrência do MC do que índividuos com os demais genótipos. A
frequência do genótipo AA do SNP PRKCA c.205+407G>A foi maior em pacientes com
tumores menos espessos (Breslow < 1,5 mm) do que em pacientes com tumores mais
profundos (Breslow > 1,5 mm). Nós hipotetizamos que a proteína codificada pelo genótipo
AA esteja associada com ganho de atividade do gene.
As frequências do SNP c.288+33994A>G em diferentes populações étnicas foram
de 53% a 93% para o genótipo selvagem GG, 6% a 50% para o genótipo heterozigoto AG
e 3% a 39% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3 Consortium et al.,
2010). Observamos, em nossa amostra, que indivíduos com o genótipo hetozigoto AG
apresentaram risco duas vezes maior de ocorrência do MC do que indivíduos com os
demais genótipos.
110
O gene CALM2 está localizado no cromossomo 2p21, possui seis éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 1.377 pb e codifica a proteína calmodulina de 17 kDa. A
calmodulina é ligante de cálcio e participa de vias relacionadas com a progressão do ciclo
celular, além de modular os níveis de cAMP ativando o gene ADCY3 (Knaup et al., 2004).
Umemura et al. (2014) verificaram que o CALM2 atuou como ativador do gene RAF-1,
promovendo a progressão do MC devido à maior proliferação, migração e metástases
(Umemura et al., 2014). Foi descrito o SNP g.47384601A>G (rs11884600) localizado na
região regulatória do gene CALM2. As frequências observadas em diferentes populações
étnicas foram de 3% a 84% para o genótipo selvagem AA, 14% a 54% para o genótipo
heterozigoto AG e 11% a 80% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3
Consortium et al., 2010). Observamos, em nossa amostra, que os indivíduos que
apresentaram o genótipo GG ou AG isolados e o genótipo AG ou GG estiveram sob risco
de cerca de 5 vezes maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os
demais genótipos. Já a frequência dos genótipos AG ou GG do SNP CALM2
g.47384601A>G foi maior em mulheres do que em homens. Assim, nós hipotetizamos que
a proteína codificada pelo alelo G esteja associada com maior expressão.
O gene CREB1 está localizado no cromossomo 2q34, possui 15 éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 9.752 pb que codifica a proteína ligante de DNA de 36 kDa. A
proteína Creb1 é a principal efetora da sinalização do AMPc atuando como fator de
transcrição para ativação do gene alvo da via da melanogênese o MITF. O CREB1 é crucial
para o aumento da expressão do MITF causando o desenvolvimento e diferenciação dos
melanócitos. (Rodriguez & Selaturi 2014). É sabido que o CREB1 está altamente expresso
em MC e está envolvido com o crecimento tumoral e metástase, além disso, regula a
expressão de diversos genes como o MMP2 que codifica proteína metalopreteínase 2
(Melnikova et al., 2006), o CYR61 que regula negativamente angiogênese e a induz a
apoptose (Dobroff et al., 2009) e o AP-2α que atua como um supressor tumoral
(Melnikova et al., 2010). Foi descrito o SNP nesse gene c.261+1161G>A (rs10932201)
localizado em íntron. As frequências observadas em diferentes populações étnicas foram
de 9% a 77% para o genótipo selvagem GG, 22% a 54% para o genótipo heterozigoto GA
e 4% a 50% para o genótipo variante AA (International Hapmap 3 Consortium et al.,
2010). Observamos, 3em nosso estudo, que os indivíduos que apresentaram o genótipo AA
e o genótipo GA isolados e o genótipo GA ou AA estiveram sob risco de cerca de 4 vezes
maior de ocorrência do MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. A
frequência dos genótipos GA ou AA foi também maior em pacientes com idade maior que
111
54 anos, do sexo masculino e com fototipo I ou II. Assim, hipotetizamos que a proteína
codificada pelo alelo A esteja associado com maior expressão do gene.
O gene MITF está localizado no cromossomo 3p14.2, possui 16 éxons, transcreve
um RNA mensageiro de 4.472 pb e codifica uma proteína de 59 kDa com a função de fator
de transcrição específico do melanócito. O MITF é o grande regulador dos melanócitos por
atuar na ativação de centenas de genes que desempenham funções importantes
relacionadas com o desenvolvimento, síntese de melanina, diferenciação e sobrevida
(Ploper et al., 2015). O MITF está altamente expresso em MC (Vachtenhein & Ondrusová,
2015), com isso conferindo características tumorais como aumento da diferenciação,
proliferação, migração e sobrevida celular (Hartman et al., 2015). Diversos genes
envolvidos na via da melanogênese, como os descritos anteriormente como o WNT8B, KIT,
GNAI1, ADCY3, PRKCA, CALM2 e o CREB1 (como sendo ativador direto), possuem
como denominador comum o MITF. Assim, alterações na expressão destes genes
certamente implicarão na desregulação da expressão do gene MITF (Hsiao & Fisher 2014).
Em linhagem de MC, o aumento da expressão de MITF foi associado com a diferenciação
do tumor, enquanto que a redução dos níveis de expressão foi associada com a senescência
celular (Vachtenhein & Ondrusová, 2015). Foi descrito o SNP nesse gene c.635-325A>G
(rs7623610) localizado no íntron. As frequências observadas em diferentes populações
étnicas foram de 2% a 30% para o genótipo selvagem AA, 2% a 89% para o genótipo
heterozigoto GA e 22% a 96% para o genótipo variante GG (International Hapmap 3
Consortium et al., 2010). Observamos, em nosso estudo, que os indivíduos que
apresentaram o genótipo AA estiveram sob risco cerca de 3 vezes maior de ocorrência do
MC do que aqueles que apresentaram os demais genótipos. Além disso, esse genótipo
também foi associado com sobrevida livre de progressão e sobrevida global mais curta do
que a observada em pacientes com os demais genótipos do gene. Nós hipotetizamos que a
proteína codificada pelo genótipo AA esteja associada com ganho de atividade do gene.
Além disso, quando avaliamos os SNPs em conjunto, combinados dois a dois,
observamos que a combinação potencializou os efeitos dos SNPs isolados no risco de
ocorrência do MC, em manifestaçoes clínicas e aspectos biológicos do tumor, bem como
na SLP e SG dos pacientes. De fato, a frequência do genótipo combinado GNAI1 TT +
MITF AA foi maior em pacientes com fototipo I+II do que em pacientes com os demais
fototipos, a frequência do genótipo combinado ADCY3 TT + CREB1 AA foi maior em
pacientes com olhos claros do que pacientes com olhos escuros e as frequências dos
genótipos combinados ADCY3 TT CREB1 AA, ADCY3 TT + MITF AA e CREB1 AA +
112
MITF AA foram maiores em pacientes com cabelos claros do que pacientes com cabelos
escuros. Os genótipos combinados PRKCA1 AA+GA + PRKCA2 AG+GG e PRKCA1
AA+GA + PLCB1 AA+CA foram mais comuns em pacientes com efélides do que em
pacientes sem efélides. As frequências do genótipos combinados ADCY3 TT+TG +
WNT8B CC+CT e ADCY3 TT + PRKCA1 AA foram maiores em pacientes com número de
nevos maior que 50 do que em pacientes com número menor de nevos. Os genótipos
combinados ADCY3 TT +CREB1 AA e PRKCA1 AA MITF AA foram mais comuns em
pacientes com tumores localizados nos membros do que em pacientes com tumores axiais.
Estes resultados, em seu conjunto, indicam que os SNPs, isolados ou combinados, estão
associados com aspectos clínicos e biológicpos do tumor. Também merece destaque o
papel do genótipo combinado TT do SNP ADYC3 com o AA do SNP MITF na redução da
SLP e SG em pacientes com MC.
Até onde atinge o nosso conhecimento, não há estudos que avaliaram a influência
desses SNPs ADCY3 c.675+9196T>G (rs 11900505), CALM2 g.47384601A>G (rs
11884600), MITF c..635-325A>G (rs 7623610), KIT c.67+12766T>C (rs 2017472),
GNAI1 g.80130766C>T (rs2079162), WNT8B c.-101T>C (rs3793772) e PRKCA
c.288+33994A>G (rs1806448) no risco de ocorrência ou no prognóstico do MC, bem
como em suas mnifestações clinicopatológicas.
Vale reforçar que ainda não foram estabelecidos se os referidos SNPs determinam
variações quantitativas ou qualitativas nas proteínas produzidas. Mas é sabido que as
proteínas codificadas desempenham funções fundamentais na melanogênse e que estão
interligadas entre si. Além disso, esses SNPs estão localizados em regiões estratégicas que
podem alterar funcionalmente as proteínas codificadas.
Assim, apresentamos pela primeira vez evidencias de que estes SNPs
desempenham papéis importantes em MC. Acreditamos que, esses resultados em conjunto,
poderão contribuir para o entendimento da fisiopatologia do MC, bem como funcionar
como alvos para novas terapêuticas para portadores da doença (Figura 12). Estamos
cientes de que estes resultados necessitam confirmação em estudo com maior casuística e
por estudos funcionais que nos permitam conhecer os papéis dos alelos distintos na síntese
das respectivas proteínas.
113
Figura 12. Representação esquemática da via da melanogênese de acordo com as funções
conhecidas ou presumidas das proteínas codificadas por genes polimórficos
identificados e selecionados em pacientes com melanoma cutâneo e controles, por
meio da genotipagem em larga escala. Os polimorfismos (SNPs) selecionados
correspondem aos genes que codificam proteínas nomeadas em preto na figura.
Não identificamos SNPs nos genes codificadores das proteínas nomeadas em azul.
A via da melanogênese inicia com ativação dos receptores de membrana, Frizzled,
MC1R e KIT através dos ligantes WNT8B, α-MSH e SCF, respectivamente, a
partir dos efeitos da luz UV na pele. Posteriomente ativação de proteínas G GNAI1
se ligarão ativando proteínas como ADCY3 e PLCB1 que na presença de
calmodulina codificado pela CALM2 repassam o sinal de ativação para o PRKCA
que ativará o CREB1 e consequente ativando o MITF causando ativação do ciclo
celular, resistência a apoptose, diferenciação celular e aumento da síntese de
pigmento, que são funções importantes na origem do melanoma cutâneo
114
CONCLUSÕES
O método de GELE possibilitou a identificação de SNPs localizados em genes
envolvidos com a via da melanogênese que podem predispor indivíduos para MC;
Os resultados encontrados a partir da GELE foram confirmados utilizando a técnica
de PCR em tempo real, considerada a técnica “padrão-ouro” para genotipagem;
Os SNPs selecionados da via da melanogênese WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
g.47384601A>G, CREB1 c.303+373G>A e MITF c.938-325A>G, isolados ou
agrupados, influenciaram o risco de ocorrência e os aspectos clínicopatológicos e
de pacientes e biológicos do tumor;
Os SNPs selecionados da via da melanogênese WNT8B c.-101T>C, KIT
c.67+12766T>C, GNAI1 g.80130766C>T, ADCY3 c.675+9196T>G, PLCB1
g.8908966C>A, PRKCA c.205+407G>A, PRKCA c.288+33994A>G, CALM2
g.47384601A>G, CREB1 c.303+373G>A e MITF c.938-325A>G, em particular os
SNPs ADCY3 c.675+9196T>G e MITF c.938-325A>G, isolados ou agrupados,
influenciaram a sobrevida de portadores do tumor; e
Em conjunto, os resultados contribuem para o entendimento e compreensão da
fisiopatologia do MC, bem como para o possível desenvolvimento de novas
terapias alvo-específicas para a doença.
115
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
American Cancer Society (2011). Cancer Facts & Figures. Atlanta, GA. Disponível em <
http://www.cancer.org > Acesso Fev 2016
Amos CI, Wang LE, Lee JE, Gershenwald JE, Chen WV, Fang S, Kosoy R, Zhang M,
Qureshi AA, Vattathil S, Schacherer CW, Gardner JM, Wang Y, Bishop DT, Barrett
JH (2011). Genome-wide association study identifies novel loci predisposing to
cutaneous melanoma. Hum Mol Genet 20(24):5012-5023
Armstrong BK, Kricker A (1993). How much melanoma is caused by sun exposure?
Melanoma Research, 6:395-401
Ascierto PA, Marincola FM (2015). The year of Anti-PD1/PD-L1s against melanoma and
beyond. EBIOMedicine, 2:92-93
Bakos L, Mastroeni S, Bonamigo RR, Melchi F, Pasquini P, Fortes C (2013). A melanoma
risk score in a Brazilian population. An Bras Dermatol 88(2):226-232
Balch CM, Gershenwald JE, Soong SJ, Thompson JF, Atkins MB, Byrd DR, Buzaid AC,
Cochran DG, Coit DG, Ding S, Eggermont AM, Flaherty KT, Gimotty PA, Kirkwood
JM, McMasters KM, Mihm Jr MC, Morton DL, Ross MI, Sober AJ, Sondak VK
(2009). Final Version of 2009 AJCC Melanoma Staging and Classification. J Clin
Oncol 27(36):6199-6206
Barrett JH, Iles MM, Harland M,Taylor JC, Aitken JF, Andresen PA, Akslen LA,
Armstrong BK, Avril MF, Azizi E, Bakker B, Bergman W, Bianchi-Scarrà G, Bressac-
de Paillerets B, Calista D, Cannon-Albright LA, Corda E, Cust AE, Dębniak T, Duffy
D, Dunning AM, Easton DF, Friedman E, Galan P, Ghiorzo P, Giles GG, Hansson J,
Hocevar M, Höiom V, Hopper JL, Ingvar C, Janssen B, Jenkins MA, Jönsson G,
Kefford RF, Landi G, Landi MT, Lang J, Lubiński J, Mackie R, Malvehy J, Martin
NG, Molven A, Montgomery GW, van Nieuwpoort FA, Novakovic S, Olsson H,
Pastorino L, Puig S, Puig-Butille JA, Randerson-Moor J, Snowden H, Tuominen R,
Van Belle P, van der Stoep N, Whiteman DC, Zelenika D, Han J, Fang S, Lee JE, Wei
Q, Lathrop GM, Gillanders EM, Brown KM, Goldstein AM, Kanetsky PA, Mann GJ,
Macgregor S, Elder DE, Amos CI, Hayward NK, Gruis NA, Demenais F, Bishop JA,
Bishop DT; GenoMEL Consortium. (2011). Genome-wide association study identifies
three new melanoma susceptibility loci. Nat Genet 43(11):1108-1113
116
Barrett JH, Taylor JC, Bright C, Harland M, Dunning AM, Akslen LA, Andresen PA,
Avril MF, Azizi E, Bianchi Scarrà G, Brossard M, Brown KM, Dębniak T, Elder DE,
Friedman E, Ghiorzo P, Gillanders EM, Gruis NA, Hansson J, Helsing P, Hočevar M,
Höiom V, Ingvar C, Landi MT, Lang J, Lathrop GM, Lubiński J, Mackie RM, Molven
A, Novaković S, Olsson H, Puig S, Puig-Butille JA, van der Stoep N, van Doorn R,
van Workum W, Goldstein AM, Kanetsky PA, Pharoah PD,Demenais F, Hayward NK,
Newton Bishop JA, Bishop DT, Iles MM; GenoMEL Consortium (2015). Fine
mapping of genetic susceptibility loci for melanoma reveals a mixture of single variant
and multiple variant regions. Int J Cancer 136(6):1351-1360
Beaumont KA, Shekar SN, Newton RA, James MR, Stow JL, Duffy DL, Sturm RA
(2007). Receptor function, dominant negative activity and phenotype correlations for
MC1R variant alleles. Hum Mol Genet 16(18):2249-2260
Beavo JA (2007). Cyclic nucleotide phosphodiesterases: functional implications of
multiple isoforms. Physiol Rev 75(4):725-748
Beiguelman B. Dinâmica dos genes nas famílias e populações. 2 ed. Ribeirão Preto: SBG,
p. 1-472, 1995
Bellei B, Pitisci A, Catricalà C, Larue L, Picardo M (2011). Wnt/β-catenin signaling is
stimulated by α-melanocyte-stimulating hormone in melanoma and melanocyte cells:
implication in cell differentiation. Pigment Cell Melanoma Res 24(2):309-325
Berrocal A, Cabañas L, Espinosa E, Fernández-de-Misa R, Martín-Algarra S, Martínez-
Cedres JC, Ríos-Buceta L, Rodríguez-Peralto JL (2014). Melanoma: diagnosis, staging,
and treatment. Consensus group recommendations. Adv Ther 31(9):945-960
Bertolotto C, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R (1998). In B16 melanoma cells, the inhibition
of melanogenesis by TPA results from PKC activation and diminution of
microphthalmia binding to the M-box of the tyrosinase promoter. Oncogene
2;16(13):1665-1670
Bishop DT, Demenais F, Iles MM, Harland M, Taylor JC, Corda E, Randerson-Moor J,
Aitken JF, Avril MF, Azizi E, Bakker B, Bianchi-Scarrà G, Bressac-de Paillerets B,
Calista D, Cannon-Albright LA, Chin-A-Woeng T, Debniak T, Galore-Haskel G,
Ghiorzo P, Gut I, Hansson J, Hocevar M, Höiom V, Hopper JL, Ingvar C, Kanetsky
PA, Kefford RF, Landi MT, Lang J, Lubiński J, Mackie R, Malvehy J, Mann GJ,
Martin NG, Montgomery GW, van Nieuwpoort FA, Novakovic S, Olsson H, Puig S,
117
Weiss M, van Workum W, Zelenika D, Brown KM, Goldstein AM, Gillanders EM,
Boland A, Galan P, Elder DE, Gruis NA, Hayward NK, Lathrop GM, Barrett JH,
Bishop JA (2009) Genome-wide association study identifies three loci associated with
melanoma risk. Nat Genet 41(8):920-925
Boland GM, Gershenwald JE (2016). Principles of Melanoma Staging. Cancer Treat Res
167:131-148
Breslow A (1970). Thickness, cross-sectional areas and depth of invasion in the prognosis
of cutaneous melanoma. Ann Surg 172(5):902-908
Burmeister BH, Henderson MA, Ainslie J, Fisher R, Di Iulio J, Smithers BM, Hong A,
Shannon K, Scolyer RA, Carruthers S, Coventry BJ, Babington S, Duprat J, Hoekstra
HJ, Thompson JF (2012). Adjuvant radiotherapy versus observation alone for patients
at risk of lymph-node field relapse after therapeutic lymphadenectomy for melanoma: a
randomised trial. Lancet Oncol 13(6):589-597
Caini S, Gandini S, Sera F, Raimondi S, Fargnoli MC, Boniol M, Armstrong BK (2009).
Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma according to anatomical site and
clinico-pathological variant. Eur J Cancer 45(17):3054-3063
Cancer Genome Atlas Network (2015). Genomic Classification of Cutaneous Melanoma.
Cell. 18;161(7):1681-1696
Carvajal RD, Antonescu CR, Wolchok JD, Chapman PB, Roman R, Teicher J, Panageas
KS, Busam KJ, Chmielowki B, Lutzky J, Pavlick AC, Fusco A, Cane L, Takebe N,
Vemula S, Bouvier N, Bastian B (2011). KIT as a therapeutic target in metastatic
melanoma. The Journal of the American Medical Association, 22:2327-2334
Carvalho BS, Louis TA, Irizarry RA (2010). Quantifying uncertainty in genotype calls.
Bioinformatics. 15;26(2):242-249
Chapman PB, Hauschild A, Robert C, Haanen JB, Ascierto P, Larkin J, Dummer R,Garbe
C, Testori A, Maio M, Hogg D, Lorigan P, Lebbe C, Jouary T, Schadendorf D,Ribas A,
O'Day SJ, Sosman JA, Kirkwood JM, Eggermont AM, Dreno B, Nolop K, Li J,Nelson
B, Hou J, Lee RJ, Flaherty KT, McArthur GA (2011); BRIM-3 Study Group. Improved
survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. The New
England Journal of Medicine, 26:2507-2516.
Chatzinasiou F, Lill CM, Kypreou K, Stefanaki I, Nicolaou V, Spyrou G, Evangelou E,
Roehr JT, Kodela E, Katsambas A, Tsao H, Ioannidis JP, Bertram L,Stratigos AJ
118
(2011). Comprehensive field synopsis and systematic meta-analyses of genetic
association studies in cutaneous melanoma. J Natl Cancer Inst 103(16):1227-1235
Chen JM, Férec C, Cooper DN (2006). A systematic analysis of disease-associated variants
in the 3' regulatory regions of human protein-coding genes II: the importance of mRNA
secondary structure in assessing the functionality of 3' UTR variants. Hum Genet
120(3):301-333
Cho DH, Bae CD, Juhnn YS (2000). Multi-facet expressions of adenylate cyclase isoforms
in B16-F10 melanoma cells differentiated by forskolin treatment. Exp Mol Med
31;32(4):235-242
Chung CC, Chanock SJ (2011). Current status of genome-wide association studies in
cancer. Hum Genet 130(1):59-78
Clark WH JR, From L, Bernardino EA, Mihm MC (1969). The histogenesis and biologic
behavior of primary human malignant melanomas of the skin. Cancer Res 29:705-727
DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA (2005). Cancer principles & practice of oncology.
In: Melanoma. 7th ed. Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins
Dobroff AS, Wang H, Melnikova VO, Villares GJ, Zigler M, Huang L, Bar-Eli M (2009).
Silencing cAMP-response element-binding protein (CREB) identifies CYR61 as a
tumor suppressor gene in melanoma. J Biol Chem. 18;284(38):26194-26206.
Edge S, Byrd DR, Compton CC, Fritz AG, Greene FL, Trotti A (2010). American Joint
Comitte On Cancer, melanoma of the Skin. In: AJCC Cancer Staging Manual. Seventh
Ed, 209-220
Elsaeber O, Leiter U, Buettner PG, Eigentler TK, Meier F, Weide B, Metzler G,
Breuninger H, Garbe C (2012). Prognosis of Sentinel Node Staged Patients with
Primary Cutaneous Melanoma. PLoS One, 1:e29791
English DR, Mac Lennan R (1990). Epidemiological studies of melanocytic naevi protocol
for identifying and recording naevi. IARC internal report no 90/002. International
Agency for Research on Cancer, Lyon.
Ernst A, Grimm A, Lim HW (2014). Tanning lamps: Health effects and reclassification by
the Food and Drug Administration. Journal of the American Academy of Dermatology,
pii: S0190-9622(14)02090-8
119
Fellner C (2012). Ipilimumab (Yervoy) prolongs survival in advanced melanoma.
Pharmacy and Therapeutics, 37:503-511
Fitzpatrick TB (1988). The validity and practically on sun-reactive skin types I through VI.
Archives Dermatology 124:869-871
Fiume R, Keune WJ, Faenza I, Bultsma Y, Ramazzotti G, Jones DR, Martelli AM, Somner
L, Follo MY, Divecha N, Cocco L (2012). Nuclear phosphoinositides: location,
regulation and function. Subcell Biochem. 59:335-361
Friedman J, Hastie T, Tibshirani R (2010). Regularization Paths for Generalized Linear
Models via Coordinate Descent. J Stat Softw 33(1):1-22
Gandini S, Sera F, Cattaruzza MS, Pasquini P, Zanetti R, Masini C, Boyle P, Melchi CF
(2005). Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma: III. Family history,
actinic damage and phenotypic factors. Eur J Cancer 41(14):2040-2059
Gandini S, Sera F, Cattaruzza MS, Pasquini P, Zanetti R, Masini C, Boyle P, Melchi CF
(2005). Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma: III. Family history,
actinic damage and phenotypic factors. Eur J Cancer 41(14):2040-2059
Geer LY, Marchler-Bauer A, Geer RC, Han L, He J, He S, Liu C, Shi W, Bryant SH
(2010). The NCBI BioSystems database. Nucleic Acids Res 38(Database issue):D492-
6
Gillgren P, Drzewiecki KT, Niin M, Gullestad HP, Hellborg H, Månsson-Brahme E,
Ingvar C, Ringborg U (2011). 2-cm versus 4-cm surgical excision margins for primary
cutaneous melanoma thicker than 2 mm: a randomised, multicentre trial. Lancet
5;378(9803):
1635-1642
Giorgi V, Savaresec I, Rossari S, Gori A, Grazzini M, Crocetti E, Sara Longo A, Oranges
T, Massi D (2012). Features of small melanocytic lesions: does small mean benign? A
clinical dermoscopic study. Melanoma Res 22(3):252-256
GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase
No. 11 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2013.
Available from: http://globocan.iarc.fr, accessed on 24/09/2014
Godar DE (2011). Worldwide increasing incidences of cutaneous malignant melanoma. J
Skin Cancer doi:10.1155/2011/858425
120
Goldstein AM, Stacey SN, Olafsson JH, Jonsson GF, Helgason A, Sulem P, Sigurgeirsson
B, Benediktsdottir KR, Thorisdottir K, Ragnarsson R, Kjartansson J, Kostic J, Masson
G, Kristjansson K, Gulcher JR, Kong A, Thorsteinsdottir U, Rafnar T, Tucker MA,
Stefansson K (2008). CDKN2A mutations and melanoma risk in the Icelandic
population. J Med Genet 45(5):284-289
Gordon D, Gillgren P, Eloranta S, Olsson H, Gordon M, Hansson J, Smedby KE (2015).
Time trends in incidence of cutaneous melanoma by detailed anatomical location and
patterns of ultraviolet radiation exposure: a retrospective population-based study.
Melanoma Res 25(4):348-356
Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R (2007). Melanoma biology and new targeted
therapy. Nature 22;445(7130):851-857
Grulich AE, van Leeuwen MT, Falster MO, Vajdic CM (2007). Incidence of cancers in
people with HIV/AIDS compared with immunosuppressed transplant recipients: a
meta-analysis. Lancet, 370:59-67
Gudbjartsson DF, Sulem P, Stacey SN, Goldstein AM, Rafnar T, Sigurgeirsson B,
Benediktsdottir KR, Thorisdottir K, Ragnarsson R, Sveinsdottir SG,Magnusson V,
Lindblom A, Kostulas K, Botella-Estrada R, Soriano V, Juberías P, Grasa M, Saez B,
Andres R, Scherer D, Rudnai P, Gurzau E, Koppova K,Kiemeney LA, Jakobsdottir M,
Steinberg S, Helgason A, Gretarsdottir S, Tucker MA, Mayordomo JI, Nagore E,
Kumar R, Hansson J, Olafsson JH, Gulcher J,Kong A, Thorsteinsdottir U, Stefansson
K (2008). ASIP and TYR pigmentation variants associate with cutaneous melanoma
and basal cell carcinoma. Nat Genet 40(7):886-891
Gupta SK, Gallego C, Johnson GL (1992). Mitogenic pathways regulated by G protein
oncogenes. Mol Biol Cell. 3(1):123-128
Hamid O, Robert C, Daud A, Hodi S, Hwu WJ, Kefford R, Wolchok J, Hersey P, Joseph
RW (2013). Safety and tumor responses with lambrolizumab (Anti–PD-1) in
melanoma. The New England Journal of Medicine, 369:134-144
Hartman ML, Czyz M (2015). MITF in melanoma: mechanisms behind its expression and
activity. Cell Mol Life Sci 72(7):1249-1260
Herrero J, Muffato M, Beal K, Fitzgerald S, Gordon L, Pignatelli M, Vilella AJ, Searle
SM, Amode R, Brent S, Spooner W, Kulesha E, Yates A,Flicek P (2016). Ensembl
comparative genomics resources. Database (Oxford) 20;2016. pii: bav096
121
Hollams EM, Giles KM, Thomson AM, Leedman PJ (2002). MRNA stability and the
control of gene expression: implications for human disease. Neurochem
Res27(10):957-980.
Hong SH, Goh SH, Lee SJ, Hwang JA, Lee J, Choi IJ, Seo H, Park JH, Suzuki H,
Yamamoto E, Kim IH, Jeong JS, Ju MH, Lee DH, Lee YS (2013). Upregulation of
adenylate cyclase 3 (ADCY3) increases the tumorigenic potential of cells by activating
the CREB pathway. Oncotarget 4(10):1791-1803
Horn S, Figl A, Rachakonda PS, Fischer C, Sucker A, Gast A, Kadel S, Moll I, Nagore E,
Hemminki K, Schadendorf D, Kumar R (2013). TERT promoter mutations in familial
and sporadic melanoma. Science 22;339(6122):959-961
Hsiao JJ, Fisher DE (2014). The roles of microphthalmia-associated transcription factor
and pigmentation in melanoma. Arch Biochem Biophys 1;563:28-34
Huang da W, Sherman BT, Lempicki RA (2009a). Systematic and integrative analysis of
large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4(1):44-57
Huang da W, Sherman BT, Zheng X, Yang J, Imamichi T, Stephens R, Lempicki RA
(2009b). Extracting biological meaning from large gene lists with DAVID. Curr Protoc
Bioinformatics Chapter 13:Unit 13.11
Iles MM, Law MH, Stacey SN, Han J, Fang S, Pfeiffer R, Harland M, Macgregor S, Taylor
JC, Aben KK, Akslen LA, Avril MF, Azizi E, Bakker B, Benediktsdottir KR, Bergman
W, Scarrà GB, Brown KM, Calista D, Chaudru V, Fargnoli MC, Cust AE, Demenais F,
de Waal AC, Dębniak T, Elder DE, Friedman E, Galan P, Ghiorzo P, Gillanders EM,
Goldstein AM, Gruis NA, Hansson J, Helsing P, Hočevar M, Höiom V, Hopper JL,
Ingvar C, Janssen M, Jenkins MA, Kanetsky PA, Kiemeney LA, Lang J, Lathrop GM,
Leachman S, Lee JE, Lubiński J, Mackie RM, Mann GJ, Martin NG, Mayordomo JI,
Molven A, Mulder S, Nagore E, Novaković S, Okamoto I, Olafsson JH, Olsson H,
Pehamberger H, Peris K, Grasa MP, Planelles D, Puig S, Puig-Butille JA, Randerson-
Moor J, Requena C, Rivoltini L, Rodolfo M, Santinami M, Sigurgeirsson B, Snowden
H, Song F, Sulem P, Thorisdottir K, Tuominen R, Van Belle P, van der Stoep N, van
Rossum MM, Wei Q, Wendt J, Zelenika D, Zhang M, Landi MT, Thorleifsson G,
Bishop DT, Amos CI, Hayward NK, Stefansson K, Bishop JA, Barrett JH; GenoMEL
Consortium; Q-MEGA and AMFS Investigators (2013). A variant in FTO shows
association with melanoma risk not due to BMI. Nat Genet. 45(4):428-32, 432e1
122
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA). Estimativas de câncer 2016. Ministério
da Saúde, Brasil, 2016. Disponível em: <http://www.inca.gov.br> Acesso: Fevereiro
2016
International HapMap Consortium (2010). The International HapMap Project. Nature
18;426(6968):789-796
Jemal A, Clegg LX, Ward E, Ries LA, WU X, Jamison PM, Wingo PA, Howe HL,
Anderson RN, Edwards BK (2004). Annual report to the nation on the status of cancer,
with a special feature regarding survival. Cancer 101(1):3-27
Jemal A, Fressie B, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D (2011). Global Cancer
statistics. CA Cancer J Clin 61:69-90
Jiang DK, Wang WZ, Ren WH, Yao L, Peng B, Yu L (2011). TP53 Arg72Pro
polymorphism and skin cancer risk: a meta-analysis. J Invest Dermatol 131(1):220-228
Kawaguchi Y, Mori N, Nakayama A (2001). Kit(+) melanocytes seem to contribute to
melanocyte proliferation after UV exposure as precursor cells. J Invest Dermatol
116(6):920-925
Kirkwood JM, Strawderman MH, Ernstoff MS, Smith TJ, Borden EC, Blum RH (1996).
Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous melanoma: the
Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684. J Clin Oncol 14(1):7-17
Knaup KX, Roemer K (2004). Cell type-specific regulation of calmodulin 2 expression by
mutant p53. FEBS Lett 569(1-3):70-74
Krasagakis K, Lindschau C, Fimmel S, Eberle J, Quass P, Haller H, Orfanos CE (2004).
Proliferation of human melanoma cells is under tight control of protein kinase C alpha.
J Cell Physiol. 199(3):381-387
Lahn MM, Sundell KL (2004). The role of protein kinase C-alpha (PKC-alpha) in
melanoma. Melanoma Res 14(2):85-89
Law MH, Bishop DT, Lee JE, Brossard M, Martin NG, Moses EK, Song F, Barrett JH,
Kumar R, Easton DF, Pharoah PD, Swerdlow AJ, Kypreou KP, Taylor JC, Harland M,
Randerson-Moor J, Akslen LA, Andresen PA, Avril MF, Azizi E, Scarrà GB, Brown
KM, Dȩbniak T, Duffy DL, Elder DE, Fang S, Friedman E, Galan P, Ghiorzo P,
Gillanders EM, Goldstein AM, Gruis NA, Hansson J, Helsing P, Hočevar M, Höiom V,
Ingvar C, Kanetsky PA, Chen WV; GenoMEL Consortium; Essen-Heidelberg
123
Investigators; SDH Study Group; Q-MEGA and QTWIN Investigators; AMFS
Investigators; ATHENS Melanoma Study Group, Landi MT, Lang J, Lathrop GM,
Lubiński J, Mackie RM, Mann GJ, Molven A, Montgomery GW, Novaković S, Olsson
H, Puig S, Puig-Butille JA, Qureshi AA, Radford-Smith GL, van der Stoep N, van
Doorn R, Whiteman DC, Craig JE, Schadendorf D, Simms LA, Burdon KP, Nyholt
DR, Pooley KA, Orr N, Stratigos AJ, Cust AE, Ward SV, Hayward NK, Han J,
Schulze HJ, Dunning AM, Bishop JA, Demenais F, Amos CI, MacGregor S, Iles MM
(2015). Genome-wide meta-analysis identifies five new susceptibility loci for
cutaneous malignant melanoma. Nat Genet 47(9):987-995
Lea CS, Holly EA, Hartge P, Lee JS, Guerry D 4th, Elder DE, Halpern A, Sagebiel RW,
Tucker MA (2007). Reproductive risk factors for cutaneous melanoma in women: a
case-control study. Am J Epidemiol 165(5):505-513
Leiter U, Eigentler T, Garbe C (2014) Epidemiology of skin cancer. Adv Exp Med Biol
810:120-140
Linger RM, Keating AK, Earp HS, Graham DK (2008). TAM receptor tyrosine kinases:
biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Adv
Cancer Res 100:35-83
Livingstone E, Zimmer L, Vaubel J, Schadendorf D (2012). Current advances and
perspectives in the treatment of advanced melanoma. J Dtsch Dermatol Ges 10(5):319-
325
Lotz MT, Dallal RM, Kirkwood JM, Flickinger JC (2001). Section 2: Cutaneous
Melanoma. In Cancer Principles & Pratice of Oncology. De Vita VT, Hellman S,
Rosenberg SA. Taunton, MA, 2012-2069
Macgregor S, Montgomery GW, Liu JZ, Zhao ZZ, Henders AK, Stark M, Schmid H,
Holland EA, Duffy DL, Zhang M, Painter JN, Nyholt DR, Maskiell JA, Jetann J,
Ferguson M, Cust AE, Jenkins MA, Whiteman DC, Olsson H, Puig S, Bianchi-Scarrà
G, Hansson J, Demenais F, Landi MT, Dębniak T, Mackie R, Azizi E, Bressac-de
Paillerets B, Goldstein AM, Kanetsky PA, Gruis NA, Elder DE, Newton-Bishop JA,
Bishop DT, Iles MM, Helsing P, Amos CI, Wei Q, Wang LE, Lee JE, Qureshi AA,
Kefford RF, Giles GG, Armstrong BK, Aitken JF, Han J, Hopper JL, Trent JM, Brown
KM, Martin NG, Mann GJ, Hayward NK (2011). Genome-wide association study
identifies a new melanoma susceptibility locus at 1q21.3. Nat Genet 9;43(11):1114-
1118
124
Mackie RM, Hauschild A, Eggermont AM (2009). Epidemiology of invasive cutaneous
melanoma. Ann Oncol 20 Suppl 6:vi1-7. Review
Mao X, Young BD, Lu YJ (2007). The application of single nucleotide polymorphism
microarrays in cancer research. Curr Genomics 8(4):219-228
McLaren W, Pritchard B, Rios D, Chen Y, Flicek P, Cunningham F (2010). Deriving the
consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.
Bioinformatics 26(16):2069-20670
Melnikova VO, Dobroff AS, Zigler M, Villares GJ, Braeuer RR, Wang H, Huang L, Bar-
Eli M (2010). CREB inhibits AP-2alpha expression to regulate the malignant
phenotype of melanoma. PLoS One 27;5(8):e12452
Melnikova VO, Mourad-Zeidan AA, Lev DC, Bar-Eli M (2006). Platelet-activating factor
mediates MMP-2 expression and activation via phosphorylation of cAMP-response
element-binding protein and contributes to melanoma metastasis. J Biol Chem
3;281(5):2911
Mendes GL, Koifman RJ, Koifman S (2010). Mortality frequency and trends attributed to
melanoma in Brazil from 1980-2005. J Toxicol Environ Health A 73:850-857
Mervic L (2012). Prognostic factors in patients with localized primary cutaneous
melanoma. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat, 21:27-31.
Moan JE, Baturaite Z, Dahlback A, Porojnicu AC (2014) Ultraviolet radiation and
cutaneous malignant melanoma. Adv Exp Med Biol 810:359-374
Mocellin S, Pasquali S, Rossi CR, Nitti D (2010). Interferon alpha adjuvant therapy in
patients with high-risk melanoma: a systematic review and meta-analysis. Journal of
the National Cancer Institute, 102, 493-501
Mocellin S, Verdi D, Nitti D (2009). DNA repair gene polymorphisms and risk of
cutaneous melanoma: a systematic review and meta-analysis. Carcinogenesis
30(10):1735-1743
Morton DL, Thompson JF, Cochran AJ, Mozzillo N, Nieweg OE, Roses DF, Hoekstra HJ,
Karakousis CP, Puleo CA, Coventry BJ, Kashani-Sabet M, Smithers BM, Paul E,
Kraybill WG, McKinnon JG, Wang HJ, Elashoff R, Faries MB (2014). Final trial
report of sentinel-node biopsy versus nodal observation in melanoma . N Engl J Med
13;370(7):599-609
125
Mouret S, Forestier A and Douki T (2012). The specificity of UVA-induced DNA damage
in human melanocytes. Photochemical & photobiological sciences, 11:155-162
Mrazek AA, Chao C (2014). Surviving Cutaneous Melanoma: A Clinical Review of
Follow-up Practices, Surveillance, and Management of Recurrence. Surg Clin North
Am 94(5):989-1002
Naser N (2011). Cutaneous melanoma: a 30-year-long epidemiological study conducted in
a city in southern Brazil, from 1980-2009. An Bras Dermatol 86(5):932-941
Niezgoda A, Niezgoda P, Czajkowski R (2015). Novel Approaches to Treatment of
Advanced Melanoma: A Review on Targeted Therapy and Immunotherapy. Biomed
Res Int 2015:851387
Ogawa K, Takeda Y, Tashima M, Sawai H, Toi T, Okazaki T, Sawada H, Maruyama Y,
Okuma M (1995). High expression of c-kit in K562YO cells due to the prolonged half-
life of its mRNA: the effects of modification with serine/threonine kinase signals.
Blood 15;85(6):1496-1503
Oliveira C, Rinck-Junior JA, Lourenço GJ, Filho PL, Moraes MA, Vassallo J, Cintra ML,
Lima CSP (2014). Association between genetic polymorphisms in apoptosis-related
genes and risk of cutaneous melanoma in women and men. J Dermatol Sci. 74(2):135-
141
Oliveira C, Rinck-Junior JA, Lourenço GJ, Moraes AM, Lima CS (2013). Assessment of
the XPC (A2920C), XPF (T30028C), TP53 (Arg72Pro) and GSTP1 (Ile105Val)
polymorphisms in the risk of cutaneous melanoma. J Cancer Res Clin Oncol
139(7):1199-1206
Pagani F, Baralle FE (2004). Genomic variants in exons and introns: identifying the
splicing spoilers. Nat Rev Genet 5(5):389-396
Paxton V, Dickson MD and Gershenwald JE (2011). Staging and prognosis of cutaneous
melanoma. Surgical Onocology Clinics of North America, 20:1-17
Pena SD, Di Pietro G, Fuchshuber-Moraes M, Genro JP, Hutz MH, Kehdy Fde S,
Kohlrausch F, Magno LA, Montenegro RC, Moraes MO, de Moraes ME, de Moraes
MR, Ojopi EB, Perini JA, Racciopi C, Ribeiro-Dos-Santos AK, Rios-Santos F,
Romano-Silva MA, Sortica VA, Suarez-Kurtz G (2011). The genomic ancestry of
individuals from different geographical regions of Brazil is more uniform than
expected. PLoS One 6(2):e17063
126
Pierre S, Eschenhagen T, Geisslinger G and Scholich K (2009). Capturing adenylyl
cyclases as potential drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8(4):321-335
Ploper D, De Robertis EM2 (2015). The MITF family of transcription factors: Role in
endolysosomal biogenesis, Wnt signaling, and oncogenesis. Pharmacol Res 21;99:36-
43
Prusis P, Schioth HB, Muceniece R, Herzyk P, Afshar M, Hubbard RE (1997). Modeling
of the three-dimensional structure of the human melanocortin 1 receptor, using an
automated method and docking of a rigid cyclic melanocyte-stimulating hormone core
peptide. J Mol Graph Model 15:307,334.
Puntervoll HE, Yang XR, Vetti HH, Bachmann IM, Avril MF, Benfodda M, Catricalà C,
Dalle S, Duval-Modeste AB, Ghiorzo P, Grammatico P, Harland M,Hayward NK, Hu
HH, Jouary T, Martin-Denavit T, Ozola A, Palmer JM, Pastorino L, Pjanova D, Soufir
N, Steine SJ, Stratigos AJ, Thomas L, Tinat J, Tsao H,Veinalde R, Tucker MA,
Bressac-de Paillerets B, Newton-Bishop JA, Goldstein AM, Akslen LA, Molven A
(2013). Melanoma prone families with CDK4 germline mutation: phenotypic profile
and associations with MC1R variants. J Med Genet 50(4):264-270
Rauterberg A, Jung EG (1993). UV exposure, skin cancer and decreased in the ozone
layer. Ther Umsch 50(12):804-807
Read J, Wadt KA, Hayward NK (2014). Melanoma genetics. J Med Genet 53(1):1-14
Robert C, Long GV, Brady B, Dutriaux C, Maio M, Mortier L, Hassel JC, Rutkowski P,
McNeil C, Kalinka-Warzoca E, Savage KJ, Hernberg MM, Lebbé C, Charles J,
Mihalcioiu C, Ciarion-Sileni V, Mauch C, Cognetti F, Arance A, Schmidt H,
Schadendorf D, Gogas H, Lundgren-Eriksson L, Horak C, Sharkey B, Waxman IM,
Atkinson V, Ascierto PA (2015). Nivolumab in previously untreated melanoma
without BRAF mutation. The New England Journal of Medicine, 4:320-330
Rodriguez CI, Setaluri V (2014). Cyclic AMP (cAMP) signaling in melanocytes and
melanoma
Sasse AD, Sasse EC, Clark LG, Ulloa L, Clark OA (2007). Chemoimmunotherapy versus
chemotherapy for metastatic malignant melanoma. Cochrane Database Syst Rev
24;(1):CD005413
Schaffer JV, Rigel DS, Kopf AW, Bolognia JL (2004). Cutaneous melanoma – past,
present and future. J Am Acad Dermatol 51(1 Suppl):65-69
127
Seal A, Gupta A, Mahalaxmi M, Aykkal R, Singh TR, Arunachalam V (2014). Tools,
resources and databases for SNPs and indels in sequences: a review. International
Journal of Bioinformatics Research and Applications, 10:264-296
Slingluff Jr CL, Flaberty K, Rosemberg SA, Read PW (2011). Cutaneous Melanoma. In:
Cancer Principles & Pratice of Oncology. De Vita Jr VT, Lawrence TS, Rosemberg
SA. Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 9th ed. Philadelphia. pp 1643-
1691
Slipicevic A, Herlyn M (2015). KIT in melanoma: many shades of gray. J Invest Dermatol
135(2):337-338
Sondak VK, Gibney GT (2014). Indications and options for systemic therapy in melanoma.
Surg Clin North Am 94(5):1049-1058
Spatz A, Stock N, Batist G and Kempen LC (2010). The biology of melanoma prognostic
factors. Discovery medicine, 10:87-93.
Svobodova AR, Galandakova A, Sianska J, Dolezal D, Ulrichova J, Vostalova J (2011).
Acute exposure to solar simulated ultraviolet radiation affects oxidative stress-related
biomarkers in skin, liver and blood of hairless mice. Biological and Pharmaceutical
Bulletin, 34:471-479
Testori A, Rutkowski P, Marsden J, Bastholt L, Chiarion-Sileni V, Hauschild A,
Eggermont AM (2009). Surgery and radiotherapy in the treatment of cutaneous
melanoma. Ann Oncol 20 (Suppl 6):vi22-vi29
Thompson JF, Scolyer RA, Kefford RF (2005). Cutaneous melanoma. Lancet. 365:687-
701
Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF (2008). Thompson & Thompson, Genética
Médica. 7ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier,2008, 640p.
Timár J, Liu B, Bazaz R, Honn KV (1996). Association of protein kinase-C-alpha with
cytoplasmic vesicles in melanoma cells. J Histochem Cytochem 44(2):177-182
Udayakumar D, Tsao H (2009). Melanoma genetics: an update on risk-associated genes.
Hematol Oncol Clin North Am 23(3):415-429
Umemura M, Baljinnyam E2, Feske S3, De Lorenzo MS2, Xie LH2, Feng X1, Oda K1,
Makino A1, Fujita T1, Yokoyama U1, Iwatsubo M2, Chen S4, Goydos JS5, Ishikawa
128
Y1, Iwatsubo K6 (2014). Store-operated Ca2+ entry (SOCE) regulates melanoma
proliferation and cell migration. PLoS One 21;9(2):e89292
Vachtenheim J, Ondrušová L (2015). Microphthalmia-associated transcription factor
expression levels in melanoma cells contribute to cell invasion and proliferation. Exp
Dermatol 24(7):481-484
Valverde P, Healy E, Jackson I, Rees JL, Thody AJ (1995). Variants of the melanocyte-
stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans.
Nat Genet 11(3):328-330
Ward KA, Lazovich D, Hordinsky MK (2012). Germline melanoma susceptibility and
prognostic genes: A review of the literature. J Am Acad Dermatol [Epub ahead of
print]
Weeraratna AT, Jiang Y, Hostetter G, Rosenblatt K, Duray P, Bittner M, Trent JM (2002).
Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.
Cancer Cell 1(3):279-288
Wehrle-Haller B (2003). The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal
homeostasis. Pigment Cell Res 16(3):287-296
Wellbrock C, Arozarena I (2015). Microphthalmia-associated transcription factor in
melanoma development and MAP-kinase pathway targeted therapy. Pigment Cell
Melanoma Res 28(4):390-406
Wunsch Filho V, Gattás GJ (2001). Molecular biomarkers in cancer:implications for
epidemiological research and public health. Cad Saúde Pública 17(3):4367-4380
Xing J, Watkins WS, Zhang Y, Witherspoon DJ, Jorde LB (2008). High fidelity of whole-
genome amplified DNA on high-density single nucleotide polymorphism arrays.
Genomics 92(6):452-456
Xu Z, Taylor JA (2009). SNPinfo: integrating GWAS and candidate gene information into
functional SNP selection for genetic association studies. Nucleic Acids Res 37:W600-5
Zhang C, Zhao X, Zhang MQ (2007). Bioinformatics for geneticists. In chapter 11:
Functional in silico analysis of gene regulatory polymorphism. Editor Wiley
Zhang T, Dutton-Regester K, Brown KM, Hayward NK (2016). The genomic landscape of
cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 29(3):266-271
Waddell N (2008). Microarray-based DNA profiling to study genomic aberrations.
IUBMB Life 60(7):437-40
129
ANEXO 1
Ficha de Coleta dos Dados Clínicos de Pacientes e Dados do Tumor
1) Identificação
Nome: _______________________________________HC_____________________________
Sexo: Feminino ( ) Masculino ( ) Data de Nascimento:_____/_______/________
2) Dados Tumorais:
2.1) Data do Diagnóstico:______/_______/_______
2.2) Localização tumoral: _____________________________________________________
2.3) Breslow (mm):________________
2.4) CLARK: I( ) II( ) III( ) IV( ) V( )
2.5) TNM: _____________________________ EC:_________________________________
2.7) Subtipos (padrão histológico): ______________________________________________
2.8) Tipo de crescimento: ______________________________________________________
2.9) Taxa de mitose: __________________________________________________________
2.10) DHL: __________________________ (Anotar o valor de normalidade do laboratório)
3) Caracteres Pessoais:
3.1) Cor da Pele: Branca( ) Negra( ) Parda( )
3.2) Cor dos olhos: Azul( ) Verde( ) Castanho/Preto( )
3.3) Cabelo: Preto( ) Castanho( ) Loiro( ) Ruivo( )
3.4) Sardas: nenhuma/raras ( ) algumas/muitas( )
3.5) Nevos: <20( ) 20-50( ) >50( )
3.6)Fototipo: I( ) II( ) III( ) IV( ) V( ) VI ( )
4) Antecedentes pessoais:
4.1) Exposição Solar: Sim( ) Não( ) Por quanto tempo:______________________ anos
4.2) Ocupação exposto ao sol: Sim ( ) Não ( ) Qual?_______________________________
4.3) Tipo de exposição solar: Nenhum ( ) Intermitente ( ) Crônica (...)
4.4) Anos de exposição ao Sol: 0( ) ≤ 20 ( ) >20 ( )
4.5) Histórico de outro tipo de câncer: Sim ( ) Não ( )
5) Antecedente Familiares:
5.1) Câncer de Pele Não Melanoma Negativo ( ) Positivo ( ) 1 ou mais da família
5.2) Câncer de Pele Melanoma Negativo ( ) Positivo ( ) 1 ou mais da família
5.3) Histórico de Câncer: Negativo ( ) Positivo ( ) com histórico de pai e mãe
OBERVAÇÕES:_________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
__
130
ANEXO 2
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
131
ANEXO 3
Termo de Consentimento Livre Esclarecido a ser obtido dos pacientes, para participação no
estudo intitulado “Identificação de Genes de Susceptibilidade Herdada para o Melanoma
Cutâneo por Genotipagem em Larga Escala”
Nome do paciente: ____________________________________________________________
Idade:____________anos RG:_____________________HC___________________________
Endereço:___________________________________________________________________
Nome do responsável legal (se paciente incapacitado): ________________________________
RG:_________________________.Grau de parentesco:_____________________________
Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei uma amostra de sangue (volume: 10 ml) a
ser colhida em veia de um dos braços. Estou ciente de que este sangue será utilizado para a
avaliação de uma predisposição pessoal para o desenvolvimento de melanoma cutâneo ou de como
o melanoma evolui. Estou ciente de que não terei prejuízos com a realização destes exames. Sei
que posso sentir dor de pequena intensidade e curta duração no local de punção da veia. Sei que
terei direito de saber o resultado do meu exame, caso esteja interessado. Neste caso, poderei marcar
uma consulta no ambulatório de Oncogenética, que é realizado no mesmo local do ambulatório de
Oncologia Clínica, no terceiro andar do Hospital de Clínicas da UNICAMP, no telefone 35217363,
com a Profa. Dra. Carmen Silvia Bertuzzo ou a Profa. Dra Fátima Aparecida Böttcher Luiz, que
darão esclarecimentos necessários para o meu caso. Sei que posso sair do estudo a qualquer
momento e que isto não vai prejudicar o meu tratamento na UNICAMP. Sei que meus dados
pessoais serão mantidos em sigilo pelo pesquisador. Sei que outros estudos só serão realizados com
o meu sangue após a aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP e caso eu concorde com o seu armazenamento.
Eu concordo com o armazenamento do meu sangue ou produto do meu sangue
SIM □ NÃO □
Se tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar o Dr. José Augusto Rinck Júnior ou a
Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima, no ambulatório de Oncologia Clínica do Hospital de
Clínicas da UNICAMP, Tel: (19) 3521 7496, ou Cristiane de Oliveira tel (19) 3521-8695.
Se tiver reclamações sobre qualquer procedimento do estudo, poderei procurar a secretaria do
Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19) 3521 8936.
Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.
_________________________________ ______________________________
Assinatura do paciente Assinatura do pesquisador legal
Campinas, ........ / ........ / ......
132
ANEXO 4
Termo de Consentimento Livre Esclarecido a ser obtido dos controles, para participação no
estudo intitulado “Identificação de Genes de Susceptibilidade Herdada para o Melanoma
Cutâneo por Genotipagem em Larga Escala”
Nome: __________________________________________________________________
Registro HEMOCENTRO: ____________________________________________________
Idade:____________anos _______________________Telefone: ______________________
Endereço:____________________________________________________________________
Aceito participar do estudo proposto, no qual fornecerei informações sobre a ocorrência de
melanoma em meus familiares e uma amostra de sangue a ser colhida em veia de um dos braços
(volume: 10 ml). Estou ciente que este material será utilizado para a avaliação de uma
predisposição pessoal para o desenvolvimento de melanoma maligno. Estou ciente de que não terei
prejuízos com a realização deste exame. Sei que posso sentir dor de pequena intensidade e curta
duração no local de punção da veia. Sei que terei direito de saber o resultado do meu exame, caso
esteja interessado. Neste caso, poderei marcar uma consulta no ambulatório de Oncogenética, que é
realizado no mesmo local do ambulatório de Oncologia Clínica, no terceiro andar do Hospital de
Clínicas da UNICAMP, no telefone (19) 35217363, com a Profa. Dra. Carmen Silvia Bertuzzo ou a
Profa. Dra Fátima Aparecida Böttcher Luiz, que darão esclarecimentos necessários para o meu
caso. Sei que posso sair do estudo a qualquer momento e que isto não vai prejudicar o meu
atendimento na UNICAMP. Sei que meus dados pessoais serão mantidos em sigilo pelo
pesquisador. Sei que outros estudos só serão realizados com o meu sangue após a aprovação do
Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP e caso eu concorde com o seu
armazenamento.
Eu concordo com o armazenamento do meu sangue ou produto do meu sangue
SIM □ NÃO □
Se tiver qualquer dúvida sobre o estudo poderei procurar a Dr. José Augusto Rinck Jr. ou a Dra.
Carmen Silvia Passos Lima, no ambulatório de Oncologia Clínica do Hospital de Clínicas da
UNICAMP. Tel: (19) 3251 7363. Se tiver reclamações sobre qualquer procedimento do estudo,
poderei procurar a secretaria do Comitê de Ética do Hospital das Clínicas UNICAMP. Tel: (19)
3521 8936.
Eu li/ouvi o conteúdo deste termo e recebi esclarecimentos sobre as minhas dúvidas oralmente.
___________________________________ ________________________________
Assinatura do controle Assinatura do pesquisador legal
Campinas, ........ / ........ / ......
133
ANEXO 5
Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a idade, o sexo, a
cor dos olhos, a cor dos cabelos e o fototipo cutâneo
Número Iniciais Idade Sexo Cor dos olhos Cor do cabelo Fototipo cutâneo
0001 RCO 19 M castanhos castanhos IV
0002 MGM 62 F Azuis loiros I
0003 CLS 71 M verdes castanhos II
0004 OKG 76 M azuis castanhos III
0005 JW 34 F castanhos loiros II
0006 TVSM 50 F castanhos castanhos II
0007 SMN 56 M azuis loiros I
0008 WC 49 M castanhos castanhos II
0009 JDJ 63 M castanhos loiros I
0010 AD 76 F castanhos castanhos II
0011 CG 54 M verdes loiros II
0012 BGL 56 F castanhos castanhos III
0013 AGO 50 M castanhos ruivos II
0014 RABB 37 F castanhos castanhos II
0015 NPJ 37 M azuis loiros II
0016 ACF 62 F castanhos castanhos III
0017 DSF 40 F verdes loiros I
0018 HB 45 M pretos castanhos IV
0019 AC 88 M castanhos castanhos II
0020 AMGA 50 F castanhos castanhos II
0021 JAN 64 M verdes castanhos III
0022 EMT 60 F azuis castanhos I
0023 JCM 69 M castanhos castanhos III
0024 MRS 70 M azuis loiros I
0025 PAV 56 M castanhos castanhos II
0026 LSL 84 F castanhos castanhos II
0027 JMP 50 M azuis castanhos II
0028 AC 67 M castanhos castanhos IV
0029 RAFP 47 F verdes castanhos II
0030 LFS 46 F castanhos castanhos II
0031 RNB 84 F azuis castanhos II
0032 DGO 38 M verdes castanhos II
0033 MCS 66 M castanhos castanhos II
0034 AS 47 M castanhos castanhos III
0035 JBO 79 M castanhos castanhos III
0036 AM 66 F verdes loiros I
0037 IBCP 60 F castanhos castanhos III
0038 ICQM 33 F azuis loiros I
0039 LMS 54 M azuis loiros I
0040 AM 73 M castanhos pretos II
0041 EMJ 62 F castanhos castanhos II
0042 TAPB 63 F castanhos castanhos III
0043 AF 86 M verdes castanhos II
0044 CILP 58 F castanhos loiros II
0045 NPPA 37 F castanhos castanhos II
0046 JBM 30 M castanhos castanhos II
0047 CRPI 39 F castanhos castanhos I
0048 ADF 46 M castanhos castanhos I
0049 MMB 32 M castanhos ruivos III
0050 ERM 58 M castanhos castanhos II
0051 PN 73 M verdes castanhos III
0052 RAS 64 M azuis loiros I
134
0053 WJBF 56 M castanhos castanhos III
0054 RMSM 32 F verdes loiros I
0055 ND 64 M azuis loiros I
0056 JCV 57 M castanhos castanhos III
0057 BJ 79 M castanhos castanhos III
0058 GM 68 M castanhos pretos IV
0059 MC 71 M castanhos castanhos III
0060 NIG 82 F azuis castanhos I
0061 DCS 69 M castanhos pretos II
0062 ABG 78 F castanhos loiros III
0063 AS 71 M azuis loiros I
0064 CV 47 M verdes loiros I
0065 CB 53 M verdes loiros II
0066 MIAN 45 F verdes castanhos II
0067 LSDS 63 F castanhos pretos II
0068 LRCN 63 M NA NA
0069 JDGM 63 M castanhos castanhos III
0070 EAM 33 F NA NA
0071 JRF 57 M azuis loiros II
0072 BJP 66 M castanhos castanhos V
0073 BGS 53 M castanhos castanhos II
0074 RPC 39 F castanhos ruivos I
0075 JFPO 25 F castanhos castanhos III
0076 RB 29 F castanhos castanhos III
0077 RAM 26 M castanhos castanhos II
0078 NLDT 25 F castanhos loiros III
0079 RS 37 M NA NA
0080 CLP 56 M castanhos pretos III
0081 MF 49 M castanhos castanhos III
0082 AB 71 M castanhos castanhos III
0083 ABM 60 F castanhos castanhos II
0084 MPR 52 F azuis loiros I
0085 AZO 82 F verdes loiros II
0086 DAS 38 M castanhos castanhos II
0087 SLPB 30 F azuis castanhos I
0088 RBS 25 F castanhos castanhos III
0089 FDC 38 M castanhos castanhos III
0090 MEKS 45 F castanhos castanhos VI
0091 JCSS 46 M castanhos castanhos IV
0092 RFM 40 F castanhos castanhos II
0093 LCQ 37 M azuis loiros I
0094 AT 49 M castanhos castanhos II
0095 MJS 55 M verdes castanhos II
0096 MLC 51 F castanhos castanhos III
0097 GNC 44 M castanhos castanhos III
0098 JAJ 59 M azuis castanhos II
0099 P-N 44 M castanhos ruivos II
0100 MFP 30 F verdes castanhos II
0101 CLZ 54 F castanhos castanhos II
0102 EFS 45 M azuis castanhos I
0103 CET 46 M azuis loiros II
Sexo: M: masculino, F: feminino; Fototipo: I: pele branca e muito sensível ao sol, II: pele branca e sensível
ao sol, III: pele morena clara e sensibilidade normal ao sol, IV: pele morena moderada e sensibilidade normal
ao sol, V: pele morena escura e pouca sensibilidade ao sol, VI: pele negra e insensível ao sol; NA: não
avaliado
135
ANEXO 6
Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a presença de efélides,
a presença de nevos e o tipo de exposição solar
Nº Iniciais Efélides Nevos Tipo de exposição solar
0001 RCO algumas/muitas 20-50 não
0002 MGM algumas/muitas <20 crônica
0003 CLS algumas/muitas 20-50 crônica
0004 OKG algumas/muitas <20 crônica
0005 JW algumas/muitas 20-50 NA
0006 TVSM nenhuma/raras 20-50 crônica
0007 SMN nenhuma/raras <20 crônica
0008 WC algumas/muitas 20-50 crônica
0009 JDJ algumas/muitas >50 crônica
0010 AD algumas/muitas <20 não
0011 CG algumas/muitas >50 intermitente
0012 BGL algumas/muitas <20 crônica
0013 AGO algumas/muitas >50 não
0014 RABB nenhuma/raras 20-50 não
0015 NPJ nenhuma/raras <20 intermitente
0016 ACF algumas/muitas 20-50 crônica
0017 DSF algumas/muitas <20 crônica
0018 HB algumas/muitas >50 crônica
0019 AC algumas/muitas 20-50 crônica
0020 AMGA algumas/muitas >50 intermitente
0021 JAN algumas/muitas <20 NA
0022 EMT algumas/muitas <20 intermitente
0023 JCM nenhuma/raras 20-50 não
0024 MRS algumas/muitas <20 crônica
0025 PAV nenhuma/raras >50 crônica
0026 LSL algumas/muitas >50 crônica
0027 JMP nenhuma/raras <20 crônica
0028 AC nenhuma/raras <20 crônica
0029 RAFP algumas/muitas >50 crônica
0030 LFS nenhuma/raras <20 crônica
0031 RNB algumas/muitas >50 crônica
0032 DGO nenhuma/raras <20 crônica
0033 MCS nenhuma/raras 20-50 crônica
0034 AS nenhuma/raras 20-50 crônica
0035 JBO algumas/muitas 20-50 crônica
0036 AM algumas/muitas <20 não
0037 IBCP algumas/muitas 20-50 não
0038 ICQM nenhuma/raras >50 crônica
0039 LMS nenhuma/raras <20 crônica
0040 AM algumas/muitas 20-50 não
0041 EMJ nenhuma/raras 20-50 crônica
0042 TAPB algumas/muitas <20 crônica
0043 AF nenhuma/raras <20 NA
0044 CILP nenhuma/raras <20 crônica
0045 NPPA nenhuma/raras 20-50 crônica
0046 JBM algumas/muitas 20-50 não
0047 CRPI algumas/muitas >50 não
0048 ADF algumas/muitas >50 intermitente
0049 MMB nenhuma/raras 20-50 não
0050 ERM nenhuma/raras >50 NA
0051 PN algumas/muitas 20-50 não
0052 RAS algumas/muitas 20-50 NA
136
0053 WJBF algumas/muitas 20-50 NA
0054 RMSM algumas/muitas >50 não
0055 ND algumas/muitas >50 NA
0056 JCV nenhuma/raras <20 crônica
0057 BJ nenhuma/raras <20 crônica
0058 GM algumas/muitas <20 NA
0059 MC algumas/muitas <20 NA
0060 NIG algumas/muitas 20-50 crônica
0061 DCS algumas/muitas <20 crônica
0062 ABG nenhuma/raras <20 não
0063 AS nenhuma/raras <20 NA
0064 CV algumas/muitas >50 não
0065 CB algumas/muitas <20 intermitente
0066 MIAN algumas/muitas <20 crônica
0067 LSDS algumas/muitas 20-50 crônica
0068 LRCN NA 20-50 NA
0069 JDGM nenhuma/raras <20 crônica
0070 EAM NA NA NA
0071 JRF nenhuma/raras <20 crônica
0072 BJP algumas/muitas 20-50 NA
0073 BGS nenhuma/raras <20 crônica
0074 RPC algumas/muitas 20-50 intermitente
0075 JFPO algumas/muitas 20-50 NA
0076 RB nenhuma/raras 20-50 NA
0077 RAM algumas/muitas 20-50 NA
0078 NLDT algumas/muitas 20-50 NA
0079 RS nenhuma/raras <20 NA
0080 CLP nenhuma/raras <20-500 crônica
0081 MF algumas/muitas 20-50 NA
0082 AB algumas/muitas >50 crônica
0083 ABM nenhuma/raras <20 crônica
0084 MPR algumas/muitas 20-50 crônica
0085 AZO algumas/muitas <20 crônica
0086 DAS algumas/muitas 20-50 intermitente
0087 SLPB algumas/muitas 20-50 NA
0088 RBS nenhuma/raras 20-50 Não
0089 FDC algumas/muitas 20-50 NA
0090 MEKS algumas/muitas <20 NA
0091 JCSS nenhuma/raras <20 NA
0092 RFM nenhuma/raras <20-500 intermitente
0093 LCQ algumas/muitas 20-50 crônica
0094 AT algumas/muitas >50 crônica
0095 MJS nenhuma/raras 20-50 crônica
0096 MLC algumas/muitas >50 crônica
0097 GNC nenhuma/raras >50 crônica
0098 JAJ algumas/muitas 20-50 intermitente
0099 P-N algumas/muitas <20-500 intermitente
0100 MFP algumas/muitas <20-500 intermitente
0101 CLZ algumas/muitas <20-500 intermitente
0102 EFS nenhuma/raras <20 não
0103 CET nenhuma/raras <20 intermitente
Efélides: nenhuma/raras: efélides em nenhuma ou apenas em um região do corpo; algumas/muitas: efélides em mais de
uma parte do corpo; Nevos: quantidade de nevos observados em toda extensão corporal
137
ANEXO 7
Distribuição dos 103 controles de acordo a idade, o sexo, a cor dos olhos, a cor dos cabelos
e o fototipo cutâneo
Nº Iniciais Idade Sexo Cor dos olhos Cor dos cabelos Fototipo cutâneo
0001 FRD 36 F castanhos castanhos III
0002 JLB 53 M castanhos pretos II
0003 ORS 49 M castanhos castanhos IV
0004 CAGV 56 F castanhos castanhos II
0005 EGS 48 M castanhos castanhos IV
0006 SEP 51 F azuis loiros III
0007 VJB 49 M castanhos pretos III
0008 JLR 47 M castanhos loiros II
0009 VB 47 M castanhos castanhos II
0010 LAG 37 F castanhos castanhos I
0011 JBR 46 M azuis loiros I
0012 LCFC 47 M castanhos castanhos I
0013 SCJ 56 M verdes castanhos I
0014 LRP 46 M castanhos castanhos II
0015 MAT 53 M castanhos pretos III
0016 FJBS 46 M castanhos pretos II
0017 MCA 34 F castanhos castanhos VI
0018 LAM 47 M verdes castanhos I
0019 LACC 47 M verdes pretos II
0020 PPS 53 M castanhos castanhos III
0021 MAJ 49 F castanhos castanhos III
0022 JCL 51 M castanhos pretos II
0023 CBS 53 M castanhos castanhos III
0024 MAPF 57 F castanhos pretos VI
0025 JCA 50 F verdes castanhos I
0026 JCS 58 M castanhos pretos V
0027 AAF 53 M castanhos castanhos II
0028 FBA 46 M castanhos castanhos III
0029 BTCP 54 F castanhos pretos II
0030 VDG 50 M castanhos castanhos III
0031 FCM 32 F azuis loiros I
0032 ESG 46 M castanhos pretos II
0033 MCD 52 F castanhos castanhos II
0034 EAR 46 M verdes loiros I
0035 ALPR 55 M castanhos castanhos III
0036 PAMP 55 M castanhos pretos III
0037 VCV 50 F castanhos pretos IV
0038 DCA 38 F castanhos castanhos III
0039 MLFS 55 F azuis castanhos III
0040 MEFS 60 F castanhos pretos II
0041 MAS 58 F castanhos pretos II
0042 GMS 49 M castanhos pretos IV
0043 LCCS 46 M castanhos pretos III
0044 ERS 48 M castanhos pretos I
0045 TBSM 54 F castanhos pretos IV
0046 PRS 55 M azuis loiros I
0047 MAP 46 M castanhos castanhos III
0048 IAM 49 M castanhos castanhos III
0049 CAM 49 M verdes loiros I
0050 RCM 32 F castanhos castanhos III
0051 MRQ 53 F castanhos castanhos I
0052 MCAS 45 F castanhos pretos II
138
0053 SMCM 51 F castanhos castanhos II
0054 FSR 37 F castanhos castanhos III
0055 AAS 49 M castanhos pretos III
0056 IV 57 F verdes loiros I
0057 ACOD 45 F castanhos castanhos III
0058 ACPBM 40 F verdes loiros I
0059 LRSS 50 F azuis castanhos III
0060 FRBC 46 M castanhos pretos I
0061 ELM 37 M castanhos pretos IV
0062 MLFCD 41 F castanhos castanhos I
0063 ROF 41 F castanhos pretos II
0064 VSA 37 F castanhos pretos III
0065 TES 35 F verdes castanhos III
0066 AMFSML 37 F castanhos pretos I
0067 JBS 47 M castanhos pretos V
0068 JO 29 M verdes castanhos II
0069 MFS 33 F castanhos castanhos I
0070 JLP 44 M castanhos castanhos III
0071 BLO 62 M castanhos pretos VI
0072 ACC 58 M verdes castanhos III
0073 AECB 50 F castanhos castanhos III
0074 ORS 52 M castanhos pretos I
0075 NÃO 47 F castanhos castanhos III
0076 MAOP 41 F castanhos pretos II
0077 JCD 63 M castanhos pretos II
0078 RSP 52 M castanhos castanhos III
0079 MCVDA 37 F castanhos pretos I
0080 MCR 47 F castanhos castanhos II
0081 CFL 34 F castanhos pretos VI
0082 SRO 29 F castanhos castanhos II
0083 SR 52 M castanhos castanhos V
0084 MCG 44 F castanhos castanhos II
0085 SLB 49 M castanhos castanhos III
0086 LSO 32 F castanhos pretos III
0087 JAI 32 F castanhos pretos III
0088 AS 47 M verdes pretos II
0089 SCM 38 F castanhos castanhos V
0090 DMPS 44 F castanhos pretos III
0091 LERR 20 M verdes pretos I
0092 ACS 35 F castanhos castanhos III
0093 AC 34 M castanhos pretos I
0094 OE 45 M castanhos pretos II
0095 CR 34 M castanhos pretos II
0096 ASJL 38 M castanhos castanhos IV
0097 AJC 48 M castanhos pretos II
0098 FHP 27 M castanhos pretos II
0099 IFS 50 F castanhos pretos II
0100 DBC 48 F castanhos pretos IV
0101 EFA 47 M castanhos pretos II
0102 HM 40 F castanhos pretos IV
0103 MC 34 M castanhos loiros I
Sexo: M: masculino, F: feminino; Fototipo: I: pele branca e muito sensível ao sol, II: pele branca e sensível
ao sol, III: pele morena clara e sensibilidade normal ao sol, IV: pele morena moderada e sensibilidade normal
ao sol, V: pele morena escura e pouca sensibilidade ao sol, VI: pele negra e insensível ao sol; NA: não
avaliado
139
ANEXO 8
Distribuição dos 103 pacientes com melanoma cutâneo de acordo com a localização tumoral,
espessura de Breslow, nível de Clark e estágio clínico
Nº Iniciais Localização tumoral Breslow (mm) Clark Estágio clínico
0001 RCO cabeça in situ I 0
0002 MGM membro inferior NA I 0
0003 CLS cabeça NA I 1
0004 OKG cabeça 0,3 II 1
0005 JW tronco 0,6 III 1
0006 TVSM tronco 6, V 2
0007 SMN cabeça 0,8 III 1
0008 WC cabeça 0,3 II 1
0009 JDJ tronco 0,9 III 1
0010 AD membro superior 0,2 I 1
0011 CG tronco in situ I 0
0012 BGL membro superior in situ I 0
0013 AGO tronco 9 IV 2
0014 RABB membro superior 0,3 II 1
0015 NPJ membro superior 0,5 III 1
0016 ACF membro inferior 0,5 II 1
0017 DSF tronco 2,6 II 2
0018 HB tronco 5, IV 2
0019 AC cabeça 2,1 V 2
0020 AMGA membro superior in situ IS 0
0021 JAN cabeça in situ I 0
0022 EMT membro inferior 4,8 IV 2
0023 JCM tronco in situ I 0
0024 MRS tronco in situ I 0
0025 PAV tronco 0,7 III 1
0026 LSL tronco 1,8 III 1
0027 JMP tronco 0,5 III 1
0028 AC cabeça 4, IV 2
0029 RAFP tronco 10,3 III 2
0030 LFS membro inferior in situ I 0
0031 RNB membro inferior 6,8 IV 2
0032 DGO tronco 0,7 III 1
0033 MCS tronco in situ I 0
0034 AS membro inferior 0,8 IV 1
0035 JBO cabeça 5 IV 2
0036 AM tronco in situ I 0
0037 IBCP cabeça 1,7 IV 2
0038 ICQM membro inferior 0,4 III 1
0039 LMS tronco 0,7 III 1
0040 AM cabeça 1,6 II 2
0041 EMJ tronco 0,2 II 1
0042 TAPB membro superior 0,4 III 1
0043 AF tronco 4, IV 2
0044 CILP membro inferior 2, II 2
0045 NPPA tronco 0,2 II 1
0046 JBM membro superior 0,6 II 1
0047 CRPI membro inferior 0,3 II 1
0048 ADF tronco 0,6 III 1
0049 MMB tronco 0,8 III 1
0050 ERM cabeça 6,8 III 2
0051 PN tronco 5 IV 3
0052 RAS membro superior 2,5 IV 4
140
0053 WJBF membro inferior 0,6 III 3
0054 RMSM membro inferior NA NA 3
0055 ND membro superior 9,4 IV 4
0056 JCV cabeça 4 V 4
0057 BJ tronco 4,2 IV 4
0058 GM tronco 1,1 III 3
0059 MC tronco 2,5 III 4
0060 NIG tronco 4 IV 3
0061 DCS tronco NA x 4
0062 ABG tronco 2,8 IV 3
0063 AS tronco 3, IV 3
0064 CV membro inferior 2, III 3
0065 CB tronco 6, IV 3
0066 MIAN tronco 2,9 IV 3
0067 LSDS membro inferior 2,3 IV 3
0068 LRCN tronco 12, IV 3
0069 JDGM tronco NA NA 4
0070 EAM tronco NA III 3
0071 JRF NA NA NA 4
0072 BJP tronco NA NA 4
0073 BGS membro inferior 4,2 V 3
0074 RPC NA 2,5 IV 3
0075 JFPO tronco 1,2 III 4
0076 RB tronco 4,5 IV 3
0077 RAM cabeça 4 IV 3
0078 NLDT membro inferior 2,7 III 3
0079 RS membro superior 3,6 IV 3
0080 CLP NA 9 V 3
0081 MF tronco 2 IV 3
0082 AB tronco 4, IV 3
0083 ABM membro inferior 3,2 IV 4
0084 MPR membro superior 6, V 3
0085 AZO membro inferior 2,2 IV 4
0086 DAS NA >0,5 I 4
0087 SLPB tronco 3,1 IV 3
0088 RBS membro superior 4 III 3
0089 FDC membro inferior 1,5 III 3
0090 MEKS membro inferior 1,6 III 3
0091 JCSS tronco NA NA 4
0092 RFM NA NA III 3
0093 LCQ NA 7 IV 3
0094 AT tronco 12, II 2
0095 MJS NA 0,6 III 1
0096 MLC NA NA NA 3
0097 GNC NA 3,7 IV 2
0098 JAJ NA 1,2 IV 1
0099 P-N NA 0,8 II 1
0100 MFP NA 1,6 IV 2
0101 CLZ NA 0,6 III 1
0102 EFS cabeça in situ I 0
0103 CET tronco 1,2 IV 3
NA: não avaliado
141
ANEXO 9
Distribuições individualizadas dos 103 pacientes com melanoma cutâneo e dos 103 controles
de acordo com o controle de qualidade de contraste (CQC), controle de qualidade de
fragmentos hibridizados e clivados pela enzima de restrição StyI (CQ StyI), pela enzima de
restrição NspI (CQ NspI), e dos fragmentos totais (CQ)
Amostras CQC CQ
StyI
CQ
NspI
CQ (%)
Paciente0001 0.94 0.98 0.01 96.06
Paciente0002 0.52 0.32 0.54 95.80
Paciente0003 0.82 0.84 0.41 96.82
Paciente0004 1.11 1.24 0.71 94.14
Paciente0005 0.78 0.72 0.39 95.20
Paciente0006 1.08 1.06 0.39 97.35
Paciente0007 1.26 1.22 0.59 96.86
Paciente0008 1.52 1.94 1.30 94.14
Paciente0009 0.65 0.71 0.31 92.42
Paciente0010 0.62 0.65 0.50 95.96
Paciente0011 1.64 1.52 1.45 97.92
Paciente0012 0.99 1.68 0.82 94.24
Paciente0013 0.97 1.07 0.22 97.12
Paciente0014 0.73 0.71 0.58 93.91
Paciente0015 0.72 1.22 1.21 95.27
Paciente0016 0.81 0.72 0.47 96.46
Paciente0017 1.46 1.34 1.07 96.96
Paciente0018 0.79 1.05 1.03 95.47
Paciente0019 1.18 1.14 1.05 96.49
Paciente0020 1.47 1.40 0.77 96.79
Paciente0022 0.63 0.70 0.50 97.19
Paciente0023 0.51 0.99 0.24 95.57
Paciente0024 1.97 1.71 1.49 98.18
Paciente0025 1.49 1.56 1.18 97.58
Paciente0026 1.06 1.14 0.84 96.13
Paciente0027 0.94 0.44 -0.03 94.31
Paciente0028 1.27 1.11 0.80 94.18
Paciente0029 0.48 0.49 0.76 94.77
Paciente0030 1.57 1.51 1.46 96.89
Paciente0031 1.04 1.75 1.36 98.25
Paciente0032 1.63 0.75 0.72 95.86
Paciente0033 1.16 1.07 0.36 96.13
Paciente0034 0.99 0.74 0.29 94.77
Paciente0036 1.02 1.13 1.17 95.14
Paciente0037 0.99 1.11 0.94 95.96
Paciente0038 0.55 0.26 0.00 93.71
Paciente0039 1.28 1.43 0.96 96.89
Paciente0040 0.73 1.44 0.00 96.66
Paciente0041 1.34 0.99 0.99 96.13
Paciente0042 0.51 -0.16 0.21 95.30
Paciente0043 0.60 0.25 0.44 96.16
Paciente0044 0.42 0.17 0.22 94.67
Paciente0045 0.79 0.62 0.26 97.12
Paciente0046 1.05 1.21 1.03 94.18
Paciente0047 0.76 0.23 0.44 95.70
Paciente0048 1.62 1.19 1.11 95.57
Paciente0049 0.52 0.03 0.08 95.93
Paciente0050 1.17 1.49 0.96 96.56
Paciente0051 0.55 0.54 0.24 95.96
Paciente0052 0.84 0.77 0.00 95.67
Paciente0053 0.86 0.96 0.43 96.19
Paciente0054 1.38 1.34 0.61 93.88
Paciente0055 0.63 0.61 0.00 95.90
Paciente0056 1.04 0.95 0.29 95.96
Paciente0057 0.85 1.08 0.56 95.33
Paciente0058 0.49 0.43 0.46 95.76
Paciente0059 0.73 0.99 0.38 96.39
Paciente0060 0.93 0.57 0.86 96.16
Paciente0061 0.65 0.63 0.57 93.94
Paciente0062 0.91 1.61 1.07 95.90
Paciente0063 1.27 1.43 1.07 96.69
Paciente0064 1.48 1.33 0.65 94.41
Paciente0065 1.27 1.59 1.31 96.33
Paciente0066 1.03 0.68 0.50 93.98
Paciente0067 1.07 0.93 0.42 97.35
Paciente0068 1.75 1.50 1.59 97.25
142
Paciente0069 1.72 1.92 1.35 97.58
Paciente0070 1.65 2.11 1.76 96.53
Paciente0071 0.76 0.34 0.56 95.00
Paciente0072 0.67 0.42 0.41 94.24
Paciente0073 0.82 0.71 0.44 95.14
Paciente0074 1.84 2.26 1.92 96.62
Paciente0075 0.87 0.69 0.34 95.00
Paciente0076 0.90 1.44 0.84 94.84
Paciente0077 1.65 2.50 2.04 95.07
Paciente0078 0.84 0.74 0.47 95.14
Paciente0079 1.21 1.14 0.68 95.90
Paciente0080 1.94 2.36 2.01 96.79
Paciente0081 1.39 1.27 1.23 96.86
Paciente0082 1.43 1.38 0.73 93.85
Paciente0083 0.70 1.23 0.51 96.76
Paciente0084 1.33 1.71 0.00 96.82
Paciente0085 0.51 0.99 0.88 94.31
Paciente0086 0.81 0.29 0.37 95.53
Paciente0087 1.12 0.85 0.63 94.97
Paciente0088 1.18 1.90 1.02 96.56
Paciente0089 1.13 1.10 0.45 97.55
Paciente0090 1.45 1.78 1.51 97.39
Paciente0091 1.00 2.00 0.78 94.37
Paciente0092 1.48 2.02 1.02 96.66
Paciente0093 1.27 1.73 0.24 92.59
Paciente0094 1.35 1.90 0.63 94.31
Paciente0095 1.54 2.28 0.90 96.00
Paciente0096 0.75 2.21 0.43 94.64
Paciente0097 1.01 1.43 0.24 96.33
Paciente0098 1.30 2.24 0.52 95.50
Paciente0099 1.04 1.67 0.52 96.43
Paciente0100 1.18 1.91 0.52 93.35
Paciente0101 1.09 1.74 0.44 92.42
Paciente0102 1.49 2.20 0.69 95.67
Paciente0103 1.70 2.17 1.17 97.52
Controle001 1.28 1.23 0.08 95.33
Controle002 0.78 0.80 0.64 96.79
Controle003 0.74 0.65 0.58 95.73
Controle004 1.03 1.46 0.77 97.25
Controle005 1.00 1.05 0.23 95.70
Controle006 1.50 1.63 1.45 97.32
Controle007 1.17 1.44 0.56 95.76
Controle008 1.08 0.41 0.08 96.33
Controle009 0.95 0.84 0.00 95.67
Controle010 1.15 1.49 0.88 91.93
Controle011 1.19 1.35 0.89 96.00
Controle012 1.27 1.58 1.27 94.90
Controle013 1.18 0.98 0.56 96.69
Controle014 1.13 0.94 0.72 96.43
Controle015 0.48 0.82 0.08 93.28
Controle016 0.41 0.53 0.36 96.39
Controle017 1.26 1.27 1.11 96.49
Controle018 1.28 1.49 1.15 97.15
Controle019 0.54 0.86 0.33 95.60
Controle020 0.50 0.59 0.13 95.70
Controle021 1.64 1.23 1.39 97.72
Controle022 0.63 0.00 0.23 93.85
Controle023 0.97 1.09 1.23 96.43
Controle024 0.67 0.95 0.74 95.10
Controle025 1.39 1.52 1.19 96.79
Controle026 1.10 1.18 1.00 94.31
Controle027 0.41 0.00 0.07 90.83
Controle028 1.87 1.67 1.27 97.32
Controle029 1.70 1.23 1.33 97.78
Controle030 0.62 0.85 0.74 96.19
Controle031 0.64 1.24 0.53 95.60
Controle032 0.57 0.44 0.63 92.95
Controle033 1.02 0.32 0.42 94.71
Controle034 0.91 1.29 0.53 96.99
Controle035 1.04 1.31 1.04 95.90
Controle036 0.55 0.52 0.16 95.96
Controle037 0.72 1.14 0.71 93.94
Controle038 0.69 0.81 0.66 93.41
Controle039 1.49 1.23 1.04 96.33
Controle040 0.89 0.65 0.19 94.77
Controle041 1.55 1.55 1.10 93.45
Controle042 0.77 0.99 0.71 97.42
Controle043 1.03 0.92 0.38 95.67
Controle044 0.61 0.67 0.79 96.72
Controle045 0.66 1.22 0.40 97.02
Controle046 1.36 1.48 0.72 93.65
Controle047 0.58 0.27 0.10 96.03
143
Controle048 1.07 0.74 0.15 96.19
Controle049 1.37 1.92 1.51 97.39
Controle050 0.89 0.95 0.99 94.57
Controle051 1.01 0.43 0.42 94.18
Controle052 0.60 0.20 0.44 94.44
Controle053 1.07 1.70 0.73 95.90
Controle054 0.40 0.19 0.19 94.80
Controle055 1.42 1.13 1.01 95.73
Controle056 1.25 1.33 1.71 95.70
Controle057 1.18 0.86 0.63 96.79
Controle058 0.76 0.99 0.55 95.86
Controle059 0.65 0.21 0.00 93.68
Controle060 0.84 1.11 0.65 96.99
Controle061 1.01 0.86 0.52 96.13
Controle062 1.35 1.52 0.94 97.05
Controle063 0.99 1.81 1.05 96.39
Controle064 1.09 0.28 0.40 95.00
Controle065 1.10 1.71 1.69 93.85
Controle066 0.92 1.64 1.44 96.96
Controle067 0.51 1.20 0.54 92.92
Controle068 1.56 1.92 2.01 97.35
Controle069 0.76 1.02 0.80 95.07
Controle070 1.41 1.55 1.37 96.16
Controle071 1.37 1.93 1.33 96.86
Controle072 0.59 0.46 0.25 95.60
Controle073 0.55 0.85 0.67 93.28
Controle074 0.42 0.90 0.89 96.03
Controle075 1.92 1.54 0.76 95.93
Controle076 1.19 1.12 0.44 96.76
Controle077 1.86 2.24 1.82 98.11
Controle078 0.62 0.17 0.00 91.73
Controle079 1.16 1.03 0.50 96.86
Controle080 0.74 1.05 0.48 95.86
Controle081 0.92 1.31 0.95 96.19
Controle082 0.64 0.53 0.42 95.33
Controle083 1.20 1.20 0.69 95.93
Controle084 0.67 1.13 0.94 96.36
Controle085 1.18 1.13 0.89 97.25
Controle086 0.94 0.20 0.08 95.14
Controle087 1.18 0.63 0.49 94.80
Controle088 0.61 1.34 1.32 96.62
Controle089 0.84 0.02 0.23 95.00
Controle090 2.01 1.76 0.63 97.45
Controle091 1.20 1.23 0.02 96.03
Controle092 0.72 0.06 0.10 95.40
Controle093 0.78 0.53 1.22 95.17
Controle094 0.71 1.20 1.17 96.76
Controle095 0.54 0.67 0.02 95.96
Controle096 1.42 1.92 1.97 98.21
Controle097 0.63 0.77 0.52 95.83
Controle098 1.30 2.24 0.52 95.50
Controle099 1.04 1.67 0.52 96.43
Controle0100 1.18 1.91 0.52 93.35
Controle101 1.09 1.74 0.44 92.42
Controle102 1.49 2.20 0.69 95.67
Controle103 1.70 2.17 1.17 97.52
CQC: controle de qualidade de contraste, CQ StyI: controle de qualidade de fragmentos
hibridizados e clivados pela enzima de restrição StyI, CQ NspI: controle de qualidade de
fragmentos hibridizados e clivados pela enzima de restrição NspI, CQ: controle de qualidade
dos fragmentos totais
144
ANEXO 10
Distribuição dos 82 polimorfismos de base única (SNP), que apresentaram frequências genotípicas
distintas entre 103 pacientes com melanoma cutâneo e 103 controles, localizados em genes
relacionados com o processo da melanogênese, de acordo com o número de referência do SNP,
símbolo do gene, frequência do alelo variante, tamanho amostral, teste de equilíbrio de
Hardy-Weinberg do grupo de controles e a localização do SNP no gene
rs do SNP Símbolo do
gene
Frequência do
alelo variante
(%)
Tamanho
Amostral
Equilíbrio de Hardy-
Weinberg Localização
X2 P valor
rs1864071 ADCY2 32 92 0,63 0,42 Íntron
rs11900505 ADCY3 46 50 3,27 0,07 Íntron
rs10198275 ADCY3 46 65 0,00 0,97 Íntron
rs10200566 ADCY3 45 232 0,13 0,71 Íntron
rs1865689 ADCY3 49 51 5,71 0,01 Íntron
rs2033653 ADCY3 44 633 0,46 0,49 íntron
rs2384058 ADCY3 43 49 0,69 0,40 regulatória
rs6545814 ADCY3 46 48 1,08 0,29 íntron
rs6733224 ADCY3 46 48 1,08 0,29 íntron
rs7567997 ADCY3 44 51 0,16 0,68 regulatória
rs9841477 ADCY5 41 71 2,30 0,12 íntron
rs9850375 ADCY5 10 129 3,80 0,05 regulatória
rs7812946 ADCY8 28 120 0,30 0,58 íntron
rs1027478 CALM2 47 48 1,08 0,29 regulatória
rs10779935 CALM2 28 26 3,98 0,04 regulatória
rs11884600 CALM2 48 114 4,97 0,02 regulatória
rs7095575 CALML3 26 250 1,41 0,23 regulatória
rs4724298 CAMK2B 10 295 0,32 0,57 regulatória
rs28599641 CAMK2D 21 188 0,95 0,32 íntron
rs6853484 CAMK2D 21 215 1,66 0,19 íntron
rs10932201 CREB1 40 117 0,45 0,50 regulatória
rs11977277 CREB3L2 10 376 1,32 0,25 íntron
rs273988 CREB3L2 45 84 0,06 0,80 íntron
rs273995 CREB3L2 41 90 0,06 0,80 íntron
rs273996 CREB3L2 42 90 0,06 0,80 íntron
rs10279584 CREB5 38 194 0,20 0,65 íntron
145
rs17156685 CREB5 8 215 2,46 0,11 íntron
rs2237364 CREB5 48 47 1,71 0,19 íntron
rs34143286 CREB5 6 633 0,46 0,49 íntron
rs41342 CREB5 49 57 0,52 0,47 íntron
rs4722839 CREB5 6 420 1,06 0,30 íntron
rs982950 CREB5 31 61 0,21 0,64 íntron
rs39733 CREBBP 10 108 0,32 0,57 regulatória
rs2079162 GNAI1 43 74 2,02 0,15 regulatória
rs17724988 GNAQ 1 633 0,46 0,49 íntron
rs6100260 GNAS 26 126 0,56 0,45 íntron
rs2017472 KIT 41 47 0,21 0,64 regulatória
rs10865653 MITF 32 90 0,41 0,52 íntron
rs7623610 MITF 32 63 0,08 0,77 regulatória
rs9822057 MITF 34 70 9,17 0,00 íntron
rs2072668 OGG1 33 120 0,30 0,58 regulatória
rs17365739 PLCB1 23 114 7,19 0,01 regulatória
rs2064272 PLCB1 28 47 0,26 0,61 regulatória
rs4295085 PLCB1 47 57 0,86 0,35 regulatória
rs6056281 PLCB1 21 96 4,62 0,03 regulatória
rs2299680 PLCB4 10 836 2,61 0,10 íntron
rs7272444 PLCB4 22 157 6,36 0,01 íntron
rs10277859 PRKAG2 10 58 0,02 0,88 regulatória
rs11766003 PRKAG2 40 144 0,12 0,72 regulatória
rs11772236 PRKAG2 37 59 2,69 0,10 regulatória
rs2024266 PRKAG2 38 55 0,28 0,59 regulatória
rs2727553 PRKAG2 40 55 6,44 0,01 regulatória
rs2727554 PRKAG2 35 48 6,89 0,01 regulatória
rs9632641 PRKAG2 10 376 1,00 0,31 regulatória
rs12601850 PRKCA 10 67 1,10 1,00 regulatória
rs1806448 PRKCA 16 108 2,67 0,10 regulatória
rs12445719 PRKCB 10 376 1,32 0,25 íntron
rs1868388 PRKCE 45 81 4,32 0,03 íntron
rs6760363 PRKCE 33 90 1,20 0,27 íntron
rs11627926 PRKCH 49 59 1,52 0,21 íntron
rs11852192 PRKCH 25 48 1,08 0,29 íntron
146
rs1536014 PRKCH 10 133 2,47 0,11 íntron
rs2058716 PRKD3 10 148 1,12 0,28 regulatória
rs1033969 PRKG1 43 58 0,06 0,80 íntron
rs10997502 PRKG1 10 64 0,91 0,34 íntron
rs10997540 PRKG1 25 46 2,76 0,09 íntron
rs10997689 PRKG1 36 55 3,02 0,08 íntron
rs16923827 PRKG1 7 8750 0,00 0,96 íntron
rs293332 PRKG1 22 44 0,48 0,48 íntron
rs4935222 PRKG1 22 140 2,04 0,15 íntron
rs7099012 PRKG1 37 63 1,24 0,26 íntron
rs2410988 PRKRIP1 23 117 1,39 0,23 regulatória
rs7797435 PRKRIP1 42 58 0,30 0,58 regulatória
rs10503830 RNA5SP259 10 152 1,22 0,26 regulatória
rs10953363 RP11-
163E9.1 42 103 0,68 0,40 regulatória
rs6997554 RP11-
737F9.1 48 47 0,26 0,61 regulatória
rs2568210 TCF7L1 34 77 4,75 0,02 íntron
rs3790608 WNT2B 10 201 0,34 0,55 íntron
rs10883497 WNT8B 10 56 0,01 0,77 íntron
rs1417823 WNT8B 10 260 0,00 0,97 íntron
rs3793771 WNT8B 10 132 0,04 0,84 codificadora
rs3793772 WNT8B 18 132 0,04 0,84 regulatória
rs: número de referência do polimorfismo de base única (SNP), χ2= qui quadrado, valores de P valores
maiores que 0,05 indicaram que a amostra encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg
147
ANEXO 11
Artigo Publicado
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