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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

CECÍLIA DE CARVALHO CASTRO E SILVA

DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES DO TIPO TRANSISTOR DE EFEITO DE

CAMPO A BASE DE GRAFENO (GraFET) DECORADOS COM NANOPARTÍCULAS DE

OURO APLICADOS NA DETECÇÃO ULTRA-SENSÍVEL DE BIOMARCADORES DE

CÂNCER DE MAMA

CAMPINAS

2015

CECÍLIA DE CARVALHO CASTRO E SILVA

DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES DO TIPO TRANSISTOR DE EFEITO DE

CAMPO A BASE DE GRAFENO (GraFET) DECORADOS COM NANOPARTÍCULAS DE

OURO APLICADOS NA DETECÇÃO ULTRA-SENSÍVEL DE BIOMARCADORES DE

CÂNCER DE MAMA

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de

Química da Universidade Estadual de Campinas

como parte dos requisitos exigidos para a obtenção

do título de Doutora em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA CECÍLIA DE CARVALHO CASTRO E SILVA, E ORIENTADA PELO PROF. DR.

LAURO TATSUO KUBOTA

CAMPINAS

2015

Silva, C. C. C Tese de Doutorado

“Follow your interests,

get the best available education and training,

set your sighs high,

be persistent, be flexible,

keep your options open,

accept help when offered,

and be prepared to help others.”

Profa. Dra. Mildred Dresselhaus


A todos aqueles que acreditam que a ciência pode ser também um

agente de transformação social,

Dedico


AGRADECIMENTOS

Por mais individual que o trabalho de uma tese de doutorado possa

parecer, muitas pessoas estão envolvidas direta ou indiretamente para tornar este

trabalho possível, assim agradeço:

Ao meu orientador Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, pela orientação

competente, confiança, por me permitir e incentivar a trabalhar em diferentes campos

da ciência. Muito obrigada Prof Lauro por tudo e principalmente pela oportunidade que

o senhor me deu anos atrás de ingressar em seu grupo de pesquisa!

A todos os integrantes do grupo LEEDS, tenho certeza que construí laços

de amizade para a vida toda aqui. Agradeço por todas as discussões e sugestões no

desenvolvimento deste trabalho. Em especial, à Dra. Camila Maroneze, Dr. Murilo

Santhiago e Ms. Maiuí N.de Camargo, pela amizade e trabalhos em colaboração

desenvolvidos neste período. Ao Glauco e Dênio por todas as discussões e

ensinamentos em relação à manipulação dos anticorpos e proteínas. Ao José Tiago,

pelas discussões sobre as medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica.

A todos os amigos e colegas (membros, ex-membros e “agregados”): João Paulo,

Cátia, Victor, Thiaguinho, Emília, Fernando, Viviane, Leandrinho, Gabriela, Luciana,

Jailson, Wilney, Mariana, Maurício, Bárbara, José Ricardo, Fabrício e Ronaldo. Em

especial à Rúbia e ao Humberto, por serem pessoas sempre dispostas a auxiliar e

ajudar os alunos do grupo.

Agradeço ao Dr. Alexandre Kisner, por todo o suporte na confecção das

máscaras de alta resolução para processos fotolitográficos, amizade e palavras de

incentivo.

Ao Prof. Dr. Manish Chhowalla, meu mentor durante o período de

doutorado sanduíche na Rutgers University. Inicialmente agradeço a oportunidade

que recebi de ingressar em seu grupo e por toda a orientação durante o período do

estágio e fora deste também. Foi um período de aprendizado intenso e

amadurecimento, que muito contribuiram não só para o desenvolvimento deste

trabalho, mas para a minha formação profissional e pessoal.

A todos os integrantes do Nanodevices Group, por todo o auxílio,

discussões científicas e amizade. Foi muito importante este período em que tive a

oportunidade de conhecer pessoas de culturas tão diferentes e extremamente

solícitas e prontas a ajudar ao próximo. Em especial ao Dr. Damien Voiry, uma pessoa


extremamente empolgada com a ciência e pesquisa, muito obrigada por dividir seus

conhecimentos comigo, pelos trabalhos em parceria e amizade. Ao Raj Kappera, por

tudo o que me ensinou sobre o crescimento de grafeno via processo CVD e métodos

de transferência. A todos os outros amigos que fiz na Rutgers University que

contribuíram muito por trazer alegria e o sentimento de comunhão neste período longe

de casa: minhas queridas amigas Elaheh e Rut, Muharrem, Hulya, Berra, Ibrahim,

Maureen, Mariana, Franciele, Ananda, Pali, Chi-Han, Yuying e Miss Kuchinow.

Agradeço ao Dr. Warren Lai (diretor da sala limpa) por me permitir usufruir

da infra-estrutura da sala limpa do Departamento de Engenharia Elétrica e

Computação da Rutgers University e ao Bob por todos os treinamentos e auxílios que

tive durante este período.

Agradeço ao Centro de Componentes de Semicondutores (CCS) da

Unicamp, por disponibilizar toda a infraestrutura para que fosse possível dar

continuidade a este trabalho no Brasil. Em especial ao Prof. Dr. Alexandre Diniz

(diretor do CCS) por todo o auxílio e preocupação com os usuários do centro. À toda

equipe técnica que me auxiliou neste período, com todos os treinamentos e suporte.

Ao Laboratório de Pesquisa de Dispositivos (LPD) do IFGW-Unicamp, em

especial ao Antônio Augusto de Godoy Von Zuben (Totó), sempre muito solicito em

me ajudar todas as vezes em que eu precisei. Ao João Hermes Clerice, Laboratório

de Nano e Biossistemas (LNB - IFGW), por todo o suporte nos experimentos iniciais

com o laser writing. Ao Laboratório Multiusuários (LAMULT) IFGW-Unicamp, em

especial à Rosane e Eduardo, sempre muito gentis com todos os usuários. Ao CTI

Renato Archer, pelo auxílio com os processos de corte e wiring bonding dos micro-

Chips.

Grande parte deste trabalho também só foi possível ser realizada graças à

infraestrutura e apoio técnico da equipe do Laboratório Nacional de Nanotecnologia

(LNNano-Campinas). A toda equipe do Laboratório de Microfabricação (LMF), em

especial ao coordenador Ângelo Gobbi, por sempre abrir as portas de seu laboratório

todas as vezes que eu precisei e por me ajudar diretamente com a deposição de

metais nos dispositivos e Rui Murer e Luis Vieira, pelo treinamento no plasma de

oxigênio e suporte. Ao Sidnei Ramis de Araújo, do Laboratório de Microscopia

Eletrônica (LME), pelo treinamento no MEV e por toda atenção e ajuda na obtenção

das micrografias de MEV de melhor qualidade. Ao Dr. Carlos Costa e Evandro Lanzoni

do Laboratório de Ciência de Superfícies (LCS) por todo o empenho na obtenção das


imagens de AFM. À Dra. Cristiane Silva (LMN) pelas análises de XPS e ensinamentos

na deconvolução dos espectros obtidos e por sempre me receber tão bem durante as

sessões. À toda equipe do DSF, em especial ao Dr. Carlos César Bof Bufon por

disponibilizar também o uso do seu sistema de caracterização elétrica.

Durante o período de doutoramento, tive a oportunidade de participar do

Programa Estágio Docente (PED), que muito contribuiu para a minha formação

profissional e reafirmou a docência em meu futuro profissional. Assim agradeço o Prof.

Dr. Jarbas José Rodrigues Rohwedder, por ter sido meu supervisor durante o estágio

docência. Obrigada Prof. Jarbas por dividir seus conhecimentos comigo e por tudo o

que o senhor ensinou para mim sobre lecionar, o senhor é uma inspiração para nós

alunos de pós-graduação que queremos seguir esta carreira.

Agradeço toda a minha família, meu cerne, meu apoio em todos os

momentos. Agradeço meus pais, Adenir e Odivar, minha irmã Mariana e avós Julieta

e Sidalino (in memorian) e meu tio Nelson (Nino) por todo o amor e apoio

incondicional, por acreditarem sempre na minha capacidade, por me incentivarem a ir

atrás de meus objetivos e compreenderem os períodos longe de casa. Tudo o que

sou devo a vocês! Agradeço também ao Marcelo, pela amizade e momentos em que

precisei de sua ajuda.

Aos professores Dr. José Alexandre Diniz, Dra. Ana Flávia Nogueira, Dra.

Mônica Alonso Cotta, Dr. Eunézio Antônio de Souza (Thoroh) e Dr. Aldo Zarbin por

todas as valiosas contribuições que realizaram durante o exame de qualificação de

área e defesa de tese, que muito me auxiliaram para a preparação da versão final

desta tese.

Ao Cnpq e ao Programa Ciências Sem Fronteiras - INCT Bioanalítica pelas

bolsas de doutorado e doutorado sanduíche concedidas. Ao INCT Bioanalítica e

FAPESP, por disponibilizar os recursos gastos no desenvolvimento desta pesquisa e

a Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, por toda infraestrutura e

recursos humanos fornecidos.


RESUMO

Título: “Desenvolvimento de biossensores do tipo transistor de efeito de campo a

base de grafeno (GraFET) decorados com nanopartículas de ouro aplicados na

detecção ultra-sensível de biomarcadores de câncer de mama”

Autora: Cecília de Carvalho Castro e Silva

Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

Palavras-chave: Transistor de efeito de campo; Grafeno, Nanopartículas de ouro,

Biossensor; Câncer de mama.

Este trabalho descreve a fabricação em grande escala de Transistores de Efeito de

Campo a base de Grafeno (GraFETs) decorados com nanopartículas de ouro e a

aplicação destes no desenvolvimento de biossensores altamente sensíveis para a

detecção dos biomarcadores de câncer de mama HER-2. O grafeno foi obtido via

processo de deposição química em fase vapor (CVD), sendo este caracterizado

através de microscopia eletrônica de varredura, de força atômica e ótica e

espectroscopia Raman, comprovando a obtenção de uma monocamada livre de

defeitos. O grafeno sintetizado foi transferido à uma lâmina de Si/SiO2 contendo as

matrizes de FET, que foram previamente fabricadas por processos convencionais de

fotolitografia e deposição de metais, sendo obtidos ao final mais de 2600 GraFETs.

Estes foram então caracterizados eletricamente em ar e em solução, exibindo assim

sensibilidade a mudanças de pH e adsorção de proteínas. Na etapa seguinte,

demonstrou-se pela primeira vez que a funcionalização da superfície do grafeno com

a p-mercaptopiridina conduz a imobilização de uma elevada densidade de

nanopartículas de ouro sobre o grafeno, de forma estável e homogênea. Além disso,

por meio do emprego da Proteína A, foi possível realizar a imobilização orientada dos

anticorpos sobre o grafeno e sobre as nanopartículas de ouro. Os GraFETs se

mostraram sensíveis a detecção da proteína HER-2, porém com a incorporação das

nanopartículas de ouro na superfície do grafeno tornou-se possível detectar níveis

extremamente baixos de HER-2, na ordem de 10-15 mol L-1. Tais magnitudes de

concentrações para este tipo de proteína não haviam até então sido detectados

empregando-se dispositivos FETs convencionais, destacando-se assim o potencial da

metodologia empregada nesta tese para a detecção precoce do desenvolvimento do

câncer de mama.


ABSTRACT

Title: “Development of Graphene Field Effect Transistor biosensors (GraFET)

decorated with gold nanoparticles applied on the ultrasensitive detection of breast

cancer biomarkers"

Author: Cecília de Carvalho Castro e Silva

Adviser: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

Key-words: Field effect transistor; Graphene, Gold nanoparticles, Biosensor, Breast

cancer.

This work describes the large scale fabrication of Graphene Field Effect Transistors

(GraFETs) decorated with gold nanoparticles and their application on the development

of highly sensitive biosensors for detecting HER-2 breast cancer biomarkers.

Graphene layers were produced by the chemical vapor deposition (CVD) method, and

the obtained graphene was characterized by scanning electron microscopy, atomic

force microscopy and optical microscopy as well as Raman spectroscopy, confirming

that the obtained graphene is defect-free and formed by a single monolayer. The co-

synthesized graphene was then transferred to a Si/SiO2 wafer containing the pre-

patterned source and drain FET electrodes, which were produced by conventional

photolithography and metal deposition, generating in total more than 2600 GraFETs in

a single wafer. The devices were electrically characterized in air and in solution and

demonstrated enough sensitivity to detect pH changes and protein adsorption. In the

next step, it was demonstrated for the first time that the chemical functionalization of

graphene surface with p-mercaptopyridine leads to the homogeneous and stable

immobilization of a high density monolayer of gold nanoparticles on its surface.

Additionally, by using protein A, it was possible to carry out the oriented immobilization

of the antibodies on graphene and over the gold nanoparticles. The GraFET sensors

without the gold nanoparticles were able to perform highly sensitive detection of the

HER-2 protein, however, after the incorporation of gold nanoparticles on the graphene

surface, concentrations even lower in the range of 10-15 mol L-1 of the HER-2 protein

were detected. Such low levels of detection for this kind of biomarker using

conventional FET have not been reported before, thus, highlighting the potential of this

approach to diagnose the primary levels of breast cancer development.


LISTA DE FIGURAS

Figura 1. (a) Imagem ilustrativa da estrutura hexagonal cristalina do grafeno. (b)

Estrutura de rede do grafeno mostrando em azul e amarelo os dois átomos de

carbono que compõem uma célula unitária e em (c) a correspondente zona de

Brillouin exibindo os pontos de alta simetria Γ, K e M. Adaptado da referência 3.

........................................................................................................................... 29

Figura 2. (a) Estrutura de banda do grafeno e zona de Brillouin ilustrada no plano

horizontal exibindo os pontos de alta simetria Γ, K e M. Em ampliação o encontro

das bandas de energia (BV e BC) em um dos pontos de Dirac. Adaptado da

referência6.(b) Efeito de campo elétrico ambipolar para uma folha de grafeno,

mostrando o acentuado aumento da resistividade em função da tensão de gate

em torno do ponto de Dirac. Dados obtidos a 1 K e na ausência de campo

magnético. Figura inserida exibindo o espectro de baixa energia cônico indicando

as alterações na posição da energia de Fermi com as mudanças na tensão de

gate. Adaptado da referência 2. .......................................................................... 30

Figura 3. Ilustração esquemática dos três principais estágios de crescimento do

grafeno via processo CVD sobre o substrato de cobre. (a) Folha de cobre com

óxido de cobre nativo sobre a superfície. (b) Folha de cobre exposta à atmosfera

de Ar/H2 à1000 ºC para etapa de recozimento, seguido de fluxo CH4 formando as

ilhas de grafeno e em (c) exibição dos domínios sp2 do grafeno com diferentes

orientações cristalográficas. Figura adaptada da referência11. .......................... 32

Figura 4. Ilustração exibindo um GraFET operando para medidas em ar na

configuração de back-gate (a) e em solução (b). ............................................... 35

Figura 5. Exemplo de curva de transferência de um GraFET quando uma voltagem

Vds constante é aplicada entre os eletrodos de fonte e dreno. ........................... 36

Figura 6. Efeito de campo eletroquímico no GraFET. Através da aplicação de uma

voltagem entre o grafeno e o eletrodo de referência, o nível de Fermi do grafeno

pode ser deslocado. Dessa forma, a condutividade pode ser modulada e o tipo

de portador de carga pode ser alterado entre lacunas (a) e elétrons (b). Figura

adaptada da referência28. ................................................................................. 36

Figura 7. Representação esquemática da dupla camada elétrica. Figura adaptada da

referência33......................................................................................................... 39

Figura 8. (a) Representação esquemática da interface grafeno/eletrólito e do circuito

equivalente exibindo os componentes da capacitância interfacial, capacitância de

Helmholtz (𝑪𝑯) em série com a capacitância quântica (𝑪𝒒) (adaptado da

referência36). (b) Modelo representativo da capacitância interfacial, exibindo as

duas componentes,(𝑪𝑯 e 𝑪𝒒)28 (c) (i) Constante dielétrica efetiva da água

próxima de uma superfície hidrofóbica, obtida através de simulação de dinâmica

molecular. (ii) Simulação da densidade dos íons Na+ e Cl- próximo a superfície do

grafeno. A simulação foi obtida considerando uma carga interfacial de 1012 cargas


negativas por cm2 em uma solução 100 mmol L-1 de cloreto de sódio e pH 7 e

com nenhuma voltagem aplicada. Adaptado da referência28 . ........................... 41

Figura 9. (a) Micrografia de MEV da superfície da folha de RGO decorada com as

nanopartículas de Au conjugadas com a proteína Anti-IgG. (b) Representação

esquemática do Biossensor FET a base do nanomaterial híbrido RGO –

Nanopartículas de Au. Adaptado da referência77. .............................................. 52

Figura 10. Representação esquemática do processo de superexpressão da

glicoproteína HER- 2 e consequentemente aumento das células cancerígenas92.

........................................................................................................................... 54

Figura 11. (a) Layout da máscara empregada na fabricação dos dispositivos exibindo

os padrões para fabricação de 49 chips. (b) Representação esquemática dos

padrões de um chip, exibindo a dimensão total deste e os 64 pares de eletrodos

de fonte e dreno organizados em uma matriz 8 x 8. Ao lado uma imagem ampliada

de um par de eletrodos de fonte e dreno. .......................................................... 59

Figura 12. Etapas empregadas no processo de obtenção do conjunto de eletrodos de

fonte e dreno dos chips fabricados. ................................................................... 61

Figura 13. Sistema empregado durante o crescimento do grafeno via processo CVD.

Composto de um forno, que fornece aquecimento constante de até 1000ºC, um

tubo de quartzo, uma bomba de vácuo conectada ao tubo de quartzo, e as linhas

de gases e controladores de fluxo. Na ampliação é mostrada a folha de cobre

inserida dentro do tubo de quartzo. .................................................................... 63

Figura 14. Diagrama exibindo o fluxo e composição dos gases, o tempo e a

temperatura empregados durante o processo de crescimento do grafeno via CVD.

........................................................................................................................... 64

Figura 15. Diagrama esquemático exemplificando o processo de transferência do

grafeno CVD para o substrato desejado. Adaptado da referência104. ................ 65

Figura 16. Imagem do dispositivo empregado a base de grafeno em substrato de

SiO2/Si, como eletrodo de trabalho para a obtenção dos espectros de EIS. ..... 72

Figura 17. (a) Imagem de microscopia ótica de um chip produzido. As diferentes

estruturas neste são indicadas pelas setas. A região dentro do retângulo branco

é mostrada em maior magnificação na Figura B. (b) Imagem de microscopia ótica

de uma região do chip mostrando alguns pares de eletrodos de fonte e dreno. (c)

Ampliação da região marcada pelo retângulo branco em B. A imagem de

microscopia ótica exibe um dos 64 pares de eletrodos formados no chip. A

distância entre cada par de eletrodos é de 12 μm e o comprimento de 20 μm. . 73

Figura 18. Imagem de microscopia ótica da folha de cobre antes (a) e após (b) o

crescimento do grafeno. Magnificação de 40x. .................................................. 74

Figura 19. Micrografias de MEV da folha de cobre antes (a) e após (b-c) o crescimento

do grafeno. ......................................................................................................... 75


Figura 20. Imagem de microscopia ótica (a) e de MEV (b) de uma monocamada de

grafeno obtida via processo CVD transferida sobre um substrato de Si/SiO2 com

um óxido de 300 nm de espessura, antes da etapa de recozimento. ................ 76

Figura 21. Imagens obtidas por AFM do filme de grafeno crescido via processo CVD

e transferido para um substrato de Si/SiO2 com 300 nm de espessura, antes (a)

e após (b-c) o processo de recozimento em ultra-alto vácuo. Em (d) o perfil de

sessão transversal da região de linha pontilhada exibida em (c). ...................... 77

Figura 22. Espectro Raman representativo (a) da amostra de grafeno crescido via

processo CVD transferido para um substrato de Si/SiO2 com um óxido de 300 nm

de espessura exibindo as típicas bandas G´(2692 cm-1), G* (2446 cm-1), G (1582

cm-1) e D (1351 cm-1). Em (b) espectro exibindo a banda G composta por uma

única Lorenztiana. (c) Exibe espectros Raman obtidos em áreas distintas do filme

de grafeno. (d) Razão da intensidade dos picos G´/G obtidos a partir dos

espectros de Raman exibidos em (c). Espectros obtidos com um laser com 𝝀 =514

nm. ..................................................................................................................... 79

Figura 23. Fotografia de uma lâmina de 4 polegadas de Si/SiO2/CVD-Grafeno com os

padrões de eletrodos (Ti/Pd) mostrando os 2668 GraFETs fabricados. Inserido a

imagem de um chip isolado, contendo os 64 GraFETs ao lado de uma moeda de

1 centavo de dólar. ............................................................................................. 81

Figura 24. Imagens de microscopia ótica dos eletrodos de fonte e dreno, após a

transferência do grafeno (a), do padrão de fotoresiste e corrosão por plasma de

oxigênio (b) e remoção do fotoresiste (c). .......................................................... 83

Figura 25. Micrografia de MEV exibindo o padrão de grafeno entre os eletrodos de

fonte e dreno. ..................................................................................................... 84

Figura 26. a) Curva corrente (I) em função da voltagem (V) aplicada para um típico

GraFET. (b) Histograma exibindo uma distribuição normal para os valores de

resistência extraído de diferentes conjuntos de eletrodos.................................. 85

Figura 27. Imagem de microscopia ótica dos eletrodos de fonte e dreno de Ti/Pd

contendo o grafeno após a passivação com o fotoresiste.................................. 86

Figura 28. (a) Medida de potencial de circuito aberto frente a um eletrodo comercial

de Ag/AgCl (3 mol L-1). Experimento realizado em meio de solução KCl 1 mol L-1

e empregando um eletrodo de fio de platina helicoidal como auxiliar. (b) Imagem

do microeletrodo de Ag/AgCl (3 mol L-1) fabricado para as medidas elétricas com

os GraFETs. ....................................................................................................... 87

Figura 29. Imagem da configuração empregada para as medidas elétricas com o

GraFET em solução. .......................................................................................... 88

Figura 30. Curva representativa de saída, Ids vs Vds variando Vg de -100 a 100 mV

(com resolução de 10 mV) em solução tampão fosfato de sódio pH 7,00 de

concentração 10 mmol L-1 e força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de

sódio para o GraFET. ......................................................................................... 89


Figura 31. Curva representativa de transferência (em preto), Ids em função de Vg

(resolução 10 mV) para um Vds de 100 mV para um típico GraFET obtida em 1mM

PBS pH 7,4. Ao lado a curva de transcondutância (gm) (em vermelho) em função

de Vg derivada a partir da curva de transferência. ............................................. 90

Figura 32. Curvas representativas de transferência, Ids em função de Vg (resolução 10

mV) para um Vds de 100 mV para cinco GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4.

........................................................................................................................... 91

Figura 33. Transcondutância em função de Vg (resolução 10 mV) para um típico

GraFET em diferentes voltagens de Vds (100, 50 e 10 mV) obtidas em 1mM PBS

pH 7,4. ................................................................................................................ 93

Figura 34. Curva C-V para o grafeno à uma frequência fixa de 100 Hz. ................... 94

Figura 35. Curvas representativas de transferência, Ids em função de Vg (resolução 10

mV) para um Vds de 10 mV para um típico GraFET em diferentes valores de pH

de 3 a 8 (força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio). A figura

inserida mostra a dependência da voltagem no ponto de Dirac em função do pH.

........................................................................................................................... 95

Figura 36. Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 10 mV para

um típico GraFET em diferentes concentrações de BSA 0,010; 1,00; 10,0; 100,0

e 1000,0 µg mL-1, preparadas em solução tampão fosfato de sódio pH 7,00 de

concentração 10 mmolL-1 e força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de

sódio. A figura inserida mostra uma ampliação do gráfico de Ids vs Vg na região

do ponto de Dirac. .............................................................................................. 97

Figura 37. Dependência do ponto de Dirac do grafeno versus concentração de BSA

para um típico GraFET. A figura inserida exibe um gráfico da dependência do

ponto de Dirac do grafeno versus – log da concentração de BSA. .................... 98

Figura 38. (a) Estrutura molecular do ácido 1-pirenobutanóico éster succinimídico

(PASE) e em (b) curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de

100 mV para um GraFET obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da

molécula ligante PASE, anticorpo, seguido do bloqueio com etanolamina e adição

de 1µg mL-1 da solução de antígeno. ............................................................... 100

Figura 39. Representação esquemática da estrutura de um anticorpo, mostrando as

porções Fab e Fc e a ligação específica da proteína A com a porção Fc do

anticorpo. Em baixo representação da relação entre a atividade do anticorpo e

sua imobilização. Adaptado da referência144. ................................................... 102

Figura 40. Medidas de ângulo de contato sobre um substrato de Si/SiO2 com 300 nm

de espessura (a), Si/SiO2 - grafeno (b) e Si/SiO2 – grafeno – Proteína A (c).

Medidas realizadas com gotas de água deionizada (resistividade de 18 MΩ. cm).

......................................................................................................................... 103

Figura 41. (a) Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV

para os GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da proteína


A, anticorpo e adições de diferentes concentrações de solução de antígenos

(10pg – 200ng mL-1). (b) Variação do potencial no ponto de Dirac do grafeno

(∆Vgmin) vs –log da concentração do antígeno, n=5. ........................................ 105

Figura 42. Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV

para um típico GraFET obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da

proteína A seguido da etapa de bloqueio, após a adição de soluções de antígenos

(100 pg e 10 ng mL-1). ...................................................................................... 107

Figura 43. (a) Imagem da solução de nanopartículas de ouro preparadas e na figura

inserida o espectro de absorbância na região do UV-Visível das mesmas,

exibindo a banda de Plasmon centrada em 518 nm. Micrografia de STEM das

nanopartículas de Au depositadas sobre uma tela de transmissão de ouro com

um filme de carbono no modo campo claro (b) e campo escuro (c). (d) Histograma

de distribuição normal do diâmetro médio de 697 nanopartículas de Au. ........ 109

Figura 44. Representação esquemática das possíveis formas de orientação

esperadas da molécula de p-mercaptopiridina em relação a superfície do grafeno.

Perpendicular (a), devido a interação do par de elétrons livre do nitrogênio

piridínico com o grafeno e paralelo (b), quando as interações intermoleculares do

tipo 𝝅 − 𝝅 prevalecem. Em ambos os casos é representado também à ligação do

tipo ácido – base mole de Pearson entre a nanopartícula de ouro e o grupo tiol.

......................................................................................................................... 111

Figura 45. Espetro de XPS de alta resolução para o N 1s obtido na superfície do

grafeno CVD após a adsorção da p-mercaptopiridina. .................................... 112

Figura 46. Micrografias de MEV do grafeno CVD depositado sobre um substrato de

300 nm de SiO2 e com nanopartículas de ouro depositadas em sua superfície,

sem (A) e com (B) a funcionalização com p-mercaptopiridina. Em (C) uma imagem

de maior magnificação (200kx) de (B).............................................................. 113

Figura 47. Imagens topográficas obtidas por AFM do grafeno CVD sobre um substrato

de 300 nm de SiO2 e com as nanopartículas de ouro imobilizadas em sua

superfície após a funcionalização com p-mercaptopiridina em uma área de 5 x 5

µm (a) e 2,5 x 2,5 µm (b). (c) Mapa topográfico em 3D da imagem exibida em (b).

......................................................................................................................... 114

Figura 48. (a) Mapa de composição para o Au (Lα 9,712 eV) de uma região da

superfície da amostra de grafeno-nanopartículas de Au sobre o substrato de

Si/SiO2, exibido na Figura X (c). Inserido o espectro de EDX exibindo as linhas

espectrais para o C (Kα 0,277 eV), O (Kα 0,525 eV), Si (Kα 1,739 eV) e Au (M

2,12 eV e Lα 0,9,712 eV). (b) Espetro de XPS de alta resolução para o Au 4f.

......................................................................................................................... 115

Figura 49. (a) Espectros Raman obtidos sobre o grafeno CVD decorado com

nanopartículas de ouro em diferentes áreas da amostra. (b) Razão da intensidade

dos picos G/D obtidos a partir dos espectros de Raman exibidos em (a). Espectros

obtidos com um laser de 𝝀 = 532 nm. .............................................................. 116


Figura 50. (a) Curvas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV para dispositivos

GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização das nanopartículas

de ouro, proteína A, anticorpo e adições de diferentes concentrações de solução

de antígenos (500fg – 200ng mL-1). (b) Variação da voltagem no ponto de Dirac

do grafeno (∆Vgmin) vs –log da concentração do antígeno, n=6. ...................... 118

Figura 51. Variação da voltagem no ponto de Dirac do grafeno (∆Vgmin) vs –log da

concentração do antígeno para os GraFET sem (•) e com (•) as nanopartículas

de ouro. ............................................................................................................ 120

Figura 52. Curva C-V (a) e variação da capacitância interfacial mínima (b) para o

grafeno à uma frequência fixa de 100 Hz obtidas em 1mmol L-1 de PBS pH 7,4

após a imobilização das nanopartículas de ouro, proteína A, anticorpo e adições

de diferentes concentrações de solução de antígenos (1p, 1n e 200ng mL-1).

Inserido em (b) o gráfico da variação da capacitância interfacial mínima em função

da adição dos antígenos. ................................................................................. 121


LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Exemplos de GraFETs aplicados como sensores e biossensores. ........... 49

Tabela 2. Valores de limite de quantificação alcançados por diferentes biossensores

no monitoramento do biom’arcador HER-2. ............................................................ 123


LISTA DE ABREVIATURAS

0 D Materiais de zero dimensão

1 D Materiais unidimensionais

2 D Materiais bidimensionais

AFM Microscopia de Força Atômica

Anti-IgG Anti-Imunoglobulina G

𝑨𝒊 Área interfacial

BC Banda de condução

BSA Albumina do soro bovino

BV Banda de valência

c Velocidade da luz

𝑪𝑯 Capacitância de Helmholtz

𝑪𝒊 Capacitância interfacial

𝑪𝒒 Capacitância quântica

C(x) Concentração das espécies iônicas à uma dada distância da

superfície

CCD Charge coupled device

CCS Centro de Componentes Semicondutores

CVD Deposição química em fase vapor

𝓭 Distância da superfície eletródica

D Eletrodo de dreno

DCE Dupla camada elétrica

∆Min Variação do potencial no ponto de Dirac do grafeno


DFT Teoria do Funcional da Densidade

DOS Densidade de estados

𝓔 Constante dielétrica adimensional do meio

𝓔𝟎 Constante dielétrica no vácuo

EBC Nível de energia na banda de condução

EBV Nível de energia na banda de valência

EDX Espectros de energia dispersiva de raio X

Engolfes Transistores Orgânicos de Efeito de Campo com Eletrólito no

Gate

EIS Espectroscopia de Impedância Eletroquímica

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

𝑬𝑭 Energia do nível de Fermi

FDA Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos

Estados Unidos

FET Transistores de efeito de campo

FWHM Largura à meia altura

gm Transcondutância

GraFET Transistores de efeito de campo a base de grafeno

ℏ Constante de Planck reduzida

HER-2 Receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2

HMDS Hexametildisiloxano

HOMO Orbital molecular ocupado de mais alta energia

HOPG Grafite pirolítico altamente ordenado

Ids Corrente que flui entre eletrodo de fonte e dreno


IFN-γ Biomarcador Tuberculose

IHP Plano interno de Helmholtz

INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva

L Comprimento geométrico do canal de condução no GraFET

𝒍𝑩 Comprimento de Bjerrum

𝝀𝑫 Comprimento de Debye

LUMO Orbital molecular desocupado de menor energia

m* Massa efetiva

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

𝝁 Mobilidade dos portadores de carga

n Concentrações de elétrons ou lacunas

n Portador de carga do tipo elétrons

OHP Plano externo de Helmholtz

p Portador de carga do tipo lacuna

PASE Ácido 1-pirenobutanóico éster succinimídico

PBS Tampão fosfato-salino

PDMS Polidimetilsiloxano

PI Ponto isoelétrico

PMMA Polimetil Metacrilato

PSA Biomarcador de câncer de próstata

𝓠 Densidade de carga no “canal” de condução do grafeno

𝒒 Carga do elétron

𝝆 Resistividade


R.F Rádio frequência

RGO Óxido de Grafeno Reduzido

𝑹𝑻 Energia térmica

S Eletrodo de fonte

STEM Scanning transmission electron microscopy

ufc mL-1 Unidades formadoras de colônia por mL

𝑽𝒄𝒉 Potencial eletrostático no “canal” de condução do grafeno

Vds Voltagem aplicada entre eletrodo de fonte e dreno

𝓿𝑭 Velocidade de Fermi

𝓥𝓓𝒊𝒓𝒂𝒄 Voltagem de Dirac

Vg Tensão no eletrodo de gate

W Largura geométrica do canal de condução no GraFET

XPS Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X

𝒛𝑭𝝓 Energia eletrostática


SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO DA TESE .................................................................................... 26

1. CAPÍTULO I - FUNDAMENTOS ........................................................................ 28

1.1. Estrutura do Grafeno e suas Propriedades Eletrônicas .................................. 28

1.2. Obtenção do Grafeno via Deposição Química em Fase Vapor (CVD) sobre

Substratos de Cu ....................................................................................................... 31

1.3. Transistores de Efeito de Campo a Base de Grafeno Operando em Meios

Líquidos ..................................................................................................................... 34

1.3.1. A Dupla Camada Elétrica – Modelo Tradicional .......................................... 38

1.3.2. A Interface Grafeno-Eletrólito ...................................................................... 41

1.4. GraFETs : Por Quê Utilizá-los Como Biossensores? ..................................... 44

1.5. Mecanismo de Detecção nos GraFETs .......................................................... 45

1.6. GraFETs Aplicados Como (Bio)Sensores ...................................................... 47

1.7. Efeito da incorporação de Nanopartículas Metálicas em GraFETs ................ 51

1.8. Diagnóstico do Câncer de Mama ................................................................... 53

2. CAPÍTULO II - OBJETIVOS .............................................................................. 56

3. CAPÍTULO III - MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................ 57

3.1. Reagentes e Soluções .................................................................................... 57

3.2. Limpeza Orgânica das Lâminas de Si/SiO2 .................................................... 58

3.3. Fabricação dos GraFETs ................................................................................ 58

3.3.1. Configuração dos Chips Fabricados ........................................................... 58

3.3.2. Fotogravação dos Padrões de Eletrodos e Formação dos Contatos

Metálicos ................................................................................................................ 60

3.3.3. Síntese de Grafeno via Deposição Química em Fase Vapor (CVD) ........... 63

3.3.4. Processo de Transferência do Grafeno para Substratos de Si/ SiO2 .......... 65

3.4. Síntese e Imobilização de Nanopartículas de Ouro sobre o Grafeno CVD .... 67

3.5. Imobilização dos Anticorpos HER-2 nos Dispositivos GraFETs e GraFETs

modificados com Nanopartículas de Au .................................................................... 68


3.6. Determinação do Ângulo de Contato .............................................................. 69

3.7. Caracterizações por Espectroscopia Raman e de Fotoelétrons Excitados por

Raios X (XPS) ........................................................................................................... 69

3.8. Caracterização por Espectrofotometria Uv-Visível ......................................... 70

3.9. Micrografias .................................................................................................... 70

3.10. Caracterização por Microscopia de Força Atômica (AFM) ............................. 70

3.11. Caracterização Elétrica ................................................................................... 71

3.11.1. Fabricação do Microeletrodo de Referência de Ag/AgCl ......................... 71

3.11.2. Caracterização por Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) 72

4. CAPÍTULO IV - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................... 73

4.1. Caracterização dos Chips Fabricados ............................................................ 73

4.2. Imagens de Microscopia Ótica e Eletrônica de Varredura (MEV) do Grafeno

Crescido sobre Substrato de Cu ............................................................................... 74

4.3. Caracterização do Grafeno Transferido Para o Substrato de Si/SiO2 via AFM

77

4.4. Caracterização do Grafeno CVD via Espectroscopia Raman ......................... 78

4.5. Transferência do Grafeno Obtido via CVD para o Substrato de

Si/SiO2/Eletrodos e Fotogravação de Padrões sobre o Grafeno ............................... 81

4.6. Caracterização Elétrica dos Dispositivos em Ar ............................................. 84

4.7. Passivação dos Eletrodos de Fonte e Dreno .................................................. 86

4.8. Caracterização Elétrica do Microeletrodo de Referência Ag/AgCl Fabricado . 87

4.9. Caracterização Elétrica dos GraFETs em Solução Eletrolítica ....................... 88

4.10. Determinação da Capacitância Interfacial para o Grafeno ............................. 93

4.11. Sensibilidade Elétrica dos GraFETs à Mudanças de pH ................................ 94

4.12. Detecção Elétrica de BSA .............................................................................. 96

4.13. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Através da Imobilização dos

Anticorpos via PASE ................................................................................................. 99


4.14. Imobilização da Proteína A Sobre o Grafeno e Medidas de Ângulo de Contato

101

4.15. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Através da Imobilização dos

Anticorpos via Proteína A ........................................................................................ 104

4.16. Caracterização por STEM e Espectrofotometria UV-Visível das

Nanopartículas de Au Sintetizadas ......................................................................... 108

4.17. Decorando o Grafeno CVD com Nanopartículas de Au ............................... 110

4.18. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Modificados com Nanopartículas

de Ouro ................................................................................................................... 117

5. CAPÍTULO V - CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ......................................... 124

6. CAPÍTULO VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................... 126

26


APRESENTAÇÃO DA TESE

A detecção de espécies de importância biológica utilizando dispositivos

elétricos miniaturizados tais como transistores de efeito de campo (do inglês, field-

effect transistor, (FETs)) tem despertado, nas últimas décadas, um grande interesse

tanto do meio acadêmico quanto tecnológico. O desenvolvimento de sensores

miniaturizados, em especial sensores em escala nanométrica, os quais possuem

elevadas áreas superficiais, torna possível a detecção de biomoléculas que

apresentam dimensões comparáveis as do próprio dispositivo de sensoriamento. Tais

características resultam em uma maior sensibilidade elétrica dos sensores devido a

uma maior interação de espécies químicas/biológicas com suas superfícies1.

Neste contexto, há uma necessidade emergente pela busca por novos

materiais semicondutores de dimensões nanométricas que apresentem as seguintes

características: facilidade de integração a matrizes de dispositivos como FETs,

produção em grande escala e que apresentem propriedades elétricas superiores aos

semicondutores convencionais, podendo assim, conferir uma maior sensibilidade à

detecção elétrica destas espécies. Neste cenário, um “novo” material bidimensional a

base de carbono, o grafeno, surge como um candidato promissor para o

desenvolvimento de biossensores do tipo FET altamente sensíveis2.

Diante do exposto, neste trabalho apresentamos o desenvolvimento de

biossensores do tipo FETs a base de grafeno (GraFETs), com o objetivo de uma

produção em grande escala e sua aplicação na detecção sensível de biomarcadores

de câncer de mama. Assim, o presente trabalho foi dividido em capítulos, no sentido

de abordar detalhadamente desde os conceitos envolvidos no entendimento das

propriedades diferenciadas do grafeno, bem como os mecanismos de operação

destes dispositivos, até a obtenção e implementação do grafeno nos FETs e seu

emprego como biossensor para a detecção de biomarcadores de câncer de mama.

O primeiro capítulo apresenta os fundamentos envolvidos no entendimento

da estrutura física do grafeno e como esta influencia no desenvolvimento de suas

propriedades optoeletrônicas diferenciadas. Realizamos uma breve abordagem sobre

o método de obtenção do grafeno via processo de deposição química em fase vapor,

bem como, os principais conceitos químicos e físicos por trás da atuação dos GraFETs

como biossensores e vantagens que estes apresentam frente aos biossensores do

tipo FET convencionais. Abordamos neste capítulo também como a incorporação de

27


nanopartículas metálicas pode oferecer melhorias ao desempenho dos dispositivos. A

última parte introduz a importância em se realizar o monitoramento dos biomarcadores

de câncer de mama.

No segundo capítulo são apresentados os objetivos do presente trabalho e

no terceiro são descritos: o processo de síntese do grafeno; a fabricação dos

dispositivos GraFETs; a obtenção das nanopartículas de ouro e imobilização destas à

superfície do grafeno; todas as condições experimentais adotadas nos ensaios de

caracterização e avaliação do seu desempenho do biossensor.

O quarto capítulo aborda os resultados e discussão referentes à

caracterização física e espectroscópica do grafeno sintetizado, fabricação dos

GraFETs, caracterização elétrica destes, bem como os imunoensaios realizados para

a detecção dos biomarcadores de câncer de mama e o efeito da incorporação das

nanopartículas de ouro no desempenho do biossensor.

O Capítulo 5 apresenta as conclusões e uma reflexão sobre o futuro dos

dispositivos GraFETs atuando como biossensores para a detecção de biomarcadores.

28

Silva, C. C. C FUNDAMENTOS Tese de Doutorado

1. CAPÍTULO I - FUNDAMENTOS

1.1. Estrutura do Grafeno e suas Propriedades Eletrônicas

A estrutura idealizada do grafeno é completamente bidimensional e

compreende uma única camada de átomos de carbono ligados covalentemente entre

si, através de uma hibridização do tipo sp2 , para formar uma estrutura plana e

hexagonal, como pode ser visto na Figura 1(a)3. O grafeno pode também ser

simplesmente descrito como uma folha de grafite, que é um mineral composto de

várias folhas de grafeno empilhadas uma sobre as outras e unidas por forças de van

der Waals e interações 𝜋 − 𝜋 4. Esta última descrição enfatiza a relação entre o

grafeno e o grafite (seu material de origem natural) e é extremamente adequada, já

que o trabalho pioneiro no emprego de grafeno por Geim e Novoselov em 20042 foi à

obtenção de uma única folha de grafeno através da “clivagem micromecânica” de

cristais de grafite pirolítico altamente ordenado (do inglês Highly Oriented Pyrolytic

Graphite (HOPG))2.

O grafeno tem uma estrutura de banda peculiar devido a sua estrutura

cristalina. A célula unitária do grafeno é composta por dois átomos de carbono, que

são definidos pelos vetores a1= (√3 ac-c/2, ac-c/2) e a2= (√3 ac-c/2, - ac-c/2), onde ac-c

corresponde ao comprimento da ligação C-C que é de 1,44 Å, como pode ser visto na

Figura 1 (b) e nesta os átomos que compõem uma célula unitária estão representados

em azul e amarelo. A célula unitária recíproca também conhecida como zona de

Brillouin apresenta um formato hexagonal com três pontos, Γ, K e M de alta simetria

(Figura 1 (c)). Estes três pontos estão localizados respectivamente no centro, onde Γ

= (0;0); no vértice de um hexágono K = 1 e no centro da aresta M. A zona de Brillouin

é representada pelos vetores b1=(2𝜋

3𝑎(1, √3) ) e b2=(

2𝜋

3𝑎(1, −√3) ). Os dois pontos, K e

K’, são denominados pontos de Dirac e são de particular importância para a física do

grafeno e consequentemente suas propriedades eletrônicas diferenciadas, as quais

serão introduzidas mais adiante3.

29


Figura 1. (a) Imagem ilustrativa da estrutura hexagonal cristalina do grafeno. (b) Estrutura de

rede do grafeno mostrando em azul e amarelo os dois átomos de carbono que compõem uma

célula unitária e em (c) a correspondente zona de Brillouin exibindo os pontos de alta simetria

Γ, K e M. Adaptado da referência 3.

A espessura de uma única folha de grafeno é de 3,4 Å, o que corresponde

exatamente à distância interplanar encontrada no grafite. Em termos de dimensões

laterais, o comprimento de uma folha de grafeno pode chegar até algumas centenas

de micrômetros, o que significa que milhões de átomos de carbono estão expostos

em sua superfície, apresentando assim uma elevada área superficial e razão de

aspecto5. Cada átomo de carbono nesta rede compartilha uma ligação 𝜎 com os seus

outros três vizinhos. A quarta ligação, é uma ligação 𝜋, o qual é orientada no eixo z

(fora do plano). Estes elétrons 𝜋 são fracamente ligados ao núcleo e estão

delocalizados sobre a folha de grafeno; assim estes elétrons que ocupam o orbital

molecular 𝜋 ligante são os responsáveis pelas propriedades optoeletrônicas do

grafeno6 . Os orbitais moleculares 𝜋 ligante e 𝜋∗ anti-ligante formam respectivamente

as bandas de valência (BV) e de condução (BC) do grafeno. Através de um gráfico da

relação de dispersão de energia para o grafeno (Figura 2 (a)) é possível visualizar a

estrutura de banda deste material, onde podemos ver que a BC apresenta seis vales

onde esta se encontra com a BV sem se sobrepor a ela. Este encontro ocorre

coincidentemente nos pontos K da zona de Brillouin, os chamados pontos de Dirac.

Assim, o grafeno é considerado um semicondutor de band gap (do inglês) de energia

zero, ou um semimetal sem superposição de bandas. Como cada célula unitária

contribui com dois átomos de carbono e consequentemente, dois elétrons 𝜋 para a

condução, podemos dizer que em seu estado fundamental, o grafeno tem todos

estados da BV preenchidos e todos os estados da BC vazios, indicando assim, que a

30


energia do nível de Fermi (𝐸𝐹) se encontra no valor mínimo desses vales, que ocorre

em 𝐸 = 0 6.

Figura 2. (a) Estrutura de banda do grafeno e zona de Brillouin ilustrada no plano horizontal

exibindo os pontos de alta simetria Γ, K e M. Em ampliação o encontro das bandas de energia

(BV e BC) em um dos pontos de Dirac. Adaptado da referência6.(b) Efeito de campo elétrico

ambipolar para uma folha de grafeno, mostrando o acentuado aumento da resistividade em

função da tensão de gate em torno do ponto de Dirac. Dados obtidos a 1 K e na ausência de

campo magnético. Figura inserida exibindo o espectro de baixa energia cônico indicando as

alterações na posição da energia de Fermi com as mudanças na tensão de gate. Adaptado

da referência 2.

As propriedades dos portadores de carga do grafeno variam com o número

de folhas presentes neste material. Os portadores de carga do grafeno e de uma

bicamada de grafeno se comportam como um gás bidimensional com massa efetiva

(m*) igual a zero, sendo assim, apresentam características de partículas relativísticas,

com velocidades de Fermi (𝜈𝐹) da ordem de 106 m s-1, apenas 300 vezes menor que

a velocidade da luz (c)7,8. As características diferenciadas dos portadores de carga

do grafeno combinado com a sua estrutura cristalina “quase” perfeita são as grandes

responsáveis pelos elevados valores de mobilidade (𝜇) dos portadores de carga neste

material, que à temperatura ambiente facilmente atingem valores na ordem de 15000

cm2 V-1 s-1, mesmo em elevadas concentrações de elétrons ou lacunas (n=1013 cm-2)

2,4,5. Estas mobilidades elevadas permitem aos portadores de carga do grafeno

desenvolverem um transporte balístico, mesmo à temperatura ambiente, onde o livre

caminho médio dos portadores de carga atinge até 0,3 µm, o que significa que estes

percorrem longas distâncias na rede do grafeno antes de sofrer algum tipo de

31


espalhamento. Adicionalmente, medidas experimentais de condutância no grafeno,

revelaram que a mobilidade dos elétrons é praticamente à mesma das lacunas, sendo

este um comportamento totalmente diferenciado dos portadores de carga do grafeno,

o qual não é encontrado em outros materiais semicondutores convencionais5.

A possibilidade de controlar as propriedades eletrônicas de um material

através da aplicação de uma voltagem externa é o grande almejo da indústria moderna

da microeletrônica e o grafeno tem oferecido tal possibilidade. O grafeno exibe um

efeito de campo elétrico ambipolar quando é incorporado na configuração de um

transistor de efeito de campo (FET). Ao se aplicar uma tensão no eletrodo de gate (Vg)

negativa há a indução de uma grande concentração de portadores de carga do tipo

lacunas no canal de condução, enquanto, ao se aplicar um Vg positivo um grande

número de portadores do tipo elétrons é induzido. A Figura 2 (b) exibe um gráfico de

resistividade (𝜌) em função de (Vg), onde é possível visualizar um pico de

resistividade (ou um mínimo de condutividade) quando a voltagem de porta se

aproxima de 0 V, o que significa que o tipo e a concentração de portadores de carga

dependem da intensidade e da polarização de tensão de gate aplicada; assim

podemos dizer que o campo elétrico atua como um “dopante” no grafeno2,9. A figura

inserida na Figura 2 (b) exibe um diagrama esquemático da estrutura de banda do

grafeno onde, sob polarização negativa o 𝐸𝐹 se desloca para baixo do ponto de Dirac,

introduzindo uma população significativa de lacunas na BV, enquanto que sob uma

polarização positiva o 𝐸𝐹 se desloca para cima do ponto de Dirac, promovendo uma

população significativa de elétrons na BC2,10.

1.2. Obtenção do Grafeno via Deposição Química em Fase Vapor

(CVD) sobre Substratos de Cu

Existem uma infinidade de métodos descritos na literatura sobre a obtenção

de grafeno e seus derivados8,11, porém a escolha do método que será empregado

para a obtenção do grafeno está diretamente relacionada com a aplicação final que

será dada a este material. Desse modo, o desenvolvimento de dispositivos opto-

eletrônicos requer a utilização de monocamadas de grafeno de elevada qualidade e

em grandes dimensões, que possam assim, ser facilmente manipuladas e integradas

a processos em grande escala. Neste contexto, um método que possibilita a obtenção

de grafeno de elevada qualidade e em grande escala é a deposição química em fase

32


vapor (do inglês, chemical vapor deposition (CVD)) empregando carbono como

precursor sobre metais de transição11,12.

Nesta, o carbono é geralmente fornecido na forma de gás (hidrocarbonetos)

e um metal de transição é empregado como catalisador e substrato para que ocorra o

crescimento da camada de grafeno11,12. O emprego dos catalisadores metálicos se

faz necessário pois devido à forte ligação C-H na molécula de metano (440kJ mol-1) a

decomposição térmica desta ocorrerá em elevadas temperaturas (>1200ºC), desse

modo, além do consumo elevado de energia, esta temperatura não é trivial de ser

alcançar em um sistema CVD convencional13. Assim para reduzir a temperatura de

decomposição do metano, diferentes metais de transição vêm sendo utilizados (Cu,

Ni, Fe, Co, Pt, Ru, Rh e Au), possibilitando o crescimento em temperaturas entre 750-

1050ºC 12,14.

No ano de 2009, Xuesong Li, et al15 demonstraram pela primeira vez o

crescimento de grafeno via processo CVD. Para isso os autores utilizaram folhas de

cobre de 25 µm de espessura como substrato, obtendo 95% de uma monocamada.

Desde então, o cobre se tornou o catalisador mais empregado para a obtenção de

monocamadas de grafeno16,17. Isto está principalmente relacionado com a baixa

solubilidade dos átomos de carbono sobre o cobre (0,001-0,008 % em massa à

1084ºC)11, parâmetro chave para a obtenção de monocamadas.

A seguir será apresentado resumidamente as principais etapas do

crescimento do grafeno via processo CVD, empregando folhas de cobre como

substrato e catalisador, conforme exemplificado na Figura 3.

Figura 3. Ilustração esquemática dos três principais estágios de crescimento do grafeno via

processo CVD sobre o substrato de cobre. (a) Folha de cobre com óxido de cobre nativo sobre

a superfície. (b) Folha de cobre exposta à atmosfera de Ar/H2 à1000 ºC para etapa de

recozimento, seguido de fluxo CH4 formando as ilhas de grafeno e em (c) exibição dos

domínios sp2 do grafeno com diferentes orientações cristalográficas. Figura adaptada da

referência11.

33


O primeiro passo para a obtenção de monocamadas de grafeno sobre o

cobre é a realização da etapa de recozimento. Nesta etapa a folha de cobre é

submetida a um aquecimento à 1000ºC, geralmente por 30 minutos em atmosfera de

Ar/H2 (Figura 3 (a-b)), visando a remoção do óxido de cobre nativo (CuO e Cu2O), que

reduz a atividade catalítica do cobre 11,18. Além disso, a etapa de recozimento antes

da etapa de crescimento do grafeno é importante para aumentar o tamanho dos grãos

de cobre e rearranjar a morfologia da superfície, removendo também imperfeições e

eliminando impurezas. Isto é extremamente importante para a obtenção de

monocamadas de grafeno livre de defeitos, pois como será discutido posteriormente,

durante a etapa de nucleação, os átomos de carbono podem nuclear nas impurezas,

imperfeições e bordas dos grãos de cobre, produzindo assim domínios sp2

menores19,20.

Após a pré-etapa de recozimento, a etapa crescimento pode ser iniciada.

Onde primeiramente, sob atmosfera de gás metano, as moléculas de metano se

adsorvem sobre a superfície da folha de cobre seguida da etapa de decomposição

catalítica em átomos de carbono (reação de desidrogenação)12. Após esta etapa, os

átomos de carbono sobre a superfície do substrato de cobre iniciam um processo de

migração sobre a superfície, dando origem a ilhas grafíticas (domínios sp2 de formato

hexagonal), processo conhecido como nucleação Figura 3 (b). Desse modo, durante

a etapa de crescimento do grafeno, vários domínios sp2 são formados e mais átomos

de carbono migram até estes, aumentando assim progressivamente o tamanho destes

domínios (Figura 3 (c)), até que estes se coalescem dando origem a uma

monocamada de grafeno11,15. Assim que toda a folha de cobre está recoberta pela

monocamada de grafeno o processo de crescimento é praticamente interrompido, já

que não há mais catalisador exposto (folha de cobre) para promover a decomposição

do gás metano11. Desse modo o fluxo de gás metano é interrompido e pode-se iniciar

o processo de resfriamento.

Vale ressaltar que a orientação cristalográfica do grafeno crescido é

dependente da orientação cristalográfica do substrato e quanto menor o número de

sítios de nucleação sobre a folha de cobre melhor será a qualidade do grafeno

crescido, já que assim, são formados domínios sp2 maiores, evitando o ocorrência de

inúmeras regiões de união entre domínios, já que este processo induz um stress e

consequentemente, defeitos no grafeno crescido21,22

34


Após a etapa de crescimento, o grafeno pode ser facilmente transferido

para os mais arbitrários substratos como SiO2, vidro e até plásticos, pela dissolução

da folha de cobre via processos de corrosão com soluções de FeCl3, CuSO4 ou

ácidos11 .

As vantagens em se utilizar a técnica de CVD para a obtenção do grafeno

incluem a produção de folhas únicas com elevados valores de 𝜇 (16000 cm2 V-1 s-1)6

e em alguns casos, como foi demonstrado recentemente por Bae et al. 19 folhas com

dimensões de até 12 polegadas. Assim, este método propicia a produção industrial de

componentes semicondutores a base de grafeno para aplicações em

micro/optoeletrônica bem como o desenvolvimento de sensores do tipo FETs à base

de grafeno em grande escala.

Já as principais desvantagens do uso do grafeno obtido via processo CVD,

estão relacionadas com os inconvenientes encontrados durante o processo de

transferência do grafeno crescido sobre o catalisador metálico para o substrato de

interesse. Principalmente devido à dificuldade em se remover completamente os

resíduos de partículas metálicas provenientes do substrato metálico, bem como da

solução corrosiva empregada para dissolver este23. Estes resíduos metálicos, mesmo

que em pequenas concentrações (de 1010 à 1013 átomos cm-2), acabam por promover

o espalhamento dos portadores de carga no grafeno, podendo comprometer os

valores de 𝜇 destes.

1.3. Transistores de Efeito de Campo a Base de Grafeno

Operando em Meios Líquidos

Devido as suas propriedades eletrônicas intrínsecas, uma das aplicações

mais promissoras para o grafeno é o seu emprego em dispositivos do tipo transistor

de efeito de campo de filme fino orgânico2. Nesta configuração o grafeno é imobilizado

sobre um material dielétrico, geralmente SiO2, crescido sobre um substrato de Si

altamente dopado, e é contactado por dois eletrodos metálicos, denominados de fonte

e dreno (geralmente de Au e Pd) e um terceiro contato elétrico é ainda estabelecido

na base do silício, sendo este conhecido como back-gate, como exemplificado na

Figura 4 (a). Assim a condutância do “canal” (na verdade do próprio grafeno) entre os

eletrodos de fonte e dreno é modulada pelo eletrodo de gate, o qual está acoplado

capacitivamente através da fina camada do dielétrico19,24.

35


Figura 4. Ilustração exibindo um GraFET operando para medidas em ar na configuração de

back-gate (a) e em solução (b).

Os transistores de efeito de campo a base de Grafeno (GraFETs) também

podem ser configurados como sensores de moléculas ou íons em meios líquidos,

como exemplificado na Figura 4 (b). Para a operação em meios líquidos, o efeito de

campo é gerado através da aplicação de um potencial (VGS) em uma solução

eletrolítica através de um eletrodo de referência convencional como Ag/AgCl, onde o

potencial na superfície do transistor é medido então em relação a este25,26. Nesta

configuração o dielétrico de porta é estabelecido através da formação da dupla

camada elétrica de Debye-Helmholtz entre a solução eletrolítica e o grafeno25,26.

Similarmente ao que acontece com transistores convencionais aplicados

como sensores, tais como os transistores de efeito de campo sensíveis a íons 27, a

condutância no “canal” dos GraFETs (operando em meio de eletrólitos) pode ser

modulada pela voltagem do eletrodo de porta, devido ao efeito de dopagem induzido

pelo efeito de campo. O desempenho de um GraFET pode então ser avaliado através

da curva de transferência, que nada mais é que a corrente que flui entre o eletrodo de

fonte ((S), do inglês source) e dreno ((D), do inglês drain) Ids, em função da voltagem

aplicada ao eletrodo de gate (Vg) à uma tensão fixa entre eletrodo de fonte e dreno

(Vds), conforme exemplificado na Figura 5.

Back gate

36


Figura 5. Exemplo de curva de transferência de um GraFET quando uma voltagem Vds

constante é aplicada entre os eletrodos de fonte e dreno.

A curva em formato de V observada na Figura 5 pode ser explicada por um

modelo que descreve a interface eletrólito-grafeno, como demonstrada na Figura 628.

Figura 6. Efeito de campo eletroquímico no GraFET. Através da aplicação de uma voltagem

entre o grafeno e o eletrodo de referência, o nível de Fermi do grafeno pode ser deslocado.

Dessa forma, a condutividade pode ser modulada e o tipo de portador de carga pode ser

alterado entre lacunas (a) e elétrons (b). Figura adaptada da referência28.

VGS (V)

I ds

(A

)

Voltagem no

Ponto de Dirac

37


Considerando o caso em que a voltagem de gate em um GraFET é aplicada

através de um eletrodo de referência Ag/AgCl, com o nível de potencial deste eletrodo

fixado no vácuo, aplicando-se uma tensão entre este eletrodo e o grafeno, a energia

do nível de Fermi (𝐸𝐹) sofre uma mudança, que consequentemente controla o número

de portadores de carga livres induzidos eletrostaticamente. Quando o nível de Fermi

atinge o ponto de Dirac, ou seja, a energia em que a banda de condução (EBC) e de

valência (EBv) se encontram, a condutividade do filme de grafeno exibe seu valor

mínimo. A voltagem na qual isto é observado é denominada como voltagem de Dirac

(𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐). Quando a 𝐸𝐹 encontra-se abaixo de 𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐, os portadores de carga

majoritários na banda de valência do grafeno são as lacunas. Quando a voltagem no

eletrodo de porta é diminuída ainda mais, (VG <<0) o nível de Fermi é deslocado mais

profundamente para o interior da banda de valência, e a densidade de carga aumenta

(Figura 6 (a)), gerando uma corrente através do “canal de condução” proveniente das

lacunas. Para situações em que o 𝐸𝐹 é deslocado acima de 𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐, a condutividade é

devida aos elétrons na banda de condução do grafeno, cuja a densidade de carga

pode ser modulada de modo semelhante (VG >>0) (Figura 6 (b))28.

Desse modo, como demonstrado na Figura 5 e 6, os GraFETs exibem uma

característica de transferência ambipolar, exibindo um “canal de condução” tanto do

tipo p (condução por lacunas) em VGS negativos, quanto um canal do tipo n (condução

por elétrons) em VGS positivos, sendo que nenhuma corrente igual a zero é observada

nos GraFETs. A corrente de Ids no GraFET, tanto para a condução por lacunas quanto

por elétrons é descrita pela equação 129,30:

𝐼𝑑𝑠 = 𝑊

𝐿𝜇𝐶𝑖|𝑉𝐺 − 𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐| 𝑉𝑑𝑠 para |𝑉𝐺 − 𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐| ≫ |𝑉𝑑𝑠| Equação 1

Onde W e L são respectivamente a largura e comprimento do canal, 𝜇 é a

mobilidade dos portadores de carga do grafeno (elétrons e lacunas) e 𝐶𝑖 a

capacitância interfacial, ou conhecida também como capacitância da região de gate

do transistor.

Assim, o valores de 𝐼𝑑𝑠 desenvolvidos pelos GraFETs, estão diretamente

relacionados principalmente com os valores de 𝜇 e 𝐶𝑖, que nos GraFETs apresentam

valores superiores aos FETs convencionais. Para o melhor compreendimento de

como a 𝐶𝑖 é descrita nos dispositivos GraFETs e obter uma descrição quantitativa de

38


como o deslocamento do nível de Fermi modula a condutividade nestes dispositivos,

a interface entre o grafeno e a solução eletrolítica deve ser explorada em maiores

detalhes. Para isso, uma breve introdução sobre o modelo tradicional da dupla

camada elétrica será introduzida e em seguida será feita uma abordagem de como

esta é formada na interface grafeno/solução eletrolítica.

1.3.1. A Dupla Camada Elétrica – Modelo Tradicional

A dupla camada elétrica (DCE) pode ser definida como um conjunto de

partículas carregadas e/ou dipolos orientados que existem na interface de todo

material31. O primeiro modelo empregado para descrever a estrutura física da DCE foi

proposto por Helmholtz em 1853. Este corresponde ao modelo de um capacitor de

placas paralelas, sendo este composto pela superfície de um eletrodo metálico, que

quando inserido em solução, provoca o alinhamento de uma única camada de contra-

íons presentes na solução à uma distância 𝒹 da superfície eletródica, de modo a

neutralizar as cargas deste 32, podendo ser descrito pela equação 2:

𝐶 = ℰℰ0𝐴𝑖

𝒹 Equação 2

Onde ℰ é a constante dielétrica adimensional do meio e ℰ0 a constante dielétrica no

vácuo e 𝐴𝑖 área interfacial.

Como demonstrado na equação 2, o modelo de Helmholtz era falho em

alguns aspectos, como o fato de que a capacitância da DCE era independente do

potencial aplicado no eletrodo. Dessa forma, o modelo mais aceito e empregado é o

de Bockris, Devanathan e Muller, de 1963 32, conforme exemplificado na Figura 7.

39


Figura 7. Representação esquemática da dupla camada elétrica. Figura adaptada da

referência33

A camada interna (próxima a superfície do eletrodo) é conhecida como

plano interno de Helmholtz ((IHP) do inglês, Inner Helmholtz Plane). Esta contém

moléculas do solvente e certos íons adsorvidos (que não são hidratados em soluções

aquosas). A próxima camada, denominada plano externo de Helmholtz ((OHP) do

inglês, Outer Helmholtz Plane), reflete o plano imaginário que passa através do centro

dos íons solvatados em sua maior aproximação à superfície. Os íons solvatados são

adsorvidos de forma não específica e são atraídos até a superfície por forças

eletrostáticas de longo alcance. O IHP e OHP representam uma camada compacta,

sendo que esta camada compacta de cargas é fortemente dependente da superfície

do eletrodo31,32.

A camada externa, além da camada compacta (IHP e OHP), é denominada

de camada difusa. Esta é uma região tridimensional de íons dispersos, que se estende

desde do OHP até o seio da solução. Esta distribuição de íons reflete o contrabalanço

entre as forças de ordenação do campo elétrico e as de desordem, causada pelo

movimento térmico aleatório. O equilíbrio entre estes dois fenômenos opostos, indica

que a concentração das espécies iônicas à uma dada distância da superfície, C(x),

IHP OHP

Eletrólito

Estrututa

normal da

água

Íon

completamente

solvatado

Moléculas

de água

Íons

adsorvidos

40


decai exponencialmente com a razão entre a energia eletrostática (𝑧𝐹𝜙) e a energia

térmica (𝑅𝑇), em acordo com a equação de Boltzmann indicada abaixo31:

C(x)= C(0) exp ((−𝑧𝐹𝜙)/𝑅𝑇) Equação 3

O modelo proposto por Bockris, Devanathan e Muller, explica também a

dependência da capacitância da DCE com o potencial da superfície. O perfil de

potencial da DCE decai linearmente dentro da camada compacta e após esta, na

camada difusa, este decaimento ocorre de modo exponencial. Dependendo da força

iônica da solução, a espessura da DCE pode se estender por mais de 10 nm e atingir

valores de capacitância na ordem de 10-40µF/cm2 31. Desse modo, o comprimento da

DCE, também conhecido como comprimento de Debye (𝜆𝐷), pode ser estimado

através da equação 4, extraída da teoria de Debye-Huckel

𝜆𝐷 =1

√4𝜋𝑙𝐵 ∑ 𝑖𝑐𝑖𝑧2𝑖 Equação 4

Sendo 𝑙𝐵 o comprimento de Bjerrum, que é definido como a distância entre

duas cargas elementares, em que a energia eletrostática começa a ser comparada

em magnitude com a energia térmica, esta distância é de 0,7 nm para a água à

temperatura de 300K34. Já o termo ∑ 𝑖 𝑐𝑖𝑧2

𝑖 é a somatória de todas as espécies iônicas

em solução, de concentração 𝑐𝑖 e valência 𝑧𝑖. Através da análise da equação 4, fica

claro que o aumento da concentração das espécies em solução, ou a presença de

espécies de elevados estados de valência, contribuem para a diminuição do

comprimento de Debye e consequentemente o gradiente de potencial da DCE. Dessa

forma, ao se trabalhar com dispositivos do tipo FET, visando a aplicação em

sensoriamento, é necessário o emprego de soluções com baixos valores de força

iônica, já que fora de 𝜆𝐷, as cargas provenientes das espécies de interesse (analítos)

serão fortemente blindadas (efeito de mascaramento) e o impacto destas em relação

a condutividade do dispositivo FET será mínimo 35.

Os conceitos introduzidos brevemente neste tópico, serão extremamente

relevantes para o melhor compreendimento sobre a estrutura e composição da dupla

camada elétrica formada na interface grafeno/solução, que será abordado a seguir.

41


1.3.2. A Interface Grafeno-Eletrólito

A capacitância interfacial (𝐶𝑖) desenvolvida atráves da interface grafeno-

eletrólito, relaciona a densidade de portadores de carga no grafeno com a voltagem

aplicada entre este e o eletrodo de referência. Porém a 𝐶𝑖 possuiu duas componentes

principais conectadas em série, como exemplificado na Figura 8 (a)36.

Figura 8. (a) Representação esquemática da interface grafeno/eletrólito e do circuito

equivalente exibindo os componentes da capacitância interfacial, capacitância de Helmholtz

(𝐶𝐻) em série com a capacitância quântica (𝐶𝑞) (adaptado da referência36). (b) Modelo

representativo da capacitância interfacial, exibindo as duas componentes,(𝐶𝐻 e 𝐶𝑞)28 (c) (i)

Constante dielétrica efetiva da água próxima de uma superfície hidrofóbica, obtida através de

simulação de dinâmica molecular. (ii) Simulação da densidade dos íons Na+ e Cl- próximo a

superfície do grafeno. A simulação foi obtida considerando uma carga interfacial de 1012

cargas negativas por cm2 em uma solução 100 mmol L-1 de cloreto de sódio e pH 7 e com

nenhuma voltagem aplicada. Adaptado da referência28 .

A primeira componente da 𝐶𝑖 é a capacitância oriunda da DCE, conhecida

também como capacitância de Helmholtz (capacitância eletrostática geométrica) (𝐶𝐻),

42


que depende principalmente da concentração dos íons no eletrólito, como discutido

anteriormente no tópico 1.3.1. A segunda componente surge em materiais de baixa

dimensionalidade (materiais 1D, 2D) e é denominada capacitância quântica (𝐶𝑞) 37,38.

Esta é proporcional à densidade de estados no grafeno38 e representa a variação da

energia no nível de Fermi com o acúmulo de carga no grafeno39,40 e é descrita pelo

modelo proposto por T Fang et al 39, segunda a equação simplificada 5.

𝐶𝑞 = 𝜕𝒬

𝜕𝑉𝑐ℎ= 𝑞2

2

𝜋

𝑞𝑉𝑐ℎ

(ℏ𝓋𝐹)=

2𝑞2

ℏ𝓋𝐹 √𝜋 √𝑛 (𝑞𝑉𝑐ℎ ≫ 𝑘𝑇) Equação 5

Onde 𝒬 é a densidade de carga no “canal” de condução do grafeno, 𝑞 é a carga do

elétron, 𝑉𝑐ℎ, é o potencial eletrostático no “canal”, 𝓋𝐹 ≈ 108 cm s-1 é a velocidade de

Fermi dos portadores de carga no grafeno, 𝑛 é a concentração de portadores de carga

no grafeno e ℏ a constante de Planck reduzida.

A 𝐶𝑞 desenvolvida possui ordem de grandeza similar à 𝐶𝐻, µF cm-2, porém

esta é muito menor próximo ao ponto de neutralidade, devido a baixa densidade de

estados (DOS) próximo a região do ponto de Dirac, limitando assim o valor da 𝐶𝑖,

segundo demostrado na Figura 8 (b)40.

Desde que a capacitância quântica e de Helmholtz são conectadas em

série, a capacitância interfacial (capacitância total) pode ser escrita como29,40:

𝐶𝑖 = (1

𝐶𝐻+

1

𝐶𝑞)

−1

Equação 6

No entanto, algumas ressalvas devem ser feitas quanto à interface grafeno-

solução eletrolítica, tanto em relação à 𝐶𝐻 quanto à 𝐶𝑞. A carga desenvolvida na

superfície do grafeno é facilmente descrita pela indução de lacunas e elétrons livre

nesta. Por outro lado, o tipo e a posição, das cargas no eletrólito requer uma descrição

mais elaborada e foge em alguns aspectos do modelo tradicional da DCE, descrito no

item 1.3.1. Inúmeros tipos de cátions e ânions estão tipicamente presentes e se

movem livremente no eletrólito. As cargas no grafeno e na sua superfície são

compensadas pelos íons presentes no eletrólito, dependendo da valência dos íons e

da carga superficial do grafeno. Devido ao consequente efeito da blindagem de carga

induzido pelos íons do eletrólito, o desequilíbrio entre os íons de cargas opostas irá

43


diminuir profundamente no eletrólito. Em uma primeira aproximação, esta queda pode

ser descrita como uma diminuição exponencial até o seio da solução, de modo

semelhante ao que ocorre na camada difusa no modelo tradicional da DCE, descrito

no item 1.3.1.

Porém, muito próximo da superfície do grafeno, o modelo tradicional da

DCE, que propõe que a concentração dos íons na camada compacta (IHP e OHP)

decai linearmente a partir da superfície do eletrodo até a camada difusa, não se aplica,

já que muito próximo a superfície de materiais de natureza hidrofóbica, como o

grafeno, a estrutura da água em si muda drasticamente41. Como demonstrado por

simulações de dinâmica molecular, a densidade de moléculas de água diminui

bruscamente nestas superfícies, o que é denominado de “gap hidrofóbico” entre a

superfície do sólido e o eletrólito, como demonstrado na Figura 8 ((c (i)). Nesta região,

a constante dielétrica efetiva da água é muito menor do que no seio da solução,

resultando em uma elevada queda de potencial na interface28,38. Isto também afeta a

distribuição de íons bem próximos a superfície do grafeno, como demonstrado na

Figura 8 (c (ii)), que exibe a simulação para a densidade de íons Na+ e Cl- bem próxima

a superfície do grafeno, através do modelo de Poisson-Boltzmann42.

Deste modo, a hidrofobicidade do grafeno deve ser levada em

consideração ao se descrever a capacitância interfacial desenvolvida na interface

grafeno-eletrólito. A partir disso e empregando o modelo estendido de Poisson-

Boltzmann, L. Hess et al28, também simularam como cada componente da 𝐶𝑖 se

desenvolve em função da voltagem aplicada ao grafeno, considerando um “gap

hidrofóbico” de 0,3 nm e uma constante dielétrica estática para a água de 1, conforme

exemplificado na Figura 8 (b), onde é possível ver que distante da região do ponto de

Dirac, a 𝐶𝑖 é dominada pela contribuição da DCE (𝐶𝐻 ).

Com os conceitos introduzidos acima, fica claro como a capacitância

interfacial é estabelecida na interface grafeno/solução e como esta varia em função

do deslocamento da energia do nível de Fermi no grafeno, devido a componente

quântica. Os valores de 𝐶𝑖 desenvolvidos pelos dispositivos GraFETs, estão

totalmente relacionados com a sensibilidade destes dispositivos, conforme discutido

no item 1.3. A seguir serão introduzidas as principais vantagens que os GraFETs

oferecem operando como biossensores, os mecanismos de detecção destes e

exemplos de aplicação.

44


1.4. GraFETs : Por Quê Utilizá-los Como Biossensores?

Devido as suas propriedades elétricas extraordinárias, discutidas

previamente na sessão 1.1, o grafeno vem possibilitando o seu emprego na

construção de sensores extremamente sensíveis, principalmente os do tipo FET.

Os GraFETs podem operar em meio de soluções eletrolíticas em contato

direto com os analítos, o que é extremamente significativo para a detecção de

inúmeras moléculas de relevância biológica e além disso, estes podem ser

empregados para o monitoramento in situ de produtos formados durante reações em

soluções aquosas.

A elevada sensibilidade elétrica de sensores do tipo GraFETs está

relacionada com uma série de fatores, sendo os principais listados a seguir.

Primeiramente, um sensor do tipo FET, pode atuar tanto como sensor, mas

também como um amplificador. Desse modo, uma pequena variação de voltagem

pode induzir a uma resposta pronunciada de corrente no “canal” de condução, devido

à função amplificadora inerente destes dispositivos 43,44.

Em segundo lugar, os portadores de carga no grafeno apresentam valores

de mobilidade extremamente elevadas em relação aos semicondutores

convencionais, como discutido anteriormente no item 1.1. Desse modo, os GraFETs

apresentam valores de transcondutância (gm) (modulação da corrente de Ids induzida

por uma pequena variação em Vg) muito mais elevados em comparação com os outros

tipos de FETs, que é um fator importante para a amplificação de sinal nestes

dispositivos44.

Os GraFETs apresentam também valores de capacitância interfacial

elevados, da ordem de µF cm-2, o que garante a possibilidade destes dispositivos

operar em baixas voltagens operacionais (Vds) (conforme demonstrado pela equação

1), normalmente menores do que 500 mV 29. Assim, os GraFETs são muito mais

sensíveis a pequenas alterações de potencial induzidas pela interação de analítos

com a superfície do grafeno. Além disso, o fato de cada átomo de carbono no grafeno

estar exposto à superfície, faz com que a sua sensibilidade elétrica em relação a

qualquer evento biológico de reconhecimento, como por exemplo, interações

antígeno-anticorpo, ou mesmo adsorção de biomoléculas, seja extremamente

elevada, tal que, pequenas concentrações destas espécies possam ser detectadas.

Os GraFETs podem ser facilmente miniaturizados sem a diminuição do desempenho

45


do dispositivo, isto porque a corrente no “canal” (Ids) é proporcional a razão entre a

largura (W) e o comprimento (L) do canal, em vez de do tamanho real do dispositivo.

Desse modo, os GraFETs são dispositivos promissores para o desenvolvimento de

micro-matrizes de dispositivos para a detecção simultânea ou múltipla (do inglês,

multiplex) de espécies de interesse43. Além disso, a miniaturização destes dispositivos

acarreta no uso de pequenos volumes de amostras (dezenas de µL), sendo esta uma

característica ideal para a análise de amostras biológicas.

Além de toda a sensibilidade elétrica exibida por estes dispositivos, o fato

do grafeno apresentar biocompatibilidade45, vêm possibilitando o uso destes

dispositivos na análise de células46 e atividade elétrica das mesmas 47 e o

desenvolvimento de sensores implantáveis 48,49, graças também à sua elevada

flexibilidade. A flexibilidade do grafeno e sua resistência mecânica, também o torna

um material ideal para o desenvolvimento de GraFETs em substratos plásticos

flexíveis, visando a fabricação de sensores descartáveis de baixo custo.

1.5. Mecanismo de Detecção nos GraFETs

A literatura tem reportado diferentes tipos de mecanismos para os GraFETs

atuando como sensores químicos e biossensores50-53. Em geral, a interação dos

analítos de interesse com a superfície do grafeno pode alterar um ou mais parâmetros

da Equação 1, a qual foi descrita anteriormente, que descreve a corrente desenvolvida

entre o eletrodo de fonte e dreno.

Os biossensores GraFETs, assim como os biossensores Transistores

Orgânicos de Efeito de Campo com Eletrólito no Gate (EGOFETs) (do inglês,

Electrolyte-Gated Organic Field-Effect Transistors) podem operar baseado no

princípio da alteração da queda de potencial através da interface eletrodo de porta

(Ag/AgCl)/eletrólito e/ou eletrólito/canal de condução (grafeno), sob o efeito de

analítos 44. Assim, dependendo do número de espécies químicas e biológicas na

superfície do grafeno, a corrente elétrica medida, entre o eletrodo de fonte e dreno,

sofrerá uma variação proporcional a variação de potencial na folha de grafeno26. Estas

variações de corrente ou potencial (deslocamento de 𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐 na curva de transferência

do GraFET) podem então ser usadas como parâmetros para monitorar a concentração

de um determinado analito.

46


Porém, a detecção nos GraFETs pode ser monitorada também através de

outros mecanismos, como efeito de dopagem, espalhamento dos portadores de carga

e mudanças no ambiente dielétrico local.

A dopagem que pode ser empregada como um mecanismo de detecção

nos GraFETs está relacionada com o efeito de dopagem induzido por moléculas,

conhecido como dopagem molecular54-56. Em semicondutores em geral, o termo

dopagem está relacionado com a incorporação de outros tipos de átomos na rede

cristalina do material, que acabam introduzindo lacunas ou elétrons de condução extra

neste. No caso do grafeno, entretanto, este processo resulta na introdução de defeitos

na rede. Porém a dopagem também pode ser realizada através da transferência de

carga de moléculas de natureza dopante situadas na superfície dos materiais, neste

caso, do grafeno 55-57. Esta situação ocorre principalmente para moléculas do tipo

camada aberta (do inglês, open-shell) que possuem orbitais de valência parcialmente

ocupados, ou seja, com elétrons desemparelhados57. Assim, os estados ocupados e

desocupados pelos elétrons da molécula dopante são separados por uma energia de

troca de Hund da ordem de 1eV, desse modo, há sempre níveis moleculares nas

proximidades do ponto de Dirac do grafeno. Se o nível do orbital molecular ocupado

de mais alta energia ((HOMO) do inglês, highest occupied molecular orbital) possuir

energia mais elevada do que a do nível de Dirac, um elétron será transferido da

molécula para o grafeno, induzindo uma dopagem do tipo n. Mas se o nível do orbital

molecular desocupado de menor energia ((LUMO) do inglês, lowest unoccupied

molecular orbital) estiver abaixo do ponto de Dirac, um elétron será transferido do

grafeno para a molécula, gerando uma dopagem do tipo p 57. Dessa forma, nos

GraFETs, é possível utilizar os efeitos de dopagem (transferência de carga direta entre

os analítos adsorvidos e o grafeno) para o monitoramento da espécie de interesse.

Muitas moléculas, particularmente, as que possuem anéis aromáticos, podem interagir

fortemente com o grafeno56. Tais interações fortes amplificam o efeito de dopagem,

monitorado através de mudanças na voltagem do ponto de Dirac e também alteração

na condutância do “canal” e consequentemente, permitem uma detecção elétrica

extremamente sensível 54,56. Esse efeito também é observado através da adsorção

de proteínas sobre o grafeno e já elucidado em FETs a base de nanotubos de

carbono58.

O efeito de espalhamento é outro mecanismo de detecção nos GraFETs

que pode ser explorado59. Moléculas que se adsorvem na superfície do grafeno

47


podem causar o espalhamento dos portadores de carga (elétrons e lacunas) e

consequentemente diminuir a mobilidade destes, e desse modo, a condutância60,61.

Contrariamente, alguns analítos podem adsorver na superfície do grafeno, e diminuir

o efeito de espalhamento causado pelo substrato de suporte, resultando em um

aumento na condutância do grafeno61.

Alterações locais no ambiente dielétrico local podem também ser usadas

como um parâmetro de respostas nos GraFETs. Por exemplo, a ligação de

biomoléculas eletricamente carregadas com a superfície do grafeno pode alterar a

constante dielétrica local ou mesmo a força iônica, que por sua vez, está intimamente

relacionada com a modulação da 𝐶𝑖, e consequentemente à condutância do grafeno29.

Em alguns casos a detecção é determinada por um mecanismo dominante,

porém em outros, esta resulta da combinação de vários mecanismos. Desse modo,

uma análise criteriosa de todos os parâmetros descritos acima deve ser realizada,

para permitir uma interpretação mais acurada do mecanismo de resposta do sensor.

Por último, temos que ressaltar que os biossensores do tipo GraFETs não

apresentam seletividade. Assim, está só será alcançada através da imobilização de

agentes de bioreconhecimento específicos, como enzimas, anticorpos, aptâmeros, ou

mesmo complexos metálicos, na superfície do grafeno.

A seguir serão apresentados alguns exemplos de como os GraFETs podem

atuar como sensores e biossensores altamente sensíveis.

1.6. GraFETs Aplicados Como (Bio)Sensores

Em 2008 P. Ang et al 62 demonstraram pela primeira vez o uso de um

GraFET como um sensor para pH e comprovaram que a dupla camada elétrica

estabelecida na interface grafeno/eletrólito é sensível a adsorção de íons OH- e H+.

Este trabalho abriu um leque de possibilidades para o desenvolvimento de sensores

visando à detecção de espécies mais complexas, como por exemplo: proteínas,

interações do tipo antígenos/anticorpos, bactérias, eventos de hibridização de DNA,

células, entre outros 46,51,63-67. Estes dispositivos se mostraram capazes de realizar

detecções em baixíssimas concentrações, na ordem de ng - pg/mL, isto devido a

elevada sensibilidade do grafeno a qualquer evento biológico de reconhecimento em

sua superfície, como por exemplo, interações antígeno-anticorpo, ou mesmo adsorção

48


de biomoléculas. Desse modo, a aplicação dos GraFETs na área de

biossensoriamento tem se tornado extremamente promissora.

A Tabela 1 exibe uma revisão dos principais trabalhos na literatura onde os

GraFETs foram empregados na detecção sensível de diversas espécies de interesse

biológico.

Uma estratégia recente que vêm sendo empregada para tentar alcançar

uma sensibilidade ainda maior nos dispositivos GraFETs é a incorporação de

nanopartículas nestes. Assim, na próxima sessão será realizada uma breve discussão

e alguns exemplos serão levantados no sentido de buscar o entendimento de como

esses nanomateriais 0 D, podem conferir propriedades extras ao grafeno.

49


Tabela 1. Exemplos de GraFETs aplicados como sensores e biossensores.

Tipo do Sensor

GraFET Analito

Tipo de Grafeno

Empregado

Limite de Detecção ou

Faixa Linear

Referência,

Ano

Sensor de pH H3O+, OH- Grafeno epitaxial 99 mV/pH, pH 14,0 - 2,0 62, 2008

H3O+, OH- Grafeno esfoliado

mecanicamente

25 mV/pH, pH 4,0 - 8,2 65, 2009

H3O+, OH- Grafeno CVD 0-6mV/pH 68, 2011

Hibridização de DNA DNA Grafeno CVD 10x10-12 mol L-1 63, 2010

DNA Óxido de Grafeno

Reduzido (RGO)

2,4x10-9 mol L-1 69,2012

DNA Grafeno CVD 1x10-15 – 100 x10-12 mol L-1 70, 2015

Sensor de Glicose Glicose Grafeno CVD 3,3 – 10,9 x10-3 mol L-1 71, 2012

Glicose Grafeno CVD 0,5x10-6 – 1x10-3 mol L-1 64, 2015

50


Sensor de Proteína BSA Grafeno esfoliado

mecanicamente

0,3x10-9 mol L-1 65,2009

Biomarcador de câncer de

próstata (PSA)

Grafeno obtido via

expansão térmica

0,1 – 100 g mL-1 67, 2010

Imunoglobulina G RGO 0,2x10-9 g mL-1 66, 2011

Biomarcador trombina

(doenças cardiovasculares)

Grafeno CVD 30 – 300 x10-9 mol mL-1 72, 2013

Biomarcador Tuberculose

(IFN-γ)

Grafeno CVD 83 x10-12 mol mL-1 73, 2015

Sensor de Dopamina Dopamina RGO 1-60x10-3 mol L-1 74, 2010

Sensor de Bactéria Escherichia coli RGO 10 ufc mL -1 * 51,2011

Sensor de Células Hemácias infectadas com

malária

Grafeno CVD Até uma única célula 46, 2011

*ufc mL-1 = unidades formadoras de colônia por mL.

51


1.7. Efeito da incorporação de Nanopartículas Metálicas em

GraFETs

Nos últimos cinco anos, vêm sendo reportado na literatura que as

propriedades de sensores a base de grafeno podem ser potencializadas com a

incorporação de nanopartículas (metálicas, semicondutoras ou de óxidos) a estes,

formando assim, nanomateriais híbridos do tipo grafeno-nanopartículas75-77. Estas

nanoestruturas híbridas são particularmente interessantes não só por exibirem as

propriedades individuais das nanopartículas e do grafeno, mas também por exibir

propriedades sinérgicas adicionais, contribuindo assim para o aumento da

sensibilidade, amplificação do sinal de resposta e até estabilidade dos

biossensores75,76.

Visando a aplicação em biossensores do tipo GraFETs, geralmente os

nanomateriais híbridos grafeno-nanopartículas são preparados através da

imobilização das nanopartículas sobre a superfície do grafeno, seja através do

crescimento in situ destas sobre a folha, ou mesmo o preparo destas em uma primeira

etapa, seguido da imobilização covalente ou não destas sobre a superfície do

grafeno75.

As nanopartículas mais empregadas em biossensores do tipo GraFETs,

são as nanopartículas metálicas de metais de transição78,79. V. Tjoa et al80 demonstrou

que a imobilização de nanopartículas de Au e Ag sobre a superfície do grafeno

influencia no comportamento de transferência de carga do grafeno através da

modificação da estrutura eletrônica local80. As nanopartículas de metais de transição

exibem ainda uma elevada biocompatiblidade81,82, o que propicia que os elementos

receptores dos biossensores, como anticorpos, aptâmeros, enzimas e/ou fitas de

DNA, sejam facilmente imobilizados sobre estas, preservando assim as propriedades

elétricas do grafeno. Além disso, a imobilização das nanopartículas sobre o grafeno

aumenta a área superficial, fazendo com que mais espécies receptoras sejam ligadas

ao grafeno, resultando assim em uma amplificação do sinal de resposta dos

biossensores.

O aumento na sensibilidade dos biossensores do tipo GraFETs após a

imobilização de nanopartículas de metais de transição está relacionado também com

o aumento da capacitância interfacial destes dispositivos, devido o acoplamento

http://pubs.rsc.org/en/results?searchtext=Author%3AVerawati%20Tjoa

52


capacitivo entre as nanopartículas e o grafeno, sendo que este mesmo efeito foi

encontrado também por Lee et al83, em transistor de efeito de campo orgânicos a base

de pentaceno modificados com nanopartículas de ouro83.

No ano de 2010, Chen et al77, reportaram pela primeira vez o emprego de

um nanomaterial híbrido de óxido de grafeno reduzido termicamente e decorado com

nanopartículas de Au, para o desenvolvimento de um biossensor do tipo FET para a

detecção de proteínas77. Para isso os autores utilizaram nanopartículas de Au

(disponíveis comercialmente) com 20 nm de diâmetro, que já são covalentemente

conjugadas à Anti-Imunoglobulina G (Anti-IgG) e através da técnica de

eletropulverização estas foram imobilizadas sobre a superfície das folhas de RGO,

conforme exibido na micrografia da Figura 9 (a). Com esta configuração (Figura 9 (b)),

o biossensor se mostrou sensível a detecção de até 13 pmol L-1 da proteína IgG, que

está entre os menores limites de detecção quando comparado com outros

biossensores do tipo FET a base de grafeno ouro ou nanotubos de carbono77.

Figura 9. (a) Micrografia de MEV da superfície da folha de RGO decorada com as

nanopartículas de Au conjugadas com a proteína Anti-IgG. (b) Representação esquemática

do Biossensor FET a base do nanomaterial híbrido RGO –Nanopartículas de Au. Adaptado

da referência77.

O trabalho pioneiro de Chen et al77 inspirou também a aplicação dos

nanomateriais híbridos grafeno-nanopartículas no desenvolvimento de outros

biossensores FETs altamente sensíveis, para a detecção principalmente de proteínas

e eventos de hibridização de DNA69,84.

Nesse sentido, os sensores do tipo GraFETs e GraFETs-Nanopartículas

metálicas se mostram extremamente sensíveis para a detecção de espécies em

baixíssimas concentrações, podendo ser até mesmo utilizados para o diagnóstico

precoce de doenças.

53


1.8. Diagnóstico do Câncer de Mama

O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e

o mais comum entre as mulheres, respondendo por 22% de novos casos a cada ano85.

De acordo com dados do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva

(INCA), no Brasil, somente no ano de 2011, 13225 mulheres faleceram vítimas da

doença 85. O método de diagnóstico mais empregado ainda é o exame clínico das

mamas, onde um profissional da saúde especializado (médico ou enfermeira) pode

detectar através do toque tumores de até 1 cm de diâmetro, se este se encontra

localizado superficialmente. Já a mamografia (radiografia da mama) permite a

detecção um pouco mais precoce do câncer, ao identificar lesões em fases iniciais,

com dimensões de alguns milímetros (41,7% de eficácia na identificação de lesões de

até 5 mm) porém, quando o tumor já se encontra em estágio de desenvolvimento86.

Assim, novas estratégias para o diagnóstico precoce do câncer de mama necessitam

ser desenvolvidas e uma alternativa promissora é a detecção dos biomarcadores de

câncer de mama.

O Instituto Nacional de Câncer dos EUA, define como biomarcadores

moléculas biológicas encontradas no sangue, em outros fluidos corporais e ou tecidos,

que tem os seus níveis relacionados de forma específica e sensível à uma condição

de doença. Assim os biomarcadores são ferramentas valiosas tanto para o diagnóstico

precoce como para avaliação do tratamento de doenças87. Neste cenário, o receptor

do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), aparece como um potencial

biomarcador para a detecção precoce do câncer de mama88.

O HER-2 é uma glicoproteína que é expressada em excesso no soro de

15-25% das pacientes que exibem o estágio inicial do câncer de mama e em 45,6 %

que se encontram em estágio de metástase89,90. A sua expressão tem sido associada

a maior agressividade biológica do tumor e a resistência a alguns tipos de tratamento.

O HER-2 codifica uma proteína de membrana das células tumorais que faz com que

estas se desenvolvam mais rápido e aumentem a sua duplicação, tornando os

tumores mais agressivos88,91, conforme exemplificado na Figura 10.

54


Figura 10. Representação esquemática do processo de superexpressão da glicoproteína

HER- 2 e consequentemente aumento das células cancerígenas92.

Estudos certificados pela Agência de Administração de Alimentos e

Medicamentos dos Estados Unidos (FDA), comprovam que quando os pacientes se

encontram nos estágios de desenvolvimento do câncer de mama I-III (o número de

células cancerosas se torna mais extenso, dando origem a tumores que vão

progressivamente aumentando de tamanho) e IV (metástase), estes exibem níveis

de HER-2 em seus soros sanguíneos bem superiores a 15 ng/mL89,93. Já os pacientes

saudáveis apresentam níveis de HER-2 em seus soros inferiores a 15 ng/mL,

conforme estudo comprovado também por S. Imuto et al 94. Os autores avaliaram por

um período de vários meses os níveis de HER-2 em mulheres saudáveis no período

pré e pós-menopausa, os dados de uma amostra representativa (12,35, 11,63, 11,49,

12,76, 11,85, e 12,42 ng mL-1) mostrou que os valores de HER-2 encontrados nas

amostras de soro foram relativamente constantes para um dado indivíduo, com uma

variação de apenas 6% ao longo de um período de vários meses94,95.

O diagnóstico do câncer de mama no estágio 0 (a quantidade de células

cancerosas é relativamente pequena e concentrada apenas no órgão no qual ele se

desenvolveu), onde não se têm ainda a formação de um tumor ou sintomas físicos de

desenvolvimento da doença é a situação ideal. Neste sentido, vários estudos indicam

que o monitoramento dos níveis de HER-2, nesse caso o aumento, pode proporcionar

um diagnóstico de até 2 à 9 meses antes que os sinais clínicos reais apareçam89.

Fehm et al relatou que 27% dos pacientes com câncer de mama tiveram seus níveis

de HER-2 gradativamente elevados seis meses antes que os sinais clínicos

aparecessem ou mesmo que o diagnóstico fosse feito. Sendo que este número

55


aumentou ainda mais, representando 50% dos pacientes, com aumentos nos níveis

de HER-2 três meses antes do diagnóstico clínico96 . Isola et al relatou que 37% dos

pacientes poderiam ter sido diagnosticados precocemente com base no aumento dos

níveis de HER-2 6 meses antes do diagnóstico clínico real97. Nesse sentido o

monitoramento dos níveis de HER-2 no soro sanguíneo de mulheres saudáveis,

porém que fazem parte do grupo de risco98, na faixa de 12-15 ng mL-1 ou até mesmo

acima do valor limite, é uma ferramenta poderosa tanto para o diagnóstico precoce,

quanto para avaliação do tratamento da doença.

Os métodos mais comumente empregados para a detecção de HER-2 são

o ELISA (do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) e a imuno-

histoquímica99,100. Ambos os métodos se referem ao processo de localizar antígenos

(os biomarcadores), explorando o princípio da ligação específica de anticorpos à

antígenos, onde a visualização da interação antígeno-anticorpo se dá através da

conjugação do anticorpo com enzimas , como a peroxidase, que pode catalisar uma

reação que produzirá cor. No caso do ELISA o teste é realizado diretamente na

solução do soro sanguíneo e a adição de substrato ao complexo enzima-anticorpo-

antígeno que resulta num produto colorido, é lido por um espectrofotômetro. Já no

caso da imunohistoquímica os biomarcadores (antígenos) são localizados diretamente

nos tecidos101. Ambos os métodos possuem uma série de limitações técnicas como

baixa sensibilidade e especificidade, elevado tempo de análise e no caso da

imunohistoquímica, subjetividade no entendimento da imagem obtida99 .

Nesse contexto, o desenvolvimento de novas ferramentas analíticas para o

diagnóstico precoce e monitoramento do tratamento do câncer de mama, através da

análise altamente sensível e específica do biomarcador HER-2, principalmente na

faixa de ng mL-1, que produzam respostas rápidas, de fácil manuseio, que não utilizem

de marcadores e sem a necessidade de operadores altamente qualificados

necessitam ser desenvolvidas.

56

Silva, C. C. C OBJETIVOS Tese de Doutorado

2. CAPÍTULO II - OBJETIVOS

Baseado nos conceitos e fundamentos apresentados no capítulo anterior,

o presente trabalho tem como objetivo central o desenvolvimento em grande escala

de biossensores miniaturizados do tipo GraFETs para a detecção ultra-sensível e

seletiva de biomarcadores de câncer de mama HER-2.

Para alcançar o objetivo central desta tese, foram estipuladas as seguintes

metas:

A síntese e transferência de uma monocamada de grafeno CVD para

lâminas de Si/SiO2 de 4 polegadas seguida da fabricação dos GraFETs em escala de

lâmina e a caracterização elétricas destes.

O desenvolvimento de um novo método de imobilização de

nanopartículas de ouro altamente dispersas sobre o grafeno CVD.

A imobilização orientada dos anticorpos anti-HER-2 sobre a região de

gate dos GraFETs e GraFETs modificados com nanopartículas de Au, seguida da

detecção de biomarcadores de câncer de mama (HER-2).

57

Silva, C. C. C MATERIAIS E MÉTODOS Tese de Doutorado

3. CAPÍTULO III - MATERIAIS E MÉTODOS

Este trabalho foi desenvolvido em colaboração com o grupo de pesquisa

do Prof. Dr. Manish Chhowalla, no departamento de Engenharia de Materiais da

Rutgers University, NJ, EUA. Toda a parte de fabricação dos dispositivos e

caracterização elétrica foi realizada em sala limpa, do Departamento de Engenharia

Elétrica e Computação da Rutgers University e no Centro de Componentes

Semicondutores (CCS) da Unicamp.

3.1. Reagentes e Soluções

Para a fabricação dos dispositivos foram utilizadas lâminas de Si/SiO2

monocristalino tipo p, com diâmetro de 4 polegadas, resistividade 1–10 Ω.cm,

orientação cristalina <100> e com um óxido de silício de 300 nm de espessura que

foram adquiridas através da empresa Polishing Corporation of America (PCA). Folhas

de cobre de 25 µm de espessura e com 99,8% de pureza, ácido nítrico e o ácido

clorídrico foram adquiridos da Alfa Aesar. O Polimetil Metacrilato (PMMA) 6% em

anisol foi adquirido da Micro Chem. O fotoresistes AZ 5214-E e o revelador AZ MIF

300 (livre de metais) foram obtidos da Clariant, Muttenz, CHE. O Hexametildisiloxano

(HMDS), o ácido 1-pirenobutanóico éster succinimídico (PASE), a albumina do soro

bovino (BSA) (peso molecular 66kDa), a etanolamina, o sulfato de cobre (II) (CuSO4),

o borohidreto de sódio, ácido cloroáurico, cloreto de sódio (NaCl), dihidrogenofosfato

de sódio (NaH2PO4), hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), p-mercaptopiridina e

proteína A (produzida a partir da Staphylococcus aureus) foram obtidos da Sigma

Aldrich. Os anticorpos ErbB2/HER-2 monoclonais (obtidos a partir de Imunoglobulinas

IgG2 de ratos) e antígenos recombinantes ErbB2/Her2 (massa molecular de 96,8kDa)

de linhagem celular mieloma (obtida a partir de ratos) foram adquiridos da R&D

System, EUA. O etanol e metanol anidros foram obtidos da Synth. A acetona e o álcool

isopropílico utilizados possuíam grau eletrônico CMOS com pureza equivalente a

99,9999 % e foram obtidos da J.T.Baker.

Todas as soluções aquosas foram preparadas com água deionizada

(Sistema Mili-Q de purificação de água, Millipore Inc., USA) com resistividade maior

que 18 MΩ cm.

58


3.2. Limpeza Orgânica das Lâminas de Si/SiO2

Antes de realizar qualquer processo de modificação ou transferência de

padrões sobre a superfície das lâminas de Si/SiO2 é realizado um processo de limpeza

conhecido como limpeza orgânica. Esta limpeza visa à remoção de possíveis

impurezas orgânicas na superfície das lâminas, auxiliando assim, os posteriores

processos de modificação de suas superfícies.

Primeiramente as lâminas foram submergidas em um recipiente contendo

acetona à 60º C por 10 minutos com agitação constante. Após este período, as

lâminas foram transferidas a outro recipiente contendo álcool isopropílico à 60º C,

onde estas também ficaram imersas por um período de 10 minutos sob agitação

constante. Terminada esta etapa, as lâminas foram lavadas repetidas vezes com água

deionizada e secas com fluxo de N2.

3.3. Fabricação dos GraFETs

3.3.1. Configuração dos Chips Fabricados

Para a fabricação dos dispositivos foi necessário fazer uso da técnica de

fotolitografia102. Desse modo, máscaras de alta resolução a base de quartzo com

camadas de cromo e óxido de cromo, necessitavam ser utilizadas para que fosse

possível a transferência dos padrões de eletrodos e padrões sobre o grafeno. Os três

níveis de máscaras empregadas para a fabricação dos dispositivos desenvolvidos

neste trabalho foram projetadas fazendo uso do software CleWin 4 (WieWeb,

Holanda) e estas foram confeccionadas pela empresa Photonics (EUA). As máscaras

possuíam dimensões de 4 x 4 polegadas e cada máscara continha os padrões para a

fabricação de 49 chips, conforme exemplificado na Figura 11 (a).

59


Figura 11. (a) Layout da máscara empregada na fabricação dos dispositivos exibindo os

padrões para fabricação de 49 chips. (b) Representação esquemática dos padrões de um

chip, exibindo a dimensão total deste e os 64 pares de eletrodos de fonte e dreno organizados

em uma matriz 8 x 8. Ao lado uma imagem ampliada de um par de eletrodos de fonte e dreno.

Fonte

comum

Dreno

individual 20 µm

12 µm

1,01 cm

(b)

(a)

60


Os chips a serem fabricados consistiam em 64 pares de eletrodos de fonte

e dreno, organizados em uma matriz de 8 x 8, com dimensão total de 1,01 cm2. Os

dispositivos eram conectados por uma fonte comum e o acesso aos eletrodos de

dreno ocorria através de contatos metálicos individuais, também conhecidos como

pads de contato. O comprimento e largura do canal entre os eletrodos de fonte e dreno

era de 12 e 20 µm respectivamente. A Figura 11(b) exibe a configuração dos padrões

do chip descrito acima, onde é possível visualizar nesta, 4 matrizes de 16 eletrodos

de fonte e dreno alinhados. Esta configuração nos permite que canais microfluídicos,

confeccionados a base de PDMS (Polidimetilsiloxano), possam ser no futuro

integrados aos dispositivos, por meio de processos de litografia-soft103 e empregados

para a entrega seletiva de soluções aos eletrodos de fonte e dreno, o que possibilita

a imobilização de diferentes tipos de anticorpos específicos aos biomarcadores de

câncer de mama em cada uma das 4 matrizes de eletrodos.

3.3.2. Fotogravação dos Padrões de Eletrodos e Formação dos

Contatos Metálicos

A fim de promover uma melhor adesão entre os eletrodos metálicos e o

substrato de Si/SiO2, optou-se por primeiro transferir os padrões de eletrodos e

depositar o metal, dando origem aos eletrodos de fonte e dreno através do processo

lift-off e depois transferir o grafeno para a superfície da lâmina de Si/SiO2/eletrodos,

como será discutido posteriormente. Assim, primeiramente foram gravados os

padrões de eletrodos de fonte e dreno.

Após a etapa de limpeza orgânica a lâmina Si/SiO2 estava pronta para a

primeira etapa de fotolitografia. Todo o processo de litografia foi desenvolvido dentro

de uma sala limpa classe 100 com luz amarela, devido a sensibilidade do fotoresiste

à luz visível.

Para a transferência dos padrões de eletrodos de fonte e dreno metálicos

foi empregado o primeiro nível de máscara, que continha a configuração ilustrada na

Figura 11 e adotou-se o procedimento exemplificado na Figura 12.

61


Figura 12. Etapas empregadas no processo de obtenção do conjunto de eletrodos de fonte e

dreno dos chips fabricados.

Adotou-se o seguinte procedimento para transferência dos padrões:

primeiramente a lâmina foi aquecida à 110ºC por 5 minutos em uma chapa

aquecedora, para que ocorresse a desumidificação de sua superfície. Em seguida a

lâmina foi levada até um Spin Coater onde se aplicou o HMDS (agente promotor de

62


aderência) e esta foi submetida a uma rotação de 5000 rpm por 40 segundos.

Aguardou-se um período de 10 minutos para a aplicação do fotoresiste AZ 5214 – E

(fotoresiste que contém como composto fotoativo uma mistura de naftoquinonas e

resina Novolak), onde a lâmina também foi submetida a uma rotação de 5000 rpm por

40 segundos para que a espessura da camada de fotoresiste fosse de apenas 1,30

µm. Após este procedimento a lâmina passou por um processo de pré-cura (do inglês

pré-bake) na chapa aquecedora à 100ºC por 1 minuto e 30 s para que ocorresse a

evaporação do solvente e fixação do fotoresiste (Figura 12 (a)). Para a fotogravação,

a lâmina foi alinhada opticamente com a máscara através da fotogravadora Karl Suss

MJB3 (Figura 12 (b)) e em seguida ambas foram colocadas no modo de contato e

exposta a luz UV com comprimento de onda fixo em 385 nm durante 25 segundos

(Figura 12 (c)). Neste processo, o fotoresiste por ser positivo, quando é exposto à luz

UV é sensibilizado, isto é, há um rompimento das ligações químicas nas cadeias

poliméricas do fotoresiste, fazendo com que as cadeias se tornem menores e mais

solúveis. Por fim a lâmina foi submetida ao processo de revelação, onde o fotoresiste

é removido das regiões que foram expostas a luz UV. Para isso utilizou-se como

revelador o AZ MIF 300, onde a lâmina foi imersa num recipiente contendo o revelador

por 12 segundos com agitação constante e posteriormente lavada com água

deionizada e seca com jato de N2 (Figura 12 (d)). Com o término deste processo

verificou-se em um microscópio ótico de luz verde que todo o resiste sensibilizado

havia sido revelado.

Para se obter eletrodos mais resistentes mecanicamente e com baixa

resistividade elétrica, optou-se por utilizar paládio como material de eletrodo. Assim

foram depositados sobre a lâmina de Si/SiO2/fotoresiste um filme metálico contendo

5 nm de Ti e 110 nm de Pd, utilizando uma evaporadora do tipo e-beam (Figura 12

(e)). Logo em seguida, para que ocorresse o processo de lift-off, a lâmina metalizada

foi inserida em um recipiente com acetona fechado por 12 horas (Figura 12 (f-g)). O

processo de lift-off faz com que o fotoresiste que demarca as regiões limites dos

padrões de eletrodos seja removido ao entrar em contato com a acetona, levando com

ele a camada de metal depositada nesta região, assim o metal só ficará aderido nas

regiões onde não havia a camada de fotoresiste. Após o período de 12 horas a lâmina

foi retirada da acetona e realizou-se uma limpeza orgânica para remover qualquer

possível resíduo de fotoresiste aderido em sua superfície.

63


3.3.3. Síntese de Grafeno via Deposição Química em Fase Vapor

(CVD)

O crescimento do grafeno via processo CVD foi realizado nas

dependências do laboratório do Prof. Dr. Manish Chhowalla, no departamento de

Engenharia de Materiais da Rutgers University, NJ, EUA.

Para o crescimento do grafeno via processo CVD, empregou-se como

substrato metálico e catalisador, folhas de cobre com 25 µm de espessura.

Primeiramente a folha de cobre foi inserida no interior de um tubo de quartzo, como

demonstrado na Figura 13 e foi empregado o procedimento otimizado, previamente,

como exemplificado na Figura 14.

Figura 13. Sistema empregado durante o crescimento do grafeno via processo CVD.

Composto de um forno, que fornece aquecimento constante de até 1000ºC, um tubo de

quartzo, uma bomba de vácuo conectada ao tubo de quartzo, e as linhas de gases e

controladores de fluxo. Na ampliação é mostrada a folha de cobre inserida dentro do tubo de

quartzo.

64


Figura 14. Diagrama exibindo o fluxo e composição dos gases, o tempo e a temperatura

empregados durante o processo de crescimento do grafeno via CVD.

Todo o processo de crescimento do grafeno foi realizado em vácuo (25

mTorr) e em atmosfera de Ar/ H2, com a razão 95%/5% a um fluxo de 100 sccm.

Inicialmente o forno foi aquecido à 1000 ºC (Etapa I) e quando atingida esta

temperatura a folha de cobre foi submetida a uma etapa de recozimento (Etapa II) por

30 minutos, esta etapa visa a redução do óxido de cobre (CuO e Cu2O) nativo na

superfície da folha de cobre, responsável por reduzir a atividade catalítica do cobre.

Além disso a fase de recozimento antes da etapa de crescimento também é importante

para o aumento do tamanho dos grãos de Cu e reorganização da morfologia da

superfície (introdução de caminhos atômicos e eliminação de defeitos estruturais na

superfície) para facilitar o crescimento da folha de grafeno e obter um material de

qualidade superior, conforme discutido anteriormente na sessão 1.2. Após esta etapa,

a folha de cobre é submetida a uma atmosfera de metano (CH4) a um fluxo de 35,5

sccm por 1 hora (Etapa III), para que o crescimento da monocamada de grafeno

ocorresse via deposição e difusão dos átomos de carbono. Logo após este período o

fluxo de CH4 foi interrompido e iniciou-se o processo de resfriamento do tubo de

quartzo (etapa IV), sendo que quando se atingiu a temperatura de 30 ºC o fluxo de

Ar/H2 foi interrompido assim como o vácuo e a folha de cobre foi retirada do interior

do tubo de quartzo e estocada sob vácuo.

1000

T(ºC)

30 Tempo (min)60

CH4

35.5sccm

H2/Ar

99sccm

(I) (II) (III) (IV)

65


3.3.4. Processo de Transferência do Grafeno para Substratos de

Si/ SiO2

Após o processo de crescimento do grafeno sobre a folha de cobre este

necessita ser removido e transferido para o substrato desejado, para isso utilizou-se

um procedimento baseado no trabalho de Wan et al104.

Cada etapa do procedimento empregado está exemplificada na Figura 15

(a-j).

Figura 15. Diagrama esquemático exemplificando o processo de transferência do grafeno

CVD para o substrato desejado. Adaptado da referência104.

Primeiramente a folha de cobre contendo o grafeno teve uma das suas

superfícies recobertas com o eletroresiste PMMA, no intuito de se proteger o grafeno

durante o processo de corrosão da folha de cobre. Assim o PMMA foi aplicado sobre

a folha de Cu/grafeno fazendo uso de um Spin Coater a uma rotação de 4000 rpm por

40 segundos (Figura 15 (a)) para que a espessura da camada de PMMA fosse de

Transferido

Utilizando um

vidro de relógio

Grafeno CVD /folha

de Cu

Substrato

Corrosão da

folha de Cu

Após 4 h

Transferido

Reagente MarblePré-cura a 170ºC

por 10 min.

Spin Coater

4000 rpm, 40 s

Transferido

Secagem a

temperatura

ambiente por 1h

H2O DI

20 vezes

(g) (h)Acetona

Acetona 4

vezes, 1 h cada

Transferido

Limpeza

orgânica

Seco com N2

Remoção do

PMMA

Grafeno/Substrato

66


apenas 300 nm. Após este procedimento a folha de Cu/grafeno passou por um

processo de pré-cura na chapa aquecedora à 170ºC por 10 minutos para que

ocorresse a evaporação do solvente e fixação do PMMA ao grafeno (Figura 15 (b)).

Como usualmente durante o processo CVD o grafeno cresce em ambos os lados da

folha de cobre, para se evitar a transferência de uma bicamada de grafeno, a folha de

Cu/grafeno/PMMA foi suspensa sobre uma solução aquosa 1:3 em ácido nítrico por 5

minutos para que ocorresse a remoção do grafeno do lado da folha de cobre exposto

a solução ácida. Logo após, esta foi transferida para uma placa de Petri contendo uma

solução do reagente de Marble, que é composto de uma solução 620 mmol L-1 de

CuSO4 em 1:1 H2O/HCl, para que ocorresse a completa corrosão e dissolução da

folha de cobre (Figura 15 (c)). Após 4 horas, todo o cobre foi eliminado do

grafeno/PMMA e assim, este foi transferido para uma placa de Petri contendo água

deionizada (Figura 15 (d)). Este processo de limpeza do grafeno/PMMA foi repetido

20 vezes para que ocorresse a completa remoção de resíduos de cobre (íons Cu2+

provenientes da solução corrosiva); em seguida o grafeno/PMMA foi transferido para

substratos de Si/SiO2 e Si/SiO2/eletrodos (Figura 15 (e)) onde aguardou-se as

amostras secarem a temperatura ambiente, em torno de 1 hora (Figura 15 (f)). As

etapas do processo de transferência do grafeno crescido via CVD para o substrato de

Si/SiO2, Figuras 15 (a-f), foram registradas e podem ser visualizadas no vídeo

acessado através do QR-Code abaixo1*. Com o término desta etapa, finalmente o

PMMA foi removido da superfície do grafeno; para isto os substratos de Si/SiO2 e

Si/SiO2/eletrodos contendo o grafeno/PMMA em sua superfície foram imersos em

placas de Petri contendo acetona, por 4 horas, sendo que a troca completa deste

solvente era realizada de 1 em 1 hora (Figura 15 (g)). A acetona promove a dissolução

e remoção do PMMA da superfície do grafeno. Após todo este processo foi realizado

novamente uma limpeza orgânica (Figura 15 (h)).

Com o intuito de se remover ainda mais qualquer resíduo de PMMA sobre

a superfície do grafeno CVD, foi realizado um processo de recozimento segundo o

procedimento empregado por van der Zande et al 105, onde as amostras foram

1

67


submetidas a um aquecimento de 300 ºC, em um ambiente de ultra - alto vácuo (10 -8

Torr) por 10 minutos. Assim o grafeno obtido via CVD estava pronto para ser

caracterizado e empregado na fabricação dos FETs.

3.4. Síntese e Imobilização de Nanopartículas de Ouro sobre o

Grafeno CVD

Com o intuito de se obter nanopartículas de ouro livre de agentes orgânicos

estabilizantes, utilizou-se o método de preparação de nanopartículas de ouro descrito

por Martin e colaboradores106, que se baseia na redução instantânea e direta de íons

Au3+ provenientes do ácido cloroáurico (HAuCl4) utilizando-se borohidreto de sódio

(NaBH4). Desse modo, 1,5 mL de uma solução aquosa 1 mmol L-1 de NaBH4 foram

adicionadas sob agitação vigorosa à 1 mL de uma solução 1 mmol L-1 HAuCl4, onde

imediatamente a solução desenvolveu a coloração vermelha e a agitação foi mantida

por mais 1 minuto e utilizadas em seguida.

Para realizar a imobilização de elevada densidade de nanopartículas de Au

sobre o grafeno, sem a introdução de defeitos na estrutura deste material, foi proposto

pela primeira vez por este trabalho o uso da p-mercaptopiridina como uma molécula

ponte ideal entre a superfície do grafeno e as nanopartículas de Au. Para isso, as

lâminas de Si/SiO2 contendo o grafeno CVD foram imersas por 24 horas em uma

solução 1mM de p-mercaptopiridina preparada em etanol seco. Após este período

estas foram lavadas com etanol repetidas vezes para a remoção de moléculas não

adsorvidas e secas em nitrogênio. Em seguida, estas lâminas foram inseridas na

solução de nanopartículas (preparada previamente) por 4 horas e posteriormente

lavadas com água deionizada. Experimentos controle também foram realizados, onde

as lâminas contendo o grafeno sem ter passado pelo processo de funcionalização

com a p-mercaptopiridina foram também inseridas na mesma solução de

nanopartículas de ouro e pelo mesmo período de tempo.

68


3.5. Imobilização dos Anticorpos HER-2 nos Dispositivos

GraFETs e GraFETs modificados com Nanopartículas de Au

Visando a imobilização direta dos anticorpos sobre a superfície do grafeno,

empregou-se primeiramente o procedimento desenvolvido por J. Chen et al107, para a

imobilização não-covalente de proteínas sobre as paredes laterais de nanotubos de

carbono e também utilizado por Y. Huang et al 51, em dispositivos do tipo GraFETs.

Neste sentido os GraFETs foram incubados por 2 horas em uma solução 5mmol L-1

de ácido 1-pirenobutanóico éster succinimídico (PASE) em meio de metanol anidro e

lavados com metanol e água deionizada por várias vezes. Em seguida os dispositivos

foram incubados por 12 horas à 4ºC em uma solução de 5 µg/mL de anticorpos

preparados em solução tampão PBS 1mmoL-1 (NaCl 1,5 mmol L-1 e pH 7,4). Após

este período os dispositivos também foram lavados com tampão PBS em excesso.

Após esta etapa os dispositivos foram incubados em uma solução 0,1 mol L-1 de

etanolamina (pH 9) por 1 hora, para desativar os grupos succinimídicos que não se

ligaram aos anticorpos e bloquear as áreas livres de grafeno expostas a solução. Após

a etapa de bloqueio, os dispositivos foram avaliados em relação ao seu potencial para

a detecção do biomarcador HER-2.

A segunda estratégia adotada para a imobilização dos anticorpos sobre o

grafeno foi o emprego da proteína A. Desse modo, os chips contendo os GraFETs

foram incubados em uma solução de 250µg/mL de proteína A em tampão PBS de

concentração 1mmoL-1 (NaCl 1,5 mmol L-1 e pH 7,4) à 4ºC por 12 horas. Após este

período os dispositivos foram lavados também com solução tampão fosfato ((PBS) do

inglês, fosfate buffer saline) 1mmoL-1 (NaCl 1,5 mmol L-1 e pH 7,4) por diversas vezes,

para remover todo e qualquer resíduo de proteína A que não adsorveu ao grafeno.

Em seguida para que ocorresse a imobilização dos anticorpos sobre a proteína A os

dispositivos foram incubados por 6 horas à 4ºC em uma solução de 5 µg/mL de

anticorpos preparados também em solução tampão PBS 1mmoL-1 (NaCl 1,5 mmol L-

1 e pH 7,4). Após este período os dispositivos também foram lavados com tampão

PBS em excesso e posteriormente incubados por 30 minutos e lavados em seguida

com a mesma solução de PBS 1mmol L-1 pH 7,4/ 0,1% de BSA, visando que a proteína

BSA recobrisse qualquer parte de grafeno exposta, evitando assim, interações não

específicas entre os antígenos e a superfície do grafeno. Após todas estas etapas, o

dispositivo estava pronto para realização do imunoensaios. Adotou-se o mesmo

69


procedimento para realizar a imobilização dos anticorpos HER-2 nos dispositivos

GraFETs contendo as nanopartículas de Au.

Após a imobilização dos anticorpos sobre a superfície do grafeno, os

dispositivos GraFETs que não foram empregados de imediato nos imunoensaios

foram estocados em geladeira, à 4º C, em meio de solução tampão PBS, pH 7,4.

3.6. Determinação do Ângulo de Contato

Com o intuito de se investigar se a adsorção da proteína A ocorreu de forma

efetiva sobre a superfície do grafeno CVD transferido para o substrato de Si/SiO2 300

nm de espessura, foram realizadas medidas de ângulo de contato empregando um

equipamento modelo Attension Theta, da Biolin Scientific. As medidas foram

realizadas em relação a gotas de água deionizada (18 MΩ cm de resistividade) com

um volume de 8µL, que foram depositadas através de uma seringa na superfície das

amostras. As imagens de ângulo de contato estático foram registradas 3 segundos

após a deposição das gotas, através de uma câmera CCD (do inglês, charge coupled

device). Uma reta tangente foi ajustada sobre a interface gota-substrato nas imagens

e o ângulo formado entre a reta tangente e a linha de base foi empregado para indicar

o ângulo de contato entre a interface sólido-líquido. Os valores de ângulo de contato

reportados são uma média de 14 a 20 medidas, para o substrato de Si/SiO2, Si/SiO2

– grafeno e Si/SiO2 – grafeno – Proteína A, sendo utilizado os valores de ângulo de

contato médio (da direita e esquerda).

3.7. Caracterizações por Espectroscopia Raman e de

Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS)

As análises por espectroscopia Raman foram conduzidas utilizando um

equipamento Renishaw 1000 equipado com um microscópio confocal com resolução

espectral de 1 cm-1 usando um laser de argônio de 514 nm à 10 mW e tempo de

aquisição de 10 s. Já os espectros de XPS foram obtidos em um espectrômetro da

Thermo Scientific K-Alpha, com uma fonte monocromatizada de Al Kα com resolução

de 0,100 eV e energia de passagem de 50 eV e tamanho de ponto de amostragem de

400 µm. Os espectros de XPS foram deconvoluídos empregando-se o software

Avantage Data System (Thermo Scientific).

70


3.8. Caracterização por Espectrofotometria Uv-Visível

Foram obtidos espectros de absorbância da solução de nanopartículas de

ouro sintetizadas empregando um espectrômetro da Agilent Uv-Vis, modelo 8453 em

cubetas de quartzo.

3.9. Micrografias

As análises de microscopia da superfície das lâminas de Si/SiO2 contendo

os padrões de eletrodos, o grafeno e as nanopartículas de Au foram realizadas

utilizando-se um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo da Zeiss

Sigma, modelo 8100 e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo

de alta resolução da FEI, modelo Inspect. Foram também obtidos espectros de energia

dispersiva de raio X (EDX), das amostras de grafeno modificadas com as

nanopartículas de Au, empregando um detector de deriva de silício (SDD) modelo X-

Max 80 mm2 da Oxford Instruments.

As nanopartículas de Au sintetizadas foram caracterizadas através de

imagens obtidas no microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo de

alta resolução da FEI (Inspect) no modo transmissão (do inglês, scanning transmission

electron microscopy (STEM)), onde as nanopartículas de Au foram depositadas em

grades de Au recobertas com um filme de carbono, obtidas da Ted Pella.

3.10. Caracterização por Microscopia de Força Atômica (AFM)

Foram obtidas imagens topográficas de AFM das amostras de grafeno CVD

antes e após a imobilização das nanopartículas de Au. Para isso utilizou-se um

Microscópio de força atômica da Nanosurf, com um controlador modelo C3000 com

24 bits, com um cabeçote modelo Flex AFM. As imagens foram obtidas através do

modo contato intermitente, empregando-se ponteiras de Si recobertas com uma liga

de Pt/Ir, de 10 nm de espessura, da marca Nanosensors, com constante de força

nominal de 2,8 N/m e frequência de ressonância de 75 kHz. O software empregado

para a aquisição das imagens foi o Nanosurf c3000, versão 3.5.0.29 e para o

tratamento das respectivas imagens o Gwyddion (32 bits).

71


3.11. Caracterização Elétrica

A caracterização elétrica dos dispositivos GraFETs foi realizada utilizando-

se um Semiconductor Characterization System 4200 CV analyzer 590 da Keithley,

equipado a um microscópio óptico de alto desempenho da marca Microzoom II

(Cambridge Instruments) e acoplado à três micromanipuladores modelo 600 (MM),

com pontas de tungstênio. Para as medidas em solução, uma das pontas de

tungstênio foi substituída por um microeletrodo de referência de Ag/AgCl de fabricação

própria como eletrodo de porta. Todas as medidas elétricas foram executadas à 25ºC

e na ausência de luz. Para os ensaios de monitoramento de pH e detecção da proteína

BSA e dos antígenos HER-2, aguardava-se um tempo de 10 minutos antes de se

iniciar as medidas, visando uma maior estabilidade da resposta dos biossensores

GraFETs.

3.11.1. Fabricação do Microeletrodo de Referência de Ag/AgCl

Para a fabricação do microeletrodo de referência de Ag/AgCl, utilizou-se

um potenciostato PGSTAT30 da marca Autolab, equipado com o software GPS e uma

célula eletroquímica composta por três eletrodos, sendo o eletrodo de referência de

Ag/AgCl (KCl 3 mol L-1), o auxiliar um fio de platina helicoidal e o eletrodo de trabalho

um fio de Ag de 500 µm de espessura. Uma solução de ácido clorídrico 1mol L-1 foi

empregada como eletrólito suporte e fonte de íons cloreto. Para promover a oxidação

controlada do fio de Ag, utilizou-se a técnica de cronopotenciometria galvanostática,

onde uma corrente de 50 µA foi aplicada ao fio de Ag por 30 min. Após a formação da

camada de AgCl sobre o fio de Ag, este foi inserido em um microcapilar de vidro

preenchido com solução 3 mol L-1 de KCl. Aguardou-se um período de 24 h para a

completa estabilização do eletrodo e este teve o seu potencial de eletrodo avaliado

em relação a um eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3 mol L-1) comercial da marca Metrohm,

através de uma medida de potencial de circuito aberto realizada por 180 s em solução

de KCl 1 mol L-1 e empregando um eletrodo de fio de platina helicoidal como auxiliar.

72


3.11.2. Caracterização por Espectroscopia de Impedância

Eletroquímica (EIS)

A capacitância interfacial do grafeno foi determinada através de medidas

de espectroscopia de impedância eletroquímica baseado no método proposto por Xia

et al 37. Para isso utilizou-se um potenciostato PGSTAT30 da marca Autolab, equipado

com o software FRA 4.8, para o controle da frequência e potencial aplicado. Uma

célula eletroquímica composta por três eletrodos foi empregada, sendo o eletrodo de

referência de Ag/AgCl saturado, o auxiliar um fio de platina helicoidal e o eletrodo de

trabalho, uma monocamada de grafeno CVD sobre um substrato de SiO2/Si, onde

apenas o grafeno foi exposto a solução (através da delimitação de área com PDMS)

e o contato elétrico se deu através de uma fita de cobre. Os espectros de impedância

foram obtidos em solução tampão PBS 1mmol L-1 em meio de NaCl 1,5 mmol L-1,

aplicando-se uma faixa de potencial de -600 a 400 mV vs Ag/AgCl, à uma frequência

fixa de 100 Hz empregando uma amplitude de perturbação de 10 mV. Todos os

experimentos foram conduzidos no interior de uma gaiola de Faraday. A Figura 16

exibe uma foto de um dos dispositivos (eletrodo de trabalho) empregado para as

medidas de EIS.

Figura 16. Imagem do dispositivo empregado a base de grafeno em substrato de SiO2/Si,

como eletrodo de trabalho para a obtenção dos espectros de EIS.

73

Silva, C. C. C RESULTADOS E DISCUSSÃO Tese de Doutorado

4. CAPÍTULO IV - RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização dos Chips Fabricados

Como detalhado na seção experimental, a parte inicial deste trabalho

envolveu a fabricação de conjuntos de eletrodos metálicos sobre uma lâmina de

Si/SiO2 de 4 polegadas. A Figura 17 (a) exibe uma imagem de um chip contendo os

pads e linhas de contato e os pares de eletrodos de fonte e dreno. Como pode-se

observar, ao todo são 64 pares de eletrodos, onde cada um deles estão conectados

a um eletrodo de fonte comum e os outros eletrodos possuem separadamente seus

contatos de dreno (Figura 17 (b)). Esta configuração permite com que os 64 eletrodos

sejam analisados simultaneamente e de forma independente. A distância máxima

entre os pares de eletrodos é de 12 μm e a largura dos eletrodos é de 20 µm, assim

como demonstrado na ampliação da Figura 17 (c).

Figura 17. (a) Imagem de microscopia ótica de um chip produzido. As diferentes estruturas

neste são indicadas pelas setas. A região dentro do retângulo branco é mostrada em maior

magnificação na Figura B. (b) Imagem de microscopia ótica de uma região do chip mostrando

alguns pares de eletrodos de fonte e dreno. (c) Ampliação da região marcada pelo retângulo

branco em B. A imagem de microscopia ótica exibe um dos 64 pares de eletrodos formados

no chip. A distância entre cada par de eletrodos é de 12 μm e o comprimento de 20 μm.

É importante salientar que os pares de eletrodos foram fabricados sobre

um substrato isolante, portanto, não há passagem de corrente entre os pares de

eletrodos. Isto é, após a etapa de fabricação dos eletrodos a resistência elétrica entre

o terminal de fonte e qualquer um dos drenos é da ordem de giga ohms. Esta

observação é extremamente importante, pois a imobilização da monocamada de

grafeno entre os eletrodos de fonte e dreno permitirá a passagem de corrente elétrica

entre estes terminais.

74


Em uma lâmina de Si/SiO2 de 4 polegadas foi possível produzir 42 unidades

de chips, sendo cada um deste composto por 64 pares de eletrodos de fonte e dreno,

que na etapa seguinte de fabricação darão origem aos GraFETs, desse modo, até ao

processo final de fabricação, será possível obter 2688 GraFETs.

4.2. Imagens de Microscopia Ótica e Eletrônica de Varredura

(MEV) do Grafeno Crescido sobre Substrato de Cu

Com o intuito de se obter as primeiras evidências sobre a eficiência do

processo de crescimento do filme de grafeno via CVD, foram realizadas imagens de

microscopia ótica (Figura 18) e eletrônica de varredura (Figura 19) da folha de cobre

antes (a) e após (b-c) o crescimento do filme de grafeno.

Figura 18. Imagem de microscopia ótica da folha de cobre antes (a) e após (b) o crescimento

do grafeno. Magnificação de 40x.

A Figura 18 (a) exibe a imagem de uma típica folha de cobre, sendo

possível observar as ranhuras do polimento. Após o crescimento do filme de grafeno

(Figura 18 (b)), é possível observar que a folha de cobre mudou de coloração, exibindo

um brilho mais intenso, já que a camada de óxido de cobre nativo foi removida durante

a etapa de recozimento15. Além disso, a Figura 18 (b) exibe os típicos grãos de cobre

(destacados pelas setas amarelas) com tamanhos que variam de 20 a 200 µm 12.

75


Figura 19. Micrografias de MEV da folha de cobre antes (a) e após (b-c) o crescimento do

grafeno.

As imagens de micrografia de MEV (Figura 19) permitiram uma análise

mais detalhada da folha de cobre antes (Figura 19 (a)) e após (Figura 19 (b-c) o

crescimento do filme de grafeno. Na Figura 19 (b) os grãos de cobre podem ser

claramente visualizados devido ao contraste de cor. Mais detalhes sobre a morfologia

do grafeno são revelados na imagem da Figura 19 (c), de maior magnificação. As

setas em vermelho indicam a presença de dobras ou “rugas” no filme de grafeno, que

são comumente originadas durante etapa de resfriamento, devido a diferença

significativa entre os coeficientes de expansão térmica do cobre (24x10-6 K-1) e do

grafeno (-6x10-6 K-1). Assim, o coeficiente de expansão térmica negativo do grafeno

sugere que ocorra o encolhimento significativo do cobre durante o processo de

resfriamento, o que induz um estresse mecânico sobre o grafeno, que é liberado na

forma de “rugas” 12,108,109. Estas “rugas” no grafeno são também encontradas

(b)(a)

(c)

76


atravessando as bordas dos grãos de cobre (indicado pelas setas em amarelo), sendo

este um indicativo que o filme de grafeno crescido é contínuo15.

A Figura 19 exibe imagens de microscopia ótica (a) e de MEV (b) do grafeno

obtido via processo CVD e transferido sobre a superfície de uma lâmina de Si/SiO2

com um óxido de 300 nm de espessura, antes da realização do processo de

recozimento.

Figura 20. Imagem de microscopia ótica (a) e de MEV (b) de uma monocamada de grafeno

obtida via processo CVD transferida sobre um substrato de Si/SiO2 com um óxido de 300 nm

de espessura, antes da etapa de recozimento.

A imagem de microscopia ótica (Figura 20 (a) exibe a típica coloração de

uma monocamada de grafeno transferida no topo de um substrato de Si/SiO2 com um

óxido de 300 nm de espessura, já a área destacada em branco, possui uma coloração

mais escura, que pode estar relacionada com o crescimento de uma bi camada de

grafeno, como reportado previamente por Blake et al. 110. A seta em amarelo, destaca

a região de interface entre o grafeno e o substrato.

Através da análise da Figura 20 (a e b) é possível se obter informações

sobre a eficiência do processo de crescimento de grafeno via CVD e transferência do

mesmo para substratos de Si/SiO2. Desse modo, é possível observar que foi obtido

um filme homogêneo e contínuo em grande extensão, não sendo possível a

visualização de grandes fissuras neste. O processo de transferência também foi

eficiente, já que o filme se mostrou “limpo” nesta escala de visualização, praticamente

isento de resíduos de partículas metálicas e de PMMA, como pode ser comprovado

na micrografia exibida na Figura 20 (b). Além disso, é possível visualizar na

micrografia exibida na Figura 20 (b) dobras (destacadas pelas setas vermelhas) no

77


filme de grafeno, que é um inconveniente do processo de crescimento do grafeno via

CVD em substratos de Cu.

4.3. Caracterização do Grafeno Transferido Para o Substrato de

Si/SiO2 via AFM

Apesar de as imagens de microscopia ótica e eletrônica de varredura

(Figuras 20 (a-b)) exibirem que o filme de grafeno transferido para os substratos de

Si/SiO2 se mostrou “limpo”, apenas através das imagens topográficas obtidas via AFM,

é possível se obter maiores detalhes sobre a superfície do grafeno crescido, bem

como estimar o número de camadas crescida.

Com este intuito, foram obtidas imagens topográficas de AFM do grafeno

transferido para o substrato de Si/SiO2 antes e após o processo de recozimento em

ultra-alto vácuo, conforme exibido na Figura 21.

Figura 21. Imagens obtidas por AFM do filme de grafeno crescido via processo CVD e

transferido para um substrato de Si/SiO2 com 300 nm de espessura, antes (a) e após (b-c) o

processo de recozimento em ultra-alto vácuo. Em (d) o perfil de sessão transversal da região

de linha pontilhada exibida em (c).

78


A imagem da Figura 21 (a) revela que o processo convencional de remoção

do PMMA via banho de acetona, seguido de limpeza orgânica, não é suficiente para

remover todo o polímero, sendo possível visualizar os resíduos de PMMA sobre a

folha de grafeno (pontos em branco). Esta mesma dificuldade, em remover os

resíduos de PMMA apenas com o protocolo convencional de limpeza em acetona,

também foi reportado por H. Park et al.111.

As Figuras 21 (b-c) exibem imagens de AFM após o processo de

recozimento, onde é possível visualizar que o filme de grafeno se encontra

praticamente livre de resíduos de PMMA, confirmando assim, a importância de se

realizar o recozimento das amostras. O processo de recozimento garante que a

superfície do grafeno esteja limpa, possibilitando assim uma melhor adsorção e

imobilização de espécies de interesse sobre a sua superfície. Além disso, a remoção

do PMMA, que é um polímero de natureza isolante, garante a manutenção da elevada

condutividade elétrica do grafeno. As imagens de AFM (Figura 21 (b-c) também

evidenciaram a presença das “dobras” típicas do filme de grafeno crescido, assim

como, sua homogeneidade, como discutido anteriormente na sessão 4.2.

A partir de uma pequena região do filme de grafeno que exibia uma

interface com o substrato de Si/SiO2 (linha pontilhada em branco na Figura 21 (c)) foi

possível estimar a espessura da camada de grafeno crescida, conforme exibido na

Figura 21 (d), senda esta de aproximadamente 0,6 nm, que é característica para uma

monocamada de grafeno crescida via processo CVD112,113.

4.4. Caracterização do Grafeno CVD via Espectroscopia Raman

A espectroscopia Raman, é uma ferramenta valiosa para caracterização da

qualidade do grafeno produzido, bem como a eficácia do processo de obtenção de

monocamadas de grafeno via CVD, já que é possível obter uma estimativa da

quantidade de camadas de grafeno presente na amostra, ou seja, se esta se trata de

uma monocamada, uma bicamada, poucas camadas ou multicamadas de

grafeno114,115.

A banda G, localizada a aproximadamente 1580 cm-1, é caracterizada como

um espalhamento Raman de primeira ordem e está presente em todos os espectros

Raman de sistemas de carbono com hibridização sp2. Esta banda é originada do

79


estiramento da ligação C-C no plano. Já as bandas G´(aproximadamente 2700 cm-1)

e D (1350 cm-1) são provenientes de um processo de dupla ressonância, sendo a

banda G´um harmônico de segunda ordem de um plano de vibração diferente da

banda D. A banda G* (2450 cm-1) também é caracterizada por um processo Raman

de dupla ressonância116-122.

Figura 22. Espectro Raman representativo (a) da amostra de grafeno crescido via processo

CVD transferido para um substrato de Si/SiO2 com um óxido de 300 nm de espessura exibindo

as típicas bandas G´(2692 cm-1), G* (2446 cm-1), G (1582 cm-1) e D (1351 cm-1). Em (b)

espectro exibindo a banda G composta por uma única Lorenztiana. (c) Exibe espectros Raman

obtidos em áreas distintas do filme de grafeno. (d) Razão da intensidade dos picos G´/G

obtidos a partir dos espectros de Raman exibidos em (c). Espectros obtidos com um laser

com 𝜆 =514 nm.

Como exibido na Figura 22 (a) é possível visualizar um pico a 1582 cm-

1(banda G) e outro de intensidade 3 vezes maior em relação a este (banda G´) a 2692

cm-1. O formato e intensidade da banda G´ podem trazer informações sobre o número

de camadas da amostra de grafeno, bem como a ordem de empilhamento

80


destas115,123,124. A partir da análise mais detalhada da Figura 22 (b) é possível

visualizar que a banda G´ é composta por uma única Lorentziana simétrica a uma

largura à meia altura (FWHM, do inglês full width at half maximum) de 34 cm-1, sendo

demonstrado por Bhaviripudi et al 112 o valor de 35 cm-1 um indicativo de uma

monocamada de grafeno crescida via processo CVD. Além disso, os autores

demonstraram também que quando a relação entre a intensidade dos picos IG´/IG

pertencer ao intervalo entre 2-5, o grafeno crescido também pode ser caracterizado

como uma monocamada, sendo que o valor extraído do espectro da Figura 22 (a) foi

de 3,2.

A banda D está relacionada com uma desordem na rede, ou seja, com a

presença de defeitos na estrutura do grafeno. A intensidade desta banda está

associada com a presença de bordas (plano edge) e limites de subdomínios sp2 122.

Como pode ser observado na Figura 22 (a) a intensidade da banda D é extremamente

baixa, de 0,01, quase não sendo visualizada, sugerindo assim, que a mostra de

grafeno CVD crescida pelas condições otimizadas por este trabalho, é praticamente

livre de defeitos.

A Figura 22 (c) exibe espectros Raman obtidos em 8 áreas distintas do filme

de grafeno crescido, onde pode ser visualizado que os espectros praticamente não

exibem a banda D. A Figura 22 (d) exibe a relação de intensidade entre os picos G´/G,

extraídas a partir dos espectros de Raman exibidos na Figura 8 (c), sendo que a

relação G´/G obtidas foram maiores que 2, caracterizando a amostra de grafeno como

uma monocamada, estando este resultado de acordo com a estimativa de espessura

obtida via sessão transversal na imagem de AFM (Figura 22 c-d). Deste modo,

através do método de crescimento de grafeno via processo CVD empregado neste

trabalho, foi possível obter grandes áreas de grafeno monocamada livre de defeitos,

sendo estas características fundamentais para o desenvolvimento de GraFETs com

elevada sensibilidade elétrica para a detecção de biomoléculas.

81


4.5. Transferência do Grafeno Obtido via CVD para o Substrato

de Si/SiO2/Eletrodos e Fotogravação de Padrões sobre o

Grafeno

Após a confirmação do sucesso na síntese e transferência do grafeno em

substratos de Si/SiO2, o processo de transferência descrito no item 3.3.4 foi

empregado para se obter a transferência de uma grande área de grafeno de 3 x 2

polegadas para uma lâmina de Si/SiO2 (4 polegadas) contendo os padrões de

eletrodos de Ti/Pd como pode ser visto na Figura 23.

Figura 23. Fotografia de uma lâmina de 4 polegadas de Si/SiO2/CVD-Grafeno com os padrões

de eletrodos (Ti/Pd) mostrando os 2668 GraFETs fabricados. Inserido a imagem de um chip

isolado, contendo os 64 GraFETs ao lado de uma moeda de 1 centavo de dólar.

Como pode ser visto na Figura 23 a monocamada de grafeno cobriu o topo

dos dispositivos, porém era necessário remover todo o grafeno que estava depositado

fora das regiões dos eletrodos de fonte e dreno, para evitar que ocorra um curto-

circuito entre os dispositivos. Dessa forma o processo de corrosão por plasma de O2

82


necessitava ser empregado. Para isso, primeiramente as regiões entre os eletrodos

de fonte e dreno com grafeno foram protegidas com um padrão de fotoresiste, através

do processo de fotolitografia, onde foi empregado o mesmo procedimento descrito no

item 3.3.2, porém desta vez utilizou-se o segundo nível de máscara, que continha

padrões retangulares exatamente alinhados ao centro dos eletrodos de fonte e dreno.

Em seguida empregou-se o processo de corrosão por plasma de O2 para a

remoção do grafeno exposto. Para este processo utilizou-se um plasma de barril

comum fluxo de oxigênio de 50 sccm de O2 a 100 mTorr e 150 W de R.F. (rádio

frequência) por 10 minutos. Após este processo a lâmina foi submetida a uma limpeza

orgânica, para remoção do fotoresiste. A Figura 24 exibe imagens de microscopia

ótica de um par de eletrodos de fonte e dreno após a transferência do grafeno (a),

após a transferência do padrão de fotoresiste entre os eletrodos e corrosão do grafeno

via plasma de O2 (b) e por fim após a remoção dos padrões de fotoresiste via limpeza

orgânica (c), onde se vê claramente o grafeno depositado entre os eletrodos de fonte

e dreno.

83


Figura 24. Imagens de microscopia ótica dos eletrodos de fonte e dreno, após a transferência

do grafeno (a), do padrão de fotoresiste e corrosão por plasma de oxigênio (b) e remoção do

fotoresiste (c).

(a)

grafeno

(c)

grafeno

(b)

grafeno

+

fotoresiste

84


A figura 25 exibe uma micrografia de MEV do grafeno depositado entre os

eletrodos de fonte e dreno, onde é possível visualizar que o grafeno se encontra

praticamente limpo e livre de resíduos de fotoresiste, confirmando assim que o

processo de remoção do fotoresiste foi eficiente.

Figura 25. Micrografia de MEV exibindo o padrão de grafeno entre os eletrodos de fonte e

dreno.

4.6. Caracterização Elétrica dos Dispositivos em Ar

Os chips fabricados foram primeiramente caracterizados eletricamente

como resistores em ar. Foram obtidas curvas corrente vs tensão (I vs V), aplicando

potenciais de -500 a 500 mV entre eletrodos de fonte e dreno, para mais de 200

conjuntos de eletrodos. A Figura 26 (a) exibe a curva I vs V representativa para um

típico GraFET e a Figura 26 (b) um histograma obtido a partir dos valores de

resistência extraídos das curvas I vs V para mais de 200 pares de eletrodos de fonte

e dreno.

85


Figura 26. a) Curva corrente (I) em função da voltagem (V) aplicada para um típico GraFET.

(b) Histograma exibindo uma distribuição normal para os valores de resistência extraído de

diferentes conjuntos de eletrodos.

A característica linear da curva I vs V (Figura 26 (a)), indica que o contato

estabelecido entre Pd/Grafeno é ôhmico125. Já o histograma da Figura 26 (b) mostra

que os valores de resistência elétrica dos dispositivos obedecem uma distribuição

normal, exibindo um máximo entre 1,5 a 2,0 kΩ, sendo o valor médio normal de

1,87±0,78 kΩ. Os valores de resistência podem ser considerados elevados, porém

nestes estão inseridos a contribuição da resistência de contato que surge na interface

grafeno/metal. Devido a diferença entre os valores da função trabalho do grafeno (4,5

eV) e do paládio (5,6 eV)126, há o estabelecimento de uma barreira de potencial. Esta

barreira de potencial ocasiona a diminuição da injeção de portadores de carga do

metal para o grafeno, contribuindo assim, para o aumento do valor de resistência

global dos dispositivos. Contudo, este é um problema comum para dispositivos do tipo

FET a base de grafeno. Neste sentido, inúmeros trabalhos na literatura vêm buscando

obter o entendimento aprofundado dos fatores de origem da resistência de contato

nos GraFETs, bem como, estratégias que podem ser adotadas visando a diminuição

da contribuição desta nos valores de resistência global dos dispositivos126-129.

Em geral, os dispositivos não apresentaram grandes variações nos valores

de resistência, o que pode ser um indicativo de que o grafeno produzido via processo

CVD possui homogeneidade.

(a) (b)

86


4.7. Passivação dos Eletrodos de Fonte e Dreno

Com o intuito de se realizar medidas em solução aquosa com estes

dispositivos, estes foram passivados com uma camada de fotoresiste AZ 5214 - E.

O processo de passivação consiste em proteger todos os contatos elétricos

dos dispositivos com uma camada de um material que não seja solúvel em água,

deixando assim uma pequena abertura entre os eletrodos de fonte e dreno exposta

para que a monocamada de grafeno possa entrar em contato com a solução aquosa,

permitindo desta forma, que medidas elétricas sejam feitas em solução sem que os

dispositivos entrem em estágio de curto-circuito, ocorra o aparecimento de elevados

valores de corrente de fuga, interações indesejadas entre o analito e os eletrodos

metálicos e ocorra também danos aos eletrodos38.

Para isso, o terceiro de nível de máscara foi empregado e através do

processo de fotolitografia, como descrito no item 3.3.2, as regiões de passivação

foram delimitadas, onde se protegeu com fotoresiste toda a superfície da lâmina,

deixando exposto somente as regiões entre os eletrodos (com uma abertura de 8 µm

de comprimento) e os pads para contato elétrico. Logo após a lâmina passou por um

processo de pós-cura (do inglês pós-bake) na chapa aquecedora à 110ºC por 20

minutos para que ocorresse o enrijecimento e maior aderência do fotoresiste ao

substrato. Figura 27 exibe uma imagem de microscopia ótica do dispositivo após a

passivação com o fotoresiste.

Figura 27. Imagem de microscopia ótica dos eletrodos de fonte e dreno de Ti/Pd contendo o

grafeno após a passivação com o fotoresiste.

87


4.8. Caracterização Elétrica do Microeletrodo de Referência

Ag/AgCl Fabricado

Antes de se realizar as medidas elétricas com os GraFETs em solução, foi

primeiramente realizada a caracterização elétrica do microeletrodo de referência de

Ag/AgCl saturado com 3 mol L-1 de KCl frente a um eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3 mol L-

1) comercial da Metrohm através da medida de potencial de circuito aberto. Como

pode ser visualizado na Figura 28 (a) o micro eletrodo de fabricação própria

apresentou uma diferença de potencial de apenas aproximadamente 2 mV vs Ag/AgCl

(3 mol L-1) comercial, sendo assim este valor aceitável, já que o valor limite é de 10

mV130,131.

A Figura 28 (b) exibe uma imagem do microeletrodo fabricado em relação

a um lápis grafite com ponta de 500 µm, exemplificando as dimensões miniaturizadas

do mesmo.

Figura 28. (a) Medida de potencial de circuito aberto frente a um eletrodo comercial de

Ag/AgCl (3 mol L-1). Experimento realizado em meio de solução KCl 1 mol L-1 e empregando

um eletrodo de fio de platina helicoidal como auxiliar. (b) Imagem do microeletrodo de Ag/AgCl

(3 mol L-1) fabricado para as medidas elétricas com os GraFETs.

88


4.9. Caracterização Elétrica dos GraFETs em Solução Eletrolítica

Para se realizar as medidas em solução, utilizou-se da configuração exibida

na Figura 29, onde um microeletrodo de referência de Ag/AgCl foi utilizado para aplicar

a voltagem de gate.

Figura 29. Imagem da configuração empregada para as medidas elétricas com o GraFET em

solução.

Primeiramente foi avaliado se os dispositivos respondiam ao efeito de

campo em uma solução tampão fosfato de sódio pH 7,00 de concentração 10 mmol

L-1 e força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio. Assim obteve-se a

curva característica de saída para o GraFET, corrente que flui entre o eletrodo de fonte

e dreno (Ids) vs voltagem aplicada entre fonte e dreno (Vds) de -100 a 100 mV (com

resolução de 10 mV), variando-se a voltagem no eletrodo de gate, (Vg), de -1 a 1 V,

com incrementos de 250 mV, como pode ser visto na Figura 30.

89


Figura 30. Curva representativa de saída, Ids vs Vds variando Vg de -100 a 100 mV (com

resolução de 10 mV) em solução tampão fosfato de sódio pH 7,00 de concentração 10 mmol

L-1 e força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio para o GraFET.

A Figura 30 mostra que quando uma voltagem é aplicada entre os eletrodos

de fonte e dreno, uma corrente pode ser observada. Esta corrente é proporcional a

Vds e pode ser modulada com Vg, comprovando assim que os portadores de carga no

GraFETs respondem ao efeito de campo. Onde é possível observar que a corrente Ids

é desenvolvida mesmo com a aplicação de valores de Vg positivos e negativos. Desse

modo a monocamada de grafeno apresenta condução tanto por elétrons quanto por

lacunas, podendo se comportar como um semicondutor tipo n e ou tipo p28,38.

90


Figura 31. Curva representativa de transferência (em preto), Ids em função de Vg (resolução

10 mV) para um Vds de 100 mV para um típico GraFET obtida em 1mM PBS pH 7,4. Ao lado

a curva de transcondutância (gm) (em vermelho) em função de Vg derivada a partir da curva

de transferência.

As características de transporte dos portadores de carga no GraFET,

operando em meios líquidos, foram também demonstradas através da curva de

transferência (Ids vs Vg), para um Vds fixo de 100 mV, em meio de solução PBS 1mM

pH 7,4 (Figura 31, em preto). A curva de transferência para o GraFET exibiu o típico

formato de V encontrado em FETs a base de grafeno (monocamada)64,132. Como

discutido anteriormente na sessão 1.3, quando o GraFET está operando em meio de

eletrólitos, a condutância no grafeno pode ser modulada através da aplicação de uma

voltagem de porta entre o filme de grafeno e um eletrodo de referência, neste caso

Ag/AgCl, na solução eletrolítica. Desse modo, a voltagem aplicada à porta através do

eletrólito, desloca o nível de Fermi (𝐸𝐹) da monocamada de grafeno, provocando

assim, alterações na condutância do dispositivo. Quando o (𝐸𝐹) atravessa o ponto de

Dirac, potencial de mínima condutividade, o tipo de portador de carga é alterado,

permitindo a condução tanto por lacunas quanto por elétrons, condizente com o

comportamento ambipolar observado na Figura 31. Foram medidos 22 transistores

em diferentes Chips e estes apresentaram em média uma voltagem no ponto de Dirac

91


de 0,298 ± 0,077 V. A Figura 32 exibe as curvas representativas de transferência para

cinco GraFETs diferentes, onde é possível se visualizar a voltagem no ponto de Dirac

em cada dispositivo.

Figura 32. Curvas representativas de transferência, Ids em função de Vg (resolução 10 mV)

para um Vds de 100 mV para cinco GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4.

Os valores de voltagem no ponto de Dirac extraídos dos GraFETs

desenvolvidos neste trabalho, dependem de uma série de fatores, mas

principalmente, do potencial eletroquímico absoluto do eletrodo de referência

empregado nas medidas (Ag/AgCl) e da função trabalho do grafeno. Como ambos

têm valores semelhantes (4,6 eV133,134 e 4,5 eV135, respectivamente), a voltagem no

ponto de Dirac esperada seria muito mais próximo de zero do que o valor médio, de

aproximadamente 0,3 V. A razão para esta diferença é provavelmente devido a um

efeito de dopagem do tipo p no grafeno, induzida principalmente pelo substrato

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8

5,0

6,0

7,0

8,0

18,0

19,8

21,6

23,4

33,6

37,8

42,0

46,2

29,1

38,8

48,5

58,2

60,0

72,0

84,0

96,0

Vg (V)

Ids

(

A)

92


adjacente ou contaminação na superfície do grafeno (como moléculas de água ou

oxigênio adsorvidos ou contaminação remanescente do processo de fabricação do

dispositivo).

Um dos parâmetros chave para se caracterizar a sensibilidade de

dispositivos do tipo FET e neste caso do GraFET, é a transcondutância (gm). A

transcondutância nada mais é que a modulação da corrente de Ids induzida por uma

pequena variação em Vg. Através das curvas de gm em função de Vg (Figura 31 (em

vermelho)), é possível analisar a capacidade de ganho ou amplificação da corrente

em dispositivos do tipo FET. De acordo com a equação 7 a transcondutância do

GraFET é dada por132,136:

𝑔𝑚 = Δ𝐼𝐷𝑆

Δ𝑉𝐺=

𝑊

𝐿𝜇𝐶𝑖𝑉𝐷𝑆 Equação 7

Assim a corrente que passa pelo “canal” entre os eletrodos de fonte (s) e

dreno (d) no GraFET é proporcional à mobilidade dos portadores de carga (𝜇) e à

capacitância interfacial (Ci), assim a corrente de resposta do dispositivo é diretamente

proporcional à transcondutância.

A partir da curva de gm em função de Vg (Figura 31 (em vermelho)),

derivada a partir da curva de transferência é possível visualizar que a

transcondutância máxima é atingida em ambos os regimes, o governado por lacunas

e por elétrons, atingindo valores de -91µS (lacunas) e 105 µS (elétrons), valores

próximos aos observados por C. Mackin et al38 .

O efeito da voltagem de Vds na magnitude da transcondutância nos

GraFETs também foi avaliado. A Figura 33 exibe gm em função de Vg para diferentes

valores de Vds (100, 50 e 10 mV) para um típico GraFET. É possível visualizar, que

para ambos os regimes, dominado por lacunas e elétrons, a magnitude de gm

aumenta com o aumento de Vds. Isto está associado ao fato do GraFET apresentar

uma característica de saída (Ids vs Vds) praticamente linear neste regime de operação,

comportamento observado também por Y, Lin et al 137. Assim, os GraFETs quando

submetidos a uma voltagem de Vds de 100 mV operam com a maior amplificação do

sinal de Ids.

93


Figura 33. Transcondutância em função de Vg (resolução 10 mV) para um típico GraFET em

diferentes voltagens de Vds (100, 50 e 10 mV) obtidas em 1mM PBS pH 7,4.

4.10. Determinação da Capacitância Interfacial para o Grafeno

Com o intuito de se caracterizar mais profundamente os biossensores

GraFETs, era necessário se extrair o valor de 𝐶𝑖 desenvolvida na interface grafeno

eletrólito. Nesse sentido foram realizadas curvas C-V à uma frequência fixa de 100

Hz, conforme a configuração apresentada no item 3.11.2. A Figura 34 exibe a curva

C-V obtida apenas para o grafeno, realizada em triplicata.

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8-200,0

-160,0

-120,0

-80,0

-40,0

0,0

40,0

80,0

120,0

160,0

200,0

gm

(S

)

Vg (V)

Vds

100mV

50mV

10mV

94


Figura 34. Curva C-V para o grafeno à uma frequência fixa de 100 Hz.

Através da análise da Figura 34, é possível visualizar que a 𝐶𝑖 exibe a

peculiar forma de V, com um valor mínimo de 1,42 µF/cm2 em 40 mV (vs NHE) e que

esta tem seu valor aumentado linearmente, em ambos os lados, atingindo um máximo

em 600 mV de 3,14 µF/cm2. Este formato da curva C-V é devido a contribuição da

capacitância quântica que surge no grafeno e limita o valor da capacitância interfacial;

assim a 𝐶𝑖 é regulada de forma significativa pelas propriedades eletrônicas do grafeno,

em adição às propriedades da solução eletrolítica da interface, conforme demonstrado

também por H. Ji et al40, e discutido no item 1.3.2.

4.11. Sensibilidade Elétrica dos GraFETs à Mudanças de pH

Visando o emprego dos GraFETs como biossensores, estes foram

primeiramente avaliados em relação a sensibilidade a mudanças de pH do meio,

através das curvas de transferência (Ids vs Vg), para um Vds fixo de 10 mV, em meio

de soluções de diferentes valores de pH (3-8) de concentração 10 mmolL-1 e força

iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio. Sendo demonstradas as curvas

representativas na Figura 35.

95


Figura 35. Curvas representativas de transferência, Ids em função de Vg (resolução 10 mV)

para um Vds de 10 mV para um típico GraFET em diferentes valores de pH de 3 a 8 (força

iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio). A figura inserida mostra a dependência

da voltagem no ponto de Dirac em função do pH.

A Figura 35 mostra que a voltagem no ponto de Dirac é modulada por

mudanças nos valores de pH do meio. O insert da Figura 35, mostra claramente que

com o aumento do pH, a voltagem no ponto de Dirac sofre mudanças para valores

mais positivos, indicando assim, um aumento na dopagem tipo p no grafeno. Isto

ocorre devido a um maior acúmulo de portadores de carga do tipo lacunas em relação

aos elétrons, provenientes do aumento da concentração de íons OH- que se ligam no

plano interior de Helmholtz da dupla camada elétrica, na interface grafeno/eletrólito62,

que torna o potencial de superfície mais negativo. Dessa forma, uma voltagem

positiva maior necessita ser aplicada no eletrodo de porta para compensar este

potencial negativo de superfície, como discutido previamente por Ang et al.62. A partir

do gráfico de voltagem no ponto de Dirac em função do pH do meio, exibido na figura

inserida dentro da Figura 35, foi possível extrair o coeficiente angular da reta, que

representa a sensibilidade do dispositivos em relação a mudanças de pH do meio,

sendo que para os GraFETs desenvolvidos neste trabalho, a sensibilidade obtida foi

de 23mV por unidade de pH, sendo o valor máximo previsto pela equação de Nernst

96


de 59mV/pH131. Porém, Y. Ohno et al, também encontraram valores de sensibilidade

próximos a 20 mV/pH, utilizando um GraFET a base de grafeno esfoliado

mecanicamente65.

A sensibilidade de dispositivos do tipo GraFETs a mudanças de pH não

está totalmente compreendida até o momento e apresenta contradições. Enquanto

Ang et al reportaram uma resposta super-Nernstiana, de 99 mV/pH, em GraFETs com

mono,bi e tricamadas de grafeno obtido via crescimento epitaxial 62, W Fu et al68,

demonstraram que GraFETs a base de grafeno CVD, possuem uma baixa

sensibilidade à mudanças de pH, apenas 6 mV/pH e que consequentemente ligações

não específicas de íons na superfície idealizada do grafeno (limpa e livre de defeitos)

não é esperada68. Porém na prática, alguns defeitos na superfície do grafeno e ao

longo das bordas, que são introduzidos durante as etapas de transferência do mesmo

e fabricação do dispositivo, podem estar relacionados com a sensibilidade ao pH.

Estes defeitos, como grupos hidroxilas e carbonílas, podem reagir com prótons do

eletrólito, gerando a “sensibilidade” a mudanças de pH nestes dispositivos68,138.

4.12. Detecção Elétrica de BSA

Após a confirmação da sensibilidade do GraFET a mudanças do pH do

meio, o dispositivo foi avaliado em relação a adsorção e detecção da proteína

albumina do soro bovino (BSA) (peso molecular 66kDa). A BSA é um polipeptídio de

cadeia única, constituída por 583 resíduos de aminoácidos e nenhum resíduo de

carboidratos (ponto isoelétrico (PI) 5,3) e rica em grupos amino, contendo em 16% de

sua composição de átomos de nitrogênio139. Desse modo, esta é considerada uma

proteína modelo para os estudos de imobilização e detecção de biossensores do tipo

FET a base de nanomateriais de carbono65,140.

97


Figura 36. Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 10 mV para um

típico GraFET em diferentes concentrações de BSA 0,010; 1,00; 10,0; 100,0 e 1000,0 µg mL-

1, preparadas em solução tampão fosfato de sódio pH 7,00 de concentração 10 mmolL-1 e

força iônica ajustada para 50 mmol L-1 com nitrato de sódio. A figura inserida mostra uma

ampliação do gráfico de Ids vs Vg na região do ponto de Dirac.

Como pode ser visto na Figura 36, o GraFET se mostrou sensível a

imobilização e detecção de BSA na superfície do grafeno, onde com o aumento da

concentração de BSA no meio, a voltagem do ponto de Dirac sofreu mudanças para

potenciais menos positivos, seguido da diminuição nos valores de corrente entre fonte

e dreno. O mecanismo mais provável que pode estar governando a resposta do

GraFET em função da adição de BSA à superfície do grafeno é baseado na diminuição

da capacitância interfacial total seguida da queda de potencial na superfície em

relação ao eletrodo de referência. Neste caso, a adsorção da proteína, aumenta a

resistência elétrica e consequentemente provoca a diminuição dos valores de corrente

e deslocamento do potencial para valores menores segundo a lei de Ohm131 .

98


Figura 37. Dependência do ponto de Dirac do grafeno versus concentração de BSA para um

típico GraFET. A figura inserida exibe um gráfico da dependência do ponto de Dirac do grafeno

versus – log da concentração de BSA.

A Figura 37 exibe a relação entre a voltagem do eletrodo de porta (eletrodo

de gate) no potencial do ponto de Dirac em função da concentração de BSA no meio,

onde é possível se visualizar que mesmo baixos valores de concentração de BSA no

meio, como 10 ng mL-1 (151,5 pmol L-1) induzem mudanças no ponto de Dirac, sendo

que a partir de valores de concentração como 100 µg mL-1 (1,52 µmol L-1) há uma

estabilização neste potencial, ocorrendo uma saturação na superfície do grafeno. A

superfície é coberta de tal maneira que o grafeno não apresenta mais sensibilidade

para detectar a adsorção de camadas moleculares adicionais. Isto pode ser melhor

visualizado a partir do gráfico inserido de –log da concentração de BSA em função da

voltagem no ponto de Dirac, exibindo assim uma relação linear entre 10-4 a 10-8 g mL-

1, como exemplificado na equação da reta abaixo:

𝒱𝒟𝑖𝑟𝑎𝑐 (V) = 0,196 (V) + 0,0154 p [BSA] (g mL-1) Eq. 8

Desse modo, pode-se concluir que o GraFET se mostrou extremamente

sensível a imobilização e detecção de BSA e que provavelmente concentrações muito

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0

0,26

0,28

0,30

0,32

0,34

3 4 5 6 7 8

0,26

0,27

0,28

0,29

0,30

0,31

0,32

Voltagem

de e

letr

odo d

e p

ort

ano p

onto

de D

irac (V

)

-log [BSA] (g mL-1)

Vo

lta

ge

m d

e e

letr

od

o d

e p

ort

a

no

po

nto

de

Dir

ac

(V

)

[BSA] ( g mL-1)

99


menores que 10 ng mL-1 (151,5 pmol L-1) podem ser detectadas, já que o dispositivo

sofreu uma saturação na presença de 100µg mL-1 (1,52 µmol L-1) de BSA. Vale

ressaltar que o GraFET operou em baixíssimas voltagens de Vds, apenas 10 mV.

Baseado nestes estudos, os quais demonstraram que os GraFETs

apresentam uma alta sensibilidade para a detecção de BSA, sendo assim, sensíveis

a adsorção de proteínas em sua superfície, os dispositivos foram então empregados

como biossensores para detecção de biomarcadores de câncer de mama.

4.13. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Através da

Imobilização dos Anticorpos via PASE

A Figura 38 (a) exibe a estrutura molecular do ácido 1-

pirenobutanóico éster succinimídico (PASE) empregado como molécula de ligação

entre a superfície do grafeno e os anticorpos. O PASE se liga à superfície do grafeno

através de interações do tipo 𝜋 − 𝜋 estabelecidas entre seu grupo pireno e a superfície

do grafeno. Assim, a outra extremidade de sua cadeia, que possui o grupo

éster succinimídico, fica livre para se ligar aos anticorpos através de uma reação de

substituição nucleofílica entre os grupos amino dos anticorpos e seu grupo

éster succinimídico, resultando em uma ligação covalente amida107.

A Figura 38 (b) exibem as curvas de transferência representativa para um

GraFET após cada etapa de imobilização e evento de bioreconhecimento entre os

anticorpos-antígenos.

100


Figura 38. (a) Estrutura molecular do ácido 1-pirenobutanóico éster succinimídico (PASE) e

em (b) curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV para um

GraFET obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da molécula ligante PASE,

anticorpo, seguido do bloqueio com etanolamina e adição de 1µg mL-1 da solução de antígeno.

Ao analisar a Figura 38 (b) é possível observar que inicialmente o ponto de

Dirac para o grafeno puro está localizado ao redor de 350 mV e que após a

funcionalização com PASE, ocorreu um pequeno deslocamento na voltagem no ponto

de Dirac para 370 mV, acompanhada de uma queda da intensidade de Ids,

confirmando a adsorção do PASE sobre a superfície do grafeno. Esta variação na

voltagem de Dirac para valores superiores ao encontrado para o grafeno puro após a

adição do PASE, pode estar relacionada com um processo de dopagem molecular do

tipo p, devido aos grupos ésteres succinimídicos serem grupos retiradores de

densidade eletrônica.

Após a imobilização dos anticorpos, um novo deslocamento na voltagem

no ponto Dirac foi observado, porém para valores menores, 320 mV, podendo este

ser um indicativo de que os anticorpos foram aderidos a superfície do grafeno via

ligação covalente com o PASE. Devido ao fato do anticorpo ErbB2/Her2 possuir um

ponto isoelétrico (PI) de 5,58141; ou seja, inferior ao pH da solução tampão PBS (7,4);

essas espécies encontram-se negativamente carregadas. Assim a densidade de

elétrons no “canal” do grafeno é aumentada, resultando em uma dopagem molecular

do tipo n, seguida da diminuição dos valores de corrente Ids, devido ao maior

espalhamento dos portadores de carga do tipo elétrons.

(a) (b)

101


Após a etapa de bloqueio com etanolamina foi observado uma diminuição

na voltagem de Dirac de apenas -10 mV (310 mV) e com a adição de 1µg mL-1 (10,33

nmol L-1) da solução do antígeno (biomarcador), nenhuma mudança significativa

ocorreu, tanto nos valores de Ids como na voltagem no ponto de Dirac.

Portanto, os GraFETs, com anticorpos imobilizados por esta estratégia, não

apresentaram sensibilidade para detecção de uma concentração elevada do

biomarcador HER-2, possivelmente pela perda da atividade dos anticorpos após o

processo de imobilização. Assim, uma nova estratégia de imobilização dos anticorpos

sobre o grafeno foi adotada, fazendo uso da proteína A.

4.14. Imobilização da Proteína A Sobre o Grafeno e Medidas de

Ângulo de Contato

Existem inúmeras abordagens na literatura sobre a imobilização de

anticorpos sobre grafeno77,84, porém poucas demonstram a imobilização destes

anticorpos de forma orientada, deixando a porção Fab dos anticorpos livre para a

interação específica com os antígenos. Desse modo, optamos por utilizar pela

primeira vez, a proteína A como uma “ponte” para a imobilização orientada dos

anticorpos sobre o grafeno, preservando assim a atividade dos anticorpos. A proteína

A consiste de um polipeptídio de cadeia única e de peso molecular de 42 kDa,

contendo quatro domínios repetitivos ricos em ácido aspártico e glutâmico, com quatro

resíduos de tirosina, mas desprovidos de cisteína142,143. Cada um destes quatro

domínios se ligam com elevada afinidade a porção Fc de imunoglobulinas IgG

(Ka=108/mols)144, como no caso dos anticorpos utilizados neste trabalho. Assim, a

proteína A é classificada como uma superfície receptora estável. A Figura 39

representa a estrutura de um anticorpo e os problemas relacionados com a

imobilização randômica destes e a ligação da proteína A à porção Fc dos anticorpos.

102


Figura 39. Representação esquemática da estrutura de um anticorpo, mostrando as porções

Fab e Fc e a ligação específica da proteína A com a porção Fc do anticorpo. Em baixo

representação da relação entre a atividade do anticorpo e sua imobilização. Adaptado da

referência144.

Desse modo, era necessário primeiramente investigar se a proteína A

poderia se adsorver na superfície do grafeno CVD, assim, medidas de ângulo de

contato foram realizadas, conforme exibido na Figura 40.

103


Figura 40. Medidas de ângulo de contato sobre um substrato de Si/SiO2 com 300 nm de

espessura (a), Si/SiO2 - grafeno (b) e Si/SiO2 – grafeno – Proteína A (c). Medidas realizadas

com gotas de água deionizada (resistividade de 18 MΩ. cm).

A Figura 40 (a) exibe o formato da gota de água sobre a superfície

hidrofílica do SiO2, sendo o valor médio de ângulo de contato de 35,77 ± 0,31 º, valor

próximo ao reportado por R. Raj et al. de 36,7º 145. Quando a superfície do SiO2 foi

recoberta pela monocamada de grafeno (Figura 40 (b)), o ângulo de contato medido

aumentou drasticamente para 81,6 ±0,28 º, devido a baixa molhabilidade do grafeno,

o qual é um material de natureza hidrofóbica. O valor encontrado está de acordo com

os reportados na literatura (entre 80-90º), para uma monocamada de grafeno CVD

crescida sobre cobre e transferida para substrato de SiO2 145,146 e próximo ao do grafite

pirolítico altamente ordenado (HOPG, do inglês, highly ordered pyrolytic graphite), de

90,6º 147. Após a proteína A ficar em contato com a superfície do grafeno por 12 horas,

o substrato de SiO2 contendo o grafeno transferido foi lavado repetidas vezes com

tampão PBS pH 7,4, seguido de água deionizada e medidas de ângulo de contato

foram realizadas novamente, conforme exibido na Figura 40 (c). O ângulo de contato

diminui ligeiramente para um valor médio de 68,66 ± 0,97 º, sendo este um indicativo

104


que a proteína A foi adsorvida na superfície do grafeno. Esta diminuição no valor de

ângulo de contato está relacionada com o fato da proteína A ter um ponto isoelétrico

(PI) de 5,1, estando assim carregada negativamente quando em contato com a água

deionizada142. Dessa forma a superfície do grafeno se torna menos hidrofóbica devido

a adsorção da proteína A.

Com a confirmação da adsorção da proteína A sobre o grafeno CVD, os

dispositivos GraFETs foram aplicados para a detecção elétrica do biomarcador HER-

2.

4.15. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Através da

Imobilização dos Anticorpos via Proteína A

Primeiramente os dispositivos GraFETs foram avaliados em relação ao seu

potencial para a detecção do biomarcador HER-2, baseado na interação com os

anticorpos imobilizados sobre o grafeno através da proteína A.

A Figura 41 (a) exibe as curvas de transferência para os GraFETs após

cada etapa de imobilização e evento de bioreconhecimento entre os anticorpos-

antígenos.

105


Figura 41. (a) Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV para

os GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da proteína A, anticorpo e

adições de diferentes concentrações de solução de antígenos (10pg – 200ng mL-1). (b)

Variação do potencial no ponto de Dirac do grafeno (∆Vgmin) vs –log da concentração do

antígeno, n=5.

(b)

(a)

106


Ao analisar a Figura 41 (a) é possível observar que inicialmente o ponto de

Dirac para o grafeno puro está localizado ao redor de 360 mV e que após a adsorção

da proteína A este teve um deslocamento para potenciais menores, ao redor de 300

mV, confirmando assim a adsorção da proteína A sobre o grafeno, conforme

comprovado também pelas medidas de ângulo de contato (item 4.14). Estes

deslocamentos no ponto de Dirac foram observados também após a imobilização do

anticorpo (270mV) e adições de solução contendo os antígenos em concentrações

superiores a 100 pg mL-1 (1,03 pmol L-1), como pode ser melhor visualizado na Figura

41 (b). O mecanismo de detecção neste caso pode estar relacionado aos efeitos de

dopagem por cargas e alteração na mobilidade dos portadores de carga do grafeno

via espalhamento. Como no caso da proteína A, anticorpo e antígeno, possuírem seus

respectivos ponto isoelétricos (PI), 5,1; 5,58 e 5,7; menores que o pH da solução

tampão PBS (7,4), essas espécies encontram-se negativamente carregadas, assim a

densidade de elétrons no “canal” do grafeno é aumentada, resultando em uma

dopagem do tipo n, que pode ser ocasionada devido a uma ascendente mudança do

nível de Fermi, sem alterar a estrutura de banda ou um desvio do ponto de Dirac um

pouco abaixo do nível de Fermi, ou seja, o deslocamento observado do potencial no

ponto de Dirac para valores mais negativos84.

Os GraFETs se mostraram sensíveis a detecção de até 100 pg mL-1 (1,03

pmol L-1) do antígeno, porém exibindo uma faixa linear de 1ng à 200 ng mL-1 (10,33

pmol a 2,10 nmol L-1) (R=0,9854).

Visando verificar o efeito de ligações não específicas na performance dos

GraFETs, foram obtidas as típicas curvas de característica de transferência para os

GraFETs após a imobilização da proteína A, seguida da etapa de bloqueio (sem a

presença dos anticorpos) na presença de soluções de antígenos de 100 pg mL-1 e 10

ng mL-1, sendo estas exemplificadas na Figura 42.

107


Figura 42. Curvas representativas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV para um

típico GraFET obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização da proteína A seguido da

etapa de bloqueio, após a adição de soluções de antígenos (100 pg e 10 ng mL-1).

A Figura 42, revela que na ausência dos anticorpos, os GraFETs

praticamente não exibem sensibilidade à detecção do biomarcador HER-2, já que

após a imobilização da proteína A, seguida da etapa de bloqueio, a voltagem no ponto

de Dirac é de 315 mV e na presença de 100 pg mL-1 de solução de antígeno apenas

um pequeno deslocamento de 10 mV foi observado (305 mV). Com o aumento de

concentração de antígenos para 10 ng mL-1, nenhuma variação na voltagem de Dirac

é observada (305 mV) indicando que não ocorrem ligações entre os antígenos e a

proteína A e BSA, confirmando a efetividade da etapa de bloqueio e o papel dos

anticorpos para a detecção seletiva e sensível dos biomarcadores HER-2.

Com o intuito de se explorar ainda mais o limite da sensibilidade dos

dispositivos GraFETs para a detecção de HER-2, avaliou-se o efeito da imobilização

de nanopartículas de ouro sobre o Grafeno-CVD em relação à diminuição ou não dos

limites de quantificação para o HER-2.

108


4.16. Caracterização por STEM e Espectrofotometria UV-Visível

das Nanopartículas de Au Sintetizadas

A Figura 43 (a) exibe uma imagem da solução aquosa das nanopartículas

de ouro obtidas. Como pode ser visto, a solução apresenta uma coloração vermelha

típica de sistemas coloidais de ouro148. Na mesma figura é possível ver o espectro de

absorbância da respectiva solução de nanopartículas de Au exibindo a banda de

Plasmon centrada em torno de 518 nm149, confirmando assim a formação das

nanoestruturas. As nanopartículas de Au foram caracterizadas em relação ao seu

formato e tamanho através de micrografias de STEM no modo campo escuro (Figura

43 (b)) e campo claro (Figura 43 (c)), onde é possível visualizar que as nanopartículas

possuem formato esférico e são relativamente homogêneas em relação ao seu

tamanho. A partir das micrografias da Figura 43 (b e c) e empregando-se o software

Image J, realizou-se uma análise da distribuição do tamanho médio de 697

nanopartículas. Com nos valores extraídos, foi possível confeccionar um histograma

referente ao diâmetro médio destas (Figura 43 (d)), que apresentaram uma

distribuição normal, com o valor médio em 8,01±2,62 nm. Além disso, 37,7% das

nanopartículas, apresentam um diâmetro médio entre 8 a 10 nm e aproximadamente

82 % destas, possuem diâmetro entre 1 a 10 nm. Desse modo, o procedimento

adotado para a síntese das nanopartículas de Au, se mostrou eficiente para a

obtenção de partículas de tamanho considerado pequeno (1 a10 nm).

109


Figura 43. (a) Imagem da solução de nanopartículas de ouro preparadas e na figura inserida

o espectro de absorbância na região do UV-Visível das mesmas, exibindo a banda de

Plasmon centrada em 518 nm. Micrografia de STEM das nanopartículas de Au depositadas

sobre uma tela de transmissão de ouro com um filme de carbono no modo campo claro (b) e

campo escuro (c). (d) Histograma de distribuição normal do diâmetro médio de 697

nanopartículas de Au.

Após a confirmação de que as nanopartículas de Au foram realmente

formadas e caracterizadas em relação ao seu formato e tamanho médio, estas

estavam prontas para serem imobilizadas sobre a superfície do grafeno CVD.

(a) (b)

300 400 500 600 7000,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Ab

so

rbân

cia

(a.u

)

(nm)

(d)

(c)

110


4.17. Decorando o Grafeno CVD com Nanopartículas de Au

Após o preparo das nanopartículas de ouro o grande desafio que

necessitava ser superado era como realizar a imobilização destas sobre o grafeno

CVD, sem a introdução de defeitos na rede do grafeno. Atualmente na literatura há

inúmeras estratégias de imobilização de nanopartículas metálicas, porém, em óxido

de grafeno, onde se utiliza os grupos funcionais oxigenados carregados

negativamente destes, como pontos de ancoramento dos cátions metálicos e a

formação das nanopartículas se dá pela redução in situ destes via borohidreto de

sódio ou outros agentes redutores 150,151.

J. Park e colaboradores demonstraram recentemente a imobilização de alta

densidade de nanopartículas de ouro sobre grafeno obtido via CVD e esfoliação

mecânica152, porém nesta abordagem os autores utilizaram de reações de ciclo-

adição via nitreto de perfluorofenil para ancorar as nanopartículas sobre o grafeno.

Desse modo, a estratégia adotada pelos autores para a imobilização das

nanopartículas se dá através de uma ligação covalente, interrompendo assim, a

hibridização sp2 dos átomos de carbono e a conjugação dos elétrons 𝜋 na rede,

introduzindo defeitos que podem ocasionar uma diminuição na condutividade do

grafeno153.

Com base nas dificuldades expostas acima, era preciso desenvolver um

método que possibilitasse a imobilização não-covalente e com elevada densidade e

homogeneidade das nanopartículas de ouro sobre o grafeno. Neste contexto foi

preciso encontrar alguma molécula que possuísse uma alta afinidade para interagir

com a superfície do grafeno e ao mesmo tempo apresentasse elevada afinidade para

ligações com nanopartículas de ouro. Em 2011, E. Voloshina e colaboradores154,

demonstraram pela primeira vez através de simulações baseadas no princípio da

Teoria do Funcional da Densidade (do inglês, density functional theory (DFT)) que

moléculas de piridina podem adsorver fortemente tanto de forma paralela quanto

perpendicular a superfície do grafeno devido à interações intermoleculares do tipo 𝜋 −

𝜋 e interações do par de elétrons livre do nitrogênio piridínico com o grafeno. Desse

modo, o trabalho de Voloshina e colaboradores nos inspirou em utilizar a p-

mercaptopiridina como molécula “ponte” ideal para a imobilização das nanopartículas

de ouro sobre o grafeno, pois além de apresentar o grupo piridínico que interage

fortemente com o grafeno, possuem ainda na posição 1 um grupo tiol, que tem forte

111


afinidade para ligar covalentemente ao ouro, configurando uma ligação ácido-base

mole de Pearson155 . A Figura 44 exibe uma representação esquemática das possíveis

formas de orientação durante a interação intermolecular entre a molécula de p-

mercaptopiridina com o grafeno, no modo perpendicular (a) e paralelo (b).

Figura 44. Representação esquemática das possíveis formas de orientação esperadas da

molécula de p-mercaptopiridina em relação a superfície do grafeno. Perpendicular (a), devido

a interação do par de elétrons livre do nitrogênio piridínico com o grafeno e paralelo (b),

quando as interações intermoleculares do tipo 𝜋 − 𝜋 prevalecem. Em ambos os casos é

representado também à ligação do tipo ácido – base mole de Pearson entre a nanopartícula

de ouro e o grupo tiol.

O efeito da interação da p-mercaptopiridina com o grafeno foi

primeiramente avaliado através do espectro de XPS em alta resolução para o

nitrogênio nível 1s, conforme exemplificado na Figura 45.

112


Figura 45. Espetro de XPS de alta resolução para o N 1s obtido na superfície do grafeno CVD

após a adsorção da p-mercaptopiridina.

A Figura 45 exibe o espectro de XPS de alta resolução para o N 1s, onde

é possível observar um pico proeminente em 399,2 eV, energia característica para

átomos de nitrogênio piridínicos desprotonados156. Desse modo, através da análise

por XPS, foi possível obter a confirmação de que a p-mercaptopiridina foi adsorvida

sobre a superfície do grafeno CVD.

Em seguida, através das imagens de MEV foi possível estudar o papel da

p-mercaptopiridina na imobilização das nanopartículas de Au sobre o grafeno,

conforme exibido na Figura 46 (a-c).

113


Figura 46. Micrografias de MEV do grafeno CVD depositado sobre um substrato de 300 nm

de SiO2 e com nanopartículas de ouro depositadas em sua superfície, sem (A) e com (B) a

funcionalização com p-mercaptopiridina. Em (C) uma imagem de maior magnificação (200kx)

de (B).

A Figura 46 (a) exibe uma micrografia de MEV do grafeno depositado sobre

uma lâmina de SiO2 após a imersão na solução contendo as nanopartículas de ouro,

porém sem a funcionalização com a p-mercaptopiridina, onde é possível visualizar

que não há nanopartículas de ouro imobilizadas sobre o grafeno. Já a Figura 46 (b)

exibe a micrografia de MEV do grafeno CVD que foi funcionalizado com p-

mercaptopiridina e que posteriormente recebeu a solução contendo as nanopartículas

de ouro, onde é possível visualizar que uma elevada densidade de nanopartículas de

ouro foi imobilizada sobre o grafeno e de forma uniforme. Na Figura 46 (c), que exibe

a micrografia de maior magnificação da mesma amostra, pode-se observar que as

(a) (b)

(c)

114


nanopartículas somente foram depositadas sobre o grafeno CVD e não nas regiões

contendo SiO2 exposto, salientando assim, que a p-mercaptopiridina interage apenas

com a superfície do grafeno.

Com o intuito de se obter maiores informações sobre a disposição e

densidade das nanopartículas imobilizadas sobre o grafeno CVD via p-

mercaptopiridina, imagens topográficas de AFM foram obtidas, conforme exibido na

Figura 47.

Figura 47. Imagens topográficas obtidas por AFM do grafeno CVD sobre um substrato de 300

nm de SiO2 e com as nanopartículas de ouro imobilizadas em sua superfície após a

funcionalização com p-mercaptopiridina em uma área de 5 x 5 µm (a) e 2,5 x 2,5 µm (b). (c)

Mapa topográfico em 3D da imagem exibida em (b).

As imagens topográficas (Figura 47 (a e b), assim como o mapa topográfico

em 3D, comprovam que uma elevada densidade de nanopartículas de Au foi

imobilizada na superfície do grafeno, corroborando assim com as micrografias de MEV

115


(Figuras 46 (b e c). Porém é possível visualizar que a imobilização destas ocorreu de

forma uniforme, praticamente uma monocamada de nanopartículas de Au, onde

regiões de aglomeração ou sobreposição destas são escassas.

A partir da análise das imagens das Figuras 46 e 47, fica claro o papel da

funcionalização com p-mercaptopiridina para a conjugação uniforme e de elevada

densidade de nanopartículas de ouro sobre grafeno CVD. Além disso, a imobilização

das nanopartículas de ouro sobre o grafeno se mostrou extremamente estável, onde

não se observou a lixiviação destas após sucessivas etapas de lavagem.

Para comprovar que as nanopartículas imobilizadas sobre a superfície do

grafeno eram mesmo de ouro, foram obtidos inúmeros espectros de EDX de uma área

da amostra selecionada a partir da micrografia de MEV exibida na Figura 46 (c). Desse

modo foi confeccionado o mapa composicional baseado na linha espectral Lα para o

elemento de Au, de energia característica de 9,712 eV157, conforme mostrado na

Figura 48 (a).

Figura 48. (a) Mapa de composição para o Au (Lα 9,712 eV) de uma região da superfície da

amostra de grafeno-nanopartículas de Au sobre o substrato de Si/SiO2, exibido na Figura X

(c). Inserido o espectro de EDX exibindo as linhas espectrais para o C (Kα 0,277 eV), O (Kα

0,525 eV), Si (Kα 1,739 eV) e Au (M 2,12 eV e Lα 0,9,712 eV). (b) Espetro de XPS de alta

resolução para o Au 4f.

A Figura 48 (a) exibe também o espectro representativo da superfície, onde

é possível identificar as linhas espectrais características para o carbono (Kα 0,277

eV), oxigênio (Kα 0,525 eV) e silício (Kα 1,739 eV), provenientes do substrato e ouro

(M 2,12 eV e Lα 0,9,712 eV)157 devido a presença das nanopartículas. No espectro

116


não foi possível identificar as linhas características do átomo de nitrogênio (Kα 0,392

eV) e do átomo de enxofre (Kα 2,307 eV)157, relacionadas com a presença da camada

de p-mercaptopiridina, porém isso pode estar relacionado com a baixa concentração

desta na superfície do grafeno.

Visando identificar o estado químico em que as nanopartículas de ouro se

encontravam após a imobilização na superfície do grafeno, foi obtido o espectro de

XPS em alta resolução para o Au nível 4f, conforme exibido na Figura 48 (b). Através

da análise da Figura 48 (b) é possível verificar o espectro tido como a “impressão

digital” para nanopartículas de ouro de estado de oxidação zero156, exibindo um

dubleto com energias de ligação para o Au 4f7/2 de 83,9 eV e para o Au 4f5/2 de 87,6

eV com o característico ∆ = 3,7eV.

Para averiguar que a imobilização das nanopartículas de ouro sobre o

grafeno CVD via funcionalização com p-mercaptopiridina ocorreu com a conservação

da estrutura sp2, não introduzindo assim defeitos na estrutura do grafeno; espectros

Raman foram coletados em quatro diferentes áreas da amostra, sendo exibidos na

Figura 49 (a).

Figura 49. (a) Espectros Raman obtidos sobre o grafeno CVD decorado com nanopartículas

de ouro em diferentes áreas da amostra. (b) Razão da intensidade dos picos G/D obtidos a

partir dos espectros de Raman exibidos em (a). Espectros obtidos com um laser de 𝜆 = 532

nm.

Na Figura 49 (a) é possível visualizar que as bandas G e G’, foram

preservadas e que ocorreu um pequeno aumento na intensidade da banda D. Este

aumento pode ser mais bem visualizado no gráfico da Figura 49 (b), que exibe a

relação entre a intensidade dos picos G/D, sendo esta de 3,3 a 5,7, valores bem

117


inferiores aos encontrados antes do processo de imobilização das nanopartículas, em

geral 19. Este pequeno aumento na intensidade da banda D, não está

necessariamente relacionado com a introdução de defeitos na rede do grafeno, mas

sim, com processos de adsorção na superfície deste, que podem aumentar a

desordem no plano basal56,123. Assim através das medidas de espectroscopia Raman

é possível afirmar que a funcionalização com a p-mercaptopiridina seguida da

imobilização das nanopartículas de Au, preservou, as propriedades elétricas do

grafeno.

4.18. Detecção Elétrica de HER-2 nos GraFETs Modificados com

Nanopartículas de Ouro

O procedimento utilizado para a imobilização das nanopartículas de ouro

sobre o grafeno CVD depositado sobre as lâminas de SiO2/Si foi realizado também

sobre os GraFETs. Após a imobilização das nanopartículas de ouro sobre os GraFETs

utilizou-se o mesmo procedimento descrito no item 3.5, porém agora a proteína A,

pode-se ligar também fortemente à superfície das nanopartículas de ouro. Horisberger

et al.158 realizou em 1985 um estudo sobre a formação de complexos entre proteína

A e nanopartículas de ouro, de diâmetro médio de 11 nm. Os autores demonstraram

que uma monocamada de proteína A é formada ao redor das nanopartículas e que o

número de proteínas adsorvidas está relacionado diretamente com o pH do meio (pH

7,2, 4-12 unidades de proteína A por nanopartícula de Au). O complexo formado entre

as nanopartículas de Au-proteína A é estável, com uma constante de associação de

108 M-1 158.

Após a imobilização da proteína A sobre às nanopartículas de Au, foram

realizados os mesmos procedimentos de imobilização dos anticorpos e etapa de

bloqueio e em seguida o imunoensaio.

118


Figura 50. (a) Curvas de transferência (Ids-Vg) para um Vds de 100 mV para dispositivos

GraFETs obtidas em 1mM PBS pH 7,4 após a imobilização das nanopartículas de ouro,

proteína A, anticorpo e adições de diferentes concentrações de solução de antígenos (500fg

– 200ng mL-1). (b) Variação da voltagem no ponto de Dirac do grafeno (∆Vgmin) vs –log da

concentração do antígeno, n=6.

(a)

(b)

119


A Figura 50 (a) exibe as curvas de transferência para os GraFETs após

cada etapa de imobilização e evento de bioreconhecimento entre os anticorpos-

antígenos. É possível observar que após a imobilização das nanopartículas de ouro

sobre o grafeno a voltagem no ponto de Dirac teve um deslocamento - 30 mV,

comprovando assim a conjugação das nanopartículas de ouro sobre o grafeno. Dong

e colaboradores63 também observaram um deslocamento na voltagem no ponto de

Dirac para valores menores após a imobilização de nanopartículas de ouro.

Também foram observados deslocamentos na voltagem no ponto de Dirac

para valores menores após a imobilização da proteína A, anticorpos e antígenos,

como visualizado anteriormente apenas para os GraFETs sem as nanopartículas

(Figura 41 (a)). O mais impressionante, é que após conjugação das nanopartículas de

ouro sobre os GraFETs, o dispositivo se mostrou sensível à detecção de apenas 500

fg mL-1 (5,17 fmol L-1) do biomarcador HER-2, sendo esta uma concentração

extremamente baixa, como pode ser mais bem visualizado na Figura 50 (b) que exibe

a relação do deslocamento no potencial do ponto de Dirac em função do –log da

concentração de HER-2 (R=0,971).

A incorporação das nanopartículas de ouro sobre os GraFETs realmente

ocasionou uma amplificação adicional no sinal de detecção dos biomarcadores HER-

2 quando comparado com o grafeno “puro”, principalmente diminuindo ainda mais o

limite de quantificação, como pode ser visualizado no gráfico da Figura 51, que

compara as regiões de detecção para o HER-2 utilizando GraFETs sem e com a

incorporação das nanopartículas de ouro.

120


Figura 51. Variação da voltagem no ponto de Dirac do grafeno (∆Vgmin) vs –log da

concentração do antígeno para os GraFET sem (•) e com (•) as nanopartículas de ouro.

Esta amplificação na detecção dos biomarcadores HER-2 após a

incorporação das nanopartículas de ouro possivelmente resulta da união de dois

fatores, o primeiro é o aumento da área superficial disponível para a imobilização dos

anticorpos, resultando assim, em uma maior quantidade de sítios de ligação para os

antígenos. Já o segundo pode estar relacionado com o aumento da mobilidade dos

elétrons, devido à elevada densidade de carga negativa e elétrons de condução

incorporados com a adição das nanopartículas de ouro. Desse modo, um efeito

sinérgico surge a partir da formação deste nanomaterial híbrido grafeno-

nanopartículas de ouro resultando assim em uma amplificação do sinal de detecção.

Com o intuito de se investigar se a imobilização das nanopartículas de Au,

bem como da proteína A, anticorpos e interações com os antígenos poderiam alterar

os valores de capacitância interfacial no grafeno, foram realizadas curvas C-V (em

triplicata) após cada etapa de imobilização, como exemplificado na Figura 52 (a).

0

-20

-40

-60

-80

-100

-120

-140

-160

-180

-200

Vg

min

(m

V)

Grafeno

Grafeno - Nanopartículas de ouro

Log [Antígeno] (g/mL-1

)

100fg 1g100ng1ng 10ng10pg 100pg

1pg

121


Figura 52. Curva C-V (a) e variação da capacitância interfacial mínima (b) para o grafeno à

uma frequência fixa de 100 Hz obtidas em 1mmol L-1 de PBS pH 7,4 após a imobilização das

nanopartículas de ouro, proteína A, anticorpo e adições de diferentes concentrações de

solução de antígenos (1p, 1n e 200ng mL-1). Inserido em (b) o gráfico da variação da

capacitância interfacial mínima em função da adição dos antígenos.

(b)

(a)

122


A Figura 52 (a) mostra que após a imobilização das nanopartículas de Au,

houve um aumento no valor da capacitância interfacial em relação ao grafeno puro,

que pode ser melhor visualizado no gráfico de capacitância interfacial mínima em

função da voltagem, na Figura 52 (b). Esse aumento está relacionado com o aumento

de área superficial da interface, pela adição das nanopartículas de Au, bem como a

elevada quantidade de cargas superficiais que estas partículas possuem, que são

capazes de gerar gradientes de campos elétricos, aumentando assim, o número de

dipolos formados na interface, grafeno/nanopartículas de Au e solução eletrolítica159.

Após a adição da proteína A, bem como da imobilização dos anticorpos e

evento de ligação dos antígenos, é possível visualizar na Figura 52 (a) e (b), que a

capacitância interfacial tem seu valor diminuído. Estes resultados podem ser

compreendidos considerando-se que cada espécie adsorvida e/ou ligada sobre a

superfície do grafeno forma uma camada molecular que está em série com a

capacitância interfacial total (𝐶𝑇) da superfície, como mostrado na equação a seguir:

1

𝐶𝑇 =

1

𝐶𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝐴 +

1

𝐶𝐴𝑛𝑡𝑖𝑐𝑜𝑟𝑝𝑜 +

1

𝐶𝐴𝑛𝑡í𝑔𝑒𝑛𝑜 Equação 9

Assim, a capacitância total da superfície tenderá a ser menor com a adição

e formação de novos filmes moleculares sobre ela, diminuindo assim o valor da

capacitância interfacial total. Sendo assim, a capacitância interfacial é um parâmetro

que está relacionado com a resposta dos biossensores GraFETs à imobilização e

interação com proteínas.

Além disso, o gráfico inserido na Figura 52 (b), mostra que a capacitância

interfacial mínima desenvolvida pelo grafeno, é extremamente sensível a eventos de

interações com os biomarcadores HER-2, em concentrações extremamente baixas,

1pg mL-1 e exibindo uma resposta linear em uma faixa de concentração de 1pg mL-1

a 200 ng mL-1. Este resultado abre a perspectiva de empregar o monitoramento da

capacitância interfacial no grafeno, como elemento de transdução e assim,

desenvolver biossensores capacitivos a base de grafeno, de configuração simplificada

e de sensibilidade considerável.

Por fim, realizamos uma busca na literatura de modo a comparar a

performance dos biossensores GraFETs modificados com nanopartículas de Au

produzidos neste trabalho com outros biossensores para a detecção do biomarcador

123


HER-2. A Tabela 2 exibem os limites de quantificação obtidos na detecção do

biomarcador HER-2 pelos principais biossensores reportados na literatura, de

diferentes elementos de transdução. Onde é possível se visualizar que os GraFETs

modificados com nanopartículas de Au desenvolvidos por este trabalho apresentam o

menor limite de quantificação.

Tabela 2. Valores de limite de quantificação alcançados por diferentes biossensores

no monitoramento do biomarcador HER-2.

Tipo de dispositivo Limite de

Quantificação Referência

Imunosensor nanoestruturado do tipo sanduíche

preparados em eletrodos impressos em membranas de

policarbonato (Voltamétrico)

40 ng mL-1 160

Sensores a Ondas Acústicas de Superfície (do inglês,

Surface Acoustic Wave (SAW)) 10 ng mL -1 161

Imunosensor com nanopartículas magnéticas com

enzima marcada (Amperométrico) 26 pg mL-1 162

GraFETs-Nanopartículas de Au 500 fg mL-1 Este

Trabalho

124

Silva, C. C. C CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS Tese de Doutorado

5. CAPÍTULO V - CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

O presente trabalho descreveu a fabricação de biossensores do tipo

GraFETs em grande escala e a aplicação destes para a detecção ultra-sensível do

biomarcador de câncer de mama HER-2. A elevada sensibilidade elétrica dos

dispositivos GraFETs foi alcançada devido a união de três fatores: o tipo de grafeno

empregado, a imobilização orientada dos anticorpos sobre o grafeno e a incorporação

das nanopartículas de ouro. Neste sentido, destacam-se na sequência as principais

contribuições realizadas por este trabalho.

Através do método de CVD, foi possível sintetizar grandes áreas (3

polegadas) de uma única camada grafeno livre de defeitos, fato confirmado através

dos espectros de Raman e imagens topográficas de AFM.

Exibimos a fabricação de um número massivo, aproximadamente 2668,

biossensores do tipo GraFETs através dos processos convencionais de fotolitografia

e deposição de metais. Sugerindo assim, a possibilidade de incorporação destes tipos

de biossensores em uma escala industrial, visando o desenvolvimento de sensores

para análises clínicas.

Demonstramos pela primeira vez, através da funcionalização da superfície

do grafeno com a p-mercaptopiridina, a imobilização de uma elevada densidade de

nanopartículas de ouro sobre o grafeno, de forma estável e homogênea, sem a

introdução de defeitos na estrutura do grafeno, comprovado através dos espectros

Raman.

A proteína A se demonstrou um agente de ligação ideal para a imobilização

direta e orientada de anticorpos sobre o grafeno, bem como, sobre as nanopartículas

de ouro. Desse modo, a proteína A contribuiu para a manutenção da atividade dos

anticorpos, que se refletiu diretamente na elevada sensibilidade elétrica dos

biossensores.

Assim, aliando a elevada área superficial do grafeno, com as suas

propriedades elétricas diferenciadas, bem como o emprego das nanopartículas de

ouro e da proteína A, como agente de imobilização dos anticorpos sobre estas, foi

possível demonstrar pela primeira vez o desenvolvimento de um sensor altamente

sensível para a detecção do biomarcador de câncer de mama HER-2, sendo possível

detectar concentrações de até 500fg mL-1 (5,17 fmol L-1), fato ainda não reportado na

125

Silva, C. C. C CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS Tese de Doutorado

literatura. Neste sentido o biossensor desenvolvido neste trabalho, possui

sensibilidade elétrica mais do que a necessária para determinar os níveis da proteína

HER-2 encontrados em fluídos corporais, tanto para o diagnóstico precoce do câncer

de mama, quanto para o monitoramento de pacientes que se encontram em fase de

tratamento, permitindo assim, uma avaliação da eficácia deste.

Como perspectivas deste trabalho nós buscamos empregar os sensores

GraFETs para a detecção simultânea de outros biomarcadores de câncer de mama,

já que nem todas as pessoas expressam um mesmo tipo de biomarcador, conferindo

assim uma maior confiabilidade no diagnóstico precoce desta doença. Além disso, o

fato do grafeno ser um material bidimensional e altamente flexível, permite que os

sensores GraFETs, sejam fabricados em substratos plásticos, como a poliimida,

visando assim o desenvolvimento de dispositivos descartáveis, de baixo custo e que

poderiam ser implantáveis nas camadas epiteliais mais externas e permitindo assim

um monitoramento contínuo de tais biomarcadores.

126

Silva, C. C. C REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Tese de Doutorado

6. CAPÍTULO VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 Patolsky, F., Zheng, G. & Lieber, C. M. Nanowire-based biosensors. Analytical chemistry 78, 4260-4269 (2006).

2 Novoselov, K. S. et al. Electric field effect in atomically thin carbon films. Science 306, 666-669 (2004).

3 Castro Neto, A. H., Guinea, F., Peres, N. M. R., Novoselov, K. S. & Geim, A. K. The electronic properties of graphene. Reviews of Modern Physics 81, 109-162 (2009).

4 Ratinac, K. R., Yang, W., Gooding, J. J., Thordarson, P. & Braet, F. Graphene and Related Materials in Electrochemical Sensing. Electroanalysis 23, 803-826 (2011).

5 Geim, A. K. & Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nature materials 6, 183-191 (2007).

6 Cooper, D. R. et al. Experimental Review of Graphene. ISRN Condensed Matter Physics 2012, 56 (2012).

7 Novoselov, K. S. et al. Two-dimensional gas of massless Dirac fermions in graphene. Nature 438, 197-200 (2005).

8 Chen, D., Tang, L. & Li, J. Graphene-based materials in electrochemistry. Chemical Society reviews 39, 3157-3180 (2010).

9 Yang, W. et al. Carbon Nanomaterials in Biosensors: Should You Use Nanotubes or Graphene? Angewandte Chemie International Edition 49, 2114-2138 (2010).

10 Allen, M. J., Tung, V. C. & Kaner, R. B. Honeycomb carbon: a review of graphene. Chemical reviews 110, 132-145 (2010).

11 Mattevi, C., Kim, H. & Chhowalla, M. A review of chemical vapour deposition of graphene on copper. Journal of Materials Chemistry 21, 3324-3334 (2011).

12 Muñoz, R. & Gómez-Aleixandre, C. Review of CVD Synthesis of Graphene. Chemical Vapor Deposition 19, 297-322 (2013).

13 Lenz-Solomun, P., Wu, M.-C. & Goodman, D. W. Methane coupling at low temperatures on Ru(0001) and Ru(11¯20) catalysts. Catal Lett 25, 75-86 (1994).

127


14 Zhang, Y., Zhang, L. & Zhou, C. Review of chemical vapor deposition of graphene and related applications. Accounts of chemical research 46, 2329-2339 (2013).

15 Li, X. et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science 324, 1312-1314 (2009).

16 Li, X. et al. Transfer of large-area graphene films for high-performance transparent conductive electrodes. Nano letters 9, 4359-4363 (2009).

17 Suk, J. W. et al. Transfer of CVD-grown monolayer graphene onto arbitrary substrates. ACS nano 5, 6916-6924 (2011).

18 Butt, M. Z. Effect of Hydrogen Attack on the Strength of High-Purity Copper. J Mater Sci Lett 2, 1-2 (1983).

19 Bae, S. et al. Roll-to-roll production of 30-inch graphene films for transparent electrodes. Nat Nanotechnol 5, 574-578 (2010).

20 Lee, Y. et al. Wafer-Scale Synthesis and Transfer of Graphene Films. Nano letters 10, 490-493 (2010).

21 Wofford, J. M., Nie, S., McCarty, K. F., Bartelt, N. C. & Dubon, O. D. Graphene Islands on Cu Foils: The Interplay between Shape, Orientation, and Defects. Nano letters 10, 4890-4896 (2010).

22 Zhao, L. et al. Influence of copper crystal surface on the CVD growth of large area monolayer graphene. Solid State Commun 151, 509-513 (2011).

23 Lupina, G. et al. Residual Metallic Contamination of Transferred Chemical Vapor Deposited Graphene. ACS nano 9, 4776-4785 (2015).

24 Torsi, L., Magliulo, M., Manoli, K. & Palazzo, G. Organic field-effect transistor sensors: a tutorial review. Chemical Society reviews 42, 8612-8628 (2013).

25 Cramer, T. et al. Water-gated organic field effect transistors - opportunities for biochemical sensing and extracellular signal transduction. J Mater Chem B 1, 3728-3741 (2013).

26 Heller, I. et al. Influence of Electrolyte Composition on Liquid-Gated Carbon Nanotube and Graphene Transistors. J Am Chem Soc 132, 17149-17156 (2010).

27 van der Schoot, B. H. & Bergveld, P. ISFET based enzyme sensors. Biosensors 3, 161-186 (1987).

128


28 Hess, L. H., Seifert, M. & Garrido, J. A. Graphene Transistors for Bioelectronics. P Ieee 101, 1780-1792 (2013).

29 Chen, F., Qing, Q., Xia, J. L. & Tao, N. J. Graphene Field-Effect Transistors: Electrochemical Gating, Interfacial Capacitance, and Biosensing Applications. Chem-Asian J 5, 2144-2153 (2010).

30 Yan, F., Zhang, M. & Li, J. Solution-gated graphene transistors for chemical and biological sensors. Advanced healthcare materials 3, 313-331 (2014).

31 Wang, J. Analytical Electrochemistry. Third Edition edn, 250 (John Wiley &Sons, Inc., 2006).

32 Ticianelli, E. G., Ernesto. Eletroquímica. 2º Edição edn, (Edusp).

33 <http://wandlowski.dcb.unibe.ch/research/edl.html> (

34 Netz, R. R. Water and ions at interfaces. Current Opinion in Colloid & Interface Science 9, 192-197 (2004).

35 Stine, R., Mulvaney, S. P., Robinson, J. T., Tamanaha, C. R. & Sheehan, P. E. Fabrication, Optimization, and Use of Graphene Field Effect Sensors. Analytical chemistry 85, 509-521 (2013).

36 Du, X., Guo, H., Jin, Y., Jin, Q. & Zhao, J. Electrochemistry Investigation on the Graphene/Electrolyte Interface. Electroanalysis, n/a-n/a (2015).

37 Xia, J. L., Chen, F., Li, J. H. & Tao, N. J. Measurement of the quantum capacitance of graphene. Nat Nanotechnol 4, 505-509 (2009).

38 Mackin, C. et al. A Current-Voltage Model for Graphene Electrolyte-Gated Field-Effect Transistors. Ieee T Electron Dev 61, 3971-3977 (2014).

39 Fang, T., Konar, A., Xing, H. L. & Jena, D. Carrier statistics and quantum capacitance of graphene sheets and ribbons. Appl Phys Lett 91 (2007).

40 Ji, H. X. et al. Capacitance of carbon-based electrical double-layer capacitors. Nat Commun 5 (2014).

41 Bonthuis, D. J., Gekle, S. & Netz, R. R. Dielectric Profile of Interfacial Water and its Effect on Double-Layer Capacitance. Phys Rev Lett 107 (2011).

42 Schwierz, N., Horinek, D. & Netz, R. R. Reversed Anionic Hofmeister Series: The interplay of Surface Charge and Surface Polarity. Langmuir 26, 7370-7379 (2010).

http://wandlowski.dcb.unibe.ch/research/edl.html

129


43 Yan, F. & Tang, H. Application of thin-film transistors in label-free DNA biosensors. Expert Rev Mol Diagn 10, 547-549 (2010).

44 Lin, P. & Yan, F. Organic Thin-Film Transistors for Chemical and Biological Sensing. Adv Mater 24, 34-51 (2012).

45 Pinto, A. M., Goncalves, I. C. & Magalhaes, F. D. Graphene-based materials biocompatibility: a review. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces 111, 188-202 (2013).

46 Ang, P. K. et al. Flow sensing of single cell by graphene transistor in a microfluidic channel. Nano letters 11, 5240-5246 (2011).

47 Hess, L. H. et al. Electrical Coupling Between Cells and Graphene Transistors. Small 11, 1703-1710 (2015).

48 Mannoor, M. S. et al. Graphene-based wireless bacteria detection on tooth enamel. Nat Commun 3, 763 (2012).

49 Wujcik, E. K. & Monty, C. N. Nanotechnology for implantable sensors: carbon nanotubes and graphene in medicine. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology 5, 233-249 (2013).

50 Mohanty, N. & Berry, V. Graphene-Based Single-Bacterium Resolution Biodevice and DNA Transistor: Interfacing Graphene Derivatives with Nanoscale and Microscale Biocomponents. Nano letters 8, 4469-4476 (2008).

51 Huang, Y. X., Dong, X. C., Liu, Y. X., Li, L. J. & Chen, P. Graphene-based biosensors for detection of bacteria and their metabolic activities. Journal of Materials Chemistry 21, 12358-12362 (2011).

52 He, R. X. et al. Solution-Gated Graphene Field Effect Transistors Integrated in Microfluidic Systems and Used for Flow Velocity Detection. Nano letters 12, 1404-1409 (2012).

53 Dankerl, M. et al. Graphene Solution-Gated Field-Effect Transistor Array for Sensing Applications. Adv Funct Mater 20, 3117-3124 (2010).

54 Wehling, T. O. et al. Molecular doping of graphene. Nano letters 8, 173-177 (2008).

55 Liu, H., Liu, Y. & Zhu, D. Chemical doping of graphene. Journal of materials chemistry 21, 3335-3345 (2011).

56 Dong, X. et al. Doping Single-Layer Graphene with Aromatic Molecules. Small 5, 1422-1426 (2009).

130


57 Jiang, D.-e. & Chen, Z. Graphene chemistry: theoretical perspectives. (John Wiley & Sons, 2013).

58 Chen, R. J. et al. An investigation of the mechanisms of electronic sensing of protein adsorption on carbon nanotube devices. J Am Chem Soc 126, 1563-1568 (2004).

59 Liu, Y. X., Dong, X. C. & Chen, P. Biological and chemical sensors based on graphene materials. Chemical Society reviews 41, 2283-2307 (2012).

60 Schedin, F. et al. Detection of individual gas molecules adsorbed on graphene. Nature materials 6, 652-655 (2007).

61 Adam, S., Hwang, E. H., Galitski, V. M. & Das Sarma, S. A self-consistent theory for graphene transport. P Natl Acad Sci USA 104, 18392-18397 (2007).

62 Ang, P. K., Chen, W., Wee, A. T. & Loh, K. P. Solution-gated epitaxial graphene as pH sensor. J Am Chem Soc 130, 14392-14393 (2008).

63 Dong, X., Shi, Y., Huang, W., Chen, P. & Li, L. J. Electrical detection of DNA hybridization with single-base specificity using transistors based on CVD-grown graphene sheets. Adv Mater 22, 1649-1653 (2010).

64 Zhang, M. et al. Highly sensitive glucose sensors based on enzyme-modified whole-graphene solution-gated transistors. Scientific reports 5, 8311 (2015).

65 Ohno, Y., Maehashi, K., Yamashiro, Y. & Matsumoto, K. Electrolyte-gated graphene field-effect transistors for detecting pH and protein adsorption. Nano letters 9, 3318-3322 (2009).

66 Mao, S., Yu, K., Lu, G. & Chen, J. Highly sensitive protein sensor based on thermally-reduced graphene oxide field-effect transistor. Nano Res 4, 921-930 (2011).

67 Yang, M. & Gong, S. Immunosensor for the detection of cancer biomarker based on percolated graphene thin film. Chemical communications 46, 5796-5798 (2010).

68 Fu, W. et al. Graphene transistors are insensitive to pH changes in solution. Nano letters 11, 3597-3600 (2011).

69 Yin, Z. et al. Real-time DNA detection using Pt nanoparticle-decorated reduced graphene oxide field-effect transistors. Nanoscale 4, 293-297 (2012).

131


70 Zheng, C. et al. Fabrication of Ultrasensitive Field-Effect Transistor DNA Biosensors by a Directional Transfer Technique Based on CVD-Grown Graphene. ACS Appl Mater Interfaces 7, 16953-16959 (2015).

71 Kwak, Y. H. et al. Flexible glucose sensor using CVD-grown graphene-based field effect transistor. Biosens Bioelectron 37, 82-87 (2012).

72 Saltzgaber, G. et al. Scalable graphene field-effect sensors for specific protein detection. Nanotechnology 24, 355502 (2013).

73 Farid, S. et al. Detection of Interferon gamma using graphene and aptamer based FET-like electrochemical biosensor. Biosens Bioelectron 71, 294-299 (2015).

74 He, Q. et al. Centimeter-long and large-scale micropatterns of reduced graphene oxide films: fabrication and sensing applications. ACS nano 4, 3201-3208 (2010).

75 Yin, P. T., Shah, S., Chhowalla, M. & Lee, K. B. Design, synthesis, and characterization of graphene-nanoparticle hybrid materials for bioapplications. Chemical reviews 115, 2483-2531 (2015).

76 Yin, P. T., Kim, T. H., Choi, J. W. & Lee, K. B. Prospects for graphene-nanoparticle-based hybrid sensors. Phys Chem Chem Phys 15, 12785-12799 (2013).

77 Mao, S., Lu, G., Yu, K., Bo, Z. & Chen, J. Specific protein detection using thermally reduced graphene oxide sheet decorated with gold nanoparticle-antibody conjugates. Adv Mater 22, 3521-3526 (2010).

78 Jain, P. K., Huang, X., El-Sayed, I. H. & El-Sayed, M. A. Noble Metals on the Nanoscale: Optical and Photothermal Properties and Some Applications in Imaging, Sensing, Biology, and Medicine. Accounts of chemical research 41, 1578-1586 (2008).

79 Eustis, S. & el-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society reviews 35, 209-217 (2006).

80 Tjoa, V., Jun, W., Dravid, V., Mhaisalkar, S. & Mathews, N. Hybrid graphene-metal nanoparticle systems: electronic properties and gas interaction. Journal of Materials Chemistry 21, 15593-15599 (2011).

81 Murphy, C. J. et al. Gold nanoparticles in biology: beyond toxicity to cellular imaging. Accounts of chemical research 41, 1721-1730 (2008).

132


82 Sperling, R. A., Gil, P. R., Zhang, F., Zanella, M. & Parak, W. J. Biological applications of gold nanoparticles. Chemical Society reviews 37, 1896-1908 (2008).

83 Lee, K. et al. Effects of Gold Nanoparticles on Pentacene Organic Field-Effect Transistors. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 5 (2011).

84 Kim, D. J. et al. Electrical graphene aptasensor for ultra-sensitive detection of anthrax toxin with amplified signal transduction. Small 9, 3352-3360 (2013).

85 Portal do Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva (INCA), <http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/mama/cancer_mama> (

86 Weigel, M. T. & Dowsett, M. Current and emerging biomarkers in breast cancer: prognosis and prediction. Endocrine-related cancer 17, R245-262 (2010).

87 Bohunicky, B. & Mousa, S. A. Biosensors: the new wave in cancer diagnosis. Nanotechnology, science and applications 4, 1-10 (2010).

88 Buitrago, F., Uemura, G. & Sena, M. C. F. Fatores prognósticos em câncer de mama. Comun. ciênc. saúde 22, 69-81 (2011).

89 Carney, W. P., Leitzel, K., Ali, S., Neumann, R. & Lipton, A. HER-2/neu diagnostics in breast cancer. Breast cancer research : BCR 9, 207 (2007).

90 Carney, W. P. et al. Monitoring the circulating levels of the HER2/neu oncoprotein in breast cancer. Clinical breast cancer 5, 105-116 (2004).

91 Souder, C. et al. Serum epidermal growth factor receptor/HER-2 predicts poor survival in patients with metastatic breast cancer. Cancer 107, 2337-2345 (2006).

92 <http://www.exame-aracatuba.com.br/informativos/boletim1006/cancer_mama.htm> (

93 Schiess, R., Wollscheid, B. & Aebersold, R. Targeted proteomic strategy for clinical biomarker discovery. Molecular oncology 3, 33-44 (2009).

94 Imoto, S., Kitoh, T. & Hasebe, T. Serum c-erbB-2 Levels in Monitoring of Operable Breast Cancer Patients. Japanese Journal of Clinical Oncology 29, 336-339 (1999).

95 Carney, W. P. et al. Potential Clinical Utility of Serum HER-2/neu Oncoprotein Concentrations in Patients with Breast Cancer. Clinical Chemistry 49, 1579-1598 (2003).

http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/mama/cancer_mama

http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/mama/cancer_mama

http://www.exame-aracatuba.com.br/informativos/boletim1006/cancer_mama.htm

http://www.exame-aracatuba.com.br/informativos/boletim1006/cancer_mama.htm

133


96 Fehm, T., Gebauer, G. & Jäger, W. Clinical Utility of Serial Serum c-erbB-2 Determinations in the Follow-up of Breast Cancer Patients. Breast Cancer Res Treat 75, 97-106 (2002).

97 Isola, J. J., Holli, K., Oksa, H., Teramoto, Y. & Kallioniemi, O.-P. Elevated erbB-2 oncoprotein levels in preoperative and follow-up serum samples define an aggressive disease course in patients with breast cancer. Cancer 73, 652-658 (1994).

98 Varella, D. O RISCO DO CÂNCER DE MAMA, <http://drauziovarella.com.br/mulher-2/cancer-de-mama/o-risco-do-cancer-de-mama/> (

99 Chandra, P., Suman, P., Mukherjee, M. & Kumar, P. HER2 Protein Biomarker Based Sensor Systems for Breast Cancer Diagnosis. J Mol Biomark Diagn 5, e119 (2013).

100 Ross, J. S. & Fletcher, J. A. The HER-2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predictive Factor, and Target for Therapy. STEM CELLS 16, 413-428 (1998).

101 Ramos-Vara, J. A. & Miller, M. A. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary pathology 51, 42-87 (2014).

102 Mack, C. Fundamental principles of optical lithography: the science of microfabrication. (John Wiley & Sons, 2008).

103 Xia, Y. & Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition 37, 550-575 (1998).

104 Wan, X., Chen, K. & Xu, J. Interface engineering for CVD graphene: current status and progress. Small 10, 4443-4454 (2014).

105 van der Zande, A. M. et al. Grains and grain boundaries in highly crystalline monolayer molybdenum disulphide. Nature materials 12, 554-561 (2013).

106 Martin, M. N., Basham, J. I., Chando, P. & Eah, S. K. Charged gold nanoparticles in non-polar solvents: 10-min synthesis and 2D self-assembly. Langmuir 26, 7410-7417 (2010).

107 Chen, R. J., Zhang, Y., Wang, D. & Dai, H. Noncovalent Sidewall Functionalization of Single-Walled Carbon Nanotubes for Protein Immobilization. J Am Chem Soc 123, 3838-3839 (2001).

108 Liu, N. et al. The origin of wrinkles on transferred graphene. Nano Res 4, 996-1004 (2011).

http://drauziovarella.com.br/mulher-2/cancer-de-mama/o-risco-do-cancer-de-mama/

http://drauziovarella.com.br/mulher-2/cancer-de-mama/o-risco-do-cancer-de-mama/

134


109 Zhu, W. et al. Structure and Electronic Transport in Graphene Wrinkles. Nano letters 12, 3431-3436 (2012).

110 Blake, P. et al. Making graphene visible. Appl Phys Lett 91, 063124 (2007).

111 Park, H., Brown, P. R., Bulović, V. & Kong, J. Graphene As Transparent Conducting Electrodes in Organic Photovoltaics: Studies in Graphene Morphology, Hole Transporting Layers, and Counter Electrodes. Nano letters 12, 133-140 (2012).

112 Bhaviripudi, S., Jia, X., Dresselhaus, M. S. & Kong, J. Role of kinetic factors in chemical vapor deposition synthesis of uniform large area graphene using copper catalyst. Nano letters 10, 4128-4133 (2010).

113 Reina, A. et al. Large Area, Few-Layer Graphene Films on Arbitrary Substrates by Chemical Vapor Deposition. Nano letters 9, 30-35 (2009).

114 Malard, L., Pimenta, M., Dresselhaus, G. & Dresselhaus, M. Raman spectroscopy in graphene. Physics Reports 473, 51-87 (2009).

115 Dresselhaus, M. S., Jorio, A., Hofmann, M., Dresselhaus, G. & Saito, R. Perspectives on carbon nanotubes and graphene Raman spectroscopy. Nano letters 10, 751-758 (2010).

116 Jorio, A., Saito, R., Dresselhaus, G. & Dresselhaus, M. S. in Raman Spectroscopy in Graphene Related Systems 1-15 (Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2011).






135



123 Ferrari, A. C. Raman spectroscopy of graphene and graphite: Disorder, electron–phonon coupling, doping and nonadiabatic effects. Solid State Commun 143, 47-57 (2007).

124 Ferrari, A. C. & Basko, D. M. Raman spectroscopy as a versatile tool for studying the properties of graphene. Nat Nano 8, 235-246 (2013).

125 Liu, W., Wei, J., Sun, X. & Yu, H. A Study on Graphene—Metal Contact. Crystals 3, 257 (2013).

126 Xia, F., Perebeinos, V., Lin, Y. M., Wu, Y. & Avouris, P. The origins and limits of metal-graphene junction resistance. Nat Nanotechnol 6, 179-184 (2011).

127 Huang, B.-C., Zhang, M., Wang, Y. & Woo, J. Contact resistance in top-gated graphene field-effect transistors. Appl Phys Lett 99, 032107 (2011).

128 Knoch, J., Zhihong, C. & Appenzeller, J. Properties of Metal–Graphene Contacts. Nanotechnology, IEEE Transactions on 11, 513-519 (2012).

129 Yanqing, W., Farmer, D. B., Fengnian, X. & Avouris, P. Graphene Electronics: Materials, Devices, and Circuits. P Ieee 101, 1620-1637 (2013).

130 Silva Jr., A. Í. d., Araújo Filho, H. d. C. & Silva, R. C. Testes de desempenho de eletrodos: eletrodos de referência. Química Nova 23, 512-517 (2000).

131 Bard, A. J. & Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. (Wiley, 2000).

132 Hess, L. H. et al. High-transconductance graphene solution-gated field effect transistors. Appl Phys Lett 99 (2011).

133 Light, T. S. Standard solution for redox potential measurements. Analytical chemistry 44, 1038-1039 (1972).

134 Reiss, H. & Heller, A. The absolute potential of the standard hydrogen electrode: a new estimate. The Journal of Physical Chemistry 89, 4207-4213 (1985).

135 Giovannetti, G. et al. Doping graphene with metal contacts. Phys Rev Lett 101, 026803 (2008).

136 Sze, S. M. & Ng, K. K. Physics of semiconductor devices. (John Wiley & Sons, 2006).

136


137 Lin, Y.-M. et al. Operation of Graphene Transistors at Gigahertz Frequencies. Nano letters 9, 422-426 (2009).

138 Lee, M. H. et al. Apparent pH sensitivity of solution-gated graphene transistors. Nanoscale 7, 7540-7544 (2015).

139 Scott, T. A. The concise encyclopedia of biochemistry. Biochemical Education 16, 208-210 (1988).

140 Bradley, K., Briman, M., Star, A. & Grüner, G. Charge Transfer from Adsorbed Proteins. Nano letters 4, 253-256 (2004).

141 HER2 (human), <http://www.phosphosite.org/proteinAction.do?id=1580&showAllSites=true> (2013).

142 Björk, I., Petersson, B.-Å. & Sjöquist, J. Some Physicochemical Properties of Protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry 29, 579-584 (1972).

143 Langone, J. J. Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumonococci. Advances in immunology 32, 157-252 (1982).

144 Lu, B., Smyth, M. R. & OKennedy, R. Oriented immobilization of antibodies and its applications in immunoassays and immunosensors. The Analyst 121, R29-R32 (1996).

145 Raj, R., Maroo, S. C. & Wang, E. N. Wettability of graphene. Nano letters 13, 1509-1515 (2013).

146 Kim, K. S. et al. Chemical vapor deposition-grown graphene: the thinnest solid lubricant. ACS nano 5, 5107-5114 (2011).

147 Li, Z. et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nature materials 12, 925-931 (2013).

148 Deraedt, C. et al. Sodium borohydride stabilizes very active gold nanoparticle catalysts. Chemical communications 50, 14194-14196 (2014).

149 Daniel, M. C. & Astruc, D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical reviews 104, 293-346 (2004).

150 Muszynski, R., Seger, B. & Kamat, P. V. Decorating Graphene Sheets with Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C 112, 5263-5266 (2008).

http://www.phosphosite.org/proteinAction.do?id=1580&showAllSites=true

137


151 Wang, W. et al. Synthesis of Gold Nanoparticles with Graphene Oxide. Journal of Nanoscience and Nanotechnology 14, 3412-3416 (2014).

152 Park, J. et al. A general method for the fabrication of graphene-nanoparticle hybrid material. Chemical communications 51, 2882-2885 (2015).

153 Georgakilas, V. et al. Functionalization of graphene: covalent and non-covalent approaches, derivatives and applications. Chemical reviews 112, 6156-6214 (2012).

154 Voloshina, E. N., Mollenhauer, D., Chiappisi, L. & Paulus, B. Theoretical study on the adsorption of pyridine derivatives on graphene. Chemical Physics Letters 510, 220-223 (2011).

155 Pearson, R. G. Hard and Soft Acids and Bases. J Am Chem Soc 85, 3533-3539 (1963).

156 Zhang, H.-L., Evans, S. D., Henderson, J. R., Miles, R. E. & Shen, T. Spectroscopic Characterization of Gold Nanoparticles Passivated by Mercaptopyridine and Mercaptopyrimidine Derivatives. The Journal of Physical Chemistry B 107, 6087-6095 (2003).

157 Energy table for EDS analysis, <http://www.jeolusa.com/DesktopModules/Bring2mind/DMX/Download.aspx?EntryId=386&Command=Core_Download&PortalId=2&TabId=320> (

158 Horisberger, M. & Clerc, M. F. Labeling of Colloidal Gold with Protein-a - a Quantitative Study. Histochemistry 82, 219-223 (1985).

159 Huang, Y., Pitter, M. C. & Somekh, M. G. Morphology-dependent voltage sensitivity of a gold nanostructure. Langmuir 27, 13950-13961 (2011).

160 Mucelli, S. P., Zamuner, M., Tormen, M., Stanta, G. & Ugo, P. Nanoelectrode ensembles as recognition platform for electrochemical immunosensors. Biosensors and Bioelectronics 23, 1900-1903 (2008).

161 Gruhl, F. J., Rapp, M. & Länge, K. Label-free detection of breast cancer marker HER-2/neu with an acoustic biosensor. Procedia Engineering 5, 914-917 (2010).

162 Eletxigerra, U. et al. Amperometric magnetoimmunosensor for ErbB2 breast cancer biomarker determination in human serum, cell lysates and intact breast cancer cells. Biosens Bioelectron 70, 34-41 (2015).

http://www.jeolusa.com/DesktopModules/Bring2mind/DMX/Download.aspx?EntryId=386&Command=Core_Download&PortalId=2&TabId=320

http://www.jeolusa.com/DesktopModules/Bring2mind/DMX/Download.aspx?EntryId=386&Command=Core_Download&PortalId=2&TabId=320

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