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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
THALITA FERNANDA ARAUJO
ESTUDOS FENOTÍPICOS DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Leishmania infantum
CAMPINAS
2019
THALITA FERNANDA ARAUJO
ESTUDOS FENOTÍPICOS DE ISOLADOS CLÍNICOS DE Leishmania infantum
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biologia da Universidade Estadual
de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestra
em Biologia Animal na área de Relações
Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA THALITA FERNANDA ARAUJO
E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SELMA GIORGIO
Orientadora: SELMA GIORGIO
CAMPINAS
2019
Campinas, 24 de maio de 2019.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Selma Giorgio (orientadora)
Prof. Dr. Carlos Emilio Levy
Profa. Dra. Adriana Degrossoli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha mãe (in memoriam), ao meu pai (in memoriam), e minha
família que sempre me apoiaram.
“Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes,
mas não esqueço de que minha vida é a maior empresa do mundo.
E que posso evitar que ela vá à falência. Ser feliz é reconhecer que vale a pena
viver, apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de crise. Ser feliz é
deixar de ser vítima dos problemas e se tornar autor da própria história. É atravessar
desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma.
É agradecer a Deus a cada manhã pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos
próprios sentimentos. É saber falar de si mesmo. É ter coragem para ouvir um “não”.
É ter segurança para receber uma crítica, mesmo que injusta”.
Augusto Cury
AGRADECIMENTOS
A Deus, que me fortalece todos os dias.
Agradeço a CAPES, sendo que o presente trabalho foi realizado com apoio da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) -
Código de Financiamento 001.
À Profa. Dra. Selma Giorgio, que me deu a oportunidade de estar desempenhando
esse projeto, ensinando e orientando com dedicação e incentivo.
À minha família e amigos que me apoiaram nessa jornada em busca de uma
realização profissional, e que em tantos momentos de dificuldade ficaram ao meu lado
encorajando-me para não desistir.
Aos meus colegas de laboratório que tanto me ensinaram, ajudaram e tornaram os
dias mais leves e divertidos.
Aos colaborados desse trabalho pelo material fornecido e pela parceria nos
experimentos.
Aos funcionários do departamento de Biologia Animal e do Laboratório de Doenças
Tropicais pela ajuda no que foi possível.
A essa banca examinadora e suplentes.
Aos animais que foram utilizados nesse trabalho, meu respeito e gratidão.
RESUMO
A leishmaniose visceral no Brasil é uma doença causada pelo protozoário Leishmania
infantum, afetando o homem e o cão. Os cães infectados são apontados como o
principal reservatório de L. infantum em áreas urbanas. Devido às pressões seletivas
distintas sofridas pelos isolados de L. infantum podem ocorrer diferentes fenótipos do
parasita. A existência desses diferentes fenótipos terá consequências na resistência
aos fármacos, infectividade e patogenicidade. Nesse trabalho isolamos dois parasitas
provenientes de casos de leishmaniose visceral de paciente humano do Hospital das
Clínicas da UNICAMP e de cão proveniente da Superintendência de Controle de
Endemias – SP, identificamos as espécies, comparamos a morfologia dos
promastigotas, capacidade proliferativa e infectiva, e susceptibilidade a fármacos
desses isolados clínicos para a análise do perfil fenotípico. Através da metodologia da
PCR mostrou-se que os dois isolados clínicos de Leishmania, pertencem a mesma
espécie (L. infantum). Como parasita referência de todos os ensaios, utilizamos a L.
infantum MHOM/BR/1972/LD proveniente de caso clínico humano. Na comparação
morfológica do tamanho dos promastigotas não observamos diferenças significativas
entre os isolados clínicos e o parasita referência. Nos ensaios de infectividade,
macrófagos de origem humana da linhagem THP1 e canina da linhagem DH82 foram
infectados nas proporções macrófago:parasita, 1:10 e 1:20, no período de 24 e 48
horas, e camundongos BALB/c foram inoculados com 2x106 promastigotas. Os
resultados indicaram que os isolados clínicos e o parasita referência infectam
macrófagos humano e canino, observando-se formas amastigotas intracelulares.
Camundongos BALB/c foram igualmente infectados, analisados pela histopatologia e
carga parasitária. Não há diferença significativa entre os isolados clínicos e o parasita
referência no padrão histopatológico e de carga parasitária. Em relação a
susceptibilidade aos fármacos analisada no modelo in vitro concluímos que os
parasitas são igualmente susceptíveis a anfotericina B, miltefosina e ao antimoniato
de meglumina.
Palavras-chave: Leishmania infantum, leishmaniose visceral, leishmaniose visceral
canina.
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis in Brazil is a disease caused by the protozoan Leishmania
infantum, infecting man and dog. The infected dogs are designated as the main
reservoir of L. infantum in urban areas. Due to the different selective pressures of L.
infantum isolates, different parasite phenotypes may occur. The existence of these
different phenotypes will have consequences on drug resistance, infectivity and
pathogenicity. In this work, we isolated two parasites from cases of visceral
leishmaniasis one of them was isolated from a human patient of the Clinicals Hospital
of UNICAMP and another clinical isolate was obtained from a dog of Endemics Control
Superintendence - SP, identified the species, compared the morphology of
promastigotes, proliferative and infective capacity, and susceptibility to drugs of these
clinical isolates for the analysis of the phenotypic profile. With the methodology of the
PCR it was shown that the two clinical isolates of Leishmania are L. infantum. As a
reference parasite of all the trials, we used L. infantum MHOM/BR/1972/LD from a
human clinical case. In the morphological comparison of promastigote size, we did not
observe significant differences between clinical isolates and reference parasite. In the
infectivity assays, human macrophages THP1 and canine macrophages DH82 were
infected in the macrophage:parasite, 1:10 and 1:20 ratios in the 24 and 48 hour period,
and BALB/c mice were inoculated with 2x106 promastigotes. The results indicated that
the clinical isolates and the reference parasite infect human and canine macrophages,
observing intracellular amastigote forms. BALB/c mice were also infected, analyzed by
histopathology and parasite load. Was evaluated no significant difference between
clinical isolates and the reference parasite in the histopathological and parasitic load
pattern. Regarding drug susceptibility, we conclude that the parasites are similarly
susceptible to drugs used (amphotericin B, miltefosine and meglumine antimoniate).
Key words: Leishmania infantum, visceral leishmaniasis, canine visceral
leishmaniasis.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 11
1.1. Histórico ....................................................................................................... 11
1.2. Ciclo de vida ................................................................................................. 11
1.3. Leishmanioses ............................................................................................. 13
1.4. Leishmaniose Visceral ................................................................................. 14
1.5. Leishmaniose visceral humana .................................................................... 16
1.6. Leishmaniose visceral canina ...................................................................... 17
1.7. Medidas profiláticas e tratamento ................................................................ 18
1.8. Isolados clínicos de L. infantum ................................................................... 20
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 23
3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 24
3.1. Objetivo Geral .............................................................................................. 24
3.2. Objetivos específicos ................................................................................... 24
4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 25
4.1. Camundongos .............................................................................................. 25
4.2. Parasitas ...................................................................................................... 25
4.3. Isolados clínicos ........................................................................................... 25
4.4. Linhagens celulares ..................................................................................... 26
4.5. Análise por PCR dos isolados clínicos ......................................................... 27
4.6. Manutenção in vitro e congelamento de L. infantum .................................... 27
4.7. Ensaio de proliferação dos promastigotas ................................................... 28
4.8. Análise morfométrica dos promastigotas ..................................................... 28
4.9. Ensaio e monitoramento da infecção dos macrófagos com L. infantum ...... 28
4.10. Testes com fármacos ................................................................................... 29
4.11. Infecção de camundongos com L. infantum ................................................. 30
4.12. Análise histopatológica ................................................................................. 30
4.13. Análise da carga parasitária ......................................................................... 30
4.14. Análise estatística ........................................................................................ 31
5. RESULTADOS ................................................................................................... 32
5.1. Isolados clínicos ........................................................................................... 32
5.2. Identificação dos isolados clínicos ............................................................... 33
5.3. Curva de proliferação celular dos promastigotas de L. infantum .................. 34
5.4. Medidas de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis ....................... 35
5.5. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em macrófagos. ... 36
5.6. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em camundongo. ... 44
5.7. Susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos anti-Leishmania ........ 48
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 59
CONCLUSÃO ............................................................................................................ 66
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 67
ANEXOS ................................................................................................................... 81
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. Histórico
Os parasitas Leishmania pertencem ao Reino Protista (Haeckel, 1866), Classe
Kinetoplastea (Honigberg, 1963 emend. Vickerman, 1976), Subclasse
Metakinetoplastina (Vickerman, 2004), Ordem Trypanosomatida (Kent, 1880), Família
Trypanosomatidae (Döflein, 1901), Subfamília Leishmaniinae (Maslov e Lukeš 2012)
e Gênero Leishmania (Ross, 1903) (AKHOUNDI et al., 2016).
Na literatura existem relatos da existência de espécies semelhantes a
Leishmania em tempos pré-históricos e documentada em dois fósseis de
invertebrados, que apresentavam as formas promastigotas e amastigotas do parasita
(STEVERDING, 2017). A primeira observação da Leishmania foi feita por Cunnignham
em 1885. O parasito foi identificado no início do século XX, quando William Leishman
encontrou o protozoário no baço de um soldado indiano e Donovan, em 1903, foi o
responsável pela primeira publicação. Em 1903, Ross criou o gênero Leishmania e
denominou Leishmania donovani o agente causador do calazar (do indostão, Kala-
azar, onde kala significa negro, e azar, doença). No Brasil, o primeiro a relatar a
doença e a suspeitar do papel dos flebotomíneos como vetores foi Cerqueira em 1885,
na Bahia (GONTIJO; CARVALHO, 2003). A espécie foi descrita como Leishmania
infantum por Nicole (1908) e Cunha e Chagas (1937) descreveram a espécie
Leishmania chagasi como causadora da leishmaniose visceral na América. De acordo
com Mauricio; Stothard; Miles (2000), pesquisas moleculares comprovam que L.
chagasi e L. infantum são sinonímias.
1.2. Ciclo de vida
O ciclo de vida da Leishmania é classificado como heteróxeno, necessitando
de hospedeiros vertebrado e invertebrado. O protozoário apresenta dois estágios:
promastigotas, com corpo alongado e flagelo, são móveis e encontrados no interior
12
do trato digestivo dos flebotomíneos; e amastigotas, que tem forma arredondada, sem
flagelo e vivem intracelularmente em células do sistema fagocitário mononuclear do
hospedeiro vertebrado, tais como os macrófagos (PACE, 2014).
Os hospedeiros vertebrados são infectados, quando fêmeas dos flebotomíneos
inoculam promastigotas metacíclicos, forma infectante, localizadas na parte anterior
do tubo digestivo, durante o repasto sanguíneo. Ocorre o processo de internalização
dos parasitas pelos macrófagos, ficando localizados dentro de um vacúolo
parasitóforo (HARHAY et al., 2011).
Em um período de 24 a 48 horas, os promastigotas se transformam em
amastigotas e se iniciam sucessivas multiplicações. Quando a célula hospedeira não
é capaz de realizar um controle parasitário, pode sofrer apoptose, e com sua ruptura,
há liberação dos amastigotas que são internalizados por outros macrófagos, causando
sua distribuição pelo organismo (RODRIGUES et al., 2016; PAGLIANO; ESPOSITO,
2017).
A infecção do hospedeiro invertebrado, o flebótomo, ocorre no momento do
repasto sanguíneo, ao ingerir formas amastigotas que acompanham o sangue e/ou
linfa contendo macrófagos oriundos, sobretudo, da pele. No intestino do inseto
ocorrerá a transformação dos amastigotas em promastigotas e com aproximadamente
três a quatro dias ocorre multiplicação intensa. Estes se diferenciam em promastigotas
metacíclicas, que são infectantes e se localizam na parte anterior do tubo digestivo do
vetor dando continuidade ao ciclo (HARHAY et al., 2011; VAN GRIENSVEN; DIRO,
2012) (Figura 1).
13
Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp. (1) Picadas do vetor flebotomíneos durante o repasto
sanguíneo no reservatório inoculam as formas promastigotas do parasita. (2) Promastigotas se aderem
aos macrófagos. (3) Promastigotas são fagocitados por macrófagos. (4) Promastigotas são
transformados em amastigotas dentro do vacúolo parasitóforo. (5) Proliferação dos amastigotas dentro
do vacúolo parasitóforo. (6) Lise do macrófago e liberação dos amastigotas. (7) Invasão dos
amastigotas em células de vários tecidos. (8) Infecção dos flebótomos do sangue infectado, ingerindo
células infectadas com formas amastigotas. (9) Amastigotas são transformados em formas
promastigotas procíclicos no intestino médio. (10) Divisão e transformação em formas promastigotas
metacíclicos e migração para a probóscide (adaptado de ORTEGA; GIORGIO; PAULA, 2017).
1.3. Leishmanioses
As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas de grande importância
mundial, afetando humanos e animais (PAGLIANO; ESPOSITO, 2017). Há registros
das doenças em 98 países da Europa, África, Ásia e América. Mas, cerca de 90% dos
novos casos ocorrem em apenas 13 países: Afeganistão, Argélia, Bangladesh,
Bolívia, Brasil, Colômbia, Etiópia, Índia, Irã, Peru, Sudão do Sul, Sudão e Síria
(STEVERDING, 2017).
As leishmanioses se manifestam principalmente em três formas: leishmaniose
cutânea, mucocutânea ou visceral (SAVOIA, 2015). No Brasil, as principais espécies
são L. amazonensis, L. braziliensis, e L. guyanensis, que causam a leishmaniose
tegumentar. Outras espécies como L. naiffi, L. shawi, L. lansoni e L. lindenberg
também foram notificadas, mas o maior número de casos da forma cutânea e muco-
14
cutânea atribui-se à L. braziliensis (GURUNG; KANNEGANTIL, 2015; OPAS/OMS,
2018).
A forma mais grave e fatal da doença é a visceral resultando em infecção
sistêmica, acometendo a maioria dos órgãos internos como baço, fígado e medula
óssea (KHADEM; UZONNA, 2014).
Nas regiões da África Oriental, Bangladesh, Índia e Nepal, é causada por L.
donovani, sendo a transmissão antroponótica, forma mais comum, sem a presença
de reservatórios. Na bacia do mediterrâneo, China, Oriente Médio e na América do
Sul, é uma doença zoonótica, causada por L. infantum, e apresenta o cão doméstico
como principal reservatório devido à sua suscetibilidade à infecção e ao alto
parasitismo cutâneo. No ambiente silvestre, no Brasil, o reservatório natural da doença
é a raposa (Vulpes vulpes). Todavia, diversas espécies já foram relatadas com
infecção, como lobo guará (Chrysocyon brachyurus), raposa-do-campo (Lycalopex
vetulus) e cachorro-vinagre (Speothos venaticus), além de outros mamíferos como
marsupiais (Didelphis albiventris e D. marsupialis) e gato doméstico (Felis catus)
(FONSECA et al., 2014; MILLÁN; FERROGLIO; SOLANO-GALLEGO, 2014; SOUZA,
et al., 2010).
Enquanto L. infantum afeta predominantemente crianças e indivíduos
imunocomprometidos, a L. donovani tende a afetar todas as faixas etárias
(PAGLIANO; ESPOSITO, 2017; VAN GRIENSVEN; DIRO, 2012).
1.4. Leishmaniose Visceral
A leishmaniose visceral era uma zoonose eminentemente rural e recentemente
vem se expandindo para áreas urbanas. Os principais fatores, observados
atualmente, relacionados à incidência e endemicidade elevada de leishmaniose
visceral humana (LV) e leishmaniose visceral canina (LVC), são: a diminuição de
populações de animais silvestres reservatórios do vetor L. longipalpis, ocasionada
pelo intenso desmatamento, colocando o homem e cão mais acessíveis ao vetor; a
adaptação do vetor as áreas urbanas (HARHAY et al., 2011) (Figura 2), além de
15
alterações climáticas, intensa urbanização, mobilizações de tropas militares,
refugiados e trabalhadores sazonais (STEVERDING, 2017).
Figura 2. Vetor da L. infantum, o flebotomíneo Lutzomyia sp.
Leishmaniose visceral e a LVC são importantes problemas de saúde pública
em vários países. Aproximadamente 350 milhões de pessoas vivem em áreas
caracterizadas pela transmissão ativa de leishmaniose, com 14 milhões de pessoas
diretamente afetadas pela doença (SAVOIA, 2015). Nos casos em que há
desenvolvimento da doença, cerca de 20.000 a 30.000 morrerão caso não tratados
(NOLI; SARIDOMICHELAKIS, 2014; STEVERDING, 2017). No período de 2001-2016
foram reportados 55.530 casos humanos de LV nas Américas (OPAS/OMS, 2018).
Os primeiros casos de LV no Brasil foram relatados nas regiões Nordeste e
Norte por volta de 1930. Surgiram novos focos expandidos de áreas endêmicas,
porém há registros de transmissão autóctone em mais de 1.200 municípios do país.
Atualmente registra-se mais de 3.000 casos anuais, em humanos, no Brasil, com
distribuição que vai desde o norte da Amazônia até o sul da fronteira com o Paraguai,
e a região Centro-Oeste. No entanto, a doença persiste predominantemente no
Nordeste (MARZOCHI, 2016; WERNECK, 2010).
Desde a década de 1970, os estados de Minas Gerais e do Espírito Santo, no
Sudeste do Brasil, são áreas endêmicas com registros de casos de LV. No estado do
Rio de Janeiro, a doença apareceu no final dos anos 1970 no bairro de Bangu, situado
na Zona Oeste. Desde os anos 80, a LV tornou-se urbanizada em as áreas
16
metropolitanas de Teresina, Belo Horizonte e Montes Claros, e isso foi seguido na
década de 1990 pelos municípios no oeste do Estado de São Paulo. Em particular,
Araçatuba e Bauru foram afetados, e estes têm relações comerciais estreitas com os
municípios endêmicos do Estado do Mato Grosso do Sul, Campo Grande e Três
Lagoas, na região Centro-Oeste (MARZOCHI, 2016).
Entre 1999 e 2013, foram notificados 2.324 casos e 200 óbitos por LV em São
Paulo, concentrados em cinco regiões de saúde e com 80 municípios afetados,
correspondendo, respectivamente, à incidência e mortalidade de 2,8 casos e 0,2
óbitos por 100 mil habitantes-ano e à letalidade de 8,6%. Dos casos notificados, 97,4%
ocorreram na área urbana e 2,4% na rural respectivamente (CARDIM et al., 2016).
1.5. Leishmaniose visceral humana
A LV é uma doença crônica, sistêmica e caracterizada por febre de longa
duração, perda de peso, anemia, entre outras manifestações. O parasita apresenta
tropismo acentuado pelo sistema fagocítico mononuclear do baço, fígado, medula
óssea e tecidos linfoides, mas outros órgãos e tecidos podem ser afetados, como
intestino, sangue, pulmões, rins e pele. Nas fases mais avançadas basicamente
encontra-se o parasita em todos os órgãos (NOLI; SARIDOMICHELAKIS, 2014;
RODRIGUES et al., 2016). Quando não tratada, pode evoluir para óbito em mais de
90% dos casos. A LV tem incidência e letalidade altas principalmente em indivíduos
não tratados, crianças desnutridas e é emergente em indivíduos portadores do vírus
da imunodeficiência adquirida (GONTIJO; MELO, 2004; VAN GRIENSVEN; DIRO,
2012).
A resposta imune protetora, e que controla a infecção na maioria das espécies
de Leishmania, inclusive a L. infantum, é mediada por células Th1. Macrófagos
infectados e outras células apresentadoras de antígenos apresentam antígenos de
Leishmania aos linfócitos T tipo CD4+. Esses linfócitos Th1 produzem IL-12 e IFN-γ
associado na produção de citocinas pró-inflamatórias e a ativação de macrófagos
infectados, para a produção de NO (óxido nítrico) e ROI (Oxigênio
intermediário reativo). Durante a resposta Th2, ainda não muito bem definida, há
17
produção de IL-4 associada estimulação de plasmócitos para produção anticorpos
anti-Leishmania. Na LV os macrófagos são incapazes de destruir os amastigotas. Em
pacientes infectados observa-se aumento dos níveis de IL-10, que em sinergismo com
a IL-4 parece ser fundamental no desenvolvimento da doença, pois essas citocinas
são capazes de inibir a ação dos macrófagos (RODRIGUES et al., 2016; KHADEM;
UZONNA, 2014).
1.6. Leishmaniose visceral canina
A infecção de cães pela L. infantum é caracterizada por diferentes
manifestações clínicas, variando da forma assintomática e subclínica a casos
sintomáticos e severos, que levam ao óbito. Os diferentes quadros da LVC
desencadeiam alterações hematológicas e bioquímicas séricas como aumento na
produção imunoglobulinas e a formação de complexos imunes solúveis, além de
alterações histológicas de órgãos linfoides. Os principais sintomas da LVC são: lesões
cutâneas pelo corpo, conjuntivites crônicas, sangramento de mucosa nasal,
hemorragias e onicogrifose (PALATNIK-DE-SOUSA, 2012; PETERSEN; BARR,
2009).
O mecanismo que direciona a resposta imune dos cães não é bem conhecido,
mas acredita-se que é semelhante ao descrito na LV humana, sendo que os linfócitos
T têm papel fundamental na imunidade à leishmaniose, por influenciar a produção de
citocinas pró-inflamatórias e interagir com os macrófagos infectados. No entanto,
parece que fatores como raça, imunossupressão e estado nutricional podem
influenciar no resultado da infecção. Da mesma forma, a presença de coinfecções
com outros patógenos ou infecções prévias parecem estar associadas com
aumento dos sinais clínico-patológicos agravando a doença (MORENO et al., 2012;
HOSEIN; BLAKE; SOLANO-GALLEGO, 2016).
A prevalência da LVC é menos estudada, mas estima-se que afete milhões de
cães e está presente em aproximadamente 50 países, principalmente na Ásia,
Europa, Norte da África, América do sul e é considerada uma doença emergente na
América do Norte. Inquéritos epidemiológicos indicam 2,5 milhões de cães infectados
com L. infantum no sul da Europa, soroprevalência de 2-25% em áreas endêmicas
18
europeias, e 1,9-35% no Brasil (ROATT et al., 2014; LINS et al., 2018; CAMPINO;
MAIA, 2018). Estudos epidemiológicos em Belo Horizonte - MG, área endêmica de
leishmaniose, realizados com o método do PCR (Reação em cadeia da polimerase)
demonstram que cerca de um quarto dos cães soronegativos estavam infectados com
L. infantum (COURA-VITAL et al., 2011), sugerindo que o número de cães
parasitados é subestimado.
Desde 2007 vêm sendo registrados casos importados de LV canina no
município de Campinas - SP, oriundos de várias regiões. A partir de 2009, casos
autóctones começaram a ser diagnosticados no Distrito de Sousas. No biênio 2016-
2017, foram notificados oito casos importados e 25 autóctones de LV canina.
Levantamentos entomológicos identificaram a presença do vetor L. longipalpis, na
cidade de Campinas, nos distritos de Sousas e Joaquim Egídio, em um ponto do bairro
Fogueteiro, na divisa com Indaiatuba, e em um ponto na divisa com Monte Mor
(DEVISA, 2018).
1.7. Medidas profiláticas e tratamento
As medidas profiláticas e de controle da LV, considerando-se o complexo ciclo
de transmissão, a natureza zoonótica da infecção, as distintas características
epidemiológicas das áreas geográficas endêmicas, a escassez de dados relacionados
à distribuição, a frequência da LVC e o custo das estratégias de controle, são muitas
vezes de difícil implementação. A Organização Mundial da Saúde até recentemente,
recomendava o tratamento de pacientes humanos, o uso de inseticidas em
habitações, a remoção e eutanásia de cães soropositivos (PALATINK-DE-SOUSA,
2012; WHO, 2011; OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013).
O antimoniato de meglumina (Glucantime®) é o fármaco de primeira linha
utilizado no Brasil para tratamento das leishmanioses humanas. Possui um esquema
terapêutico prolongado e apresenta muitas reações adversas. O composto age
inibindo enzimas do parasita relacionadas à oxidação de ácidos graxos e glicólise,
resultando na depleção dos níveis de ATP intracelular. A forma tóxica para os
parasitas é o antimônio trivalente (Sb3+), formado pela redução da forma pentavalente
(Sb5+) no interior do parasita, e capaz de interferir no metabolismo dos tióis
19
(FREITAS-JUNIOR et al., 2012). Os antimoniais são empregados no tratamento das
leishmanioses desde 1945 e casos de resistência vem sendo relatados há vários anos
(MESQUITA; TEMPONE; REIMÃO, 2014).
A miltefosina pertence à classe das alquilfosfocolinas, que são ésteres de
fosfocolina de álcoois alifáticos de cadeia longa, originalmente foi desenvolvida contra
o câncer. Do ponto de vista funcional, é considerada um inibidor da Akt, também
conhecida como proteína quinase B, importante na via de sinalização intracelular. Foi
o primeiro fármaco oral do mercado e está registrada para tratamento de LV na Índia,
devido à resistência causada pelo tratamento da LV com antimoniais no continente, e
na Alemanha. Na Colômbia é usada no tratamento da leishmaniose cutânea (DORLO
et al., 2012; MONDELAERS et al., 2016).
A anfotericina B (AmB), é um antibiótico poliênico produzido naturalmente pelo
actinomiceto Streptomyces nodosus. Inicialmente era usado no tratamento das
infecções fúngicas, mas hoje é prescrito no tratamento da leishmaniose em
associação com outros fármacos, ou como primeira escolha onde há resistência de
antimoniais. Formulações lipídica e lipossomal de AmB estão disponíveis. A
seletividade da anfotericina B contra a Leishmania é devida a maior afinidade do
fármaco com o esterol, predominante nas membranas do parasita, do que com o
colesterol predominante em células de mamíferos. Ocorre a alteração da
permeabilidade da membrana provocando extravasamento dos componentes
intracelulares. Outros compostos anti-Leishmania usados contra a doença são:
alopurinol, puromomicina, sitamaquina, pentamidina dentre outros que ainda estão em
estudo (SEIFERT, 2011).
Em relação aos cães com LVC, os fármacos disponíveis para o tratamento são:
alopurinol, aminosidina, anfotericina B, antimoniais pentavalentes e estibogluconato
de sódio (RIBEIRO et al., 2018). No Brasil, a situação é complexa. Em 2008, a portaria
interministerial proibiu a utilização de produtos de uso humano ou não registrados no
tratamento de cães infectados, mas em 2013 a portaria foi derrubada, permitindo-se
o tratamento dos cães. Apesar de controverso, o tratamento de LVC é defendido por
diversos autores que consideram não apenas necessário para a sobrevida dos
animais e a melhora de suas condições gerais, mas também para reduzir a carga
20
parasitária e a probabilidade de transmissão (OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013;
ROATT et al., 2014).
De acordo com a Nota Técnica Conjunta n° 001/2016 MAPA/MS, assinada pelo
Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento e pelo Ministério da Saúde foi
autorizado o registro do produto Milteforan® indicado para o tratamento da LVC, uma
vez que a miltefosina, princípio ativo do medicamento em questão, não é uma droga
utilizada para o tratamento da doença em humanos no Brasil. É necessário seguir o
protocolo de tratamento descrito na rotulagem do produto, avaliação periódica de um
Médico Veterinário para o controle da carga parasitária, tempo de tratamento e uso
de coleira repelente (SBTM, 2016).
O controle dos cães pela eutanásia é matéria de discussão, pois enquanto
alguns estudos indicam que as campanhas de remoção e eutanásia têm efeitos
positivos na prevenção da LV (NUNES et al., 2010), outras avaliações apontam para
efeitos pouco significativos dessa estratégia na profilaxia (PALATNIK-DE-SOUSA,
2012). No mercado há vacinas comerciais disponíveis para a LVC, mas o Ministério
da Saúde não as reconhece como medida de controle, devido à baixa eficácia
protetora, 68 a 71%. Vacinas e medicamentos anti-Leishmania estão constantemente
sendo testados para melhoria na proteção e combate à doença (OTRANTO, DANTAS-
TORRES, 2013; RIBEIRO et al., 2018).
1.8. Isolados clínicos de L. infantum
A importância de preservar e estudar os isolados clínicos de um parasita reside
no fato de que populações de parasitas encontradas em humanos e animais sofrem
pressões seletivas distintas que devem gerar diferentes fenótipos de resistência aos
fármacos, virulência e patogenicidade (CARNIELLI et al., 2018).
Existe uma necessidade prática de diferenciar e caracterizar as populações de
parasitas para diagnóstico, tratamento e controle da doença, além da importância
desses estudos para a taxonomia. Há inúmeros relatos do isolamento de parasitas em
animais e humanos. A maioria dos estudos relaciona-se a análise do material genético
dos isolados clínicos, para a pesquisa de polimorfismo genético inter e intraespecífico.
Por exemplo, Teixeira (2017) realizou sequências genômicas de 20 isolados de L.
21
infantum coletados no nordeste do Brasil, comparando-as entre si e com as
sequências genômicas disponíveis de 29 isolados de L. infantum e L. donovani do
Nepal e Turquia. Foram coletadas amostras de sangue e medula óssea de humanos
e cães, lesão cutânea de humano e baço de cães. Vinte sequências genômicas
apresentam 99,95% de semelhança entre si. No geral, as análises não sugerem
variantes de sequências individuais responsáveis por diferenças no resultado clínico
ou na adaptação de diferentes hospedeiros. E, Carnielli et al. (2018) identificaram
marcadores moleculares que predizem falha no tratamento da LV com miltefosina,
uma vez que o fármaco tem sido usado com sucesso no tratamento na Índia, mas sem
sucesso para LV em ensaio clínico no Brasil. Uma forte associação foi identificada
(p=0,0005) entre a presença de um lócus de sensibilidade (LSM) a miltefosina
geneticamente estável em L. infantum e uma resposta positiva ao tratamento com
miltefosina. O risco de falha do tratamento aumentou 9,4 vezes quando um isolado
não tinha o LSM. O LSM foi encontrado nos genomas de todos os isolados
sequenciados de L. infantum e L. donovani (n = 671), onde a miltefosina pode ter uma
taxa de cura superior a 93%.
Análises da infectividade, comportamento em cultura e susceptibilidade a
fármacos são menos frequentes (SERIN et al., 2005). Mas alguns trabalhos
apresentam dados interessantes, como por exemplo, Nunes (2018), que realizou
caracterização molecular de HSP70, mpi e ITS1 de amostras de 29 isolados de L.
infantum de medula óssea de cães naturalmente infectados das cidades de
Divinópolis, Pará de Minas e Brumadinho, localizados nas regiões centro-oeste e
central do estado de Minas Gerais, respectivamente. A análise das sequências de
nucleotídeos do parasito demonstrou uma homogeneidade muito alta das amostras.
Nas regiões endêmicas estudadas, os parasitas são genotipicamente indistinguíveis.
Os estudos dos isolados de cães são mais escassos. Análises genéticas de
isolados clínicos de cães e humanos infectados com L. infantum, da região
metropolitana de Belo Horizonte - MG foram publicadas recentemente (SILVA et al.,
2015).
Em relação às análises da infectividade, comportamento em cultura axênica e
susceptibilidade a fármacos também há poucos estudos no Brasil. Por exemplo,
Alcolea et al. (2016) isolaram promastigotas resistentes ao óxido nítrico (NO) através
22
de análise proteômica de isolados de cães infectados com L. infantum syn. L. chagasi
do centro de controle de zoonose da cidade de Aracajú, estado de Sergipe – Brasil.
Concluíram que promastigotas resistentes ao NO são mais infecciosas do que as
sensíveis ao NO. Entre as regiões diferencialmente abundantes, 40 proteínas podem
ser identificadas com sucesso na linhagem sensível e 38 em promastigotas
resistentes.
Na literatura, há pesquisas de isolados clínicos de outras espécies de
Leishmania, por exemplo, Silva Junior et al. (2015), que avaliaram a metaciclogênese
in vitro de isolados de pacientes humanos de L. braziliensis e L. amazonensis
utilizando critérios como tamanho da promastigota (análise morfométrica e citometria
de fluxo), curva de crescimento, modificações de superfície (perda de ligação de
lectina ou de anticorpo monoclonal (mAb), resistência ao complemento) e infectividade
em macrófagos humanos. Os resultados mostraram que, ao utilizar diferentes técnicas
para avaliar diferentes aspectos da metaciclogênese (aspectos morfológicos e
bioquímicos), diferentes porcentagens de promastigotas metacíclicos podem ser
detectadas em cada cultura isolada.
23
2. JUSTIFICATIVA
A principal justificativa para esse estudo fenotípico de parasitas é de que o
conhecimento de características fenotípicas, tais como morfometria, proliferação de
diferentes isolados clínicos diagnosticados na região de Campinas - SP, contribuirá
para o monitoramento da infectividade e da resposta aos fármacos de parasitas
circulando em diferentes ecótopos. Faz-se necessário também o estudo dos isolados,
uma vez que a LV é uma zoonose afetando humanos e animais hospedeiros, os quais
podem exercer diferentes pressões seletivas no parasita.
O Hospital das Clínicas da UNICAMP é um centro de referência em diversas
especialidades médicas, recebendo pacientes de cidades do Estado de São Paulo. A
Divisão de Patologia Clínica é responsável pelos serviços pré e pós-analítico da área
de parasitologia clínica, e realiza exames parasitológicos, entre eles, o diagnóstico
etiológico de leishmanioses. Com a colaboração da Sucen (Superintendência de
Controle de Endemias) tem sido possível o diagnóstico de cães com LVC.
Nos últimos anos, nosso laboratório tem auxiliado na análise de material de
pacientes com suspeita de LV, leishmaniose tegumentar e LVC. Nesse trabalho
avaliamos isolados clínicos de casos de LV e LVC.
24
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Análise do perfil fenotípico de isolados clínicos de L. infantum diagnosticados
na região de Campinas – SP.
3.2. Objetivos específicos
• Identificação da espécie de Leishmania dos isolados clínicos pelo método de
PCR.
• Análise morfométrica dos promastigotas.
• Análise dos promastigotas mantidos em meio de cultivo quanto a capacidade
de proliferação.
• Análise da capacidade dos promastigotas de infectar macrófagos de linhagens
humana e canina.
• Análise dos parasitas quanto a susceptibilidade aos fármacos usados na
clínica.
• Análise da capacidade de promastigotas de infectar camundongos BALB/c.
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Camundongos
Os animais utilizados foram camundongos fêmeas da linhagem BALB/c de 4
semanas de idade fornecidas pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP). Os camundongos
foram ambientados durante duas semanas antes dos experimentos no Biotério do
Laboratório de Doenças Tropicais do Instituto de Biologia/UNICAMP. Todos os
ensaios foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais
CEUA/UNICAMP (Protocolo N° 4710-1, 9 de novembro de 2017).
4.2. Parasitas
O parasita L. infantum (MHOM/BR/1972/LD) foi mantido na forma promastigota
em meio Schneider (SIGMA-ALDRICH) contendo 0,1% de gentamicina, 10% de soro
fetal bovino (SFB) e 5% de urina humana a 26°C, e usado como parasita referência
dos experimentos. O parasita L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) e L. braziliensis
(MHOM/BR/00/BA788) foram mantidos em meio RPMI-1640 (SIGMA-ALDRICH)
contendo 0,1% de gentamicina e 10% de SFB. As respectivas espécies são mantidas
in vivo mediante passagens sucessivas em camundongos BALB/c.
4.3. Isolados clínicos
As amostras de biópsia foram coletadas no Hospital das Clínicas da UNICAMP
e encaminhadas a Divisão de Patologia Clínica, para diagnóstico diferencial de outras
patologias. Após esses procedimentos essas amostras foram enviadas ao nosso
laboratório onde foram cultivadas em meios de culturas. Os promastigotas desses
isolados clínicos estão congelados nos tanques de nitrogênio líquido do Departamento
de Biologia Animal do Instituto de Biologia da UNICAMP.
26
Um dos isolados clínicos (isolado humano) foi obtido da amostra de punção de
medula óssea e linfonodo de paciente humano, feminino, 8 anos, atendido no HC da
Unicamp no ano de 2014, apresentando hepatoesplenomegalia e pancitopenia. O
paciente só iniciou o tratamento com Glucantime® e Anfotericina B lipossomal após o
resultado positivo para LV no exame direto, cultura e PCR. Os promastigotas obtidos
da cultura desse isolado foram imediatamente congelados em DMSO
(Dimetilsulfóxido) e SFB em freezer a -80ºC e transferidos para nitrogênio líquido após
24 horas. O segundo isolado clínico foi obtido da punção de medula óssea e linfonodo
de cão diagnosticado com LVC pelo teste sorológico ELISA, recolhido pelo Serviço
Regional de Campinas SR-05 (Sucen – SP) no ano de 2014, após eutanásia. Os
promastigotas obtidos da cultura desse isolado foram imediatamente congelados em
DMSO e SFB em freezer a -80ºC e transferidos para nitrogênio líquido após 24 horas.
E, um terceiro isolado clínico foi obtido da punção de medula óssea e linfonodo de cão
do município de Valinhos - SP, recolhido pela Sucen – SP no ano de 2017,
apresentando os seguintes sintomas: descamação e úlcera de pele, onicogrifose,
emagrecimento e aumento de linfonodo. O teste sorológico ELISA foi positivo para
LVC e o cão foi eutanasiado. Amostras de baço e fígado recebidas em solução salina
foram posteriormente fixadas em formol 10% por 24 horas e mantidas em álcool 70%.
O processamento histológico (inclusão em parafina, micrometria com cortes de 5 µm
e coloração com hematoxilina/eosina) foi realizado no Serviço de Soluções em
Anatomia Patológica, Histocell, São Paulo, SP.
4.4. Linhagens celulares
A linhagem THP1 (Homo sapiens) foi isolada do sangue de uma criança de um
ano de idade, com leucemia monocítica aguda (TSUCHIYA et al., 1980). As células
foram cultivadas em meio RPMI-1640 (SIGMA-ALDRICH) com 2 mM de L-glutamina,
1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, 10mM de HEPES (4-(2-hidroxietil)-
1-piperazino-etossulfónico), 1,0 mM de piruvato de sódio, 0,05 mM de 2-
mercaptoetanol e 10% SFB em estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado,
a 37ºC. A diferenciação monocítica de células THP-1 em macrófagos foi induzida com
27
13-acetato de forbol-12-miristato (PMA - SIGMA-ALDRICH) durante 48 horas (SHIO
et al., 2015). A linhagem DH82 foi estabelecida a partir de células progenitoras
neoplásicas de histiocitose maligna canina (Canis familiaris) de um Golden Retriever
masculino de dez anos (WELLMAN et al., 1988), e foi cultivada em Dulbecco's
Modified Eagle's Medium (DMEM - NUTRICELL) suplementado com 1% aminoácidos
não essenciais, 2 mM L-glutamine, 1 mM piruvato de sódio, 1,5 g/L bicabornato de
sódio, 1.0 g/L glucose e 10% de SFB em estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2
balanceado, a 37°C. As subculturas da DH82 são preparadas tratando-se células com
0,25% de tripsina/0,03% de solução de EDTA a 37°C (SIGMA-ALDRICH)
(LORKOWSKI, 2011). As linhagens são provenientes do Banco de Células da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (ATCC nacional).
4.5. Análise por PCR dos isolados clínicos
O DNA de promastigotas foi extraído usando-se o kit QIAamp® DNA Mini, de
acordo com as instruções do fabricante. As amostras de DNA foram quantificadas
usando Thermo Scientific NanoDrop 2000c. As amplificações do gene foram
realizadas com o par de iniciadores RV1 (5´-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3´) e
RV2 (5´-CACCTGGCCTATTTTACACCA-3´) específico para a espécie L. infantum
como citado por Costa et al. (2014). Os componentes da PCR consistem em 40,5 µL
de água Milli-Q, 5µL de tampão, 1 µL dNTP’s, 1µL de primer RV1, 1µL de primer RV2,
0,5 µL deTaq polimerase e 1µL de DNA. O mix foi colocado no termociclador Veriti
TM96-Well Thermal Cycler – Applied Biosystems. Os ciclos foram de 94°C – 5
minutos, 29 ciclos de: 94°C - 30 segundos, 60°C – 30 segundos, 72°C – 30 segundos
e extensão final de 72°C - 5 minutos. Para a análise dos produtos da PCR, foi realizada
a eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE (tris base, ácido bórico e
EDTA).
4.6. Manutenção in vitro e congelamento de L. infantum
Os parasitos são cultivados em número de 2x105 promastigotas/mL em 5 mL
de meio Schneider em frasco de cultura de 25 cm2 e incubados em estufa a 26°C. Os
28
parasitos são mantidos em cultura por no máximo 7 dias e depois são congelados em
nitrogênio líquido com 90% SFB e a adição de 10% do crioprotetor DMSO.
4.7. Ensaio de proliferação dos promastigotas
Os promastigotas foram cultivados em 5 mL de meio Schneider em frascos de
25 cm2 e incubados a 26°C durante 10 dias sem renovação do meio. Amostras da
suspensão foram retiradas diariamente e fixadas em solução de formaldeído 0,1% e
Tampão fosfato salino (PBS). Os promastigotas foram contados em câmara de
Neubauer em microscópio óptico (Zeiss® Primo star Axiocam) em aumento de 400x.
Os experimentos foram realizados em triplicata.
4.8. Análise morfométrica dos promastigotas
O volume de 10 µL contendo 5x105 parasitas foi colocado em orifícios de
lâminas de imunofluorescência (GlassTécnica - SP). As lâminas foram secas em
temperatura ambiente e coradas com Giemsa. As fotos foram realizadas no programa
de obtenção de imagens, Axio-vision 4,3 (Zeiss®) em microscópio óptico (Zeiss®
Primo star Axiocam) em aumento de 1000x. As imagens foram analisadas utilizando
o software Image J (Atlanta, GA, USA). O tamanho do corpo celular e o comprimento
do flagelo foram medidos em 100 parasitas de cada isolado (SILVA JUNIOR et al.,
2015).
4.9. Ensaio e monitoramento da infecção dos macrófagos com L. infantum
Os ensaios foram realizados utilizando-se linhagens de macrófagos THP1 e
DH82 e promastigotas de L. infantum. Cerca de 5x104 macrófagos/0,4mL foram
plaqueados em lâminas de 8 poços (Lab-TekChamber Slide w/Cover Permanox Slide
Sterile). Para a detecção de células viáveis foi utilizado o corante azul de tripan
(SIGMA-ALDRICH). As proporções célula:parasita utilizadas foram 1:10 e 1:20.
As células THP1, previamente diferenciadas com PMA (subitem 4.4 de
materiais e métodos) foram plaqueadas com meio RPMI-1640 suplementado com
10% de SFB, infectadas com os promastigotas e incubadas durante 24 e 48 horas em
29
estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado a 37ºC. Os macrófagos DH82
foram plaqueados com meio DMEM suplementado de 10% de SFB e incubados em
estufa com 5% de CO2, 21% de O2 e N2 balanceado, a 37ºC durante 3 horas. Após
esse período, foram lavados com PBS, infectados com os promastigotas e incubados
por mais 24 e 48 horas.
Para a avaliação da infecção as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS,
fixadas com metanol por 10 minutos e coradas com Giemsa diluído em solução de 1M
de tampão fosfato, pH 7,0, na proporção Giemsa:solução tampão 1:20 v/v por 3
minutos. Após a secagem em temperatura ambiente, as lâminas foram examinadas
em microscópio óptico no aumento de 1000X. Duzentas células, por poço, foram
avaliadas quanto ao número de células infectadas e o número de amastigotas
intracelulares. Os experimentos foram repetidos no mínimo duas vezes (MORAES et
al., 2018; TERREROS et al., 2017).
4.10. Testes com fármacos
Os fármacos utilizados foram: o Glucantime® (antimoniato de meglumina,
Sanofi Aventis, 300 mg/mL), Anfotericina B® (anfotericina B, Sigma-Aldrich, 1g) e
Miltefosine® (miltefosina, Cayman Chemical Company, 500mg). Anfotericina B e
miltefosina foram dissolvidas em DMSO, conforme as instruções dos fabricantes, e
depois diluídas em meio de cultura adequado para cada linhagem celular. O cálculo
do Glucantime® foi baseado do conteúdo do antimônio pentavalente (Sb+5). Um ml
do antimoniato de meglumina usado nos testes contém 81 mg de Sb+5 (Massa
molecular do antimoniato de meglumina: 365,97 g/mol), concentrações usadas nos
ensaios segundo Terrenos (2016). O tratamento das células foi realizado após a
infecção das mesmas (item 4.9 de materiais e métodos). As culturas de macrófagos
após 24 horas de infecção foram lavadas com PBS, e os fármacos foram adicionados.
As culturas celulares foram mantidas por 48 horas. Após a secagem em temperatura
ambiente e coloração com Giemsa, as lâminas foram examinadas em microscópio
óptico no aumento de 1000X. Duzentas células, por poço, foram avaliadas quanto ao
número total de células, células infectadas, número de amastigotas intracelulares e
analisado a viabilidade celular. Para a análise da viabilidade celular foram contadas
30
células de 20 campos por poço. Os experimentos realizados em triplicata foram
repetidos no mínimo duas vezes.
4.11. Infecção de camundongos com L. infantum
Os camundongos foram infectados com 2x106 promastigotas via
intraperitoneal. Após 2 meses do inóculo de infecção os camundongos foram
eutanasiados por deslocamento cervical para remoção de medula óssea, baço e
fígado para realizarmos as análises histopatológicas e carga parasitária (MORAES et
al., 2018).
4.12. Análise histopatológica
Amostras do fígado e baço dos camundongos foram fixadas em formol 10% por
24 horas e transferidas para o álcool 70% e enviados para histopatologia. Os cortes
dos tecidos tinham espessura de 5 µm e foram corados com Hematoxilina e Eosina
(OLIVEIRA et al., 2017; MORAES et al., 2018). (Histocell Soluções em Anatomia
Patológica, São Paulo – SP). As fotos foram realizadas no programa de obtenção de
imagens, Axio-vision 4,3 Zeiss® em microscópio óptico (Zeiss® Primo star Axiocam)
em aumento de 400x e 1000x.
4.13. Análise da carga parasitária
Para análise da carga parasitária, baço e fígado dos camundongos foram
pesados e homogeneizados em meio Schneider. A medula óssea foi retirada do osso
fêmur, com a lavagem (3 vezes) do canal medular com meio Schneider. Os
homogeneizados dos tecidos foram diluídos em séries de 1:4 em duplicata em placas
96-wells e mantidas a 26ºC durante 10 dias. Mediante o uso de microscópio invertido
foram avaliados os poços quanto a presença de promastigotas e estimado o número
de parasitas por mL de tecido (medula óssea) e mg de tecido (baço e fígado) (BUFFET
et al., 1995). Para a detecção de promastigotas na medula óssea e no baço 1 mL dos
homogeneizados foram colocados em placas de 6-wells contendo 5 ml de meio
Schneider e mantidos a 26ºC por até 10 dias.
31
4.14. Análise estatística
O teste estatístico utilizado foi ANOVA do pacote estatístico GraphPad Prism
7.0, com um nível de significância estabelecido como p<0,05.
32
5. RESULTADOS
5.1. Isolados clínicos
Os dois isolados clínicos utilizados nesse estudo foram obtidos de humano e
cão, e estavam congelados até a realização dos experimentos. Um terceiro isolado
clínico foi obtido durante o período de execução desse trabalho. Recebemos da
SUCEN – SP materiais de biópsia (baço e fígado) e punção (medula óssea e
linfonodo) de cão diagnosticado com LVC na região de Valinhos – SP. Esses materiais
biológicos foram cultivados em meio de cultura Schneider a 26ºC. Após 24 horas
foram observados promastigotas nas culturas de linfonodo e medula óssea. Porém, o
frasco com material de linfonodo apresentou contaminação com bactérias e foi
descartada. Após 48 horas, os promastigotas observados em frasco com material de
medula óssea não sobreviveram, o que não possibilitou a expansão e congelamento
do isolado clínico. As análises histopatológicas de baço e fígado do cão são mostradas
na Figura 3. Observa-se desorganização tecidual em ambos os tecidos, sem infiltrado
inflamatório, mas com intensa vacuolização celular e presença de amastigotas
intracelulares.
Figura 3. Histopatologia de fígado (A) e baço (B) de cão diagnosticado com leishmaniose visceral
canina. As setas indicam formas amastigotas.
33
5.2. Identificação dos isolados clínicos
Com o objetivo de identificar a espécie dos isolados clínicos realizamos o
ensaio da PCR. A Figura 4 representa o produto da extração de DNA de promastigotas
dos isolados clínicos, parasita referência e L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788). Os
valores mensurados de DNA extraído das amostras de L. infantum
(MHOM/BR/1972/LD), isolado humano, isolado de cão e L. braziliensis foram 42,1
ng/µL, 75,5 ng/µL, 36,1 ng/µL e 24,3 ng/µL, respectivamente. De acordo com esses
valores a qualidade do DNA estava adequada para a realização da PCR.
Figura 4. Produtos da extração de DNA de promastigotas. Marcador de 1200pb (M). Isolados clínicos
de humano (1) e cão (2). Parasita referência (3). L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788) (4). Controle
negativo água (5).
Os resultados da amplificação do DNA dos isolados clínicos com os iniciadores
RV1/RV2 de L. infantum estão apresentados na Figura 5. Os isolados clínicos
avaliados foram positivos para a espécie L. infantum, assim como o parasita
referência. Como esperado, não ocorreu à amplificação do DNA de promastigotas de
L. braziliensis.
Figura 5. Produtos de amplificação da PCR com os iniciadores RV1/RV2. Marcador de 148pb (M).
Isolados clínicos de humano (1) e cão (2). Parasita referência (3). L. braziliensis (MHOM/BR/00/BA788)
(4). Controle negativo água (5).
34
5.3. Curva de proliferação celular dos promastigotas de L. infantum
As curvas de proliferação dos promastigotas do parasita referência e dos
isolados clínicos foram realizadas para compararmos o comportamento dos parasitas
em cultura. Na Figura 6 observa-se que o número de promastigotas aumenta
exponencialmente até o dia 5 atingindo o pico de proliferação (± 170x106
parasitas/mL) nas culturas dos dois isolados. O número de parasitas é reduzido
gradativamente, até o dia 10 (14x106 parasitas/mL em isolado de cão e 8x106
parasitas/mL em isolado humano). Para o parasita referência o pico de proliferação é
observado no dia 7 (190x106 parasitas/mL) e o número de parasitas é reduzido
gradativamente, até o dia 10 (49x106 parasitas/mL). Não há diferença significativa
entre as curvas de proliferação dos dois isolados clínicos e do parasita referência.
Figura 6. Curvas de proliferação de promastigotas de L. infantum (MHOM/BR/1972/LD) e dos isolados
clínicos. Cerca de 2x105 promastigotas/mL foram cultivados em meio Schneider contendo 10% de soro
fetal bovino, 5% de urina, 0,1% de gentamicina, e mantidos em frasco de cultura de 25cm2 incubados
a 26°C. Os promastigotas foram contados em câmara de Neubauer durante 10 dias consecutivos.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5
6
7
8
9
Dias
Pro
ma
sti
go
tas
(L
og
10 c
élu
las
/mL
)
Isolado de Cão
Isolado Humano
Parasira referência
35
5.4. Medidas de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis
Com o objetivo de avaliar se há diferenças morfológicas entre os isolados
clínicos, parasita referência e L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) analisamos o
tamanho dos promastigotas. Na Figura 7, observamos as médias das medidas do
comprimento do corpo celular do parasita referência, isolado de cão, isolado humano
e L. amazonensis, que são, 8,09 μm ± 1,9, 7,76 μm ± 1,5, 8,57 μm ± 1,9 e 9,48 μm ±
2,19 respectivamente; e as médias das medidas do comprimento do flagelo do
parasita referência, isolado de cão e isolado humano, que são 8,5 μm ± 1,9, 7,52 μm
± 1,5, 8,6 μm ± 1,8 e 11,67 μm ± 2,55, respectivamente.
Figura 7. Medidas do comprimento (μm) do corpo celular e flagelo de promastigotas de L. infantum e
L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269).
Na figura 8, observamos a média do comprimento celular total (corpo+flagelo)
de promastigotas do parasita referência, isolado de cão, isolado humano e L.
corpo flagelo corpo flagelo corpo flagelo corpo flagelo
0
5
10
15
20
Ta
ma
nh
o (
m)
Parasita referência
Isolado de cão
Isolado humano
L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269)
36
amazonensis, que são 16,55μm ±3,04, 15,27μm ±2,12, 17,21 μm ±3,03 e 21,15μm
±3,68, respectivamente. Quando consideramos o comprimento total, corpo celular e
flagelo, não detectamos diferença significativa entre os quatro parasitas analisados,
apesar da observação de vários indivíduos menores na população de promastigotas
do cão e vários indivíduos maiores na população de promastigotas da L. amazonensis.
Figura 8. Medidas do comprimento (μm) total de promastigotas de L. infantum e L. amazonensis
(MHOM/BR/73/M2269).
5.5. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em macrófagos.
Os objetivos desses ensaios foram avaliar e comparar a capacidade infectiva
dos isolados clínicos e parasita referência. Para tanto, usamos macrófagos humano
THP1 e canino DH82. Nos ensaios de infecção, realizados no período de 24 e 48
horas, foi usada a forma promastigota do parasita e testadas as razões macrófago:
parasita 1:10 e 1:20.
Quando os macrófagos THP1, previamente diferenciados foram infectados com
promastigotas do parasita referência, isolado de cão e isolado humano, as
porcentagens de células infectadas foram de 29,0%, 26,0% e 24,0%, respectivamente
0
10
20
30
40
Ta
ma
nh
o (
m)
Parasita referência
Isolado de cão
Isolado humano
L. amazonensis (MHOM/BR/73/M2269)
37
e os números de amastigotas por macrófago foram de 2,46, 2,47 e 2,44 na proporção
1:10 em 24 horas. Após 48 horas de infecção, as porcentagens de células infectadas
com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram de 24,0%, 23,0% e
22,0%, respectivamente, e os números de amastigotas por macrófago foram de 2,47,
2,27 e 2,37 (Figura 9).
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
0
1
2
3
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:1
0)
24
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
A
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
0
1
2
3
4
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:1
0)
48
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
B
Figura 9. Infectividade in vitro de macrófagos THP1. Porcentagem de infecção e número de
amastigotas por macrófagos infectados com promastigotas de L. infantum na proporção 1:10 durante
24 (A) e 48 (B) horas.
38
Os macrófagos THP1 infectados com o parasita referência, isolado de cão e
isolado humano na proporção 1:20 obtiveram as porcentagens de células infectadas
de 42,0%, 38,0% e 35,0%, respectivamente, e os números de amastigotas por
macrófago foram de 3,77, 3,88 e 3,80 em 24 horas. Após 48 horas, as porcentagens
de células infectadas com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano
foram de 39,0%, 36,0% e 35,0%, e os números de amastigotas por macrófago foram
de 3,68, 3,33 e 3,29, respectivamente (Figura 10).
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
50
0
1
2
3
4
5
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:2
0)
24
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº amastigotas/macrófago
A
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
50
0
1
2
3
4
5
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:2
0)
48
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº amastigotas/macrófago
B
Figura 10. Infectividade in vitro de macrófagos THP1. Porcentagem de infecção e número de
amastigotas por macrófagos infectados com promastigotas de L. infantum na proporção 1:20 durante
24 (A) e 48 (B) horas.
39
Com o objetivo de verificar a capacidade infectiva dos isolados clínicos e do
parasita referência em outro tipo de macrófago utilizamos macrófagos de linhagem
canina DH82 que foram infectados utilizando-se protocolo semelhante ao utilizado
com macrófagos THP1.
Quando os macrófagos DH82 foram infectados com promastigotas do parasita
referência, isolado de cão e isolado humano as porcentagens de células infectadas
foram de 29,0%, 24,5% e 24%, respectivamente, e os números de amastigotas por
macrófago foram de 2,39, 2,49 e 2,56 na proporção 1:10 em 24 horas. Após 48 horas
de infecção, as porcentagens de células infectadas com o parasita referência, isolado
de cão e isolado humano foram de 28,0%, 24,0% e 25,0%, respectivamente, e os
números de amastigotas por macrófago foram de 2,67, 2,42 e 2,59, respectivamente
(Figura11).
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:1
0)
24
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
A
40
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4%
de
in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:1
0)
48
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
B
Figura 11. Infectividade in vitro de macrófagos DH82. Porcentagem de infecção e número de
amastigotas por macrófagos infectados com promastigotas de L. infantum na proporção 1:10 durante
24 (A) e 48 (B) horas.
Os macrófagos DH82 infectados na proporção 1:20 com o parasita referência,
isolado de cão e isolado humano obtiveram as porcentagens de infecção de 43,0%,
36,0%e 36,0%, respectivamente e os números de amastigotas por macrófago foram
de 3,56, 3,62 e 3,68 em 24 horas. Após 48 horas, as porcentagens de células
infectadas com o parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram de
41,0%, 36,0% e 35,0%, e os números de amastigotas por macrófago foram de 3,40,
3,23 e 3,45, respectivamente (Figura 12).
41
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
50
0
1
2
3
4
5
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:2
0)
24
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
A
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
10
20
30
40
50
0
1
2
3
4
% d
e in
fec
çã
o
ma
cró
fag
o:p
rom
as
tig
ota
s (
1:2
0)
48
ho
ras
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
acró
fag
o
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
B
Figura 12. Infectividade in vitro de macrófagos DH82. Porcentagem de infecção e número de
amastigotas por macrófagos infectados com promastigotas de L. infantum na proporção 1:20 durante
24 (A) e 48 (B) horas.
Os resultados indicam que os promastigotas dos isolados clínicos e do parasita
referência são infectantes para os macrófagos humano e canino. Não há diferença
significativa entre as porcentagens de infecção dos macrófagos e os números de
amastigotas intracelulares em culturas infectadas com os dois isolados clínicos e
parasita referência nos períodos de 24 e 48 horas de infecção.
42
Avaliamos também a morfologia dos macrófagos infectados com o parasita
referência e os isolados clínicos. Observa-se na Figura 13, fotos representativas de
macrófagos THP1 sem infecção. Eles possuem aspecto normal, isto é, formato oval
e/ou fusiforme com núcleo excêntrico e espraiados na lamínula. Os macrófagos
infectados com L. infantum do isolado humano nas proporções 1:10 e 1:20, as 24 e
48 horas de infecção apresentam-se ovais, núcleo excêntrico, hipertróficos,
vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares.
Figura 13. Micrografias de macrófagos THP1 sem infecção (A) e infectados com amastigotas
intracelulares de L. infantum do isolado humano na proporção 1:10 as 24 horas (B) e 48 horas (C), na
proporção 1:20 as 24 horas (D) e 48 horas (E) de infecção. As setas indicam amastigotas intracelulares.
A morfologia dos macrófagos DH82 infectados com o parasita referência e os
isolados clínicos também foi analisada. Observa-se na Figura 14, fotos
43
representativas dos macrófagos sem infecção que têm formato oval a circular e núcleo
localizado excentricamente. E, macrófagos infectados com o isolado clínico humano
nas proporções 1:10 e 1:20, as 24 e 48 horas de infecção. Os macrófagos
apresentam-se ovais, núcleo excêntrico, hipertróficos, vacuolizados e com formas
amastigotas intracelulares.
Figura 14. Micrografias de macrófagos DH82 sem infecção (A) e infectados com amastigotas
intracelulares de L. infantum do isolado humano na proporção 1:10 as 24 horas (B) e 48 horas (C), na
proporção 1:20 as 24 horas (D) e 48 horas (E) de infecção. As setas indicam amastigotas intracelulares.
44
5.6. Capacidade infectiva de promastigotas de L. infantum em
camundongo.
Com o objetivo de avaliar a capacidade infectiva dos isolados clínicos in vivo,
foram usadas formas promastigotas para infectar camundongos BALB/c. Os animais
após 3 semanas do inóculo foram eutanasiados e a pesagem, a análise
histopatológica e a avaliação da carga parasitária dos órgãos foram realizadas.
Os pesos de baço e fígado de camundongos infectados com o parasita
referência e isolados clínicos foram comparados com os pesos de baço e fígado de
camundongos não infectados (controle). Os dados mostrados na Figura 15 indicam
que não há diferença significativa nos pesos dos baços de animais infectados em
relação ao grupo controle. Porém, os pesos dos fígados dos animais infectados
apresentam diferença significativa em relação ao grupo controle.
Figura 15. Peso de órgãos de animais infectados com L. infantum. Camundongos BALB/c foram
infectados com promastigotas do parasita referência, isolado de cão e isolado humano. Após 3
semanas do inóculo foram eutanasiados e os baços e fígados foram pesados. Grupo controle:
camundongos não infectados. Foram usados grupos de camundongos com n=3. Os asteriscos (*)
indicam os pesos que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o grupo controle (teste
ANOVA, p>0,05).
Controle Parasita referência Isolado cão Isolado humano
0
500
1000
1500
2000
2500
Pe
so
(m
g)
Baço
Fígado
*
* *
45
Para a análise histológica, baços e fígados de camundongos BALB/c infectados
e não infectados foram processados em parafina e coradas com hematoxilina e
eosina. Os baços de camundongos não infectados apresentam vascularização assim
como a estrutura do órgão preservados, sem aspecto hipertrófico e vacuolizado das
células. Nos baços de animais infectados com o parasita referência, isolado de cão e
isolado humano observam-se granulomas, presença de infiltrado de células
inflamatórias, além de tecido conjuntivo fibroso, desorganização das células com
aspecto hipertrófico e vacuolizado. Não foram observadas formas amastigotas
intracelulares (Figura 16).
Figura 16. Histologia de baços de camundongo não infectado (A) infectado com L. infantum do parasita
referência (B), isolado de cão (C) e isolado humano (D). Células hipertróficas e vascularizadas (seta
preta). Granulomas (*).
Os fígados de camundongos não infectados apresentam a vascularização e
estrutura do órgão preservados, sem o aspecto hipertrófico e vacuolizado das células
46
notados em animais infectados. Nos fígados dos animais infectados com o parasita
referência, isolado de cão e isolado humano observam-se a presença de infiltrados de
células inflamatórias, desorganização tecidual com células de aspecto hipertrófico e
vacuolizado. Não foram observadas formas amastigotas intracelulares (Figura 17).
Figura 17. Histologia de fígados de camundongo não infectado (A) infectado com L. infantum do
parasita referência (B), isolado de cão (C) e isolado humano (D). Células hipertróficas e vascularizadas
(seta preta).
A análise da carga parasitária foi realizada após a retirada dos órgãos (baço,
fígado e medula óssea), homogeneização, diluição seriada e cultivo. Durante 10 dias
o material foi observado e detectada baixa carga parasitária. Não houve diferença
significativa entre órgãos de animais infectados com os três parasitas analisados
(Figura 18).
47
Figura 18. Carga parasitária de L. infantum em baço e fígado (A) e medula óssea (B) nos diferentes
grupos do experimento in vivo. Os órgãos foram obtidos e cultivados conforme descrito no item 4.13 de
Material e Métodos.
Baço Fígado
0
11001
21001
31001
41001
51001
5.01002
1.01003
1.51003
2.01003c
arg
a p
ara
sit
ári
a (
mg
/te
cid
o)
Parasita referência
Isolado de cão
Isolado humano
A
Parasita referência Isolado de cão Isolado humano
0
21001
41001
61001
81001
Ca
rga
pa
ras
itá
ria
/mL
Parasita referência
Isolado de cão
Isolado humano
B
48
Considerando os dados observados acima, também avaliamos esse material
cultivado sem diluição seriada prévia, mas cultivado em placas de 6-wells com 5 mL
de meio Schneider. O resultado foi positivo para o aparecimento de formas
promastigotas nos poços contendo tecidos de animais infectados com o parasita
referência, isolado de cão e isolado humano, após 10 dias de incubação (Tabela 1).
Observamos que as formas promastigotas dos isolados clínicos aparecem primeiro
em comparação ao parasita referência.
Tabela 1 - Análise da positividade de culturas de órgãos de camundongos BALB/c.
Animais foram infectados com 2x106 promastigotas e após 3 semanas foram eutanasiados. Os órgãos
(medulas óssea e baço) foram homogeneizados e incubados a 26°C por 10 dias. (M) Medula óssea (B)
Baço.
5.7. Susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos anti-Leishmania
A susceptibilidade dos isolados clínicos aos fármacos foi realizada avaliando-
se a ação de antimoniato de meglumina, miltefosina e anfotericina B em macrófagos
THP1 e DH82 infectados com promastigotas L. infantum na proporção
macrófago:parasita 1:20. Os resultados da infecção dos macrófagos THP1 e DH82
pelo parasita referência, isolado de cão e isolado humano foram semelhantes, como
observado nas Figuras 10 e 12 do item 5.5 dos resultados.
Nesse ensaio a análise foi feita calculando-se as porcentagens de macrófagos
infectados e o número de amastigotas intracelulares, após a incubação das culturas
celulares com os compostos, durante 48 horas. Cada composto foi usado em 2 doses
diferentes; Glucantime® (32 µg/mL e 128 µg/mL), Anfotericina B (0,2 µg/mL e 0,4
µg/mL) e Miltefosine® (2 µg/mL e 4 µg/mL). O DMSO foi usado como diluente para a
miltefosina e a anfotericina B, e assim, também testado nas culturas celulares.
49
Na Figura 19 observamos que quando os macrófagos THP1 foram infectados
por 24 horas com promastigotas do parasita referência observa-se que as
porcentagens de macrófagos infectados e os números de amastigotas por macrófago
tratados com DMSO não tiveram diferenças significativas em relação ao controle
(macrófagos infectados sem tratamento). A anfotericina B nas doses de 0,2 µg/mL e
0,4 µg/mL não reduziu as porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu os
números de amastigotas intracelulares. A miltefosina reduziu as porcentagens de
macrófagos infectados nas duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL), embora tenha
ocorrido diminuição dos números de amastigotas intracelulares somente com a dose
de 4 µg/mL. O antimoniato de meglumina não causou redução das porcentagens de
macrófagos infectados em nenhuma das duas doses testadas (32 µg/mL e 128
µg/mL), mas causou diminuição dos números de amastigotas intracelulares com as
doses de 128 µg/mL.
Figura 19. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do parasita referência em
macrófagos THP1 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as
dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e tratamento com
DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
ca 3
2 g
/mL
Glu
ca 1
28
g/mL
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
% d
e i
nfe
cç
ão
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
* ** * * * * * *
50
Quando os macrófagos THP1 foram infectados por 24 horas com promastigotas
dos isolados clínicos observa-se semelhança nos resultados obtidos. Em ambos, as
porcentagens de macrófagos infectados e os números de amastigotas por macrófago
tratados com DMSO não tiveram diferença significativa em relação ao controle
(macrófagos infectados sem tratamento). Com a Anfotericina B não houve redução
nas porcentagens de macrófagos infectados na dose de 0,2 µg/mL, mas houve
redução nas porcentagens de macrófagos infectados na dose de 0,4 µg/mL. Também,
houve redução nos números de amastigotas intracelulares nas duas doses testadas.
A miltefosina causou redução nas porcentagens de macrófagos infectados e nos
números de amastigotas intracelulares nas duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL).
O antimoniato de meglumina não causou redução nas porcentagens de macrófagos
infectados, mas causou diminuição nos números de amastigotas intracelulares nas
duas doses testadas (32 µg/mL e 128 µg/mL) (Figura 20).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
ca 3
2 g
/mL
Glu
ca 1
28
g/mL
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
% d
e i
nfe
cç
ão
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
* * * * * * * * *
A
51
Figura 20. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado de cão (A) e isolado
humano (B) em macrófagos THP1 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos
(*) indicam as dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e
tratamento com DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Quando os macrófagos DH82 foram infectados por 24 horas com promastigotas
do parasita referência observa-se que as porcentagens de macrófagos infectados e
os números de amastigotas por macrófago tratados com DMSO não tiveram diferença
significativa em relação ao controle (macrófagos infectados sem tratamento). A
anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as porcentagens de macrófagos
infectados, mas reduziu as porcentagens de macrófagos infectados com a dose de
0,4 µg/mL. Os números de amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses
testadas (0,2 µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina causou redução nas porcentagens de
macrófagos infectados e nos números de amastigotas por macrófago com as duas
doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O antimoniato de meglumina não causou
redução nas porcentagens de macrófagos infectados, mas causou diminuição dos
números de amastigotas intracelulares com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128
µg/mL) (Figura 21).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
ca 3
2 g
/mL
Glu
ca 1
28
g/mL
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
5%
de
in
fec
çã
o
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
B
* * * * * * * * *
52
Figura 21. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do parasita referência em
macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as
dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e tratamento com
DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Na infecção com o isolado de cão em macrófagos DH82 observa-se que as
porcentagens de macrófagos infectados e os números de amastigotas por macrófago
tratados com DMSO não teve diferença em relação ao controle (macrófagos
infectados sem tratamento). A anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as
porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu com a dose de 0,4 µg/mL. Os
números de amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses testadas (0,2
µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina reduziu as porcentagens de macrófagos infectados,
mas não reduziu os números de amastigotas por macrófago com as duas doses
testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O antimoniato de meglumina não reduziu a
porcentagem de macrófagos infectados, mas reduziu os números de amastigotas
intracelulares com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128 µg/mL) (Figura 22).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
ca 3
2 g
/mL
Glu
ca 1
28
g/mL
0
10
20
30
40
50
0
1
2
3
4
% d
e i
nfe
cç
ão
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
* * * * * * * * *
53
Figura 22. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado de cão em
macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. Os asteriscos (*) indicam as
dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e tratamento com
DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Na infecção com o isolado humano em macrófagos DH82 observa-se que as
porcentagens de macrófagos infectados e os números de amastigotas por macrófago
tratados com DMSO não teve diferença em relação ao controle (macrófagos
infectados sem tratamento). A anfotericina B com a dose de 0,2 µg/mL não reduziu as
porcentagens de macrófagos infectados, mas reduziu as porcentagens de macrófagos
infectados com a dose de 0,4 µg/mL. Os números de amastigotas intracelulares
reduziram com as duas doses testadas (0,2 µg/mL e 0,4 µg/mL). A miltefosina reduziu
as porcentagens de macrófagos infectados, mas não reduziu os números de
amastigotas por macrófago com as duas doses testadas (2 µg/mL e 4 µg/mL). O
antimoniato de meglumina não reduziu as porcentagens de macrófagos infectados
com a dose de 32 µg/mL, mas reduziu com a dose de 128 µg/mL. Os números de
amastigotas intracelulares reduziram com as duas doses testadas (32 µg/mL e 128
µg/mL) (Figura 23).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
ca 3
2 g
/mL
Glu
ca 1
28
g/mL
0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
% d
e i
nfe
cç
ão
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
* * * * * * *
54
Figura 23. Susceptibilidade de amastigotas intracelulares de L. infantum do isolado humano em
macrófagos DH82 tratados com diferentes fármacos durante 48 horas. \Os asteriscos (*) indicam as
dosagens que apresentaram diferenças estatísticas comparando-se com o controle e tratamento com
DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Outro aspecto avaliado foi a viabilidade dos macrófagos THP1 e DH82
infectados com o parasita referência e os isolados clínicos, não tratados e tratados
com antimoniato de meglumina, miltefosina, anfotericina B, DMSO. Na Figura 24
observamos redução significativa na viabilidade celular comparado ao grupo controle
apenas com o tratamento com miltefosina (2 µg/mL e 4 µg/mL).
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
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Milt
e 2 g
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Milt
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Glu
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2 g
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Glu
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28
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0
10
20
30
40
0
1
2
3
4
% d
e i
nfe
cç
ão
nº d
e a
ma
stig
ota
s/m
ac
rófa
go
% de infecção
nº de amastigotas/macrófago
* * * * * * **
55
Contr
ole
DM
SO
Am
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,2
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Am
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,4
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Milt
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Milt
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80
100
120V
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ilid
ad
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(% d
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on
tro
le)
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DH82
* * * *
A
Contr
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60
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120
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (%
do
co
ntr
ole
)
THP1
DH82
* ***
B
56
Figura 24. Efeito dos fármacos em macrófagos THP1 e DH82. Macrófagos THP1 (quadrado preto) e
DH82 (quadrado cinza) infectados com o parasita referência (A), isolado de cão (B) e isolado humano
(C) foram tratados ou não (controle) com DMSO, anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina
durante 48 horas. Após esse período foi realizada a contagem de células em lâminas coradas com
Giemsa. Os asteriscos (*) indicam redução da viabilidade celular com diferenças estatísticas
comparando-se com o controle e tratamento com DMSO (teste ANOVA, p>0,05).
Avaliamos também a morfologia dos macrófagos infectados com o parasita
referência e os isolados clínicos. Observa-se na Figura 25 e 26, fotos representativas
de macrófagos THP1 e DH82, respectivamente, infectados com isolado de cão e não
tratados, e macrófagos infectados com isolado de cão e tratados com DMSO,
anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina durante 48 horas. Os
macrófagos infectados e não tratados apresentam-se ovais, núcleo excêntrico,
hipertróficos, vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares. Os macrófagos
infectados e tratados com os fármacos também se apresentam ovais, núcleo
excêntrico, hipertróficos, vacuolizados e com formas amastigotas intracelulares. Nas
lâminas de macrófagos tradados com miltefosina observamos restos celulares
decorrente da maior toxicidade do fármaco aos macrófagos.
Contr
ole
DM
SO
Am
B 0
,2
g/mL
Am
B 0
,4
g/mL
Milt
e 2 g
/mL
Milt
e 4 g
/mL
Glu
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Glu
ca 1
28
g/mL
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40
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120V
iab
ilid
ad
e c
elu
lar
(% d
o c
on
tro
le)
THP1
DH82
* * * *
C
57
Figura 25. Micrografias de macrófagos THP1 infectados com L. infantum do isolado de cão e tratados
com diferentes fármacos. Macrófagos infectados e sem tratamento (A). Macrófagos infectados e
tratados com DMSO (B), anfotericina B 0,2 µg/mL (C) e 0,4 µg/mL (D). Miltefosina 2 µg/mL (E) e 4
µg/mL (F). Antimoniato de meglumina 32 µg/Ml (G) e 128 µg/mL (H) em 48 horas. As setas indicam
amastigotas intracelulares.
58
Figura 26. Micrografias de macrófagos DH82 infectados com L. infantum do isolado de cão e tratados
com diferentes fármacos. Macrófagos infectados e sem tratamento (A). Macrófagos infectados e
tratados com DMSO (B), anfotericina B 0,2 µg/mL (C) e 0,4 µg/mL (D). Miltefosina 2 µg/mL (E) e 4
µg/mL (F). Antimoniato de meglumina 32 µg/Ml (G) e 128 µg/mL (H) em 48 horas. As setas indicam
amastigotas intracelulares.
59
DISCUSSÃO
O objetivo principal desse trabalho foi analisar o perfil fenotípico de isolados
clínicos de L. infantum diagnosticados em paciente humano e cão da região de
Campinas-SP. Algumas características fenotípicas foram escolhidas para serem
avaliadas: espécie, morfometria, proliferação, viabilidade, infectividade e
susceptibilidade do parasita a fármacos.
Dois isolados clínicos foram usados, um proveniente de paciente humano
diagnosticado com LV pelo exame direto, cultura e PCR; e outro de cão diagnosticado
com LVC pelo teste sorológico ELISA. No primeiro momento, era necessário a
identificação da espécie da Leishmania desses isolados. Os dois isolados clínicos
foram positivos para os iniciadores RV1/RV2 na reação em cadeia da polimerase, o
que permitiu a identificação de Leishmania infantum como agente etiológico da
doença, concordando com as citações da literatura quanto à utilização desses
iniciadores na caracterização da espécie de Leishmania (LACHAUD et al., 2002;
FERROGLIO et al., 2006; LIMA JUNIOR et al., 2009; COSTA et al., 2014). Outros
dados também apontam para a presença dessa espécie do parasita diagnosticado
pela PCR na região de Campinas, como mostram os resultados de Costa et al. (2014),
que detectaram a espécie L. chagasi em cães e Von Zuben et al. (2014) relatando o
primeiro surto canino de leishmaniose visceral em Campinas, detectando a espécie L.
chagasi syn. L. infantum.
Esperávamos heterogeneidade de perfil fenotípico entre os isolados clínicos,
uma vez que se trata de parasitas provenientes de hospedeiros diferentes, humano e
cão, que são espécies de mamíferos com funções orgânicas distintas (temperatura,
tipos celulares, expectativa de vida) e exercendo pressão seletiva distinta no parasita.
Nesse trabalho foi analisada a cinética de proliferação dos promastigotas em
meio de cultivo Schneider. As culturas demonstraram que os isolados clínicos
proliferam mais rápido, isto é, atingem a fase estacionária antes do parasita referência.
Entretanto, o número de promastigotas, observados durante os 10 dias foi semelhante
entre os três parasitas analisados. Dados similares, isto é, um padrão de curva de
60
proliferação igual, foi obtido por Cunha et al. (2013); Gaona (2016) usando isolados
clínicos de L. infantum e Vanaerschot (2010) usando isolados de L. donovani.
Alterações morfológicas como diferenças no tamanho do corpo celular e do
flagelo de promastigotas podem ocorrer devido a características biológicas de cada
isolado ou a fatores externos como as condições experimentais, meio de cultura,
número de gerações e principalmente na fase de proliferação em que os
promastigotas se encontram (SACKS; PERKING, 1984; SARAIVA et al., 2005,
FARINHA, 2011). Sendo assim, analisamos a morfologia dos isolados e os dados
mostraram não existir diferença significativa entre os comprimentos médios dos quatro
parasitas analisados (L. infantum parasita referência, isolado de cão, isolado humano
e L. amazonensis) em fase estacionária da curva de proliferação. Quando
comparamos os dados com a literatura observamos que Silva Junior et al. (2015)
detectaram formas metacíclicas de L. amazonensis são maiores que formas
metacíclicas de L. braziliensis em 6 e 10 dias de cultura, indicado pela razão do
tamanho do corpo/flagelo, sendo que os isolados da mesma espécie são
semelhantes. O valor das médias das medidas de comprimento do corpo e flagelo de
L. amazonenis são semelhantes ao nosso (9,49 µm e 11,37 µm, respectivamente). Lei
et al. (2010); Farinha (2011) e Santi (2017) observaram que isolados de L. infantum
são semelhantes em tamanho de corpo celular e flagelo entre si, e os valores também
são semelhantes aos obtidos nesse trabalho.
Outro aspecto fenotípico importante é a capacidade infectiva, isto é, a
capacidade do parasita invadir e sobreviver dentro de macrófago, sendo sua taxa de
multiplicação nesse ambiente um fator importante para determinar o potencial de
infectividade do isolado e a manifestação da doença. Esta capacidade do parasita é
avaliada in vitro com macrófagos cultivados e expostos a promastigotas, e então
analisada a porcentagem de células infectadas e o número de amastigotas
intracelulares (KANELLOPOULOS et al., 2014). O uso de macrófagos se justifica por
serem as células-alvo onde os parasitas se multiplicam e sobrevivem (LIU; UZONNA,
2012). Sabendo que a leishmaniose visceral acomete várias espécies de hospedeiros,
optamos por analisar macrófagos humano (THP1) e canino (DH82). Além de serem
61
os hospedeiros em que foram isolados os parasitas que pesquisamos nos permite
demonstrar in vitro se esses isolados têm afinidade por algum desses macrófagos.
Para validar o uso destas linhagens na infecção por L. infantum avaliamos,
após 24 e 48 horas, a internalização do parasito testando diferentes proporções entre
células, parasitas e tempos.
Os dados mostraram que ambas as linhagens são infectadas com amastigotas
presentes por pelo menos 48 horas. Entre 22% e 24% dos macrófagos THP1; 2,27 e
2,47 amastigotas intracelulares por célula são encontrados quando a infecção foi na
proporção 1:10 para todos os isolados e parasita referência. Entre 35% e 39% dos
macrófagos THP1; 3,29 e 3,68 amastigotas intracelulares por célula são encontrados
quando a infecção foi na proporção 1:20 para todos os isolados e parasita referência.
E, cerca de 25% e 28% dos macrófagos DH82; 2,42 e 2,68 amastigotas intracelulares
por célula são encontrados quando a infecção foi na proporção 1:10 para todos os
isolados e parasita referência. Entre 35% e 41% dos macrófagos DH82; 3,23 e 3,45
amastigotas intracelulares por célula são encontrados quando a infecção foi na
proporção 1:20 para todos os isolados e parasita referência. Concluímos que os
isolados clínicos são capazes de infectar os dois tipos de macrófagos, em diferentes
proporções macrófago:parasito e sem predileção por nenhuma das linhagens
celulares, indicando que o isolado de cão não têm preferência e/ou maior facilidade
para infectar macrófagos de cão, o que também ocorreu com o parasita isolado de
humano com macrófago humano.
Dados na literatura apontam para conclusões semelhantes na capacidade
infectiva de isolados ao infectar macrófagos. Maia et al. (2007) testaram a capacidade
infectiva de dois isolados de L. infantum em diferentes macrófagos, incluindo os
macrófagos DH82, e concluíram que os parasitas são capazes de infectar todas as
linhagens de macrófagos. Kanellopoulos et al. (2014) analisaram o potencial de
infecção de isolados clínicos de L. infantum infectando células THP-1 in vitro e os
resultados mostram similaridade dos isolados quanto a infectividade. Em ensaios
realizados por Kerkhof et al. (2018) notou-se que macrófagos derivados de medula
óssea de camundongos BALB/c foram mais permissivos à replicação de amastigotas
intracelulares de isolados de L. infantum. Os resultados de todos os trabalhos
62
apresentam resultados que variam muito em relação à porcentagem células
infectadas e ao número de amastigotas intracelulares devido a diferenças nas células
e parasitas utilizados, entretanto em todos os casos observou-se parasitas
intracelulares e manutenção da infecção de macrófagos.
Após os testes de infecção in vitro que mostraram que os isolados são capazes
de infectar macrófagos, foi avaliada a capacidade de infectividade desses isolados em
camundongos BALB/c. Os camundongos BALB/c são excelentes modelos animais
experimentais para estudos sobre leishmaniose, porque são susceptíveis a infecção,
com doença crônica e respostas imunes incapazes de controlar os parasitas (NIETO
et al., 2011).
Nos nossos experimentos, o comportamento infectivo dos isolados e parasita
referência foi semelhante. Os animais inoculados apresentaram parasitas em baixas
quantidades no baço, fígado e medula óssea. Diferente do que foi observado por
Correa (2011); Agallou et al. (2018) e Silva et al. (2018), que ao inocularem
promastigotas de L. infantum em camundongos BALB/c obtiveram valores das cargas
parasitárias elevados. Entretanto esses autores inocularam promastigotas por via
endovenosa. Rolão, Melo e Campino (2004) obtiveram resultados semelhantes aos
nossos (carga parasitária esplênica) quando inocularam L. infantum via
intraperitoneal. Marques et al. (2005) e Figueiredo et al. (2017) obtiveram resultados
com maior carga parasitária (esplênica e hepática) comparados aos nossos dados
utilizando o mesmo método. Em relação a histopatologia, todos os camundongos
BALB/c inoculados com os isolados clínicos ou parasita referência sobreviveram até
o período de 3 meses e apresentaram granulomas, presença de infiltrado de células
inflamatórias, além de tecido conjuntivo fibroso, desorganização das células com
aspecto hipertrófico e vacuolizado no baço e no fígado concordando com os
resultados de Honoré et al. (1998); Coelho (2011); Cajueiro et al. (2017); Moraes et
al. (2018). Assim, concluímos que os isolados infectam camundongos e são
igualmente patogênicos.
Analisamos os efeitos de fármacos com atividade leishmanicida em macrófagos
de linhagem humana e canina infectados com L. infantum. Nosso objetivo era avaliar
se há variação na susceptibilidade de parasitas de isolados de cão e humano para
63
anfotericina B, miltefosina e antimoniato de meglumina, pois na literatura há relatos
de resistência. Por exemplo, na Índia, o uso da miltefosina foi licenciado após
resistência aos antimoniais, resultando em falha do tratamento em até 60% dos
pacientes (GUERIN et al., 2002; SUNDAR, 2001). Estudos in vitro apontam que
promastigotas de populações de Leishmania resistentes a anfotericina B e a
miltefosina apresentam diminuição do metabolismo de ácido graxo e esterol em
comparação a cepa selvagem (MBONGO et al., 1998; RAKOTOMANGA; SAINT-
PIERRE-CHAZALET; LOISEAU, 2005). Estudos realizados com L. infantum e outras
espécies de Leishmania predominantes no Brasil sugerem que doses mais elevadas
de miltefosina são necessárias para melhorar a eficácia de cura do tratamento de
pacientes infectados (MORAIS-TEIXEIRA et al., 2011). Maia et al. (2013) ao testarem
a susceptibilidade de isolados humanos e de cães de Leishmania relataram insucesso
terapêuticos em isolado de paciente humano imunossuprimido tratado com o
Glucantime®.
Em nossos experimentos observamos que apenas em macrófagos humanos
THP1 infectados com o parasita referência e tratados com doses de 128 µg/mL de
antimoniato de meglumina há redução de ambos, macrófagos infectados e
amastigotas intracelulares. As doses de 32 µg/mL reduziram apenas amastigotas
intracelulares. Em macrófagos humanos THP1 infectados com os isolados há redução
apenas de amastigotas intracelulares nas doses de 32 µg/mL e 128 µg/mL de
antimoniato de meglumina.
Nos macrófagos caninos DH82 infectados com o parasita referência há redução
apenas de amastigotas intracelulares nas doses de 32 µg/mL e 128 µg/mL de
antimoniato de meglumina. Macrófagos caninos DH82 infectados com os isolados há
redução de ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares apenas nas
doses de 128 µg/mL de antimoniato de meglumina. Nas doses de 32 µg/mL há
redução apenas de amastigotas intracelulares em macrófagos infectados com o
isolado de cão. Sugerimos que a interação de macrófagos humanos THP1 com os
isolados resultou em uma situação mais difícil de tratamento com antimoniato.
Enquanto, em macrófagos canino DH82, a interação dos macrófagos com os isolados
mostrou-se mais sensíveis ao composto.
64
Vale salientar que há diversos trabalhos na literatura sobre o efeito dos
antimoniais em cultura de macrófagos infectados, usando condições diversas de
tempo, espécie do parasita e doses (variações entre 64 µg/ml até mais de 1322 µg/ml)
(AREVALO et al., 2007; GIORGIO et al., 2000; MOREIRA; PETRILLO-PEIXOTO,
1991; WALKER; SARAVIA, 2004; ZAULI-NASCIMENTO et al., 2010). Alguns estudos
avaliam a susceptibilidade dos parasitas aos fármacos calculando IC50, o que não foi
realizado em nosso trabalho. Porém, podemos comparar nossos dados com os de
Pérez et al. (2016), que usaram o antimoniato em promastigotas de L. infantum de
isolado canino e amastigotas intracelulares em macrófagos humano THP1 e
comprovaram que isolado era resistente ao fármaco após duas intervenções
terapêuticas. Terrenos (2015) apesar dos altos desvios estatísticos, demonstrou que
o Glucantime® às 48 horas apresentou efeito leishmanicida no tratamento dos
macrófagos peritoneais infectados com L. amazonensis.
Os macrófagos THP1 infectados com o parasita referência e isolados foram,
semelhantemente, susceptíveis a doses de 2 µg/mL e 4 µg/mL de miltefosina, pois
ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares foram reduzidos. Já em
macrófagos DH82 infectados com o parasita referência há redução de ambos,
macrófagos infectados e amastigotas intracelulares nas doses 2 µg/mL e 4 µg/mL de
miltefosina. Na infecção com os isolados, há menor susceptibilidade em relação as
duas doses, pois somente há redução na porcentagem de macrófagos infectados.
Entretanto, a miltefosina foi tóxica para ambos os macrófagos, THP1 e DH82 pelo fato
de ser um fármaco anticâncer com efeito leishmanicida. Essa toxicidade já era
esperada, uma vez que células THP1 e DH82 são linhagens tumorais (SINGH;
KUMAR, SINGH, 2012). Sugerimos que a interação de macrófagos humanos THP1
com os isolados resultou em uma situação susceptível ao tratamento com miltefosina.
Enquanto, em macrófagos caninos DH82, a interação dos macrófagos com os
isolados mostrou-se uma situação mais difícil ao tratamento.
Nos experimentos de macrófagos THP1 infectados com o parasita referência e
isolados, semelhantemente, há redução de amastigotas intracelulares nas doses 0,2
µg/mL e 0,4 µg/mL de anfotericina B. Os macrófagos infectados somente foram
reduzidos nas doses de 0,4 µg/mL de anfotericina B quando infectados com os
65
isolados. Em relação a macrófagos DH82 infectados com o parasita referência e
isolados há redução de ambos, macrófagos infectados e amastigotas intracelulares
nas doses de 0,4 µg/mL de anfotericina B, diferente nas doses de 0,2 µg/mL onde
houve redução apenas dos amastigotas intracelulares. Sugerimos que a interação de
macrófagos humanos THP1 e DH82 com os isolados resultou em uma situação
susceptível ao tratamento com anfotericina B.
De acordo com a literatura, há variação nas doses do fármaco. Por exemplo,
Corral et al. (2013) demonstrou que doses de 0,1 µg/mL de anfotericina B não
afetaram a taxa de infecção em macrófagos infectados com L. infantum ou L.
donovani, e ainda demonstraram que a associação com outro fármaco (Alicina) pode
ser mais eficaz na inibição da proliferação do parasita. Mukhopadhyay et al. (2010)
mostraram em estudos in vitro com células THP1 que a dose de 2 mg/ml de
anfotericina B poderia mediar depuração do parasita devido à forte indução de radicais
livres e citocinas pró-inflamatórias.
Sugerimos que as doses dos fármacos analisados não dificultam a entrada dos
compostos em nenhuma das duas linhagens celulares. Porém, agem diferente em
relação a porcentagem de macrófagos infectados e/ou amastigotas intracelulares, o
que faz o parasita se tornar mais ou menos susceptível ao composto. De acordo com
os nossos dados, os isolados clínicos foram mais susceptíveis a miltefosina e
anfotericina B quando a interação foi com macrófagos THP1 e mais susceptíveis a
antimoniato de meglumina e anfotericina B quando a interação foi com macrófagos
DH82.
Consideramos que é importante realizar análises do perfil fenotípico de isolados
clínicos provenientes de humanos e cães, como fizemos nesse trabalho, pois
características diferentes podem aparecer, o que serviria de base para estudos mais
avançados. Como perspectiva para mais estudos desses isolados seria importante
compará-los com um maior número de isolados clínicos, diferenciar as fases da
proliferação através da citometria de fluxo, assim como a realização de análises
genômica e proteômica de isolados com perfis fenotípicos diferentes.
66
CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos podemos concluir que:
• A espécie de Leishmania dos isolados clínicos identificada foi
Leishmania infantum.
• Em relação a análise da morfométrica dos promastigotas dos isolados
clínicos e parasita referência mostram que são semelhantes no
tamanho.
• As curvas de proliferação dos isolados clínicos e parasita referência
são semelhantes.
• Os isolados clínicos e o parasita referência são igualmente capazes de
infectar macrófagos caninos (DH82) e macrófagos humanos (THP1).
• Em relação a susceptibilidade aos fármacos os isolados clínicos
isolados clínicos foram mais susceptíveis a miltefosina e anfotericina B
quando a interação foi com macrófagos THP1 e mais susceptíveis a
antimoniato de meglumina e anfotericina B quando a interação foi com
macrófagos DH82.
• Os isolados clínicos e o parasita referência são igualmente capazes de
infectar camundongos BALB/c porque os valores da carga parasitária
pelo método de diluição e a presença de granulomas no histopatológico
foram semelhantes.
67
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experimental visceral leishmaniasis mediated by dendritic cells pulsed with the N-
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81
ANEXOS
Abaixo constam o certificado de aprovação da CEUA, o certificado de alteração
do título do projeto, a declaração de direitos autorais e declaração de bioética e
biossegurança.
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