universidade estadual de...

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

MIRIAN AYUMI KURAUTI

O EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO REDUZ A INSULINEMIA

ATRAVÉS DA REDUÇÃO DA SECREÇÃO E AUMENTO DO

CLEARANCE DE INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS

Campinas

2015

vii

RESUMO

A hiperinsulinemia, frequentemente associada a doenças como obesidade e diabetes tipo 2,

decorre do aumento da secreção e redução do clearance de insulina, processo que acontece

principalmente no fígado pela ação da IDE (“insulin degrading enzyme”), principal enzima

responsável pela degradação da insulina. Sabe-se que o exercício físico reduz a insulinemia,

entretanto, seu efeito sobre o clearance de insulina ainda não está totalmente esclarecido.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do exercício físico agudo sobre o clearance

de insulina e expressão proteica de IDE, em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica.

Camundongos C57BL6 foram distribuídos em 3 grupos: Controle (CTL), Obeso (O) e Obeso

Exercitado (OE) e, submetidos a 12 semanas de dieta CHOW (CTL) ou hiperlipídica (O e OE). O

exercício físico agudo foi realizado em esteira com duração de 3 horas (intensidade de 60-70% do

VO2máx). Após o exercício, tolerância à glicose (ipGTT), à insulina (ipITT) e ao piruvato

(ipPTT), bem como o clearance de insulina foram avaliados. Os camundongos foram

eutanasiados por decapitação para coleta de sangue e órgãos como: fígado, tecido adiposo

perigonadal, músculo esquelético gastrocnêmio e pâncreas, do qual foram isoladas as ilhotas

pancreáticas para avaliar a secreção de insulina estimulada por glicose. Proteínas foram extraídas

dos tecidos para análise da expressão proteica de IDE, IR, p-Akt e p-AMPK (Western blot).

Testes estatísticos ANOVA One-Way seguido de pós-teste Tukey foram empregados para análise

dos resultados. Comparado ao grupo CTL, camundongos do grupo O apresentaram aumento da

massa corporal e de tecido adiposo perigonadal, hiperglicemia, hiperinsulinemia, intolerância à

glicose e à insulina, aumento da glicemia durante o ipPTT, hipersecreção e redução do clearance

de insulina, além de redução da expressão proteica de IDE, IR e p-Akt no fígado e, redução de p-

AMPK no tecido adiposo perigonadal e também no fígado. Como esperado, o exercício agudo

não alterou a massa corporal e a massa do tecido adiposo perigonadal, entretanto reduziu a

glicemia e insulinemia, melhorou a tolerância à glicose e à insulina, reverteu o aumento da

glicemia durante o ipPTT, reduziu a secreção de insulina e aumentou o clearance de insulina dos

camundongos OE. Além disso, aumentou a expressão proteica de IDE, IR e p-Akt no fígado e

músculo gastrocnêmio e, aumentou a p-AMPK apenas no músculo gastrocnêmio desses

camundongos. Os resultados demonstram que apenas uma sessão de exercício físico pode

melhorar significativamente a homeostase glicêmica de camundongos obesos. Em adição, o

exercício agudo, além de reduzir a secreção de insulina, aumentou o clearance desse hormônio,

justificando a redução da insulinemia nesses obesos. Tal aumento no clearance de insulina ocorre

provavelmente via aumento da expressão proteica de IR e IDE no fígado e músculo

gastrocnêmio, indicando um possível novo mecanismo pelo qual o exercício físico reduz a

insulinemia. Estes resultados mostram a importância do clearance de insulina na regulação desse

hormônio em obesos. Portanto, estratégias farmacológicas dirigidas ao aumento do clearance de

insulina pode ser uma ferramenta importante na prevenção e/ou tratamento de doenças associadas

à hiperinsulinemia, como obesidade e Diabetes tipo 2.

Palavras-chave: Diabetes tipo 2. Dieta hiperlipídica. Hiperinsulinemia. IDE. Obesidade

ix

ABSTRACT

Hyperinsulinemia is often associated with pathological conditions such as obesity and type 2

diabetes. It occurs by increase in insulin secretion and decrease in insulin clearance that occurs,

mainly, in liver by insulin degrading enzyme (IDE), the main responsible for insulin degradation.

It is known that exercise reduces insulinemia, however, its effects on insulin clearance remain

unclear. The aim of this study was to investigate the effect of a single bout of acute exercise on

insulin clearance and IDE protein expression in mice fed a high-fat diet. C57BL6 male mice were

distributed in three groups: Control (CTL), Obese (O) and Exercised obese (OE), fed for 12

weeks with CHOW diet (CTL) or high-fat diet (O and OE). Acute exercise was performed on a

treadmill for 3 hours (60 – 70% of VO2 máx). After, glucose tolerance (ipGTT), insulin tolerance

(ipITT), piruvate tolerance (ipPTT), and insulin clearance was evaluated. Mice were beheaded to

obtain blood and organs samples such as liver, gastrocnemius skeletal muscle, perigonadal

adipose tissue and pancreas. The islets were isolated by pancreases digestions with collagenase,

and used to evaluate the insulin secretion stimulated by glucose. Protein from various tissues was

extracted and the expression of IDE, IR, p-Akt and p-AMPK were assessed (Western blot).

ANOVA One-Way and Tukey post-test were used for the analysis of the results. Compared to the

CTL group, the O group showed increased body and perigonadal adipose tissue masses,

hyperglicemia, hyperinsulinemia, glucose and insulin intolerance, higher glycemia during ipPTT,

hypersecretion and lower insulin clearance, in addition to reduction of IDE, IR and p-Akt protein

expression in liver, and, p-AMPK reduction also in liver and perigonadal adipose tissue. As

expected, acute exercise did not alter body and perigonadal adipose tissue masses, however it

reduced glycemia and insulinemia, improved glucose and insulin tolerance, reversed higher

glycemia during ipPTT, decreased insulin secretion and increased insulin clearance in obese

mice. Moreover, acute exercise increased the expression of IDE, IR and p-Akt proteins in liver

and gastrocnemius muscle, and p-AMPK only in gastrocnemius muscle in these obese mice.

These results show that acute exercise improves glucose homeostasis in obese mice. In addition,

besides the reduction in insulin secretion, the increase in insulin clearance, induced by exercise,

explain the lower insulinemia in OE group. This increased insulin clearance occurs most likely by

the augment in the expression of IDE and IR proteins in liver and gastrocnemius muscle,

suggesting a new possible mechanism whereby acute exercise reduces insulinemia. Taken all

together, this study demonstrate that insulin clearance is very important to insulin regulation in

obese. Therefore, pharmacological strategies targeting to increase insulin clearance may be an

important way to prevention and/or treatment of diseases associated with hyperinsulinemia, such

as obesity and type 2 diabetes.

Key words: High-fat diet. Hyperinsulinemia. IDE . Obesity. Type 2 Diabetes.

xi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 23

2 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 28 2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................................... 28 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................... 28

3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................... 29 3.1 ANIMAIS ................................................................................................................................... 29

3.2 CONSUMO MÁXIMO DE OXIGÊNIO (VO2 MÁX) ......................................................................... 30

3.3 SESSÃO DE EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO ...................................................................................... 30 3.4 AVALIAÇÃO DA OBESIDADE ..................................................................................................... 31 3.5 TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE INTRAPERITONEAL (IPGTT) ............................................... 31 3.6 TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA INTRAPERITONEAL (IPITT) ............................................... 32

3.7 TESTE DE TOLERÂNCIA AO PIRUVATO INTRAPERITONEAL (IPPTT) .......................................... 32 3.8 CLEARANCE DE INSULINA ......................................................................................................... 32

3.9 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ..................................................................................................... 32 3.10 SECREÇÃO DE INSULINA ESTIMULADA POR GLICOSE ............................................................... 33 3.11 DOSAGEM DE INSULINA .......................................................................................................... 33

3.12 SINALIZAÇÃO DE INSULINA NOS TECIDOS ................................................................................ 33 3.13 WESTERN BLOT ...................................................................................................................... 34

3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................................ 34

4 RESULTADOS ......................................................................................................................... 35 4.1 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE ALGUNS PARÂMETROS METABÓLICOS DE CAMUNDONGOS

OBESOS ..................................................................................................................................... 35

4.2 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA À GLICOSE EM CAMUNDONGOS OBESOS .. 35

4.3 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA À INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS 37 4.4 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA AO PIRUVATO EM CAMUNDONGOS OBESOS

................................................................................................................................................. 38 4.5 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A SECREÇÃO DE INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS .. 39 4.6 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE O CLEARANCE DE INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS . 40

4.7 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO SOBRE A EXPRESSÃO PROTEICA DE IDE E IR EM

CAMUNDONGOS OBESOS ........................................................................................................... 41 4.8 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO SOBRE A EXPRESSÃO PROTEICA DE P-AKT E P-AMPK EM

CAMUNDONGOS OBESOS ........................................................................................................... 42

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 44

CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 49

xii

REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 50

ANEXOS ...................................................................................................................................... 57

xiii

DEDICATÓRIA

À minha família, em especial à minha avó Rosa, a quem

eu dedico todos os meus esforços no estudo do

Diabetes.

xv

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Antônio Carlos Boschero pelos

ensinamentos e pela excelente orientação.

Ao Dr. Luiz Rezende pela co-orientação.

Aos principais envolvidos na realização deste trabalho, José Maria, Sandra,

Gustavo, André e Tarlliza, pela ajuda nos experimentos e pela parceria.

Aos colegas do Laboratório de Pâncreas Endócrino e Laboratório de Lípedes

pela boa convivência no dia-a-dia.

Aos professores Dr. Alexandra Gabarra, Dra. Camila Oliveira e Dra. Carmen

Veríssimo pelas correções e sugestões para este trabalho no exame de qualificação.

Ao Prof. Dr. Everardo M. Carneiro e à Profa. Dra. Helena C. F. de Oliveira.

Aos técnicos Marise, Cláudio, Emeirieli, Priscila, Francini, Mônica, Bill,

Rogério e César.

Ao Instituto de Biologia pelo apoio estrutural.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao

Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), pelo apoio financeiro.

À minha família e ao meu namorado Rodrigo pelo apoio e incentivo.

À Unicamp Swimming Society Reloaded (USSR) pelos treinos descontraídos

após um dia no laboratório.

Gostaria de agradecer também à todos que contribuíram, de alguma forma, para

a realização deste trabalho e que não foram citados. Muito obrigada.

xvii

“O sucesso nasce do querer, da determinação e

persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não

atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no

mínimo fará coisas admiráveis.”

José de Alencar

xix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Esquema simplificado da secreção de insulina estimulada pela glicose ... 24

Figura 2 - Esquema do clearance de insulina ............................................................. 23

Figura 3 -

Protocolo Experimental ............................................................................. 31

Figura 4 - Efeito do exercício agudo sobre a glicemia e insulinemia em

camundongos obesos durante o ipGTT ..................................................... 36

Figura 5 - Efeito do exercício agudo sobre a tolerância à insulina em camundongos

obesos ......................................................................................................... 37

Figura 6 - Efeito do exercício agudo sobre a glicemia em camundongos obesos

durante o ipPTT ......................................................................................... 38

Figura 7 - Efeito do exercício agudo sobre a secreção de insulina em camundongos

obesos ......................................................................................................... 39

Figura 8 - Efeito do exercício agudo sobre o clearance de insulina em

camundongos obesos ................................................................................. 40

Figura 9 - Efeito do exercício agudo sobre a expressão proteica de IDE e IR em

camundongos obesos ................................................................................. 42

Figura 10 - Efeito do exercício agudo sobre a expressão proteica de p-AKT e p-

AMPK em camundongos obesos ............................................................ 43

xxi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Akt ou PKB Protein kinase B

AMP Adenosine monophosphate

AMPK AMP-activated protein kinase

ANOVA Analise of variance

AS160 Akt substrate of 160 kDa

ATP Adenosine triphosphate

AUC Area under the curve

BSA Bovine serum albumin

CO2 Dióxido de carbono

CTL Grupo controle

DDT Dithiothreitol

DM2 Diabetes Mellitus tipo 2

EPM Erro padrão da média

EROs Espécies reativas do oxigênio

GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

GDP Guanosine diphosphate

GLUT2 Glucose transporter 2

GLUT4 Glucose transporter 4

GTP Guanosine triphosphate

IDE Insulin degrading enzyme

IMC Índice de massa corporal

ipGTT Teste de tolerância à glicose intraperitoneal

ipITT Teste de tolerância à insulina intraperitoneal

ipPTT Teste de tolerância ao piruvato intraperitoneal

IR Insulin receptor

IRS Insulin receptor substrate

KATP Canal de potássio dependente de ATP

kDa Quilodalton

Km Constante de Michaelis-Menten

xxii

mTOR mammalian target of rapamycin

O Grupo obeso

OE Grupo obeso exercitado

p-Akt Akt fosforilada

p-AMPK AMPK fosforilada

PHG Produção hepática de glicose

PI3K Phosphoinositide 3 kinase

Rab-GAP Rab GTPase-activating protein

RPM Rotação por minuto

S6K1 S6 Kinase 1

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TBC1 tre-2/USP6, BUB2, cdc16

U Unidade

Vmáx Velocidade máxima da reação

VO2máx Consumo máximo de oxigênio

23

1 INTRODUÇÃO

A insulina é um importante hormônio anabólico e desempenha papel fundamental no

controle glicêmico sendo, portanto, necessário manter níveis adequados desse hormônio na

circulação sanguínea, para um controle efetivo da glicemia. Sabe-se que a insulinemia depende,

basicamente, de dois processos fisiológicos: secreção de insulina pelo pâncreas endócrino e

remoção da insulina plasmática, também conhecida como clearance de insulina, que ocorre

principalmente no fígado (Polonsky et al., 1988).

A secreção de insulina pelas células β pancreáticas depende, basicamente, dos níveis de

nutrientes circulantes, principalmente da glicose. Esta é transportada para dentro das células β

através do transportador de glicose do tipo 2 (GLUT2). Este transportador apresenta um alto Km

(baixa afinidade) e Vmáx elevado, permitindo o rápido equilíbrio entre as concentrações extra e

intracelular de glicose, quando sua concentração plasmática se eleva (Meglasson e Matschinsky,

1986). O metabolismo da glicose promove a síntese de ATP, e concentrações altas desse

substrato induzem o fechamento de canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP), elevando,

consequentemente, a concentração de potássio intracelular (Koster, Permutt e Nichols, 2005).

Este evento provoca a despolarização da membrana plasmática e abertura dos canais de cálcio

dependentes de voltagem (Satin e Cook, 1985), aumentando as concentrações desse íon no

citoplasma que por fim, desencadeia a translocação e fusão dos grânulos de insulina na

membrana plasmática com subsequente liberação de insulina, como ilustrado na Figura 1

(Layden, Durai e Lowe, 2010). Além da secreção de insulina ser regulada pelos níveis de

nutrientes circulantes, ela também pode ser modulada, direta ou indiretamente, por alguns

hormônios e fármacos. Isso permite que as células β secretem insulina adequadamente, regulando

os níveis de nutrientes circulantes de acordo com a necessidade do organismo em diferentes

situações fisiológicas, como o jejum, refeição, exercício físico entre outros (Boschero, 1996).

24

Figura 1 – Esquema simplificado da secreção de insulina estimulada pela glicose. 1) Entrada da

glicose pelo GLUT2 e síntese de ATP; 2) Fechamento dos canais KATP e despolarização da membrana; 3)

Abertura dos canais de cálcio voltagem-dependentes; 4) Fusão do grânulo secretório com a membrana

plasmática e secreção de insulina (Layden, Durai e Lowe, 2010).

Se, por um lado, os mecanismos de secreção de insulina têm sido continuamente

estudados (Mayhew, Wright e Ashmore, 1969; Meglasson e Matschinsky, 1986; Prentki,

Matschinsky e Madiraju, 2013), menor atenção tem sido dada ao estudo do clearance desse

hormônio. O principal órgão envolvido nesse processo é o fígado (Sato et al., 1991) e cerca de

50% dessa remoção ocorre logo na primeira passagem da insulina por esse órgão. Além disso, a

remoção desse hormônio também acontece, com menor intensidade, em outros tecidos sensíveis à

insulina, como o tecido muscular esquelético e o tecido adiposo (Duckworth e Kitabchi, 1981;

Duckworth, Bennett e Hamel, 1998). Basicamente, o clearance de insulina ocorre através das

seguintes etapas: A) ligação da insulina ao seu receptor (IR, do inglês "insulin receptor"); B)

internalização do complexo insulina-IR; e C) degradação do hormônio no citoplasma pela IDE

(do inglês “insulin degrading enzyme”), que é a principal enzima responsável por esse processo

(Castillo et al., 1994). Além disso, o IR internalizado, quando se dissocia da insulina, pode

retornar à membrana plasmática, sendo dessa forma reciclado (Fawcett e Duckworth, 2009),

como ilustrado na Figura 2.

25

Figura 2 – Esquema do clearance de insulina. A) Ligação da insulina ao IR, B) Internalização do

complexo insulina-IR, C) degradação da insulina pela IDE e D) Reciclagem do IR.

A IDE é uma zinco-metaloproteinase de 110 kDa expressa, principalmente, no citoplasma

de células responsivas a insulina, podendo ser tanto secretada quanto agir intracelularmente

(Duckworth, Bennett e Hamel, 1998). A atividade e expressão dessa enzima podem ser

moduladas por fatores semelhantes àqueles que atuam no metabolismo hepático de insulina,

como glicose, a própria insulina (Pivovarova et al., 2009), ATP (Camberos et al., 2001),

corticóides (Harada et al., 1996), óxido nítrico (Cordes et al., 2009) e ácidos graxos (Hamel,

Upward e Bennett, 2003), além de inibidores de metaloproteinases intracelulares (Kayalar e

Wong, 1989). Assim, a ingestão de diferentes nutrientes pode alterar a expressão da IDE bem

como o metabolismo da insulina e o controle glicêmico em humanos e outros animais (Hennes,

Dua e Kissebah, 1997).

Um desequilíbrio entre o clearance e a secreção de insulina pode alterar,

significativamente, a insulinemia. Dessa forma, um aumento da secreção de insulina e/ou redução

do seu clearance aumentam as concentrações desse hormônio no plasma, podendo gerar um

quadro de hiperinsulinemia (Erdmann et al., 2009). Nesse contexto, a obesidade destaca-se por

26

estar frequentemente associada à hiperinsulinemia, devido aos distúrbios na secreção (Kreisberg

et al., 1967) e no clearance de insulina (Brandimarti et al., 2013), geralmente presentes nessa

patologia.

A obesidade está, frequentemente, associada a outras condições patológicas como o

Diabetes tipo 2 (DM2). Ambas as patologias, obesidade e DM2, são associadas à resistência à

insulina (Kahn, Hull e Utzschneider, 2006) e, na maioria dos casos, à hiperinsulinemia (Kelly et

al., 2014). Apesar da controvérsia, se a hiperinsulinemia é causa ou consequência da resistência à

insulina, muitos estudos colocam a hiperinsulinemia como a iniciadora de todo o processo

patológico, reduzindo ou dessensibilizando os receptores de insulina levando a resistência a este

hormônio (Gavin et al., 1974; Kanety et al., 1994). A hiperinsulinemia também está associada a

outras patologias como doenças cardiovasculares (Stolar, 1988; Younk, Lamos e Davis, 2014) e

alguns tipos de câncer (Balkau et al., 2001; Pan e Hong, 2014). Portanto, reduzir a insulinemia

pode ser uma estratégia promissora na prevenção e/ou tratamento de patologias, principalmente

as relacionadas com a resistência à insulina.

Nesse contexto, o exercício físico, indicado para pacientes obesos e diabéticos, mostra-se

eficaz em reduzir a concentração de insulina plasmática (Musi et al., 2001). Muitos estudos,

utilizando modelos de exercício físico crônico e agudo, atribuem esse efeito, principalmente, à

redução da secreção de insulina (Aarnio, Lauritsen e Dela, 2001). Entretanto, em nosso

laboratório foi demonstrado que, no exercício físico agudo, a redução de insulina plasmática, em

camundongos magros, parece ocorrer, principalmente, devido ao aumento do clearance de

insulina, uma vez que a secreção de insulina não foi alterada. Além disso, foi observado que o

aumento do clearance de insulina está associado ao aumento das concentrações proteicas de IDE

no fígado e nos músculos esqueléticos gastrocnêmio e sóleo (dados não publicados).

Além de reduzir a insulinemia, é bem estabelecido que o exercício físico aumenta a

sensibilidade à insulina, promovendo maior ativação da cascata de sinalização intracelular desse

hormônio (Hawley e Lessard, 2008), que se inicia com a ligação ao IR. A autofosforilação do IR

ativa a fosforilação dos substratos do receptor de insulina, principalmente 1 e 2 (IRS-1 e 2, do

inglês "insulin receptor substrate") que, quando fosforilados ativam fosfoinositídeo 3 quinase

(PI3K, do inglês "phosphoinositide 3-kinase"), o qual fosforila e ativa a proteína quinase B (Akt

ou PKB, do inglês "protein kinase B") (Saltiel e Kahn, 2001). Akt participa da captação de

glicose, pois induz a migração de vesículas contendo transportadores de glicose tipo 4 (GLUT4,

27

do inglês "glucose transorter 4") para a membrana plasmática (Chang, Chiang e Saltiel, 2004).

Além disso, a captação de glicose, induzida pelo exercício, pode ser estimulada por outra via

independente da insulina, que ocorre através da ativação da AMPK (do inglês “AMP-activated

protein kinase”) (Richter e Hargreaves, 2013). Esta proteína é sensível a concentrações de AMP,

de modo que, quando a razão AMP/ATP está elevada, devido a contrações musculares, ocorre

fosforilação da AMPK que, assim como a Akt, induz a translocação de GLUT4 para a membrana

plasmática (Kennedy et al., 1999; Kahn et al., 2005).

A fim de observar apenas o efeito do exercício físico e excluir o efeito da perda de peso e

tecido adiposo, induzido pelo exercício crônico, neste trabalho foi utilizado um modelo de

exercício físico agudo. Trabalhos anteriores, que utilizaram modelos de exercício agudo, já

demonstraram diversos efeitos benéficos desse tipo de exercício sobre o controle glicêmico, em

modelos de obesidade e diabetes, tais como: melhora da tolerância à glicose e sensibilidade à

insulina (Henriksen, 2002; Matos et al., 2010; Newsom et al., 2013), aumento da captação de

glicose principalmente pelo tecido muscular esquelético (Jessen e Goodyear, 2005), redução da

produção hepática de glicose (De Souza et al., 2010) e, redução da secreção de insulina

estimulada por glicose (Karlsson e Ahrén, 1990). Entretanto, o efeito do exercício físico sobre o

clearance de insulina, em modelos de obesidade, ainda não foi demonstrado. Portanto mais

estudos envolvendo o efeito do exercício físico sobre o clearance de insulina em estados

patológicos como obesidade e DM2, mostram-se necessários.

Sabendo que o exercício físico agudo pode modular o clearance de insulina através do

aumento da expressão proteica de IDE, em camundongos não obesos, e que este efeito pode

contribuir para a redução da insulinemia (dados não publicados), é muito provável que, em

camundongos obesos, o exercício físico agudo reduz a insulinemia através desse mecanismo, ou

seja: aumento do clearance de insulina via elevação dos níveis proteicos de IDE.

28

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o efeito do exercício físico agudo sobre o clearance de insulina e

expressão proteica de IDE em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o efeito do exercício agudo sobre a tolerância à glicose, tolerância à

insulina e tolerância ao piruvato em camundongos obesos;

Determinar o efeito do exercício agudo sobre a secreção de insulina,

estimulada por glicose, em ilhotas isoladas de camundongos obesos;

Investigar o possível efeito modulador do exercício agudo sobre o clearance de

insulina em camundongos obesos;

Caracterizar a expressão de proteínas chaves no processo do clearance de

insulina, como a IDE e IR, no fígado, tecido muscular esquelético e tecido

adiposo de camundongos obesos submetidos ao exercício agudo;

Determinar a expressão de proteínas importantes no metabolismo da glicose

em suas formas ativadas (fosforiladas), como p-Akt e p-AMPK, no fígado,

tecido muscular esquelético e tecido adiposo de camundongos obesos

submetidos ao exercício agudo.

29

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

Camundongos C57BL6 machos, com 4 semanas de vida, foram adquiridos do

biotério central da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e mantidos em período de

claro/escuro (12h/12h) e temperatura (232ºC) controlados de acordo com os Princípios Éticos na

Experimentação Animal da Sociedade Brasileira de Ciências em Animais de Laboratórios. Estes

camundongos foram distribuídos inicialmente em dois grupos: controle que recebeu dieta padrão

CHOW (CTL), e, obeso (O) que recebeu dieta hiperlipídica (Tabela 1), durante 12 semanas. Ao

final desse período, o grupo obeso foi dividido em dois grupos: obeso não exercitado (O) e obeso

submetido a uma única sessão de exercício físico (OE). Todos os experimentos foram aprovados

pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNICAMP (protocolo nº 3087-1).

Tabela 1 - Composição da dieta hiperlipídica

Ingredientes g/Kg

Caseína 200

Amido 115,5

Dextrina 132

Sacarose 100

L-cistina 3

Fibra 50

Óleo de soja 40

Banha 312

Sais AIN93G** 35

Vitaminas AIN93G** 10

Cloridrato de colina 2,5

** Composição detalhada dada por Reeves e colaboradores (1993) (Reeves, Nielsen e Fahey, 1993).

30

3.2 CONSUMO MÁXIMO DE OXIGÊNIO (VO2 MÁX)

Após uma semana de familiarização ao ergômetro, foi avaliado o consumo

máximo de oxigênio dos camundongos. Para isso, foi utilizada esteira metabólica selada, (Pan

Lab/Harvad instruments, Barcelona, Espanha) com 25° de inclinação, acoplada ao sistema de

respirometria Oxylet system (Pan Lab/Harvad instruments, Barcelona, Espanha). Os valores do

consumo de oxigênio foram coletados utilizando-se o software Metabolism® (Pan Lab/Harvad

instruments, Barcelona, Espanha), também acoplado ao sistema. Os animais caminharam por 8

min (tempo médio necessário para a estabilização da concentração de oxigênio e calibração

automática do equipamento) e o teste iniciou com uma velocidade de 15 cm/s sendo acrescentado

mais 5 cm/s a cada min. O teste foi interrompido quando os animais passaram a se apoiar na base

inferior da esteira, demonstrando exaustão física. Consideramos o valor de VO2 máx quando a

curva de consumo de O2 atingiu um platô, a despeito do aumento da velocidade da esteira,

conforme protocolo descrito (Rezende et al., 2006).

3.3 SESSÃO DE EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO

Dez dias após a realização da análise do VO2 máx, os animais foram separados

nos grupos: controle (CTL), obeso (O) e obeso exercitado (OE). O grupo OE foi submetido a

uma única sessão de exercício físico com duração de 3 h e intensidade de 60 - 70 % do VO2 máx,

em esteira rolante Gesan®, com inclinação de 25°. Todas as mensurações feitas nesses

camundongos, in vivo e/ou ex vivo, foram executadas 30 min após a sessão de exercício (Figura

3).

31

Figura 3 – Protocolo Experimental. Protocolo para o teste de tolerância à glicose (A), teste de tolerância

à insulina (B), teste de tolerância ao piruvato (C) e coleta de órgãos para posterior análise (D). Todos os

experimentos foram realizados 30 min após a sessão de exercício físico.

3.4 AVALIAÇÃO DA OBESIDADE

A obesidade dos camundongos teve como parâmetros o ganho de peso dos

animais e o peso da gordura perigonadal. Para o cálculo do ganho de peso, os camundongos

foram pesados antes e após as 12 semanas de dieta, hiperlipídica ou padrão (CHOW) e, a

seguinte fórmula foi aplicada: ganho de peso = peso final – peso inicial. Esses camundongos

foram eutanasiados por saturação de CO2 seguida por decapitação, de acordo com as diretrizes da

Comissão de Ética em Experimentação Animal, sendo os tecidos: músculo gastrocnêmio e

gordura perigonadal retirados e pesados.

3.5 TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE INTRAPERITONEAL (IPGTT)

Para verificar a tolerância à glicose dos animais, foi realizado o ipGTT descrito

anteriormente (Rezende et al., 2012), com pequenas modificações. Após 12 semanas de dieta

hiperlipídica ou padrão (CHOW), os animais foram submetidos a um jejum de 10 h antes do

procedimento experimental. A glicemia foi avaliada antes (tempo 0’) e 15, 30, 60 e 120 min após

administração intraperitoneal de 1g/kg de glicose. A insulinemia também foi avaliada nos tempos

0, 15 e 30 min.

32

3.6 TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA INTRAPERITONEAL (IPITT)

Para verificar a tolerância à insulina, foi realizado o ITT intraperitonial (ipITT).

Após 12 semanas de dieta hiperlipídica ou padrão (CHOW), a glicemia foi avaliada antes (tempo

0’) e 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 60 min após administração intraperitoneal de 1 U/kg de insulina,

como já descrito (Brandimarti et al., 2013).

3.7 TESTE DE TOLERÂNCIA AO PIRUVATO INTRAPERITONEAL (IPPTT)

Para verificar a tolerância ao piruvato dos animais, foi realizado o ipPTT como

previamente descrito (Rodgers e Puigserver, 2007). Após 12 semanas de dieta hiperlipídica ou

padrão (CHOW), os animais foram submetidos a um jejum de 16h antes do procedimento

experimental. A glicemia foi avaliada antes (tempo 0’) e 15, 30, 60 e 90 min após administração

intraperitoneal de 1g/kg de piruvato.

3.8 CLEARANCE DE INSULINA

Para avaliação do clearance de insulina, durante o ipITT, amostras de plasma

foram coletados antes (tempo 0’) e 5, 15, 30 e 60 min após administração intraperitoneal de 1

U/kg de insulina. As concentrações de insulina foram, então, avaliadas, e a área sob a curva

(AUC) da insulinemia foi calculada, como descrito previamente (Brandimarti et al., 2013).

3.9 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS

Nos testes ipGTT, ipITT e ipPTT amostras de sangue foram obtidas através da

cauda dos animais e a glicemia medida pelo método da glicose oxidase, através do glicosímetro

33

Acucheck Performa II. No ipGTT e na avaliação do clearance de insulina, o plasma foi obtido

através da centrifugação do sangue e estocado a –20ºC, para posterior quantificação da insulina.

3.10 SECREÇÃO DE INSULINA ESTIMULADA POR GLICOSE

Ilhotas pancreáticas foram pré-incubadas em solução de Krebs 5,6 mM de

glicose por 1 h a 37°C. Após, as ilhotas foram incubadas com solução de Krebs contendo

diferentes concentrações de glicose (5.6, 11.2 ou 22.4 mM) por 1 h a 37°C. Amostras do

sobrenadante foram coletadas para posterior dosagem de insulina.

3.11 DOSAGEM DE INSULINA

A insulina contida no plasma dos animais e nas soluções de Krebs foi avaliada

por radioimunoensaio e, a curva padrão confeccionada com insulina de rato, de acordo com

método já estabelecido (Rezende et al., 2007).

3.12 SINALIZAÇÃO DE INSULINA NOS TECIDOS

Para avaliar a sinalização da insulina nos tecidos (fígado, músculo e tecido

adiposo), foi administrado 100 μl (10 U) de insulina humana regular (Humulin®R, Eli Lilly, São

Paulo, Brasil), via intraperitoneal, nos camundongos de todos os grupos (CTL, O e OE). Parte

dos camundongos do grupo CTL, ao invés de insulina, receberam 100 μl de salina, como

previamente descrito (Ribeiro et al., 2012). Após 10 min da administração de insulina ou salina,

os animais foram eutanasiados por saturação de CO2 seguida por decapitação, para retirada dos

tecidos a serem analisados. Para análise da expressão de Akt fosforilada (p-Akt), proteína da via

de sinalização da insulina, foi utilizada a técnica de Western blot descrita a seguir.

34

3.13 WESTERN BLOT

Alíquotas dos tecidos (fígado, músculo e tecido adiposo) foram

homogeneizadas e os extratos centrifugados a 12000 rpm 4°C por 30 min para remoção do

material insolúvel. As proteínas contidas nos extratos foram dosadas através do método de

Bradford, tendo como base uma curva padrão de albumina (BSA). As amostras foram tratadas

com tampão Laemmli (20 % do volume da amostra) contendo DDT 10 mM, aquecidas a 100ºC

por 5 min. Alíquotas com concentrações proteicas semelhantes foram aplicadas no SDS-PAGE

(10 % Tris acrilamida) em aparelho minigel (Miniprotean) em paralelo com marcadores de pesos

moleculares conhecidos. Após corrida eletroforética, as proteínas foram transferidas para

membrana de nitrocelulose. Esta foi incubada por duas horas em solução bloqueadora para

diminuir a ligação inespecífica das proteínas. As membranas foram então incubadas com

anticorpos primários específicos para as diferentes proteínas (anti-IDE, Abcam ab32216; anti-

IRβ, Cell Signaling #3025; anti-p-AKT thr308, Santa Cruz Biotechnology sc-16646-R; anti-p-

AMPK thr172, Cell Signaling #2531; anti-GAPDH, Sigma G9545) de um dia para o outro. Após

este procedimento, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário adequado, por 2

horas. Finalmente, as membranas foram reveladas por quimiluminescência utilizando o reagente

SuperSignal West Fento (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, EUA). A intensidade das

bandas foram medidas e quantificadas utilizando o software ImageJ (National Institutes of

Health, Maryland, EUA), sendo os valores das bandas normalizados pelos valores do controle

interno GAPDH.

3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA

ANOVA One-Way seguido de pós-teste Tukey foram empregados para análise

estatística dos resultados. As análises foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism 5.

Os dados foram expressos como média erro padrão da média (EPM) e o nível de significância

adotado foi de 5% (p<0,05).

35

4 RESULTADOS

4.1 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE ALGUNS PARÂMETROS METABÓLICOS DE CAMUNDONGOS

OBESOS

Como esperado, a dieta hiperlipídica induziu aumento do peso corporal e da

massa de tecido adiposo perigonadal, mas não alterou a massa do músculo esquelético

gastrocnêmio. O exercício agudo não alterou esses parâmetros nos camundongos obesos,

entretanto, reverteu a hiperglicemia e hiperinsulinemia, induzidas pela dieta hiperlipídica (Tabela

2).

Tabela 2 – Parâmetros metabólicos. Controle (CTL), obeso (O) e obeso exercitado (OE). Os

dados foram expressos como média EPM, n=6-8.

Parâmetros CTL O OE

Peso Corporal (g) 26,94±0,45 36,75±1,46* 35,42±1,07*

Ganho de peso (g) 11,18±0,91 17,40±1,07* 17,22±1,64*

Gordura perigonadal (% do peso corporal) 0,23± 0,02 1,15± 0,16* 1,01+ 0,22*

Músculo gastrocnêmio (% do peso corporal) 0,15± 0,005 0,15± 0,007 0,16± 0,002

Glicemia de jejum (mg/dl) 93,75± 4,54 149,80±21,11* 85,14±14,34#

Insulinemia de jejum (ng/ml) 0,12± 0,015 1,06± 0,27* 0,3193± 0,06#

*p ≤ 0.05 vs controle; #p ≤ 0.05 vs obeso.

4.2 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA À GLICOSE EM CAMUNDONGOS OBESOS

A redução da glicemia, pelo exercício agudo, poderia ser explicada por um

aumento da tolerância à glicose e/ou pela redução da produção hepática de glicose. Portanto,

primeiramente, foi realizado o ipGTT. Como esperado, camundongos obesos apresentaram um

padrão hiperglicêmico comparado ao grupo controle durante o teste (Figuras 4A), indicando

intolerância à glicose nesses animais, e, o exercício agudo foi capaz de melhorar a tolerância à

36

glicose em camundongos obesos, como demonstrado pelo gráfico da AUC da glicemia (Figura

4B). Durante o ipGTT foram coletados amostras de plasma para avaliação da insulinemia. Nos

camundongos obesos a intolerância à glicose foi acompanhada por um aumento significativo da

insulinemia, comparado ao grupo controle (Figura 4C). Entretanto, o exercício agudo reverteu o

aumento da insulinemia nos obesos, como obervado na Figura 4D.

0 30 60 90 1200

100

200

300

400CTL

O

OE

*

* *

*

*

#

#

A

Tempo (min)

Glic

em

ia (m

g/d

L)

CTL O OE0

10000

20000

30000

40000

*

#

B

AU

C d

a g

licem

ia

(mg

/dl p

er m

in)

0 15 300.0

0.5

1.0

1.5

*

*

#

C

O

OE

C

Tempo (min)

Insu

linem

ia (

ng/m

l)

CTL O OE0

5

10

15

*

#

D

AU

C d

a in

sulin

em

ia

(ng/m

l per m

in)

Figura 4 – Efeito do exercício agudo sobre a glicemia e insulinemia em camundongos obesos durante

o ipGTT. Glicemia nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 min (A) e insulinemia nos tempos 0, 15 e 30 min (C)

após injeção intraperitoneal de 1 g/kg de glicose em camundongos submetidos a 10 h de jejum. AUC da

glicemia (B) e insulinemia (D). Controle (CTL), obeso (O) e obeso exercitado (OE). Os dados foram

expressos como média EPM, n=6-8. *p≤0.05 vs controle; #p≤0,05 vs obeso.

37

4.3 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA À INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS

Para avaliação da tolerância à insulina foi realizado o ipITT. Como esperado,

camundongos obesos apresentaram redução da tolerância à insulina quando comparados com o

grupo controle (Figura 5A). Entretanto, em camundongos obesos, submetidos a uma única sessão

de exercício físico, a tolerância à insulina foi restaurada, como evidenciado pela AUC da

glicemia durante o teste (Figura 5B).

0 15 30 45 600

25

50

75

100

125

CTL

O

OE

*

#

*

# ##

A

Tempo (min)

Glic

em

ia

(% d

o b

asal)

CTL O OE0

1000

2000

3000

4000 *

#

B

AU

C d

a g

licem

ia

(% d

o b

asa

l)

Figura 5 – Efeito do exercício agudo sobre a tolerância à insulina em camundongos obesos. Glicemia

nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 60 min (A) e, AUC da glicemia (B) após injeção intraperitoneal de 1

U/kg de insulina em camundongos alimentados. Controle (CTL), obeso (O) e obeso exercitado (OE). Os

dados foram expressos como média EPM, n=5-6. *p≤0.05 vs controle; #p≤0,05 vs obeso.

38

4.4 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A TOLERÂNCIA AO PIRUVATO EM CAMUNDONGOS OBESOS

Para determinar o efeito do exercício agudo sobre a produção hepática de

glicose em camundongos obesos, foi realizado o ipPTT. Como demonstrado na Figura 6A,

camundongos obesos apresentaram uma curva glicêmica elevada, comparado ao grupo controle,

indicando um provável aumento da PHG. O exercício agudo normalizou a curva glicêmica nos

camundongos obesos, indicando redução da PHG, como observado nas Figuras 6A e 6B.

0 30 60 900

50

100

150

200

CTL

O

OE

*

*

##

*

#

*

#

A

Tempo (min)

Glic

em

ia (

mg

/dL

)

CTL O OE0

5000

10000

15000

20000

*

#

B

AU

C d

a g

licem

ia

(mg

/dl p

er m

in)

Figura 6 – Efeito do exercício agudo sobre a glicemia em camundongos obesos durante o ipPTT.

Glicemia nos tempos 0, 15, 30, 60 e 90 min (A) e AUC da glicemia (B) após injeção intraperitoneal de 1

g/kg de piruvato em camundongos submetidos a 16 h de jejum. Controle (CTL), obeso (O) e obeso

exercitado (OE). Os dados foram expressos como média EPM, n=5-6. *p≤0.05 vs controle; #p≤0,05 vs

obeso.

39

4.5 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE A SECREÇÃO DE INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS

A redução da insulinemia nos camundongos obesos exercitados pode ser

explicada por alterações na secreção e/ou no clearance da insulina. Primeiramente, foi avaliada,

em ilhotas pancreáticas isoladas, a secreção de insulina estimulada por diferentes concentrações

de glicose. Como observado na Figura 7A, ilhotas de camundongos obesos apresentaram maior

secreção de insulina, comparado ao grupo controle, em todas as concentrações de glicose

utilizadas. Nas ilhotas de camundongos obesos exercitados, a secreção foi similar ao observado

nas ilhotas controles, em todas as concentrações de glicose (Figura 7A). Como esperado,

camundongos obesos apresentaram aumento no conteúdo de insulina das ilhotas pancreáticas,

comparado ao grupo controle e, o exercício agudo não alterou esse parâmetro (Figura 7B).

0.0

1.5

3.0

7.5

10.0

12.5

5.6 mM 11.2 mM 22.4 mM

*

#

*

#* #

CTL

O

OE

A

Secre

ção d

e in

sulin

a

(ng

/ml p

er

h p

er ilh

ota

)

CTL O OE0

500

1000

1500* *

B

Conte

údo d

e in

sulin

a

(ng

/ml p

er ilh

ota

)

Figura 7 – Efeito do exercício agudo sobre a secreção de insulina em camundongos obesos. Secreção

de insulina estimulada por 5.6, 11.2 e 22.4 mM de glicose (A), e conteúdo total de insulina (B) de ilhotas

pancreáticas isoladas de camundongos controles (CTL), obesos (O) e obesos exercitados (OE). Os dados

foram expressos como média EPM, n=5-6. *p≤0.05 vs controle; #p≤0,05 vs obeso.

40

4.6 EFEITO DO EXERCÍCIO AGUDO SOBRE O CLEARANCE DE INSULINA EM CAMUNDONGOS OBESOS

Logo após a administração intraperitoneal de insulina, a insulinemia aumentou,

atingindo o ápice após 15 min. A seguir e, ao longo do tempo, observa-se uma redução gradativa

da insulinemia, em todos os grupos. Porém, o grupo obeso apresentou concentrações plasmáticas

de insulina mais elevadas ao longo do tempo, comparado ao grupo controle (Figura 8A e 8B).

Esses resultados indicam redução do clearance de insulina nos obesos. Entretanto, quando os

camundongos obesos foram submetidos ao exercício agudo, as concentrações plasmáticas de

insulina voltaram aos níveis do grupo controle, provavelmente, pela restauração do clearance de

insulina nesses animais (Figuras 8A e 8B).

0 15 30 45 60

0

40

80

120

C

O

OE

*

#

#*

A

Tempo (min)

Insu

linem

ia (

ng/m

l)

C O OE0

1000

2000

3000

4000 *

#

B

AU

C d

a in

sulin

em

ia

(ng

/ml p

er m

in)

Figura 8 – Efeito do exercício agudo sobre o clearance de insulina em camundongos obesos.

Insulinemia nos tempos 0, 5, 15, 30 e 60 min (A) e AUC da insulinemia (B) após injeção intraperitoneal

de 1 U/kg de insulina em camundongos alimentados. Controle (CTL), obeso (O) e obeso exercitado (OE).

Os dados foram expressos como média EPM, n=6-8. *p≤0.05 vs controle; #p≤0,05 vs obeso.

41

4.7 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO SOBRE A EXPRESSÃO PROTEICA DE IDE E IR EM

CAMUNDONGOS OBESOS

O clearance de insulina ocorre principalmente no fígado e, em menor grau, em

outros tecidos sensíveis á insulina, como músculo esquelético e tecido adiposo. Como este

processo depende, basicamente, da ligação da insulina ao IR e degradação pela IDE, foram

analisadas a expressão dessas duas proteínas, no fígado, músculo gastrocnêmio e, tecido adiposo

perigonadal. No fígado de camundongos obesos, tanto a expressão de IDE (Figura 9A) quanto de

IR (Figura 9B) foram reduzidas, comparadas ao controle, justificando a redução do clearance de

insulina nesse grupo. O exercício agudo, em camundongos obesos, aumentou as concentrações

dessas proteínas no fígado, o que, provavelmente, explica o aumento do clearance de insulina,

induzido pelo exercício. No músculo gastrocnêmio, não houve diferença na expressão dessas

proteínas entre obeso e controle (Figura 9C e 9D). Entretanto, o exercício agudo aumentou a

expressão tanto de IR quanto de IDE nesse tecido, demonstrando um possível papel do músculo

esquelético no aumento do clearance de insulina, induzido pelo exercício. No tecido adiposo

perigonadal, não houve diferença na expressão de ambas as proteínas analisadas (Figuras 9E e

9F).

42

Figura 9 – Efeito do exercício agudo sobre a expressão proteica de IDE e IR em camundongos

obesos. Expressão proteica de IDE e IR, e suas respectivas imagens representativas no fígado (A e B), no

músculo gastrocnêmio (C e D) e no tecido adiposo perigonadal (E e F) de camundongos controles (CTL),

obesos (O) e obesos exercitados (OE). Os dados foram expressos como média EPM, n=5-6. *p≤0.05 vs

controle; #p≤0,05 vs obeso.

4.8 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AGUDO SOBRE A EXPRESSÃO PROTEICA DE P-AKT E P-AMPK EM

CAMUNDONGOS OBESOS

Como esperado, a administração de insulina nos camundongos controles

aumentou as concentrações de p-Akt em todos os tecidos analisados, comparado aos controles

que não receberam insulina (Figura 10). Após administração de insulina, houve redução de p-Akt

no fígado de obesos, comparado ao grupo controle e, o exercício agudo restaurou as

concentrações de p-Akt no fígado dos obesos (Figura 10A). No músculo gastrocnêmio, apesar de

haver uma tendência de redução da p-Akt, não houve diferenças significativas entre obesos e

controles. Entretanto, o exercício agudo em camundongos obesos induziu aumento significativo

de p-Akt nesse tecido (Figura 10C). No tecido adiposo perigonadal não houve diferenças nos

níveis de p-Akt entre os grupos estimulados com insulina (Figura 10E). Diferente da Akt, a

43

fosforilação e consequente ativação da AMPK promove translocação de GLUT 4 para a

membrana plasmática por uma via independente da insulina. No fígado, a dieta hiperlipídica

reduziu, significativamente, as concentrações de p-AMPK e o exercício agudo não foi capaz de

restaurar essa alteração (Figura 10B). No músculo gastrocnêmio, as concentrações de p-AMPK

nos camundongos obesos foram semelhantes ao grupo controle, entretanto, uma única sessão de

exercício físico aumentou, significativamente, as concentrações de p-AMPK em obesos (Figura

10D). No tecido adiposo perigonadal houve redução de p-AMPK no grupo obeso, comparado ao

grupo controle, porém o exercício agudo não reverteu essa redução em camundongos obesos

(Figura 10F).

Figura 10 – Efeito do exercício agudo sobre a expressão proteica de p-AKT e p-AMPK em

camundongos obesos. Expressão proteica de p-AKT e suas respectivas imagens representativas no fígado

(A), no músculo gastrocnêmio (C) e no tecido adiposo perigonadal (E) após administração de insulina (+)

ou salina (-). Expressão de p-AMPK no fígado (B), no músculo gastrocnêmio (D) e no tecido adiposo

perigonadal (F). Controles (CTL), obesos (O) e obesos exercitados (OE). Os dados foram expressos como

média EPM, n=5-6. §p≤0,05 vs controle salina; *p≤0.05 vs controle insulina; #p≤0,05 vs obeso.

44

5 DISCUSSÃO

O modelo de obesidade por dieta hiperlipídica é bem estabelecido e seus efeitos

deletérios já foram descritos em inúmeros trabalhos (Oscai, 1982; Shiota et al., 2001; De Souza

et al., 2005). Muitos desses efeitos, como: o ganho de peso e aumento do tecido adiposo,

hiperglicemia e hiperinsulinemia de jejum (Tabela 2), intolerância à glicose e à insulina (Figuras

4 e 5), provável aumento da PHG (Figura 6) e, aumento da secreção de insulina (Figura 7A)

foram reproduzidos neste trabalho. Tais resultados demonstram a efetividade da dieta

hiperlipídica, utilizada para provocar a obesidade. Além dos efeitos esperados descritos acima,

observamos, ainda, redução do clearance de insulina em camundongos alimentados com dieta

hiperlipídica (Figura 8). Por outro lado, o exercício físico agudo, praticamente, reverteu todas as

alterações encontradas nos camundongos obesos, ou seja: hiperglicemia e hiperinsulinemia de

jejum (Tabela 2), intolerância à glicose e à insulina (Figuras 4 e 5), aumento da PHG (Figura 6),

hipersecreção (Figura 7) e redução clearance de insulina (Figura 8).

Em obesos, a hiperglicemia resulta, principalmente, da menor captação de glicose pelos

tecidos responsivos à insulina, especialmente, músculo esquelético e tecido adiposo. Nesses

tecidos, a captação de glicose depende da migração de vesículas contendo GLUT4 para

membrana plasmática. Essa migração está sob controle de duas proteínas da família TBC1 (do

inglês “tre-2/USP6, BUB2, cdc16”): TBC1D4 ou AS160 (do inglês “Akt substrate of 160 kDa”),

e TBC1D1. Nas formas ativas, AS160 e TBC1D1 hidrolisam GTP a GDP ligados a Rab-GAP (do

inglês “Rab GTPase-activating protein”) tornando essas proteínas menos ativas, reduzindo o

tráfego de vesículas contendo GLUT4 (Sakamoto e Holman, 2008). AS160 e TBC1D1 são

inativadas através de várias fosforilações, efetuadas pelas proteínas quinases Akt e AMPK. Essas

proteínas são ativadas (através da fosforilação de determinados resíduos) por vias diferentes; a)

através da sinalização intracelular da insulina (Bruss et al., 2005) e, b) em condições de baixos

níveis energéticos, ou seja, quando da razão intracelular AMP/ATP está elevada (Viollet et al.,

2006), respectivamente.

Corroborando a literatura, observamos que camundongos obesos apresentaram redução da

concentração de p-Akt no fígado (Figura 10A), indicando menor sensibilidade à insulina. Além

disso, foi observada redução de p-AMPK no fígado e tecido adiposo perigonadal (Figuras 10B e

10F) nos mesmos camundongos, indicando possíveis alterações no metabolismo de glicose e

45

lipídeos. No fígado, AMPK possui importante papel no controle do metabolismo hepático e, sua

ativação estimula a oxidação de ácidos graxos e inibe a lipogênise, a produção de glicose e a

síntese proteica (Viollet et al., 2006). A redução da ativação de AMPK no fígado de obesos

parece ocorrer devido a redução da liberação ou sensibilidade a adipocinas, como adiponectina e

leptina, respectivamente, cujas vias de sinalização levam a fosforilação e ativação de AMPK

(Hardie, 2008; Ix e Sharma, 2010). No tecido adiposo, a ativação de AMPK aumenta a captação

de glicose e oxidação de ácidos graxos, além de reduzir a lipogênese (Daval, Foufelle e Ferré,

2006; Bijland, Mancini e Salt, 2013). Assim, as observações feitas neste trabalho corroboram

com resultados de outros autores relacionados à redução da expressão de p-AMPK no tecido

adiposo, em modelos de obesidade induzida por dieta hiperlipídica, (Pang, Choi e Park, 2008;

Fei-Wang et al., 2012), efeito já esperado nessas condições patológicas em que há prejuízos no

metabolismo de carboidratos e lipídeos. Além disso, a redução de p-AMPK parece estar

associada ao aumento da massa de tecido adiposo (Fei-Wang et al., 2012), uma vez que essa

proteína, quando fosforilada, inibe a lipogênese nesse tecido.

Por outro lado, uma única sessão de exercício físico, em camundongos obesos, aumentou

os níveis de p-Akt, no fígado e músculo gastrocnêmio (Figuras 10A e 10C), concordando com o

aumento da tolerância à insulina observada através do ipITT nesses animais (Figura 5). Além

disso, também observamos aumento dos níveis de p-AMPK, porém, apenas no músculo

gastrocnêmio dos camundongos obesos exercitados (Figuras 10D). Esses resultados podem

explicar, pelo menos em parte, a melhora do controle glicêmico induzido pelo exercício agudo

nesses obesos.

A redução da glicemia pelo exercício agudo em condições patológicas, como obesidade e

diabetes, já esta bem estabelecida e pode ocorrer devido a dois principais eventos: 1) aumento da

mobilização de GLUT4 para a membrana plasmática no tecido muscular esquelético (Kennedy et

al., 1999; Jessen e Goodyear, 2005), principalmente via ativação de AMPK (Hardie, 2008) e, 2)

redução da PHG, principalmente via ativação da Akt (De Souza et al., 2010).

Durante o exercício físico, a contração muscular consome grande quantidade de ATP,

elevando as concentrações de AMP intracelular o que estimula a fosforilação e ativação de

AMPK (Kahn et al., 2005). A ativação dessa via, nas células musculares, além de estimular a

captação de glicose, independente da sinalização da insulina, também pode aumentar a

sensibilidade a esse hormônio, potencializando a captação de glicose (O'neill, 2013). Diante

46

desses e outros efeitos benéficos, a AMPK é um importante alvo terapêutico, muito utilizado no

tratamento do DM2 (Fryer, Parbu-Patel e Carling, 2002). Portanto, o fato do exercício físico ser

um ativador não farmacológico dessa via, justifica a sua indicação a pacientes obesos e diabéticos

tipo 2.

Além de promover maior captação de glicose pelo músculo esquelético, o exercício agudo

parece reduzir a PHG (Figura 6). Este efeito inibitório do exercício agudo sobre a PHG em

modelos de obesidade e diabetes parece ser explicado pela melhora da sensibilidade à insulina

com consequente aumento da fosforilação e ativação da Akt (De Souza et al., 2010). Portanto, o

aumento de p-Akt no fígado (Figura 10A) dos camundongos obesos, submetidos ao exercício

agudo, pode explicar, pelo menos em parte, a redução da glicemia desses camundongos durante o

ipPTT (Figura 6), sugerindo redução da PHG.

Assim como em pacientes obesos, os camundongos alimentados com dieta hiperlipídica

apresentaram altas concentrações de insulina no plasma. Essa hiperinsulinemia pode ser

explicada não apenas pela hipersecreção de insulina, mas também pela redução do clearance

desse hormônio (Bonora et al., 1984; Polonsky et al., 1988). Parece existir uma correlação entre

IMC, secreção e clearance de insulina. Foi observado um paralelismo entre o aumento do IMC e

da secreção de insulina. Contudo, o aumento da secreção do hormônio rapidamente atinge um

platô, enquanto o clearance de insulina reduz progressivamente, indicando ser este processo o

principal mecanismo responsável pela elevação da insulinemia em obesos (Erdmann et al., 2009).

Entretanto, em modelos de obesidade, este efeito sobre o clearance de insulina ainda é

controverso. Em roedores obesos, por dieta de cafeteria, foi observado tanto aumento do

clearance, via aumento da expressão gênica e atividade da IDE (Castell-Auví et al., 2012),

quanto redução do clearance de insulina, via redução da expressão gênica e proteica da IDE

(Brandimarti et al., 2013). Recentemente, um estudo utilizando dieta hiperlipídica, demonstrou

aumento da atividade e expressão gênica de IDE no fígado de camundongos obesos, indicando

possível aumento do clearance de insulina nesses animais (Wei et al., 2014). Entretanto, neste

trabalho, observamos que camundongos obesos alimentados com dieta hiperlipídica apresentam

redução do clearance de insulina e menor expressão proteica de IDE e IR no fígado (Figuras 9A

e 9B), fato que explica, juntamente com o aumento de secreção de insulina, a hiperinsulinemia

desses obesos. Quando esses camundongos obesos são submetidos ao exercício físico agudo, essa

hiperinsulinemia é normalizada.

47

Trabalhos anteriores já demonstraram redução da insulinemia, induzida pelo exercício

físico (Björntorp, 1981; Musi et al., 2001), entretanto este efeito é atribuído principalmente a

redução da secreção de insulina. No presente trabalho, confirmamos essa redução na secreção de

insulina nos camundongos obesos exercitados (Figura 7A). Tal redução ocorre, provavelmente,

devido a estimulação do sistema nervoso simpático no pâncreas (Aarnio, Lauritsen e Dela, 2001).

Além desse efeito do exercício agudo sobre a redução da secreção, demonstramos que o exercício

agudo aumenta o clearance de insulina (Figura 8), contribuindo para redução da insulinemia nos

camundongos obesos. Esse efeito sobre o clearance de insulina, induzido pelo exercício agudo,

pode ser explicado pelo aumento da expressão proteica de IR e IDE no fígado e no músculo

gastrocnêmio dos obesos exercitados (Figuras 9A, 9B, 9C e 9D). No músculo gastrocnêmio, o

aumento da expressão de IR e IDE indica um possível papel do tecido muscular esquelético no

clearance de insulina, durante uma atividade física (Figuras 9C e 9D). Tal aumento de expressão

proteica pode ocorrer devido a vias ativadas pela contração muscular, entretanto, estudos mais

aprofundados são necessários para a confirmação dessa suposição. No fígado, o aumento da

expressão de IR e IDE, induzidos pelo exercício agudo, possivelmente decorre da sinalização de

moléculas secretadas pelo músculo esquelético, as miocinas (Pedersen e Febbraio, 2012).

Portanto, um maior entendimento dessas miocinas poderia contribuir para o conhecimento sobre

o controle da degradação e clearance de insulina.

Em camundongos knockout para IDE, foi observado concentrações elevadas de insulina

plasmática. Em consequência dessa hiperinsulinemia crônica, esses camundongos apresentam um

fenótipo diabético importante, com intolerância a glicose e a insulina, além de aumento

considerável do peso corporal (Abdul-Hay et al., 2011). Além disso, sabe-se que um modelo de

diabetes muito utilizado, o rato Goto-Kakizaki (Goto, Kakizaki e Masaki, 1976), apresenta

mutações no gene da IDE e consequente redução da eficiência da degradação da insulina, o que

leva ao fenótipo diabético desses roedores (Farris et al., 2004). A resistência à insulina,

encontrada nesses animais com deficiência na expressão de IDE, se deve a hiperinsulinemia

ocasionada pela degradação ineficiente da insulina. Altos níveis de insulina podem ativar vias de

feedback negativo da sinalização do hormônio, como a via mTOR/S6K1 (Ye, 2007), reduzindo a

resposta a ele na célula. Neste contexto, a indução da expressão e/ou atividade da IDE poderia

prevenir esse feedback negativo por reduzir o nível de insulina circulante, melhorando a

sensibilidade a insulina (Wei et al., 2014). Corroborando essa hipótese, nos tecidos (fígado e

48

músculo esquelético) em que houve aumento da expressão proteica de IDE, também foram

encontrados maiores concentrações proteicas de p-Akt (Figura 10C), enquanto no tecido adiposo,

onde não houve aumento de IDE, a p-Akt mostrou-se inalterada (Figura 10E). Portanto, o

aumento da expressão de IDE, poderia ser um novo mecanismo pelo qual o exercício físico

melhora a sensibilidade à insulina.

Em resumo, e como já descrito na literatura, observamos que em camundongos obesos

alimentados com dieta hiperlipídica, o exercício físico agudo reduz a glicemia, provavelmente,

através do aumento da captação de glicose e redução da PHG. Essa redução da glicemia,

associada ao aumento da sensibilidade à insulina, explica a redução da insulinemia nos obesos

exercitados. Neste trabalho, demonstramos que além da redução da secreção de insulina o

exercício físico colabora com a redução da hiperinsulinemia através do aumento do clearance de

insulina, provavelmente via aumento da expressão de IDE e IR no fígado e no músculo

esquelético.

49

CONCLUSÃO

Os resultados deste trabalho indicam um possível novo mecanismo pelo qual o

exercício físico reduz a insulinemia em camundongos obesos, ou seja: o aumento do clearance de

insulina, provavelmente, via aumento da expressão proteica de IDE e IR. Estes resultados

indicam que, em obesos, o aumento do clearance de insulina pode desempenhar um papel

importante na redução da insulinemia. Diante disso, estratégias farmacológicas dirigidas ao

aumento do clearance de insulina podem se constituir em uma ferramenta importante na

prevenção e/ou tratamento de doenças relacionadas à hiperinsulinemia, como obesidade e DM2.

Portanto, é indicado um estudo aprofundado sobre os mecanismos pelo qual o exercício físico

aumenta a expressão de proteínas como IDE e IR, envolvidas no processo do clearance de

insulina.

50

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ANEXOS

universidade estadual de...

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