universidade estadual do cearÁ faculdade de … · azitromicina (91,3%), seguido de ampicilina...
TRANSCRIPT
ELISÂNGELA DE SOUZA LOPES
PERFIL DE ENTEROBACTÉRIAS ISOLADAS DE PSITACÍDEOS DO TRÁFICO DE
AVES SILVESTRES DO ESTADO DO CEARÁ
FORTALEZA-CEARÁ
2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ELISÂNGELA DE SOUZA LOPES
PERFIL DE ENTEROBACTÉRIAS ISOLADAS DE PSITACÍDEOS DO TRÁFICO DE
AVES SILVESTRES DO ESTADO DO CEARÁ
FORTALEZA-CEARÁ
2016
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em
Ciências Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de doutor em Ciências
Veterinárias. Área de concentração:
Reprodução e Sanidade Animal.
Orientador: Prof. Dr. William Cardoso Maciel
Co-orientador: Dr. Régis Siqueira de Castro
Teixeira
ELISÂNGELA DE SOUZA LOPES
PERFIL DE ENTEROBACTÉRIAS ISOLADAS DE PSITACÍDEOS DO TRÁFICO DE
AVES SILVESTRES DO ESTADO DO CEARÁ
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em
Ciências Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Aprovada em: 12 de Dezembro de 2016
BANCA EXAMINADORA
Dedico aos meus pais Jorge Alves Lopes (in
memoriam) A minha mãe Dulcineide de Souza
Lopes que sempre torceram por meu sucesso, a
minha irmã Emylly Andreza Souza Lopes com
seu jeito doce e meigo me cativa e torço para
que você encontre o caminho do sucesso. Ao
meu filho o único amor verdadeiro que existe.
Ao meu marido Edivaldo da Silva Alves que
junto comigo acompanhou minhas desilusões,
lamentações, as dificuldades do mestrado e
agora do doutorado. E a minha Luna que me
faz feliz com sua alegria de me receber em
casa todos os dias.
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me dado forças e determinação de cumprir essa etapa da minha vida que foi a
conclusão do doutorado.
À Universidade Estadual do Ceará – UECE representada pelo Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias – PPGCV- e seu corpo docente, pela competência e conduta na
transmissão de seus ensinamentos.
Ao Laboratório de Estudos Ornitológicos - LABEO, pela oportunidade de conhecer o mundo
das aves e da pesquisa científica.
Ao Laboratório de Toxinologia Molecular da Universidade Federal do Ceará que muito
contribui para os ensinamentos moleculares dos micro-organismos.
Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), pelo apoio
financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio durante os cursos de mestrado e doutorado,
contribuindo para a conclusão de uma etapa importante da minha vida.
A Fundação Oswaldo Cruz, onde as amostras foram sorotipadas.
Ao meu orientador Prof. Dr. William Cardoso Maciel que me concedeu a oportunidade de
realizar o mestrado e o doutorado e de conhecer esse mundo dos micro-organismos no qual eu
me apaixonei.
Ao professor Alexandre Havt Bindá pela oportunidade que nos foi concedida para realizar
nossos trabalhos em seu laboratório. A Pedro Henrique Quintela Soares de Medeiros e
Mariana Duarte Bona pela paciência, competência em nos ensinar os primeiros passos dos
estudos moleculares.
Ao professor Ricardo Barbosa de Lucena e ao Doutor Temístocles Soares de Oliveira Neto
que foram incrivelmente receptivos no Laboratório de Patologia Veterinária (LPV) da
Universidade Federal da Paraíba - Campus Areia/PB agradeço à competência em nos ensinar
as práticas histológicas.
A querida amiga Dra. Rosa Patrícia Ramos Salles que me ajudou com seus ensinamentos,
com seu carinho, nos momentos de desespero, quando faltava material era a ela que sempre
nos auxiliava. Pessoa forte e guerreira. Um forte abraço.
Ao meu queridíssimo, amado e carinhoso amigo Isaac Neto Goes da Silva que também
sempre nos auxiliou nos momentos que mais precisávamos nos envolvendo com sua calma e
tranquilidade.
Ao meu amigo Régis Siqueira de Castro Teixeira pela paciência de sempre me ouvir, de
aguentar minhas lamentações, de nos fazer voltar à razão, de me orientar em tudo, seja no
percurso da vida espiritual ou na vida acadêmica e científica. A melhor orientação que tive
nesses oitos anos que estou no laboratório. Obrigada por todos esses anos de dedicação,
amizade, companheirismo e compromisso.
Ao Guilherme Augusto Marietto Gonçalves que sempre esteve presente virtualmente na hora
que sempre precisei, nas dúvidas que tive e que sempre foram esclarecidas. Meu muito
Obrigada.
A Átilla Holanda de Albuquerque um que esteve comigo ao longo da jornada da graduação,
depois mestrado e doutorado. A pessoa mais engraçada, divertida, de um humor inigualável,
que dá carinho do modo dele mais sei que é verdadeiro. Uma amizade que cultivamos ao
longo desses anos a ponto de um ajudar ao outro sem cobrar nada em troca, sua amizade
quero levar até o último dia da minha vida porque sei que posso contar com você e você sabe
que pode sempre contar comigo.
A Débora Nishi Machado que conheci durante o Mestrado que chegou tímida ao Labeo mais
que aos poucos foi se entregando a insanidade dos loucos do laboratório, mais que me cativou
de um modo único. Uma pessoa íntegra, responsável, dedicada, companheira e séria.
Obrigada Nishi e Átilla pela consideração e compromisso que sempre tiveram nos momentos
que precisei. Amo vocês.
Aos alunos da pós-graduação: os doutorandos Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra e
Ruben Horn Vasconcelos pela ajuda nos trabalhos na microbiologia. Aos mestrandos: Suzan
Vitória Girão agradeço pelos momentos de estudos e alegria, ao Jackson Forte Beleza sua
humildade e força de vontade torna você um grande batalhador do conhecimento, Raul
Antunes Siqueira Silva obrigada pela ajuda na microbiologia e nos trabalhos histológicos. A
Fernanda Gaio Conceição uma pessoa que se tornou especial para mim, você é muito
iluminada.
Aos estudantes de iniciação científica do Laboratório de Estudos Ornitológicos - LABEO:
Bruno Pessoa Lima, Adson Ribeiro Marques, Marcel Freitas de Lucena, Ana Paula Andrade,
Cecília Casemiro Carmo, Felipe Rebouças Oliveira, Neilton Monteiro Pascoal Filho pela
ajuda durante a realização da parte prática do trabalho e por compartilhar momentos incríveis
de descontração no laboratório, vocês foram essenciais para a realização dos experimentos.
Agradeço ao Francisco Wallison Silva Cavalcante que me auxiliou nos trabalhos dos
experimentos, na manutenção dos galpões experimentais e em tudo que foi solicitado.
Ao Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) por permitir as coleta nas aves, a
Médica Veterinária Fernanda Conceição Gaio e aos tratadores, pois sem eles não seria
possível realizar o trabalho.
Aos membros da banca que reservaram um tempo para corrigir o trabalho de doutorado.
Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a execução dos trabalhos. Meus
sinceros agradecimentos.
RESUMO
O tráfico de animais silvestres representa a maior ameaça para a fauna silvestre do Brasil. O
objetivo desse trabalho foi identificar enterobacterias isoladas de aves da ordem
Psittaciformes provenientes do Centro de Triagem de Animais Silvestres-CETAS de
Fortaleza-CE. Capítulo 1 – pesquisar a ocorrência de enterobactérias na microbiota intestinal
de psitacídeos provenientes do tráfico e avaliar o perfil de resistência dos antibióticos das
amostras isoladas. Dentre as enterobacterias isoladas Escherichia coli foi a mais frequente
(46,5%) e, dos doze antibióticos testados, as cepas apresentaram maior resistência à
azitromicina (91,3%), seguido de ampicilina (51,6%) e sulfonamida (38,5%). Escherichia coli
foi a espécie que apresentou um percentual de 92,3% de resistência a azitromicina. Somente
uma amostra de Salmonella do sorotipo Saintpaul foi detectada e isolada de uma das espécies
de psitacídeos estudados. Capítulo 2 – identificar sorogrupos de E. coli importantes para a
saúde humana, assim como detectar a atividade hemolítica e produção de Betalactamase de
Espectro Estendido (ESBL). Das 78 amostras isoladas 31 soroaglutinaram, sendo o O127 o
mais frequente seguido do O114 e do O128. Considerando as amostras sororreagentes em
qualquer um dos sorogrupos avaliados, observou-se que 4 (5,1%) e 16 (20,5%) cepas de E.
coli apresentaram produção de hemolisinas e produção de ESBL, respectivamente. Entre as
amostras não sororreagentes, observou-se que 5 (6,4%) apresentaram atividade hemolítica e
19 (24,4%) produção de ESBL. Somente três amostras foram positivas para os três testes
utilizados e estavam relacionadas aos grupos O86, O127 e O114 e 26 cepas foram negativas
para a produção de ESBL. Capítulo 3 - analisar através da Reação em Cadeia da Polimerase
cepas de E. coli diarreiogênicas. Foram utilizados os seguintes genes stx1 e stx2 para
identificação de E. coli produtora de toxina Shiga - STEC; eltB e estA para E.
coli enterotoxigênica - ETEC; eaeA e bfpA para E. coli enteropatogênica -
EPEC; ipaH para E. coli enteroinvasiva - EIEC; e aatA e aaiC para E. coli enteroagregativa –
EAEC. Somente os genes eaeA e bfpA foram diagnosticados nas amostras pesquisadas.
Capítulo 4 – avaliar a excreção, capacidade invasiva e alterações anatomohistopatológicas
em periquitos australianos inoculados, experimentalmente, com Salmonella Saintpaul isolada
de papagaio do tráfico (Amazonas amazonica).
Palavras-chave: Psittaciformes. Salmonella. Escherichia coli. Zoonose. Saúde Pública.
ABSTRACT
Illegal wildlife trade represents a major threat to the Brazilian native fauna. This study aimed
to identify enterobacteria isolated from Psittaciformes from the local Wildlife Rehabilitation
Center of Fortaleza, Brazil. Chapter 1 – This study aimed to evaluate the prevalence of
enterobacteria from the intestinal microbiota of psittacine from illegal wildlife trade and the
antimicrobial resistance profile of these isolates. Among the isolated enterobacteria,
Escherichia coli was the most frequent (46.5%) and azithromycin was the antibiotic to which
the isolates presented more resistance (91.3%) most frequently, followed by ampicillin
(51.6%) and sulfonamide (38.5%). Onle one strain of Salmonella ser. Saintpaul was isolated
from one psittacine in this study. Chapter 2 – Identification of E. coli serogroups important
for the human health. In addition, production of hemolysis and extended spectrum beta
lactamases (ESBL) was assessed in these isolates. Out of 78 strains used in this study, 31
were positive for the serogroups studied, in which O127 was the most frequent, followed by
O114 and O128. Considering the strains that were positive for any of the evaluated
serogroups, 4 (5.1%) and 16 (20.5%) of these strains presented hemolysis and ESBL
production, respectively. Only three strains were positive for all three tests and belonged to
the serogroups O86, O127 and O114. However, 26 strains were negative for ESBL
production. Chapter 3 –Analysis of the presence of diarrheagenic E. coli. Genes stx1 and
stx2 were used for the diagnosis of Shiga-Toxin E. coli (STEC); eltB and estA for
Enterotoxigenic E. coli (ETEC); and eaeA and bfpA for Enteropathogenic E. coli (EPEC);
ipaH for Enteroinvasive E. coli (EIEC); aatA and aaiC for Enteroaggregative (EAEC). Only
eaeA and bfpA were successfully identified. Chapter 4 – evaluation of excretion, invasive
ability and anatomical pathological alterations in budgerigars inoculated with a Salmonella
Saintpaul strain isolated from a parrot (Amazona amazonica) from illegal wildlife trade.
Keywords: Psittaciformes. Salmonella. Escherichia coli. Zoonosis. Public Health.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
Figure 1- Percentage of seropositive and seronegative Escherichia coli strains
producing hemolysis and ESBL isolated from psittacine seized from
illegal wildlife trade ................................................................................
65
CAPÍTULO 3
Figure 2- Figure 1- Agarose gel electrophoresis of PCR products. Column 1:
Molecular Marker. Column 2: Positive control. Column 3: sample
isolated from psittacine positive for eaeA gene. Column 4: Negative
control………………………………………………………………...
82
CAPÍTULO 4
Figura 1- Distribution scheme of budgerigar groups inoculated with
Salmonella Saintpaul………………………………….......................
88
Figure 2- Total percentage of most frequent gross alterations in budgerigars
inoculated with Salmonella Saintpaul observed in 3, 7 and 14 days
post-inoculation………………………………………………………
92
Figure 3- Experimental infection of Salmonella Saintpaul in budgerigars. A:
Liver (group E6 in 3dpi) – multiple inflammatory foci randomly
distributed associated with the presence of a yellowish brown
pigment (hemosiderin) in the cytoplasm of histiocytes and Kupffer
cells (arrows). HE, obj. 40x. B: Liver (group E6 14dpi) – Periportal
inflammation composed by numerous histiocytes, epithelioid
macrophages and some heterophils, lymphocytes and plasma cells
(arrows) associated with proliferation of bile ducts (arrowhead). HE,
obj. 40x. C: Spleen (group E5 14dpi) – infiltration of macrophages
in parenchyma, resulting in loss of normal architecture of the organ.
HE, obj. 40x. D: Intestine (group E6 3dpi): intense inflammatory
infiltration, composed by heterophils, macrophages, lymphocytes
and plasma cells in the lamina propria (arrows). HE, obj.
20x………………………………………………………………….
94
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Table 1- Prevalence of enterobacteria isolated from psittacine of ilegal
wildlife trade in Fortaleza, Brazil………………….............................
49
Table 2- Frequency of enterobacteria resistant to antimicrobials isolated from
psittacine of illegal wildlife trade.........................................................
50
Table 3- Multi-drug resistant (MDR) enterobacteria isolated from parrots of
CETAS in Fortaleza, Brazil…………………………………………..
51
CAPÍTULO 2
Table 1- Absolute and relative frequencies of Escherichia coli serogroups
isolated from psittacine seized from illegal wildlife trade in Ceará,
Brazil........................................................................................................
65
Table 2- Escherichia coli profile of psittacine surveyed for O serogroup,
hemolysis and extended spectrum beta-lactamase (ESBL)
production..............................................................................................
66
CAPÍTULO 3
Table 1- Absolute (n) and relative (%) frequencies of E. coli pathotypes
isolated from psittacine of illegal wildlife trade in the State of Ceará,
Brazil…………………………………………………………………
78
CAPÍTULO 4
Tabela 1 Absolute and relative frequency of gross alterations observed in
budgerigars inoculated with Salmonella
Saintpaul…………………...................................................................
91
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APEC Escherichia coli patogênica aviária
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
CETAS Centro de Triagem de Animais Silvestres
CBRO Comitê Brasileiro de Registros Ornitológicos
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
SCNov Selenito Cistina com Novobiocina
DEC Escherichia coli diarreiogênica
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EAEC Escherichia coli enteroagregativa
EIEC Escherichia coli enteroinvasiva
EHEC Escherichia coli enterohemorrágica
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima
EMB Eosina Azul de Metileno
EPEC Escherichia coli enteropatogênica
ESBL Betalactamase de espectro estendido
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica
ExPEC Escherichia coli patogênica extra intestinal
HE Hektoen entérico
ICMbio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
LIA Ágar Lisina Ferro
MDR Resistente a Múltiplas Drogas
MMA Ministério do Meio Ambiente
MNEC Escherichia coli de meningite neonatal
ONG Organização não Governamental
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
REDEC Escherichia coli enteropatogênica para coelhos
RENCTAS Relatório Nacional sobre o Tráfico da Fauna Silvestre
SIM Sulfito Indol Motilidade
STEC Escherichia coli produtora de shiga toxina
TSI Tríplice Açúcar Ferro
UPEC Escherichia coli uropatogênica
VB Verde Brilhante
VM Vermelho de Metila
VP Voges – Proskauer
XLD Xilose Lisina Desoxicolato
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 16
2 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 17
2.1 PSITACÍDEOS................................................................................................... 17
2.2 TRÁFICO DE AVES......................................................................................... 18
2.3 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE........................................................... 23
2.4 ESCHERICHIA COLI....................................................................................... 24
2.5 SALMONELLA.................................................................................................... 28
2.6 MEDIDAS DE CONTROLE............................................................................. 33
2.7 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA.............................................................. 35
3 JUSTIFICATIVA............................................................................................. 38
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.............................................................................. 39
5 OBJETIVOS..................................................................................................... 40
5.1 GERAL............................................................................................................... 40
5.2 ESPECÍFICOS................................................................................................... 40
6 CAPÍTULO 1………………………………………………………………….. 41
7 CAPÍTULO 2........................................................................................... 60
8 CAPÍTULO 3........................................................................................... 74
9 CAPÍTULO 4............................................................................................. 83
10 CONCLUSÃO.................................................................................................. 102
11 PERSPECTIVAS............................................................................................. 103
REFERÊNCIAS............................................................................................... 104
16
1 INTRODUÇÃO
Os Psittaciformes são uma das ordens mais afetadas pelo tráfico de animais
silvestres (GODOY, 2007), as aves provenientes do comércio ilegal são principalmente
animais retirados da natureza (REGUEIRA & BERNARD, 2012) que são submetidos a
condições inadequadas de transporte, alimentação, higiene e não passam por controle sanitário
durante o processo. Assim, do ponto de vista sanitário, essas condições degradantes podem
afetar a capacidade imunológica e, com isso, deixar os animais suscetíveis à infecção por
diversos agentes patogênicos devido às situações como o estresse e nutrição inadequada
(CAVALHEIRO, 1999; HALL & SAITO, 2008).
No contexto bacteriano, pesquisas realizadas em psitacídeos demonstraram que a
microbiota intestinal de aves saudáveis era constituída, de uma maneira geral, de
microorganismos Gram-positivos (BANGERT et al., 1988; MATTES et al., 2005) e que a
presença de patógenos Gram-negativos, em especial as pertencentes a Família
Enterobactereaceae, seria considerado um sinal de doenças (GRAHAN & GRAHAN, 1978;
FLAMMER & DREWES, 1988; MATTES et al., 2005; XENOULIS et al., 2010).
Em função do maior contato dessas aves com o ser humano, da submissão a
condições de vida antropizadas e mudanças na dieta, observou-se que psitacídeos ausentes de
sinais clínicos para qualquer enfermidade poderiam albergar patógenos Gram negativos
(MARIETTO-GONÇALVES et al., 2010; XENOULIS et al., 2010). Estudos recentes em
psitacídeos oriundos do tráfico mostram que essas aves aparentemente saudáveis apresentam
bactérias Gram-negativas especialmente às da família Enterobacteriaceae (HIDASI et al., 2013).
As bactérias da Família Enterobactereaceae podem causar infecções intestinais e
extra-intestinais em aves imunocomprometidas (CORRÊA et al., 2013). Nesse aspecto, os
psitacídeos podem ser afetados por bactérias oportunistas como Klebsiella, Enterobacter,
Proteus e Citrobacter (GERLACH, 1994) ou por bactérias consideradas zoonóticas como
Escherichia coli (CORRÊA et al., 2013; KNOBL et al.,2011) e Salmonella (VIGO et al.,
2009; PICCIRILLO et al., 2010; TUNCA et al., 2012) que podem ser transmitidos para outros
animais, incluindo o homem.
17
Além da transmissão desses agentes patogênicos entre homens e animais, uma outra
preocupação refere-se a transmissão de importantes fatores de resistência e virulência.
Estudos realizados em psitacídeos mostram que essas aves podem albergar inúmeras bactérias
que apresentam resistência a diversas classes de antimicrobianos (HIDASI et al., 2013;
CORRÊA et al., 2013; MATIAS et al. 2016).
Em relação às pesquisas voltadas a detecção de fatores de virulência em psitacídeos,
observa-se ainda uma escassez de informações, entretanto, alguns relatos mostram que essas
aves apresentam componentes em seu material genético que podem ser transmitidos a
humanos e outros animais e, nesse contexto, destaca-se E. coli, micro-organismo comum na
microbiota humana (KNÖBL et al., 2008; SAIDENBERG et al., 2012ab). Em função de toda
essa problemática é importante que se busque cada vez mais pesquisar a composição da
microbiota de psitacídeos do tráfico de animais silvestre afim de que se possam esclarecer
dados relevantes quanto à presença de bactérias importantes para a saúde das aves, do homem
e do ambiente.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PSITACÍDEOS
A ordem dos psitaciformes é constituída por três grandes famílias: Loridae, composta
essencialmente pelos Lóris, Cacatuidae, representada pelas cacatuas, e a Psittacidae,
exemplificada pelas araras, papagaios e periquitos, sendo este último objeto de estudo do
presente trabalho. Dentro desta ordem existem cerca de 78 gêneros, representados por 332
espécies distribuídas no globo terrestre, dentre elas, cerca de 80 espécies são encontradas no
Brasil (GODOY, 2007).
Representada por 80 gêneros e aproximadamente 360 espécies diferentes,
incluindo todos os papagaios, sendo estes populares em coleções de zoológicos e
extremamente populares como animais de companhia (BRIAN SPEER, 2007). No mundo, as
espécies encontram-se distribuídas pela área tropical do globo terrestre e irradiam-se para as
áreas sub-tropicais e frias (SICK, 1997). A maior parte das espécies está localizada na
América do Sul e na área do Pacifico (Austrália, Nova Guiné), enquanto na África encontram-
18
se somente espécies pertencentes a cinco gêneros Psittacus, Poicephalus, Psittaculla,
Coracopsis e Agapornis. A família dos Lóris contém 50 espécies e a Cacatuidae contém
aproximadamente 20 espécies ambos se concentram em uma única área do Pacífico onde
habitam quase todas as espécies de papagaios e periquitos e boa parte das cacatuas
(RAVAZZI & CONZO, 2008).
Os psitacídeos possuem características peculiares que podem distinguir-se
facilmente de outras aves, pois, estas possui maxilar superior curvado e arredondado, língua
grossa, articulação craniofacial, cabeça grande e robusta, pescoço curto, e pés prenseis
zigodáctilos. São aves que possuem dois dedos voltados para frente e dois dedos voltados
para trás muito articuláveis, que além de sustentarem o corpo, auxiliam na manipulação dos
alimentos que consomem (SICK, 1997).
Os machos assim, como as fêmeas, possuem plumagens com cores exuberantes,
conferindo-lhes uma beleza inigualável. Usualmente os sexos são muito parecidos, ou seja,
não apresentam dimorfismo sexual (SICK, 1997). Os papagaios tornam-se sexualmente
maduros entre um e cinco anos de idade, dependendo da espécie (HARCOURT-BROWN,
2010).
Muitas pessoas são atraídas por aves da família Psittacidae, pois elas possuem
grande habilidade cognitiva e comunicativa (PEPPERBERG, 1999). São bastante procurados
como animais de companhia porque tem uma grande capacidade de imitar sons humanos
(HARCOURT-BROWN, 2010), sendo o tráfico de animias silvestres o meio mais comum de
captura e obtenção comercial dessas aves no qual é responsável pelo perigo de extinção de
inúmeros representantes dessa ordem (SIGRIST, 2014).
2.2 TRÁFICO DE AVES
O Brasil tem uma das mais diversas faunas de aves do mundo, com 1.901 espécies
catalogadas (COMITÊ BRASILEIRO DE REGISTROS ORNITOLÓGICOS, 2014). O
comércio ilegal de animais é considerado a maior ameaça para a fauna silvestre após a
destruição de habitat e caça desenfreada (MARINI & GARCIA, 2005), sendo as aves o grupo
mais envolvido no tráfico de animais silvestres no Brasil (ALVES et al., 2013) que, segundo
dados do IBAMA, representam cerca de 80% dos animais contrabandeados (GAMA &
SASSI, 2008).
19
As aves da ordem Psittaciformes são consideradas uma das mais ameaçadas do
mundo em função do tráfico (FREITAS et al., 2015). São comercializadas cerca de 4 milhões
de aves das quais 800 mil são da ordem Psittaciformes (ACOSTA, 2004). Sendo assim,
verifica-se que se trata de uma das ordens que mais sofrem com a demanda comercial,
perdendo apenas para a ordem dos Passeriformes (LICARIÃO et al., 2013). Estes dados
foram relatados em estudos prévios realizados por Alves et al., (2013) que comprovaram que
as espécies das famílias Emberizidae e Psittacidae se destacaram entre os táxons de aves
selvagens mais negociadas como animais de estimação no Brasil.
Neto (2012) define que o tráfico de animais é um comércio ilegal no qual ocorre a
captura de espécime de vida livre, a prisão e a venda desses animais para benefício próprio, o
que pode tornar um negócio milionário para um grupo de indivíduos. Para melhor
compreensão da complexidade do tráfico de animais silvestres foi criada a Lei de Proteção a
Fauna (Lei 5.197/67), que deixa assegurado em seu artigo 1º o significado do que é fauna
silvestre:
“Os animais de quaisquer espécies, em qualquer fase do seu desenvolvimento
e que vivem naturalmente fora do cativeiro, constituindo a fauna silvestre,
bem como seus ninhos, abrigos e criadouros naturais, são propriedades do
Estado, sendo proibido a sua utilização, perseguição, destruição, caça ou
apanha”.
O contrabando de aves silvestres no Brasil envolve rotas comerciais através de
diferentes estados, sendo que a maioria das espécies comercializadas vem do Norte para o
Sul, sendo as regiões Norte, Nordeste e Centro Oeste os principais fornecedores de fauna
dentro do território nacional, e os estados das regiões Sul e Sudeste do país, os principais
consumidores, de onde os animais são exportados para outros países (ALVES et al., 2013).
As aves sofrem altos níveis de mortalidade nos primeiros dias de cativeiro e por
serem transportados por longos percursos em locais extremamente pequenos e lotados no qual
não é fornecido água e nem alimento, muitas aves costumam brigar, mutilar e matar uns aos
outros. Muitos morrem por estresse, esmagamento, asfixia, choque de temperatura,
desidratação e diarreia. Várias aves são perdidas e não chegam ao seu destino final
(WESTON & MEMON 2009; ALVES et al., 2013) e para cada dez animais capturados,
apenas um chega a ser comercializado vivo. Porém, no comércio de produtos animais, para
cada produto comercializado três outros animais são mortos (REDFORD, 1992).
20
Estima-se que o tráfico de animais silvestres movimenta aproximadamente cerca
de US$ 15 a 20 bilhões por ano e o Brasil participa desse mercado com cerca de US$ 1,5
bilhão a US$ 2 bilhões ao ano. Por se tratar de uma atividade totalmente ilegal, além de não
existir uma agência centralizadora das ações contra o tráfico no país, os dados estatísticos
sobre esse comércio ilegal são difíceis de serem calculados minuciosamente ou corretamente
(NETO, 2012).
Diante do valor estimado, esse tipo de contrabando perde apenas para o tráfico de
armas e drogas (BARBER-MEYER, 2010). Essa dimensão assustadora vem acarretando
ameaças à biodiversidade brasileira e pode provocar a extinção de diversas espécies a médio e
longo prazo (INSTITUTO CHICO MENDES DA BIODIVERSIDADE, 2016). A retirada de
psitacídeos da natureza para serem vendidos ilegalmente é impactante, pois esse tipo de
contrabando contribuiu para a extinção, por exemplo, de ararinhas-azuis na natureza.
Sabe-se que o comércio ilegal é um dos fatores que ameaçam a população de aves
no mundo bem como, o desmatamento, degradação e fragmentação de habitat, perturbações
antrópicas e captura excessiva de animais silvestres (FREITAS et al., 2015).
Regueira & Bernard (2012) estimaram que na cidade de Recife sejam traficados
cerca de 50.000 aves silvestres que são vendidas anualmente nos mercados de rua. Esses
mesmos autores fizeram um levantamento da quantidade de aves vendidas ilegalmente e
constataram que das 2130 aves 7% eram da ordem Psittaciformes. Assim como na pesquisa
realizada por Alves et al. (2013) que constataram através de levantamentos de pesquisas
científicas que a ordem Psittaciformes representou 15,06% das aves traficadas no Brasil.
Santos et al. (2011) ao realizarem levantamento de aves que são recebidas no CETAS no
Estado do Amapá observaram a predominância de 9,96% de aves da ordem Psittaciformes.
A aquisição e a posse ilegais de animais silvestres são, portanto, consideradas
crimes ambientais, estando o infrator sujeito a multas e penalizações (RIBEIRO & SILVA,
2007). Portanto, na esfera penal, a fauna, seja ela silvestre ou não, está protegida pela Lei
9.605/98, que dispõe sobre as sanções penais e administrativas derivadas de condutas e
atividades danosas ao meio ambiente, que determina:
21
O caput do art. 29 da Lei nº 9.605/98 a pena de detenção de seis meses a um
ano e multa para o crime de “Matar, perseguir, caçar, apanhar, utilizar
espécimes da fauna silvestre, nativos ou em rota migratória, sem a devida
permissão, licença ou autorização da autoridade competente, ou em desacordo
com a obtida.
Quando apreendidos por órgãos de fiscalização competentes ou quando são
entregues espontaneamente e resgatados os animais vítimas das ações antrópicas são levados
para centros de triagem de animais silvestres – CETAS (SAIDENBERG et al., 2012a) que são
responsáveis por receber, identificar, marcar, triar, avaliar, recuperar, reabilitar e destinar
animais silvestres (DESTRO et al., 2012).
O recebimento dos animais nos CETAS pode ser classificado, de acordo com a
procedência, em três formas distintas: a) apreensão, representada pelos animais decorrentes da
ação fiscalizatória do IBAMA ou da Polícia Ambiental; b) recolhimento, resultado da captura
de animais pelo IBAMA ou Polícia Ambiental; c) entrega voluntária, feita pelo cidadão que
mantinha ilegalmente sob sua guarda animais silvestres (PAGANO et al., 2009). No entanto,
esses centros estão frequentemente sobrecarregados, os animais são mantidos em condições
inadequadas o que resulta na perda de informação e conhecimento científico (REGUEIRA &
BERNARD, 2012).
É relevante mencionar que no ambiente de cativeiro as aves têm suas dietas
modificadas. Muitos psitacídeos são condenados a viver em cativeiro sendo alimentados com
uma dieta inadequada que é constituída basicamente de milho, semente de girassol e frutas
(WESTON & MEMON, 2009). As aves cativas tem seu comportamento alterado, isso traz
grandes prejuízos na reintrodução dessas aves à natureza, pois irá acarretar problemas na sua
sobrevivência devido à competição com outras aves e por ser mais sensível a doenças
(ROCHA et al., 2006). Os impactos e os danos ambientais de solturas ilegais e doenças
transmitidas pelos animais contribuem para a perda do patrimônio ambiental brasileiro e
aumento no desequilíbrio ambiental (CARRERA, 2004).
Diante da dramática realidade Neto (2012) enfatiza que:
O cativeiro é a única tortura a que são submetidos os animais do tráfico e é,
com certeza, a derradeira e perpétua pena, porque durante a captura além de
maltratados, mutilados, humilhados, feridos a maioria dos homens não sabe
que eles têm alma. Eles sentem as dores, choram quando agredidos e separados
dos pais. Indefesos, têm inteligência para saber que foram desagregados de seu
universo e separados da família.
22
Apesar do tráfico de animais silvestres terem numerosas consequências é possível
agrupá-las em três ramificações: (a) sanitário, uma vez que animais ilegais são vendidos sem
nenhum tipo de controle sanitário e podem transmitir doenças graves, inclusive doenças
desconhecidas, para as pessoas e criações; (b) econômica/social, pois o tráfico movimenta
quantias incalculáveis de recursos financeiros sem que impostos sejam recolhidos aos cofres
públicos; (c) Ecológicos, já que a captura na natureza, feita sem critérios, acelera o processo
de extinção das espécies, causando danos às interações ecológicas e perda de herança
genética. Além disso, o tráfico também pode causar danos ecológicos pela introdução de
espécies exóticas, que, embora adquiridos como animais de estimação são abandonados por
seus donos em áreas naturais (DESTRO et al., 2012).
O comércio ilegal da vida selvagem é bem conhecido no Brasil e também em
outros lugares, sendo que as autoridades competentes sabem onde encontrá-los, e parte das
pessoas está ciente dos impactos negativos associados com essa atividade ilícita. Estudos
científicos podem contribuir com dados para avaliar a realidade que o impacto do comércio
ilegal produz na avifauna silvestre. No entanto, dados científicos por si só não são capazes de
combater o contrabando de animais silvestres e esse comércio deve ser encarado como um
problema ambiental, econômico e social (REGUEIRA & BERNARD, 2012).
O tráfico ilegal de animais silvestres deve envolver o acompanhamento severo
com aplicações de leis que condene de forma efetiva os principais personagens desse crime
que são os consumidores finais. Fiscalizações efetivas devem ser priorizadas principalmente
em mercados públicos a fim de combater efetivamente esse ato ilícito. Vale salientar que
programas de educação ambiental devem ser implementados a fim de conscientizar a
população para que estas mudem as suas atitudes diante da relação com a criação de aves
silvestres como animais de estimação (ALVES et al., 2013)
Portanto, o ideal é que a sociedade tenha uma mudança de comportamento em
relação às aves e a todo o patrimônio faunístico brasileiro, permitindo que vivam livres em
seus ambientes originais, e denunciando a comercialização ilegal. De qualquer modo, pessoas
que desejam adquirir animais da fauna brasileira como animais de companhia, devem agir
com responsabilidade e procurar os criadores comerciais, que vendem animais nascidos em
cativeiro e legalizados, conforme estabelecem as leis ambientais vigentes (RIBEIRO &
SILVA, 2007).
23
2.3 FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
As bactérias da família Enterobactereaceae podem ser facilmente encontradas em
amostras clínicas. Essas bactérias estão bastante difundidas na natureza e podem ser
encontradas na terra, água, plantas e na microbiota dos animais e do homem (KONEMAN et al
2012). As bactérias dessa família incluem membros da microbiota normal do intestino, bem
como patógenos francos. São capazes de causar um vasto espectro de doenças incluindo
diarreia, infecção das vias urinárias e respiratórias, sepse e meningite (KEUSCH & ACHESON,
2009).
Essa família apresenta uma lista de 42 gêneros e 142 espécies bacterianas (JANDA
& ABBOT, 2008), compreende um grande grupo heterogêneo caracterizando-se por
apresentarem bastonetes Gram-negativos, anaeróbios facultativos e geralmente são móveis
(CARTER e WISE, 2004). Bioquimicamente a família Enterobacteriaceae é oxidase negativa,
catalase positiva, fermentadores de uma ampla variedade de carboidratos, reduz nitrato a nitrito
e apresenta ótimo crescimento a uma temperatura de 37° C (BERGEY & HOLT, 1994;
QUINN et al., 2005).
São bactérias que produzem uma grande variedade de doenças nos seres humanos
e animais. São agrupadas em micro-organismos patogênicos como Salmonella, Shigella e
Yersinia que estão associadas a uma enfermidade, patógenos oportunistas como (Escherichia
coli, Klebsiella penumoniae, Proteus mirabilis) e patógenos comensais como Escherichia
coli. Porém, podem tornar-se patogênicas quando adquirem genes com fatores de virulência
presentes em plasmídeos, bacteriófagos ou ilhas de patogenicidade (MURRAY et al., 2006).
Estudos realizados em psitacídeos evidenciaram isolamento de enterobacterias da
sua microbiota, seja de vida livre, de cativeiro ou que foram confiscados do comércio ilegal.
As bactérias comumente isoladas são E. coli, Enterobacter sp., Klebsiella e Citrobacter
(HIDASI et al., 2013; MARIETTO-GONÇALVES et al., 2007; MARIETTO-GONÇALVES
et al., 2010; EVANS et al. 2014). Porém, a bactéria do gênero Salmonella já foi relatada em
diversas espécies de psitacídeos cativos, de vida livre e do comércio ilegal e vários autores
constataram baixa prevalência de isolamento dessa bactéria nessas aves (ALLGAYER et al.,
2009; MARIETTO-GONÇALVES et al., 2010; LOPES et al., 2014).
24
De acordo com os autores essa baixa prevalência pode ser devido as condições
higiênico sanitárias adequadas (KEEN et al., 2007; BEZERRA et al., 2013) ou devido a
excreção intermitente desse micro-organismo por essas aves (LOPES et al.,2014). De acordo
com Xenoulis et al., (2010) e Evans et al., (2014) a composição da microbiota dessas aves é
influenciada pelo ambiente, dieta, idade, genótipo, uso de antibióticos, fonte de água e medidas
de biosseguridade, pH e motilidade intestinal.
O diagnóstico para infecções causadas por bactérias da família Enterobacteriaceae
é feito com base na anamnese dos achados clínicos, anatomopatológicos e exames
laboratoriais (BERCHIERI Jr. et al. 2009), sendo importante a coleta de amostras biológicas
através do isolamento do agente em culturas microbiológicas ou teciduais (GODOY, 2007). A
identificação de uma enterobacteria é feita por meio de provas bioquímicas, seguidas ou não
de provas sorológicas para a identificação definitiva do micro-organismo. Ademais, outros
métodos de diagnósticos que surgiram nos últimos anos foi o avanço de técnicas moleculares,
que são métodos mais sensíveis e específicos, que proporcionaram a identificação de bactérias
entéricas que afetam o homem (EJIDOKUN et al., 2006), aves e outros animais
(SAIDENBERG et al., 2012a).
Para as aves acometidas com infecções causadas por enterobacterias o tratamento
das mesmas é realizado utilizando antibióticos aliado com as corretas práticas de manejo
(GODOY, 2007). Dentre estas práticas de manejo podemos citar: boa higienização e além da
adequada desinfecção do ambiente é necessária, a associação de diferentes medidas de
prevenção como boa ventilação e controle populacional de recintos, redução de estresse
ambiental e de manipulação, ótima nutrição e a utilização de probióticos.
2.4 ESCHERICHIA COLI
Desde 1885, quando foi isolada pela primeira vez em fezes de crianças pelo
bacteriologista alemão Theodor Escherich, a bactéria Escherichia coli é provavelmente o
micro-organismo mais bem estudado. Foi inicialmente nomeada de Bacterium coli commune
e em 1919, Castelani e Chalmers instituíram o nome de Escherichia coli em homenagem ao
seu descobridor (CHEN & FRANKEL, 2005). É habitante quase universal do intestino de
animais de sangue quente. É uma bactéria Gram-negativa anaeróbia facultativa pertencente à
25
Família Enterobactereacea (KAPER et al., 2004). Caracterizam-se por serem micro-
organismos bacilares, medindo de 1,1-1,5µm, é móveis por flagelos peritríquios (BERGEY &
HOLT, 1994).
Por muitos anos E. coli foi considerado um micro-organismo avirulento,
progressivamente esse espectro foi mudando ao longo dos anos pois evidências indicavam
que esse micro-organismo era capaz de causar doença no homem (CHEN & FRANKEL,
2005) e animais (QUINN et al., 2005).
Devido a uma série de mecanismos de patogenicidade, associados com fatores de
virulência diversos, essa espécie bacteriana foi classificada em patotipos, divididos em duas
categorias: os patotipos associados à infecções intestinais, denominados de E. coli
diarreiogênica (DEC), e aqueles causadores de infecções extra-intestinais, pertencente a
Escherichia coli patogênica extra-intestinal (ExPEC) (MARTINEZ & TRABULSI, 2008).
Escherichia coli engloba diversas cepas patogênicas e não patogênicas. Dentre as
cepas patogênicas existem seis grupos identificáveis que provocam doença entérica: EPEC
(enteropatogênica), ETEC (enterotoxigênica), EAEC (enteroagregativa), EIEC
(enteroinvasiva), EHEC (enterohemorrágica) (KEUSCH & ACHESON 2009) e DAEC (E.
coli difusamente aderente) (KONEMAN et al., 2012). Os patotipos extra-intestinais
associados às regiões que refletem ao sítio de isolamento são comumente divididos em UPEC
(uropatogênicos), MNEC (meningite neonatal), REDEC (enteropatogênicos de coelhos) e
APEC (patogênicos para aves) (FERREIRA & KNÖBl et al., 2009).
Em psitacídeos o isolamento de E. coli nas aves de cativeiro, do tráfico e de vida
livre já foram relatados e diversas pesquisas mostram resultados relacionados a sua ocorrência
(HIDASI et al., 2013; KNÖBL et al., 2011; SAIDENBERG et al., 2012b). Todavia, a
presença de bactérias Gram-negativas resulta em distúrbios intestinais ou septicemia sendo
consideradas patogênicas ou oportunistas (GERLACH, 1994).
Segundo Corrêa et al (2013) possivelmente a alta taxa de isolamento de E. coli em
psitacídeos pode ser determinada pela manutenção dessas aves em cativeiro, que podem ser
submetidas ao estresse crônico. Nas aves as infecções causadas por E. coli é considerada
secundária a outros agentes e a manifestação da doença é extraintestinal (FERREIRA &
KNÖBL 2009).
26
Isolamento de cepas patogênicas de E. coli em psitacídeos é um importante
problema na saúde pública, pois existe a possibilidade de transmissão de colibacilose a partir
dessas aves para o homem (PRIYA et al., 2008). Dentre os patotipos mais estudados,
atualmente em psitacídeos sejam provenientes do tráfico, cativeiro ou mesmo de vida livre as
que mais frequentemente são detectadas são as EPECs (SAIDENBERG et al., 2012a).
EPEC foi originalmente definida como sendo a principal causadora de diarreia
infantil. Subsequentemente passaram a ser definidas pela sua principal característica que é o
padrão de aderência localizado na célula hospedeira. Esses patotipos são identificados com
base na presença de genes de virulência específicos, sendo EPEC reconhecida por causar
lesões attaching e effacing (A/E). Na lesão (A/E) as bactérias aderem na membrana da célula
hospedeira causando a destruição das microvilosidades das células epiteliais intestinais. A
ligação das células intestinais é mediada por uma proteína de membrana externa denominada
de intimina, sendo codificada pelo gene eae, atualmente utilizado para o diagnóstico
molecular dos patotipos de EPEC (OCHOA & CONTRERAS, 2011).
Os patotipos de EPEC são classificados em típicas e atípicas. A primeira possui os
genes eae e bfp, sendo ambos responsáveis pelo contato inicial entre a bactéria e a célula
hospedeira. Em contraste, a segunda não apresenta tal característica por não possuir o gene
bfp (TRABULSI et al., 2002).
Isolamento de EPEC típicas foi detectado em amostras de 46 psitacídeos
assintomáticos provenientes de criadores, centros de resgate e zoológico, sendo três amostras
positivas para os genes de eae e bfp e foram caracterizadas em EPEC típicas (SAIDENBERG
et al., 2012b). Segundo os autores cepas de EPEC típicas podem ser importantes fontes de
infecção zoonótica e que essas aves podem ter adquirido as cepas através do contato com o
homem e animais domésticos.
Adicionalmente, pesquisa de patotipos de EPEC em filhotes de araras azuis
(Anodorhynchus hyacinthynus) e papagaios verdadeiros (Amazona aestiva) oriundos do
Refúgio Ecológico Caiman em Mato Grosso do Sul Pantanal/Brasil, e araras de lear na
Estação Ecológica de Canudos na Bahia todos de vida livre, demonstrou que somente uma
27
amostra foi positiva para o gene eae em arara azul de lear (Anodorhynchus leari) e todas
negativas para o gene bfp caracterizando, portanto, cepas atípicas de EPEC (SAIDENBERG
et al., 2012b). De acordo com os autores apesar da presença desse gene de virulência no
filhote as aves de vida livre parecem ser mais propensas a permanecerem livres da doença
ocasionadas por essas bactérias.
MARIETTO-GONÇALVES et al. (2011) constataram a presença de cepas de E.
coli EPEC em pelo menos um isolado de psitacídeo, demostrando mais uma vez que essas
aves podem ser reservatórios de cepas com potencial zoonótico. Outros patotipos de E.coli
vêm sendo paulatinamente isolados em psitacídeos, como exemplificados por estudo realizado
por knobl et al. (2011), que ao analisarem a presença de sorogrupos e genes de E. coli em 24
psitacídeos foi possível constatar a presença de EPEC, UPEC e APEC, ou seja, as amostras
apresentaram os mesmos fatores de virulência para esses patotipos.
Outro patotipo que está em evidência nos estudos científicos com psitacídeos é o
de Escherichia coli patogênica para aves (APEC) que é um termo comumente designado para
o agente etiológico da colibacilose que acomete aves industriais (SÁNCHEZ et al., 2012).
Nos psitacídeos acometidos com colibacilose as infecções primárias ou
secundárias de colibacilose geralmente apresentam sinais clínicos de forma inespecífica,
como letargia, penas arrepiadas, anorexia, diarreia, políúria, conjuntive, rinite, dispneia,
inchaço articular, sinais nervosos, edema subcutâneo, perda de peso, vômito e morte súbita.
Quanto ao aspecto necroscópico são inclusos atrofia da musculatura peitoral, penas
descoloridas, hepatomegalia com a disposição de pontos amarelados ao longo do órgão,
opacificação dos sacos aéreos, hiperemia da mucosa intestinal, esplenomegalia e polisserosite
fibrinosa (GODOY, 2007).
Marietto-Gonçalves et al. (2010) observaram, também, em um caso de
colisepticemia em psitacídeo, a presença de sinais como incoordenação motora, presença de
sons estertores, dor abdominal e secreção ocular. Diante à necropsia, os autores citam a
presença de pneumonia, aerossaculite, pericardite, congestão hepática e renal e peritonite.
O diagnóstico de colibacilose é realizado através da anamnese da ave bem como
deve estar associado com exame laboratorial (MARIETTO-GONÇALVES et al., 2007).
28
Cientificamente os trabalhos envolvendo a busca de E. coli em psitacídeos empregam as
técnicas laboratoriais convencionais nos quais são utilizados caldos nutrientes como os caldos
Brain Infusion Heart (BHI) e nutriente.
Posteriormente são utilizados ágares MacConkey, ágar Eosina Azul de Metileno
(EMB), o ágar entérico Hoektoen (HE) e Verde Brilhante (AVB). Para a identificação
utilizam-se usualmente testes bioquímicos que indiquem a produção de ácido e gás a partir da
glicose. Escherichia coli não produz H2S, urease, L-triptofano desaminase, citrato, mas são
passiveis de utilizar a lisina e produzir indol (FERREIRA & KNÖBL 2009). Pesquisas
evidenciam que a coloração de Gram pode ser uma ferramenta que juntamente com a
microbiologia clássica pode ser considerada como uma boa técnica de detecção bacteriana
(EVANS et al., 2014).
Prioste et al., (2013) enfatizam que a heterogeneidade de sorogrupos e patotipos
de E. coli isoladas de aves é um entrave para o entendimento da patogênese em psitacídeos e
que clinicamente o significado desse micro-organismo na microbiota de psitacídeos saudáveis
ainda precisa ser desvendado.
2.5 SALMONELLA
Salmonella foi aludido como a primeira fonte de infecção em pacientes com febre
tifoide após ser confirmada a transmissão pela via fecal oral pelo médico Inglês William Budd
em 1873, no qual descreveu a natureza contagiosa da doença e incriminou fontes de água
contaminada com fezes como o veículo de transmissão do micro-organismo. Porém, em 1880
Karl Joseph Eberth e Rudolf Virchow descobriram o bacilo nos gânglios linfáticos
abdominais e no baço de pacientes com febre tifoide (MARINELI et al., 2013).
O primeiro a cultivar com sucesso Salmonella sorotipo Typhi foi George Gaffky
em pacientes alemães em 1884. O gênero Salmonella denominado em homenagem ao
americano Dr. Daniel Elmer Salmon, veterinário bacteriologista do século XIX (KORSAK et
al., 2004), que com Theobald Smith, em 1885, isolaram e descreveram pela primeira vez o
micro-organismo, o qual chamaram de bacilo da peste suína (GRIMONT et al., 2007). O
gênero Salmonella é dividido em duas espécies: Salmonella enterica no qual é composta por
seis subespécies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica e Salmonella
bongori (GUIBOURDENCHE et al., 2010).
29
Pertencentes à família Enterobactereaceae as bactérias do gênero Salmonella são
patógenos intracelulares facultativos que causam infecções localizadas ou sistêmicas
(KABIR, 2010). Morfologicamente são bacilos com hastes retas com cerca de 0,7-1,5 μm a
2-5 μm de comprimento. São Gram-negativas e anaeróbias facultativas, possuem mobilidade
através de flagelos peritríquios, a exceção dos biovares Pullorum (BvPu) e Gallinarum
(BvGa) que são imóveis (BERGEY e HOLT, 1994).
Bioquimicamente são capazes de fermentarem arabinose, glicose, galactose,
manitol, manose, ramnose e xilose. Em contrapartida, não são aptas a fermentarem adonitol,
dulcitol, inositol, lactose, rafinose, sacarose, salicina, sorbitol e amido. Adicionalmente,
apresentam resultados negativos para os testes de produção de indol, urease, Vogues
Proskauer (VP) e fenilalanina desaminase. Ao contrário dos resultados provenientes dos testes
de Vermelho de Metila (VM), sulfeto de hidrogênio e lisina descarboxilase.
Divergências quanto ao resultado das provas bioquímicas têm sido empregadas
para diferenciar sorotipos do gênero, como o caso da S. Pullorum e S. Gallinarum, no qual a
primeira é capaz de descarboxilar a ornitina e produzir gás enquanto a segunda não apresenta
tais características (KONEMAN et al., 2012), no entanto é capaz de fermentar o ducitol e
utilizar o citrato como única fonte de carbono (BERGEY & HOLT, 1994).
As salmonelas paratifoides apresentam bioquimicamente o comportamento do
gênero, às vezes são encontradas cepas com características bioquimicamente atípicas como as
do sorotipo S. Anatum que não descarboxila a lisina e S. Cerro com produção mínima ou sem
produção de H2S (BECHIERI Jr. et al., 2009).
As bactérias do gênero Salmonella são classificadas de acordo com a convenção
do esquema de White-Kauffmann-Le Minor que é mundialmente utilizado por todos os
laboratórios de saúde pública. Tem como base a imunorreatividade das células da estrutura de
superfície, os antígenos somáticos (O) e flagelar (H) e diante da diversidade substancial de
antígenos as salmonelas são divididas em 2610 sorotipos (GUIBOURDENCHE et al., 2010).
Salmonella enterica é a única bactéria que inclui sorotipos capazes de infectar
grande quantidade de hospedeiros, como exemplo, S. Typhimurium e S. Enteritidis possuem a
capacidade de infectar diversas espécies animais e o próprio homem. No entanto outros
sorotipos estão restritos ao homem como Salmonella Typhi e S. Gallinarum (SG) e S.
Pullorum (SP) que acometem exclusivamente as aves (FOLEY et al., 2013).
30
A salmonela aviária apresentam três quadros distintos: Pulorose, causada pela SP
que pode acometer aves de qualquer idade. Porém, é mais comum em aves jovens,
particularmente nos primeiros vinte dias de vida. O tifo aviário causado pela SG acomete de
forma severa aves de qualquer idade é altamente patogênica, causando infecção sistêmica e
provocando mortalidade de 80 a 100%. O paratifo aviário que engloba várias espécies de
animais e seres humanos (BERCHIERI Jr. et al., 2009).
Sorotipos paratifoides, com destaque Enteritidis e Typhimurium, podem infectar
várias espécies de animais, pois não estão relacionados com enfermidades específicas, mas
são capazes de causar infecções. As aves jovens são mais susceptíveis às infecções por
salmonelas paratifoides, pois apresentam o sistema imune ainda em desenvolvimento. Nesse
contexto, embora as aves adultas apresentem uma melhor resposta ofensiva às infecções,
podem desenvolver enfermidades em situações de estresse (BERCHIERI Jr.et al., 2009).
As aves das espécies Gallus gallus são consideradas hospedeiros naturais de SP e
SG (BERCHIERI Jr.et al., 2009), no entanto outras espécies de aves também podem ser
infectadas, dentre elas espécies de aves silvestres como os psitacídeos (DEEM et al., 2005;
TUNCA et al., 2012).
Salmonela tem sido comumente transmitida por alimentos na maioria dos países
do mundo (KABIR, 2010), mas em alguns casos, pode ocorrer diretamente do contato com
animais domésticos ou através das aves doentes ou portadoras do micro-organismo
(AKHTER et al., 2010; KORSAK et al., 2004). Para que ocorra o desenvolvimento da
enfermidade é necessária à localização da bactéria em um ambiente adequado para seu
estabelecimento, replicação e expressão de seus fatores de virulência. Os passos de um
processo infeccioso consistem em adesão, invasão, replicação, resistência aos mecanismos de
defesa e dano ao hospedeiro (OCHOA & RODRIGUEZ, 2005).
A salmonelose é uma doença bem conhecida que acomete diferentes espécies de
aves silvestres, dentre elas os psitacídeos de vida livre, de cativeiro e do tráfico de animais
silvestres (MARIETTO-GONÇALVES, et al., 2010; HIDASI et al., 2013; LOPES et al.,
2014). Vários sorotipos de Salmonella foram isolados de psitacídeos aparentemente saudáveis
e em aves enfermas, sendo S. Typhimurium o sorotipo mais frequente e que se apresenta de
forma severa causando mortalidade nessas aves (PICCIRILLO et al., 2010; VIGO et al.,
2009).
31
Pesquisas realizadas em psitacídeos assintomáticos provenientes do tráfico
revelaram a presença de S. Enteritidis e S. Typhimurium, demostrando que essas aves podem
atuar como portadoras desses micro-organismos (MARIETTO-GONÇALVES et al., 2010;
HIDASI et al., 2013) e que apesar do baixos índices de positividade de salmonela relatados
em psitacídeos (ALLGAYER et al., 2009; MARIETTO-GONÇALVES et al., 2010; HIDASI
et al., 2013; LOPES et al., 2014) não devemos desconsiderar o importante papel que essas
aves desempenham na disseminação desse patógeno. Interessante aportar que o isolamento de
Salmonella em aves aparentemente saudáveis reforça a necessidade de programas de
acompanhamento para evitar surtos de salmonelose no homem (MATIAS et al., 2016).
Vale ressaltar que o curso da salmonelose em psitacideos é influenciado por
vários fatores, dentre eles: a idade da ave; estresse; infecções secundárias; dietas deficientes;
más condições de transporte e manejo. Essa série de fatores pode resultar em desequilibrio
microbiano que contribuirá para a multiplicação desordenada de agentes patogênicos como a
Salmonella (VIGO et al., 2009; PICCIRILLO et al., 2010). Quando acometidas por bactérias
do gênero Salmonella as aves apresentam infecções agudas que são caracterizadas por
quadros de letargia, anorexia, polidpsia, diarreia, poliúria, alterações respiratórias, oculares,
nervosas, depressão, perda de peso, convulsão, desidratação e morte súbita. Nos casos
crônicos, podem estar presentes pericardite, granulomas no fígado, baço e rim (VIGO et al.,
2009).
A transmissão desse micro-organismo ocorre pela via fecal-oral, especialmente,
em aves de vida livre que vivem em áreas urbanizadas (KRAWIEC et al., 2015). Em se
tratando de aves procedentes do tráfico como os psitacídeos é difícil determinar a origem da
contaminação, pois não se sabe se essas aves já são carreadoras de Salmonella ou se
adquiriram quando são submetidas ao processo de reabilitação (MARIETTO-GONÇALVES
et al., 2010).
Adicionalmente, em psitacídeos de vida livre foram detectados sorotipos de S.
Bredney isolado de órgãos de filhotes de arara azul e os autores sugeriram que essas aves
adquiriram o micro-organismos através dos pais ao regurgitarem o alimento ou por via
transovariana (VILELA et al., 2001) e S. Braenderup que foi isolada de um filhote de arara
32
azul saudável que pode ter adquirido através de artrópodes presentes nos ninhos dessas aves
ou pela a nidificação de diferentes aves de rapina nos ninhos utilizados pelas araras azuis
(ALLGAYER et al., 2009).
O diagnóstico de salmonelose deve incluir a avaliação da ave e o histórico
completo, que inclui a exposição à doença infecciosa ou toxinas, ambiente em que a ave vive,
práticas de manejo, dieta, estado reprodutivo e enfermidades anteriores. Quando houver
suspeita de infecção, a confirmação do diagnóstico requer o isolamento e identificação do
agente causal, de preferência o sorovar específico (LISTER & BARROW, 2008).
A maioria dos estudos que pesquisam a presença de bactérias entéricas em
psitaciformes tem aplicado técnicas microbiológicas tradicionais para o diagnóstico:
isolamento, identificação bioquímica e caracterização antigênica (ANDRADE et al., 2010).
Para a identificação da presença de Salmonella são utilizados caldos e ágares seletivos a partir
de amostras de suabes e matéria fecal (BENSKIN et al., 2009). Os meios de enriquecimento
mais comuns são os caldos Selenito Cistina (SC), Tetrationato (TT), Rappaport-Vassiliadis
(RV) e seus derivados acrescidos, ou não, de Novobiocina (GORSKI, 2012).
Para plaqueamento um grande número de meios tem sido formulado para o
isolamento de salmonelas. Nesses meios são incorporados vários agentes seletivos e
diferenciais que permitem distinguir as colônias de salmonelas de outras bactérias, sendo
recomendados pelo menos dois meios para plaqueamentos seletivos. Os meios de
plaqueamento mais comuns são Ágar MacConkey, Ágar Citrato Desoxicolato (DCA), Ágar
Verde Brilhante e Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) (LISTER & BARROW, 2008).
Para o isolamento do agente são utilizadas culturas microbiológicas de exsudatos,
de lesões, da cloaca ou cavidade oral (GODOY, 2007). Em psitaciformes são utilizados como
métodos de diagnósticos para Salmonella procedimentos microbiológicos convencionais e
testes sorológicos (ALLGAYER et al., 2009; DEEM et al., 2005). Em se tratando dos testes
sorológicos são comumente utilizados o ELISA e soroaglutinação rápida em placas em que
são utilizados soros polivalentes anti-antígenos somático (O) e anti-antígenos flagelares (H)
(BERCHIERI Jr., 2009).
33
Com os avanços científicos disponíveis na atualidade, sistemas moleculares estão
sendo empregados como métodos de diagnóstico para diferentes enfermidades. Portanto, a
reação em cadeia polimerase (PCR) representa um grande avanço no que diz respeito à
rapidez, sensibilidade e especificidade dos métodos de diagnósticos e tem sido utilizada para
identificar várias espécies de bactérias patogênicas de alimentos e amostra clínica (HIRSH,
2009).
Segundo COHEN et al. (1994), devido ao fato da PCR detectar uma região única
de um genoma bacteriano, a técnica demonstra maior especificidade quando comparada com
os métodos microbiológicos tradicionais. A pesquisa realizada por (ALLGAYER et al., 2008)
demonstra rigorosamente esse fato, pois ao comparar o isolamento de salmonela em
psitacídeos mantidos em cativeiro através da técnica microbiológica convencional e a PCR
observaram que 13,2% das amostras de 280 swabs cloacais foram positivas para salmonela
quando se utilizou a PCR enquanto que nenhuma amostra foi positiva quando empregou-se o
método convencional constatando, assim, a elevada sensibilidade do teste molecular.
Sareyyupoglu et al. (2008) também constataram que a PCR parece ser um método
rápido e prático para o diagnóstico de Salmonella spp. quando comparado com os métodos
tradicionais.
2.6 MEDIDAS DE CONTROLE
Um adequado manejo alimentar contribui para uma boa manutenção da
microbiota intestinal, sendo importante o oferecimento de sementes adequadas para cada
espécie, além de frutas e verduras devidamente limpas e frescas (MARIETTO-GONÇALVES
et al., 2007). Esses cuidados não ocorrem para as aves provenientes do tráfico, ao contrário,
muitas vezes são submetidas à privação de água e alimento (PEREIRA & BRITO, 2005;
CORADINI, 2013), o que é bastante prejudicial à saúde, visto que nestas condições as aves
podem se tornar imunocomprometidas e suscetíveis a infecções (RENCTAS, 2001). Desta
forma, uma atenção adequada ao manejo nutricional, levando em consideração o estado
específico de cada ave que chega aos centros de triagem, é indispensável para a recuperação e,
assim, redução da taxa de mortalidade (SIQUEIRA et al., 2013).
O manejo sanitário é de fundamental importância para o controle de possíveis
patógenos que possam vir a ser um problema não somente para animais em reabilitação, como
34
também para os seres humanos. MATIAS et al. (2016) advertem que as aves silvestres
provenientes do tráfico são potencialmente portadoras de importantes agentes zoonóticos,
como as bactérias do gênero Salmonella. Dessa maneira, medidas como quarentena são
imprescindíveis para que evitar a propagação de cepas para humanos, assim como impedir a
dispersão de problemas relacionados à resistência bacteriana. Deve ser evitado o alojamento
dos psitacídeos em um mesmo recinto com outras espécies aviárias (MARIETTO-
GONÇALVES, et al.,2007).
Sabe-se que os Centros de Triagem de Animais Silvestres são superlotados e
possuem poucos recursos. Desta forma, os animais que chegam dos resgates ou apreendidos
por órgãos de fiscalização muitas vezes são submetidos a inapropriadas condições de vida e,
com isso, podem ocorrer altas taxas de mortalidade (VANSTREELS et al., 2010).
Marietto-Gonçalves et al. (2010) esclarece que a monitoria da presença de
bactérias Gram-negativas na microbiota entérica de psitaciformes cativos é um procedimento
que deveria ser incluído na rotina de criadouros particulares, parques zoológicos, hospitais
veterinários e principalmente em projetos de reintrodução de aves cativas para a vida livre.
Pois, essas bactérias não pertencem a microbiota normal dessas aves e também devido ao
risco de disseminação desses possíveis patógenos em recintos de alocação e de disseminação
destes no meio ambiente, evitando assim na cadeia epidemiológica que várias doenças
entéricas sejam transmitidas para o homem e outros animais.
Outras medidas de controle simples também podem ser consideradas essenciais,
como o combate à presença de artrópodes, roedores e aves silvestres nas instalações através
do uso de telas, assim como práticas de armazenamento adequado dos alimentos e destino
adequado dos resíduos sólidos e outros dejetos (CARCIOF, 1996; FRIEND & FRASON,
1999).
A melhor e talvez a mais importante forma de prevenção de doenças as quais
essas aves possam transmitir, seria a implementação de políticas públicas que combata
efetivamente o contrabando de animais, associado ao esclarecimento para a população de que
a retirada de espécies da vida silvestre traria risco à saúde humana (MATIAS et al., 2016). A
diminuição de animais chegando aos CETAS poderia favorecer a uma melhor manutenção
das aves, visto que, conforme esclarecem EFE et al. (2006), um dos grandes entraves nessas
instituições é a dificuldade de manutenção das aves em cativeiro, pois envolve altos custos e
35
gastos com funcionários, alimentação e medicamentos, além de que os recursos de combate
ao tráfico são limitados.
2.7 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
A descoberta da penicilina por Alexander Fleming em 1928, a purificação e
síntese do composto feito por Howard Walter Florey e Ernst Boris Chain foram marcos
históricos para o tratamento das infecções bacterianas. Após o processo de industrialização da
penicilina, especialmente em consequência da Segunda Guerra mundial, foi observado um
rápido crescimento na descoberta e desenvolvimento de novos antibióticos (GUIMARÃES et
al., 2010). Apesar da rapidez com que tem se introduzido novos agentes microbianos, as
bactérias tem demonstrado uma notável capacidade de desenvolver resistência às diversas
drogas existentes (MURRAY et al., 2006).
A resistência aos antibióticos desenvolve-se de forma natural, pois é devastadora a
habilidade que a população bacteriana tem de se adaptar a diversos fatores como a exposição
a agentes químicos potentes (GUIMARÃES et al 2010). A resistência antimicrobiana pode ser
definida em resistência intrínseca e adquirida. A resistência intrínseca é aquela que ocorre
naturalmente, e é uma caraterística de toda a espécie. A resistência adquirida ocorre através de
processos mutagênicos, e indubitavelmente o mais preocupante é através da aquisição de
DNA exógeno. As bacterias promíscuas, pois podem trocar material genético entre linhagens
da mesma espécie ou de diferentes espécies e isso proporciona a transferência de genes de
organismos resistentes para os sensíveis (PRESCOTT, 2009; GUIMARÃES et al. 2010).
Nesse contexto, a resistência a múltiplos agentes antimicrobianos em bactérias
patogênicas tornou-se uma ameaça à saúde pública. Micro-organismos multirresistentes
(MDR) são aqueles considerados resistentes a pelo menos três antibióticos de classes
diferentes (MAGIORAKOS et al., 2012).
É crescente o interesse de estudar a resistência antimicrobiana, pois abrange tanto
a medicina humana como a veterinária, e agora se tornou clara que a devastadora resistência a
diversas classes de antibióticos representa um risco para a saúde humana e animal
(AARESTRUP, 2005). Diante da magnitude do problema que envolve a resistência a
inúmeros antibióticos, animais tanto de produção, estimação e aves do comércio ilegal são
36
rotineiramente submetidos a terapias com antibióticos. Portanto, a utilização desenfreada de
antibióticos está produzindo micro-organismos resistentes como Salmonella e Escherichia
coli (GILBERT, 2012; MATIAS et al., 2016).
No que diz respeito à medicina aviária tem se comprovado cada vez mais o
aparecimento de cepas resistentes a antimicrobianos ou resistentes a múltiplas drogas, (MDR)
carreadas por aves tanto de vida livre como as confiscadas pelo comércio ilegal (IKUNO et
al., 2008, SHOBRAK &ABO-AMER, 2014; HIDASI et al. 2013; MATIAS et al., 2016).
Interessante ressaltar que estudos prévios realizados em psitacídeos do comércio
ilegal revelaram micro-organismos como Salmonella e E. coli multirresistentes a diversas
drogas (MARIETTO-GONÇALVES et al 2010; HIDASI et al., 2013). Em se tratando dessas
aves é de extrema importância o estudo do estado sanitário desses animais confiscados, pois é
essencial avaliar se essas aves agem como portadores de agentes patogênicos que possam
transmitir para outros animais e seres humanos uma vez que esses animais serão
reintroduzidos na natureza (BRACONARO et al., 2015).
Em resumo, Pinto et al. (2015) afirmam que a permanência de aves em centros de
reabilitação poderia proporcionar maiores oportunidades de contaminação do ambiente com
bactérias que carreiam genes de resistência, além do contato direto com outras aves, com os
tratadores e através da cadeia alimentar podem também favorecer a disseminação desses
micro-organismos multirresistentes. Em seus estudos com aves do comércio ilegal os autores
constataram através das fezes e alimentos crus uma vasta quantidade de cepas de E. coli
multirresistentes. Santos et al. (2010) citam que o desenvolvimento de cepas resistentes em
aves de cativeiro podem ocorrer através do: contato com fezes de animais domésticos; contato
direto com o homem e através da ração comercial, que comumente contém antimicrobianos
como promotores de crescimento.
Adicionalmente estudos realizados por Matias et al., (2016) também
comprovaram que aves silvestres do tráfico apresentaram cepas de Salmonella Typhimurium
e Panamá multirresistentes a diversos antibióticos demonstrando que esses sorotipos circulam
na população de aves e que são capazes de causar sérios problemas para a saúde pública.
Diversos estudos ao longo dos anos vêm mostrando o isolamento de
enterobactérias da microbiota de psitacídeos, entretanto a preocupação com a resistência aos
37
antimicrobianos tem sido enfatizada nos últimos anos (MARIETTO-GONÇALVES et al.,
2010; HIDASI et al., 2013; LOPES et al., 2015; MACHADO et al., 2016). Em outras espécies
de aves silvestres essa problemática da multirresistência também tem sido relatada
(DOLEJSKA et al., 2007, PINTO et al., 2015; MATIAS et al., 2016).
Apesar das evidências da transmissão de cepas de bactérias multirresistentes, de
aves silvestres para humanos ainda não estarem bem definidas sabe-se que o contato com
outros animais e os seus subprodutos são importantes no processo de infecção humana. Desta
forma, é importante considerar que as aves silvestres são potencialmente portadoras de
agentes patogênicos e que a manipulação desses animais pode acarretar um risco para a saúde
humana se as mesmas não estiverem mantidas sob condições adequadas de higiene (MATIAS
et al., 2016).
38
3 JUSTIFICATIVA
Os psitaciformes, provenientes do tráfico de animais silvestres, devido às condições
do ambiente e alimentação inadequadas às quais são submetidos, tornam-se comprometidos
imunologicamente e com isso suscetível a diversos patógenos, dentre eles Salmonella e outras
importantes enterobacterias como a Escherichia coli. O conhecimento da ocorrência,
comportamento patogênico e resistência antimicrobiana e, fatores de virulência desses
patógenos, assim como a resposta imune dos psitacídeos infectados, são de grande importância
para o controle de possíveis problemas sanitários relacionados a esses micro-organismos.
Pesquisas dessa natureza não estão relacionadas apenas a sanidade das aves, pois sabe-se que
Salmonella e Escherichia coli diarreiogênicas podem acometer o homem e são consideradas
como causadoras das mais importantes zoonoses aviária.
39
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
1. Psittaciformes podem ser reservatórios de bactérias patogênicas como a Salmonella
enterica e Escherichia coli causadoras de problemas infecciosos em seres humanos;
2. Escherichia coli isolada de Psittaciformes provenientes do tráfico contém fatores de
virulência e pertencem a sorogrupos importantes para a saúde humana;
3. Salmonella sp. isolada de Psittaciformes provenientes do tráfico apresenta potencial
patogênico e risco a saúde de outras aves;
40
5 OBJETIVOS:
5.1 GERAL
Isolar enterobactérias em psitacídeos confiscados do tráfico de animais silvestres, avaliar a
patogenicidade de Salmonella Saintpaul inoculada em psitacídeo e identificar a presença de
sorogrupos e genes de Escherchia coli diarreiogênicas.
5.2 ESPECÍFICOS
1. Determinar a ocorrência de enterobactérias em psitaciformes alojados no CETAS-CE e
avaliar o perfil de sensibilidade antimicrobiana de enterobactérias isoladas;
2. Identificar sorogrupos de Escherichia coli em psitacídeos importantes para a saúde
humana de psitacídeos provenientes do tráfico e detectar atividade hemolítica e
produção de Betalactamase de Espectro Estendido (ESBL).
3. Diagnosticar através da PCR Escherichia coli diarreiogênicas isolada de Psittaciformes.
4. Avaliar a capacidade invasiva e a persistência de Salmonella Saintpaul isoladas de
psitaciformes através da inoculação experimental em periquitos australianos;
41
6 Capítulo 1
Prevalence and Antimicrobial Resistance Profile of Enterobacteria Isolated from
Psittaciformes of Illegal Wildlife Trade
(Prevalência e Perfil de resistência de enterobactérias isoladas de Psittaciformes do tráfico
illegal de animais silvestres)
Elisângela de Souza Lopes, William Cardoso Maciel, Átilla Holanda de Albuquerque, Débora
Nishi Machado, Windleyanne Gonçalves de Amorim Bezerra, Ruben Horn Vasconcelos,
Bruno Pessoa Lima, Guilherme Augusto Marietto Gonçalves e Régis Siqueira de Castro
Teixeira
Publicado no periódico: Acta Scientiae Veterinariae
(Publicado-Setembro 2015)
42
Prevalence and Antimicrobial Resistance Profile of Enterobacteria Isolated from
Psittaciformes of Illegal Wildlife Trade
Elisângela de Souza Lopes, William Cardoso Maciel, Átilla Holanda de Albuquerque, Débora
Nishi Machado, Windleyanne Gonçalves de Amorim Bezerra, Ruben Horn Vasconcelos,
Bruno Pessoa Lima, Guilherme Augusto Marietto Gonçalves e Régis Siqueira de Castro
Teixeira
Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO). Programa de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE),
Campus do Itaperi, Fortaleza, CE, Brazil. Docente da Universidade do Oeste de Santa
Catarina - UNOESC/Xanxerê-SC, Medicina Veterinária. CORRESPONDENCE: E.S. Lopes
[[email protected] - Fax +55 (85) 3101-9860]. Faculdade de Veterinária,
PPGCV, UECE. Av. Dr. Silas Munguba, n. 1700, Bairro Itaperi. CEP 60.714.903 Fortaleza-
CE. Brazil.
ABSTRACT
Background: The psittacine are birds frequently commercialized in illegal wildlife trade and
when apprehended by the responsible public departments are often found in poor sanitary
conditions. In these cases, these birds become susceptible to several pathogens, such as the
enterobacteria, which some are important poultry pathogens and other bacterial species may
be found in the intestinal microbiota, but may also cause intestinal and extraintestinal
opportunistic infections. Therefore, this study aimed to identify the prevalence of
enterobacteria in the intestinal microbiota of psittacine from the illegal wildlife trade and to
evaluate the antimicrobial resistance profiles in the isolated samples.
43
Materials, Methods e Results: A total of 167 individual cloacal swabs were collected from
apparently healthy psittacines, who were housed in the local Wildlife Rehabilitation Center
(Centro de Triagem de Animais Selvagens - CETAS) in Fortaleza, CE, Brazil. Initially,
samples were submitted to the microbiological procedure, with the following steps: pre-
enrichment, selective enrichment and plating. Biochemical tests were used to identify the
species of enterobacteria. The samples with biochemical profile of Salmonella spp. were
submitted to slide agglutination test using polyvalent "O" serum anti-Salmonella. To perform
the antibiotic susceptibility testing, all the strains isolated were cultured in BHI broth, and
then streaked in MacConkey agar. After this step, colonies were inoculated in tubes
containing sterile saline solution. Then, the diluted cultures were plated with the aid of sterile
swabs on plates containing Mueller-Hinton agar. Then, the following antimicrobial discs were
added to the plates: ceftiofur, ciprofloxacin, enrofloxacin, streptomycin, gentamycin,
sulfonamide, sulfamethoxazole-trimethoprim, nalidixic acid, ampicillin, polymyxin B,
tetracycline and azithromycin. From 119 birds (71.3%), a total of 161 bacteria strains from the
Enterobacteriaceae family were isolated, in which the most prevalent microorganisms were:
Escherichia coli (46.7%), Pantoea agglomerans (13.2%) and Enterobacter cloacae (12%).
Salmonella Saintpaul was detected in one sample (0.6%). The highest antibiotic resistance
rate observed was to azithromycin (92.3%), followed by ampicillin (52.6%) and sulfonamide
(28.2%). Multiple drug resistances were detected in 72.9% of the samples.
Discussion: These results demonstrate that psittacines from illegal wildlife trade harbor
various and important genera of enterobacteria, which most act like opportunistic pathogens.
Among the pathogens of greater importance to the public health, a strain of Salmonella
Saintpaul was isolated, indicating that the birds studied have the potential of spreading this
bacterial genus. The higher rate of resistant bacteria detected may have been a result of an
44
inappropriate use of antibiotics at some point in the lives of the psittacines investigated or that
these bacteria may have acquired resistance through genes transferred by other
microorganisms from the direct contact with other animals. If antimicrobial drug use is not
controlled, this condition may present a sanitary risk to the bird housed in CETAS, as well as
to the wild animals that are exposed to these psittacines when reintroduced in their natural
habitat. Since birds, carrying resistant bacteria may disseminate these microorganisms
through feces and therefore affect other wild animals.
Keywords: psittacine, captivity, antibiotics, microbiology, avian health.
INTRODUCTION
Macaws, parrots and parakeets are birds usually illegally traded [36]. These birds
when captured by hunters and maintained in inappropriate conditions often present a decreased
immune capacity by the stress to which they are submitted, becoming susceptible to infections
caused by many pathogens [1,33].
Among the bacteria considered important avian pathogens, the members of the
Enterobacteriaceae family are highlighted. This group of bacteria may be a part of the
commensal intestinal microbiota of some species, but in certain situations may opportunistically
colonize birds, with the possibility of causing intestinal or extraintestinal infections [8,29,34].
Enterobacteria are considered reservoirs of resistance genes, which can be transferred to other
bacteria, which can be a part of the intestinal microbiota of animals and humans [15].
There are few studies focusing surveys of the enterobacterial population of psitaccine,
as well as the effect of antimicrobial on the isolated pathogens. Microbiologial data of
populations targeted by illegal wildlife trade may contribute to the conservation of wild
species, since it can provide necessary information for improving sanitary control in the
45
management of captive birds, in altered natural environment and/or in rehabilitating birds
destined to reintroduction programs. Therefore, this study aimed to identify the prevalence of
enterobacteria isolated from psittacine of illegal wildlife trade and to analyze the
antimicrobial resistance profile of the isolated species.
MATERIALS AND METHODS
Sampling
One-hundred and sixty-seven (167) psittacine maintained in the Wildlife
Rehabilitation Center (Centro de Triagem de Animais Selvagens - CETAS) in Fortaleza, CE,
Brazil, were evaluated in this study for the presence of enterobacteria. At the time of
collection, all psittacines were apparently healthy. From the total of birds sampled, 12
different species were identified: three hyacinth macaws (Anodorhynchus hyacinthinus), two
scarlet macaws (Ara macao), seven blue-and-yellow macaws (Ara ararauna), one red-and-
green macaw (Ara chloropterus), one chestnut-fronted macaw (Ara severus), sixty seven
cactus parakeets (Eupsittula cactorum), three peach-fronted parakeets (Eupsittula aurea),
sixty six blue-fronted amazon parrots (Amazona aestiva), thirteen orange-winged amazon
parrots (Amazona amazonica), one mealy amazon parrot (Amazona farinosa), two yellow-
chevroned parakeets (Brotogeris chiriri) and one white-eyed parakeet (Psittacara
leucophthalma). For the collection of the samples, birds were physically restrained for cloacal
swabbing. Then, samples were immediately submitted to the Laboratory of Ornithological
Studies (LABEO) at the State University of Ceara for the bacteriological procedure.
Microbiological procedure
The samples were pre-enriched in buffered peptone water1, following enrichment with
BHI broth1 and Selenite-Cystine broth
1, after which samples were streaked in solid media in
petri dishes containing MacConkey agar1 and plates with Hektoen enteric agar
1. Initial
46
identification of bacteria were performed based on morphology and color of the colonies.
With a needle, two or three colonies were collected and transferred to Triple-Sugar-Iron agar
(TSI) 1
. In all steps, the tubes and plates were maintained in bacteriological incubator at 37ºC
for 24 h. The biochemical tests and the results were interpreted according to reference tables
for bacterial identification [18]. Colonies with morphology compatible with the genus
Salmonella were serologically tested with slide agglutination test using antiserum somatic O2.
The positive colonies were maintained in nutrient agar and sent to the Oswaldo Cruz Institute
Foundation (Fiocruz) in Rio de Janeiro (RJ) for serotyping.
Antimicrobial resistance testing
The following discs were used for the antimicrobial susceptibility test: ceftiofur (30
μg), ciprofloxacin (5 μg), enrofloxacin (5 μg), streptomycin (10 μg), gentamycin (10 μg),
sulfonamide (300 μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (25 μg), nalidixic acid (30 μg),
ampicillin (10 μg), polymyxin B (300 μg), tetracycline (30 μg) and azithromycin (15 µg). The
results were interpreted according to CLSI [9], and the strains classified as intermediate were
considered resistant. The bacteria were considered as multidrug-resistant when presented
resistance to at least two antibiotics.
RESULTS
From the 167 cloacal swabs samples of the twelve species of investigated Psittaciformes
enterobacteria were isolated from 119 (71.3%) individuals. Among the positive birds, from 16
different avian species a total of 161 bacterial strains were isolated, of which the most
prevalent was Escherichia coli (46.5%), followed by Pantoea agglomerans (13.2%) and
Enterobacter cloacae (12%) (Table 1).
Other enterobacteria were isolated less frequently: Salmonella Saintpaul (0.6%),
Escherichia hermanii (0.6%), Enterobacter aerogenes (0.6%), Citrobacter diversus (0.6%),
47
Citrobacter freundii (1.8%), Proteus mirabilis (1.8%), Klebsiella pneumoniae (1.8%), Hafnia
alvei (1.8%), Citrobacter amalonaticus (2.4%), Enterobacter gergoviae (2.4%), Serratia
rubidae (2.4%), Enterobacter sakazakii (3.6%), and Serratia liquefaciens (4.2%).
E. coli was the most commonly isolated bacteria among the psittacine species that
occurred in greater numbers in this study, with a prevalence of 61.1% and 28.4% for Amazona
aestiva and Eupsittula cactorum, respectively. In addition, Pantoea agglomerans and
Enterobacter cloacae, respectively, were the second and third most isolated enterobacteria.
All the different species of enterobacteria isolated from psittacines showed different
resistance rates to the antibiotics tested (Table 2). The antibiotic which the strains presented
the higher resistance was the azithromycin (91.3%), followed by ampicillin (51.6%) and
sulfonamide (38.5%). Among the bacterial species it was verified that 92.3% of E.coli strains
showed resistance to azithromycin, but it was also observed high resistance to ampicillin
(52.6%), tetracycline (48.7%) and streptomycin (37.2%). Pantoea agglomerans exhibited a
high resistance to azithromycin (91.3%), ampicillin (52.2%) and the sulfonamide (34.8%).
Enterobacter cloacae also showed a high resistance to azithromycin (83.3%), streptomycin
(70.8%) and ampicillin (41.7%). Just one sample of Salmonella was isolated, which serotype
was Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul. Among the twelve antibiotics
tested, this strain was resistant to azithromycin, streptomycin, tetracycline and sulfonamide.
Among the 161 enterobacteria isolated in this study, 153 (95.0%) showed resistance to
at least one of the antibiotics tested and a single Proteus mirabilis strain (0.6%) presented
resistance to 11 of the 12 antibiotics used. Additionally, more than half of the strains studied
(57.8%) were resistant to at least three antibiotics and 97.4% of the E. coli strains were
resistant to at least one antibiotic, whereas multiple resistance was detected in 70.5% of the
isolates. The highest number of antibiotics that a single E. coli isolate expressed resistance
48
was 10 (6.4%) (Table 3). The percentage of resistant E. coli to at least three antibiotics
(56.4%) was higher when compared to the total of bacterial isolates.
DISCUSSION
The obtained results demonstrated a 71.3% enterobacteria contamination rate in the
investigated birds and every positive individual presented at least one of the isolated species.
Gram negative bacteria may be isolated from healthy psittacine [33], however previous
studies indicated that the normal microbiota of these birds are composed only by Gram
positive bacteria and yeasts [7,20] and the presence of enterobacteria is not considered
normal, but actually is categorized as a contamination status by many authors [7,18,23,21].
As observed in other studies, E. coli was frequently isolated among the evaluated
psittacine (46.7%). Psittacine from a Wildlife Rehabilitation Center in Goias state were
investigated and a 33.87% E. coli contamination rate in feces samples was found [16]. Similar
results have been found [11] with 506 captive psittacine analyzed in the United States, from
which a 31% E. coli isolation rate was detected. In addition, a study [21] involving birds
from illegal wildlife trade in the São Paulo State found a 19% contamination rate and different
contamination levels between birds from conservationist farms (20%) and birds from a
recreational zoo (80%) have been reported [23].
A single strain of Salmonella enterica serotype Saintpaul was isolated from one
Amazona amazonica parrot, representing 0.6% (1/164) of the total. This result is similar to a
report [21], which found 1.12% of positive birds. The only report of this serotype in a
psittacine was previously described from an Ara chloroptera [20]. The Salmonella sp.
serotype most frequently isolated from psittacines is S. Typhimurium
[4,14,10,16,24,28,37,39], however others such as Braenderup, Lexington, Newport,
Enteritidis, Hadar, Bredney and Rissen have been reported [3,20,22,25,34,38].
49
Table 1. Prevalence of enterobacteria isolated from psittacine of ilegal wildlife trade in Fortaleza, Brazil.
Bacteria
Amazona
aestiva
Amazona
amazonica
Amazona
farinosa
Anodorhynchus
hyacinthinus
Ara
ararauna
Ara macao Ara
chloropterus
Eupsittula
cactorum
Eupsittula
Aurea
Ara
severus
Psittacara
leucophthalma
Brotogeris
chiriri
Total of
birds
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Escherichia coli 41 (61,1) 8 (61,5) - 1 (33,3) 4 (57,1) - - 19 (28,4) 2 (66,7) 1 (100,0) - 2 (100,0) 78 (46,5)
Escherichia hermanii 1 (1,5) - - - - - - - - - - - 1 (0,6)
Pantoea agglomerans 7 (10,6) - - 1 (33,3) 6 (85,7) - - 6 (9,0) - - 1 (100,0) 1 (50,0) 22 (13,2)
Enterobacter cloacae 7 (10,6) 1 (7,7) 1 (100,0) - 2 (28,6) - - 9 (13,4) - - - - 20 (12,0)
Enterobacter gergoviae 1 (1,5) - - - 1 (14,3) - - 2 (3,0) - - - - 4 (2,4)
Enterobacter aerogenes 0 (0,0) - - - - - - 1 (1,5) - - - - 1 (0,6)
Enterobacter sakasakii 1 (1,5) 1 (7,7) - - - - - 4 (6,0) - - - - 6 (3,6)
Serratia rubidae 2 (3,0) 1 (7,7) - - 1 (14,3) - - - - - - - 4 (2,4)
Serratia liquefaciens 4 (6,1) - - - 2 (28,6) - - 1 (1,5) - - - - 7 (4,2)
Citrobacter amalonaticus - 1(7,7) - - - - - 3 (4,5) - - - - 4 (2,4)
Citrobacter diversus 1 (1,5) - - - - - - - - - - - 1 (0,6)
Citrobacter freundii 1 (1,5) - - - - 1(50,0) - - - - 1 (100,0) - 3 (1,8)
Proteus mirabilis 1 (1,5) 1 (7,7) - - - 1(50,0) - - - - - - 3 (1,8)
Klebsiella pneumoniae 2 (3,0) 1 (7,7) - - - - - - - - - - 3 (1,8)
Hafnia alvei 2 (3,0) - - - - - - 1 (1,5) - - - - 3 (1,8)
Salmonella Saintpaul - 1 (7,7) - - - - -
-
-
- - - - 1 (0,6)
Negative birds 11 (16,7) - - - 2 (28,6) - 1 (100,0) 33 (49,3) 1 (33,3) - - - 48 (28,7)
Positive birds 55 (83,3) 13 (100,0) 1 (100,0) 3 (100,0) 5 (71,4) 2 (100,0) - 34 (50,7) 2 (66,7) 1 (100,0) 1(100,0) 2 (100,0) 119 (71,3)
50
Table 02. Frequency of enterobacteria resistant to antimicrobials isolated from psittacine of illegal wildlife trade.
Bacteria
AZI STR SUL CIP SUT TET ENO CTF GEN AMP NAL POL
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
Escherichia coli 72 (92,3) 29 (37,2) 22 (28,2) 6 (7,7) 24 (30,8) 38 (48,7) 9 (11,5) 4 (5,1) 2 (2,6) 41 (52,6) 20 (25,6) 2 (2,6)
Escherichia hermanii - - - - - - - - - - - -
Enterobacter cloacae 20 (83,3) 17 (70,8) 12 (50,0) 1 (4,2) 4 (16,7) 5 (20,8) 1 (4,2) - - 10 (41,7) 6 (25,0) 1 (4,2)
Enterobacter gergoviae 4 (100,0) - 1 (25,0) - 1 (25,0) 1 (25,0) - 1 (25,0) - - - -
Enterobacter aerogenes 1 (100,0) - 0 (0,0) - - - - - - 1 (100,0) - -
Enterobacter sakazakii 6 (100,0) 1 (20,0) 4 (80,0) - 1 (20,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 2 (40,0) - 5 (100,0) 2 (40,0) -
Citrobacter amalonaticus - - - - - - - - - - - -
Citrobacter diversus 1 (100,0) - 1 (100,0) - 1 (100,0) 1 (100,0) - 1 (100,0) - 1 (100,0) - -
Citrobacter freundii 3 (100,0) - 2 (66,7) - 1 (33,3) 0 (0,0) - - - 1 (33,3) 2 (66,7) 2 (66,7)
Proteus mirabilis 3 (100,0) 1 (33,3) 3 (100,0) - 3 (100,0) 3 (100,0) 1 (33,3) 1 (33,3) 1 (33,3) 3 (100,0) 3 (100,0) 3 (100,0)
Serratia rubidae 4 (100,0) 1(25,0) 2 (50,0) 1 (25,0) 2 (50,0) 3 (75,0) 1(25,0) 1 (25,0) 1 (25,0) 4 (100,0) 2 (50,0) -
Hafnia alvei 2 (66,7) - 1 (33,3) - - - 1 (33, 3) - - 1 (33,3) - -
Klebsiella pneumoniae 2 (100,0) - 1 (50,0) - 1 (50,0) 1 (50,0) - - - 2 (100,0) - -
Serratia liquefaciens 7 (100,0) 1(14,3) 4 (57,1) - 1 (14,3) - - - - 2 (28,6) 1 (14,3) -
Pantoea agglomerans 21 (91,3) 2 (8,7) 8 (34,8) 1 (4,3) 7 (30,4) 6 (26,1) 1 (4,3) 2 (8,7) - 12 (52,2) 2 (8,7) -
Salmonella Saintpaul 1 (100,0) 1 (100,0) 1 (100,0) - - 1 (100,0) - - - - - -
Total (enterobacterias) 147 (91,3) 53 (32,9) 62 (38,5) 9 (5,6) 46 (28,6) 60 (37,3) 15 (9,3) 12 (7,5) 4 (2,5) 83 (51,6) 38 (23,6) 8 (5.0)
AZI: azithromycin; AMP: ampicillin; NAL: nalidixic acid; CTF: ceftiofur; SUT: sulfamethoxazole+trimethopim; STR: streptomycin; SUL: sulfonamide; GEN: gentamicin; CIP: ciprofloxacin; ENO: enrofloxacin; TET:
tetracycline; POL: polymyxin B. *Proteus spp. are naturally resistant to polymyxin B.
51
Table 3. Multi-drug resistant (MDR) enterobacteria isolated from parrots of CETAS in Fortaleza,
Brazil.
Antibiotics
Resistant E. coli strains
(%)
Total of resistant strains (%)
None 2 (2.5) 8 (5.0)
at least 1 76 (97.4) 153 (95.0%)
>1 55 (70.5) 117 (72.9%)
>2 44 (56.4) 93(57.8%)
>3 33 (42.3) 63 (39.1%)
>4 25 (32.1) 45 (28.0)
>5 13 (16.7) 23 (14.3)
>6 10 (12.8) 16 (9.9)
>7 8 (10.3) 11 (6.8)
>8 7 (9.0) 9 (5.6)
>9 5 (6.4) 6 (3.7)
>10 0 (0.0) 1 (0.6)
>11 0 (0.0) 0 (0.0)
Salmonella enterica and E. coli are among the most clinically important enterobacteria
for humans and animals, and there is a considerably high number of scientific studies
concerning these two pathogens. However, the other enterobacteria species isolated should
not be interpreted as unimportant pathogens. Species from Proteus, Hafnia, and Serratia
genera can act as opportunistic pathogens in certain circumstances [12,31] and result in a
hazard to the avian health. In most studies, however, the genera Klebsiella, Enterobacter and
Citrobacter are most frequently debated, due to the higher number of infection cases in birds
and humans, most often related to secondary infections [6,13].
52
In this study, Enterobacter clocae (20%) was one of the most isolated species from
psittacines. The Enterobacter genus is important due to the frequent association with systemic
infections, such as respiratory and intestinal [32]. However, it is important to note that the
species E. sakazakii, E. cloacae, E. aerogenes can be isolated from clinically healthy birds
[12,16].
The antimicrobial resistance analyzed in this study revealed high azithromycin
resistance rates, which is an antibiotic widely used in treatment of human infections and that
is currently being used in the veterinary medicine [27]. Despite lower rates of antimicrobial
resistance when compared to azithromycin, antibiotics such as ampicillin, tetracycline and
sulfonamide also showed high resistance rates, thus suggesting more caution when using
these drugs.
In psittacine, the studies evaluating antimicrobial sensitivity Enterobacteriaceae
members do not present uniformity. In addition, they are very scarce and the few that exist are
directed to investigating E. coli. Other studies revealing high resistance rates of E. coli strains
to ampicillin, similar to the results in this study, have been described [2,16], presenting
resistance rates of 100% and 75.58% of strains isolated from cloacal swabs of psittacine. The
excessive use of a specific antimicrobial agent may explain the differences between the
sensitivity profiles observed among the surveys. Since it is known that continuous exposure of
the bacteria to an antimicrobial agent tends to select this microorganism to resistance [5,29].
In this study, high rates of multidrug resistance can be observed when at least two
antibiotics are considered. In addition, a considerable rate of E. coli (32.1%), as well total
Enterobacteriaceae (28.0%), resistant to more than four antibiotics could be detected. These
results suggest that at some point in life, these psittacine had access to antibiotics or acquired
resistant bacteria. This fact can bring negative consequences to animal health, since, the
53
occurrence of bacteria with high rates of antimicrobial resistance hinders infection treatment
and contributes to increase the therapeutic costs [26].
The presence of multidrug resistant strains, if not controlled, can be considered a
condition of sanitary risk to the birds in CETAS, as well as to free-living animals that may be
exposed to the introduced birds. Birds carrying resistant strains may spread these bacteria and,
consequently, affect other wildlife animals through direct or indirect contact with
contaminated feces [15]. In this context, the investigation of Gram negative bacteria in
psittacine destined to reintroduction or from illegal wildlife trade is essential to avoid
problems related to the dissemination of antimicrobial resistant bacteria [22].
In conclusion, psittacine from illegal wildlife trade in this study harbor several and
important genera of Enterobacteriaceae, which most act as opportunist pathogens. Among the
microorganisms that present a risk to the public health, the presence of Salmonella Saintpaul
was observed, which indicates that the studied psittacine have the potential to disseminate
bacteria of this genus. The antimicrobial susceptibility tests revealed that the enterobacteria
found in the intestinal microbiota of the studied birds presented high multidrug resistance
rates, which the most frequent resistance was to azithromycin among the various isolated
strains and this may be a consequence inadequate use of this antibiotic at some part of the life
of these birds. Given the several bacterial genera isolated and the high frequency of multidrug
resistant strains, we observed that CETAS plays a key role in the sanitary control of the
psittacine that will be reintroduced in their habitat, otherwise, environmental problems
involving the dissemination of these agents to wildlife species or even to man may become a
real issue.
54
MANUFACTURERS
1Himedia®. Mumbai, India.
2Probac do Brasil®. São Paulo, SP, Brazil.
3Laborclin®. Pinhais, PR, Brazil.
Acknowledgments. We thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), the Centro de Triagem de Animais Silvestres de Fortaleza (CETAS)
and the Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO) for all the support in this study.
Ethical approval. The experimental protocol was approved by the Animal Research Ethics
Committee of Ceará State University (CEUA/UECE), protocol nº 127697942.
Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are
responsible for the content and writing of the paper.
REFERENCES
1 Aguilar R.F., Hernandez S.M. e Hernandez S.J. 2006. Atlas de medicina, terapêutica
e patologia de animais exóticos. 1 ed. São Caetano do Sul: Interbook, 375p.
2 Akhter J.M., Hossain T., Islam M.T., Siddique M.P. e Islam M.A. 2010. Isolation
and identification of microflora from apparently healthy caged parrots of Dhaka Zoo of
Bangladesh. Bangladesh Journal of Veterinary Medicine. 25(1): 5- 10.
3 Allgayer M.C., Oliveira S.J., Mottin V.D., Loiko M.R., Abilleira F., Guedes
N.M.R., Passos D.T. e Weimer T.A. 2009. Isolamento de Salmonella Braenderup em
arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus) de vida livre do Pantanal (Mato
Grosso do Sul, Brasil). Ciência Rural. 39(8): 2542-2545.
4 Allgayer M. C., Lima-Rosa C.A.V., Weimer T.A., Rodenbusch C.R., Pereira R. A.,
Streck A. F., Oliveira S.D. e Canal C.W. 2008. Molecular diagnosis of Salmonella
species in captive psittacine birds. Veterinary Record. 162(25): 816-819.
55
5 Arias M.V.B. e Carrilho C.M.D.M. 2012. Resistência antimicrobiana nos animais e no
ser humano. Há motivo para preocupação? Semina: Ciências Agrárias. 33(2): 775-590.
6 Badger J.L., Stins M.F. e Kim K.S. 1999. Citrobacter freundii Invades and Replicates
in Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67(8): 4208-
4215.
7 Bangert R.L., Cho B.R., Widders P.R., Stauber E.H. e Ward A.C. 1988. A survey
of aerobic bacteria and fungi in the feces of healthy psittacine birds. Avian
Diseases.32(1): 46-52.
8 Campos L.C. e Trabulsi L.R. 2002. Escherichia. In: Trabulsi L.R. e Souza C.P. (Eds.)
Microbiologia. 3 ed. São Paulo: Atheneu, pp.215-228.
9 Clinical Laboratory Standards Institute 2012. Document M100-S22 - Performance
Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Informational Supplement. Twenty-
Second – v. 32, n. 3.
10 Dorrestein G.M., Buitelaar M.N., Van Der Hage M.H. e Zwart P. 1985. Evaluation
of bacteriological and mycological examination of psittacine birds. Avian Disease.
29(4): 951-962.
11 Flammer K. e Drewes L.A. 1988. Species-related differences in the incidence of
Gram-negative bacteria isolated from the cloaca of clinically normal psittacine birds.
Avian Diseases. 32(1): 79-83.
12 Fudge A.M. 2001. Diagnosis and Treatment of Avian Bacterial Diseases. Seminars in
Avian and Exotic Pet Medicine. 10(1): 3-11.
13 Gerlach H. 1994. Bacteria. In: Ritchie, Harrison and Harrison (Eds.). Avian Medicine:
Principles and Application. 1ed. Florida: Wingers Publishing, pp.949-983.
14 Grimes J.E. e Arizmendi F. 1992. Survey of clinical psittacine bird sera for
Salmonella Typhimurium agglutinins. Avian Diseases. 36(3): 813-815.
56
15 Hebla L., Kačániová M., Lejková J. e Pocho J. 2011. Antibiotic Resistance of
Enterobacteriaceae Species Associated with Faecal Bacterial Cenosis of Ducks. Animal
Science and Biotechnologies. 44(1): 408-414.
16 Hidasi H.W., Neto J.H., Moraes D.M.C., Linhares G.F.C., Jayme V.S. e Andrade
M.A. 2013. Enterobacterial detection and Escherichia coli antimicrobial resistance in
parrots seized from the illegal wildlife trade. Journal of Zoo and Wildlife Medicine.
44(1): 1-7.
17 Jang Y.H., Lee S.J., Lim J.G., Lee H.S., Kim T.J., Park J.H., Chung B.H. e Choe
N.H. 2008. The rate of Salmonella sp. infection in zoo animals at Seoul Grand Park,
Korea. Journal of Veterinary Science. 9(2): 177-181.
18 Kanashiro A.M.I., De Castro A.G.M., Cardoso A.L.S.P., Tessari E.N.C. e Tavechio
A.T. 2002. Persistência de Salmonella spp. após antibióticoterapia em psitacídeos
pertencentes a um criadouro comercial. Arquivos do Instituto Biológico. 69(2): 99-101.
19 Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Procop G., Schreckenberger P. e Woods
G. 2012. As Enterobacteriaceae. In: Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas
Colorido. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, pp. 209-243.
20 Lopes E.S., Cardoso W.M., Albuquerque Á.H., Teixeira R.S.C., Salles R.P.R.,
Bezerra W.G.A., Rocha e Silva R.C., Lima S.V.G., Sales R.J.P.F. e Vasconcelos
R.H. 2014. Isolation of Salmonella spp. in captive Psittaciformes from zoos and a
commercial establishment of Fortaleza, Brazil. Arquivo Brasileiro de Medicina. 66(3):
965-968.
21 Marietto-Gonçalves G.A., Almeida S.M., Lima E.T. e Andreatti Filho, R.L. 2010.
Detecção de Escherichia coli e Salmonella spp. em microbiota intestinal de
Psittaciformes em fase de reabilitação para soltura. Brazilian Journal of Veterinary
Research and Animal Sciences. 47(3): 185-189.
57
22 Marietto Gonçalves G.A., Almeida S. M., Lima E.T., Okamoto A.S., Pinczowsk P.
e Andreatti Filho R.L. 2010. Isolation of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in
Blue-Fronted Amazon Parrot (Amazona aestiva). Avian Disease. 54(1): 151–155.
23 Mattes B.R., Consiglio S.A.S., Almeida B.Z., Guido M.C., Orsi R.B., Silva R. M.,
Costa A., Ferreira A.J.P., e Knöbl T. 2005. Influência da biossegurança na
colonização intestinal por Escherichia coli em psitacídeos. Arquivo do Instituto
Biológico. 72(2): 13-16.
24 Menão M.C.; Bottino J.A.; Biasia I.; Ferreira C.S.A., Calderaro F. F., Tavechio
A.L., Fernandes S. e Ferreira A.J.P. 2000. Infecção por Salmonella Typhimurium em
Arara Azul (Anodorynchus hyacinthinus). Arquivos do Instituto Biológico. 67(1): 43-47.
25 Oliveira C.Z.F., Boakari Y.L., Braga J.F.V. e Nobre M.L.M. 2009. Detecção de
Salmonella sp. em papagaios (A. aestiva e A. amazona) de vida livre apreendidos no
Estado do Piauí. In: XXV Congresso Brasileiro de Microbiologia. Porto de Galinhas,
PE. Microbiologia In foco. São Paulo. p.108.
26 Oliveira K.W., Gomes F.C.O. e Morais P.B. 2012. Ocorrência de Escherichia coli
multirresistentes a antimicrobianos nas principais praias do reservatório de Lajeado –
TO. Engenharia Ambiental. 9(3): 338-351.
27 Pereira I.A., Soares L.C., Coelho S.M.O., Balbino F.A., Pribul B.R. e Souza
M.M.S. 2009. Suscetibilidade à azitromicina de agentes bacterianos isolados de
processos infecciosos em diferentes sítios de animais de companhia. Arquivo Brasileiro
Medicina Veterinária Zootecnia. 61(34): 601-616.
28 Piccirillo A., Mazzariol S. Caliari D. e Menandro M.L. 2010.
Salmonella Typhimurium Phage Type DT160 Infection in Two Moluccan Cockatoos
(Cacatua moluccensis): Clinical Presentation and Pathology. Avian Diseases. 54(1):
131-135.
58
29 Regitano J.B. e Leal R.M.P. 2010. Comportamento e impacto ambiental de
antibióticos usados na produção animal brasileira. Revista Brasileira de Ciência do
Solo. 34(6): 601-616.
30 Ritchie B.W., Harrison G.J. e Harrison L.R. 1994. Avian Medicine: principles and
application. 1ed. Florida: Wingers Publishing, 1384p.
31 Rodriguez L.A., Vivas J., Gallardo C.S. Acosta F., Barbeyto L. e Real F. 1999.
Identification of Hafnia alvei with the Micro Scan Walk Away system. Journal of
Clinical Microbiology. 37(12): 4186-4188.
32 Rooskopf W. e Woerpel R. 1996. Diseases of cage and aviary birds. 3th edn.
Baltimore Pensylvania - USA, Willians e Wilkins A waverly Company, 650p.
33 Rupley A.E. 1999. Manual de clínica aviária. 1ed. São Paulo, Rocca, 598p.
34 Seepersadsingh N. e Adesiyun A.A. 2003. Prevalence and Antimicrobial Resistance of
Salmonella sp. in Pet Mammals, Reptiles, Fish Aquarium Water, and Birds in Trinidad.
The Journal of Veterinary Medical Science. 50(10): 488–493.
35 Segabinazi S.D., Flôres M.L., Barcelos A.S., Jacobsen G. e Eltz R.D. 2005. Bactérias
da família Enterobacteriaceae em Alphitobius diaperinus oriundos de granjas avícolas dos
Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina, Brasil. Acta Scientiae Veterinariae.
33(1): 51-55.
36 Sick H. 1997. Ornitologia Brasileira. Rio de Janeiro. Ed. Nova Fronteira, 862p.
37 Vigo G.B., Origlia J., Gornatti D., Piscopo M., Salve A., Caffer M.I., Pichel M.,
Binsztein N. e Leotta G.A. 2009. Isolation of Salmonella Typhimurium from dead blue
and gold macaws (Ara ararauna). Avian Disease. 53(1): 135–138.
38 Vilela V.O., Guedes N.M.R., Araújo F.R., Solari C.A., Filiú W.F.O., Catelan V.L.,
Alves M.M., Carmo M.A., Souza, R.A. e Vargas, F.C. 2001. Salmonella Bredney em
59
Arara-Azul (Anodorhynchus hyacinthinus). In: IX Congresso Brasileiro de Ornitologia.
(Curitiba-Paraná.). p.394-395.
39 Ward M.P., Ramer J.C., Foot J.P., Garner M.M., Salles C.J. e WU C.C. 2003.
Outbreak of salmonellosis in a zoologic collection of lorikeets and lories
(Trichoglossus, Lorius, and Eos sp.). Avian Diseases. 47(2): 493–498.
60
7 Capítulo 2
Serogroup identification, phenotypic detection of hemolysis and extended spectrum
beta-lactamases of Escherichia coli isolated from psittacine of illegal wildlife trade in
Fortaleza, Brazil
[Identificação de sorogrupos, e detecção fenotípica de Betalactamase de Espectro Estendido
e produção de hemolisina em Escherichia coli isoladas de psitacídeos do tráfico de animais
silvestres em Fortaleza-CE]
E.S. Lopes1, W.M, Cardoso
1, D.M. Nishi
1, R.V. Horn
1, Á.H. Albuquerque
1, S.V.G. Lima
1,
A.J.F. Beleza1, F.G. Conceição
1, C.C, Carmo
1, M.N, Pascoal Filho
1, R.S.C. Teixeira
1.
Submetido: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
61
Serogroup identification, phenotypic detection of hemolysis and extended spectrum
beta-lactamases of Escherichia coli isolated from psittacine of illegal wildlife trade in
Fortaleza, Brazil
[Identificação de sorogrupos, e detecção fenotípica de Betalactamase de Espectro
Estendido e produção de hemolisina em Escherichia coli isoladas de psitacídeos do tráfico
de animais silvestres em Fortaleza-CE]
E.S. Lopes1, W.M, Cardoso
1, D.M. Nishi
1, R.V. Horn
1, Á.H. Albuquerque
1, S.V.G. Lima
1,
A.J.F. Beleza1, F.G. Conceição
1, C.C, Carmo
1, M.N, Pascoal Filho
1, R.S.C. Teixeira
1.
1Universidade Estadual do Ceará – UECE – Fortaleza, CE
ABSTRACT
This study aimed to identify serogroups of Escherichia coli important for human health in
isolates from psittacine of illegal wildlife trade in Ceará State, in addition to detect hemolysis
and production of Extended Spectrum Beta-Lactamases (ESBL). A total of 78 E. coli strains
isolated from different Psittaciformes species in a wildlife rehabilitation center in Fortaleza,
Brazil, previously identified and stored were used in this study. Serogroup identification was
performed using polyvalent sera for EPEC (O55, O111, O119, O114, O125, O86, O126,
O127, O128), EIEC (O136, O124) and EHEC (O157). ESBL detection was performed with
double disk synergy method. For hemolysis detection, isolates were inoculated in blood agar
base enriched with ovine blood. Only 32 (41%) isolates were seropositive and the most
frequent were O127, O114, O128 and O111. There was no agglutination for serogroups O55,
O124, O136 or O157. Considering both seropositive and seronegative isolates, 9 (11.5%) and
35 (44.9%) presented hemolysis and ESBL production, respectively. In conclusion, the
investigated psittacine from illegal wildlife trade hosted ESBL-producing E. coli strains and
some belong to important serogroups often linked to severe human infections.
Keywords: Escherichia coli, serogroups, ESBL, hemolysis.
62
RESUMO
Esse trabalho teve como objetivo identificar sorogrupos de E. coli importantes para a saúde
humana oriundos de psitacídeos provenientes do tráfico no Estado do Ceará, assim como
detectar atividade hemolítica e produção de Betalactamase de Espectro Estendido (ESBL).
Foram testadas 78 cepas de Escherichia coli proveniente de Psitaciformes do Centro de
Triagem de Animais Silvestres, Fortaleza, CE. Para a identificação dos sorogrupos,
utilizaram-se soros polivalentes EPEC (O55, O111, O119, O114, O125, O86, O126, O127,
O128), EIEC (O136, O124) e EHEC (O157). Para detecção de ESBL as cepas foram
submetidas ao método de aproximação de disco e para a detecção de Hemolisina foram
plaqueadas em ágar sangue base enriquecido com sangue de carneiro. No geral, 32 (41,0%)
das amostras foram soropositivas. Os sorogrupos mais frequentemente detectados foram
O127, O114, O128 e O111. Não houve positividade para os sorogrupos O55, O124, O136 e
O157. Considerando as amostras sororreagentes e não sororreagentes, observou-se que 9
(11,5%) e 35 (44,9%) cepas de E. coli apresentaram produção de hemolisinas e produção de
ESBL respectivamente. Em conclusão, observou-se que psitacídeos provenientes do tráfico de
animais silvestres albergam cepas de E. coli produtoras de ESBL e são providas de
importantes sorogrupos implicados em graves infecções humanas.
Palavras-chave: Escherichia coli, sorogrupos, ESBL, hemólise.
INTRODUCTION
Important enterobacteria, such as Salmonella and Escherichia coli, have been isolated
from psittacine seized from illegal wildlife trade (Marietto-Gonçalves et al., 2010). Therefore,
the contact of these animals with humans or other animals may present a risk, considering that
wild birds may transmit virulent or resistant pathogens (Bonnedahl et al., 2009; Saidenberg et
al., 2012).
Some E. coli identified as causative agents of intestinal disorders have been defined as
a the specific pathotype enteropathogenic (EPEC) and were initially diagnosed with
serological tests and association with diarrhea in children (Regua et al., 1990). This
denomination differentiates some of the pathogenic from commensal strains found in the
human microbiota (Nataro and Kaper 1998). EPEC may host genes usually found in other
diarrheagenic pathotypes, such as those enconding hemolysins (Magalhães et al., 2011).
Pathogens with these characteristics may be detected with the hemolytic activity test, which
has been important for initial analysis of virulence (Roy et al., 2006).
63
In addition to EPEC serogroups, others are known causative agents in humans.
Serogroup O157, which is a part of enterohemorrhagic pathotype (EHEC), cause hemorrhagic
colitis and hemolytic uremic syndrome in humans, which is a severe and frequently lethal,
when associated with flagellar antigen H7 (Mittelstaedt e Carvalho 2006). However, despite
the flagellar antigen H7, serogroup O157 is a severe pathogen to humans (Synge, 2000). A
less frequent pathotype, but also related to human intestinal infections, is enteroinvasive
Escherichia coli (EIEC), which often affects children with at least two years of age and adults
(Martinez and Trabulsi, 2008).
In addition to hosting E. coli with virulence factors, antimicrobial resistance is a
considerable problem concerning this microorganism, especially to beta-lactam antibiotics,
which are frequently used in human and veterinary medicine (Bonnedahl et al., 2009). The
investigation of bacterial resistance in wild birds from illegal wildlife trade is important not
only due to the possibility of zoonotic transmission (Lopes et al., 2015), but also to the
probable dissemination of these resistant microorganisms to the environment after
reintroduction of infected and rehabilitated specimens (Dolejska e Literak, 2007).
In fact, there are scarce studies relating the detection of virulence factors in the
microbiota of wild birds, especially with victims of illegal wildlife trade. Therefore, this study
aimed to identify serogroups of E. coli important for the humans health from psittacine of a
local wild animals rehabilitation center in Fortaleza, Brazil, in addition to identify the
presence of hemolytic activity and extended spectrum beta-lactamase production.
MATERIAL AND METHODS
A total of 78 strains of Escherichia coli previously isolated by Lopes et al. (2015)
from Psittaciformes maintained in a local wild animal rehabilitation center in Fortaleza,
Brazil, was used in this study. The experimental protocol was approved by the Animal
Research Ethics Committee of Ceará State University (CEUA/UECE), protocol nº
127697942. Strains were maintained temporarily in nutrient agar and were reactivated to
perform the tests. For serogroup identification, the polyvalent sera were used: EPEC (O55,
O111, O119, O114, O125, O86, O126, O127, O128), EIEC (O136, O124) and (O157)
(EHEC).
Serogroups were identified with rapid slide agglutination test following
manufacturer’s specifications. Briefly, a suspension with the strain was prepared with sterile
buffered peptone water (0.1%) and a drop was placed in a slide. Then, a drop of the
polyvalent serum was added and gently homogenized, with a result interpreted as positive
64
with the observation of agglutination and negative in the absence. As a negative control, DHα
E. coli strain was used and O157:H7 was used as a positive control.
Hemolysin production was assessed with the use of plates containing blood agar base
enriched with ovine blood (5%) inoculated with the E. coli strains incubated at 37º C for 24
horas. Then, plates were evaluated for the presence of partial or complete hemolysis.
E. coli isolates were tested for the production of extended spectrum beta-lactamases
(ESBL) with the double disk synergy method according to Dhara et al., (2012) with
modifications. Disk diffusion was performed in plates with Mueller-Hinton agar inoculated
with a bacterial suspension adjusted to 0.5 turbidity in McFarland scale. Then, a disk
containing amoxicillin with clavulanic acid (30µg) was placed in the center of the plate and,
around, in a distance of 30mm center to center from the central disk, the following were
distributed: ceftazidime (30µg), ceftriaxone (30µg), cefepime (30µg) and aztreonam (30µg).
ESBL production was positive when the inhibition zone was improved towards some of the
cephalosporins or aztreonam, or even the appearance of an irregular inhibition zone (ghost
zone) between the composed disk and one of the beta-lactam drugs. E. coli ATCC 25922 was
used as a negative control and Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 as a positive control.
RESULTS
Agglutination was observed in 31 (39.7%) out of 78 tested isolates. Most prevalent
serogroup was O127 (11.5%), followed by O114 and O128, both with a 6.4% frequency (Tab.
1). Among the twelve serogroups investigated, O55, O124, O136 and O157 were not
identified. Strains isolated from Amazona aestiva and Eupsittula cactorum presented the most
diversity of serogroups and elevated number of positive reactions.
65
Table 1. Absolute and relative frequencies of Escherichia coli serogroups isolated from psittacine seized from illegal wildlife trade in Ceará,
Brazil.
Avian species EPEC Serogroups
n O86 O111 O114 O119 O125 O126 O127 O128
Eupsitulla cactorum 20 - 1(5.0%) 1(5.0%) 1(5.0%) - - 4(20.0%) -
Amazona aestiva 40 1(2.5%) - 3(7.5%) 1(2.5%) 2(5.0%) 2(5.0%) 3(7.5%) 3(7.5%)
Amazona amazonica 9 - 2(22.2%) - - 1(11.1%) - 1(11.1%) -
Ara ararauna 4 - - - - - - 1(25.0%)
Anodorhynchus hyacinthinus 1 - - - - - - - 1(10.,0%)
Ara severus 1 - - 1(100.0%) - - - - -
Eupsittula aurea 2 - 1(50.0%) - - - - - -
Brotogeris chiriri 1 - - - - - - - 1(100.0%)
Total 78 1(1.3%) 4(5.1%) 5(6.4%) 2(2.6%) 3(3.8%) 2(2.6%) 9(11.5%) 5(6.4%)
No strain was positive for serogroups O55, O124, O136 and O157.
Considering only the seropositive isolates, 4 (5.1%) and 16 (20.5%) presented
hemolysis and ESBL production, respectively (Fig. 1). Among the seronegative isolates, 5
(6.4%) presented hemolytic activity and 19 (24.4%) produced ESBL. In general, hemolysis
rate was 11.5%, while ESBL production rate was 44.9%.
Figure 1. Percentage of seropositive and seronegative Escherichia coli strains producing hemolysis and
ESBL isolated from psittacine seized from illegal wildlife trade.
Among the isolates that presented hemolysis, serogroups O86 (n=1), O127 (n=2) and
O114 (n=1) were identified. ESBL-producing strains were positive for the following
5.1 6.4
11.5
20.5
24.4
44.9
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Seropositive Seronegative Total
Posi
tive s
am
ple
s (%
)
Hemolysis ESBL
66
serogroups: O111 (n=1), O119 (n=2), O125 (n=3), O126 (n=1), O127 (n=5), O128 (n=2),
O86 (n=1). Only three isolates were positive for all tests and the serogroups were O86, O127
and O114. A total of 26 E. coli strains (33.3%) were negative for ESBL-production,
hemolysis and the investigated serogroups (Tab. 2).
Table 2. Escherichia coli profile of psittacine surveyed for O
serogroup, hemolysis and extended spectrum beta-lactamase
(ESBL) production.
Isolates (n) Serogroups Hemolysis ESBL
1 O86 + +
3 O111 - -
1 O111 - +
1 O114 - +
3 O114 - -
1 O114 + +
1 O119 - -
1 O119 - +
3 O125 - +
1 O126 - -
1 O126 - +
4 O127 - +
3 O127 - -
1 O127 + -
1 O127 + +
2 O128 - +
3 O128 - -
2 NR + -
26 NR - -
16 NR - +
3 NR + +
78 39.7%* 11.5%* 44.9%*
NR – Negative reaction to all of the sera used in this study.
* Positive percentage was calculated based on the total number of
investigated strains (n=78).
67
DISCUSSION
The elevated variety and number of positive serogroups detected in strains from
Amazona aestiva and Eupsittula cactorum may be explained by the fact that in the study in
which they were isolated (Lopes et al., 2015), those were the main species found in the
population.
The presence of these E. coli serogroups in these birds may be associated with contact
with humans during domiciliary captivity before being seized or during the period in which
these animals were exposed to inappropriate conditions in their journey from capture in the
wild until being apprehended by official authorities.
Most serogroups detected in this study (O111, O119, O114, O125, O86, O127, O126,
O128) have been reported in breast-fed children (Regua et al., 1990, Oliva et al., 1997) in
association with severe cases of acute diarrhea. Despite the fact that these serogroups have not
been yet reported in psittacine, preventive measures should be applied to avoid severe
problems, considering the importance of these microorganisms to human health and the
possibility of transmission between birds and people.
In this study, serogroup O157 was not identified in any of the isolated samples.
Studies demonstrate that the isolation frequency of E. coli strains from this serogroup is low.
According to Coura et al. (2014), ruminants are considered the main reservoirs of EHEC with
importance for human health. However, with wild birds there are scarce reports of this
serogroup, which has been identified in seagulls (Wallace and Jones, 1997) and geese (Smith
et al., 1998).
Some of the E. coli serogroups isolated in this study are not frequently reported in the
scientific literature as a pathogen for birds, as is the case of O128. In our study, this serogroup
was identified in five Amazona aestiva, one Anodorhynchus hyacinthinus and one Brotogeris
chiriri, which did not present any clinical signs of disease. Similar to this study, free-living
pigeons in Würzburg, Germany, were positive for E. coli O128 and clinical signs were not
reported (Schmidt et al., 2000).
However, a study performed with eight E. coli strains isolated from diseased parrots
admitted for treatment in the clinic of the University of São Paulo, Brazil, identified one
isolate from serogroup O128 in a liver sample from a bird that presented clinical signs of
avian colibacilosis and died (Knöbl et al., 2008). In addition, a study performed with birds
that presented enteritis and septicemia revealed that one psittacine, out of 14 carcasses
68
submitted to necropsy, presented an E. coli from serogroup O128 in a liver sample (Knöbl et
al., 2011).
Serogroup O86 have also been reported causing disease and mortality in wild birds
(Foster et al., 1998), however the isolation of this serogroup in a single bird (Amazona
aestiva) in this study reveals that psittacine may act as asymptomatic hosts. This serogroup, in
association with antigen K61, have been detected in liver, intestine and caeca of dead free-
living passerines in Scotland. Therefore, researchers reported that free-living birds might play
a role as reservoirs of these microorganisms for production and pet animals, in addition to the
possibility of zoonotic problems derived from practices that that promote an agglomeration of
great numbers of passerines in urban environments (La Ragione et al., 2002).
Considering all the bacteria analyzed, the percentage of positive samples with
hemolytic activity was considerably low in comparison to a study performed in feces samples
of Psittaciformes seized and in rehabilitation before reintroduction in Botucatu, Brazil
(Marietto-Gonçalves et al., 2010). In this occasion, from a total of 89 E. coli isolates, 70.6%
produced hemolysis. Considering this virulence factor, in this study might present a lesser risk
to humans and other animals. Despite the low positive rate found with the hemolysin
production test, the possible virulence of these microorganisms cannot be discarded,
considering that several serogroups often involved in human cases have been identified in this
study.
ESBL production in members from the Enterobacteriaceae family, specifically E. coli,
is a serious concern in several countries, due to the frequent implications in human infections
(Costa et al., 2006). ESBL-producing E. coli strains is frequently reported in production
animals (Briñas et al., 2003, Shiraki and Arakawa 2004, Briñas et al., 2005), in pet and wild
animals in Portugal, Italy and France (Carattoli et al., 2005, Costa et al., 2006, Bonnedahl et
al., 2009). This problem has not been reported yet with psittacine. However, ESBL-producing
E. coli strains have been isolated in wild and aquatic birds (Literak et al., 2010, Pinto et al.,
2010).
Despite the commensal feature, Escherichia coli is frequently implicated in human and
animal infections, especially in production animals, which are more frequently exposed to
antibiotics, such as beta-lactams. Therefore, their possible contact with wild animals may be
related to the propagation of these microorganisms to the wildlife (Guenther et al., 2011).
However, the antimicrobial resistance identified in this study may be related to direct and
inappropriate use of antibiotics with therapeutic or preventive intent. Therefore, detecting
69
ESBL-producing strains in psittacine from illegal wildlife trade in Ceará is worrying,
considering that seized birds are in some way affected, direct or indirectly by inadequate use
of antibiotics.
Reintroduction of animals to nature is the solution chosen by the official authorities.
However, this option may have a potential risk to the natural environment. Monitoring ESBL-
producing E. coli strains of clinic or commensal origin must be performed in both men and
animals in order to observe the evolution and analyze factors that contribute to the selection
and propagation of these resistance mechanisms (Briñas et al., 2005).
In conclusion, psittacine from illegal wildlife trade may host ESBL-producing E. coli
strains of different serogroups, in which some are often implicated in severe human
infections. This study revealed the occurrence of some E. coli serogroups not yet previously
reported in other studies involving wild birds and, more specifically, members of the
Psittacidae family. Therefore, more studies with other serogroups of veterinary and human
medicine importance should be performed.
In addition, while serotyping is a technique widely used in the diagnosis of intestinal
diseases caused by EPEC and EHEC (Trabulsi et al., 2002), molecular based diagnostic is
recommended, considering the more conclusive results provided due to the elevated
specificity and sensitivity.
Acknowledgments. The authors thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq), Centro de Triagem de Animais Silvestres de Fortaleza (CETAS) and
Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO) for all the support in this study.
REFERÊNCIAS
ARENAS-HERNÁNDEZ, M.M.P.; MARTÍNEZ-LAGUNA, Y; TORRES, A.G. Clinical
implications of Enteroadherent Escherichia coli. Curr. Gastroenterol. Rep., v.14, p. 386-394,
2012.
BONNEDAHL, J.; DROBNI, M.; GAUTHIER-CLERC, M. et al. Dissemination of
Escherichia coli with CTX-M type ESBL between human and Yellow-Legged Gulls in the
South of France. Plos one., v.4, p.1-6, 2009.
70
BRIÑAS, L., MORENO, M.A., TESHAGER, T., et al. Monitoring and Characterization of
Extended-Spectrum -Lactamases in Escherichia coli Strains from Healthy and Sick Animals
in Spain in 2003. Antimicrob. Agents Chemother., v.49, p.1262–1264, 2005.
BRIÑAS, L., MORENO, M.A., ZARAZAGA, M. et al. Detection of CMY-2, CTX-M-14,
and SHV-12 -Lactamases in Escherichia coli Fecal-Sample Isolates from Healthy Chickens.
Antimicrob. Agents Chemother., v.47, p.2056–2058, 2003.
CARATTOLI, A., LOVARI, S., FRANCO, A. et al. Extended-Spectrum β-lactamases in
Escherichia coli isolated from dogs and cats in Rome, Italy, from 2001 to 2003. Antimicrob.
Agents Chemother., v.49, p.833-835, 2005.
COURA, F.M.; ANDREY, P.L.; MARCOS, B.H. Patotipos de Escherichia coli causadores de
diarreia em bezerros: uma atualização. Pesqui. Vet. Bras.., v.34, p. 811-818 , 2014.
COSTA, D.; POETA, P.; SÁENZ, Y. et al. Detection of Escherichia coli harbouring
extended-spectrum β-lactamases of the CTX-M, TEM and SHV classes in fecal samples of
wild animals in Portugal. Antimicrob. Agents Chemother., v.58, p. 1311-1312, 2006.
DHARA, M.; DISHA, P.; SACHIN, P.; et al. Comparison of various methods for the
detection of extended spectrum beta lactamase in Klebsiella pneumoniae isolated from
neonatal intensive care unit, ahmedabad. Natl J Med Res., v.2, p. 348-353, 2012.
DOLEJSKA, M.; CIZEK, A.; LITERAK, I. High prevalence of antimicrobial-resistant genes
and integrons in Escherichia coli isolates from Black-headed Gulls in the Czech Republic. J.
Appl. Microbio., v.103, p.11-19, 2007.
FOSTER, G.; ROSS, H.M.; PENNYCOTT, T.W. et al. Isolation of Escherichia coli
O86:K61 producing cyto-lethal distending toxin from wild birds of the finch Family. Lett.
Appl. Microbiol., v.26, p.395-398, 1998.
71
GUENTHER, S.; EWERS, C.; WIELER, L.H. Extended-spectrum betalactamase producing
E. Coli in wildlife, yet another form of environmental pollution? Fron. Microbiol., v.2, p,1-
13, 2011.
KNÖBL, T.; GODOY, S.N.; MATUSHIMA, E.R. et al. Caracterização molecular dos fatores
de virulência de estirpes de Escherichia coli isoladas de papagaios com colibacilose aviária.
Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.45, p. 54-60, 2008.
KNÖBL, T.; SAIDENBERG, A.B.S.; MORENO, A.M. et al. Serogroups and virulence
genes of Escherichia coli isolated from psittacine birds. Pesqui. Vet. Bras., v.31, p.916-921,
2011.
LA RAGIONE, R.M.; MCLAREN, I.M.; FOSTER, G. et al. Phenotypic and Genotypic
Characterization of Avian Escherichia coli O86:K61 Isolates Possessing a Gamma-Like
Intimin. Appl. Environ. Microbiol., v.68, p. 4932–4942, 2002.
LITERAK, I.; DOLEJSKA, M.; JANOSZOWSKA, D. et al. Antibiotic-resistant Escherichia
coli bacteria, including strains with genes encoding the extended-spectrum beta-lactamase and
QnrS, in waterbirds on the Baltic Sea Coast of Poland. Appl. Environ. Microbiol., v.76, p.
8126–8134, 2010.
LOPES, E.S.; MACIEL, W.C.; ALBUQUERQUE, A.H. et al. Prevalence and Antimicrobial
resistance profile of Enterobacteria isolated from psittaciformes of illegal wildlife trade. Acta
Sci Vet., v.43, p.1-9, 2015.
MAGALHÃES, C.A.; ROSSATO, S.S.; BARBOSA, A.S. et al. The ability of haemolysins
expressed by atypical enteropathogenic Escherichia coli to bind to extracellular matrix
componentes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., v.106, p. 146-152, 2011.
MARIETTO-GONÇALVES, G.A.; ALMEIDA, S.M.; LIMA, E.T.; FILHO, R.L.A. Detecção
de Escherichia coli e Salmonella sp. em microbiota intestinal de Psittaciformes em fase de
reabilitação para soltura. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.47, p.185-189, 2010.
72
MARTINEZ, M.B.; TRABULSI, L.R. Enterobacteriaceae. In: TRABULSI, L.R.;
ALTHERTHUM, F. Microbiologia. 5ed. São Paulo: Atheneu, 2008, p.267-279.
MITTELSTAEDT, S.; CARVALHO, V.M. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC)
O157:H7-revisão. Rev. Inst. Cienc Saude., v.24, p. 175-182, 2006.
OLIVA, C.A.G.; SCALETSKY, I.; DE MORAIS, M.B.; FAGUNDES NETO U. Diarreia
aguda grave associada à Escherichia coli enteropatogênica clássica (EPEC): características
clínicas e enteropatogênica clássica (EPEC): características clínicas e perdas fecais em
lactentes hospitalizados. Rev. Assoc. Med. Bras., v.43, p. 283-289, 1997.
PINTO, L.; RADHOUANI, H.; COELHO, C. et al. Genetic detection of extended-spectrum
beta-lactamase-containing Escherichia coli isolates from birds of prey from Serra da Estrela
Natural Reserve in Portugal. Appl. and Environ. Microbiol., v.76, p. 4118–4120, 2010.
REGUA, A.H.; BRAVO, V.L.R.; LEAL, M.C.; LOBO LEITE, M.E.L. Epidemiological
Survey of the Enteropathogenic Escherichia coli Isolated from Children with Diarrhoea. J.
Trop. Pediatr., v.36, p.176-179, 1990.
ROY, P.; PURUSHOTHAMAN, V.; KOTEESWARAN, A.; DHILON A.S. Isolation,
characterization, and antimicrobial drug resistance pattern of Escherichia coli isolated from
japonese quail and their environment. J. Appl. Poult. Resh., v.15, p. 442-446, 2006.
SAIDENBERG, A.B.; TEIXEIRA, R.H.F.; GUEDES, N.M.R.; ALLGAYER, M.C.;
MELVILLE, P.A.; BENITES, N.R. Molecular detection of enteropathogenic Escherichia
coli in asymptomatic captive psittacines. Pesq. Vet. Bras., v, 32, p. 922-926, 2012.
SCHMIDT, H.; SCHEEF, J.; MORABITO, S.; et al., A new shiga toxin 2 variant (Stx2f)
from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol., v.66, p.1205–1208,
2000.
SMITH, H.R.; ROWE, B.; ADAK, G.K.; REILLY, W.J. Shiga toxin (verocytotoxin-
producing) Escherichia coli in the United Kingdom, p 49–58 1998. In J. B. Kaper and A. D.
73
O’Brien (ed.), Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin-producing Escherichia coli
strains. ASM Press, Washington, D.C. 1998.
SHIRAKI, Y.; SHIBATA, N.; YOHEI, D.; ARAKAWA, Y. Escherichia coli producing
CTX-M-2 β-lactamase in cattle, Japan. Emerg. Infect Dis.. v.10, p. 69-75, 2004.
SYNGE, B.A. Verocytotoxin-producing Escherichia coli: a veterinary view. J. Appl.
Microbiol. v.88, p. 318-378. 2000.
TRABULSI, L.R.; KELLER, R.; GOMES, T.A.T. Typical and Atypical Enteropathogenic
Escherichia coli. Emerging Infectious Diseases. v.8, p. 508-513, 2002.
WALLACE, J.S.; CHEASTY, T.; K. JONES, K. 1997. Isolation of verocytotoxinproducing
Escherichia coli O157 from wild birds. J. Appl. Microbiol. v.82, p. 99–404, 1997.
74
8 Capítulo 3
Molecular Diagnosis of Diarrheagenic Escherichia coli isolated from Psittaciformes from
traffic
(Diagnóstico Molecular de Escherichia coli diarreiogênicas ioladas de Psittaciformes do
tráfico)
Elisângela de Souza Lopesa*
, William Cardoso Maciel1, Pedro Henrique Quintela Soares de
Medeiros, Mariana Bona Duarte, Alexandre Havt, Suzan Vitoria Girão Lima, Fernanda
Conceição Gaio, Régis Siqueira de Castro Teixeira
Submetido: Pesquisa Veterinária Brasileira
75
Molecular Diagnosis of Diarrheagenic Escherichia coli isolated from Psittaciformes from
traffic
Elisângela de Souza Lopesa*
, William Cardoso Maciel1, Pedro Henrique Quintela Soares de
Medeiros, Mariana Bona Duarte, Alexandre Havt, Suzan Vitoria Girão Lima, Fernanda
Conceição Gaio, Régis Siqueira de Castro Teixeira
ABSTRACT.- Lopes E.S., Maciel W.C., Medeiros P.H.Q.S., Duarte M.B., Havt A.B., Lima
S.V.G., Gaio F.C., Teixeira R.S.C. [Molecular Diagnosis of Diarrheagenic Escherichia coli
isolated from Psittaciformes from traffic] Diagnóstico Molecular de Escherichia coli
diarreiogênicas isoladas de Psittaciformes do tráfico. Pesquisa Veterinária Brasileira 00 (0):
00-00. Laboratório de Estudos Ornitológicos (LABEO). Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará
(UECE), 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza, CE, Brazil. Laboratório de Toxinologia
Molecular. Escola de Medicina da Universidade Federal do Ceará (UFC), Campus do
Porangabussu, Fortaleza, CE, Brazil. Email: [email protected]
Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) are considered one of the major causes of
human diarrhea in developing countries. Some studies have pointed wild birds as important
reservoirs for these pathogens. However, scarce species have been investigated. This study
aimed to evaluate the presence of DEC strains in Psittaciformes from illegal wildlife trade. A
total of 78 E. coli strains isolated from cloacal swab samples of Psittaciformes in the Ceará
State, Brazil, were evaluated regarding the presence of the following DEC virulence genes by
polymerase chain reaction (PCR): eaeA and bfpA genes (Enteropathogenic E. coli – EPEC);
stx1 and stx2 (Shiga toxin-producing E. coli - STEC); estA and eltB (Enterotoxigenic E. coli –
ETEC); ipaH (Enteroinvasive E. coli - EIEC); aatA and aaiC (Enteroaggregative E. coli -
EAEC). Gene eaeA was identified in 20 strains (25.6%) and 22 (28.2%) were positive for the
bfpA gene. In addition, 11 (14.1%) and 9 (11.5%) belonged to tEPEC and aEPEC,
respectively. A total of 47 (60.3%) were negative for the remaining DEC pathotypes
investigated. In conclusion, psittacine from illegal wildlife trade in Ceará State, Brazil,
presented an elevated prevalence of typical and atypical EPEC, potentially playing a role as
reservoirs of DEC strains in the environment. Thus, proper control measures must be adopted
to block the spread of these pathogens.
INDEX TERMS: EPEC, Escherichia coli, Psittaciformes, Wildlife Traffic.
RESUMO.- Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) são consideradas uma das causas mais
importantes de diarreia em países em desenvolvimento. Alguns estudos têm apontado aves
silvestres como importantes reservatórios destes patógenos. Entretanto, poucas espécies têm
sido investigadas. O objetivo deste estudo foi analisar a presença de cepas de E. coli
diarreiogênicas em Psittaciformes do tráfico de animais silvestres. Um total de 78 amostras de
E. coli isoladas de suabes cloacais de Psittaciformes do Ceará, Brasil, foram diagnosticadas
quanto a presença dos seguintes genes específicos DEC por meio de reação em cadeia de
polimerase (PCR): eaeA e bfpA (E. coli Enteropatogênica – EPEC); stx1 e stx2 (E. coli
produtora de Shiga - STEC); estA e eltB (E. coli Enterotoxigênica – ETEC); ipaH (E. coli
Enteroinvasiva - EIEC); aatA e aaiC (E. coli Enteroagregativa - EAEC). As cepas positivas para os genes eaeA e bfpA foram consideradas EPEC típicas, enquanto que as positivas
somente para o gene eaeA foram classificadas como EPEC atípicas. O gene eaeA foi
identificado em 20 cepas (25,6%) e 22 foram positivas para o gene bfpA (28,2%).
76
Adicionalmente, 11 (14,1%) e 9 (11,5%) cepas foram EPEC típicas e atípicas,
respectivamente. Um total de 47 cepas (60,3%) foram negativas para os demais patotipos
DEC pesquisados. Em conclusão, psitacídeos provenientes do tráfico de aves silvestres do
estado do Ceará, Brasil, apresentaram elevada prevalência de EPEC típicas e atípicas,
potencialmente participando como reservatórios de cepas DEC no ambiente. Portanto,
medidas de controle devem ser adotadas para inibir a disseminação destes patógenos.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: EPEC, Escherichia coli, Psittaciformes, Tráfico de animais
silvestres.
INTRODUCTION
Recent studies have observed the isolation of E. coli from captive, trafficked and free-
living psittacine (Hidasi et al., 2013; Saidenberg et al., 2012ab). However, there are scarce
reports on virulence characterization of these strains. Currently, pathogenic E. coli is
classified as intestinal pathogenic (or diarrheagenic E. coli – DEC) and extra-intestinal
pathogenic E. coli (ExPEC) (Russo and Johnson 2000). DEC are further classified as
enteropathogenic (EPEC), enterohemorragic (EHEC), enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive
(EIEC), enteroaggregative (EAEC) and diffusely adherent (DAEC) E. coli (Croxen et al.,
2013).
EPEC are the most prevalent DEC in psittacine (Saidenberg et al., 2012ab). These
strains are characterized by an “attaching and effacing” lesion (A/E), marked by the eae gene
presence (Ochoa et al., 2011). Moreover, EPEC are divided in typical (tEPEC) and atypical
(aEPEC), due to the presence of the bundle-forming pilus (BFP), which is responsible for the
localized adherence to the host epithelium (Donnenberg e Finlay 2013).
tEPEC are classically responsible for most severe diarrhea in children less than five
years of age (Croxen et al., 2013), while aEPEC are found more frequently, regardless of
diarrhea (Beutin et al., 2003; Carvalho et al., 2003; Nakazato et al., 2004; Aidar-Ugrinovich et
al., 2007). Although there are some reports of tEPEC identification in psittacine (Schremmer
1999), this pathotype is known to be rarely isolated from animals (Trabulsi; Keller; Gomes,
2002; Carvalho et al., 2003; Nakazato et al., 2004). On the other hand, farm, pet and wild
animals are recognized as possible reservoirs and sources of aEPEC infection for humans
(Carvalho et al., 2003; Nakazato et al., 2004; Krause et al., 2005; Ishii et al., 2007, Almeida
2012).
Other DECs of human clinical importance have also been investigated in psittacine,
such as EHEC and EAEC, which were identified in captive birds (Marietto-Gonçalves et al.,
2011). EHEC are associated with hemorrhagic colitis and uremic hemolytic syndrome, while
EAEC is highly prevalent in children and adults (Ferens and Hovde, 2011), in which is
responsible for acute diarrhea outbreaks in developed and developing countries (Steffen et al.,
2015). Considering the importance of these pathogens for human health and the paucity of
studies about these microorganisms in psittacine, the objective of this study was to evaluate
the presence of DEC strains in Psittaciformes from illegal wildlife trade in Fortaleza, Brazil.
77
MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains. A total of 78 E. coli strains isolated by Lopes et al (2015) from clinically
healthy psittacine isolated from illegal wildlife trade in the city of Fortaleza, Brazil, were
collected from July to November, 2013. Strains maintained in nutrient agar were reactivated
in BHI broth and plated in MacConkey for 24h at 37°C.
DNA Extraction. From each plate, two to three colonies were collected and placed in tubes
containing 1mL of 0.5% Triton X-100, which were vortexed for 15s and boiled for 20min at
94ºC. Tubes were then centrifuged at 10.000rpm for 10min. Supernatant containing DNA was
quantified and qualified by spectrophotometry using NanoDrop Spectrophotometer 2000
(Thermo Scientific, Wilmington, USA).
Molecular diagnosis of DEC. DNA samples were submitted to polymerase chain reactions
(PCR) for the diagnosis of DEC from E. coli strains isolated from cloacal swabs. The
presence of eight genes of virulence genes from five pathotypes was evaluated as follows:
genes stx1 (348pb) and stx2 (584pb) for the identification of Shiga-Toxin producing E. coli
(STEC); eltB (508pb) and estA (147pb) for enterotoxigenic E. coli (ETEC); eaeA (881 pb)
and bfpA (300 pb) for enteropathogenic E. coli (EPEC); ipaH (483 pb) for enteroinvasive E.
coli (EIEC); aatA (630 pb) and aaiC (215pb) for enteroaggregative E. coli (EAEC) (Taniuchi
et al. 2012). Epec strains were classified as typical when possessing eae and bfpA genes,
without stx; and as atypical if only the eae gene is found (Donnenberg e Finlay 2013). Strains
EAEC 042, EHEC O157:H7, EIEC O124, EPEC 2348/69 and ETEC H10407 were used as
positive controls for the reactions. PCR was performed using GoTaqGreen kit (Promega) and
primers at 0.2 uM in MyCycler Thermal Cycler (Biorad, CA, EUA), with the following
protocol: 95°C for 15min; 40 cycles of 95°C for 30s, 57°C for 30s and 72°C for 1min;
followed by 72°C for 10min. Amplified products were submitted to 2% agarose gel
electrophoresis stained with ethidium bromide and photo-documented by the transilluminator
ChemicDoc XRS System (Biorad, CA, EUA).
RESULTS
From the total of 78 E. coli strains isolated from psittacine of illegal wildlife trade,
only eaeA and bfpA genes were detected, with the prevalence rates of 25.6% (20/78) and
28.2% (22/78), respectively. Figure 1 presents an agarose gel with positive results for eaeA
and bfpA genes. Considering eaeA and bfpA genes, 14.1% (11/78) of strains were classified
as tEPEC, while 11.5% (9/78) were classified as aEPEC (Table 1). In addition, 60.3% (47/78)
did not harbor any of the virulence genes used to diagnose EPEC, EIEC, EHEC, EAEC or
ETEC. Furthermore, tEPEC prevalence within species were: 4/41 Amazona aestiva (9.8%),
3/8 Amazona amazonica (37.3%)
and 4/19 Eupsitulla cactorum (21.1%).
78
DISCUSSION
This study identified important DEC virulence genes (eaeA e bfpA) in E. coli strains
isolated from psittacine of illegal wildlife trade, which are important to diagnose the EPEC
pathotype. Although these bacteria are recognized as important human pathogens (Peréz et al.,
2010), aEPEC have also been associated with increasing morbidity and mortality of
Budgerigars (Seeley et al., 2014).
The detected percentages of tEPEC and aEPEC in this research were higher than
results found in different reports involving psittacine. Studies about psittacine in free-life,
zoos, rescue centers and commercial breeders present a positive rates up to 6.5% for tEPEC
and 3.8% for aEPEC (Schremmer et al., 1999; Saidenberg et al. 2012a; Marietto-Gonçalves et
al., 2011; Saidenberg et al. 2015; Marietto-Gonçalves et al. 2011; Saidenberg et al., 2012b).
The majority of E. coli strains isolated in this study (60.3%) did not harbor any of the
genes analyzed and, therefore are not identified as any of the DEC investigated in this study
harmful for human health (EPEC, EIEC, EHEC, EAEC, ETEC). Considering that reports of
EPEC isolated from psittacine are scarce, the other DEC pathotypes appear to be even harder
to identify. Marietto-Gonçalves et al. (2011) surveying for DEC in 86 captive psittacine
observed strains of STEC and EAEC, in addition to EPEC. Koochakzadeh et al. (2015)
investigated stx1, stx2 and eae genes in 30 E. coli strains from psittacine of pet shops in Iran.
However, none of the strains presented these genes.
Studies with other avian species also showed that the DEC genes analyzed here may
be detected elsewhere. The study of Chandran et al. (2014) reported an elevated rate of
positive samples for DEC diagnosing genes. From a total of 412 samples collected from
captivity-bred birds of 15 different species, 63 isolates harboring the stx gene were detected.
However, ETEC and EIEC related genes were not identified. In addition, Saviolli et al. (2016)
Table 01. Absolute (n) and relative (%) frequencies of E. coli pathotypes isolated from
psittacine of illegal wildlife trade in the state of Ceará, Brazil.
Number E. coli
analyzed
EPEC
E. coli containing
only bfpA
Negative for the genes
investigated Typical Atypical
Sample source N n(%) n(%) n(%) n (%)
Amazona aestiva 40 4 (10.0) 2 (5.0) 6 (15.0) 29 (72.5)
Amazona amazonica 9 3 (33.3) 2 (22.2) 1 (11.1) 2 (22.2)
Eupsitulla cactorum 19 4 (21.1) 4 (21.1) 4 (21.1) 7 (36.8)
Brotogeris chiriri 2 - 1 (50.0) - 1 (50.0)
Eupsittula aurea 2 - - - 2 (100.0)
Ara ararauna 4 - - - 4 (100.0)
Anodorhynchus
hyacinthinus
1 - - - 1(100.0)
Ara severus 1 - - - 1(100.0)
Total 78 11
(14.1)
9 (11.5) 11 (14.1) 47 (60.3)
The following genes were negative in all samples: aaiC, stx1, stx2, eltB, estA, ipaH, aatA
79
looked for the genes eae, stx1 e stx2 in free-living fragatas (Fregata magnificens) and did not
detect EPEC or STEC genes.
The detection of eaeA and bfpA genes in some of the bacterial strains isolated from
psittacine suggests that these birds might have a contamination source for these pathogenic
strains. Studies with psittacine in captivity or from illegal wildlife trade, in which tEPEC were
identified, show that the likely source of contamination may have anthropozoonotic character,
considering the poor environmental conditions of these places (Saidenberg et al., 2012a).
Illegal wildlife trade might have influenced the findings here described, as it
contributes to a closer contact between wild and domestic species, in addition to humans
(Kruse et al., 2004). Trafficked wild birds are potential reservoirs of important agents of
human health (Matias et al., 2016). Thus, measures, such as quarantine, are essential for
avoiding the spread of strains with zoonotic potential. Marietto-Gonçalves et al. (2010)
explained that the monitoring of Gram-negative bacteria in the enteric microbiota of
Psittaciformes is a procedure that must be included in the routine of private breeders, zoos,
veterinary hospitals and main programs that aim to reintroduce captive birds back to the wild.
Such sanitary care measures are important not only because E. coli is not a member of the
normal microbiota of these birds, but also due to the risk of dissemination of these pathogens
to the wild environment, contributing for the epidemiologic chain of a variety of enteric
diseases for humans and other animals.
CONCLUSION The findings presented here suggest that psittacine from illegal wildlife trade in Ceará,
Brazil, present important prevalence of typical and atypical EPEC. Thus, we suggest that E.
coli isolates from these birds must be further investigated, considering that, clinically healthy
wild birds might harbor bacterial strains that present virulence factors relevant for human and
animal health alike (Oh et al., 2011).
REFERENCES
Aidar-Ugrinovich L., Blanco J., Blanco M., Blanco J.E., Leomil L., Dahbi G., Mora A.,
Onuma D.L., Silveira W.D. e Pestana de Castro, A.F. 2007. Serotypes, virulence
genes, and intimin types of Shiga toxinproducing Escherichia coli (STEC) and
enteropathogenic E. coli (EPEC) isolated from calves in São Paulo, Brazil. Int. J. Food
Microbiol. 115 (3):297–306.
Almeida P.M.P., Arais L.R., Andrade J.R.C., Prado E.H.R.B., Irino K. e Cerqueira A.M.F.
2012. Characterization of atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC)isolated
from dogs. Vet. Microbiol. 158 (3-4): 420–424.
Beutin L., Marchés O., Bettelheim K.A., Gleier K.; Zimmermann S., Schmidt H. e Oswald
E. 2003. Hep-2 cell adherence, actin aggregation, and intimin types of attaching and
effacing Escherichia coli strains isolated from healthy infants in Germany and
Australia. Infect. Immun. 71 (7):3995–4002.
Carvalho V.M., Gyles C.L., Ziebell K., Ribeiro M.A. Catão-Dias J. L., Sinhorini I. L.;
Otman J.; Keller R.; Trabulsi L. R. e Pestana de Castro A. F. 2003. Characterization of
monkey enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and human typical and atypical
EPEC serotype isolates from neotropical no nhuman primates. J. Clin. Microbiol. 41
(3):1225–1234.
80
Chandran A. e Mazumder A. 2014. Occurrence of Diarrheagenic Virulence Genes and
Genetic Diversity in Escherichia coli Isolates from Fecal Material of Various Avian
Hosts in British Columbia, Canada. Appl. Environ. Microbiol. 80 (6): 1933–1940.
Croxen M.A. e Finlay B.B., 2010. Molecular mechanisms of Escherichia coli
pathogenicity. Nat. Rev. Microbiol. 8 (1): 27-38.
Croxen M.A., Law R.J., Scholz R., Keeney K.M., Wlodarska M. e B.B Finlay. 2013.
Recent Advances in Understanding Enteric Pathogenic Escherichia coli. Clin.
Microbiol. Rev. 26 (4): 822–880.
Donnenberg M.S. e Finlay B.B. 2013. Combating enteropathogenic Escherichia coli
(EPEC) infections: the way forward. Trends Microbiol. 21 (7): 1-3.
Franzolin M.R., Alves R.C.B., Keller R., Gomes T.A.T., Beutin L., Barreto M.L., Milroy
C., Strina A., Ribeiro H. e Trabulsi L.R. 2005. Prevalence of diarrheagenic
Escherichia coli in children with diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz. 100 (4): 359-363.
Ferens W.A., Hovde C.J. 2011. Escherichia coli O157:H7: animal reservoir and sources of
human infection. 8(4): 465-487.
Hidasi H.W., Neto J.H., Moraes D.M.C., Linhares G.F.C., Jayme V.S. e Andrade M.A.
2013. Enterobacterial detection and Escherichia coli antimicrobial resistance in parrots
seized from the illegal wildlife trade. Jour. Zoo. Wild. Med. 44(1): 1-7.
Ishii S., Meyer K.P. e Sadowsky M.J. 2007. Relationship between Phylogenetic Groups,
Genotypic Clusters, and Virulence Gene Profiles of Escherichia coli Strains from
Diverse Human and Animal Sources. Appl. Environ. Microbiol . 78 (18): 5703–5710.
Kaper J.B., Nataro J.P. e Harry L.T.M. 2004. Pathogenic Escherichia coli. Nature
Reviews. 2,123-40.
Knobl T., Saidenberg A.B.S., Moreno A.M., Gomes T.A.T., Vieira M.A.M., Leite D.S.,
Blanco J.E. e Ferreira A.J.P. 2011. Serogroups and virulence genes of Escherichia coli
isolated from psittacine birds. Pesq. Vet. Bras. 31 (10): 916-921.
Koochakzadeh A., Badouei A.M., Salehi Z.T., Aghasharif S., Soltani M. e Ehsan M.R.
2015. Prevalence of Shiga Toxin-Producing and Enteropathogenic Escherichia coli in
Wild and Pet Birds in Iran. Braz. J. Poult. Sci. 17 (4): 445-450.
Krause G., Zimmermann S. e Beutin L., 2005. Investigation of domestic animals and pets
as a reservoir for intimin- (eae) gene positive Escherichia coli types. Vet. Microbiol.
106 (1-2): 87–95.
Kruse H., Kirkemo A.M., Handeland K. 2004. Wildlife as source of zoonotic infections.
Emerging Infec. Dis.,10(12):2067-72.
Lima I.F.N., Boisen N., Quetz J.S., Havt A., Carvalho E.B., Soares A.M., Lima N.L., Mota
R.M.S., Nataro J.P., Guerrant R.L. e Lima, A.A.M. 2013. Prevalence of
enteroaggregative Escherichia coli and its virulence-related genes in a case–control
study among children from north-eastern Brazil. J. Med Microbiol,. 62 (5): 683–693.
Lopes E.S., Maciel W.C., Albuquerque A.H., Nishi D.M., Bezerra W.G.A., Horn R.V.,
Lima B.P., Marietto-Gonçalves G.A. e Teixeira, R.S.C. 2015. Prevalence and
Antimicrobial resistance profile of Enterobacteria isolated from psittaciformes of
illegal wildlife trade. Acta Sci Vet. 43 (1313): p.1-9.
Marietto-Gonçalves G.A., Almeida S.M., Lima E.T., Okamoto A.S., Pedro P. e Filho
R.L.A. 2010. Isolation of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Blue-Fronted
Amazon Parrot (Amazona aestiva). Avian. Dis. 54 (1): 151–155.
Marietto-Gonçalves G.A., Almeida S.M. e Rodrigues J., 2011. Presence of a Human
Diarrheagenic Escherichia coli Clone in Captivity Kept Psittacidaes. Open Microbiol.
J. 5, 72-75.
81
Matias C.A.R., Pereira I.A., Araújo M.S., Santos A.F.M., Lopes R.P., Christakis S.,
Rodrigues D.P. e Siciliano S. 2016. Characteristics of Salmonella spp. Isolated from
Wild Birds Confiscated in Illegal Trade Markets, Rio de Janeiro, Brazil. Biomed Res.
Int. 2016, 1-7.
Nakazato G., Gyles C., Ziebell K., Keller R., Trabulsi L.R., Gomes T.A.T., Irino K.,
Silveira W.D. e Pestana de Castro A.F. 2004. Attaching and effacing Escherichia coli
isolated from dogs in Brazil: characteristics and serotypic relationship to human
enteropathogenic E. coli (EPEC). Vet. Microbiol. 101 (4): 269–277.
Ochoa, T.J.; Contreras, C.A. 2011. Enteropathogenic E. coli (EPEC) infection in children.
Curr. Opin. Infect. Dis., v. 24, (5): 478–483.
Oh J.Y., Kang M.S., Hwang H.T., An B.K., Kwon J.H. e Kwon Y.K. 2011.
Epidemiological Investigation of eaeA-Positive Escherichia coli and Escherichia
albertii Strains Isolated from Healthy Wild Birds. J. Microbiol. 49 (5): 747-752.
Russo T.A., Johnson J.R. 2000. Proposal for a New Inclusive Designation for
Extraintestinal Pathogenic Isolates of Escherichia coli: ExPEC. Jour. Infec. Dis. 181:
p 1753-1754.
Saidenberg A.B., Teixeira R.H.F., Guedes N.M.R., Allgayer M.C., Melville P.A. e Benites,
N.R., 2012a. Molecular detection of enteropathogenic Escherichia coli in
asymptomatic captive psittacines. Pesq. Vet. Bras. 32 (9): 922-926.
Saidenberg A.B., Guedes N.M.R., Seixas G.H.F., Allgayer M.C., Assis E. P., Silveira L.F.,
Melville P.A., e Benites N.R., 2012b. A Survey for Escherichia coli Virulence Factors
in Asymptomatic Free-Ranging Parrots. ISRN Dent. 2012, 1-6.
Saidenberg A.B.S., Zuniga E., Melville P.A., Salaberry S. e Benites N.R. 2015. Health-
screening protocols for vinaceous amazons (Amazona vinacea) in a reintroduction
project. J. Zoo Wildl. Med. 46 (4): 1-10.
Steffen R., Hill D.R., DuPont H.L. 2015. Traveler’s Diarrhea-A Clinical Review. Clin.
Rew. Ed. 33(1):71-80.
Saviolli J.Y., Cunha M.P.V., Guerra M.F.L., Irino Kinue., Catão-Dias J. L. e Carvalho
V.M., 2016. Free-Ranging Frigates (Fregata magnificens) of the Southeast Coast of
Brazil Harbor Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli Resistant to Antimicrobials.
PLOS ONE. 4 (2): 1-14.
Schremmer C., Lohr J.E., Wasthulber U., Kösters J., Ravelshofer K., Steinrück H. e
Wieler L.H., 1999. H. Enteropatogenic Escherichia coli in Psittaciformes. Avian
Pathol. 28 (4): 349-354.
Seeley K.E., Baitchman E., Bartlett S., DebRoy C. e Garner M.M., 2014. Investigation and
control of an attaching and effacing Escherichia coli outbreak in a colony of captive
budgerigars (Melopsittacus undulatus). J. Zoo Wildl. Med. 45 (4): 875-882.
Taniuchi M., Walters C.C., Gratz J., Maro A., Kumburu H., Serichantalergs O., Sethabutr
O., Bodhidatta L., Kibiki G., Toney D.M., Berkeley L., Nataro J.P. e Houpt E.R. 2012.
Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for diarrheagenic
Escherichia coli and Shigella spp. and its evaluation on colonies, culture broths, and
stool. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (2): 121–128.
Trabulsi L.R., Keller R. and Gomes T.A.T. 2002. Typical and Atypical Enteropathogenic
Escherichia coli. Emerg. Infect. Dis. 8 (5): 1-6.
82
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products. Column 1: Molecular Marker. Column 2: Positive
control. Column 3: sample isolated from psittacine positive for eaeA gene. Column 4: Negative control.
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products. Column 1: Molecular Marker. Column 2: Positive
control. Column 3: sample isolated from psittacine positive for bfpA gene. Column 4: Negative control.
83
9 Capítulo 4
Evaluation of bacterial shedding by budgerigars inoculated with Salmonella
enterica serotype Saintpaul
(Avaliação da disseminação bacteriana por periquitos inoculados com Salmonella
enterica sorotipo Saintpaul)
Elisângela de Souza Lopes1*
, William Cardoso Maciel1, Débora Nishi Machado
1, Átilla
Holanda de Albuquerque1, Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra
1, Ruben Horn
Vasconcelos1, Raul Antunes Silva Siqueira
2, Temístocles Soares de Oliveira Neto
2, Ricardo
Barbosa de Lucena2, Antônio Jackson Forte Beleza, Bruno Pessoa Lima
1, Isaac Neto Goes da
Silva4, Rosa Patrícia Ramos Salles
3, Régis Siqueira de Castro Teixeira
1
Submetido: Avian Pathology
84
Evaluation of bacterial shedding by budgerigars inoculated with Salmonella
Saintpaul
Elisângela de Souza Lopes1*
, William Cardoso Maciel1, Débora Nishi Machado
1, Átilla
Holanda de Albuquerque1, Windleyanne Gonçalves Amorim Bezerra
1, Ruben Horn
Vasconcelos1, Raul Antunes Silva Siqueira
2, Temístocles Soares de Oliveira Neto
2, Ricardo
Barbosa de Lucena2, Antônio Jackson Forte Beleza, Bruno Pessoa Lima
1, Isaac Neto Goes da
Silva4, Rosa Patrícia Ramos Salles
3, Régis Siqueira de Castro Teixeira
1
1Laboratory of Ornithological Studies (LABEO). Postgraduate Program in Veterinary Science
(PPGCV), Veterinary Faculty, State University of Ceará (UECE), Itaperi Campus, Fortaleza,
Ceará, Brazil.
2Animal pathology Laboratory. Veterinary Science Department, Federal University of Paraíba
(UFPB). Areia Campus, Areia, Paraíba, Brazil.
3Clinical Laboratory Pathology – BIOLAB
4Clinical Pathology Laboratory. Veterinary Faculty, State University of Ceará (UECE),
Itaperi Campus, Fortaleza, Ceará, Brazil
* Corresponding author: [email protected]
85
Abstract
This study aimed to evaluate shedding, invasive ability and histopathological
alterations of budgerigars (Melopsittacus undulatus) inoculated with a Salmonella Saintpaul
strain. Two inoculi of 2x105 (I5) and 2x10
6 (I6) were prepared with Salmonella Saintpaul and
administered via gavage to two groups of 22 adult budgerigars. Microbiological analyses to
detect the pathogen in faeces and cloacal swabs were performed during 14 days post-
inoculation (dpi), in addition to histopathological examinations in 3, 7 and 14 dpi. During the
experiment, there was no mortality and a single bird presented typical clinical signs of
salmonellosis. All cloacal swab samples were negative and a faecal sample from one bird in
I5 group was positive in the first dpi. In addition, most organ samples were negative and only
some birds that received the higher inoculum (I5) presented positive results. In 3 dpi,
intestinal samples were positive, while in 7 dpi two birds presented positive spleen, intestine
and liver samples. However, there were microscopic findings in all of the investigated
samples. Although clinical signs and bacterial shedding were rare or absent, the presence of
macroscopic and microscopic alterations indicate that Salmonella Saintpaul was capable of
causing infection and lesions in organs of budgerigars that received two different oral doses of
the bacterial inoculum.
Keywords: Salmonella Saintpaul, Psittaciformes, histopathological lesions, pathogenesis,
bacterial concentration, clinical signs and bacterial shedding.
86
Introduction
Studies with Salmonella enterica in poultry are common in the scientific literature,
whether evaluating epidemiological or pathogenic aspects (Kanashiro et al., 2005; Marcq et
al., 2011; Albuquerque et al., 2016). However, despite the fact that studies involving this
pathogen and wild birds are not performed as often, in the last decades several reports with
psittacine have demonstrated the isolation of important paratyphoid serotypes, such as
Salmonella Typhimurium and Enteritidis (Marietto-Gonçalves et al., 2010; Hidasi et al.,
2013). In addition, information on the pathogenesis of salmonellosis in these birds is
practically inexistent, especially with less frequent serotypes.
Among several serotypes involved in foodborne infections, Salmonella Saintpaul is
one of the most frequently associated with outbreaks of human salmonellosis (Munnoch et al.,
2009; Mody et al., 2011). However, this serotype have been reported in other studies with
animals, including wild birds and poultry (Osman et al., 2010). In addition, this pathogen
have been reported in clinically healthy psittacine from a commercial breeder (Ara
chloropterus) and from illegal wildlife trade (Amazonas amazonica), both in Ceará State,
Brazil (Lopes et al., 2014; Lopes et al., 2015).
Currently, there are no studies assessing pathogenicity of Salmonella Saintpaul in
psittacine, unlike serotype Typhimurium, which several reports indicate that is the most
frequent and virulent salmonella serotype in these birds (Vigo et al., 2009, Piccirillo et al.,
2010).
Due to the lack of information, concerning pathogenic aspects of paratyphoid
serotypes in psittacine, this study aimed to evaluate shedding, invasive ability and
histopathological alterations of budgerigars inoculated with Salmonella Saintpaul.
87
Material and Methods
Birds. The experiment was performed in the inoculation facilities of the Ornithological Sector
in the State University of Ceará (UECE). Budgerigars (Melopsittacus undulatus) aged six to
twelve months were used. Birds were maintained in galvanized wire cages (22x21x16cm) in
pairs (male and female). During the entire experiment, temperature (±20°C) and light hours
(12 hours/day) were controlled and all birds received sterile water and feed ad libitum. This
study was approved by the local Ethics Committee for the use of Animals of the State
University of Ceará with the following protocol number: 127697942.
Pre-inoculation evaluation. All birds used in this study were initially submitted to physical
examination to detect and discard unfit individuals. Haematological analysis was used to
assess health status and results were compared to reference values for the species.
Approximately 0.3mL of blood was collected from the right jugular vein and placed in tubes
with EDTA (Fischer et al., 2006).
To guarantee the absence of Salmonella spp., microbiological procedure was
performed in samples from all birds according to the methodology used by Zancan et al.
(2000) with modifications. Briefly, individual cloacal swab samples were collected and placed
in tubes containing selenite-cystine broth with novobiocin (SCNov) (40µg/mL). After
incubation, samples were inoculated in plates with brilliant green agar (BGA) and incubated.
Then, colonies with morphological characteristics of Salmonella spp. were identified through
biochemical methods and, if positive, birds were removed from the experiment.
Inoculum preparation. A strain of Salmonella Saintpaul resistant to nalidixic acid (SSNalr)
isolated from a parrot (Amazona amazonica) in a local Wildlife Rehabilitation Center in
Fortaleza, Brazil, was used to prepare the inoculum. This strain belonged to the collection of
the Laboratory of Ornithological Studies (LABEO) and was isolated in a previous study
88
(Lopes et al., 2015). The inoculum was prepared according to the methodology by Berchieri
Jr. et al. (2001), with some modifications as follows: strain was reactivated in 10mL buffered
peptone water 0.1% and incubated statically. Then, serial dilutions were performed to count
the colony forming units (CFU) (Miles et al., 1938). With these results, two inocula were
prepared with saline solution: I5 (2x105 CFU/0.7mL of SSNal
r) and I6 (2x10
6 CFU/0.7mL of
SSNalr).
Experimental design. A scheme to illustrate the methodology is displayed in Figure 1.
During the experiment, two aspects were evaluated: 1- SSNalr shedding in faeces and swabs
during post inoculation period; 2- Bacterial invasion performed by SSNalr
in organs
throughout the experiment.
Figure1.Dsitribution scheme of budgerigar groups inoculated with Salmonella Saintpaul.
Legend: Aspect 1. E5 (ten birds received inoculum I5); E6 (ten birds received inoculum I6); EC (control group, composed by
six birds); Aspect 2: CG (six birds euthanized in pre-inoculation period); D3-I5 (five birds inoculated with I5 and euthanized
in 3dpi); D3-I6 (five birds inoculated with I6 and euthanized in 3dpi); D7-I5 (five birds inoculated with I5 and euthanized in
7dpi); D7-I6 (five birds inoculated with I6 and euthanized in 7dpi); D14-I5 (ten birds inoculated with I5); D14-I6 (ten birds
inoculated with I6); D14-C (six birds not inoculated).
To evaluate aspect 1, a total of 26 birds were used and divided in three groups, which received
0.7mL of inocula with the following distribution: E5 (ten birds received inoculum I5); E6 (ten
birds received inoculum I6); EC (control group, composed by six birds). Every 24h for a
period of 14 days post inoculation (dpi), individual cloacal swab and faecal samples were
89
collected for microbiological monitoring. The exact moment before the inoculation was
defined as 0 dpi.
In order to evaluate aspect 2, additional 26 birds were distributed in the following
groups: CG (six birds euthanized in pre-inoculation period); D3-I5 (five birds inoculated with
I5 and euthanized in 3dpi); D3-I6 (five birds inoculated with I6 and euthanized in 3dpi); D7-
I5 (five birds inoculated with I5 and euthanized in 7dpi); D7-I6 (five birds inoculated with I6
and euthanized in 7dpi). In addition, all birds that survived the evaluation of aspect 1 were
euthanized in 14 dpi, which was the end of the experiment. These were then renamed as the
following groups: D14-I5 (ten birds inoculated with I5); D14-I6 (ten birds inoculated with
I6); D14-C (six birds not inoculated).
Birds were euthanized with ketamine overdose administered via IV injection in the
jugular vein. Then, necropsy was performed aseptically, during which fragments of liver,
spleen and intestine were collected for microbiological and histological examination.
Microbiological procedure. Cloacal swab samples were processed according to the
methodology of Zancan et al (2000) with some modifications described previously. Faecal
samples were pooled and organ fragments were macerated individually, placed in tubes
containing SCNov and incubated. Then, aliquots were streaked in plates containing brilliant
green agar supplemented with nalidixic acid (100µg/mL) (VBNalr). After incubation, colonies
with morphological characteristics of Salmonella Saintpaul (Koneman et al., 2012) were
confirmed with rapid slide agglutination test using polyvalent antiserum O (PROBAC).
Histopathological procedure. Birds from groups CG, D3-I5, D3-I6, D7-I5, D7-I6, D14-I5
and D14-I6 were submitted to euthanasia and necropsy was performed to collect samples and
evaluate macroscopic alterations. Fragments from liver, spleen and intestine were collected
from each bird, pooled in five per group and fixated in 10% formalin for histopathological
90
analysis. Then, samples were submitted to standard histopathological procedure, using
paraffin and slides were mounted with 5μm slices stained with haematoxylin-eosin, analysed
with light microscope. Histopathological analysis was performed in the Laboratory of
Histopathology in the Federal University of Paraíba (UFPB), Areia Campus.
Results
Clinical signs. During the experiment, no bird died in any group, while a single bird from I5
presented clinical signs compatible with salmonellosis, which were ruffled feathers (3dpi) and
diarrhoea (14dpi).
Microbiological examination of swabs and faeces. During the experiment, Salmonella was
not isolated in any cloacal swab samples from the evaluated groups (E5, E6 and EC).
However, one faecal sample was positive in 1 dpi from birds of group E5.
Microbiological examination of organs. A low rate of SSNalr recovery in the investigated
organs was observed, which occurred only in birds from the higher inoculum group (I6).
Intestine from one bird was positive in 3dpi. On 7 dpi, two birds presented positive spleen,
intestine and liver. All other samples were negative.
Macroscopic findings. Non-inoculated budgerigars submitted to necropsy in 0 and 14 dpi did
not present any gross alterations. Several findings were observed in birds from both groups in
different days of investigation (Table 1). However, some alterations were more frequent in
7dpi, which were hepatomegaly (80%) and splenomegaly (60%) in birds from D7-I6 and
hepatic congestion (60%) in birds from D7-I5. Considering gross alterations of the entire
experiment, splenomegaly was the most frequent (30%), followed by hepatic congestion
(22.5%), hepatomegaly (17.5%), hepatic haemorrhage (17.5%) and pulmonary congestion
(12.5%) (Figure 2).
91
Table 1. Absolute and relative frequency of gross alterations observed in budgerigars inoculated with SS
3 dpi 7 dpi 14 dpi
105 106 105 106 105 106
Liver n(%) n(%) n(%) n(%) n(%)* n(%)*
Hepatomegaly 1(20) - - 4(80) 2(20) -
Friable - - 1(20) - 1(10) -
Extended area of necrosis 1(20) - - - - -
Multiple necrotic foci - - - - 1(10) 1(10)
Congestion 1(20) 1(20) 3(60) - 4(40) -
Haemorrhage 1(20) 2(40) 1(20) 1(20) - 2(20)
Focal granuloma - - - 1(20) - -
Miliary granuloma - - - 1(20) - -
Yellowish - - - - 2(20,0) 2(20)
Pale - - - - - 2(20)
Infarct - - - 1(20) - -
Polyserositis - - 1(20,0) - - 1(10)
Spleen
Splenomegaly - 2(40) 1(20) 3(60) 3(30) 3(30)
Necrotic foci - 2(40) - - - -
Congestion - - - - - -
Focal area of necrosis - - 2(40) - - -
Heart
Pericarditis - - - - - -
Nodules - - - - - -
Suffusion - 1(20) - - - -
Cardiomegaly - - 1(20) 1(20) 1(10) -
Polyserositis - - - - - 1(10)
Intestine
Haemorrhage - - - - - 1(10)
Enteritis - - - 1(20) 2(20) -
Lung
While/yellow nodules - - - - - -
Oedema - - - - - -
Lesion 1(20) - - - - -
Haemorrhage - 1(20) - 1(20) 1(10) 2(20)
Congestion - - 1(20) 1(20) - 3(30)
Hyperaemia - - - - - 1(10)
Thrombi/Congestive diffuse pneumonia - - - - - 1(10)
Polyserositis - - - - - 1(10)
- Non-inoculated birds submitted to necropsy in 0 and 14 dpi were negative and results were not displayed in the table.
* Percentage of lesions detected in 14dpi was based in 10 birds, while in the remaining rates were calculated for 5 in the remaining days of
observation.
7.5%
20.0%
5.0%
10.0%
2.5%
10.0%
2.5%
12.5%
20.0%
10.0%
17.5%
22.5%
17.5%
30.0%
12.5%
0
2
4
6
8
10
12
14
Hepatomegaly Hepatic
congestion
Hepatic
haemorrhage
Splenomegaly Pulmonary
congestion
Abso
lute
fr
equen
cy (
n)
I5 I6 I5+I6
92
Figure 2. Total percentage of most frequent gross alterations in budgerigars inoculated with Salmonella Saintpaul
observed in 3, 7 and 14 days post-inoculation.
Histopathological alterations: Control group. Birds from the control groups did not present
any alteration indicating Salmonella infection or any other disease.
I5 groups. Liver necrosis and inflammation were the most frequent lesions in birds from I5
groups in 3, 7 and 14 dpi. All organ samples from each day of necrosis in the same
experimental group presented similar histopathological alterations. In 3 and 7 dpi, birds
presented random necrosis of hepatocytes, associated with inflammation composed by
heterophils, lymphocytes and plasma cells. In 3dpi, hepatic sinusoids were diffusely
congested. In addition, intense diffuse congestion was observed in 14 dpi. Intestine samples in
3 dpi revealed inflammation in lamina propria and in 14 dpi moderate diffuse congestion, with
lymphoid aggregates infiltrated by macrophages and heterophils. Spleen samples in 14 dpi
presented macrophage infiltration within the parenchyma resulting in loss of the normal
architecture of the organ.
I6 groups. Similar to what occurred in I5 groups, birds from I6 presented necrosis and
inflammation in liver samples. In addition, in each day of necrosis, all slides presented similar
findings. Lesions in liver were more intense in 3 dpi, in which samples presented intense
diffuse congestion and multiple inflammation foci composed by histiocytes and epithelioid
macrophages, in addition to a low number of lymphocytes and plasma cells. Cytoplasm of
some macrophages and Kupffer cells presented a yellowish brown pigment (interpreted as
hemosiderin) (Figure 3). In 14 dpi, random and periportal inflammation composed by
lymphocytes and plasma cells was observed, associated with proliferation of bile ducts.
Intestine samples in 3 dpi presented an intense infiltration of mixed inflammatory cells
(heterophils, macrophages, lymphocytes and plasma cells). In addition, loss of enterocytes
associated with luminal haemorrhage was observed. In 7 dpi, lamina propria of the intestine
93
was diffusely infiltrated by macrophages, plasma cells and some heterophils. However, in 14
dpi, intense diffuse congestion was observed, in addition to a mixed inflammation in the
lamina propria associated with loss of intestinal crypts. Spleen samples in 3 dpi presented
intense diffuse congestion, thick capsule and infiltrate composed by macrophages and
heterophils. In addition, in 14 dpi macrophage infiltration in the parenchyma was observed.
A
D
B
C
Figure 3. Experimental infection of Salmonella Saintpaul in budgerigars. A: Liver (group E6 in 3dpi) – multiple inflammatory foci
randomly distributed associated with the presence of a yellowish brown pigment (hemosiderin) in the cytoplasm of histiocytes and
Kupffer cells (arrows). HE, obj. 40x. B: Liver (group E6 14dpi) – Periportal inflammation composed by numerous histiocytes,
epithelioid macrophages and some heterophils, lymphocytes and plasma cells (arrows) associated with proliferation of bile ducts
(arrowhead). HE, obj. 40x. C: Spleen (group E5 14dpi) – infiltration of macrophages in parenchyma, resulting in loss of normal
architecture of the organ. HE, obj. 40x. D: Intestine (group E6 3dpi): intense inflammatory infiltration, composed by heterophils,
macrophages, lymphocytes and plasma cells in the lamina propria (arrows). HE, obj. 20x.
94
Discussion
The absence of mortality and occurrence of clinical signs in a single budgerigar is not
enough to affirm that Salmonella Saintpaul is not pathogenic for birds. A study performed by
Andel et al. (2015) resulted in mortality and clinical signs compatible with salmonelosis, such
as ruffled feathers, depression and poor body score condition in adult free-living passerines in
the island Tititiri Matangi, New Zealand, associated with the presence of Salmonella
Saintpaul. Studies have demonstrated that the inoculating dose of Salmonella in birds
determines the occurrence of mortality and manifestation of clinical signs typical of
salmonellosis (Noguera et al., 1992; Connolly et al., 2006; Rocha-e-Silva et al., 2013). In this
context, experimentally infected free-living sparrows inoculated with Salmonella
Typhimurium in a dose of 105 CFU presented mortality and clinical signs typical of
salmonellosis in two birds out of six. However, an inoculum of 108 CFU caused mortality in
all birds, in addition to an increased occurrence of clinical signs (Connolly et al., 2006).
Another important factor that may have influenced the results in this study and may
explain the absence of mortality or clinical signs is the age. Budgerigars used in this study
were adults and in this phase when infected by paratyphoid salmonella, usually there is a
responsive immune system. In addition, the microbiota of adult birds is responsible for
protecting against Salmonella serotypes (Gast, 2008).
The concentration of Salmonella Saintpaul may have hindered the recovery of this
microorganism in swabs and faeces, considering that when an insufficient inoculating dose is
used, bacterial excretion may not be detected in cloacal swab samples (Borsoi et al., 2011). In
addition, serotype and species may also influence the results in inoculation experiments.
Albuquerque et al. (2016) infected orally one-day-old chicks with Salmonella Typhimurium
using doses similar to this study. These authors verified that in 1, 4, 7 and 14 dpi the
95
frequency of birds shedding the pathogen in faeces and swabs was elevated, which was
detected at a minimum rate of 60% of birds in each day of observation.
The low isolation rate in faeces and absence in cloacal swab samples in budgerigars
may also be explained by the fact that Salmonella is a facultative intracellular bacterium.
Therefore, this pathogen may infect the host without necessarily be eliminated in faeces due
to individual or nutritional aspects, especially when birds are submitted to adequate sanitary
and welfare conditions (Dlugosz et al., 2015).
Birds are less susceptible to the infection by Salmonella in the adult age (Beal et al.,
2004) and there is not a detailed report in the scientific literature of intestinal or visceral organ
colonization by Salmonella in experimentally infected psittacine. Unlike what occurs with
poultry, in which studies demonstrate that in the first weeks of age, there is a development in
the immune system within the intestine that interfere with the colonization and persistence of
the inoculated pathogen (Marcq et al., 2011).
Budgerigars submitted to the more elevated bacterial dose presented low frequency
of positive results in the organs. Although the dose may have influenced the results, it is
important to emphasize that the bacterial isolation from extra-intestinal organs samples may
be related to the virulence of the inoculated strain. The persistence of Salmonella in the
enteric environment also depends on the virulence of the serotype, considering that the
pathogen may penetrate the intestinal barrier, invade phagocytes and replicate, migrating then
through the defence cells to organs of the reticuloendothelial system, such as liver and spleen,
possibly developing septicaemia (Ohl and Miller, 2001).
Despite the absence or low frequency of clinical signs, bacterial excretion and
isolation from organs, gross and microscopic alterations demonstrate that Saintpaul serotype
was capable of causing infection and lesions in the birds. According to Sousa et al. (2013),
96
bacterial isolation from liver and spleen suggests that the pathogen inoculated orally passed
through the blood stream to reach the organs. Therefore, this may explain why the gross
alterations observed were concentrated on these organs. Macroscopic findings detected in
budgerigars in this study were compatible with typical cases of Salmonella infection, which
have been reported in naturally infected psittacine bactéria (Orosz et al., 1992; Ward et al.,
2003; Vigo et al., 2009; Piccirillo et al., 2010).
In general, microscopic alterations observed in spleen, intestine and liver samples
were similar to what have been described in the literature with psittacine infected by
Salmonella Typhimurium or Gallinarum that died with or without clinical signs (Ward et al.,
2003; Piccirillo et al., 2010; Tunca et al., 2013). Commonly reported findings were
infiltration by heterophils, lymphocytes and macrophages; necrosis and inflammation in the
intestine, spleen and liver; in addition to hemosiderosis. However, no mortality or relevant
clinical signs were observed in this study. Therefore, the detected microscopic alterations may
indicate only the invasive capacity of the inoculated strain and the immune response, which
may have been capable of controlling the infection.
In conclusion, the oral doses of Salmonella Saintpaul used in this study inoculated in
budgerigars did not cause in almost all birds clinical signs or bacterial shedding. However,
important gross and microscopic alterations were observed in the evaluated organs, which
demonstrates the invasive capacity of this strain and reveals pathogenic potential. Therefore,
we suggest that a more elevated inoculating dose could lead to a more expressive occurrence
of clinical signs and bacterial shedding.
97
Disclosure statement
The authors declare that they have no conflict of interests, affiliation or financial involvement
in organizations with financial interest in the subject presented in this review.
Acknowledgements
The authors thank the Conselho Nacional Tecnológico e Desenvolvimento Científico (CNPq);
the Laboratório de Histopatologia, Federal University of Paraíba; and the Laboratório de
Estudos Ornitológicos, State University of Ceará.
References
Andel, M.V., Jackson, B.H., Midwinter, A.C., Alley, M.R., Ewen, J.G., McInnes, K.,
Jakob, R.H., Reynolds, A.D. e French, N. (2015). Investigation of mortalities
ssociated with Salmonella spp. infection in wildlife on Tiritiri atangi Island in the
Hauraki Gulf of New Zealand. New Zealand Veterinary Journal, 63, 235–239.
Albuquerque, Á.H., Teixeira, R.S.C., Machado, D.N., Lopes, E.S., Horn, R.V., Lima,
B.P., Marques, A.R., Silva, I.N.G., Salles, R.P.R. e Cardoso, W.M. (2016).
Semina: Ciências Agrárias, Londrina, 37, 1919-1928.
Barrow, P.A., Huggins, M.B., Lovell, M.A. e Simpson, J.M. (1987). Observations on
the pathogenesis of experimental Salmonella Typhimurium infection in chickens.
Veterinary Science, 42, 94-199.
Beal, R.K., Powers, C., Wigley, P., Barrow, P.A. e Smith, A.L. (2004). Temporal
dynamics of the cellular, humoral and cytokine responses in chickens during
primary and secondary infection with Salmonella enterica serovar Typhimurium.
Avian Pathology, 33, p. 25-33.
Berchieri Jr. A., Murphy, C.K., Marston, K. e Barrow, P.A. (2001). Observations on
the persistence and vertical transmission of Salmonella enterica serovars Pullorum
and Gallinarum in chickens: effect of bacterial and host genetic background.
Avian Pathology, 30, 221– 231.
Borsoi, Anderlise., Santos, L.R., Rodrigues, L.B., Moraes, H.L.S., Salle, C.T.P. e
Nascimento V.P.(2011). Behavior of Salmonella Heidelberg and Salmonella
Enteritidis strains following broiler chick inoculation: evaluation of cecal
morphometry, liver and cecum bacterial counts and fecal excretion patterns.
98
Brazilian Journal of Microbiology, 42, 266-273.
Connolly, J.H., Alley, M.R., Dutton, G.J. e Rogers, L.E. (2006). Infectivity and
persistence of an outbreak strain of Salmonella enterica serotype Typhimurium
DT160 for house sparrows (Passer domesticus) in New Zealand. New Zealand
Veterinary Journal, 54, 329-332.
Dlugosz, A.P., Santin, E., Hayashi, R.M., Lourenço, M.C. e Silva, A.B. (2015).
Prevalência de Salmonella sp. em calopsitas (Nymphicus hollandicus) mantidas
em cativeiro comercial. Archives of Veterinary Science, 20, 155-160.
Fischer, I., Christen, C., Lutz, H., Gerlach, H., Hässig, M. e Hatt, J.M. (2006). Effects
of two diets on the haematology, plasma chemistry and intestinal flora of
budgerigars (Melopsittacus undulatus). Veterinary Record, 159, 480-484.
Gast, R.K, Shivaprasad, H.L., Barrow, P.A. Salmonella Infections. In: Saif, Y. M.,
Fadly, A. M., Glisson, J. R., Mcdougald, L. R., Nolan, L. K., Swayne, D. E. (ed),
Diseases of Poultry. 12.ed. Blackwell Publishing, 2008. p.619-674.
Hidasi, H.W., Neto, J.H., Moraes, D.M.C., Linhares, G.F.C., Jayme, V.S. e Andrade,
M.A. (2013). Enterobacterial detection and Escherichia Coli antimicrobial
resistance in parrots Seized from the illegal wildlife trade. Journal of Zoo and
Wildlife Medicine, 44, p. 1-7.
Kanashiro A.M.I., Stoppa, G.F.Z., Cardoso, A.L.S.P., Tessari, E.N.C. e Castro,
A.G.M. (2005). Serovars of Salmonella spp Isolated from Broiler Chickens and
Commercial Breeders in Diverse Regions in Brazil from July 1997 to December
2004. Brazilian Journal of Poultry Science, 7, 195 – 198.
Koneman, E., Winn, W.J.R., Allen, S., Janda, W., Procop, G., Schreckenberger, P.,
WOODS, G. As enterobacteriaceae. In: ______. Diagnóstico microbiológico:
texto e atlas colorido. 6 ed. Rio de Janeiro.: Guanabara Koogan, 2012, p.208-299.
Lopes, E.S., Cardoso, W.M., Albuquerque, A.H., Teixeira, R.S.C., Salles, R.P.R.,
Bezerra, W.G., Rocha e Silva, R.C., Lima, S.V.G. e Vasconcelos, R.H. (2014).
Isolation of Salmonella spp. em Psittaciformes from zoos and a commercial
establishment of Fortaleza, Brazil. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia, 66, 965-969.
Lopes, E.S., Maciel, W.C., Albuquerque, A.H., Machado, D.N., Bezerra, W.G.A.,
Vasconcelos, R.H., Lima, B.P., Marietto-Gonçalves, G.A. e Teixeira, R.S.C.
(2015). Prevalence and Antimicrobial resistance profile of Enterobacteria isolated
99
from Psittaciformes of illegal wildlife trade. Acta Scientiae Veterinariae, 43, 1-9.
Marcq, C., Cox, E., Szalo, I.M., Thewis, A. e Beckers, Y. (2011). Salmonella
Typhimurium oral challenge model in mature broilers: Bacteriological,
immunological, and growth performance aspects. Poultry Science, 90, 59–67.
Marietto-Gonçalves, G.A., Almeida DE S.M., Lima, E.T., Okamoto, A.S., Pedro, P. e
Filho, R.L.A. (2010). Isolation of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Blue-
Fronted Amazon Parrot (Amazona aestiva). Avian Diseases, 54,151–155.
Michael E. Ohl e Samuel I. Miller. (2001). SALMONELLA: A Model for Bacterial
Pathogenesis. Annual Review of Medicine, 52, 259–74.
Miles, A.A., Misra, S.S., Irwin, J.O. (1938). The Estimation of the bactericidal power
of the blood. The Journal of Hygiene, 38, 732-749.
Mody, R.K., Greene, S.A., Gaul, L., Sever, A., Pichette, S., Zambrana, I., Dang, T.,
Gass, A., Wood, R., Herman, K., Cantwell, L.B., Falkenhorst, G., Wannemuehler,
K., Hoekstra, R.M., McCullum, I., Cone, A., Franklin, L., Austin, J., Delea, K.,
Behravesh, C.B., Sodha, S.V., Yee, J.C., Emanuel, B.,Al-Khaldi, S.F., Jefferson,
V., Williams, I.T., Griffin, P.M., Swerdlow, D.L. (2011). Plos one. 6, 1-7.
Munnoch, S.A., Ward, K., Sheridan, S., Fitzsimmons, G.J., Shadbolt, C.T., Piispanen,
J. P., Wang, Q., Ward, T.J., Worgan, T.L.M., Oxenford, C., Musto, J.A.,
Mcanulty, J. e Durrheim, D.N. (2009). A multi-state outbreak of Salmonella
Saintpaul in Australia associated with cantaloupe consumption. Epidemiology
Infection, 137, 367–374.
Noguera, C.R., Infante, D., León, A.A., Rolo, N.R. Herrera, A. e Valdillo, P. (1992).
Estudio de patogenicidad de una cepa de Salmonella Saintpaul. Veterinaria
Tropical, 17, 3-13.
Ohl, M.E. e Miller Samuel I. SALMONELLA: A Model for Bacterial Pathogenesis
(2001). Annual. Review. Medicine, 52, 259–74 Orosz, S.E., Chengappa, M.M., Oyster, R.A., Morris, P.J., Trock, S. e Altekruse, S.
(1992). Salmonella Enteritidis infection in two species of Psittaciformes. Avian
Disease, 36, 766–769.
Osman, K.M., Yousef, A.M.M., Aly, M.M. e Radwan, M.I. (2010). Salmonella spp.
Infection in Imported 1-Day-Old Chicks, Ducklings, and Turkey Poults: A Public
Health Risk. Foodborne Pathogens and Disease, 7, 383-390.
Piccirillo, A., Mazzariol, S., Caliari, D. e Menandro M.L. (2010). Salmonella
100
Typhimurium Phage Type DT160 Infection in Two Moluccan Cockatoos
(Cacatua moluccensis): Clinical Presentation and Pathology. Avian Diseases, 54,
131–135.
Rajal, K.M., Sharon, A.G., Linda, G., Sever, A., Pichette, S., Zambrana, I., Dang, T.
Gass, A., Rene, W., Herman, K., Cantwell, L.B., Falkenhorst, G., Wannemuehler,
K., Hoekstra, R.M., McCullum, I., Cone, A., Franklin, L., Austin, J., Delea, K.,
Behravesh, C.B., Sodha, S.V., Yee, J.C., Emanuel, B., Al-Khaldi, S.F., Jefferson,
V., Williams, I. T., Griffin, P.M. e Swerdlow, D.L. (2011). National Outbreak of
Salmonella Serotype Saintpaul Infections: Importance of Texas Restaurant
Investigations in Implicating Jalapeño Peppers. Plos one, 6, 1-7.
Rocha-e-Silva, R.C., Cardoso, W.M., Teixeira, R.S.C., Albuquerque, A.H., Horn,
R.V., Cavalcanti, C.M., Lopes, E.S. e Gomes Filho, V.J.R. (2013). Salmonella
Gallinarum Virulence in Experimentally-Infected Japanese Quails (Coturnix
japonica). Brazilian Journal of Poultry Science, 15, 39-46.
Sousa, E., Werther, K., Berchieri Jr. A., Almeida, A.M, Ardisson, F.A, Silva, A.C.,
Candioto, C.G. e Fernandes, A.S. (2013). Experimental Infection of One-Day-Old
Chicks with Salmonella Serotypes Previously Isolated from Poultry Facilities,
Wild Birds, and Swine. Brazilian Journal of Poultry Science, 15, 301-306.
Tunca, R., Toplu, N., Kurkan, S., Avci, H., Aydogan, A., Epikmen, E.T. e Tekbikyik,
S. (2012). Pathomorphological, immunohistochemical and bacteriological
findings in budgerigars (Melopsittacus undulatus) naturally infected with S.
Gallinarum. Avian Pathology, 41, 203-209.
Vigo, G.B., Origlia, J., Gornatti, D., Piscopo, M., Salve, A., Caffer, M.I., Pichel, M.,
Binsztein, N. e Leotta, G.A. (2009). Isolation of Salmonella Typhimurium from
dead blue and gold macaws (Ara ararauna). Avian Diseases, 53, 135–138.
Ward, M.P., Ramer J.C., Foot, J.P., Garner, M.M., Salles, C.J. e Wu, C.C. (2003).
Outbreak of salmonellosis in a zoologic collection of lorikeets and lories
(Trichoglossus, Lorius, and Eos sp.). Avian Diseases, 47, 493–498.
Zancan, F.T., Berchieri Junior, A., Fernandes, A.S. e Gama, N.M.S.Q. (2000).
Salmonella spp. investigation in transport boxes of day-old birds. Brazilian
Journal of Microbiology, 31, 230-32.
101
10 CONCLUSÕES
- Os psitacídeos provenientes do tráfico albergam variados e importantes gêneros de
enterobactérias. Dentre os patógenos de grande importância em saúde pública, observou-se a
presença de Salmonella Saintpaul e Escherchia coli, indicando que os psitacídeos avaliados
apresentam potencial de disseminação desse gênero bacteriano. A realização de testes de
sensibilidade antimicrobiana é fundamental para acompanhar a sanidade das aves que
futuramente serão reintroduzidas na natureza.
- Psitacídeos provenientes do tráfico de animais silvestres albergam cepas de Escherichia coli
produtoras de ESBL e são providas de importantes sorogrupos implicados em graves
infecções humanas. Importante ressaltar que a sorotipagem é uma prova amplamente aplicada
no diagnóstico de doenças gastrointestinais causadas por EPEC e EHEC, mas é recomendada
a utilização de provas moleculares, visto que é uma ferramenta que pode trazer resultados
mais conclusivos por se tratar de um teste mais sensível e específico.
- Os psitacídeos provenientes do tráfico de animais silvestres albergam uma considerável taxa
de EPEC típicas e atípicas. Sendo assim, verifica-se que isolados de E.coli provenientes de
psitacídeos necessitam ser mais investigados, visto que aves silvestres clinicamente saudáveis
podem apresentar genes de virulência que representam uma ameaça significativa para a saúde
humana e animal.
- Os Psitacídeos quando infectados experimentalmente com cepa de Salmonella Saintpaul não
desencadearam, resposta sintomatológica assim como a excreção do patógeno. Todavia, a
cepa foi capaz de causar importantes lesões macroscópicas e microscópicas o que demonstrou
caráter de invasibilidade, revelando seu potencial patogênico.
102
11 PERSPECTIVAS
Os Psittaciformes têm sido cada vez mais criados como ave pet. A tendência para
os próximos anos é de que ocorra cada vez mais o interesse da criação dessas aves em
residências e criatórios em diversas partes do mundo, possibilitando um maior contato íntimo
do homem com os psitacídeos. Em função de diversas pesquisas que apontam a presença da
bactéria do gênero Salmonella sp. cada vez mais presente em psitacídeos criados em
cativeiros, preocupação de ordem sanitária deverão ocorrer cada vez mais nas pesquisas
relacionadas a essas aves. Devido à importância sanitária dessas enterobactérias, sugere-se
que maiores esforços de prevenção e controle para evitar a presença desse patógeno no
ambiente em que são criadas essas aves.
103
REFERÊNCIAS
AARESTRUP, F.M. Veterinary Drug Usage and Antimicrobial Resistance in Bacteria of
Animal Origin. Basic e Clinical Pharmacology e Toxicology, v. 96, n. 4, p. 271–281, 2005.
ACOSTA, Raul González. Tráfico internacional de animais silvestres. In: O Brasil no
combate ao tráfico de a legislação brasileira. Brasília: Ministério das Relações Exteriores,
2004.
AKHTER, J.; HOSSAIN, M.T.; ISLAM, M.T.; SIDDIQUE, M.P.; ISLAM, M.A. Isolation
and identification of microflora from apparently healthy caged parrots of Dhaka Zoo of
Bangladesh. Bangladesch Journal of Veterinary Medicine, v. 8, n. 1, p. 5-10, 2010.
ALLGAYER, M.C.; LIMA-ROSA, C.A.V.; WEIMER, T.A.; RODENBUSCH, C.R.;
PEREIRA, R.A.; STRECK, A.F.; OLIVEIRA, S.D.; CANAL, C.W.; Molecular diagnosis of
Salmonella species in captive psittacine birds. Veterinary Record, v. 162, n. 25, p. 816-819,
2008.
ALLGAYER, M.C.; OLIVEIRA, S.J.; MOTTIN, V.D.; LOIKO, M.R.; ABILLEIRA, F.;
GUEDES, N.M.; PASSOS, D.T.; WEIMER, T.A. Isolamento de Salmonella Braenderup em
arara-azul (Anodorhynchus hyacinthinus). Ciência Rural, v. 39, n. 8, p. 2542-2545, 2009.
ALVES, R.R.N.; LIMA, J.R.F.; ARAUJO, H.F.P. The live bird trade in Brazil and its
conservation implications: an overview. Bird Conservation International, v. 23, n.1, p.53-
65, 2013.
ANDRADE, R.B.; GEMELLI, T.; DALL ONDER L.P.; CRISTINA K.; BRITO T.;
BARBOZA A.A.L.; BRITO, B.G. de. Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares:
Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria Monocytogenes. Arquivos Instituto Biológico,
São Paulo, v. 77, n. 4, p. 741-750, 2010.
BANGERT, R.L.; CHO, B.R.; WIDDERS, P.R.; STAUBER, E.H.; WARD, A.C. A survey of
aerobic bacteria and fungi in the feces of healthy psittacine birds. Avian Diseases, v. 32, n.1,
p. 46-52, 1988.
BARBER-MEYER, S.M. Dealing with the Clandestine Nature of Wildlife-Trade Market
Surveys. Conservation Practice and Policy, v. 24, n. 4, p. 918-923, 2010.
BENSKIN, C.M.W.H.; WILSON, K.; JONES, K.; HARTLEY, I.R. Bacterial pathogens in
wild birds: a review of the frequency and effects of infection. Biological Reviews, v. 84, n. 3,
p. 349–373, 2009.
BERCHIERI A.J; NETO, O.C.F. Salmoneloses. In: BERCHIERI, A.J.; SILVA, E.N.; DI
FÁBIO, J.; SESTI, L.; ZUANASE, M.A.F. Doença das aves. Campinas: Facta, 2009, p. 435-
451.
BERGEY, D.H.; HOLT, J. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Baltimore:
William e Wilkis, 787p., 1994.
104
BEZERRA, W.G.A.; CARDOSO, W.M.; TEIXEIRA, R.S.C.; VASCONCELOS, R.H.;
MACHADO, D.N.; LOPES, E.S.; ALBUQUERQUE, A.H.; ROCHA-E-SILVA, R.C. Survey
of Salmonella sp. in budgerigars (Melopsittacus undulatus) in Fortaleza, Brazil. Acta
Scientiae Veterinariae, v. 41, p. 1-7, 2013.
BRACONARO, P.; SAIDENBERG, A.B.S.; BENITES, N.R.; ZUNIGA, A.M.J.S.; SANCHES,
T.C.; ZWARG, T.; BRANDÃO, P.A.M. Detection of bacteria and fungi and assessment of the
molecular aspects and resistance and Escherichia coli isolated from confiscated passerines
intended for reintroduction programs. Microbial Pathogenesis, v. 88, p. 65-72, 2015.
BRIAN SPEER. Parrots. In: GAGE, L.J.; DUERR, R. S. Hand-Rearing Birds. Blackwell
Publishing, Iowa, 2007. p. 243-254.
CARCIOFI, A.C. Avaliação de dieta à base de sementes e frutas para papagaios
(Amazona sp). Determinações da seletividade dos alimentos, consumo, composição
nutricional, digestibilidade e energia metabolizável. 1996. 104f. Dissertação (Mestrado em
nutrição animal)-Departamento de Criação de Ruminantes e Alimentação Animal,
Universidade de São Paulo- SP, 1996.
CARRERA, Francisco. O tráfico de animais silvestres: a legislação brasileira. In: O Brasil no
combate ao tráfico de animais silvestres. Brasília: Ministério das Relações Exteriores, 2004.
CARTER, G.R.; WISE, D.J. Essentials of Veterinary Bacteriology and Mycology. Iowa
State Press, 2004. 268p.
CAVALHEIRO, Maria De Lourdes. Qualidade do ambiente e características fisiológicas
do papagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis) Ilha Comprida - São Paulo. 1999. 117f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Florestal, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 1999.
COHEN, N.D.; MCGRUDER, E.D.; NEIBERGS, H.L.; BEHLE, R.W.; WALLIS, D.E.;
HARGIS, B.M. Detection of Salmonella Enteritidis in feces from poultry using booster
Polymerase Chain Reaction and oligonucleotide primers specific for all members of the genus
Salmonella. Poultry Science, v.73, n. 2, p. 354-357, 1994.
CHEN, H.D.; FRANKEL, G. Enteropathogenic Escherichia coli: unravelling pathogenesis.
FEMS Microbiology Reviews, v. 29, n. 1, p. 83–98, 2005.
COMITÊ BRASILEIRO DE REGISTROS ORNITOLÓGICOS. Listas das aves do Brasil.
Florianópolis, SC. 2014. Disponível em: <http://www.cbro.org.br>. Acesso em: 17 ago 2016.
CORADINI, Flávia Rossato. Educação Ambiental no combate ao tráfico de animais
silvestres. 2013. 32f. Monografia (Especialização em Educação Ambiental), Universidade
Federal de Santa Maria, RS, 2013.
CORRÊA, I. M. O.; FLORES, F.; SCHNEIDERS, G. H.; PEREIRA, L. Q.; BRITO, B. G.;
LOVATO, M. Detecção de fatores de virulência de Escherichia coli e análise de Salmonella
spp. em psitacídeos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 33, n. 2, p. 241-246, 2013.
105
DEEM, S.L.; NOSS, A.J.; CUELLAR, R.L.; KARESH, W.B. Health evaluation of free-
ranging and captive Blue-fronted Amazon parrots (Amazona aestiva) in the Gran Chaco,
Bolivia. Journal of Zoo and Wildlife Medicine, v.36, n.4, p.598–605. 2005.
DESTRO, Guilherme Fernando Gomes.; PIMENTEL, Tatiana Lucena.; SABAINI, Raquel
Monti.; BORGES, Roberto Cabral.; BARRETO, Raquel. Efforts to Combat Wild Animals
Trafficking in Brazil. In: LAMEED, Gbolagade Akeem. Biodiversity enrichement in a
diverse world. Nigéria: Intech, 2012. p 421-436.
DOLEJSKA, M.; CIZEK, A.; LITERAK, I. High prevalence of antimicrobial-resistant genes
and integrons in Escherichia coli isolates from Black-headed Gulls in the Czech Republic.
Journal of Applied Microbiology, v.103, n. 1, p.11-19; 2007.
EFE, M.A.; MARTINS-FERREIRA, C.; OLMOS, F.; MOHR, L.V.; SILVEIRA, L. F.
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Ornitologia para a destinação de aves silvestres
provenientes do tráfico e cativeiro. Revista Brasileira de Ornitologia, v.14, n.1, 67-72,
2006.
EJIDOKUN, O.O.; WALSH, A.; BARNETT, J.; HOPE, Y.; ELLIS, S.; SHARP, M.W.;
PAIBA, G.A.; LOGAN, M.; WILLSHAW, G.A.; CHEASTY, T. Human Vero cytotoxigenic
Escherichia coli (VTEC) O157 infection linked to birds. Epidemiology and Infection, v.
134, p. 421–423, 2006.
EVANS, E.E.; MITCHEKK, M.A.; WHITTINGTON, J.K.; TULLY JR.; T.N. Measuring the
level of agreement between clocal Gram’s stains and bacterial cultures in Hispaniolan
Amazon Parrots (Amazona ventralis). Journal of Avian Medicine and Surgery, v. 28, n. 4,
p. 290-296, 2014.
FERREIRA, A.J.P; KNÖBL, T. Colibacilose. In: BERCHIERI, A.J.; SILVA, E.N.; DI
FÁBIO, J.; SESTI, L.; ZUANASE, M.A.F. Doença das aves. Campinas, SP: Facta, 2009,
p.457-471.
FLAMMER, K.; DREWES, L.A. Species-related differences in the incidence of Gram-
negative bacteria isolated from the cloaca of clinically normal psittacine birds. Avian
Diseases, v.32, n.2, p.79-83, 1988.
FOLEY, S.L.; JOHNSON, T.J.; RICKE, S.C.; NAYAK, R.; DANZEISEN, J. Salmonella
Pathogenicity and Host Adaptation in Chicken-Associated Serovars, Microbiology and
Molecular Biology Reviews, v. 77, n. 4, p. 582–607, 2013.
FREITAS, A.C.P.; PASTRANA, M.E.O.; VILELA, D.A.R.; PEREIRA, P.L.L.; LOUREIRO,
L. O.C.; HADDAD, J.P.A.; MARTINS, N.R.S.; SOARES, D.F.M. Diagnóstico de animais
ilegais recebidos no centro de triagem de animais silvestres de Belo Horizonte, estado de
Minas Gerais, no ano de 2011. Ciência Rural, v. 45, n.1, p. 163-170, 2015.
FRIEND, M.; J. C. FRASON. Field Manual of Wildlife Diseases: General Field Procedures
and Diseases of Dirds U.S. Geological Society. Madison, 1999, 427p.
GAMA, T. P; SASSI, R. Aspectos do comércio ilegal de pássaros silvestres na cidade de João
Pessoa, Paraíba, Brasil. Gaia Scientia, v. 2, n. 2, p. 01-20, 2008.
106
GERLACH, H. BACTERIA. Bacteria. In: RITCHIE, B.W.; HARRISON, G.J.; HARRISON,
L.R. Avian Medicine: Principles and Application, RITCHIE, HARRISON AND
HARRISON. Wingers Publishing, Inc., Lake Worth, Florida, 1994. p.949-983.
GILBERT, N. Rules tighten on use of antibiotics on farms. Nature, v.481, n. 7380, p.125,
2012.
GODOY, SILVIA NERY. Psittaciformes (arara, papagaio, periquito). In: CUBAS, ZALMIR
S.; SILVA, J.C.R.; CATÂO-DIAS, J.L. Tratado de animais selvagens: medicina veterinária.
São Paulo: Roca, 2007. p. 222-251.
GORSKI, L. Selective Enrichment Media Bias the Types of Salmonella entérica Strains
Isolated from Mixed Strain Cultures and Complex Enrichment Broths. Plos one, v.7, n.4, p.
1-8, 2012.
GRAHAN, C.L.; GRAHAN, D.L. Occurrence of Escherichia coli in feces of psittacine birds.
Avian Diseases, v.22, n.4, p.717-720, 1978.
GRIMONT, P.A.D.; WEILL, F.X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars. In: World
health organization collaborating centre for reference and research on Salmonella. Paris,
França: Pasteur Institute, 2007. 166p.
GUIBOURDENCHE, M.; ROGGENTIN, P.; MIKOLEIT, M.; FIELDS, P.I.;
BOCKEMÜHL, J.; GRIMONT, P.A.D.; WEILL, F.X. Supplement 2003-2007 (No. 47) to the
White-Kauffmann-Le Monor Scheme. Research in Microbiology, v. 161, p. 26-29, 2010.
GUIMARÃES, D.O.; MOMESSO, L.S.; PUPO, M.T. Antibióticos: importância terapêutica e
perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Química Nova, v. 33, n.
3, 667-679, 2010.
HALL, A J.; SAITO, E.K. Avian wildlife mortality events due to salmonellosis in the United
States, 1985-2004. Journal of Wildlife Diseases, v. 44, n. 3, p. 585-593, 2008.
HARCOURT-BROWN, N.H. Aves Psitaciformes. In: TULLY T.; DORRESTEIN, G. M.;
JONES A. K. Clínica de aves. Rio de Janeiro, Elsevier, 2010, p. 122-149.
HIDASI, H. W.; NETO, J. H.; MORAES, D. M. C.; LINHARES, G. F. C.; JAYME, V. S.;
Andrade M. A. Enterobacterial detection and Escherichia Coli antimicrobial resistance in
parrots Seized from the illegal wildlife trade. Journal of Zoo and Wildlife Medicine, v. 44,
n.1, p. 1-7, 2013.
HIRSH, D.C. Familía Enterobacteriaceae. In: HIRSH, D.W.; ZEE, Y.C. Microbiologia
veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. p. 59-76.
INSTITUTO CHICO MENDES DA BIODIVERSIDADE. Trafico-de-animais-Contribui-
para extinção de espécies. Brasília. Ministério do Meio Ambiente. 2016. Disponivel em:
<http://www.brasil.gov.br/meio-ambiente/2014/07/traficodeanimaiscontribuiparaextincaode-
especies>. Acesso em: 26 abr 2016.
IKUNO, Alice Akimo.; GAMA, Nilce Maria Soares Queiroz.; GUASTALLI, Elisabeth
Aparecida Lopes.; GUIMARÃES, M.B.; FERREIRA, V.C.A. Características de isolados de
Escherichia coli provenientes de aves silvestres quanto a genes de virulência e resistência a
107
antibióticos. In: Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária 38º. Anais... Gramado, RS:
SOVERGS, 2008.
JANDA, J.M. e ABBOT, S.L. The Family Enterobacteriaceae. In: GOLDMAN, E.; GREEN,
L.M. Pratical handbook of microbiology. EUA: ACRC title, 2008. p. 217-219.
KABIR, S.M.L. Avian Colibacillosis and Salmonellosis: A Closer Look at Epidemiology,
Pathogenesis, Diagnosis, Control and Public Health Concerns. International Journal
Environmental Research Public Health, v. 7, n. 1, 89-114, 2010.
KAPER JB, NATARO JP, MOBLEY HLT. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews
Microbiology, v. 2, n. 2, 123-40, 2004.
KEEN, J. E.; DURSO, L. M.; MEEHAN, T. P. Isolation of Salmonella enterica and Shiga-
Toxigenic Escherichia coli O157 from Feces of Animals in Public Contact Areas of United
States Zoological Parks. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 1, 2007.
KEUSCH, G.T.; ACHESON, D.W.K. Bactérias Entéricas: Diarreia Secretória. In:
SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N.C.; EISENSTEIN, B.I.; MEDOFF, G.
Microbiologia: mecanismos das doenças infeciosas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2009. p.157-164.
KONEMAN, E.; WINN, W.JR.; ALLEN, S.; JANDA, W.; PROCOP, G.;
SCHRECKENBERGER, P.; WOODS, G. As enterobacteriaceae. In: ______. Diagnóstico
microbiológico: texto e atlas colorido. 6. ed. Rio de Janeiro.: Guanabara Koogan, 2012. p.
208-299.
KNÖBL, T.; GODOY, S.N.; MATUSHIMA, E.R.; GUIMARÃES, M.B.; FERREIRA, A.J.P.
Caracterização molecular dos fatores de virulência de estirpes de Escherichia coli isoladas de
papagaios com colibacilose aviária. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal
Science, v.45; p.54-60, 2008.
KNÖBL, T.; SAIDENBERG, A. B.S.; MORENO, A.M.; GOMES, T. A.T.; VIEIRA,
M.A.M.; LEITE, D.S.; BLANCO, J.E.; FERREIRA, A.J.P. Serogroups and virulence genes
of Escherichia coli isolated from psittacine birds. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 31, n.
10, p. 916-921, 2011.
KORSAK, N.; CLINQUART, A.; DAUBE, G. Salmonella sp. Dans les denrées alimentaires
d’origene animale: un réel probléme de santé publiqué? Annales de Médicine Véterinaire, v.
148, p.174-193, 2004.
KRAWIEC, M.;. KUCZKOWSKI, M., KRUSZEWICZ, A.G.; WIELICZKO, A. Prevalence
and genetic characteristics of Salmonella in free-living birds in Poland. BMC Veterinary
Research, v. 31, n 11, 2015.
LICARIÃO, M.R.; BEZERRA, D.M.M.; ALVES, R.R.N. Wild birds as pets in Campina
Grande, Paraíba State, Brazil: An Ethnozoological. Anais da Academia Brasileira de
Ciências, v. 85, n.1, 201-213.
108
LISTER, S. A.; BARROW, P. Enterobacteriaceae. In: GORDON, B. Poultry Diseases.
Philadelphia, Elsevier Limited, 2008. p. 109-145.
LOPES, E.S.; CARDOSO, W.M.; ALBUQUERQUE, A.H.; TEIXEIRA, R.S.C.; SALLES,
R.P.R.; BEZERRA, W.G.; ROCHA E SILVA, R.C.; LIMA, S.V.G.; VASCONCELOS, R.H.
Isolation of Salmonella spp. em Psittaciformes from zoos and a commercial establishment of
Fortaleza, Brazil. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 66, p. 965-
969, 2014.
MACHADO, D.N.; LOPES, E.S.; ALBUQUERQUE, Á.H.; BEZERRA, W.G.A.; HORN,
R.V.; LIMA, S.V.G.; SIQUEIRA, R.A.S.; BELEZA, A.J.F.; OLIVEIRA, F.R.; CARDOSO,
W.M.; Teixeira, R.S.C. Detecção e avaliação do perfil de sensibilidade antimicrobiana de
enterobacterias isoladas de periquitos cara-suja (Pyrrhura griseipectus) em cativeiro.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 68, n. 6, p.1732-1736, 2016.
MAGIORAKOS, A.P.; SRINIVASAN, A.; CAREY, R.B.; CARMELI, Y.; FALAGAS, M.E.;
GISKE, C.G.; HARBARTH, S.; HINDLER, J.F.; KAHLMETER, G.; OLSSON-
LILJEQUIST, B.; PATERSON, D.L.; RICE, L.B.; STELLING, J.; STRUELENS, M.J.;
VATOPOULOS, A.; WEBER, J.T.; MONNET, D.L. Multidrug-resistant, extensively drug-
resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard
definitions for acquired resistance. Clinical Microbiology and Infection, v. 18, n. 3, 2012.
MARIETTO-GONÇALVES, G.A.; LIMA, E.T., SEQUEIRA, J.L., ANDREATTI FILHO,
R.L. Colisepticemia em Papagaio verdadeiro (Amazona aestiva) – Relato de caso. Revista
Brasileira de Saúde Produção Animal. Bahia, v. 8, n.1, p.56-60, 2007.
MARIETTO-GONÇALVES, G.A.; ALMEIDA DE S.M.; LIMA DE E.T.; OKAMOTO, A.S.;
PEDRO, P.; FILHO R.L.A.; Isolation of Salmonella enterica Serovar Enteritidis in Blue-
Fronted Amazon Parrot (Amazona aestiva). Avian Diseases, v.54, n.1, p.151–155, 2010.
MARIETTO-GONÇALVES, G.A.; S. M. ALMEIDA; RODRIGUES, J. Presence of a Human
Diarrheagenic Escherichia coli Clone in Captivity Kept Psittacidaes. The open microbiology
Journal, v. 5, n. 1, p72-75, 2011.
MARINELI, F.; TSOUCALAS, G.; KARAMANOU, M.; ANDROUTSOS, G. Mary Mallon
(1869-1938) and the history of typhoid fever. Annals of Gastroenterology, v. 26, n.2, 132-
134, 2013.
MARINI, M.A.; GARCIA, F.I. Conservação de aves no Brasil. Megadiversidade, v.1, n.1,
2005.
MARTINEZ, M.B.; TRABULSI, L.R. Enterobacteriaceae. In: TRABULSI, L.R.;
ALTHERTHUM, F. Microbiologia. 5. ed. São Paulo: Atheneu, 2008. p.267-279.
MATIAS, C.A.R.; PEREIRA, I.A.; ARAÚJO, M.S.; SANTOS, A.F.M.; LOPES, R.P.;
CHRISTAKIS, S.; RODRIGUES, D.P.; SICILIANO, S. Characteristics of Salmonella spp.
Isolated from Wild Birds Confiscated in Illegal Trade Markets, Rio de Janeiro, Brazil.
BioMed Research International, v. 2016, p. 1-7.
109
MATTES, B.R.; CONSIGLIO, S.A.S.; ALMEIDA, B.Z.; GUIDO, M.C.; ORSI, R.B.;
SILVA, R.M.; COSTA, A.; FERREIRA, A.J.P.; KNÖBL, T. Influência da biossegurança na
colonização intestinal por Escherichia coli em psitacídeos. Arquivos do Instituto Biológico,
v.72, n.2, p.13-16, 2005.
MURRAY, P.; ROSENTHAL, K.; PFAÜER, M. Microbiologia Médica. Espanha: Elsevier,
2006. 927p.
NETO, A.A.M.C. O tráfico de animais. Revista da Faculdade de Direito da Universidade
de São Paulo. v. 106/107, p.307-347, 2012.
OCHOA, I.M.F.; RODRÍGUEZ, A.V. Mecanismos moleculares de patogenicidad de
Salmonella sp. Revista Latinoamericana de Microbiologia, v.47, n.1-2, p. 25-42, 2005.
OCHOA, T.J.; CONTRERAS, C.A. Enteropathogenic E. coli (EPEC) infection in children.
Current Opinion in Infectious Diseases, v. 24, n. 5, p. 478–483, 2011.
PAGANO, I.S.A.; SOUSA, A.E.B.A.; WAGNER, P.G.C.; RAMOS, R.T.C. Aves depositadas
no Centro de Triagem de Animais Silvestres do IBAMA na Paraíba: uma amostra do tráfico
de aves silvestres no estado. Ornithologia, v. 3, n. 2, p.132-144, 2009.
PEPPERBERG, I.M. The Alex studies. Cambridge, MA: Harvad University Press. 1999.
PEREIRA, G.A.; BRITO, M.T. Diversidade de aves silvestres brasileiras comercializadas nas
feiras livres da Região Metropolitana do Recife, Pernambuco. Atualidades Ornitológicas,
n.126, p. 14, 2005.
PICCIRILLO, A.; MAZZARIOL, S.; CALIARI, D.; MENANDRO
M.L. Salmonella Typhimurium Phage Type DT160 Infection in Two Moluccan Cockatoos
(Cacatua moluccensis): Clinical Presentation and Pathology. Avian Diseases, v.54, n. 1, p.
131–135, 2010.
PINTO, A.; SIMÕES, R.; OLIVEIRA, M.; VAZ-PIRES, P.; BRANDÃO, R.; COSTA, P.M.
Multidrug resistance in wild bird populations:importance of the food chain. Journal of Zoo
and Wildlife Medicine, v.46, n. 4, p. 723-731, 2015.
PRESCOTT, J.F. Quimioterapia Antimicrobiana. In: HIRSH, D.W.; ZEE, Y.C.
Microbiologia veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. p. 27-46.
PRIOSTE, F.E.S, CUNHA, M.P.V, TEIXEIRA, R.H.F, ZWARGG, T, GIOIA DI-
CHIACCHIO, R, MELVILLE, P.A, BENITES, N.R, SINHORINI, J, MATUSHIMA, E.R,
KNÖBL T. Genetic similarity between APEC and Escherichia coli strains isolated from
Guaruba guarouba in a survey on healthy captive psittacine birds. Brazilian Journal
Veterinary Research Animal Science, v. 50, n. 2, p.145-51, 2013.
PRIYA, P.M,; PILLAI, D. S.; RAMESHKUMA, P. e SENTHAMILSELVAN, P. An Unusual Occurrence of Colisepticemia in Budgerigars (Melopsittacus undulatus). International
Journal of Poultry Science, v.7, n. 2, p. 191-192, 2008.
110
QUINN, P.J.; MARKEY, B.K.; CARTER, N.E.; DONNELY, W.J.; LEONARD, E.C.
Microbiologia veterinária e doenças infecciosas. Porto Alegre: Artmed, 2005. 512p.
RAVAZZI, G.; CONZO, G. Enciclopedia mundial de los loros. Barcelona, Espanha:
Editorial De Vecchi, 2008, 280p.
REDFORD, F.M. The empty Forest. Bioscience, v.42, n. 6, p. 412-422, 1992.
REGUEIRA, R.F.S.; BERNARD, E. Wildlife sinks: Quantifying the impact of illegal bird
trade in street markets in Brazil. Biological Conservation, v.149, n. 1, p. 16-22, 2012.
REDE NACIONAL DE COMBATE AO TRÁFICO DE ANIMAIS SILVESTRES. Primeiro
relatório nacional sobre o tráfico de fauna silvestre, 2001. 108p.
RIBEIRO, L. B. e SILVA, M. G. O comércio ilegal põe em risco a diversidade das aves no
Brasil. Ciência e Cultura, v.59, n.4, p. 4-5, 2007.
ROCHA, M.S.P.; SOUTO J.S.; CAVALCANTI, P.C.M.; Holanda, A.C. Aspectos da
comercialização ilegal de aves nas feiras livres de Campina Grande, Paraíba, Brasil. Revista
de Biologia e Ciências da Terra, v.6, n. 2, p. 204-221, 2006.
SAIDENBERG, A.B.; TEIXEIRA, R.H.F.; GUEDES, N.M.R.; ALLGAYER, M.C.;
MELVILLE, P.A.; BENITES, N.R. Molecular detection of enteropathogenic Escherichia
coli in asymptomatic captive psittacines. Pesquisa Veterinária Brasileira, 32, n. 9, p. 922-
926, 2012a.
SAIDENBERG, A.B., GUEDES, N.M.R., SEIXAS, G.H.F., ALLGAYER, M.C., ASSIS, E.
P., SILVEIRA, L.F., MELVILLE, P.A., BENITES, N.R. A Survey for Escherichia coli
Virulence Factors in Asymptomatic Free-Ranging Parrots. ISRN Veterinary Science, v.
2012, p. 1-6, 2012b.
SÁNCHEZ, S.D.; SÁNCHEZ, S.; EWERS, C.; HÖFLE, U. Occurrence of avian pathogenic Escherichia coli and antimicrobial-resistant E. coli in red-legged partridges (Alectoris rufa):
sanitary concerns of farming. Avian Pathology, v. 41, n.4, p 337-344, 2012.
SANTOS, E.A.M.; BUENO, M.; ARAÚJO, A.S.; BARROS, I.F.A.; PAES, N.N.G.;
RODRIGUES, S.R.W.; CAMPOS, C.E.C. Aves do Centro de Triagem de Animais Silvestres
do Estado do Amapá. Ornithologia, v. 4, n. 2, p. 86-90, 2011.
SANTOS, H. F.; FLÔRES, M. L.; LARA, V. M.; SILVA, M.S.; BATTISTI, L.; LOVATO, L.
T. Microbiota cloacal aeróbia de cracídeos cativos no Rio Grande do Sul e sua
susceptibilidade a antimicrobianos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 30, n. 12, p. 1087-
1082, 2010.
SAREYYUPOGLU, B.; ÇELIK, A.O.K.; CANTEKIN, Z.; YARDIMCI, H.; AKAN M.;
AKÇAY, A. Polymerase Chain Reaction Detection of Salmonella sp. in Fecal Samples of Pet
Birds. Avian Diseases, v.52, n.1, p.163-167, 2008.
SICK, H. Ornitologia Brasileira. Rio de Janeiro: Nova Fronteira, 1997. 351p.
111
SIGRIST, T. Guia de Campo Avis Brasilis:Avifauna Brasileira. São Paulo: Avis Brasilis,
2014. 608p.
SIQUEIRA, R.A.S.; LUNA, A.C.L.; CAVALCANTI, T.A.; GUERRA, R.R. Levantamento
do perfil e das condições corpóreas de canário-da-terra, gavião-carijó, azulão, papagaio-
verdadeiro e galo-de campina apreendidos pelo CETAS/IBAMA-PB, Revista de Biologia e
Farmácia, v. 9, n. 3, p 1-8, 2013.
SHOBRAK, M.Y.; ABO-AMER, A.E. Role of wild birds as carriers of multi-drug resistant
Escherichia coli and Escherichia vulneris. Brazilian Journal of Microbiology, v. 45, n. 4, p.
1199-1209, 2014.
TRABULSI, L.R.; KELLER, R.; GOMES, T.A.T. Typical and Atypical Enteropathogenic
Escherichia coli. Emerging Infectious Diseases, v.8, n. 5, p. 508-513, 2002.
TUNCA, R., TOPLU, N., KURKAN, S., AVCI, H., AYDOGAN, A., EPIKMEN, E.T.;
TEKBIKYIK, S. Pathomorphological, immunohistochemical and bacteriological findings in
budgerigars (Melopsittacus undulatus) naturally infected with S. Gallinarum. Avian
Pathology, v.41, n. 2, p. 203-209, 2012.
VANSTREELS, R.E.T.; TEIXEIRA, R.H.F.; CAMARGO, L.C.; NUNES, A.L.V.;
MATUSHIMA, E.R. Impacts of Animal Traffic on the Brazilian Amazon Parrots (Amazona
species) Collection of the Quinzinho de Barros Municipal Zoological Park, Brazil, 1986–
2007. Zoo Biology, v. 29, p. 600–614, 2010.
VIGO, G.B.; ORIGLIA, J.; GORNATTI, D.; PISCOPO, M.; SALVE, A.; CAFFER, M.I.;
PICHEL, M.; BINSZTEIN, N.; LEOTTA, G.A. Isolation of Salmonella Typhimurium from
dead blue and gold macaws (Ara ararauna). Avian Diseases, v.53, n.1, p.135-138, 2009.
VILELA, Valter Oshiro.; GUEDES, Neiva Maria Robaldo.; ARAÚJO, Flábio Ribeiro.;
SOLARI, Claude André.; FILIÚ, Wander Fernandes Oliveira.; CATELAN, Viviane Lima.;
ALVES, Mariele Mucke.; CARMO, Michelli Almoeida.; SOUZA, Rebeca Abrão.;
VARGAS, Flávia Carolina. Salmonella Bredney em Arara-Azul (Anodorhynchus
hyacinthinus). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ORNITOLOGIA, 9., 2001, Curitiba.
2001. Anais... Curitiba, PR: Ornitologia sem fronteiras, 2001. p. 390-391.
WESTON, M.K.; MEMON, M.A. The illegal parrot trade in Latin America and its
consequences to parrot nutrition, health and conservation. Bird Populations, v.9, p. 76-83,
2009.
XENOULIS, P. G., P. L. Gray, D. BRIGHTSMITH, P. BLAKE, S. HOPPES, J. M.
STEINER, I. TIZARD, and J. S. SUCHODOLSKI. Molecular characterization of the cloacal
microbiota of wild and captive parrots. Veterinary Microbiology, v. 146, n. 3-4, p. 320–325,
2010.