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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL CAPRINO
COMO FERRAMENTA PARA O ISOLAMENTO DE LENTIVÍRUS EM
CULTIVO CELULAR
FORTALEZA - CEARÁ
2016
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GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL CAPRINO
COMO FERRAMENTA PARA O ISOLAMENTO DE LENTIVÍRUS EM CULTIVO
CELULAR
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do título de Doutor em
Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade
de pequenos ruminantes.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da
Silva Teixeira.
FORTALEZA – CEARÁ
2016
3
4
GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO
5
Dedico a minha família, em especial aos meus
pais Rita Maria e Eguimar, e ao meu marido
Ismael, por todo apoio durante minha
caminhada para conquista desse título.
6
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), da Faculdade de
Veterinária (FAVET), da Universidade Estadual do Ceará (UECE).
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.
A Profª. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira por todo apoio e ensino, sempre disposta a
lutar pelos sonhos e conquistas, pessoa que admiro pela garra e talento para lecionar e
pesquisar, muito obrigada.
A Profª. Drª. Lilia Maria Carneiro Câmara pelos ensinamentos e por abrir as portas do seu
laboratório com todo carinho e paciência, apresentando o mundo da citometria de fluxo.
Ao Senhor Silva, gestor responsável pela Fazenda parceira por colaborar com o projeto
através da disponibilização de animais para coleta.
Aos meus amigos do Laboratório de Virologia, em especial a Rebeca e Junior, por todo
apoio e ajuda, principalmente disponibilidade para ajudar nas coletas, mesmo em feriados e
finais de semana, facilitando a execução desse experimento.
Aos meus pais, Rita Maria Rosemblit Martins e Eguimar Araujo Martins, que sempre me
apoiaram em toda a minha caminhada acadêmica, sempre orgulhosos das conquistas.
Ao meu marido, Ismael Aires, por toda paciência durante esse período do experimento, e
acima de tudo disposição para acompanhar e ajudar nas coletas, mesmo em finais de
semana, feriados e férias.
A minha avó e tias, em especial a Rosaly, pelo apoio e orações para que tudo desse
certo nesse doutorado.
Aos demais que contribuiram de alguma forma, e aqui não foram citados, meu sincero
agradecimento.
A Deus, sem Ele esse sonho não poderia ter se concretizado. Aprendi que devemos
sempre agradecer por tudo que acontece em nossas vidas, nunca sabemos o que Deus
tem para nos dar, mas Ele conhece nossos corações, nossos medos e nossas
necessidades.
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RESUMO
Células-tronco são células não diferenciadas de embriões, fetos ou tecidos adultos, com
potencial para gerar diversos tipos celulares sob o estímulo bioquímico, hormonal e
mecânico adequado. Dentre elas figuram as células-tronco mesenquimais (CTM), tipo
celular que tem particular importância na pesquisa científica, utilizadas principalmente
em terapias celulares. No entanto, o seu potencial é bem mais amplo, podendo ser
utilizadas como insumo para o isolamento viral em cultivo celular. Dessa forma, o
objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais
provenientes do cordão umbilical caprino, investigar o seu potencial de diferenciação, e
produzir monocamada celular para o isolamento de lentivírus em cultivo celular. Para
tanto, foram coletadas amostras de tecido e sangue do cordão umbilical caprino,
submetidas a protocolos de transporte, separação, isolamento e cultivo das CTM, para a
obtenção da monocamada celular. Essas células foram caracterizadas através da
imunofenotipagem por citometria de fluxo e submetidas à diferenciação em linhagens
mesodermais. As monocamadas obtidas foram utilizadas para isolamento dos lentivírus
de pequenos ruminantes, através da infecção experimental com os vírus da artrite
encefalite caprina (CAEV-Cork) e Maedi Visna (MVV K1514), visando testar sua
permissibilidade aos efeitos citopáticos causados por esses vírus, e seu potencial para o
uso no diagnóstico de lentiviroses em cultivo celular. A padronização do isolamento e
cultivo dessas células, tanto de amostras de tecido como sangue do cordão umbilical,
permitiu o isolamento das células-tronco mesenquimais, bem como obtenção de
monocamada celular com potencial de diferenciação nas linhagens mesodermais de
condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Essas monocamadas se mostraram permissíveis à
infecção pelos lentivírus de pequenos ruminantes, apresentando efeito citopático de lise
e sincício celular. Esses resultados contribuem para evolução do diagnóstico das
lentiviroses em cultivo celular, apresentando nova alternativa de obtenção de células, e
dão base para maiores estudos com células-tronco mesenquimais caprinas.
Palavras-chave: CAEV. MVV. Cultivo Celular. CTM. Citometria de fluxo.
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ABSTRACT
Stem cells are undifferentiated cells of embryos, fetuses or adult tissues, with the
potential of generate cells of several tissues in the biochemical, hormonal and
mechanical stimulation suitable. Among them, the mesenchymal stem cells (MSC), a
cell type that has particular importance in scientific research, used mainly in cellular
therapies. However, its potential is much broader, and can be used as element material
for virus isolation in cell culture. Thus, the objectives of this work were to isolate and
characterize mesenchymal stem cells from the goat umbilical cord, to investigate its
differentiation potential, and to produce cell monolayer for the isolation of lentivirus in
cell culture. For this purpose, tissue and blood samples from the goat umbilical cord
were collected, submitted to protocols for transport, separation, isolation and culture of
the MSC, to obtain the cellular monolayer. These cells were characterized by
immunophenotyping by flow cytometry and submitted to differentiation in mesodermal
lines. The obtained monolayers were used to isolate lentiviruses from small ruminants
through experimental infection with Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV-Cork)
and Maedi Visna virus (MVV K1514), in order to test their permissibility to the
cytopathic effects caused by these viruses and their potential for use in the diagnosis of
lentiviruses in cell culture. The standardization of the isolation and culture of these
cells, both tissue samples and umbilical cord blood, allowed the isolation of
mesenchymal stem cells, as well as obtaining a cell monolayer with differentiation
potential in the mesodermal lines of chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. These
monolayers were shown to be permissible for infection by lentiviruses of small
ruminants, presenting cytopathic effect of lysis and cellular syncytium. These results
contribute to the evolution of the diagnosis of lentiviruses in cell culture, presenting a
new alternative to obtain cells, and provide a basis for further studies with mesenchymal
stem cells.
Key-words: CAEV, MVV, Cell Culture, MSC, Flow Cytometry.
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LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
Figure 1 - Morphological features of MSC derived from goat UCB. (A) Primary culture
after 4-5 days. (B) Short or long spindles, with uniform fibroblast-like
morphology. (C) Typical fibroblast-like morphology with 80-85%
confluence.
Figure 2 - (A) Positive staining of Alcian Blue showed the chondrogenic differentiation.
(B) Positive Alizarin Red stain showed osteogenic differentiation. (C)
Sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets in the cytoplasm,
showed lower adipogenic potential.
Figure 3 - Comparison of cell surface marker profiles between two types of MSC. (A)
Large fibroblastic MSC. (B) Small fibroblastic MSC. Both types of MSC at
passage 3 were analyzed by flow cytometry with antibodies against the
indicated antigens. Calibrated histogram representing standard number of
events in the Y-axis; and fluorescent intensity on X-axis. Negative control
was shown in the graph area with fluorescent intensity less than 10¹.
CAPÍTULO 3
Figure 1 -Primary culture of cGUCs: morphological features and cell monolayers
formed. (A) Epithelial cell-like phenotype. (B) Typical fibroblastoid shape.
(C) cGUCs exhibiting a large, flattened fibroblast-like morphology after the
third passage.
Figure 2 - Cytopathic effects caused by MVV and CAEV. (A) Cell lysis and syncytia
caused by MVV. (B) Giant multinucleated cells caused by CAEV. (C)
Negative control for the viral infectivity assay.
Figure 3 - FACS analysis of Vimentin and CD90, in vitro culture, third passage cGUCs.
(A) Vimentin PE. (B) CD90 FITC. Calibrated histogram representing the
number of events on the Y-axis and fluorescent intensity on the X-axis. The
red area histogram indicate negative control.
Figure 4 - Mesodermal lineage differentiation. Adipogenic Differentiation. (A)
Chondrogenic Differentiation. (B) Osteogenic Differentiation. (C)
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADSCs - Goat Adipose-derived Stem Cells
AIEV – Vírus da Anemia Infecciosa Equina
APC - Allophycocyanin
BME - Meio Basal de Eagle
CTM – Células-tronco Mesenquimais
CAEV - Artrite Encefalite Caprina
cAF-MSCs - Caprine Mesenchymal Stem Cells derived from Amniotic Fluid
CAPES – Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
cGUCs - Cells from Goat Umbilical Cords
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 – Dióxido de carbono
DMEM – Meio Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
FACS - Fluorescence Activated Cell Sorter
FBS – Fetal Bovine Serum
FITC - Fluorescein Isothiocyanate
FIV – Vírus da Imunodeficiência felina
HIV-1 - Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1
HIV-2 – Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2
HSC - Hematopoietic Stem Cells
ICTV - Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
ISCT - International Society for Cytotherapy
LVPR - Lentivírus de Pequenos Ruminantes
MEM – Meio Essencial Mínimo
MEM-E - Minimum Essential Medium with Earle’s salt and L-glutamine
Mg2+ - Magnésio
MO - Missouri
MOI – Multiplicidade de infecção
MSC - Mesenchymal Stem Cells
MVV - Vírus Maedi-Visna
NY – New York
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PBS - Phosphate buffered saline
PE - Phycoerythrin
pH – Potencial hidrogeniônico
PPGCV – Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias
RNA - Ácido Ribonucleico
RPMI - Roswell Park Memorial Institute Medium
SFB – Soro Fetal Bovino
SIV – Vírus da Imunodeficiência Símia
SRLV - Small Ruminant Lentivirus
SS – Saline Solution
TGF-β – Fator de crescimento de transformação β
VSEL - Very small embryonic/epiblast-like stem cells
UCB - Umbilical cord blood
UFC – Universidade Federal do Ceará
UFC-F – Unidade formadora de colônia fibroblástica
USA – United States of America
USSC - Unrestricted somatic stem cells
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 15
2.1 CÉLULAS-TRONCO ....................................................................................................... 15
2.2 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS........................................................................ 16
2.3 CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO .............................................................................. 17
2.4 IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO .......................................... 19
2.5 LENTIVIROSES DE PEQUENOS RUMINANTES ....................................................... 20
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 23
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ............................................................................... 24
5. OBJETIVOS .......................................................................................................... 25
5.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 25
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 25
6. CAPÍTULO 1 ......................................................................................................... 26
7. CAPÍTULO 2 ......................................................................................................... 44
8. CAPÍTULO 3 ......................................................................................................... 62
9. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 78
10. PERSPECTIVAS .................................................................................................. 79
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 80
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1. INTRODUÇÃO
A célula-tronco é uma célula indiferenciada com capacidade de autorrenovação,
que pode originar diferentes tipos celulares. As células-tronco totipotentes, presentes no
embrião, podem originar os diversos tipos celulares do organismo. Em contraste, as
células-tronco multipotentes, como as células-tronco mesenquimais e células-tronco
hematopoiéticas, podem se diferenciar em apenas algumas linhagens celulares (ORBAY
et al., 2012).
A célula-tronco mesenquimal representa um tipo de célula-tronco adulta,
caracterizada por baixa imunogenicidade, multipotência, facilidade de isolamento,
purificação, expansão in vitro e a possibilidade de criopreservação (PROSPER et al.,
2003). Essas características favorecem o seu uso em diversos campos da pesquisa
científica, sendo capazes de se diferenciar e produzir vários tipos celulares necessários
como osteoblastos, condroblastos, hepatócitos, neurônios, células epiteliais, renais,
cardíacas, musculares, dentre outras (PITTENGER et al., 1999; SALEM e
THIEMERMANN, 2010).
Estudos com células-tronco mesenquimais buscam isolar, cultivar e caracterizar
esse tipo celular a partir de amostras de diversos tecidos e espécies animais, visando
utilizá-las em terapias celulares. As terapias baseadas em células visam reparar e
substituir tecidos lesados ou senescentes, oferecendo uma abordagem terapêutica
promissora tanto na medicina humana como na medicina veterinária (FORTIER e
TRAVIS, 2011; STOLTZ et al., 2012).
Porém, o potencial de utilização desse tipo celular pode ser bem mais amplo,
contribuindo para avanços em outros ramos da pesquisa científica, como estudos
microbiológicos, através do isolamento viral em cultivo celular, produção de antígenos
e vacinas. Essa nova possibilidade de aplicação pode contribuir para o diagnóstico, e
consequente prevenção de diversas doenças.
O sucesso da produção animal depende da aplicação de um bom manejo, que
inclui cuidados com nutrição, reprodução e sanidade animal. O manejo sanitário de
pequenos ruminantes inclui o controle e prevenção das lentiviroses de pequenos
ruminantes, doenças crônicas que afetam consideravelmente a produção desses animais.
Os lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), que compreendem o vírus da
artrite encefalite caprina (CAEV) e o vírus Maedi-Visna (MVV), são um conjunto
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genético de espécies lentivirais que foram inicialmente isoladas de cabras e ovelhas,
respectivamente (LEROUX et al., 1997). Após longo período de incubação, esses vírus
são responsáveis por uma infecção persistente que induz a doença crônica degenerativa
das articulações, pulmões, úbere e sistema nervoso central dos hospedeiros infectados
(RAVAZZOLO et al., 2006).
O diagnóstico dessas infecções é de suma importância em termos de
investigação epidemiológica e controle do comércio internacional de pequenos
ruminantes, de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde
Animal (OIE). A variedade biológica dos lentivírus de pequenos ruminantes dificulta a
utilização de uma ferramenta diagnóstica única, rápida e precisa, mas, em geral, são
eficientemente detectados através de métodos sorológicos que podem ser
complementados por técnicas moleculares (ANDRÉS et al., 2005). Entretanto, o
isolamento viral em cultivo celular representa a técnica padrão-ouro de detecção dessa
doença em um rebanho, comprovando a presença dos vírus a partir da observação dos
efeitos citopáticos em monocamadas celulares co-cultivadas com amostras (sangue,
lavado bronco-alveolar, leite, entre outros) coletadas dos animais infectados (CORK e
NARAYAN, 1980; HÖTZEL et al., 1993; CALLADO, 1999).
Considerando-se o potencial das células-tronco mesenquimais, e a possibilidade
de cultivo de diversos tipos de células, tanto para obter linhagens como para auxiliar no
diagnóstico de doenças, o objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar fenotipicamente
e investigar o potencial de diferenciação das células-tronco mesenquimais provenientes
do cordão umbilical caprino, visando obter monocamada de células para uso no
diagnóstico das lentiviroses de pequenos ruminantes no cultivo celular, bem como
padronizar protocolo de isolamento e cultivo desse tipo celular em caprinos,
contribuindo para avanços nesse campo de pesquisa.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CÉLULAS-TRONCO
As células-tronco possuem como características a capacidade de diferenciação
celular, o que as permitem originar os mais diversos tecidos a partir de resposta a
estímulos externos, gerando linhagens celulares mais especializadas como tecido
muscular esquelético, ósseo, cartilaginoso e adiposo (SOUZA et al., 2003, PEREIRA,
2008; YARAK e OKAMOTO, 2010). Além disso, possuem o poder de autorrenovação
e diferenciação (WATT e HOGAN, 2000).
Quanto a sua potencialidade podem ser classificadas em totipotentes,
multipotentes, oligopotentes e unipotentes. As totipotentes apresentam como
característica a capacidade de gerar todos os tecidos do organismo e do folheto
embrionário; as classificadas como multipotentes apresentam a capacidade de gerar
diversas linhagens celulares; por sua vez, as oligopotentes originam células do próprio
tecido isolado e diversas células de tecidos somáticos (SOUZA et al., 2003) e as
células-tronco unipotentes originam apenas um tipo celular do folheto (FRIEL et al.,
2005; YARAK e OKAMOTO, 2010).
Outra classificação é realizada de acordo com a sua origem em células-tronco
embrionárias (CTE) e as células-tronco somáticas (CTS). As CTE são obtidas da massa
interna do blastocisto. As células-tronco somáticas são consideradas células
multipotentes que possuem potencial de se diferenciarem em múltiplas linhagens
celulares, sendo classificadas em células hematopoiéticas e mesenquimais. São
consideradas relevantes no uso da terapia celular devido sua facilidade de isolamento de
quase todos os tecidos adultos, cultivo e formação de banco de células (DOMINICI et
al. 2006, DEL CARLO et al. 2008, NERY et al. 2013). Anexos fetais como o fluído
amniótico, cordão umbilical e membrana amniótica são fontes promissoras de células-
tronco mesenquimais com grande potencial de aplicação na medicina regenerativa
(ZUCCONI et al. 2010).
As células-tronco mesenquimais apresentam grande plasticidade, originando
tecidos mesodermais e não mesodermais (ZAGO e COVAS, 2004; MEIRELLES et al.,
2006). São células multipotentes, com alta capacidade de se renovar e diferenciar em
células de diversas linhagens de tecido conjuntivo (BITTENCOURT et al., 2006) como
osteoblastos, condrócitos e adipócitos (KADIYALA et al., 1997).
16
2.2 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
As células-tronco mesenquimais (CTM), também chamadas de células
progenitoras mesenquimais (KARAHUSEYINOGLU et al., 2007), representam um
arquétipo das células-tronco somáticas multipotentes. Essas células são uma promessa
para aplicação na medicina regenerativa em humanos (WAGNER et al., 2005) e
também em animais domésticos (CREMONESI et al., 2011), principalmente devido a
sua capacidade intrínseca de autorrenovação e diferenciação em vários tipos celulares
funcionais (BAKSH et al., 2004).
As CTM tem particular importância na medula óssea, sendo responsáveis pela
manutenção do “nicho da célula-tronco hematopoiética”, regulando sua autorrenovação
e diferenciação in vivo (WILSON e TRUMPP, 2006). A comprovação da existência
desse tipo de célula na medula óssea ocorreu após os estudos de Friedenstein et al.
(1966), caracterizadas pela capacidade de aderir ao plástico, formar colônias em
formato de fuso e semelhante a fibroblastos, sendo estas colônias derivadas de uma
única célula precursora, designada Unidade Formadora de Colônia Fibroblástica (UFC-
F) (PROCKOP, 1997).
Os critérios mínimos para se caracterizar esse tipo celular são sua característica
plástico aderente quando mantidas sob condições de cultivo; apresentar padrões de
expressão de antígenos de superfície incluindo CD29, CD44 (WAGNER et al., 2005),
CD73, CD90 e CD105 (DE MATTOS CARVALHO et al., 2009); e não apresentar
expressão dos marcadores da linhagem hematopoiética e HLA-DR (WAGNER et al.,
2005). Ainda devem ter capacidade de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e
condroblastos in vitro (PITTENGER et al., 1999).
Essa linhagem de células-tronco somáticas pode ser encontrada em pequenas
quantidades em regiões perivasculares de todos os tecidos adultos, incluindo a medula
óssea, tecido adiposo, muscular e os órgãos parenquimatosos (MAMBELLI et al., 1999;
MEIRELLES et al., 2008; ZUCCONI et al., 2009). Uma vez isoladas, independente do
tecido de origem, podem ser utilizadas, principalmente, em terapias celulares. A forma
mais antiga de terapia celular é a transfusão de componentes sanguíneos, um dos
procedimentos terapêuticos mais executados em todo o mundo. No entanto, o foco atual
da terapia celular é a medicina regenerativa, que busca a substituição de células ou
tecidos lesados, senescentes ou perdidos para restaurar sua função. As formas de terapia
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celular que despertam as maiores esperanças da comunidade científica e da sociedade
em geral são as terapias com células-tronco (ZAGO, 2005).
Por apresentar alta plasticidade, possibilidade de isolamento a partir de tecidos
adultos, adaptação no cultivo celular in vitro, além de sua baixa imunogenicidade, essas
células apresentam um potencial bem mais amplo de utilização, podendo ser exploradas
por outros campos da pesquisa cientifica, não só o da medicina regenerativa. Para tanto,
necessita-se padronizar protocolos de isolamento e cultivo celular, proporcionando o
seu uso em diferentes experimentos, como os relacionados com a microbiologia, que
podem aproveitar os benefícios da técnica de cultivo celular in vitro, e auxiliar no
diagnóstico e prevenção de diversas doenças.
2.3 CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO
O cultivo celular é um conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter
células isoladas fora do organismo, e tem como objetivo a expansão do número dessas
células. Baseia-se na capacidade de as células multiplicarem-se numa placa de cultura
em condições adequadas, mantendo suas características próprias. A cultura de células
implica numa prévia desagregação mecânica ou enzimática do tecido original e o
cultivo de tais células é feito em uma camada aderente, em uma placa ou garrafa de
cultivo, em um substrato sólido ou cultura em suspensão. Esta técnica deve ser feita em
condições ótimas de temperatura e pH, conforme o tipo de células em estudo
(FRESHNEY, 2010).
A nutrição com meios suplementados com aminoácidos e carboidratos deve ser
fornecida para que as células se mantenham vivas e se comportem como se estivessem
no organismo vivo (ALBERTS et al., 2009). Meios como o Meio Essencial Mínimo
(MEM), Meio Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos (DMEM), RPMI-1640
(Roswell Park Memorial Institute medium) e Meio Basal de Eagle (BME), acrescidos
de Soro Fetal Bovino (SFB), normalmente na concentração de 10-20%, têm sido
utilizados para manutenção das células-tronco mesenquimais in vitro, sendo a escolha
do meio uma variável importante para o sucesso do crescimento e diferenciação dessas
células (TAPP et al., 2009). A principal função do soro nas culturas celulares é fornecer
fatores hormonais que estimulem o crescimento celular e suas funções, fatores de
adesão e expansão e transporte de proteínas carregadoras de hormônios, minerais,
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lipídeos. O papel mais importante do soro está na promoção de adesão e expansão de
uma linhagem através de fatores como o colágeno e fibronectina (BASTOS et al.,
2007). As células-tronco isoladas e destinadas ao cultivo celular são mantidas em
incubadora a 37ºC com atmosfera com 5% CO2, o que facilita a manutenção do pH do
meio, permitindo que as trocas das células com o meio sejam mais eficientes
(FRESHNEY, 2005).
Culturas preparadas diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem um
passo inicial de fracionamento das células, são chamadas culturas primárias. Na maioria
dos casos, células em culturas primárias podem ser retiradas da placa de cultura e
usadas para formar um número razoável de culturas secundárias; elas podem ser
repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses (MANI et al., 2008).
As CTM podem ser cultivadas em meio de cultivo completo, em frascos ou
placas de cultura, nos quais elas se aderem, começam a se proliferar e formam as UFC-
F (KRAMPERA et al., 2006). Essas células se tornam uma população aderente cada vez
mais homogênea e de acordo com estudos de caracterização com CTM humanas, tem
potencial para se proliferarem sem se diferenciarem por até 40 passagens (HORWITZ et
al., 1999; PITTENGER et al., 1999). Em determinadas circunstâncias podem passar por
diferenciação celular, transformando-se em células com função mais especializadas
(ALBERTS et al., 2009).
A caracterização dessas células baseia-se na sua propriedade de adesão ao
plástico, morfologia fibroblástica e padrão característico de marcadores de superfície
(MARTIN et al., 2002). Esses critérios, juntamente com a habilidade de se diferenciar
em diversos tipos celulares, sendo os principais adipócitos, condrócitos e osteoblastos,
são suficientes para defini-la como células-tronco mesenquimais (PITTENGER et al.,
1999).
A técnica de cultivo proporciona o isolamento, cultivo e diferenciação desse tipo
celular, bem como sua aplicação em diversos campos da medicina veterinária.
Associada a técnica de citometria de fluxo proporciona uma caracterização completa,
identificando a presença de marcadores de superfície e intracelulares específicos.
19
2.4 IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO
A citometria de fluxo é um método moderno do estudo de células, através do
qual podem ser determinadas múltiplas propriedades físicas e biológicas de uma célula.
A linhagem celular e suas subpopulações podem ser determinadas pelo número e tipo de
antígeno de superfície, intracitoplasmático ou mesmo intranuclear, o que propicia a
quantificação e classificação ontogênica (imunofenótipo) das células. A citometria
permite, além do rastreamento rápido de inúmeras populações celulares, a quantificação
de pequenas populações com extrema especificidade (BACAL e FAULHABER, 2003).
Na caracterização de células-tronco mesenquimais, obtidas da medula óssea,
cordão umbilical, ou outro tecido de origem são utilizados anticorpos conjugados a
fluorocromos excitáveis, os quais reconhecem antígenos específicos de membrana, e são
analisados em citômetro de fluxo. A citometria de fluxo é um recurso importante na
Veterinária, permitindo uma análise rápida, objetiva e quantitativa de células em
suspensão (FALDYNA et al., 2001).
As células, em suspensão, são marcadas com anticorpos específicos, conjugados
com fluorocromos para detecção de moléculas de superfície e são introduzidas em uma
câmara de fluxo. O fluxo de células que atravessa a câmara está suspenso em uma
solução tampão, sendo que 500 a 4000 células ou partículas passam em fila única, por
segundo, através do sensor eletrônico. O fluxo é iluminado por laser argônio, que tem
uma energia de luz incidente de 488 nm. Cada célula é avaliada com relação ao tamanho
(feixe de luz frontal) e granularidade e complexidade interna (feixe de luz lateral), bem
como para a intensidade de fluorescência para detecção de diferentes marcadores de
superfície (imunofenotipagem). A técnica de citometria de fluxo permite, portanto,
identificar e quantificar células em suspensão com base no tamanho (“Forward scatter” -
FSC), na granularidade (“Side scatter” - SSC) e na intensidade da fluorescência dessas
células (ROITT et al., 2003).
Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de
superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os
contêm (COVAS, 2006). Contudo, as CTM apresentam poucos marcadores
imunofenotípicos específicos (ALHADLAQ e MAO, 2004; MEIRELLES et al., 2006),
sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de um perfil de marcadores
específicos e não específicos. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de
20
anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana
celular (MEIRELLES et al., 2006; LOJUDICE, 2008).
A população de CTM isoladas da medula óssea de humanos e camundongos
expressa em sua superfície marcadores moleculares como: CD44 (receptor de
hialuronato), CD105 (endoglina, marcador angiogênico), CD106 (VCAM-1, molécula
de adesão vascular), CD166 (ALCAM, moléculas de adesão de leucócitos ativados),
CD29 (integrinas, VLA-ß), CD73 (SH3 e SH4), CD90 (Thy-1), Stro-1(estroma de
suporte da hematopoese) e Sca-1 (GRONTHOS et al., 2003; KOLF et al., 2007;
PHINNEY e PROCKOP, 2007). KOLF et al. (2007) afirmaram que o marcador Stro-1 é
o melhor marcador a se investigar quando se deseja pesquisar a presença de CTM.
Entretanto, esse marcador é gradualmente perdido durante a expansão em culturas.
Uma vez isoladas e caracterizadas essas células podem ser utilizadas em
experimentos biológicos, dentre eles no diagnóstico de lentiviroses, através do co-
cultivo de amostras de animais infectados com monocamadas de células-tronco
mesenquimais, no caso em questão, derivadas do cordão umbilical caprino.
2.5 LENTIVIROSES DE PEQUENOS RUMINANTES
Os pequenos ruminantes podem ser infectados por um grupo de lentivírus,
genericamente denominados de Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR), que
compreende vários isolados distribuídos, basicamente, em dois grupos filogenéticos,
cujos protótipos são os vírus Maedi-Visna (MVV) e Artrite encefalite Caprina (CAEV)
(Valas et al. 1997, Castro et al. 1999a, Valas et al. 2000). Os LVPR compartilham
similaridades genéticas, mecanismo molecular de replicação, morfologia e interações
biológicas em seus hospedeiros. Os membros deste grupo compõem um grupo
taxonômico espécie-específicos, tem tropismo por células da linhagem monocítica-
fagocitária e são caracterizados pela infecção persistente in vivo (Narayan et al. 1997).
São pertencentes à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e ao gênero
Lentivirus (CORK et al., 1974; ICTV, 2015).
A artrite-encefalite caprina é uma enfermidade infecciosa, multissistêmica,
incurável e de caráter crônico que afeta caprinos em várias fases do desenvolvimento
etário, independente do sexo, raça e produção (CORK et al., 1974; LARA et al., 2005).
O CAEV é um RNA vírus, não oncogênico, que foi inicialmente descrito por Cork et al.
21
(1974) como agente causal de encefalite em caprinos jovens, sendo posteriormente
identificado como um retrovírus por Crawford et al. (1980) em animais adultos que
apresentavam artrite crônica.
O vírus Maedi-Visna infecta, preferencialmente, ovinos causando infecção
multissistêmica, como em caprinos, porém com maior predileção pelos pulmões e
sistema neurológico. Os sinais clínicos da enfermidade deram origem à denominação da
doença. Primeiramente o quadro de dificuldade respiratória deu origem ao termo
“maedi”, que significa “dispneia”, decorrente de pneumonia intersticial progressiva
crônica. Logo depois, a doença que levava os ovinos á paralisia atáxica deu origem ao
termo “visna” que significa “desorientação”, causada por leucoencefalomielite
(STRAUB, 2004). Posteriormente descobriram que embora a enfermidade Maedi-Visna
acometesse diferentes sistemas do organismo e parecesse ser duas doenças bastante
distintas, os vírus causadores das duas formas clínicas eram semelhantes em sua
estrutura física, química e biológica (incluindo as propriedades de reações sorológicas).
Estudos comparativos revelaram que tanto Maedi quanto Visna eram doenças causadas
pelo mesmo vírus, originando a denominação Maedi-Visna (THORMAR e
HELGADOTTIR, 1965).
Outros vírus pertencentes ao gênero Lentivirus são os vírus das
imunodeficiências felina (FIV), bovina (BIV), símia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2); o
vírus da anemia infecciosa equina (AIEV) e o lentivirus Puma (ICTV, 2015).
Os lentivírus são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100nm
de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas moléculas idênticas de
RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg2+
e
proteínas do nucleocapsídeo (GONDA et al., 1986). O envelope está associado
covalentemente com as glicoproteínas transmembranárias e de superfície. Outra
estrutura presente na partícula viral é a matriz que está situada entre o capsídeo e o
envelope (PEPIN et al., 1998).
A infecção é caracterizada por um período prolongado de latência, na ausência
de transformação oncogênica nas células hospedeiras e tropismo principalmente por
monócitos/macrófagos e as células dendríticas (HUSO et al., 1988). O estudo de
lentivirus animais in vitro através do cultivo celular é considerado o padrão ouro para
isolamento de lentivirus de pequenos ruminantes. E para que isto seja possível é
necessário o uso de células de pequenos ruminantes para a replicação viral. O
22
isolamento e identificação do vírus por meio do co-cultivo de células do colostro, leite,
lavado brônquio-alveolar, sanguíneas e líquido cerebrospinal com células de membrana
sinovial de cultivo primário caprino representa um diagnóstico determinante (CORK e
NARAYAN, 1980; HÖTZEL et al., 1993; CALLADO, 1999), sendo as culturas
primárias de células de membrana sinovial as mais usadas para o isolamento e
caracterização biológica do LVPR (CRAWFORD et al., 1980; NARAYAN et al.,
1980).
No entanto, barreiras éticas dificultam a obtenção de células derivadas da
membrana sinovial, devido à necessidade de utilização de tecidos fetais. Cultivos
primários podem ser instituídos, porém a rápida senilidade das células dificulta a
manutenção de um banco de células continuo para o diagnóstico e isolamento viral. As
células-tronco mesenquimais se apresentam como alternativa promissora para a
evolução dessa técnica, podendo ser obtidas de tecidos adultos, com capacidade de
autorrenovação, baixa imunogenicidade e proliferação in vitro por diversas passagens.
23
3. JUSTIFICATIVA
As células provenientes do cordão umbilical representam uma alternativa
potencial de uso no diagnóstico de lentiviroses, com riscos reduzidos de contaminação
com agentes infecciosos, principalmente quando a colheita é feita de forma asséptica,
além de não utilizar embriões ou fetos, em geral por ocasião do parto este cordão seria
descartado e pode constituir um material excelente rico em células multipotentes com
possibilidade de gerar diversos tipos celulares.
As células-tronco têm sido utilizadas com finalidades diversas tais como
reconstrução de tecidos, correção de defeitos genéticos, transplantes em pessoas e
animais imunossuprimidos, obtenção de células reprodutivas, entre outros. Porém, com
a finalidade precípua de obtenção de monocamada de células visando o uso como
ferramenta destinada ao cultivo para isolamento viral ainda não tinha sido utilizada.
O cultivo de vírus constitui uma técnica padrão ouro para o diagnóstico por
isolamento viral, ampliação de estoques virais, confecção de antígenos diagnósticos e
vacinas; para a multiplicação viral a condição indispensável é a obtenção de
monocamadas celulares. Células primárias e secundárias de diversos tecidos têm sido
utilizadas, algumas linhagens celulares foram obtidas, contudo não existe uma
disponibilidade comercial para uso de rotina. Os cultivos primários apesar de custo
relativamente baixos, oferecem inúmeras dificuldades para sua obtenção, como a
utilização de tecidos fetais ou embrionários para sua confecção, riscos de contaminação,
além da senescência, depois de reduzido número de passagens.
A obtenção e caracterização de células-tronco mesenquimais multipotentes
provenientes do cordão umbilical caprino pode contribuir para o diagnóstico de diversas
doenças, a partir do isolamento de agentes patogênicos no cultivo celular, podendo
constituir linhagens de células com potencial para disponibilidade comercial.
24
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
1- Células-tronco mesenquimais podem ser isoladas do tecido e sangue do
cordão umbilical caprino.
2- Monocamadas de células-tronco mesenquimais provenientes do cordão
umbilical caprino constituem ferramenta para diagnóstico e isolamento de
lentivírus de pequenos ruminantes em cultivo celular.
25
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Isolar, caracterizar fenotipicamente e investigar o potencial de diferenciação das
células-tronco mesenquimais provenientes do cordão umbilical caprino, visando
obter monocamada celular para uso no diagnóstico das lentiviroses de pequenos
ruminantes no cultivo celular.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Testar protocolos de transporte de amostras de tecido do cordão umbilical ao
laboratório;
Padronizar protocolo de separação de células-tronco mesenquimais a partir de
amostra de tecido e sangue do cordão umbilical;
Cultivar as células-tronco mesenquimais de cordão umbilical caprino em dois
meios de cultivo específicos para obtenção de monocamadas de células;
Testar concentrações de soro fetal bovino acrescida ao meio de cultivo das
células-tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical
caprino;
Caracterizar imunofenotipicamente por meio de citometria de fluxo as células-
tronco mesenquimais provenientes de cordão umbilical caprino, pós-cultivo;
Testar a susceptibilidade das células-tronco mesenquimais de cordão umbilical
caprino para a cepa padrão do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV Cork) e
do vírus Maedi Visna (MVV K-1514);
Investigar o potencial de diferenciação das células-tronco mesenquimais em
linhagens mesodermais de adipócitos, condrócitos e osteoblastos.
26
6. CAPÍTULO 1
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS: CARACTERÍSTICAS,
CULTIVO E USO NA MEDICINA VETERINÁRIA
MESENCHYMAL STEM CELLS: CHARACTERISTICS, CULTIVATION
AND USE IN VETERINARY MEDICINE
Periódico: Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v. 08, n. 2, p. 181-202,
abr-jun, 2014
27
RESUMO
As células-tronco mesenquimais são células adultas indiferenciadas com grande
plasticidade, capazes de originar tecidos mesodermais e não mesodermais, produzindo
qualquer tipo celular necessário num processo de reparação. Devido a essas
características essas células vêm ganhando muito atenção das pesquisas voltadas tanto
para humanos como para animais, buscando-se protocolos padrões de separação, cultivo
e diferenciação das mesmas para que possam ser utilizadas em diversas terapias
celulares. O principal foco atual de interesse da terapia celular é a medicina
regenerativa, em que se busca a substituição de células ou tecido lesado, senescentes ou
perdidos para restaurar sua função, sendo as terapias com células-tronco, as que
despertam mais interesse na sociedade. Atualmente, as pesquisas em Medicina
Veterinária têm utilizados camundongos, ratos, gatos, cães, cavalos, ovelhas e cabras,
isolando esse tipo celular, principalmente, da medula óssea, tecido adiposo, cordão
umbilical e fluido amniótico.
28
CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS: CARACTERÍSTICAS, CULTIVO E USO
NA MEDICINA VETERINÁRIA
Gabrielle Rosemblit Martins¹*, Maria Fátima da Silva Teixeira2, Rosivaldo Quirino
Beserra Junior3, Ronaldo Pereira Dias4, Tereza D’ávila de Freitas Aguiar5, Rebeca
Cavalcante Marinho6, Ana Raquel Almeida Pinheiro7.
_________________________________________________________________________ Resumo: As células-tronco mesenquimais são células adultas indiferenciadas com grande
plasticidade, capazes de originar tecidos mesodermais e não mesodermais, produzindo
qualquer tipo celular necessário num processo de reparação. Devido a essas características
essas células vêm ganhando muito atenção das pesquisas voltadas tanto para humanos como
para animais, buscando-se protocolos padrões de separação, cultivo e diferenciação das
mesmas para que possam ser utilizadas em diversas terapias celulares. O principal foco
atual de interesse da terapia celular é a medicina regenerativa, em que se busca a
substituição de células ou tecido lesado, senescentes ou perdidos para restaurar sua função,
sendo as terapias com células-tronco, as que despertam mais interesse na sociedade.
Atualmente, as pesquisas em Medicina Veterinária têm utilizados camundongos, ratos,
gatos, cães, cavalos, ovelhas e cabras, isolando esse tipo celular, principalmente, da medula
óssea, tecido adiposo, cordão umbilical e fluido amniótico.
Palavras-chave: Medula óssea, animais, terapias, multipotentes.
MESENCHYMAL STEM CELLS: CHARACTERISTICS, CULTIVATION AND
USE IN VETERINARY MEDICINE
Abstract: The mesenchymal stem cells are undifferentiated adult cells with high plasticity,
capable of causing tissue mesodermais and not mesodermais, producing any cell type
needed in the repair process. Due to such characteristics these cells have been gaining much
attention from research directed both to humans and to animals, seeking standards protocols
to separation, cultivation and differentiation of the same so that they can be used in various
cell therapies. The main current focus of interest in the cell therapy is regenerative
medicine, which seeks to replace damaged cells or tissue, senescent or lost to restore their
function, and therapies with stem cells, those that arouse more interest in society. Currently,
research in veterinary medicine have used mice, rats, cats, dogs, horses, sheep and goats,
isolating this cell type, mainly bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and amniotic
fluid.
Keywords: Bone marrow, animals, therapies, multipotent
_________________________
1 3 4 5 Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará (UECE), email: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
2 Doutora responsável pelo Laboratório de Virologia do Programa de Pós-graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará
(UECE), orientadora, email: [email protected], Médica Veterinária
6 Mestre pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), email: , email:
[email protected], Médica Veterinária
7 Aluna de iniciação cientifica do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), email:
[email protected], curso: Medicina Veterinária
29
Introdução
Células-tronco são células indiferenciadas que possuem capacidade de
autorrenovação, sendo capazes de se multiplicar mantendo o seu estado indiferenciado,
proporcionando uma reposição ativa de sua população nos tecidos; além de ter
capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, possuindo, desta forma, um
papel regenerativo quando estes sofrem uma lesão ou injúria (BLAU et al., 2001;
FODOR, 2003).
A proliferação das células-tronco (autorrenovação) ocorre por meio de mitoses
sendo responsável por garantir um número adequado de células-tronco em determinado
local do organismo. Com relação à regeneração de tecidos esta ocorre quando as
células-tronco presentes em diversos locais do organismo recebem sinais específicos
para que ocorram divisão e reposição de células perdidas, como no caso de uma lesão
tecidual. A diferenciação é a capacidade particular que estas células apresentam de gerar
tipos celulares distintos, sob o estimulo bioquímico, hormonal e mecânico adequado, in
vitro ou in vivo (CSAKI et al., 2007).
Tomando-se como referencial os aspectos relativos ao potencial de diferenciação
das células-tronco estas podem ser classificadas em: pluripotentes - podem gerar todos
os diferentes tipos celulares, como as células da massa celular interna do blastocisto, e
multipotentes - precursoras de diferentes tipos celulares de uma mesma linhagem do
tecido onde se insere, como por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas. As células-
tronco ainda podem ser classificadas como oligopotentes, que podem originar células de
diferentes linhagens celulares de um mesmo tecido, como as células-tronco neurais.
Existem também aquelas que originam apenas um tipo celular, com função repositora,
como as células-tronco da epiderme, chamadas unipotentes (FRIEL et al., 2005).
Essa série de características particulares das células-tronco determina o seu
importante papel na terapia de diversas doenças, sendo utilizadas tanto na medicina
humana, como na medicina veterinária, e em sua maioria obtidas, pós-natal, de amostras
da medula óssea (BYDLOWSKI et al., 2009).
Existem dois tipos de células-tronco potencialmente úteis para medicina:
células-tronco embrionárias e células-tronco adultas. O potencial de diferenciação das
primeiras está bem caracterizado em camundongos e em humanos, no entanto seu uso
em terapia celular e em pesquisa tem sido dificultado por questões de
histocompatibilidade, segurança e ética. Em contraste, as células-tronco adultas não
30
apresentam estes empecilhos, apesar da extensão de sua plasticidade ainda estar sob
investigação (PEREIRA, 2008).
As células-tronco embrionárias são classificadas como totipotentes ou
pluripotentes, sendo encontradas durante o desenvolvimento do pré-embrião. Já as
células-tronco adultas ou células-tronco somáticas, são multipotentes, não
especializadas e já foram identificadas em diferentes órgãos e tecidos, como sangue
periférico, tecido adiposo, sistema nervoso central, músculo, epitélio intestinal, pele,
dente e medula óssea, onde participam da homeostase tecidual, gerando novas células
devido à renovação fisiológica ou injúria sofrida (BJORNSON et al., 1999; CLARKE et
al, 2000; CSAKI et al., 2007). As primeiras células-tronco adultas identificadas foram
às precursoras hematopoiéticas, responsáveis pela produção das células sanguíneas na
medula óssea (ZAGO, 2005).
Atualmente, dentre as células-tronco adultas estudadas, as células-tronco
mesenquimais (CTM) apresentam maior plasticidade, originando tecidos mesodermais e
não mesodermais (ZAGO & COVAS, 2004; MEIRELLES et al., 2006). São células
multipotentes, com alta capacidade de se renovar e diferenciar em células de diversas
linhagens de tecido conjuntivo (BITTENCOURT et al., 2006) como osteoblastos,
condrócitos e adipócitos (KADIYALA et al., 1997a), além de poderem ser obtidas de
diferentes tecidos como medula óssea e tecido adiposo (REBELATTO et al., 2008).
Células-tronco mesenquimais (CTM)
As CTM tem particular importância na medula óssea, sendo responsável pela
manutenção do “nicho da célula-tronco hematopoiética”, regulando sua autorrenovação
e diferenciação in vivo (WILSON & TRUMPP, 2006), estas CTM são formadas por um
grupo heterogêneo de células não hematopoiéticas, que inclui fibroblastos, adipócitos,
precursores osteogênicos e células reticulares (LAZZAROTTO-SILVA, 2009).
A presença de células-tronco não hematopoiéticas na medula óssea foi
primeiramente sugerida pelo patologista alemão Julius Clonheim, em 1867, quando
sugeriu que a medula óssea pudesse ser a fonte de fibroblastos que depositam fibras
colágenas como parte do processo normal de reparo (BYDLOWSKI et al., 2009).
Porém, a comprovação da existência desse tipo de célula na medula óssea só
ocorreu após os estudos de (FRIEDENSTEIN et al., 1966), através da demonstração de
uma cultura de células da medula óssea que tinha capacidade de aderir ao plástico,
31
formar colônias em formato de fuso e semelhante a fibroblastos, sendo estas colônias
derivadas de uma única célula precursora, designada Unidade Formadora de Colônia
Fibroblásticas (UFC-F) (PROCKOP, 1997).
As CTM são consideradas uma linhagem de células-tronco somáticas e estão
presentes em pequenas quantidades em regiões perivasculares de todos os tecidos
adultos, incluindo a medula óssea, o tecido adiposo, o periósteo, o tecido muscular e os
órgãos parenquimatosos (MAMBELLI et al., 1999; MEIRELLES et al., 2008;
ZUCCONI et al., 2009). A medula óssea constitui um dos principais sítios doadores
dessas células, assim como de células-tronco hematopoiéticas e endoteliais
(PITTENGER et al., 1999; MINGUELL et al., 2000).
Inicialmente as CTM foram isoladas do baço e timo. Subsequentemente,
aspirados da medula óssea foram considerados amostras de eleição, por serem mais
acessíveis e apresentarem fontes ricas em CTM. Atualmente, essas vêm sendo isoladas
de vários locais do organismo humano e animal, incluindo cartilagem, periósteo,
sinóvia, líquido sinovial, músculos e tendões (FRIEDENSTEIN et. al., 1966), cérebro
(UCHIDA et al., 2000), tecido adiposo (ZUK et al., 2001), sangue do cordão umbilical
(LEE et al., 2004), e em tecidos fetais como sangue, fígado, medula óssea e do rim
(MIAO et al., 2006). Todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular
comparado com a medula óssea, além de ainda não estarem bem estabelecidas às
condições ideais de cultivo (WEXLER et. al., 2003).
As CTM caracterizam-se por ser uma população de células multipotentes
capazes de se diferenciar e produzir qualquer tipo celular necessário num processo de
reparação, como osteoblastos, condroblastos, hepatócitos, neurônios, células epiteliais,
renais, cardíacas, dentre outras (PITTENGER et al., 1999). Tais características de
plasticidade sugerem que esse tipo celular é o responsável pela manutenção de todos os
tecidos do organismo (CAPLAN, 2009).
As CTM expressam um grande número de moléculas bioativas como as
moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, as citocinas e os receptores
para fatores de crescimento, permitindo interações com demais células (HUSS, 2000;
BOBIS et al., 2006). Essas moléculas atuam modulando a resposta inflamatória,
angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (WAN et
al., 2008; CAPLAN, 2009).
32
As CTM, uma vez isoladas, independente do tecido de origem, podem ser
utilizadas principalmente em terapias celulares. A forma mais antiga de terapia celular é
a transfusão de componentes sanguíneos, um dos procedimentos terapêuticos mais
amplamente utilizados no mundo todo. Porém, o principal foco atual de interesse da
terapia celular é a medicina regenerativa, em que se busca a substituição de células ou
tecidos lesado, senescentes ou perdidos para restaurar sua função. As formas de terapia
celular que despertam as maiores esperanças da comunidade científica e da sociedade
em geral são as terapias com células-tronco (ZAGO, 2005).
Cultivo de células-tronco
O cultivo celular é um conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter
células isoladas fora do organismo, e tem como objetivo a expansão do número dessas
células. Essa expansão é realizada pela manutenção das células em frascos ou placas de
cultivo, em meio apropriado, suplementado com diversos fatores, até que estas atinjam
80-85% de confluência, quando são submetidas à tripsinização, processo no qual são
transferidas e expandidas para mais frascos ou frascos maiores, técnica denominada de
passagem celular, que permite a ampliação do estoque celular e sua utilização em
pesquisas cientificas (FRESHNEY, 2005).
As células isoladas e destinadas ao cultivo celular são mantidas em incubadora a
37ºC com 5% CO2, o que facilita a manutenção do pH do meio, permitindo que as
trocas das células com o meio sejam mais eficientes (FRESHNEY, 2005). Diversos
meios de cultivo já foram testados para manutenção das CTM, dentre eles MEM, Meio
Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos (DMEM), RPMI-1640, Meio Basal de
Eagle (BME), dentre outros, acrescidos de Soro Fetal Bovino (SFB), normalmente na
concentração de 10- 20%, sendo a escolha do meio uma variável importante para o
sucesso do crescimento e diferenciação das CTM em cultivos celulares in vitro (TAPP
et al., 2009).
As CTM podem ser cultivadas em meio de cultivo completo, em frascos ou
placas de cultura, nos quais elas se aderem, começam a se proliferar e formam as UFC-
F (KRAMPERA et al., 2006). Essas células se tornam uma população aderente cada vez
mais homogênea e de acordo com estudos de caracterização com CTM humanas, tem
potencial para se proliferarem sem se diferenciarem por até 40 passagens (HORWITZ et
al., 1999; PITTENGER et al., 1999).
33
A separação de células para o cultivo pode ser efetuada através de diversos
gradientes de densidade de alto peso molecular. Dentre eles estão o Ficoll-Hypaque®,
Histopaque®, Isolymph® e Nycomed®, os quais apresentam a função de isolar
linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da medula óssea (ISLAM,
1995). O gradiente de densidade Ficoll tem merecido destaque, por ser de fácil
aplicabilidade, rápido e favorecer a concentração de células mononucleares, atingindo
altos níveis de rendimento celular (OLIVEIRA, 2009). O princípio da técnica de
separação baseia-se na densidade do gradiente em relação aos linfócitos, monócitos e
plaquetas, os quais não conseguem penetrar pelo gradiente. Esses se depositam na
interface entre o Ficoll e o plasma, formando o chamado “anel celular”. A migração
celular durante o processo de centrifugação com o Ficoll resulta na formação de
camadas contendo diferentes tipos celulares (Amersham BIOSCIENCES, 2002).
Nos primeiros estudos para separação de células-tronco foi utilizado Percoll®,
que apresenta o mesmo funcionamento dos outros gradientes de densidade
apresentados. Com o mesmo propósito, WAGNER et al. (2005) utilizaram Biocoll®,
com sucesso, para isolamento da medula óssea de humanos e DVORAKOVA et al.
(2008) utilizaram Ficoll-paque®. Sung et al. (2008) realizaram isolamento das CTM da
medula óssea de camundongos com Histopaque®.
Em uma variação do protocolo original de separação e isolamento de células-
tronco, a medula óssea coletada de camundongo é centrifugada e as células resultantes
são lavadas com meio de cultivo e então semeadas em frasco de cultivo (TROPEL et al.,
2004; Lennon & Caplan, 2006). Nesse caso, as células não aderentes são removidas
após três dias, removendo-se dessa forma as células sanguíneas e excluindo-se o uso de
um separador por gradiente de densidade.
O cultivo de CTM é feito selecionando-se as células com propriedade de adesão
ao plástico, sendo que as células que permanecem em suspensão são facilmente
removidas. Os outros tipos celulares “contaminantes” como os macrófagos, são
eliminados após um determinado número de passagens em cultura (JAVAZON et. al.,
2004). Estas células aderentes são heterogêneas e ficam inativas por dois a quatro dias,
quando começam a proliferar rapidamente. Após várias passagens em cultura, as células
aderentes se tornam fibroblastóides (BYDLOWSKI et al., 2009).
Toda CTM não diferenciada exibe morfologia fibroblástica e padrão
característico de marcadores de superfície (MARTIN et al., 2002). Esses critérios,
34
juntamente com a habilidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, têm sido
usados para definição de um protótipo de fenótipo para CTM que seja consistente entre
as diferentes espécies (MARTIN et al., 2002), incluindo rato (WOODBURY et al.,
2000), camundongo (PHINNEY et al., 1999), cão (KADIYALA et al., 1997b) e
humano (PITTENGER et al., 1999).
O padrão ouro para a identificação das CTM foi estabelecido por PITTENGER
et al. (1999) como “fibroblastos capazes de se diferenciarem em três linhagens
principais: osteoblástica, adipocítica e condrocítica”. Essa definição funcional permite a
afirmação da natureza de uma população das CTM na ausência de marcadores
específicos. Além desses tipos, as CTM podem ser expandidas ex vivo e induzidas in
vitro a se diferenciar em diferentes tipos celulares esqueléticos encontrados em vários
estágios do desenvolvimento, assim como em sítios anatômicos específicos. Tais tipos
celulares incluem osteoblastos (osso), condrócitos (cartilagem), adipócitos (estroma
medular), fibroblastos (periósteo), e células reticulares (estroma medular) (BIANCO et
al. 2008). Além de sofrer diferenciação não convencional tanto in vitro como in vivo,
formando células do tipo neural, endodermal, e cardiomiócitos, derivadas, portanto, de
folhetos embrionários diferentes do mesenquimal.
Laboratorialmente, as células mesenquimais isoladas e posteriormente
expandidas podem ser conduzidas a diferenciação em múltiplas linhagens fenotípicas,
quando cultivadas em meios específicos contendo fatores de crescimento ou outras
substâncias como dexametasona, indometacina, hidrocortisona e fatores de crescimento
de transformação (TGF-β) (JONES et. al., 2002).
Apesar dos avanços obtidos no emprego de células-tronco como auxiliares no
tratamento de inúmeras enfermidades, muitos questionamentos ainda não foram
esclarecidos. Assim, é possível argumentar que a grande preocupação acerca dos fatores
de sucesso e insucesso dos procedimentos de cultura celular tem relação com o número
de células obtidas nas colheitas, sua diferenciação e viabilidade nos meios utilizados
(PEREIRA et al., 2008), principalmente, quando se trata das células com potencial
reparador, as chamadas células-tronco mesenquimais (PROCKOP et al., 2003).
Uso das CTM na Medicina Veterinária
Diversos estudos vêm sendo realizados na Medicina Veterinária com o intuito de
isolar e caracterizar as CTM a partir de amostras de vários tecidos celulares, e de
35
diferentes animais. Essas pesquisas têm como objetivos elaborar protocolos padrões
para separação, isolamento, cultivo e caracterização destas células, de forma a contribuir
para o seu uso em terapias humanas e animais, principalmente no tocante a tratamentos
visando à recuperação de lesões, sejam elas ósseas, epiteliais, dentre outras.
Inicialmente, os trabalhos envolvendo animais como ratos e camundongos foram
realizados, principalmente, com objetivo de utilizar um modelo animal para pesquisas
com humanos, como os trabalhos de BARROS et al. (2001) que utilizaram células-
tronco na reparação de falhas experimentais em rádio de coelhos, e de ARGÔLO NETO
(2009) e MONTEIRO (2009) que utilizaram culturas de CTM marcadas pela proteína
fluorescente verde em aplicações autógenas in situ, no tratamento de lesões epiteliais de
pacientes diabéticos e de lesões ósseas na calota craniana, demonstrando cicatrização
das feridas cutâneas em camundongos diabéticos e reparação de defeitos ósseos críticos,
respectivamente.
Atualmente, as pesquisas em Medicina Veterinária têm utilizado felinos,
caninos, equinos, ovinos e caprinos. Em gatos, MARTIN et al. (2002) realizaram o
isolamento e caracterização de CTM provenientes de amostras da medula óssea.
Estudos realizados com cães isolaram estas células da medula óssea (CSAKI et al.,
2007), tecido adiposo e medula óssea (Silveira et al., 2009) e do cordão umbilical (LEE
et al., 2013).
Em equinos já foi comprovado o isolamento deste tipo celular em tecido adiposo
(CARVALHO et al., 2009), cordão umbilical (REED & JONHSON, 2012), e medula
óssea (Seo et al., 2012), sendo realizadas diversas pesquisas voltadas para o uso de
células-tronco na reparação de lesões como de tendões, articulações e ligamentos
(PACINI et al., 2007; GODWIN et al., 2012; SOLE et al., 2012; FERRIS et al., 2013).
Isolamento de células-tronco também foram realizados em ratos (KADIYALA et
al., 1997ª; LENNON & CAPLAN, 2006), camundongos (BITTENCOURT et al., 2006;
YAMAMOTO et al., 2007; SUNG et al., 2008), ovinos, sendo utilizadas amostra de
tecido adiposo e cordão umbilical (FADEL et al., 2011) e em tecido adiposo e fluido
amniótico de caprinos (REN et al., 2012; PRATHEESH et al., 2013).
Considerações finais
A capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares das células-tronco
mesenquimais é de grande interesse da comunidade cientifica devido, principalmente, a
36
sua importância para o sucesso das terapias celulares, reestabelecendo de maneira mais
rápida o funcionamento normal de tecidos lesados.
Atualmente, com o avanço do conhecimento sobre células-tronco e das técnicas
moleculares, a ciência conseguiu gerar informações importantes para o diagnóstico e
tratamento de diversas doenças. Dessa forma, os avanços nas pesquisas sobre terapias
celular têm colaborado para o bem-estar animal, proporcionando uma melhor qualidade
de vida, redução da dor e do período de recuperação dos mesmos.
Considerando a vasta capacidade das CTM, pesquisas mais abrangentes,
destinadas a outros interesses médico-veterinários, poderiam ser realizadas com o
intuito de ampliar a utilização e importância destas células. A implementação de
linhagens de células-tronco como ferramenta para o isolamento de patógenos em cultivo
celular se apresenta como potencial alternativa as pesquisas com células
indiferenciadas, não se restringindo apenas ao seu uso em terapias regenerativas.
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Recebido em 10/03/2014
Aceito em 14/05/2014
44
7. CAPÍTULO 2
ISOLATION, CULTURE AND CHARACTERIZATION OF MULTIPOTENT
MESENCHYMAL STEM CELLS FROM GOAT UMBILICAL CORD BLOOD
Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira, aceito para publicação em 13 de outubro de
2016.
45
ABSTRACT
Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and
organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived
multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and
amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these
cells. However, it has not been demonstrated the MSC isolation from the goat UCB.
Therefore, the aims of the present study were to isolate, culture and characterize goat
umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB
by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10%
or 20% FBS. It was performed FACS analysis and induction lineage differentiation for
characterize these cells. These cells exhibited two different populations in flow
cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but
negative staining for CD34 in larger cells; and positive stained for CD90 and CD105,
but negative for CD44 and CD34, in the smaller cells. MSC from goat UCB showed
capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific
differentiation medium. Present study establishes that goat mesenchymal stem cells can
be derived successfully from umbilical cord blood.
46
Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells
from goat umbilical cord blood
Gabrielle R. Martins2*, Rebeca C. Marinho
2, Rosivaldo Q. Bezerra-Junior
2, Lilia M. C.
Câmara3, Luiz C. Albuquerque-Pinto
3, Maria F. S. Teixeira
2,4
ABSTRACT - Gabrielle R. Martins2*, Rebeca C. Marinho2, Rosivaldo Q. Bezerra-
Junior2, Lilia M. C. Câmara3, Luiz C. Albuquerque-Pinto3, Maria F. S. Teixeira2,4.
2016. Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells
from goat umbilical cord blood. Laboratório de Virologia, Núcleo de Pesquisa em
Sanidade Animal, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade
Estadual do Ceará, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, CEP 60.714.903, Fortaleza, CE,
Brazil. Email corresponding author: [email protected].
Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and
organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived
multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and
amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these
cells. However, it has not been demonstrated the MSC isolation from the goat UCB.
Therefore, the aims of the present study were to isolate, culture and characterize goat
umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB
by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10%
or 20% FBS. It was performed FACS analysis and induction lineage differentiation for
characterize these cells. These cells exhibited two different populations in flow
cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but
negative staining for CD34 in larger cells; and positive stained for CD90 and CD105,
but negative for CD44 and CD34, in the smaller cells. MSC from goat UCB showed
capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific
differentiation medium. Present study establishes that goat mesenchymal stem cells can
be derived successfully from umbilical cord blood.
INDEX TERMS: MSC, caprine, flow cytometry, stem cell, lineage differentiation.
_______________________
1- Received on June 06, 2016.
Accepted for publication on October 13, 2016.
2- Laboratório de Virologia, Núcleo de Pesquisa em Sanidade Animal; Programa
de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dr.
Silas Munguba, 1700, Itapery, Fortaleza, CE, CEP 60.714.903, Brazil. * Email
corresponding author: [email protected].
3- Laboratório de Imunologia, Programa de Pós-graduação em Microbiologia
Médica, Universidade Federal do Ceará, Rua Alexandre Baraúna, 994, Rodolfo Teófilo,
Fortaleza, CE, CEP 60430-160, Brazil.
4- Bolsista Produtividade em Pesquisa-CNPq
RESUMO. – [Isolamento, cultura e caracterização de células tronco mesenquimais
multipotentes provenientes do sangue do cordão umbilical caprino.] As células tronco
mesenquimais (MSC) residem em pequenas quantidades em muitos tecidos e órgãos
adultos, desempenhando um papel ativo na homeostase destes locais. O isolamento de
MSC já foi demonstrado em amostras de medula óssea, tecido adiposo e fluido
amniótico de cabras. O sangue de cordão umbilical é considerado uma fonte importante
47
desse tipo de células. No entanto, até o presente momento, não foi demonstrado o
isolamento de MSC provenientes do sangue de cordão umbilical de cabras. Dessa
forma, o objetivo do presente estudo foi isolar, cultivar e caracterizar células tronco
mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino. As MSC foram
isoladas utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Paque e cultivadas em DMEM
suplementado com 10% ou 20% de FBS. A caracterização desse tipo celular foi
realizada através de análise por citometria de fluxo e diferenciação em linhagens
celulares mesodermais. A analise no citômetro de fluxo demonstrou a presença de duas
populações distintas, um grupo com células maiores e outro com células menores;
observando expressão positiva de CD90, CD44 e CD105, e negativa para CD34 nas
células maiores; enquanto que as menores foram positivas para CD90 e CD105, mas
negativas para CD44 e CD34. As células isoladas demonstraram capacidade de se
diferenciar em condrócitos e osteoblastos quando incubadas com meio de diferenciação
específico. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais podem ser
obtidas com sucesso do sangue do cordão umbilical caprino.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: MSC, caprino, citometria de fluxo, células tronco,
diferenciação em linhagens.
INTRODUCTION
Mesenchymal stem cells (MSC), first obtained from bone marrow aspirate, have
a great plasticity and are able to differentiate into bone, cartilage, fat tissue and even
muscle (Pountos and Giannoudis, 2005). MSC was originally described for Friedenstein
et al. (1968) in bone marrow as a component of the marrow stromal cell population that
collectively supports hematopoietic stem cell persistence and differentiation. However,
since this initial description, it is now recognized that MSC reside in small numbers in
many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites.
These cells can be isolated from others different tissues, such as the umbilical cord
blood and matrix, adipose tissue, synovial membranes, embryonic tissue, and amniotic
fluid (Chang et al. 2006; Lee et al. 2013; Orbay et al., 2012; Pratheesh et al., 2013; Ren
et al., 2012; Reed and Jonhson, 2012).
Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of many types of
stem cells, including hematopoietic stem cells (HSC), endothelial progenitors,
mesenchymal stem cells (MSC), very small embryonic/epiblast-like (VSEL) stem cells,
and unrestricted somatic stem cells (USSC), potentially suitable for use in regenerative
medicine (Pelosi et al., 2012). Researches with UCB stem cells still face some
difficulties, mainly during the isolation process (Mareschi et al., 2001; Wexler et al.,
2003). MSC was isolated from umbilical cord of human (Chang et al., 2006; Lee et al.,
48
2004), sheep (Fadel et al., 2011), equine (Reed and Johnson, 2012) and canine (Lee et
al., 2013).
Minimum criteria for the characterization of human MSC were created. These
should present adherence to the plastic, positive expression for the surface markers
CD105, CD73 and CD90, negative expression for the markers CD45, CD34, CD14 or
CD11b, CD79a or CD19 and the HLA-DR surface molecules, and present the capability
to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes in vitro (Dominici et al.,
2006). However, one major difficulty in characterizing MSC in veterinary medicine is
due to the low number of specific monoclonal antibodies available and evidence that
certain markers from human and mouse do not present a cross-reaction with others
species (Taylor et al., 2007). There is a large number of a positive marker described, but
each group of investigators using different markers, none specific or single. Perhaps the
differences between studies may be attributed to variations in culture methods or stage
of cells differentiation (Bydlowski et al., 2009).
Mesenchymal stem cells have low immunogenicity, thus allowing their potential
use in regenerative medicine. Human MSC (hMSC) are characterized by the low
expression of the major histocompatibility complex class I and are described by their
immunomodulatory effect on immune system cells. Additionally, hMSC fail to induce
proliferation of allogeneic or xenogeneic lymphocytes, causing effects on B lymphocyte
function, inhibiting its differentiation into plasma cells, and showed to interfere with
dendritic cell differentiation, maturation, and function (Krampera et al., 2003; Jiang et
al., 2005). In equines, preliminary studies examining the use of umbilical cord and
placentally derived MSC have suggested that such cells do not incite a cellular immune
response, even after repeated injections (Carrade et al., 2011a,b). It is important to
recognize that MSC from neonatal sources are likely more immune-privileged than
those derived from adult sources. MSC are remarkable potential as a cell mediate repair
and regenerative medicine for fatal or incurable diseases, such as spinal cord injury,
arthritis, and ischemic heart injury, has been demonstrated in the field of stem cell
therapy (Hatami et al., 2009; Pittenger and Martin, 2004; Sharp et al., 2010).
Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow (Zhang
et al., 2012), adipose tissues (Ren et al., 2012), and amniotic fluid (Pratheesh et al.,
2013). However, it has not demonstrated the isolation of mesenchymal stem cells from
the goat umbilical cord blood. Therefore, the aims of the experiments in this study were
49
to isolate, phenotypically characterize and investigate the differentiation potentials of
goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells.
MATERIALS AND METHODS
Animals and samples. All experiments were approved by the Ethics Committee for
Animal Use at the State University of Ceará, protocol number 127.769.79-0. For this
study, mongrel pregnant goats were used, aged between two and three years and free of
infection by SRLV. Blood samples were collected during calving. After birth, the goat
umbilical cord was clamped in the end next to the fetus, and the umbilical cord blood
(UCB) was harvested by syringe aspiration and packed in sterile tube with EDTA
(Ethylenediamine tetraacetic acid). The samples were transported within 2h to the
laboratory, packed in isothermal box with ice.
Isolation and culture. Mesenchymal stem cells were isolated from goat UCB by
Ficoll-Paque density centrifugation (600g for 10 min) and cultured in low glucose
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Gibco®, Grand Island, NY, USA)
supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL
amphotericin and 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco®, Grand Island, NY, USA).
The cells were seeded in A25 cell culture flasks and cultured at 37 °C in a CO2
incubator (5% CO2). After 4-5 days growth, fibroblast-like plastic-adherent cells were
observed. The media was changed after 5 days to avoid any mechanical stress, and
thereafter, it was replenished every third day until obtain confluent cell monolayer. It
was observed slow growth, due to this; it was increased FBS concentration for 20%,
promoting a better cell growth. At 80% confluence, cells were trypsinized (0,25%
Trypsin-EDTA, Gibco®, Grand Island, NY, USA) and reseeded in new cell culture
flask for expand the cell stock. For all the experiments, mesenchymal stem cells were
taken from third passage, whereas rest of the cells was allowed to grow further.
Chondrogenic differentiation. Chondrogenic differentiation was induced in
micromass cultures by seeding 5 μL droplets of cell solution (1.6 × 107 viable cells/mL)
in the center of 24-well plate. The cells were incubated with DMEM supplemented with
300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL amphotericin and 10% FBS
for 2 hours. Afterward, the cells were fed with a specific chondrogenesis differentiation
medium (StemPro®, Gibco®, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced
50
every 2-3 days. After 14 days, chondrogenic differentiation was confirmed by staining
for Alcian Blue (Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA).
Osteogenic differentiation. To induced osteogenic differentiation, the cells from the
confluent monolayer of the third passage (5 x 103 cells/cm²) were seeded in to a 24-well
plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL
streptomycin, 0,5 mg/mL amphotericin and 10% FBS. After 24h, the medium was
discarded, and cells were cultured in StemPro® Osteocyte Differentiation Basal
Medium (StemPro®, Gibco®, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced
every 2-3 days. After 14 days of culture, osteogenic differentiation of stem cells was
confirmed by Alizarin Red S staining (Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA).
Adipogenic differentiation. For adipogenic differentiation, trypsinized cells (1 x 104
cells/cm²) were seeded into a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented
with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL amphotericin and 10%
FBS. After 24 h, the medium was discarded, and the cells were incubated with
StemPro® Adipogenesis Differentiation Basal Medium (Gibco®, Grand Island, NY,
USA). The differentiation medium was replaced every 3-4 days. After 14 days of
culture, the cells were fixed with 10% formalin at room temperature, washed with PBS,
and stained with 0,5% Oil-Red O (Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA) for 15 min
and Mayer’s Hematoxylin (Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA) for 5 min to visualize
lipid droplets.
FACS analysis. FACS analysis was performed to investigate the expression of the
surface markers CD90 FITC, CD105 APC, CD44 PE and CD34 APC in goat umbilical
cord blood derived MSC after the third passage. The cells were harvested and aliquoted
at a density of 3,2 x 106 cells/mL for each marker assay. These cells were incubated
with antibodies against surface markers [mouse anti-Human CD90 FITC, CD105 APC,
CD44 PE and CD34 APC (BD Biosciences®, USA)] for 30 min at 4 °C in the dark.
Thereafter, the cells were washed twice with FACS buffer washes, fixed with
formaldehyde buffer (PBS with formaldehyde 1%) and analyzed using a flow cytometer
(FACS Calibur BD, BD Biosciences®). The negative control was processed in similar
manner but without antibodies. The data obtained was analyzed using Flowjo® software
and plotted as single parameter histogram.
51
RESULTS
Growth and culture characteristics of MSC
MSC from goat umbilical cord blood began to adhere after 4-5 days of culture,
first with a small, round, polygons and fibroblast-like cells, with some others types of
blood cells (Fig. 1A). Gradually, they extended into small or large spindles, with
uniform fibroblast-like morphology (Fig. 1B). Initially, the cells were being grown in
DMEM supplemented with 10% FBS, however, the cells showed slow growth, not
reached confluence, even after 15 days of incubation. In order to provide the best
growth of these cells, the FBS concentration was changed for 20%. Cells culture in 20%
FBS reached to 80-85% confluence faster about 8 days than those in 10% FBS in the
same inoculation condition (Fig. 1C). MSC showed a typical fibroblast-like morphology
after passage, with mix of short and long spindles. Cells at passage 3 were used in the
differentiation and FACS analysis tests, whereas rest of the cells were allowed to grow
further, and it observed that the growth and proliferation activity reduced with aging.
Chondrogenic differentiation
The chondrogenic potential of MSC from goat umbilical cord blood was
evaluated by in vitro micromass cultures of these cells in a specific differentiation
medium. After 14 days of incubation, the accumulation of sulfated proteoglycans was
visualized by positive Alcian Blue staining (Fig. 2A).
Osteogenic differentiation
In osteogenic differentiation, cells proliferated and reached to complete
confluence after 8-10 days of incubation with differentiation medium. The cellular
aggregates were then observed and were characterized by calcium deposits, which
demonstrated by positive Alizarin Red stain (Fig. 2B).
Adipogenic differentiation
Adipogenic differentiation of goat umbilical cord blood derived mesenchymal
stem cells was not confirmed. After incubated these cells with adipogenic-inducing
medium for 14 days, sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets were
observed in the cytoplasm by Oil Red-O staining (Fig. 2C).
Surface antigen profile by FACS analysis
The study of cells by flow cytometry revealed the presence of two distinct
populations of cells. The populations differed in size, being characterized as small or
52
large cells according to the characteristics of size and granularity observed. It evaluated
the immunophenotypic characteristics through presence of surface molecules comparing
both groups to negative control group.
FACS analysis revealed the positive expression of CD90 (52%), CD44 (19%) and
CD105 (15%), but negative staining for CD34 (2%) in larger cells. The smaller cells
were positive for CD90 (32%) and CD105 (12%), but negative for CD44 (3%) and
CD34 (1%). It observed difference about the fluorescent intensity in the groups. The
larger cells showed major fluorescent intensity to CD90 than small cells. Negative
control group of cells, which was processed in similar manner but without antibodies in
the incubation, didn’t show any expression of surface molecules analyzed. Negative
control wasn’t shown expression, It was represented in the graph area with fluorescent
intensity less than 10¹ (Fig.3).
DISCUSSION
Umbilical cord blood represents a potentially important source of mesenchymal
stem cells. These cells can be defined as multipotent stem cells capable of
differentiating into different tissue cell types, including adipocytes, osteocytes,
chondrocytes, myocytes and neuron-like cells. The main source of MSC is represented
by marrow; however, UCB represents an important alternative source for generation of
MSC (Lee et al., 2004). The umbilical cord is composed of several different parts
(amniotic membrane, umbilical cord matrix, umbilical cord vein, and umbilical cord
blood) that are available as source of MSC (Lee et al., 2013). In this study, MSC was
isolated from goat umbilical cord blood and first, cultured in DMEM supplemented with
10% FBS, however, the cells showed slow growth. In order to provide the best growth
of these cells, the FBS concentration was changed for 20% that demonstrated high
efficiency to maintenance the culture, and contributed for quick amplification of cell
stock. Several culture media have been tested for maintenance of MSC as MEM,
DMEM, RPMI-1640 and Basal Medium Eagle (BME), supplemented with FBS,
generally at concentration of 10-20%. The choice of the medium culture is important to
success of MSC growth in the in vitro cell culture (Tapp et al., 2009). MSC were highly
dependent on serum for growth. Cells cultured in 20% FBS reached to 80–85%
53
confluence faster than those in 10% FBS in the same inoculation density (Im et al.,
2005).
This is a first study that isolated MSC from goat UCB. It was observed different
morphologic phenotypes in primary culture of MSC from goat UCB, but, gradually the
cells exhibited uniform fibroblast-like morphology. Goat derived multipotent MSC have
been established from bone marrow (Zhang et al., 2012), adipose tissues (Ren et al.,
2012), and amniotic fluid (Pratheesh et al., 2013) that observed similar morphology in
the same culture conditions.
Phenotypic characterization was performed by flow cytometry. The general
strategy for identifying in vitro cultivated mesenchymal stem cells as per ISCT
(International Society for Cytotherapy) is to analyze the expressions of cell-surface
markers such as CD-73, CD-44, CD-90 and CD-105 (Dominici et al., 2006; Donzelli et
al., 2007). During the FACS analysis was observed two different populations, small and
large MSC. Large MSC are positive for CD90, CD105 and CD44, whereas negative for
CD34 surface marker. Small MSC are positive for CD90, CD105, but negative for
CD44 and CD34. Differences in fluorescent intensity were observed, and large cells
showed more intensity than small cells, mainly in CD90 marker expression. This result
can be compared with others studies, Ren et al. (2012) described MSC from goat
adipose stained positively for vimentin, CD49d and CD13, and negatively for CD34 and
CD106. Caprine mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid were positive for
CD90, CD105, CD73, and negative for CD34 (Pratheesh et al., 2013). Fadel et al.
(2011) isolated MSC of ovine umbilical cord that were positive for CD44 and negative
for CD38, CD41/61 and CD45. Lee et al. (2013) demonstrated by FACS analysis that
canine umbilical cord matrix derived MSC were positive for CD44, CD90, CD 105, and
CD184, whereas negative for the other CD markers such as CD29, CD33, CD34 and
CD45.
CD90 has been known as a negative regulator for hematopoietic proliferation
(Mayani and Lansdrop, 1994), its expression associate CD34 negative staining confirm
that there was no evidence of hematopoietic precursors in this culture. The levels
expression of surface markers are also different in others studies. Chang et al. (2006)
isolated cells from human UCB, and observed two different morphologic phenotypes:
flattened fibroblastic clones and spindle-shaped fibroblastic clones. CD90 was
differently expressed by these two cell populations. Spindle-shaped clonogenic MSC
54
expressed a high level of CD90, while flattened clonogenic MSC showed negative
expression of CD90.
CD105 is usually express in mesenchymal stem cells. CD34 is a surface marker
of hematopoietic stem cells (HSC) and is expressed in lymph nodes, bone marrow HSC,
and various endothelial cells. CD34 negative staining demonstrated that cells were not
derived from circulating stem cells (Peng and Huard, 2004; Pittenger et al., 1999).
CD44 is a hyaluronate receptor. The positive staining for CD44 antibody in flow
cytometry argued with that published by Barry et al. (1999) and Martínez et al. (2009).
These studies showed that CD44 is an antibody that characterizes mesenchymal cells
for human and sheep fat tissue derived cells. In case of rabbits, CD44 is negative,
according to researches published by Martínez et al. (2009).
The differentiation potentials of MSC from goat UCB were investigated. These
cells showed capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated
with specific differentiation medium. Pratheesh et al. (2013) demonstrated that MSC
from goat amniotic fluid, like their marrow counterparts, were able to differentiate into
adipose cells in addition to osteogenic and chondrogenic lineages. Goat adipose-derived
stem cells showed the same differentiation potential (Ren et al., 2012). Chang et al.,
2006 investigated the same capability in MSC from human UCB and results showed
that both types of clonogenic MSC (flattened fibroblastic clones and spindle-shaped
fibroblastic clones) could differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages under
appropriate conditions. However, in adipogenic induction, the spindle shaped MSC
exhibited many typical neutral lipid vacuoles within the cells as mature adipocytes,
while the flattened MSC only contained sparsely small lipid droplets or even no lipid
droplets at all. It was reported that UCB-derived MSC showed a reduced capability to
undergo adipogenesis (Bieback et al., 2004). Recently, we have also found that UCB-
derived MSC have lower adipogenic potential than bone morrow-derived MSC in vitro
(Chang et al., 2006). In this study, it was observed similar results, the MSC from goat
UCB have lower adipogenic potential. However, the cell showed high capability to
undergo chondrogenesis and osteogenesis.
CONCLUSION
Present studies establishes that goat mesenchymal stem cells can be derived
successfully from umbilical cord blood, which exhibit morphology, growth characters,
55
immunophenotype and lineage differentiation potential similar with MSC of other
origins. These results collaborate to advances in research and treatments using stem
cells, demonstrating the potential and isolation as protocol of this cell type in goats.
MSC have low immunogenicity, thus allowing their potential use in regenerative
medicine.
Acknowledgements.- This work was supported by the National Council of Scientific
and Technological Development (CNPq), grant numbers 487425/2012-0 and
308995/2013-9, and by Personnel Improvement Coordination higher level (CAPES),
which provided a PhD scholarship. The authors are thankful to the Post Graduate
Program in Veterinary Science (PPGCV) of the State University of Ceará for supporting
the implementation of the experiments; to the Federal University of Ceará, particularly
to Lilia Maria Carneiro Câmara, PhD, for unconditional support in performing the
FACS analysis; and to Marcos Fábio Gadelha Rocha, PhD, and Júlio Sidrim, PhD (Post
Graduate Medical Microbiology – UFC). The authors also express their gratitude to
owners of the farms that allowed the use of their animals for this study.
Conflict of interest statement.- The authors have no competing interests.
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59
Fig.1. Morphological features of MSC derived from goat UCB. (A) Primary culture
after 4-5 days. (B) Short or long spindles, with uniform fibroblast-like morphology. (C)
Typical fibroblast-like morphology with 80-85% confluence.
60
Fig.2. (A) Positive staining of Alcian Blue showed the chondrogenic differentiation. (B)
Positive Alizarin Red stain showed osteogenic differentiation. (C) Sparsely small lipid
droplets or even no lipid droplets in the cytoplasm, showed lower adipogenic potential.
61
Fig.3. Comparison of cell surface marker profiles between two types of MSC. (A) Large
fibroblastic MSC. (B) Small fibroblastic MSC. Both types of MSC at passage 3 were
analyzed by flow cytometry with antibodies against the indicated antigens. Calibrated
histogram representing standard number of events in the Y-axis; and fluorescent
intensity on X-axis. Negative control was shown in the graph area with fluorescent
intensity less than 10¹.
62
8. CAPÍTULO 3
GOAT UMBILICAL CORD CELLS ARE PERMISSIVE TO SMALL
RUMINANT LENTIVIRUS INFECTION IN VITRO
Periódico: Brazilian Journal of Microbiology, volume 48, págs. 125-131, 2017.
63
ABSTRACT
Small ruminant lentiviruses isolated from peripheral blood leukocytes and target organs
can be propagated in vitro in fibroblasts derived from goat synovial membrane cells.
These cells are obtained from tissues collected from embryos or fetuses and are
necessary for the establishment of the fibroblast primary culture. A new alternative type
of host cells, derived from goat umbilical cord, was isolated and characterized
phenotypically with its main purpose being to obtain cell monolayers that could be used
for the diagnosis and isolation of small ruminant lentiviruses in cell culture. To
accomplish this goal, cells were isolated from umbilical cords; characterized
phenotypically by FACS analysis; differentiate into osteogenic, chondrogenic and
adipogenic lineage; and submitted to viral challenge. The proliferation of goat umbilical
cord cells was fast and cell monolayers formed after 15 days. These cells exhibited
morphology, immunophenotype, growth characteristics, and lineage differentiation
potential similar to MSCs of other origins. The goat umbilical cord derived cells stained
positive for vimentin and CD90, but negative for cytokeratin, CD34 and CD105
markers. Syncytia and cell lysis were observed in cell monolayers infected by CAEV-
Cork and MVV-K1514, showing that the cells are permissive to small ruminant
lentivirus infection in vitro. These data demonstrate the proliferative competence of
cells derived from goat umbilical cords and provide a sound basis for future research to
standardize this cell lineage.
64
GOAT UMBILICAL CORD CELLS ARE PERMISSIVE TO SMALL
RUMINANT LENTIVIRUS INFECTION IN VITRO
Gabrielle R. Martins¹, Rebeca C. Marinho¹, Rosivaldo Q. Bezerra Junior¹;
Antoniel de O. Alves¹, Lilia M. C. Câmara², Luiz C. Albuquerque-Pinto², Maria F.
da S. Teixeira¹
1- Laboratório de Virologia, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias,
Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
2- Laboratório de Imunologia, Programa de Pós-graduação em Microbiologia
Médica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
Abstract
Small ruminant lentiviruses isolated from peripheral blood leukocytes and target organs
can be propagated in vitro in fibroblasts derived from goat synovial membrane cells.
These cells are obtained from tissues collected from embryos or fetuses and are
necessary for the establishment of the fibroblast primary culture. A new alternative type
of host cells, derived from goat umbilical cord, was isolated and characterized
phenotypically with its main purpose being to obtain cell monolayers that could be used
for the diagnosis and isolation of small ruminant lentiviruses in cell culture. To
accomplish this goal, cells were isolated from umbilical cords; characterized
phenotypically by FACS analysis; differentiate into osteogenic, chondrogenic and
adipogenic lineage; and submitted to viral challenge. The proliferation of goat umbilical
cord cells was fast and cell monolayers formed after 15 days. These cells exhibited
morphology, immunophenotype, growth characteristics, and lineage differentiation
potential similar to MSCs of other origins. The goat umbilical cord derived cells stained
positive for vimentin and CD90, but negative for cytokeratin, CD34 and CD105
markers. Syncytia and cell lysis were observed in cell monolayers infected by CAEV-
Cork and MVV-K1514, showing that the cells are permissive to small ruminant
lentivirus infection in vitro. These data demonstrate the proliferative competence of
cells derived from goat umbilical cords and provide a sound basis for future research to
standardize this cell lineage.
Key-words: CAEV, MVV, CELL CULTURE, MSC, FLOW CYTOMETRY
Introduction
The small ruminant lentivirus (SRLV) comprises two types of viruses, the
Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV) and the Maedi Visna virus (MVV); both of
which are widely distributed throughout the world. CAEV and MVV share genetic
similarities, molecular mechanisms of replication, morphology and similar biological
interactions in their hosts. These lentiviruses cause persistent infections, including
encephalitis, arthritis, progressive pneumonia, and mastitis in goats and sheep. Like
other lentiviruses, CAEV and MVV infect cells of the monocyte/macrophage lineage
and dendritic cells.1,2
65
CAEV and MVV can replicate in primary fibroblasts derived from synovial
membranes or from choroid plexus cultures,3,4
and can also replicate in the
immortalized TIGEF cell line (T Immortalized Goat Embryonic Fibroblast).5 These
cells are obtained from the tissues collected from embryos or fetuses and are necessary
for the establishment of the fibroblast primary culture.
An alternative method would involve using cells derived from goat umbilical
cords, which is an invaluable tool that does not use embryos or fetuses. Generally, the
umbilical cord would be discarded after calving. However, it is an excellent source
material, rich in cells that are able to originate several cell types. The umbilical cord is a
well-known source of mesenchymal stem cells (MSCs), which have been isolated and
characterized in umbilical cord samples from canine,6 equine
7 and ovine
8 species. MSCs
are a multipotent adult stem cell.9
Undifferentiated MSCs exhibit fibroblast-like morphology and are characterized
phenotypically by the expression of surface markers; however, the characterization of
these cells has not yet been fully defined. There are several positive markers described,
and there is a consensus that undifferentiated MSCs should be positive for CD29,
CD44, CD90, CD105, CD73 and negative for CD34, CD45, CD14 and CD3.10,11
MSCs
are multipotent stromal cells capable of differentiating to mesenchymal lineages,
including tissues such as adipose tissue, bone, cartilage and muscle.9,12
The aims of the experiments in this study were to isolate, phenotypically
characterize and investigate the differentiation potentials of cells from goat umbilical
cords (cGUCs), with the main purpose being to obtain cell monolayers for use in the
diagnosis of small ruminant lentiviruses via isolation in cell culture.
Materials and methods
Samples
All experiments were approved by the Ethics Committee for Animal Use at the
State University of Ceará, protocol number 127.769.79-0. For this study, mongrel
pregnant goats were used, aged between two and three years and free of infection by
SRLV.
Three umbilical cord samples were collected during calving. After birth, the goat
umbilical cords were clamped at both ends, i.e., next to the fetus and the goat, and then
cut and packed in the transport medium. The solutions used during transport were low
66
glucose DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Gibco®, Grand Island, NY,
USA), MEM-E (Minimum Essential Medium with Earle’s salt and L-glutamine)
(Gibco®, Grand Island, NY, USA), PBS (phosphate buffered saline) and saline solution
0,9% (SS), supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5
mg/mL amphotericin and 10% FBS. The samples were transported within 2 h to the
laboratory, packed in an isothermal box with ice.
Isolation and culture of cGUCs
The tissue samples were processed in a laminar flow cabinet. The umbilical cord
was washed with PBS to remove blood. The amniotic epithelium surrounding the
umbilical cord was dissociated using sterile scissors and forceps. Tissue samples of
umbilical cord matrix were cut into pieces of 0,5 – 1 cm (explants) and were plated in
A25 cell culture flasks and 6-well culture plates using DMEM-low glucose or MEM-E
supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL
amphotericin and 10% FBS and cultured at 37 °C in a CO2 incubator (5% CO2).
The cell cultures were observed in an inverted microscope every day, until
proliferation of the first cells from the explants had occurred. The media was changed
after 5 days to avoid any mechanical stress, and thereafter, it was replenished every
third day. At 80% confluence, cells were trypsinized (0,25% Trypsin-EDTA, Gibco®,
Grand Island, NY, USA) and reseeded in new cell culture flasks.
Virus infectivity assay
The cells from the confluent monolayer after the third passage were infected
with either the CAEV-Cork or MVV-K1514 strains, provided by Dr. Roberto Soares de
Castro (Federal Rural University of Pernambuco - UFRPE). These strains originated
from the Institut National de la Recherche Agronomique, Lyon-France. The virus
infectivity assay was performed in duplicate for each of three separate experiments. The
cells were incubated with viral suspension 105 TCID50 at a MOI of 1 for 1 h at 37 °C in
a 5% CO2 incubator. Thereafter, the supernatant was discarded and the growth medium
was added (DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin,
0,5 mg/mL amphotericin and 2% FBS).
67
The cell monolayers were observed in an inverted microscope every day until
the cytopathic effect caused by the virus was evident, proving that the cells were
permissive for infection by SRLV.
FACS analysis
FACS analysis was performed to investigate the expression of the surface
markers CD90, CD105, CD34, and the intracellular markers vimentin and cytokeratin in
cGUCs after the third passage. The cells were harvested and aliquoted at a density of
106 cells/ml for each marker assay. First, these cells were incubated with antibodies
against surface markers [mouse anti-Human CD90 FITC, CD105 APC and CD34 APC
(BD Biosciences®, USA)] for 30 min at 4 °C in the dark. Then, the cells were
permeabilized with fixation/permeabilization solution (BD Cytofix/Cytoperm
Fixation/Permeabilization Kit, BD Biosciences®, USA) for 20 min at 4 °C in the dark.
Permeabilized cells were incubated with antibodies against intracellular markers [mouse
anti-Human vimentin PE and cytokeratin PE (BD Biosciences®, USA)] for 30 min at 4
°C in the dark. Thereafter, the cells were washed twice with BD perm/wash buffer (BD
Biosciences®, USA), fixed with formaldehyde buffer (PBS with 1% formaldehyde) and
analyzed using a flow cytometer (FACS Calibur BD, BD Biosciences®). A gate was
defined and the minimum number of events constituting was set to 10,000. The negative
control was processed in a similar manner but without antibodies. The data obtained
was analyzed using Cell Quest Pro software and plotted as a histogram.
Adipogenic Differentiation
For adipogenic differentiation, trypsinized cells (1 x 104 cells/cm²) were seeded
into a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL
penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL amphotericin and 10% FBS. After 24 h,
the medium was discarded, and the cells were incubated with StemPro® Adipogenesis
Differentiation Basal Medium (Gibco®, Grand Island, NY, USA). The differentiation
medium was replaced every 3-4 days. After 14 days of culture, the cells were fixed with
10% formalin at room temperature, washed with PBS, and stained with 0,5% Oil-Red O
(Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA) for 15 min and Mayer’s Hematoxylin (Sigma-
Aldrich®,St. Louis, MO, USA) for 5 min to visualize lipid droplets.
68
Chondrogenic Differentiation
Chondrogenic differentiation was induced in micromass cultures by seeding 5
μL droplets of cell solution (1.6 × 107 viable cells/mL) in the center of a 24-well plate.
The cells were incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300
µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL amphotericin and 10% FBS for 2 hours. Afterward,
the cells were fed with a specific chondrogenesis differentiation medium (StemPro®,
Gibco®, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced every 2-3 days. After 14
days, chondrogenic differentiation was confirmed by staining for Alcian Blue (Sigma-
Aldrich®,St. Louis, MO, USA).
Osteogenic Differentiation
To induce osteogenic differentiation, the cells from the confluent monolayer of
the third passage (5 x 103 cells/cm²) were seeded into a 24-well plate and incubated with
DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/mL streptomycin, 0,5 mg/mL
amphotericin and 10% FBS. After 24 h, the medium was discarded, and cells were
cultured in StemPro® Osteocyte Differentiation Basal Medium (StemPro®, Gibco®,
Grand Island, NY, USA). The medium was replaced every 2-3 days. After 14 days of
culture, the osteogenic differentiation of stem cells was confirmed by Alizarin Red S
staining (Sigma-Aldrich®,St. Louis, MO, USA).
Results
Growth and culture characteristics
Goat umbilical cord cells started to migrate out of explants after 3 – 6 days of
culture, and the cells gradually grew into small colonies. In the samples transported in
DMEM and MEM-E, cell proliferation started 3 days after beginning the incubation,
whereas samples transported in PBS started proliferating after 5 days and the samples
packed in SS after 6 days. These data demonstrated that DMEM and MEM-E enable
better preservation of the samples and, consequently, enable better acquisition of cells.
During the initial days of incubation, cells displayed a non-fibroblastic, rounded,
epithelial cell-like phenotype (Fig. 1A). Later, cells attained a typical fibroblast-like
spindle-shaped structure (Fig. 1B). As growth continued, adjacent colonies
interconnected with each other, and a confluent monolayer was obtained (Fig. 1C). Cell
69
monolayers derived from goat umbilical cords were used in viral challenge assays, for
immunotyping by flow cytometry, and in mesodermal lineage differentiation assays.
The growth media used in this study (DMEM or MEM-E supplemented with
10% FBS) were highly suitable to sustaining the cells, resulting in high rates of growth
and expansion of the cell stock. After 15 days, cells had grown to 80% confluence, at
which time the first passage was performed. In later passages, cultured cells reached 80-
90% confluence faster, in approximately 3-4 days.
Cytopathicity of SRLV in cGUCs
The cGUCs are highly permissive to SRLV infection in vitro. The cytopathic
effects appeared 7 days after inoculation. Classical giant multinucleated cells (syncytia)
were observed in the monolayers infected with CAEV-Cork virus (Fig. 2B). The cells
infected with MVV-K1514 virus underwent syncytia formation and cell lysis. The
cytopathic effects progressed, resulting in the progressive destruction of the cell
monolayer (Fig. 2A). The negative control for the viral infectivity assay is shown in
figure 2C.
Figure 1 - Primary culture of cGUCs: morphological features and cell monolayers formed. (A) Epithelial cell-like phenotype. (B) Typical fibroblastoid shape. (C) cGUCs exhibiting a large, flattened fibroblast-like morphology after the third passage.
Figure 2 - Cytopathic effects caused by MVV and CAEV. (A) Cell lysis and syncytia caused by MVV. (B)
Giant multinucleated cells caused by CAEV. (C) Negative control for the viral infectivity assay.
70
Immunophenotypic characterization by flow cytometry
In vitro cultured, third-passage cGUCs were analyzed by FACS. FACS analysis
revealed that these cells were positive for the expression of vimentin (91,6%) and CD90
(23%) but were negative when staining for CD105 (3,66%), CD34 (2,95%) and
cytokeratin (1,67%) (Figure 3).
Mesodermal lineage differentiation
Adipogenic differentiation of cGUCs was confirmed by Oil Red-O staining.
After incubating these cells with adipogenic-inducing medium for 14 days, small lipid
droplets were present in the cytoplasm (Fig. 4A).
The chondrogenic potential of cGUCs was evaluated by in vitro micromass
culture of these cells in a specific differentiation medium. After 14 days of incubation,
the accumulation of sulfated proteoglycans was visualized by Alcian Blue staining (Fig.
4B).
In the osteogenic differentiation assay, the cells proliferated and reached
complete confluence after 8-10 days of incubation with differentiation medium. The
cellular aggregates were then observed and were characterized by calcium deposits,
which were demonstrated by positive Alizarin Red staining (Fig. 4C).
Figure 3 - FACS analysis of Vimentin and CD90, in vitro culture, third passage cGUCs. (A) Vimentin PE. (B)
CD90 FITC. Calibrated histogram representing the number of events on the Y-axis and fluorescent intensity
on the X-axis. The red area histogram indicate negative control.
Figure 4 - Mesodermal lineage differentiation. Adipogenic Differentiation. (A) Chondrogenic Differentiation.
(B) Osteogenic Differentiation. (C)
71
Discussion
The umbilical cord is composed of several different components (amniotic
membrane, umbilical cord matrix, umbilical cord vein, and umbilical cord blood) that
can be used as sources of MSCs.6 In this study, cGUCs were isolated from the umbilical
cord matrix and were cultured in DMEM or MEM supplemented with 10% FBS. These
conditions were found to be very well suited for the maintenance of the cultured cells,
and contributed to quick amplification of the cell stock. Several culture media have been
tested for the maintenance of MSCs, such as MEM, DMEM, RPMI-1640 and Basal
Medium Eagle (BME), supplemented with FBS, generally at a concentration of 10 -
20%. The choice of the culture medium is important for the successful growth of MSCs
during in vitro cell culture.13
During the initial days of incubation, the population of cells was heterogeneous,
including both epithelial-like and fibroblast-like cells. However, after passaging, the
epithelioid cell population disappeared from the culture and most of the cells exhibited a
fibroblast-like appearance. These data are consistent with the observations of Pratheesh
et al.14
who observed similar morphological features in caprine mesenchymal stem cells
derived from amniotic fluid (cAF-MSCs) and also with Ren et al.15
in their study with
goat adipose-derived stem cells (ADSCs). In addition, the fibroblast-like cells derived
from goat umbilical cord matrix are similar to MSCs in their general features.
The aim of the present study was to investigate the capacity of cells from goat
umbilical cord matrix to generate cell monolayers that could be used for viral diagnosis
in cell culture assays. It was demonstrated that these cells are highly permissive to
SRLV infection in vitro. Syncytia and cell lysis were observed after 7 days of
inoculation with the CAEV-Cork strain, and similar results were observed with the
MVV-K1514 strain. These results resemble the effects observed after infection of
synovial membrane cells, which are the cells traditionally used for this purpose.
High amounts of small ruminant lentivirus can be produced in vitro using fibro-
epithelial synovial membrane cells or choroid plexus cells from goats or sheep.16,17
However, the disadvantage is that these types of cells can only be obtained from
embryos or fetuses, whereas goat umbilical cords offer a great alternative for the
generation of fibroblasts because the umbilical cord would be discarded after calving
and thus represents a highly convenient source material for generation of cells.
72
Other cell types permissive for small ruminant lentivirus infection are
microglia;18
dendritic cells;² epithelial cells from the lung;19
mammary gland;²0 third eye
lid;²1 kidney;
22 uterus and epididymis
23,24 and endothelium; smooth myocytes;
25,19
granulosa cells;26
and parenchyma cells from the liver and heart.27
The phenotypic characterization of cGUCs was performed by flow cytometry.
The general strategy for identifying in vitro cultivated mesenchymal stem cells was
executed as per the ISCT recommendation (International Society for Cytotherapy),
which is to analyze the expression of cell-surface markers such as CD-73, CD-44, CD-
90 and CD-105.28,29,30,31
It was demonstrated that the cGUCs are positive for vimentin
and CD90, whereas they were negative for cytokeratin, CD105 and CD34. These results
can be compared with those of other studies. Ren et al. 15
described MSCs from goat
adipose that stained positively for vimentin, CD49d and CD13 and negatively for CD34
and CD106. Caprine mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid were positive
for CD90, CD105, CD73, and negative for CD34.14
Vimentin is present in normal and pathological mesenchymal tissues and is an
important marker of the mesoderm. Positive vimentin staining verified that the cGUCs
were derived from mesodermal stem cells.32
Cytokeratin-negative staining demonstrated
the predominance of fibroblast-like cells and is consistent with the observation that the
epithelial-like cells disappeared from culture and could no longer be found from third
passage onward. Additionally, most of the cells exhibited a fibroblast-like appearance.
CD34 is a surface marker of hematopoietic stem cells (HSCs) and is expressed in lymph
nodes, bone marrow HSCs, and various endothelial cells. CD34-negative staining
demonstrated that cGUCs were not derived from circulating stem cells.9,33
The cGUCs from umbilical cord matrix are negative for CD105. This marker is
usually expressed in mesenchymal stem cells; however, there is not yet a definitive
marker for MSCs. There are a large number of positive markers described, but each
group of investigators uses different markers, none of which are specific or used singly.
Perhaps the differences between studies may be attributed to variations in culture
methods or the stage of cell differentiation.34
In this study, FACS analysis revealed low levels of CD90 marker expression
(23%) in comparison to Vimentin (91,6%). CD90 is known to be a negative regulator of
hematopoietic proliferation.35
Its expression, in association with CD34-negative
staining, confirms that there was no evidence of hematopoietic precursors in this
73
culture. The expression levels of surface markers are also different in other studies.
Chang et al.36
isolated cells from umbilical cord blood (UCB) and observed the
following two different morphologic phenotypes: flattened fibroblastic clones and
spindle-shaped fibroblastic clones. CD90 was expressed differently by these two cell
populations. Spindle-shaped, clonogenic MSCs expressed a high level of CD90, while
flattened, clonogenic MSCs did not express CD90. These data might explain the
inconsistent results regarding CD90 expression in UCB-derived MSCs in various
reports.37,38,39
The differentiation potential of cGUCs was investigated. These cells showed a
capacity to differentiate into adipocytes, chondrocytes or osteoblasts when incubated
with the appropriate differentiation medium. Pratheesh et al.14
demonstrated that MSCs
from goat amniotic fluid, such as their marrow counterparts, were able to differentiate
into adipose cells in addition to differentiating into osteogenic and chondrogenic
lineages. Goat adipose-derived stem cells showed the same differentiation potential.15
Goat-derived multipotent MSCs have been established from bone marrow and
successfully induced to differentiate into osteogenic and adipogenic lineages under
specific culture conditions.40
The present study establishes that goat umbilical cord cells are permissive for
small ruminant lentivirus infection in vitro, can be successfully used in cell culture
diagnosis, and represent a new alternative source of host cells for virus isolation. These
cells exhibit a fibroblast morphology, and immunophenotype, growth characteristics
and mesodermal lineage differentiation potential that are all similar to MSCs. These
cGUCs also express vimentin and CD90 but are negative for CD34. These data
demonstrate the proliferative capacity of cells from goat umbilical cords, and they
establish a sound basis for future research aimed at standardizing the cell lineage and
using these cells for the diagnosis of several diseases.
Acknowledgements
This work was supported by the National Council of Scientific and
Technological Development (CNPq), grant numbers 487425/2012-0 and 308995/2013-
9, and by Personnel Improvement Coordination higher level (CAPES), which provided
a PhD scholarship. The authors are thankful to the Post Graduate Program in Veterinary
Science (PPGCV) of the State University of Ceará for supporting the implementation of
74
the experiments; to the Federal University of Ceará, particularly to Lilia Maria Carneiro
Câmara, PhD, for unconditional support in performing the FACS analysis; and to
Marcos Fábio Gadelha Rocha, PhD, and Júlio Sidrim, PhD (Post Graduate Medical
Microbiology – UFC). The authors also express their gratitude to owners of the farms
that allowed the use of their animals for this study.
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78
9. CONCLUSÕES
1. Os meios DMEM baixa glicose (Meio essencial mínimo modificado por
Dulbeccos) e MEM (Meio Essencial Mínimo), acrescidos de
penicilina/estreptomicina, anfotericina, e soro fetal bovino demonstraram ser
os melhores meios para transporte das amostras de tecido do cordão
umbilical caprino ao laboratório.
2. Os meios de cultivo DMEM baixa glicose (Meio essencial mínimo
modificado por Dulbeccos) e MEM (Meio Essencial Mínimo) são eficientes
na manutenção das células-tronco mesenquimais provenientes do cordão
umbilical caprino no cultivo celular.
3. A concentração de 10% de soro fetal bovino acrescida aos meios de cultivo
DMEM e MEM foi eficiente na manutenção e promoção do crescimento das
células-tronco mesenquimais provenientes do tecido do cordão umbilical
caprino, enquanto que a manutenção e crescimento das células-tronco
mesenquimais isoladas do sangue do cordão umbilical caprino somente foi
eficiente quando acrescido 20% de soro fetal bovino ao meio de cultivo
DMEM.
4. Células-tronco mesenquimais podem ser isoladas do tecido e sangue do
cordão umbilical caprino, exibindo morfologia fibroblastóide, características
imunofenotípicas, de crescimento e diferenciação celular similar a células-
tronco mesenquimais isoladas de outros tecidos.
5. Células provenientes do tecido do cordão umbilical caprino são permissíveis
à infecção pelos lentivirus de pequenos ruminantes, podendo ser utilizadas
para o diagnóstico e isolamento desses vírus em cultivo celular.
79
10. PERSPECTIVAS
A pesquisa envolvendo células-tronco constitui um dos mais promissores campos
de investigação que contribuem para a compreensão do desenvolvimento celular. O
isolamento das células-tronco mesenquimais do cordão umbilical caprino e seu uso
como ferramenta para o diagnóstico em cultivo celular apresenta-se como nova
alternativa de obtenção de células destinadas a esse objetivo, evitando problemas éticos
envolvidos no uso da membrana sinovial de fetos. Esse trabalho fornece bases para
maiores estudos, podendo-se utilizar essas células para isolamento de lentivirus de
pequenos ruminantes em amostras de campo, produção de antígenos, vacinas, linhagem
celulares imortalizadas, entre outros. Além de contribuir para tratamentos regenerativos,
sendo utilizadas em terapias celulares, principalmente devido a sua característica de
baixa imunogenicidade.
80
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