UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

FACULDADE DE FARMÁCIA

Camila França Rodrigues

Identificação e caracterização estrutural de condroitim sulfato obtido de

pele e tentáculo de lula Doryteuthis (Loligo) plei

Juiz de Fora

2017

Camila França Rodrigues

Identificação e caracterização estrutural de condroitim sulfato obtido de

pele e tentáculo de lula Doryteuthis (Loligo) plei

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao corpo docente da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.

Orientador: Prof. Dr. Jair Adriano Kopke de Aguiar

Co-orientador (a): Me. Camila Malafaia Leite

Juiz de Fora

2017

Camila França Rodrigues

Identificação e caracterização estrutural de condroitim sulfato obtido de pele e tentáculo de lula Doryteuthis (Loligo) plei

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao corpo docente da Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia.

Aprovada em 20 de Junho de 2017.

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Mestre. Luiz Gustavo de Oliveira

Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Bacharel em Farmácia Natalia Kelmer da Silva

Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Prof.ª Dr. Valquíria Pereira de Medeiros

Universidade Federal de Juiz de Fora

Dedico este trabalho à minha avó Maria e aos meus pais, Marta e Célio por toda força, carinho e amor dedicados a mim.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço à Deus, pois sem Ele nada seria possível.

À minha avó Maria, que com seu amor incondicional, segurou minha

mão nos momentos difíceis e vibrou com minhas vitórias. Obrigada por sempre

cuidar de mim. Vó, te amo muito!

Á minha mãe Marta, que com amor e dedicação, não mediu esforços

para que eu chegasse até aqui, acreditou nos meus sonhos e me ajudou a

torná-los realidade. Meu amor por você é imensurável. Obrigada por tudo, mãe!

Ao meu pai Célio, pelo apoio e incentivo. Sua presença significou

segurança е a certeza dе não estar sozinha nessa caminhada.

Ao meu querido irmão Célio Júnior, pelo amor e incentivo em tudo que

me propus a fazer, por suas sábias palavras nos momentos certos, por me

ajudar a enxergar a vida de uma forma mais bonita. Te amo muito!

Às minhas amigas e companheiras da faculdade, Yasmin e Isadora, por

estarem sempre presentes, me apoiando e ajudando no que foi preciso.

Agradeço aos professores que desempenharam com dedicação as aulas

ministradas.

Às minhas amigas de república, Carol e Bela, que nos vários momentos

de alegria e descontração, amenizaram a distância e saudade de casa.

Obrigada por tudo que passamos juntas.

Ao meu professor e orientador Jair, pela oportunidade de fazer parte do

laboratório, pelos ensinamentos, apoio e incentivo fundamentais para a

concretização deste trabalho.

Ao amigo Rafael, por toda ajuda e por ter cedido generosamente grande

parte do material que utilizei neste trabalho. Você foi demais.

Á minha querida co-orientadora Camila, pela grande ajuda na realização

dos experimentos, pela paciência em ensinar e pelo seu tempo dedicado à

mim; sua presença no laboratório foi de importância fundamental.

À todos do Laboratório de Análise de Glicoconjugados pelos

ensinamentos e ajuda de sempre. Muito obrigada!

A CNPQ pela bolsa de treinamento profissional concedida.

A todos qυе, direta оu indiretamente, fizeram parte dа minha formação

nestes cinco anos de faculdade, о mеu muito obrigada.

“Tudo tem seu apogeu e seu declínio... É natural que seja assim, todavia,

quando tudo parece convergir para o que supomos o nada, eis que a vida

ressurge, triunfante e bela!... Novas folhas, novas flores, na infinita benção do

recomeço!”

Francisco Cândido Xavier

RESUMO

Os glicosaminoglicanos (GAG) são heteropolissacarídeos que têm como estrutura básica unidades dissacarídicas repetitivas formadas por uma hexosamina e um açúcar não nitrogenado, unidas por ligações glicosídicas. Com exceção do ácido hialurônico, todos os GAG estão ligados covalentemente a um esqueleto protéico, formando assim os proteoglicanos (PG). Diferenças na concentração, perfil de sulfatação e epimerização dos GAG têm sido correlacionados com suas propriedades biológicas, como migração/adesão/diferenciação celular, interação com proteínas específicas, funções neuroreguladoras, atividade anticoagulante e anti-inflamatória. Em animais de origem marinha são encontrados GAG com estrutura singular, como é o caso do CS-E (Condroitim sulfato E), extraído de cartilagem de lula, o qual encontra-se mais sulfatado que o condroitim sulfato (CS) encontrado em animais terrestres. Estudos recentes sobre a estrutura química do CS demonstraram que a supersulfatação pode estar ligada a atividade biológica dessa molécula. O presente trabalho teve por objetivo a identificação e caracterização estrutural dos GAG extraídos de pele e tentáculos de lula (Doryteuthis plei). Para isso, os tecidos foram submetidos à extração por meio de degradação proteolítica com a enzima Papaína e precipitação com etanol, na presença de NaCl 1M. Os GAG extraídos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose em tampão 1,3-diaminopropano (PDA) 0,05 M, pH 9,0 e, em seguida, a purificação através da cromatografia de troca iônica em resina Q-Sepharose. Foram realizadas dosagens químicas para determinar o teor de ácido urônico e hexosamina, e a partir destas, foi calculado, aproximadamente, o teor de GAG extraídos. Foi estimado o peso molecular dos GAG extraídos por eletroforese em gel de poliacrilamida e, a identificação dos mesmos com degradação enzimática específica utilizando a liase AC de Flavobacterium heparinum. Por fim, foi identificado as unidades dissacarídicas predominantes na estrutura do GAG extraído pelo método da Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). Obtivemos o CS como o GAG majoritário extraído de pele e tentáculo de Doryteuthis plei, o qual apresentou peso molecular estimado na faixa entre 7-44 kDa. A análise do perfil dissacarídico do CS por FACE demonstrou a presença de dissacarídeos com alto teor de sulfatação, relacionada à presença de uma alta proporção de resíduos sulfatados nas posições 4 e 6 da N-acetil-galactosamina, ΔDi4,6S, em ambos os tecidos (22,76 e 37,64% para tentáculo 1 e 2 M e 15,39 e 21,57% para pele 1 e 2 M), além dos dissacarídeos monosulfatados (ΔDi4S: 20,19 e 23,25% para tentáculo 1 e 2 M e 20,03 e 25,79% para pele 1 e 2 M; ΔDi6S: 51,17 e 39,11% para tentáculo 1 e 2 M e 26,64 e 27,00% para pele 1 e 2 M ). As atividades biológicas do CS estão associadas à interação com diferentes elementos da matriz, relacionadas às suas características estruturais relativas ao elevado teor de grupos sulfato e carboxila. Dessa forma, acredita-se que o CS “supersulfatado” de lula da espécie Doryteuthis plei possa ser uma nova molécula a ser explorada quanto a seu potencial farmacológico. Palavras-chave: Proteoglicano, glicosaminoglicano, condroitim sulfato, lula.

ABSTRACT

Glycosaminoglycans (GAG) are heteropolysaccharides having as their basic structure repetitive disaccharide units formed by an hexosamine and a non-nitrogenous sugar, joined by glycosidic linkages. With hyaluronic acid as exception, all GAG are covalently attached to a protein skeleton forming proteoglycans (PG). Differences in concentration, sulfation profile and epimerization of GAG have been correlated with their biological properties, such as cell migration/adhesion/differentiation, interaction with specific proteins, neuroregulatory functions, anticoagulant and anti-inflammatory activities. GAG with a singular structure are found in marine animals, such as CS-E (Chondroitin sulfate E) extracted from squid cartilage which is more sulfated than terrestrial chondroitin sulfate (CS) found in terrestrial animals. Recent studies show that chemical modifications carried out in CS have shown that supersulfationis linked to the biological activity of this molecule. The present study had as objective the identification and structural characterization of GAG extracted from skin and tentacles of squid (Doryteuthis plei). Therefore, the tissues have been extracted by proteolytic degradation with the papain enzyme and precipitation with ethanol, in the presence of 1 M NaCl. The extract GAG were subjected to agarose gel electrophoresis in 0,05 M 1,3-diaminopropane (PDA) buffer, pH 9.0 and subjected to purification by ion exchange chromatography on Q-Sepharose resin. Chemical dosages were performed to determine the content of uronic acid and hexosamine and from these dosages, approximate GAG content extracted was calculated. The molecular weight of the GAG extracted was estimated by polyacrylamide gel electrophoresis and the identification of them with enzymatic degradation, such as Liase AC of Flavobacterium heparinum was performed. Finally, it was identified predominant disaccharide units in the structure of GAG extracted by the Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) method. We obtained CS as the majority GAG extracted from skin and tentacle of Doryteuthis plei which showed an estimated molecular weight in the range between 7-44 kDa. Analysis of the disaccharide profile of CS by FACE showed the presence of disaccharides with a high sulfation content, related to the presence of a high proportion of sulphated residues at 4 and 6 positions of N-acetylgalactosamine, ΔDi4,6S, in both tissues (22.76 and 37.64% for tentacle 1 and 2 M and 15.39 and 21.57% for skin 1 and 2 M), in addition to monosulfated disaccharides (ΔDi4S: 20.19 and 23.25% for tentacle 1 and 2 M and 20,03 and 25.79% for skin 1 and 2 M; ΔDi6S: 51.17 and 39.11% for tentacle 1 and 2 M and 26.64 and 27.00% for skin 1 and 2 M). The biological activities of CS are associated to the interaction with different elements of the matrix, related to its structural characteristics according to the high content of sulfate and carboxyl groups. Thus, it is believed that the "supersulfated" CS of squid from the Doryteuthis plei specie might be a new molecule to be explored in relation to its pharmacological potential.

Keywords: Proteoglycan, glycosaminoglycan, chondroitin sulfate, squid.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Tecido conjuntivo com diferentes tipos celulares distribuídos na

matriz extracelular, composta por diversos tipos de fibras

protéicas e outras moléculas secretadas pelos fibroblastos....... 17

Figura 2 Estrutura de um proteoglicano de membrana. O esquema

representa um proteoglicano ancorado à membrana

citoplasmática pela região hidrofóbica do esqueleto protéico

deste. As cadeias de heparam sulfato, dermatam sulfato e

condroitim sulfato são ligadas à proteína por resíduos de

serina............................................................................................ 20

Figura 3 Esquema da composição típica de diferentes famílias de

glicosaminoglicanos..................................................................... 21

Figura 4 Região de ligação do GAG à serina do eixo protéico pelo

tetrassacarídeo............................................................................. 22

Figura 5 Estrutura química dos dissacarídeos que constituem diversos

tipos de condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS)........... 24

Figura 6 Anatomia da lula Loligo macho. Vista ventral com o manto

aberto longitudinalmente ao longo da linha mediana ventral....... 25

Figura 7 Cascata de regulação do processo inflamatório.......................... 27

Figura 8 Doryteuthis plei............................................................................. 30

Figura 9 Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH

9,0 de GAG extraídos de tentáculo e pele de lula, corados com

azul de toluidina. 1 - Padrão de GAG (condroitim sulfato (CS),

dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS)); 2 – pele

(10mg/mL) 20x concentrado; 3 – pele (10mg/mL) 40x

concentrado; 4 – tentáculo (10 mg/mL) 2x concentrado; O –

origem.......................................................................................... 39

Figura 10 Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH

9,0 de GAG extraídos e purificados em Q-Sepharose de pele

(A) e tentáculo (B) de lula. 1 - Padrão de GAG (condroitim

sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS)); 2

– Fração amostra; 3 – Fração H2O; 4 – Fração 0,5 M NaCl; 5 –

Fração 1,0 M NaCl; 6 – Fração 2,0 M NaCl; O – origem............. 41

Figura 11 Eletroforese da purificação de GAG em Q-Sepharose de pele

(A) e tentáculo (B) de lula e eletroforese da degradação de

GAG de lula incubados com condroitinase AC. Alíquotas de

mistura de incubação (5 µL) foram submetidas a eletroforese e

corados, como descrito em Métodos. 1: Padrão de GAG (CS;

DS; HS); 2: padrão de C6S; 3: padrão de C6S com enzima

Chase AC, 4: pele 1 M com Chase AC; 5: pele 2 M com Chase

AC; 6: tentáculo 1 M com Chase AC; 7 tentáculo 2 M com

Chase AC; O – origem................................................................. 43

Figura 12 Eletrofluorogramas no sistema Tris-glicina de produtos de

digestão de condroitim sulfato de tentáculo (A) e pele (B) de

lula após degradação com condroitinase AC. Alíquotas de cada

amostra foram incubadas por 18h com condroitinase AC e

derivatizadas com AMAC............................................................. 44

Figura 13 Eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% corado com azul de

toluidina 0,1% para peso molecular das amostras de CS de

tentáculo e pele de lula purificadas em Q-Sepharose. 1 -

Dextram Sulfato (8 kDa); 2 - C4S (26 kDa); 3 - C6S (67 kDa); 4

- Tentáculo 1,0 M NaCl; 5 - Tentáculo 2,0 M NaCl; 6 - Pele 1,0

M NaCl; 7 - Pele 2,0 M NaCl; O – origem.................................... 46

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Cálculo do rendimento das amostras após a extração............... 40

Tabela 2 Porcentagem relativa de produtos de digestão de CS de

tentáculo e pele de lula por condroitinase AC de F. heparinum,

determinada por FACE Tris-glicina............................................. 45

Tabela 3 Peso molecular modal................................................................ 46

Tabela 4 Dosagens químicas de CS de lula.............................................. 47

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

∆Di0S 2-acetamido-2-deoxi-3-O-(ácido β-D-gluco-4-enepiranosil

urônico)- Dgalactose ou dissacarídeo insaturado não sulfatado

∆Di4,6S

2-acetamido-2-deoxi-3-O-(ácido β-D-gluco-4-enepiranosil

urônico)-4,6-di-Osulfo-D-galactose ou dissacarídeo insaturado

4,6-dissulfatado

∆Di4S

2-acetamido-2-deoxi-3-O-(ácido β-D-gluco-4-enepiranosil

urônico)-4-O-sulfoD-galactose ou dissacarídeo insaturado 4-

sulfatado

∆Di6S

2-acetamido-2-deoxi-3-O-(ácido β-D-gluco-4-enepiranosil

urônico)-6-O-sulfoD-galactose ou dissacarídeo insaturado 4-

sulfatado

µ micro

Abs absorbância

AH ácido hialurônico

AMAC 2-aminoacridona

APS persulfato de amônio

C4S condroitim 4-sulfato

C6S condroitim 6-sulfato

CETAVLON brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamônio

Chase AC condroitinase AC

CS condroitim sulfato

CS-A condroitim sulfato A

CS-B condroitim sulfato B

CS-C condroitim sulfato C

CS-D condroitim sulfato D

CS-E condroitim sulfato E

Di4,6S Dissacarídeo 4,6-dissulfatado

DMB azul de 1,9-dimetilmetileno (dimethylmethylene blue)

DMSO dimetil sulfóxido

DS dermatam sulfato

EULAR european league against rheumatism

FACE fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis

GAG glicosaminoglicano (s)

Gal galactose

GalNAc N-acetil-D-galactosamina

GalNAc-4,6S N-acetil-D-galactosamina-4,6-di-sulfato

GalNAc-4S N-acetil-D-galactosamina-4-sulfato

GalNAc-6S N-acetil-D-galactosamina-6-sulfato

GlcA ácido β-D-glucurônico

GlcN glucosamina

GlcNAc N-acetil-D-glucosamina

Hep heparina

HS heparam sulfato

IdoA ácido α-L-idurônico

kDa quiloDaltons

LPS Lipopolissacarídeo

M molar

NaCNBH3 cianoborohidreto de sódio

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis

PG proteoglicano (s)

QS queratam sulfato

Rf fator de retenção

TCA ácido tricloro acético

TEMED tetrametiletilenodiamina

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

U unidades

USP The United States Pharmacopeia

UV ultravioleta

Xil Xilose

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................ 17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................... 20

2.1 PROTEOGLICANOS E GLICOSAMINOGLICANOS.................. 20

2.2 CONDROITIM SULFATO............................................................ 23

2.3 LULA Doryteuthis (Loligo) plei..................................................... 24

2.4 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE CONDROITIM

SULFATO.................................................................................... 26

2.4.1 Atividade Anti-inflamatória....................................................... 26

2.4.2 Atividade anticoagulante.......................................................... 27

3 OBJETIVOS................................................................................ 29

3.1 OBJETIVO GERAL..................................................................... 29

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................... 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................... 30

4.1 MATERIAIS................................................................................. 30

4.1.1 Lulas........................................................................................... 30

4.1.2 Reagentes.................................................................................. 31

4.1.2.1 Padrões....................................................................................... 31

4.1.2.2 Eletroforese................................................................................. 31

4.1.2.3 Enzimas....................................................................................... 32

4.1.2.4 Resinas cromatográficas............................................................. 33

4.1.2.5 Outros reagentes e equipamentos.............................................. 33

4.2 MÉTODOS.................................................................................. 33

4.2.1 Extração de glicosaminoglicanos dos tecidos de lula.......... 33

4.2.2 Purificação dos glicosaminoglicanos dos tecidos de lula.... 34

4.2.2.1 Cromatografia de Troca Iônica (Q-Sepharose)........................... 34

4.2.2.2 Dessalinização de Frações Purificadas por Cromatografia de

Gel Filtração em Sephadex G-50................................................ 34

4.2.3 Análise dos glicosaminoglicanos de tecidos de lula............ 34

4.2.3.1 Eletroforeses .............................................................................. 34

4.2.3.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose (0,5%) Tampão 1,3-

Diaminopropano Acetato (PDA).................................................. 34

4.2.3.1.2 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em Tampão Tris-

EDTA........................................................................................... 35

4.2.3.1.3 Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE)..... 36

4.2.3.2 Caracterização Enzimática.......................................................... 37

4.2.3.3 Dosagens Químicas.................................................................... 38

4.2.3.3.1 Dosagem de Ácido Urônico......................................................... 38

4.2.3.3.2 Dosagem de Hexosamina .......................................................... 38

5 RESULTADOS............................................................................ 39

5.1 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE

GLICOSAMINOGLICANOS DE DIFERENTES TECIDOS DE

LULA........................................................................................... 39

5.2 PURIFICAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS EXTRAÍDOS

DE TECIDOS DE LULA POR CROMATOGRAFIA DE TROCA

IÔNICA EM Q-SEPHAROSE

(FF)........................................................................................... 40

5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS DE

LULA........................................................................................... 42

5.3.1 Identificação por degradação enzimática............................... 42

5.3.2 Análise dos produtos da degradação de condroitim sulfato

por condroitinase AC................................................................ 44

5.3.3 Determinação de peso molecular por eletroforese em gel

de poliacrilamida....................................................................... 45

5.3.4 Dosagens químicas................................................................... 46

6 DISCUSSÃO............................................................................... 48

7 CONCLUSÃO............................................................................. 50

REFERÊNCIAS........................................................................... 51

17

1 INTRODUÇÃO

A matriz extracelular (MEC) pode ser definida como a organização

supramolecular de diversas proteínas estruturais e polissacarídeos nos tecidos

conjuntivos que preenchem os espaços extracelulares e mantém as células

associadas, possibilitando a organização dos tecidos e a sobrevivência celular.

É constituída, em proporções variáveis, por colágeno, fibras elásticas,

proteoglicanos (PG), glicosaminoglicanos (GAG) e elementos celulares, juntas

essas moléculas formam uma rede responsável pela grande diversidade

morfológica e funcional dos tecidos, como mostrado na Figura 1 (DOS ANJOS

et al, 2000; GOMES et al, 2007).

Figura 1. Tecido conjuntivo com diferentes tipos celulares distribuídos na matriz extracelular, composta por diversos tipos de fibras protéicas e outras moléculas secretadas pelos

fibroblastos. Fonte: CEDERJ.

Os componentes da MEC dividem-se em dois tipos: moléculas protéicas

alongadas que se unem formando estruturas fibrilares, como o colágeno e a

elastina; e estruturas não fibrilares, divididas em dois subtipos: glicoproteínas

alongadas como a fibronectina e a laminina; e os PG e GAG. O colágeno e a

elastina são responsáveis pelo arcabouço estrutural e elástico, enquanto, os

PG e GAG formam uma espécie de gel hidrófilo, semifluido que permite a

circulação de nutrientes, hormônios e outros mensageiros químicos. Esses

componentes são produzidos, principalmente, pelos fibroblastos e distribuídos

em uma rede organizada em íntima associação com a superfície da célula que

18

os produziu. Eles estão associados ao controle de eventos celulares como:

adesão, migração e proliferação celular (FELDNER et al, 2008).

Os PG são importantes componentes de matriz extracelular (MEC),

sendo caracterizados como macromoléculas que possuem pelo menos uma

cadeia de GAG ligada covalentemente a um núcleo proteico (KJÉLLEN &

LINDAHL, 1991). Por sua vez, os GAG são heteropolissacarídeos formados por

unidades dissacarídicas repetitivas de uma hexosamina e um açúcar não

nitrogenado, unidas por ligações glicosídicas, eles estão presentes em todas as

células animais com diferenças estruturais, as quais dependem do tecido e do

organismo de origem. Os principais GAG são: condroitim sulfato (CS),

dermatam sulfato (DS), heparan sulfato (HS), heparina (HEP), queratam sulfato

(QS) e ácido hialurônico (AH). Estes compostos diferem entre si quanto ao tipo

de hexosamina e açúcar não nitrogenado, quanto ao grau e posição de

sulfatação, bem como quanto ao tipo de ligação glicosídica inter e

intradissacarídica. Com exceção do ácido hialurônico, todos os GAG estão

ligados covalentemente a esqueleto protéico, formando assim os PG

(FELDNER et al, 2008).

Os GAG estão envolvidos em múltiplas funções biológicas, como adesão,

migração e proliferação celular, secreção de proteínas e expressão gênica,

além disso, contribuem para a estrutura e as propriedades de permeabilidade

do tecido conjuntivo, bem como guia para enzimas e fatores de crescimento

tanto na matriz quanto na superfície das células (FELDNER JR et al, 2008).

Estudos têm demonstrado uma relação entre a concentração, o perfil de

sulfatação e epimerização e as propriedades biológicas e, também,

farmacológicas como, anticoagulante e antiinflamatória, que os GAG estão

envolvidos no tecido e no organismo (LIMA et al., 2012; MIKAMI & KITAGAWA,

2013; SUGAHARA et al., 2003).

Suzuki e colaboradores descreveram originalmente a ocorrência de CS-E,

um CS rico em dissacarídeos sulfatados na posição 4 e 6 da N-

acetilgalactosamina (∆Di4,6S), CS “supersulfatado” na cartilagem de lula. Este

mesmo CS foi encontrado em PG presentes em mastócitos, células NK (natural

killer) e em leucócitos de mamíferos (RAZIN et al., 1982; STEVENS, 1986). De

acordo com o tecido e a espécie animal, há uma variação da proporção dos

∆Di4,6S na cadeia do CS, o que torna interessante a verificação dos tipos de

19

ações do CS-E de lula nos processos biológicos humanos bem como sua

estrutura. Diversos estudos têm demonstrado o papel biológico dos PG/GAG

em diversas condições fisiopatológicas, impulsionando na busca por indícios de

atividade farmacológica (GUEDES, 2013; OLIVEIRA, 2012).

20

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 PROTEOGLICANOS E GLICOSAMINOGLICANOS

Proteoglicanos (PG) são macromoléculas complexas que contêm um

esqueleto protéico com uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanos (GAG)

ligados covalentemente. O esqueleto protéico dos PG tem uma localização

central na molécula e, frequentemente, fica apoiado a um arcabouço formado

pelas cadeias dos GAG (Figura 2) (TOFFOLETTO et al., 2005).

Figura 2. Estrutura de um proteoglicano de membrana. O esquema representa um proteoglicano ancorado à membrana citoplasmática pela região hidrofóbica do esqueleto protéico deste. As cadeias de heparam sulfato, dermatam sulfato e condroitim sulfato são ligadas à proteína por resíduos de serina. Fonte: Adaptado de Gandhi & Mancera, 2008.

Os GAG, por sua vez, são polímeros de cadeias longas lineares formados

por unidades dissacarídicas repetitivas onde uma das unidades é

invariavelmente uma hexosamina (D-glucosamina ou D-galactosamina) e a

outra um ácido urônico (ácido glucurônico ou idurônico) ou uma galactose,

onde essas cadeias apresentam tamanho médio entre 10-50 kDa. As três

unidades dissacarídicas: N-acetil-galactosamina-ácido urônico; N-acetil-

glucosamina-ácido urônico e N-acetilglucosamina-galactose representam as

21

unidades básicas na formação da cadeia dos GAG (BRIMACOMBE &

WEBBER, 1964; JACKSON et al., 1991).

GAG de diferentes origens podem ser classificados dentro de famílias: os

galactosaminoglicanos, cuja hexosamina será sempre uma D-galactosamina,

constituídos pelo condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) e, os

glucosaminoglicanos, cuja hexosamina será sempre uma D-glucosamina,

constituídos pelo ácido hialurônico (AH), heparam sulfato (HS), heparina (HEP)

e queratam sulfato (QS) (Figura 3). Com exceção do AH todos os GAG são

encontrados na forma de PG (Figura 2). O grau de sulfatação também

caracteriza esses polímeros, onde o AH o único GAG não sulfatado e o HS e a

HEP tendem a ser os mais sulfatados. Na classe dos CS poderemos encontrar

aqueles que não serão sulfatados, porém, com maior frequência, encontramos

os monossulfatados, CS 4-sulfatado e 6-sulfatado (TOFFOLETTO et al., 2005;

ESKO, KIMATA & LINDAHL, 2009).

Figura 3. Esquema da composição típica de diferentes famílias de glicosaminoglicanos. Fonte: Adaptado de Esko, Kimata & Lindahl, 2009.

A ligação dos GAG sulfatados ao esqueleto protéico nos PG, se faz por

meio do tetrassacarídeo ácido glucurônico-galactosil-galactosil-xilose (GlcA-

22

Gal-GalXil), onde a extremidade redutora se une à proteína por uma ligação do

tipo O-glicosídica entre a xilose do tetrassacarídeo e a hidroxila de um resíduo

de serina/treonina, representado pela Figura 4. A extremidade não redutora se

liga à cadeia de GAG (IOZZO, 1998; SAMPAIO & NADER, 2006).

Figura 4. Região de ligação do GAG à serina do eixo protéico pelo tetrassacarídeo. Fonte: CEDERJ.

Os GAG são encontrados tanto em animais vertebrados quanto em

invertebrados. Foi reportado em diversos estudos, que um mesmo tecido de

diferentes vertebrados, possui em geral, o mesmo tipo de GAG (DIETRICH et

al., 1976; GOMES e DIETRICH, 1982; TOLEDO e DIETRICH, 1977). Porém, o

primeiro estudo sistemático da distribuição de GAG nas classes de

invertebrados foi publicado em 1976, por CÁSSARO e DIETRICH.

Em relação ao ambiente terrestre, o ambiente marinho se encontra bem

mais diversificado, porém, ainda é pouco conhecido devido às dificuldades de

coletar os organismos que compõem este meio. Mas a busca por novas

substâncias com ação farmacológica tem levado a um aumento no número de

estudos que buscam o isolamento e a elucidação estrutural de substâncias

biologicamente ativas em invertebrados marinhos, como as esponjas, os

corais, os moluscos e, em menor escala equinodermos (TEIXEIRA, 2009).

23

2.2 CONDROITIM SULFATO

Condroitim sulfato (CS) é um GAG formado por unidades dissacarídicas

repetitivas onde o açúcar não nitrogenado é o ácido D-glucurônico (GlcA), e a

hexosamina a N-acetilgalactosamina (GalNAc), unidas por ligações glicosídicas

β (1→3) e β(1→4), [→4GlcAβ1→3GalNAcβ1→]. De acordo com a sulfatação

dos dissacarídeos, diferentes tipos de CS são conhecidos, onde os principais

são: condroitim 4-sulfato (C4S), ou condroitim sulfato A (CS-A), rico em

dissacarídeos sulfatados na posição 4 da N-acetilgalactosamina (~65% Di4S) e

condroitim 6-sulfato (C6S), ou condroitim sulfato C (CS-C), que possui

essencialmente N-acetil-galactosamina sulfatada na posição 6 (~90% Di6S). O

DS, conhecido anteriormente como CS-B, possui uma estrutura hibrida devido

à modificação do resíduo de ácido glucurônico, envolvendo epimerização do C-

5 para formar ácido idurônico (LAMARI & KARAMANOS, 2006; VOLPI, 2007).

A proporção relativa dos dissacarídeos na cadeia de CS varia de acordo

com o tecido e a espécie. O dissacarídeo E extraído de cartilagem de lula (CS-

E) apresenta dois grupos sulfato nas posições 4 e 6 da GalNAc (SUZUKI et al.,

1968). A unidade dissacarídica D, encontrada em cartilagem de tubarão e

arraias (CS-D), apresenta dissacarídeos di-sulfatados na posição 2 do GlcA e 6

da GalNAc (VOLPI, 2007). Em caranguejos, dissacarídeos conhecidos como

tipo K (CS-K), possuem sulfatação na posição 4 da GalNAc e também são 3-O-

sulfatados em GlcA (LAMARI & KARAMANOS, 2006; SUGAHARA & YAMADA,

2000). A Figura 5 mostra a estrutura química de dissacarídeos que formam os

diferentes tipos de CS e DS.

24

Figura 5. Estrutura química dos dissacarídeos que constituem diversos tipos de condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS). Fonte: Stylianou et al., 2006; Martel-Pelletier et al., 2008

2.3 LULA Doryteuthis (Loligo) plei

As lulas encontram-se inseridas no táxon dos cefalópodes, moluscos

marinhos cujo corpo consiste de cinco pares de apêndices flexíveis (braços e

tentáculos) em torno da cabeça, sendo oito braços curtos e espessos e o

quarto par, contado a partir do dorso do animal, formado por longos tentáculos

retráteis. As lulas também apresentam o manto, formado por uma camada

espessa de músculos circulares interposta por músculos radiais menores. A

cavidade do manto é envolvida por músculos encontrados entre túnicas de

colágeno interna e externa que participam da locomoção por meio do

lançamento de um jato de água pelo funil. Para evitar que afundem, as lulas

utilizam nadadeiras que permanecem em movimento constante a fim de manter

esses cefalópodes em determinada posição na coluna d’água. O tecido

conjuntivo subjacente que forma a derme, em contato com a epiderme externa,

compõe o tegumento destes moluscos. A derme é constituída de fibras de

colágeno, MEC e órgãos cromatofóricos abundantes. E, além dos tecidos

25

citados anteriormente, as lulas também apresentam rádula, brânquias e

vísceras, como representado na Figura 6 (RUPPERT et al., 2003).

Figura 6. Anatomia da lula Loligo macho. Vista ventral com o manto aberto longitudinalmente ao longo da linha mediana ventral. Fonte: Mary Ann Nelson Adaptado de Ruppert et al., 2005.

A lula Doryteuthis (Loligo) plei (Blainville, 1823), pertencente à família

Lolignidae, é um cefalópode endococleado, que não possui conchas e pode ser

encontrado em ambientes de água morna, desde a costa da Flórida até o Rio

Grande do Sul (RODRIGES, A. R., 2007 apud PEREZ et al., 2005), sendo

neste muitas vezes associada à influência da Corrente do Brasil (HAIMOVICI &

PEREZ, 1991).

26

2.4 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE CONDROITIM SULFATO

2.4.1 Atividade Anti-inflamatória

A EULAR (European League Against Rheumatism) recomenda e

classifica o CS como evidência 1A (nível mais elevado para uma estratégia

terapêutica) para o tratamento de osteoartrite de joelho e de mão, baseada em

estudos clínicos (JORDAN et al., 2003). Foi demonstrado por meio de estudos

clínicos, que o CS, além de ajudar na melhora dos sintomas provocados pela

doença, pode também ser capaz de parar sua progressão, agindo na

modificação do seu curso (UEBELHART et al., 2006; UEBELHART, 2008;

KAHAN et al., 2009). A associação do CS com glucosamina é indicada como

terapia medicamentosa na melhora do quadro sintomático de pacientes que

sofrem de osteoartrite de joelho. Constituintes naturais dos PG da cartilagem,

essas moléculas estão sendo muito utilizadas como suplementos nutricionais

principalmente nos Estados Unidos e como medicamento em países da

Europa, Ásia e América Latina (ZHANG et al., 2008; ZHANG et al., 2010). No

Brasil, o CS é registrado pela ANVISA como medicamento.

No tratamento da osteoartrite, o CS melhora as funções das

articulações, reduzindo a dor e o edema articular bem como impedindo o

estreitamento do espaço articular (UEBELHART, 2008). Muitos trabalhos

mostram o potencial farmacológico do CS para a inibição do processo

inflamatório. A adição de diferentes doses de GAG extraídos do plasma

humano em condrócitos estimulados com LPS foi capaz de reduzir as citocinas

inflamatórias e iNOS (CAMPO et al., 2008).

Em estudo conduzido em modelo animal foi verificado que C4S inibe a

translocação de NF-κB e ativação de caspases em artrite induzida (CAMPO et

al., 2008). Jomphe e colaboradores (2008) demonstram que o CS diminui a

translocação de NF-κB induzida por IL-1β, além de inibir a fosforilação da

p38MAPK, proteínas quinase p38 ativadas por mitógenos, e da ERK 1/2,

quinases extracelulares reguladas por sinal, induzida por essa mesma

interleucina. Já Canãs e colaboradores (2010) dizem que aquele GAG pode

reduzir potencialmente a neuroinflamação também por inibição do NF-κB.

Apesar de todos os trabalhos mencionados ainda não é claro como CS gera

27

esses efeitos. Foi mostrado que ele é internalizado na célula por receptores

como o receptor de hialuronam (principal componente da matriz intersticial)

(HARE), CD36, CD34 entre outros. Entretanto, o mecanismo pelo qual o CS

reduz a fosforilação da p38MAPK e da ERK1/2 e a translocação do NF-κB

ainda não foi completamente elucidado (Figura 7) (VALLIÉRES & SOUICH,

2010).

Figura 7. Cascata de regulação do processo inflamatório. Fonte: Adaptado de Vallieres e Du

Souich, 2010.

2.4.2 Atividade Anticoagulante

Nos processos de regulação da formação do coágulo, alguns inibidores

naturais estão envolvidos, entre eles: antitrombina III (AT III), proteína C (PC),

inibidor da via do fator tecidual (TFPI), cofator II da heparina (HCII), inibidor de

protease dependente de proteína Z (ZPI) e ativador de plasminogênio tecidual

(tPA) (DEVLIN, 2007). GAG sulfatados, como HEP, DS e HS obtidos de

animais vertebrados e invertebrados, com diferentes composições e

28

características estruturais apresentam atividade anticoagulante e antitrombótica

relatadas em modelos in vivo e in vitro.

HEP age como um composto anticoagulante porque forma um complexo

ternário com antitrombina III (ATIII) e diferentes serino-proteases da cascata de

coagulação. As características estruturais da interação envolvendo ATIII e HEP

parecem estar bem estabelecidas (BOURIN & LINDAHL, 1993; McGEE et al.,

1995; NADER et al., 2004).

Diferentes CS têm sido testados para atividade anticoagulante, porém

somente CS-E tem demonstrado esse potencial, que foi descrito associado à

inibição de fatores da coagulação da via intrínseca (fator VIIIa/IXa) (McGEE et

al., 1995). Scully e colaboradores (1986) demonstraram que o CS-E foi capaz

de prolongar o tempo de trombina e potencializou a ação de inibidores das

proteases plasmáticas como ATIII e HC II. Condroitim monosulfatado

submetido a processo de O-sulfonação demonstrou atividade anticoagulante

relacionada à inibição de fator Xa após modificação estrutural (MURUYAMA et

al., 1997). Sakai e colaboradores (2000) verificaram que o CS-E induziu o

aumento da ativação do plasminogênio por t-PA, importante processo para

fibrinólise do coágulo.

O crescente interesse por compostos que possam ser alternativas a

heparina tem intensificado os estudos de atividade anticoagulante e

antitrombótica in vivo e in vitro, visto que esta apresenta alguns efeitos

colaterais observados com o seu uso clínico contínuo, como por exemplo,

efeitos anticoagulantes variáveis, incapacidade de inibir trombina ligada ao

coágulo e ocorrência de trombocitopenia em alguns pacientes. Desta forma, os

polissacarídeos sulfatados estão sendo os principais alvos na busca por novos

compostos anticoagulantes (NADER et al, 2001).

29

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

O presente trabalho teve por objetivo a extração, purificação,

identificação, bem como análise da composição química parcial de condroitim

sulfato extraídos de pele e tentáculo de lula Doryteuthis (Loligo) plei.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Extração GAG presentes em pele e tentáculo de lula Doryteuthis

(Loligo) plei;

Purificação dos GAG extraídos por meio de cromatografia de troca

iônica em resina Q-Sepharose;

Estimar peso molecular utilizando eletroforese em gel de

poliacrilamida;

Identificação do GAG extraído utilizando liases específicas –

condroitinase AC de Flavobacterium heparinum;

Análise química do CS obtido por dosagem de ácido urônico e

hexosamina;

Determinação da composição dissacarídica do CS constituinte dos

tecidos analisados utilizando a técnica da FACE.

30

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Lulas

Espécimes de lulas foram obtidos em diferentes distribuidoras de

pescados das cidades de Juiz de Fora e de Ubá. Os animais foram

identificados e classificados taxonomicamente pelos professores MSc. Gilson

Alexandre de Castro (Depto. Zoologia, UFJF) e prof. Dr. Manuel Haimovici

(Depto. de Oceanografia, UFRGS). Após a confirmação taxonômica, os

animais foram segregados nas seguintes regiões anatômicas: manto,

nadadeira, tentáculos e pele. Após pesagem, os tecidos foram mantidos a

-20ºC até serem utilizados para extração de GAG analisados nesse trabalho.

Figura 8. Doryteuthis plei. Fonte: Blainville, 1823

Filo: Mollusca

Classe: Cephalopoda

Subclasse: Coleoidea

Ordem: Teuthida

Subordem: Myopsina

Família: Loliginidae

Espécie: Doryteuthis plei

31

4.1.2 Reagentes

4.1.2.1 Padrões

Condroitim 4-sulfato extraído de traquéia bovina;

Ácido D-glucurônico e N-acetil-D-glucosamina foram adquiridos da

Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA);

Condroitin 6-sulfato de cartilagem de tubarão foi obtido da Seikagaku

Kogyo Co. Ltd. (Tóquio, Japão);

Dissacarídeos insaturados de condroitim sulfato/dermatam sulfato

ΔDi0S, ΔDi4S, ΔDi6S, foram obtidos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis,

MO, EUA);

Dissacarídeos insaturados de condroitim sulfato/dermatam sulfato

ΔDi4,6S foram obtidos da Seikagaku Kogyo Co. Ltd. (Tóquio, Japão);

4.1.2.2 Eletroforese

Eletroforese em gel de agarose (0,5%) tampão 1,3-diaminopropano acetato

(PDA):

Agarose obtida da Bio-Rad Laboratories Inc. (Richmond, CA, EUA) foi

dissolvida em tampão 1,3-diaminopropano acetato (PDA) (Sigma-Aldrich

Co., St. Louis, MO, EUA), 0,05 M, pH 9,0 e ácido acético (LABSYNTH,

Diadema, SP, Brasil), em água destilada;

Brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON) da Merck (Darmstadt,

Alemanha) em água destilada;

Azul de toluidina (Vetec Química Fina Ltda, Duque de Caxias, RJ, Brasil)

solução 1% de ácido acético (LABSYNTH, Diadema, SP, Brasil) e 50%

de etanol PA (PROQUÍMIOS, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) em água

destilada;

Benzina adquirida da ISOFAR Indústria e Comércio de Produtos

Químicos Ltda. (Duque de Caxias, RJ, Brasil).

32

Eletroforese em gel de poliacrilamida em tampão Tris-EDTA:

Gel de corrida: persulfato de amônio (APS) (Vetec Química Fina Ltda.,

Duque de Caxias, RJ, Brasil), N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamina

(TEMED) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), solução de

acrilamida/ bisacrilamida (Ludwig Biotecnologia Ltda., Porto Alegre, RS,

Brasil e Neon Comercial Ltda., São Paulo, SP, Brasil), tampão Tris-HCl

0,06 M (Biosolve, Valkenswaard, Holanda e Vetec Química Fina Ltda.,

Duque de Caxias, RJ, Brasil) e água destilada;

Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE):

Cianoborohidreto de sódio e 2-aminoacridona (AMAC) foram adquiridos

de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA);

Resolving gel: persulfato de amônio (APS) (Vetec Química Fina Ltda.,

Duque de Caxias, RJ, Brasil), N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamina

(TEMED) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), solução de

acrilamida/ bisacrilamida (acrilamida (Ludwig Biotecnologia Ltda., Porto

Alegre, RS, Brasil) e bisacrilamida (Neon Comercial Ltda., São Paulo,

SP, Brasil) em água destilada), tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 e água

destilada;

Stacking gel: persulfato de amônio (APS) (Vetec Química Fina Ltda.,

Duque de Caxias, RJ, Brasil), N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamina

(TEMED) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), solução de

acrilamida-bisacrilamida T 40%, C 5%; tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,7 e

água destilada;

Tampão de corrida (Tris-glicina) pH 8,3 (Tris (2-amino-2hidroximetil-

propano-1,3-diol) (Biosolve, Valkenswaard, Holanda) e glicina (Sigma-

Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA).

4.1.2.3 Enzimas

Condroitinases:

33

Papaína PA (PROQUÍMIOS, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) em tampão

fosfato-cisteína 0,05 M pH 6,5. (cisteína-HCl (Sigma-Aldrich Co. St.

Louis, MO, EUA), EDTA sal dissódico (Êxodo Científica, Hortolândia,

SP, Brasil), Na2HPO4 e NaH2PO4 (Vetec Química Fina Ltda, Duque de

Caxias, RJ, Brasil) em água destilada).

Condroitinase AC de Flavobacterium heparinum ambos gentilmente

cedidos pela Profª. Drª. Yara Maria Corrêa da Silva Michelacci da

Universidade Federal de São Paulo.

4.1.2.4 Resinas Cromatográficas

Resina Q-Sepharose Fast Flow e Sephadex G50 foram adquiridas da

GE Healthcare Bio-Sciences AB (Uppsala, Suécia).

4.1.2.5 Outros reagentes e equipamentos:

Os demais reagentes utilizados, todos de grau analítico, eram de uso

comum no laboratório, assim como os equipamentos.

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Extração de glicosaminoglicanos dos tecidos de lula

Para a extração de glicosaminoglicanos, os tecidos de lula selecionados

(tentáculos e pele), foram picotados em pequenos fragmentos de

aproximadamente 1 mm e submetidos à proteólise com papaína (1 mg/mL em

tampão fosfato - cisteína 0,05M, pH 6,5), na proporção de 2 mL de solução da

enzima para 100 mg de tecido. Após incubação por 24 horas a 60°C, ácidos

nucléicos e proteínas foram precipitados pela adição de ácido tricloroacético

(TCA 10%), em presença de NaCl 1 M. Após 20 minutos em banho de gelo, o

precipitado formado foi removido por centrifugação (2500 rpm por 20 minutos).

Ao sobrenadante foram adicionados, lentamente e sob agitação, 2,5 volumes

de etanol para precipitação de glicosaminoglicanos. Após 24 horas a -20°C, o

precipitado foi coletado por uma nova centrifugação e seco à vácuo.

34

4.2.2 Purificação dos glicosaminoglicanos dos tecidos de lula

4.2.2.1 Cromatografia de Troca Iônica (Q-Sepharose)

Foi realizada purificação dos extratos obtidos por cromatografia de troca

iônica (Ion Exchange Chromatography – IEC) em resina de Q-Sepharose Fast

Flow (FF) da seguinte maneira:

Amostras (10 mg) foram solubilizados em água destilada (5 mg/mL), em

seguida, aplicadas na coluna de Q-Sepharose (2 mL de resina)

previamente equilibrada com solução de NaCl 4M. A coluna foi lavada

com 3 volumes de água destilada e iniciado a eluição em step wise com

3 volumes de soluções de NaCl em concentrações crescentes (0, 0,5, 1

e 2 M), em um total de 4 frações. Essas frações foram precipitadas com

2,5 volumes de etanol em NaCl 1 M. Após 24 horas a -20°C, o

precipitado de cada fração foi coletado por centrifugação (2500 rpm por

20 minutos) e seco à vácuo, sendo ressuspenso em 50 µL de água e

analisado por eletroforese em gel de agarose (0,5%) tampão 1,3-

diaminopropano acetato (PDA).

4.2.2.2 Dessalinização das Frações Purificadas por Cromatografia de Gel

Filtração em Sephadex G-50

Alíquotas das frações NaCl 1 e 2 M (10 mg/mL) de amostras de lula

purificadas por cromatografia de troca-iônica em Q-Sepharose foram

dessalinizadas em cromatografia de gel filtração Sephadex G-50 (10 mL). Após

aplicação das alíquotas na coluna, estas foram submetidas à secagem à

vácuo.

4.2.3 Análise dos glicosaminoglicanos de tecidos de lula

4.2.3.1 Eletroforeses

4.2.3.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose (0,5%) Tampão 1,3-Diaminopropano

Acetato (PDA)

35

Glicosaminoglicanos extraídos dos tecidos de lula foram analisados por

eletroforese em gel de agarose (0,5%) em tampão 1,3-diaminopropano acetato

(PDA) 0,05 M, pH 9,0 (DIETRICH & DIETRICH, 1976). Uma mistura padrão de

glicosaminoglicanos (5 µL), contendo condroitim sulfato, dermatam sulfato e

heparam sulfato, na concentração de 1 mg/mL cada, foi aplicada às lâminas

como controle. A corrida eletroforética foi realizada em câmara refrigerada,

submetida a uma diferença de potencial 100 V, por aproximadamente 1 hora.

Após a corrida, o gel foi submerso em solução de brometo de

cetiltrimetilamônio (CETAVLON) 0,1%, por 2 horas. Após esse período o gel foi

seco em corrente de ar quente e corado com azul de toluidina 0,1% em solução

de ácido acético 1%: etanol 50% por 20 minutos. O excesso de corante foi

posteriormente removido com solução de ácido acético 1%: etanol 50%. O gel

foi digitalizado e os glicosaminoglicanos quantificados por densitometria

usando o programa TotalLab TL120 1D v 2009 (Nonlinear Dynamics Ltd.).

4.2.3.1.2 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em Tampão Tris-EDTA

Análise do peso molecular em amostras de glicosaminoglicanos extraídos

de tecidos de lula foi realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida como

adaptado por Hilborn & Anastassiadis (1971) e modificado por Dietrich & Nader

(1974). Alíquotas das amostras de pele e tentáculo foram ressuspensas em 5

µL de tampão de amostra (Tris 40 mM, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM, glicerol 40%,

vermelho de cresol 0,05%) e aplicadas em gel de poliacrilamida 7,5% em

tampão Tris-HCl 20 mM. A eletroforese foi realizada em tampão de corrida

contendo Tris 40 mM, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM (100 V), e após 1 hora de

corrida o gel foi removido das placas e corado com azul de toluidina 0,1% em

ácido acético 1%, por 5 minutos. O excesso de corante foi removido com

solução de ácido acético 1%, e o gel digitalizado e submetido à análise por

densitometria pelo programa TotalLab TL120 1D v 2009 (Nonlinear Dynamics

Ltd.).

36

4.2.3.1.3 Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE)

A composição dissacarídica das amostras de tentáculo e pele 1 e 2 M foi

avaliada por Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) como

descrito por Cunha (2015).

Derivatização das amostras.

Inicialmente as amostras de tentáculo e pele 1 e 2 M foram incubadas

com condroitinase AC como descrito no item 4.2.3.2. Em seguida, alíquotas

contendo 17,5 µg da amostra tentáculo 1 M e 2 M e pele 1 M, foram secas à

vácuo e derivatizadas com 5 µL de solução de AMAC 20 mM (100 nmol). A

amostra pele 2 M apresentou baixo rendimento sendo derivatizados apenas

6 µg com 3 µL de solução de AMAC 20 mM. Após 15 minutos em temperatura

ambiente foram adicionados 5 µL de solução recém-preparada de

cianoborohidreto de sódio 1 M, para a amostra de pele 2 M foi adicionado 3 µL.

Essa mistura de derivatização foi mantida em banho a 37 °C por 16 horas,

quando então foram adicionados 5 µL de glicerol 60%, novamente para a

amostra pele 2 M esse volume foi de 3 µL. Alíquotas de 2,7 µg de todas

amostras derivatizadas foram então analisadas por FACE ou congeladas a –

80°C para posterior análise. Foi utilizado como padrão condroitim 4 sulfato e 6

sulfato.

Preparo dos Géis de Poliacrilamida e Eletroforese.

A FACE foi realizada em sistema de eletroforese vertical Mini-PROTEAN

Tetra Cell com lâminas de 7,2 cm com espaçadores de 0,75 mm. A corrida

eletroforética foi realizada em gel de acrilamida-bisacrilamida 25%, preparados

em sistema-tampão tris-HCl pH 8,8 e 6,7 e, a corrida eletroforética em tampão

tris-glicina pH 8,3.

Solução para dois géis de separação dos dissacarídeos (resolving gel) foi

preparada a partir de 5,0 mL de solução de acrilamida-bisacrilamida T 40%, C

5%; 1,5 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 e 3,5 mL de água destilada. Para

iniciar a polimerização dos géis foram adicionados 70 μL de solução de

37

persulfato de amônio 10% (APS) e 7 μL de N,N,N’,N’-Tetrametiletilenodiamino

(TEMED). Verteu-se a solução para o conjunto de lâminas do sistema Mini-

PROTEAN Tetra Cell e foi adicionado butanol ao topo para total polimerização.

Os géis de entrada (stacking gel) foram preparados com 500 µL de solução de

acrilamida-bisacrilamida T 40%, C 5%; 660 µL de tampão Tris-HCl 0,5 M, pH

6,7 e 3,0 mL de água destilada. Depois que o butanol foi removido, adicionou-

se 50 μL de APS 10% e 10 μL de TEMED a solução do stacking gel, e em

seguida, verteu-se a mesma sobre o resolving gel, colocando os pentes de

amostra para total polimerização do stacking gel.

Decorrido a polimerização dos géis, 150 mL de tampão Tris-glicina (0,025

M/0,192 M), pH 8,3 foram adicionados ao anodo, em seguida, os pentes de

amostra foram removidos e 2-4 μL das amostras e padrões foram aplicados. O

catodo foi preenchido com aproximadamente 500 mL de tampão de corrida

Tris-glicina e a corrida eletroforética foi realizada sob uma diferença de

potencial de 100 V por cerca de 20 minutos, em seguida, aumentada para 220

V até o fim da corrida. A migração dos dissacarídeos foi acompanhada

utilizando luz UV 320-400nm (luz negra). Após a corrida, as imagens foram

digitalizadas em GelDoc-It Imaging System (transluminador UV com filtro em

365 nm e Câmara Scientific Grade CCD GelCam 310), em diferentes tempos

de exposição.

4.2.3.2 Caracterização Enzimática

Foi realizado a degradação enzimática com condroitinase AC de

Flavobacterium heparinum das amostras purificadas em cromatografia de troca

iônica, tentáculo e pele eluídas com 1 e 2 M de NaCl (YAGAMATA et al., 1968;

MICHELACCI & DIETRICH, 1975; CÁSSARO E DIETRICH 1977; JANDIK et

al., 1994; AGUIAR et al., 2003). Alíquotas de 20 µg das amostras, com exceção

da amostra pele 2 M que foi de 6,9 µg, foram incubadas com 10 µL de

condrotinase AC de Flavobacterium heparinum à 37 ºC no período de 18 h em

tampão Tris-acetato 0,05 M, pH 8,2. Após o período de incubação, a enzima foi

inativada em banho fervente (100 ºC) por 10 minutos. Os produtos da

degradação foram secos a vácuo, ressuspensos em água destilada e

analisados por eletroforese em gel de agarose em tampão PDA.

38

4.2.3.3 Dosagens Químicas

4.2.3.3.1 Dosagem de Ácido Urônico

A dosagem de ácido urônico das amostras foi realizada utilizando o

método de Di Ferrante (1971). Em tubo contendo 10 µL de amostra foram

adicionados 2,5 mL do reagente de borato (tetraborato de sódio 0,4% em ácido

sulfúrico), seguido de 100 µL de solução de carbazol 0,1% em etanol. Os tubos

foram agitados cuidadosamente em vórtex e aquecidos em banho fervente por

15 minutos. A leitura da absorbância das amostras foi realizada em 525 nm e

os valores de ácido urônico foram calculados por meio de curva padrão com

ácido glucurônico.

4.2.3.3.2 Dosagem de Hexosamina

A dosagem de hexosamina (5 µL de amostra) foi conduzida conforme

método modificado por Rondle & Morgan (1955). Inicialmente, foi realizado a

hidrólise das amostras com HCl 6M a 100ºC por 4 horas com posterior

secagem e neutralização à vácuo na presença de NaOH. Em seguida, as

amostras foram ressuspensas em água e adicionado 0,17 mL do reagente de

acetilacetona. Após incubação (100ºC, 20 min.) e sob pressão, 6,0 mL do

reagente de Ehrlich foi adicionado. A leitura da absorbância das amostras foi

realizada a 530 nm e os valores de hexosamina foram calculados por meio de

curva padrão com N-acetilglucosamina.

39

5 RESULTADOS

5.1 EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS DE

TENTÁCULO E PELE DE LULA

Ambos tecidos foram submetidos à proteólise com papaína por 24 horas,

como descrito no item 4.2.1. Após remoção de DNA e proteínas, os GAG foram

precipitados com etanol e mantidos a -20ºC, por 18-24 horas. O material obtido

foi ressuspenso em água destilada (soluções 10 mg/mL) e analisados por

eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0, sendo

aplicados 5 µL do padrão de GAG de cada amostra. A Figura 9 mostra o

resultado obtido.

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0 de GAG extraídos de tentáculo e pele de lula, corados com azul de toluidina. 1 - Padrão de GAG (condroitim

sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS)); 2 – pele (10mg/mL) 20x concentrado; 3 – pele (10mg/mL) 40x concentrado; 4 – tentáculo (10 mg/mL) 2x concentrado;

O – origem. Fonte: Próprio autor

O método de eletroforese em gel de agarose utilizado neste trabalho,

desenvolvido por Dietrich & Dietrich (1976), é utilizado para a separação de

diferentes GAG, baseando-se na interação entre a diamina presente no tampão

PDA e as cargas negativas dos GAG. Neste método, GAG mais sulfatados

(contendo maior densidade de cargas negativas), como heparam sulfato e

heparina, interagem mais com a diamina do tampão e migram menos. Já

condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS), por apresentar menor

densidade de carga, apresentam maior migração eletroforética. A diferença na

40

migração entre estes dois GAG se deve principalmente à conformação espacial

do ácido urônico (β-D-glucurônico para CS e α-L-idurônico para DS). Após a

corrida eletroforética, os GAG são corados por azul de toluidina, um corante

que se complexa com os grupamentos sulfato destes compostos produzindo

metacromasia, corando-os em roxo.

Na Figura 9, podemos notar bandas metacromáticas em ambos tecidos

analisados por eletroforese em agarose em tampão PDA 0,05M, pH 9,0 com

migração eletroforética entre os padrões de CS e de dermatam sulfato (DS). A

diferença de migração do CS de lula em relação ao CS presente no padrão de

GAG pode estar relacionada a uma maior densidade de carga destes

compostos aumentando assim a interação com a diamina presente no tampão

e consequentemente uma menor mobilidade no gel de agarose.

A Tabela 1 apresenta os rendimentos obtidos de ambos os tecidos:

Podemos observar na Tabela 1 que a pele foi o tecido em que se obteve

maior rendimento em relação ao tentáculo. Porém, como visto na Figura 9, a

amostra de tentáculo apresentou melhor metacromasia, utilizando menor

quantidade de amostra. A partir destes resultados, o material foi submetido à

cromatografia de troca-iônica em Q-sepharose para remoção de compostos

contaminantes e obtermos um maior teor de GAG para as análises posteriores.

5.2 PURIFICAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS EXTRAÍDOS DE TECIDOS

DE LULA POR CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM Q-SEPHAROSE

(FF)

Cromatografia de troca iônica se fundamenta na interação entre cargas

contrárias presentes em um composto de interesse e uma resina

Amostra Rendimento (%)

Tentáculo 0,42

Pele 0,62

Fonte: Próprio autor

Tabela 1. Cálculo do rendimento das amostras após a extração

41

cromatográfica. Posteriormente, estes compostos são eluídos da resina com

soluções salinas de força iônica crescente. Desta forma, quanto maior a

densidade de cargas negativas de uma molécula, maior será a força iônica da

solução salina necessária para eluição da mesma. A resina Q-Sepharose FF

apresenta uma grupamento amônio quaternário com carga positiva capaz de

interagir com as cargas negativas dos GAG.

Amostras dos precipitados (10 mg) foram solubilizados em água destilada

(5 mg/mL) e aplicadas na coluna (contendo 2 mL de resina) previamente

equilibrada com NaCl 4 M. A coluna foi lavada com água destilada e a eluição

foi realizada em step wise com soluções de NaCl em concentrações crescentes

(0 a 2 M), obtendo-se um total de 4 frações de cada tecido. Cada fração foi

posteriormente submetida à precipitação por etanol (2,5V) e analisada por

eletroforese em gel de agarose em tampão PDA, pH 9,0, como mostrado na

Figura 10.

Os GAG dos tecidos de lula foram eluídos com concentrações de NaCl

que variaram entre 0,5 a 2,0 M. O mesmo padrão de eluição foi observado em

ambos os tecidos. Estes resultados mostram que tanto para pele como para

tentáculos, a eluição dos GAG ocorreu em faixa de concentração de NaCl entre

1 e 2 M, com migração eletroforética próxima do CS. Novamente pela

A

Figura 10. Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0 de GAG extraídos e purificados em Q-Sepharose de pele (A) e tentáculo (B) de lula. 1 - Padrão de GAG (condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS)); 2 – Fração amostra; 3 – Fração

H2O; 4 – Fração 0,5 M NaCl; 5 – Fração 1,0 M NaCl; 6 – Fração 2,0 M NaCl; O – origem. Fonte: Próprio autor.

42

intensidade da metacromasia observa-se que o tentáculo apresenta maior teor

de GAG que a pele.

Os GAG purificados por cromatografia de troca iônica foram submetidos

a caracterização estrutural parcial por diferentes metodologias, que serão

mostradas à seguir.

5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS DE LULA

5.3.1 Identificação por degradação enzimática

Liases bacterianas são importantes ferramentas na identificação e

análise estrutural de GAG. Condroitinases (ou condroitim liases) de

Flavobacterium heparinum são endoglicosidases que reconhecem ligações

glicosídicas presentes em condroitim sulfato, dermatam sulfato e ainda ácido

hialurônico. De acordo com sua especificidade são denominadas como:

condroitinase AC (N-acetilgalactosamina ou N-acetilglucosamina e ácido D-

glucurônico), condroitinase B (N-acetilgalactosamina e ácido L-idurônico),

condroitinase C (N-acetilgalactosamina 6S ou não sulfatada e ácido D-

glucurônico). Condroitinase ABC quebra ligações β glicosídicas em CS, DS e

AH. Alíquotas contendo as amostras de tentáculo e pele 1 e 2 M purificadas,

foram incubadas com condrotinase AC de Flavobacterium heparinum à 37 ºC

no período de 18 h. Após o período de incubação, a enzima foi inativada em

banho fervente por 10 minutos, as amostras foram secas a vácuo,

ressuspensas em água destilada (2 mg/mL) e analisadas por eletroforese em

gel de agarose tampão PDA.

Após degradação com condroitinase AC, houve a diminuição da banda

com migração semelhante e próxima ao CS do padrão de GAG, em todos os

tecidos analisados (tentáculo e pele), sugerindo, de acordo com a

especificidade da enzima, que o GAG presente nos tecidos de lula é condroitim

sulfato (Figura 11).

43

Observando ainda a Figura 11C podemos notar que após digestão com

condroitinase AC a amostra tentáculo 2 M apresentou uma segunda banda

metacromática na altura de HS sugerindo a presença de outros GAG na

amostra.

A

Figura 11. Eletroforese da purificação de GAG em Q-Sepharose de pele (A) e tentáculo (B) de lula e eletroforese da degradação de GAG de lula incubados com condroitinase AC. Alíquotas de mistura de incubação (5 µL) foram submetidas a eletroforese e corados, como descrito em Métodos. 1: Padrão de GAG (CS; DS;

HS); 2: padrão de C6S; 3: padrão de C6S com enzima Chase AC, 4: pele 1 M com Chase AC; 5: pele 2 M com Chase AC; 6: tentáculo 1 M com Chase AC; 7

tentáculo 2 M com Chase AC; O – origem. Fonte: Próprio autor.

44

5.3.2 Análise dos produtos da degradação de condroitim sulfato por

condroitinase AC

FACE (Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis) é um

método de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) aplicado à separação

e visualização de açúcares derivatizados com fluoróforo em seu grupamento

aldeído livre. A marcação dos sacarídeos confere alta sensibilidade para sua

detecção e quantificação nos géis (eletrofluorogramas), quando iluminados por

luz UV e digitalizados por sistema de aquisição de imagens. Por esse método

também é possível determinar o tipo de dissacarídeo comparando a migração

dos produtos de degradação das amostras com os de padrões conhecidos, que

em nosso experimento foram ΔDi0S, ΔDi4S, ΔDi6S, ΔDi4,6S. Inicialmente os

CS de lula foram incubados com 10 µL de chase AC de F. heparinum a 37°C

por 18h. Após o tempo de incubação a enzima foi inativada em banho fervente

por 10 minutos. As amostras foram secas a vácuo e submetidas à

derivatização com 5 µL de AMAC, na presença de cianoborohidreto de sódio

1M, a 37°C por 16 horas. Após este tempo, 5 µL de glicerol 60% foram

adicionados à cada amostra. Alíquotas (2 µL dos padrões; 2,31 µL das

amostras de tentáculo 1 e 2 M e pele 1 M e 4,03 µL da amostra de pele 2 M )

foram submetidas à análise por FACE no sistema Tris-glicina, demonstrado na

Figura 12.

A B

Figura 12. Eletrofluorogramas no sistema Tris-glicina de produtos de digestão de

condroitim sulfato de tentáculo (A) e pele (B) de lula após degradação com

condroitinase AC. Alíquotas de cada amostra foram incubadas por 18h com

condroitinase AC e derivatizadas com AMAC. T1 e T2: tentáculo 1 e 2 M

respectivamente; P1 e P2: pele 1 e 2 M respectivamente. Fonte: Próprio autor.

45

Tabela 2. Porcentagem relativa de produtos de digestão de CS de tentáculo e pele de lula por

condroitinase AC de F. heparinum, determinada por FACE Tris-glicina

A Figura 12 e a Tabela 2 mostram que ΔDi6S foi o dissacarídeo

predominante nas amostras de tentáculo e que ΔDi0 e ΔDi6S predominaram

nas amostras de pele, além da presença de dissacarídeo dissulfatado. E ainda

foi visualizado arraste em todas as amostras indicando degradação incompleta

dos CS, com provável presença de oligossacarídeos e tetrassacarídeos.

5.3.3 Determinação de peso molecular por eletroforese em gel de

poliacrilamida

O peso molecular (PM) dos GAG das amostras tentáculo e pele 1 e 2 M

foi estimado por eletroforese em gel de poliacrilamida em tampão tris-glicina pH

8,3, e para isso, alíquotas das amostras foram secas e ressuspensas em

tampão de corrida (Tris 40 mM, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM, glicerol 40%,

vermelho de cresol 0,05%) e submetidas à eletroforese em gel de

poliacrilamida como descrito em metodologia, item 4.1.2.2. A Figura 13

apresenta o gel do PM estimado para os CS extraídos e purificados dos

diferentes tecidos de lula.

Origem CS ΔDi0S (%) ΔDi6S (%) ΔDi4S (%) ΔDi4,6S (%)

Tentáculo 1,0 M NaCl 5,89 51,17 20,19 22,76

Tentáculo 2,0 M NaCl Não detectado 39,11 23,25 37,64

Pele 1,0 M NaCl 37,95 26,64 20,03 15,39

Pele 2,0 M NaCl 25,64 27,00 25,79 21,57

Fonte: Próprio autor.

46

Figura 13. Eletroforese em gel de poliacrilamida 7,5% corado com azul de toluidina 0,1% para peso molecular das amostras de CS de tentáculo e pele de lula purificadas em Q-

Sepharose. 1 - Dextram Sulfato (8 kDa); 2 - C4S (26 kDa); 3 - C6S (67 kDa); 4 - Tentáculo 1,0 M NaCl; 5 - Tentáculo 2,0 M NaCl; 6 - Pele 1,0 M NaCl; 7 - Pele 2,0 M NaCl; O – origem. Fonte:

Próprio autor.

O peso molecular modal das amostras foi estimado por meio de

regressão logarítmica, comparando-se a distância de migração das amostras

testadas com os valores obtidos das amostras de peso molecular já

estabelecido (Dextran, C4S, C6S). CS de tentáculo 2 M apresentou o maior

peso molecular enquanto CS de tentáculo 1 M foi o de menor peso. Já o CS de

pele, em ambas concentrações, apresentou peso intermediário.

5.3.4 Dosagens químicas

Dosagens de hexosamina e ácido urônico foram realizadas como

descrito no item 4.2.3.3.1. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Amostra Peso molecular (kDa)

Tentáculo 1,0 M NaCl 7,16

Tentáculo 2,0 M NaCl 43,69

Pele 1,0 M NaCl 22,05

Pele 2,0 M NaCl 30,71

Tabela 3. Peso molecular modal

Fonte: Próprio autor

47

Tabela 4. Dosagens químicas de CS de lula

Amostra Hexosamina (ug/uL de CS) Ácido urônico ug/uL de CS)

Tentáculo 1,0 M NaCl 2,89 3,33

Tentáculo 2,0 M NaCl 2,04 3,50

C4S 7,49 7,97

C6S 6,67 6,50

Podemos observar com base nos resultados, que a relação

hexosamina/ácido urônico se encontra próxima de 1:1, assim como nos

padrões (C4S e C6S).

Fonte: Próprio autor

48

6 DISCUSSÃO

Polissacarídeos sulfatados de cartilagens de lulas do gênero Loligo têm

tido sua presença reportada por MATHEWS e colaboradores desde 1962 e foi

por CÁSSARO & DIETRICH em 1976 que a identificação de GAG em tecidos

de lula da espécie Loligo brasiliensis também denominada Doryteuthis plei,

encontrada na costa brasileira, foi inicialmente realizada. Observou-se que

nesta espécie, o condroitim sulfato era o glicosaminoglicano majoritário e que

havia também a presença de uma outra macromolécula em menores

quantidades, o heparam sulfato. Resultados semelhantes foram encontrados

em ambos tecidos analisados de Doryteuthis plei em nosso trabalho, onde a

presença de CS nos materiais extraídos foi confirmada por degradação

enzimática com chase AC.

Em um trabalho pioneiro de Kawai e colaboradores (1966) foi detectada

a presença de CS polisulfatado na espécie de lula Ommastrephes sloani

pacificu. Este condroitim isolado possuía alta relação sulfato por hexosamina

(1,55), sugerindo que era um CS supersulfatado e ainda ficou evidenciado por

método de espectroscopia de infravermelho que ele possuía substituições de

grupos sulfato nas posições 4- e 6- do resíduo de GalNAc. Cássaro & Dietrich

também demonstraram que os GAG identificados em Loligo brasiliensis

possuíam um elevado valor de sulfato por dissacarídeo (1,6), porém o dado

encontrado não pode ser atribuído somente ao CS pois havia HS na amostra

analisada. Em nosso trabalho, não foi possível realizar a dosagem de sulfato

devido ao baixo rendimento apresentado após a purificação e dessalinização.

Porém, por meio da FACE (Figura 12 e Tabela 2), podemos observar que o

dissacarídeo sulfatado predominante foi o ΔDi6S, conferindo uma maior

densidade de cargas negativas, o que justifica a migração eletroforética

próxima à região de DS verificada para o CS de D. plei no sistema de

eletroforese em gel de agarose em tampão PDA (Figura 10). O perfil de

eluição de CS na cromatografia de troca-iônica também nos indicou que os

GAG encontrados possuíam uma alta densidade de cargas negativas, já que

populações eluíram em concentrações salinas superiores a 1 M (Figura 10).

A alta polidispersividade verificada nos géis de poliacrilamida em tampão

tris-glicina pH 8,3 indica uma grande heterogeneidade no tamanho das cadeias

49

de CS de lula (Figura 13 e Tabela 3). Pesos moleculares maiores foram

encontrados em CS supersulfatado obtido de proteoglicanos de pele de Illex

illecebrosus coidenti possuindo cadeias de até 110 kDa (KARAMANOS,1992).

A análise dissacarídica foi conduzida por degradação dos CS de lula

com condroitinase AC de Flavobacterium heparinum e posterior análise por

FACE. Tanto para tentáculo como para pele a proporção total de dissacarídeos

monosulfatados (ΔDi4S e ΔDi6S) foi semelhante e próximo a 20-30%, com

exceção das amostras de tentáculo (1 e 2 M) onde o ΔDi6S estava em maior

quantidade (entre 40 e 50%). Ainda foram detectadas unidades dissacarídicas

sulfatadas na posição 4 e 6 do GalNAc (ΔDi4,6S) e dissacarídeos não-

sulfatadas (ΔDi0S), com exceção da amostra de tentáculos 2 M em que ΔDi0S

não foi detectado. Os resultados observados em nosso trabalho corroboram

com os já descritos na literatura os quais relatam que proteoglicanos de

condroitim supersulfatado degradados com condroitinase AC, condro-4-

sulfatase e condro-6-sulfatase, apresentaram dissacarídeos monosulfatados,

di-sulfatados e tri-sulfatados em tecido de pele da lula Illex illecebrosus

coidentii (KARAMANOS et al., 1992).

Estudos assim como o nosso procuraram determinar a presença de

condroitim supersulfatado obtido a partir de diferentes tecidos de lula, porém

nem sempre unidades-E foram predominantes.

Além dos dissacarídeos, a digestão de CS de lula com condroitinase AC

também levou a formação de oligossacarídeos e tetrassacarídeos, indicando

degradação incompleta dos CS. Em um trabalho anterior, nosso grupo de

pesquisa (Carvalho, 2015) sugeriu que esta digestão incompleta do CS de lula

D. plei possa ser devido a uma resistência do substrato à ação da enzima.

Acredita-se que a maior sulfatação dos CS de lula foi determinante para a

resistência a algumas condroitinases AC.

50

7 CONCLUSÃO

Neste trabalho concluímos que:

CS foi o principal GAG extraído dos tecidos de tentáculos e pele de lula

(Doryteuthis plei), porém detectou-se um outro GAG sulfatado, com

mobilidade eletroforética semelhante a HS, no tecido de tentáculo após

purificação;

A relação hexosamina/ácido urônico das amostras de tentáculo

encontrou-se próxima de 1:1;

Os CS extraídos e purificados por cromatografia troca iônica

apresentaram alta polidispersividade no PM estimado. As amostras de

pele (1 e 2 M) apresentaram PM intermediário em torno de 20 – 30 KDa,

enquanto as amostras de tentáculo variaram entre 7 – 44 KDa, para 1 e

2 M, respectivamente;

O CS de tentáculo e pele da lula D plei apresentou dissacarídeos não

sulfatados, monosulfatados e di-sulfatados após degradação com

condroitinase AC;

Até o momento, não se tem conhecimento de publicações que

demonstrem a caracterização estrutural de CS em tecidos de pele e

tentáculo de lula.

.

51

REFERÊNCIAS

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