UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA PS-GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS

IMUNOLOGIA E DIP

Juliana Melo

AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM

A BACTRIA Brucella abortus

Juiz de Fora 2017

JULIANA MELO

AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM

A BACTRIA Brucella abortus

Dissertao de Mestrado do Curso de

Ps-Graduao em Cincias Biolgicas:

rea: Imunologia e Doenas Infecto-

Parasitrias para obteno do Ttulo de

Mestre em Cincias Biolgicas: rea:

Imunologia e Doenas Infecto-

Parasitrias. .

Orientador: Prof. Dr. Gilson Costa Macedo

Juiz de Fora 2017

JULIANA MELO

AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM

A BACTRIA Brucella abortus

Dissertao de Mestrado do Curso de

Ps-Graduao em Cincias Biolgicas:

rea: Imunologia e Doenas Infecto-

Parasitrias para obteno do Ttulo de

Mestre em Cincias Biolgicas: rea:

Imunologia e Doenas Infecto-

Parasitrias.

Exame de Qualificao aprovado em:

_____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________________ Dr Priscila de Faria Pinto

Universidade Federal de Juiz de Fora.

__________________________________________________________ Dr Michele Cristine Ribeiro de Freitas

Universidade Federal de Juiz de Fora.

__________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Costa Macedo (orientador)

Universidade Federal de Juiz de Fora.

Dedico esse trabalho a Deus que em sua infinita bondade e amor me permitiu dar mais esse passo em minha jornada.

AGRADECIMENTOS

Seria impossvel no iniciar os agradecimentos sem citar inicialmente Aquele que foi

o grande pilar para a concluso de mais uma etapa importante da vida. Meu muito

obrigada a Deus por ter me amparado e sustentado at aqui.

Agradeo a minha famlia, em especial aos meus pais Regina e Ivamar por todo

amor, oraes, confiana e suporte. Obrigada por me amarem e entenderem a

ausncia.

Agradeo ao Professor Dr. Gilson Macedo pela orientao e suporte na realizao

dessetrabalho.

Aos amigos do laboratrio de imunologia da UFJF que forneceram auxlio e fizeram

esses ltimos anos mais leves.

Agradeo tambm a professora Dra. Priscilla Pinto e sua aluna Danielle Merconato

pelo acolhimento no laboratrio de Bioqumica da UFJF bem como pelo auxlio em

experimentos.

Agradeo aos amigos de Resende por todo amor, apoio, torcida alm da

compreenso pela ausncia.

Aqueles que passam por ns, no vo ss, no nos deixam ss. Deixam um pouco de si, levam um pouco de ns.

Antoine de Saint-Exupry, 1943.

RESUMO

A brucelose uma doena infectocontagiosa causada por bactrias do gnero

Brucella que acometem o homem e uma grande variedade de animais domsticos,

resultando em prejuzos econmicos significativos aos sistemas de produo. Em

humanos essa infeco pode causar febre ondulante, endocardite, artrite,

osteomielite e complicaes neurolgicas enquanto em animais leva ao aborto e

infertilidade. Sabe-se que a resposta imunolgica a bactrias intracelulares como a

Brucella ocorre essencialmente atravs da imunidade mediada por clulas, sendo

macrfagos especialmente importantes no combate infeco. Entretanto, apesar

da efetividade da resposta, a B. abortus conta com diversos mecanismos de evaso,

o que garante a sua sobrevivncia no organismo hospedeiro. Dentre estes

mecanismos, a modulao de clulas apresentadoras de antgenos tem sido

apontada como um dos mais relevantes. Recentemente, diversos trabalhos tm

evidenciado a importncia das NTPDases e da molcula PD-1 na modulao da

resposta imune. As NTPDases esto envolidas com a produo de adenosina que

apresenta relevante carter imunomodulador. J a molcula PD-1 est associada a

induo de um perfil anti-inflamatrio com diminuio de IL-12 e aumento de IL-10.

Neste contexto, o objetivo deste estudo foi determinar se a infeco com B. abortus

capaz de alterar a expresso destas molculas e assim limitar a ao do sistema

imune, favorecendo a sobrevivncia do patgeno. Para isso, clulas RAW 264.7

foram infectadas com B.abortus e a modulao das molculas CD80, CD86, CD40,

MHCII, foi avaliada por citometria de fluxo. Em seguida, a expresso de CD39

tambm foi determinada por citometria de fluxo e por Western Blot. Por fim

analisamos possveis alteraes na expresso da molcula PD-1 induzidas pela

bactria. Como resultados, foi confirmado que a infeco capaz de inibir a

expresso de CD80, CD86 e CD40, embora o mesmo no tenha sido observado

com o MHCII. Alm disso, a expresso de CD40 se mostrou diminuda mesmo aps

o estmulo com LPS. De forma surpreendente, foi observada uma diminuio na

expresso das molculas CD39 e PD-1, o que pode ser explicado pela menor

ativao celular induzida pela infeco. Assim, os dados obtidos at o momento

demonstram que as molculas CD39 e PD-1 no so utilizadas pela Brucella para

modular as APCs, mas so influenciados pela menor ativao celular induzida pelo

patgeno.

Palavras chave: Brucella.abortus. Imunomodulao. PD-1. CD39. CD73

ABSTRACT

Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella that

affect humans and a wide variety of domestic animals, resulting in significant

economic losses to production systems. In humans the infection can cause undulant

fever, endocarditis, arthritis, osteomyelitis and neurological complications while in

animals leads to abortion and infertility. It is known that the immune response to

intracellular bacteria such as Brucella occurs primarily by cell-mediated immunity,

macrophage being especially important in fighting infection. However, despite the

effectiveness of the response, B. abortus has several avoidance schemes, which

ensures their survival in the host organism. Among these mechanisms, modulation of

antigen-presenting cells has been identified as one of the most relevant. Recently,

several studies have shown the importance NTPDase and PD-1 molecule to

modulate the immune response. The NTPDase are envolidas with the production of

adenosine which presents immunomodulatory relevant character. Since PD-1

molecule is associated with induction of an anti-inflammatory profile with decreased

IL-12 and IL-10 increase. In this context, the aim of this study was to determine

whether infection with B. abortus is able to alter the expression of these molecules

and thus limit the action of the immune system, favoring the survival of the pathogen.

To this end, RAW 264.7 cells were infected with B.abortus and modulation of CD80

molecules, CD86, CD40, MHCII, was evaluated by flow cytometry. Then the CD39

expression was also determined by flow cytometry and Western blot. Finally, we

analyze possible changes in PD-1 molecule expression induced by bacteria. As a

result, it was confirmed that the infection is capable of inhibiting expression of CD80,

CD86 and CD40, although this has not been observed with MHCII. Additionally,

CD40 expression showed decreased even after the stimulation with LPS.

Surprisingly, it was observed a decrease in the expression of CD39 and PD-1

molecules, which can be explained by the lower cellular activation induced by the

infection. Thus, the data obtained so far show that the PD-1 and CD39 molecules are

not used by Brucella Modular APCs but are less influenced by cellular activation

induced by the pathogen.

Keywords: Brucella.abortus. Immunomodulation. PD-1. CD39. CD73

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Marcadores de superfcie envolvidos no desenvolvimento de respostas imunolgicas ................................................................................................................................................. 24

Figura 2. Exemplificao da produo de adenosina aps degradao sequencial de ATP/ ADP via CD39 e CD73 em macrfagos ............................................................................... 28

Figura 3. Determinao da zona de macrfagos ........................................................................ 35

Figura 4. Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD80 ........................... 38

Figura 5. Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD86 ........................... 39

Figura 6. Anlise da expresso de molculas MHC II ............................................................. 41

Figura 7. Avaliao da expresso de molculas CD40 .......................................................... 43

Figura 8. Anlise da expresso de molculas CD39 ............................................................... 45

Figura 9 Identificao da NTPDase 1/ CD39 em macrfagos pela tcnica de Western blotting .......................................................................................................................................... 47

Figura 10. Avaliao da expresso de molculas PD-1 ......................................................... 49

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Anticorpos utilizados nos ensaios de citometria .................................................... 34

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADP Adenosina difosfato

AMP Adenosina monofosfato

APC Antigen presented cell - Clulas apresentadora de antgenos

ATP Adenosina trifosfato

BB Meio Brucella Broth

CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4 Antgeno 4 associado

a linfcito T citotxico

DMSO Dimetilsulfxido

DNA Desoxyribonucleic acid

FoxP3 Fator de transcrio Forkhead Box P3

IDO Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase

IFN- Interferon-gama

IL Interleucina

LPS lipopolissacardeo

MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1 - Protena quimiottica de

moncitos-1

MHC Major Histocompatibility Complex Complexo de histocompatibilidade

principal

MOI Multiplicity of infection Multiplicidade de infeco

NK Natural Killer

NO Nitric Oxide Oxido ntrico

PAMPs Pathogen associated molecular patterns - Padres moleculares

associados a patgenos

PBS Phosphate buffered saline - Tampo salina fosfato

PD-1 Programador de morte celular-1

PNCEBT Programa Nacional de Controle e Erradicao da Brucelose e

Tuberculose

PRRs Pattern recognition receptor - Receptores de reconhecimento de

padres

SFB Soro fetal bovino

TCR T cell receptor Receptor de clula T

TGF- Transforming growth factor beta Fator-beta de transformao do

crescimento

TH1 T helper 1 Linfcitos T auxiliar 1

TH2 T helper 2 Linfcitos T auxiliar 2

TLR Toll Like Receptor - Receptores do tipo Toll

TNF- Tumor necrosis fator alpha - Fator alfa de Necrose Tumoral

UFC Unidades formadoras de colnias

SUMRIO

1. INTRODUCO .................................................................................................................................... 13

1.1. EPIDEMIOLOGIA .................................................................................................................... 15

1.2. CARACTERSTICAS PATOGNICAS........................................................................... 16

1.3. RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA Brucella sp................................................. 19

1.4. REGULAO E IMUNOMODULAO .......................................................................... 22

1.5. SINALIZAO PURINRGICA ......................................................................................... 25

1.5.1. AS NTPDases ............................................................................................................... 26

1.6. Brucella sp. E EVASO DA RESPOSTA IMUNOLGICA ................................... 28

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 31

2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................. 31

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................................ 31

3. MATERIAL E MTODOS ............................................................................................................. 32

3.1. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIES DE CULTIVO .................................. 32

3.2. LINHAGEM CELULAR ............................................................................................................ 32

3.3. CULTURA DE CLULAS....................................................................................................... 32

3.4. CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................................................... 33

3.5. CULTURA DE MACRFAGOS E PREPARO DE HOMOGENEIZADO

CELULAR ............................................................................................................................................... 35

3.5.1. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E

IDENTIFICAO PELA TCNICA WESTERN BLOTTING .................................... 36

3.6. ANLISE ESTATSTICA ........................................................................................................ 36

4. RESULTADOS .................................................................................................................................. 37

5. CONCLUSO..................................................................................................................................... 51

6. PERSPECTIVAS .............................................................................................................................. 52

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................................. 53

1. INTRODUO

A brucelose uma doena infectocontagiosa causada por bactrias do gnero

Brucella, que acometem o homem e uma grande variedade de animais domsticos

(NICOLETTI, 1989). Apresenta-se na forma endmica em muitos pases, resultando

em prejuzos econmicos significativos aos sistemas de produo, alm de srias

implicaes na sade animal e pblica, visto seu carter zoontico (BRASIL, 2006).

1.1. HISTRICO

O grupo bacteriano responsvel pela transmisso da brucelose foi descrito no

homem pela primeira vez por Marston, em 1859, a partir de casos de febre

ondulante seguidos de morte, ocorridos na Ilha de Malta, no Mar Mediterrneo,

sendo por isso denominada tambm de Febre de Malta (NICOLETTI, 2002;

POESTER et al., 2009).

Em 1887, o mdico ingls, Sir David Bruce, isolou pela primeira vez uma

bactria do bao de soldados britnicos mortos na Ilha de Malta, denominando-a

como Micrococcus melitensis (VIEIRA, 2004; GODFROID et al., 2005; POESTER et

al., 2009). J em 1895, Bernhard Bang, um patologista veterinrio

dinamarqus,isolou um microrganismo do tero e de membranas fetais resultantes

do aborto de vacas, identificando-o como Bacillus abortus (NICOLETTI, 2002;

POESTER et al., 2009).

Nos EUA, em 1918, Alice Evans demonstrou que os microrganismos isolados

por Bruce e Bang apresentavam similaridades morfolgicas, imunolgicas e de

cultivo. Em 1920, baseados em tais evidncias, Meyer e Shaw propuseram a criao

do gnero Brucella em homenagem ao autor do primeiro isolamento do agente, alm

da designao dos dois microrganismos descobertos anteriormente por Brucella

melitensis e Brucella abortus, respectivamente (CORRA e CORRA, 1992;

VIEIRA, 2004; RIBEIRO, MOTTA e ALMEIDA, 2008).

No Brasil, o primeiro caso de brucelose humana foi descrito em 1913 por

Gonalves Carneiro e Danton Seixas, que um ano depois realizou pela primeira vez

no pas o diagnstico clnico da brucelose bovina no estado do Rio Grande do Sul

(PAULIN e FERREIRA NETO, 2003; VIEIRA, 2004).

Atualmente, dentro do gnero Brucella, so descritas dez espcies

independentes que so classificadas principalmente por diferenas de

patogenicidade, preferncia de hospedeiro e caractersticas bioqumicas e

antignicas (ALTON et al., 1988; PAJUABA, 2006; OIE, 2009). As espcies

conhecidas so classificadas da seguinte forma: B. melitensis (caprinos), B. abortus

(bovinos), B. suis (sunos), B. canis (ces), B. ovis (ovinos), B. neotomae (ratos do

deserto), B. cetceos (cetceos), B. pinnipedia (pinpedes), B. microti (ratazanas), e

B. inopinata (desconhecido). Dentre essas espcies conhecidas de Brucella, apenas B. abortus, B.melitensis, B.suis e B. canis so patognicas para os seres humanos,

sendo que as infeces causadas por B. canis so raras nos mesmos

(CLOECKAERT et al., 2003; HE, 2012). Embora a B. melitensis seja a espcie mais

patognica, a B. abortus ganha destaque por ser a principal fonte de infeco em

funo da sua maior disseminao no mundo (CORBEL, 1997).

1.2. EPIDEMIOLOGIA

A brucelose uma zoonose distribuda mundialmente, sendo endmica em

regies como Amrica Latina, Oriente Mdio, frica, sia e na bacia do

Mediterrneo. Estima-se que so registrados anualmente no mundo cerca de meio

milho de novos casos de brucelose humana (MANTUR e AMARNATH, 2008; HE,

2012; AVILA-CALDERON et al., 2013). Embora j tenha sido erradicada em diversos

pases da regio norte e central da Europa, alm da Austrlia, Japo e Nova

Zelndia, essa zoonose reemergente continua se mostrando como um grave

problema sanitrio e econmico (CORBEL, 1997; PAULIN e FERREIRA NETO,

2003; OIE, 2009), podendo apresentar em determinados pases uma taxa de

prevalncia superior a dez casos a cada cem mil habitantes, sendo ainda mais

frequente em pessoas que trabalham em fazendas (MANTUR e AMARNATH, 2008).

O Brasil est localizado na rea em que a brucelose endmica, porm sua

disseminao no territrio relativamente diferenciada, principalmente em virtude da

ampla extenso territorial e as caractersticas prprias de cada regio (POESTER et

al., 2002; RIBEIRO, MOTA e ALMEIDA, 2008; LAGE et al., 2008).

Segundo boletim epidemiolgico, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e

Abastecimento MAPA, em 2001, instituiu o Programa Nacional de Controle e

Erradicao da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), que consiste em um conjunto

de medidas sanitrias estratgicas em busca da reduo da prevalncia e incidncia

da brucelose, adotando como medida profiltica a vacinao de bezerras com idade

entre trs e oito meses em todo o pas. Dentre outras atividades previstas no

programa, destacam-se a adeso voluntria dos criadores na busca de rebanhos

livres e monitorados, a prtica de testes sorolgicos regulares em rebanhos de elite

para a participao em feiras e exposies, e o sacrifcio dos animais positivos para

brucelose (BRASIL, 2006).

Esse programa tem como intuito reduzir os impactos causados por essas

doenas na sade pblica, alm de promover a competitividade da pecuria

nacional, haja visto que o Brasil detm o maior rebanho bovino comercial do mundo

(IDAF, 2011).

Visando obter informaes acerca da prevalncia da brucelose bovina no

Brasil, foi realizado nos estados brasileiros um levantamento epidemiolgico a partir

de dados amostrais obtidos de propriedades rurais entre os anos de 2001 e 2004.

Tal estudo aponta que a prevalncia de focos da doena nessas propriedades

amostradas foi de 0,32% em Santa Catarina, 2,5% no Distrito Federal, 4,02% no

Paran, 4,2% na Bahia, 6,04% em Minas Gerais, 9% no Esprito Santo, 9,70% em

So Paulo, 12,60% em Sergipe, 15,42% no Rio de Janeiro, 17,54% em Gois,

21,22% em Tocantins e 35,18% em Rondnia (ALVES e VILLAR, 2011).

O controle dos patgenos associados doena, aliado a medidas profilticas

como a vacinao dos reservatrios animais, so fatores que contribuem de forma

satisfatria para a reduo da incidncia da brucelose humana, fato que vem sendo

observado em alguns pases como Austrlia, pases do norte Europeu e Amrica do

Norte (PAPPAS et al., 2006a).

1.3. CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DA BACTRIA Brucella sp.

As bactrias do gnero Brucella sp., patgenos causadores da brucelose, so

classificadas como cocobacilos Gram-negativos pertencentes classe

Proteobacteria. So microrganismos intracelulares facultativos, imveis e no

esporulados, e apresentam-se na forma de bastonetes curtos que medem de 0,6 a

1,5 m por 0,5 a 0,7 m de dimenso (VELASCO et al., 2000; REDKAR et al., 2001;

PROBERT et al., 2004). Com relao a obteno de energia, so classificados como

microrganismos aerbios, entretanto, sob atmosfera com tenso de 5 - 10% de CO2

h favorecimento para o isolamento de algumas espcies. Apresentam temperatura

de multiplicao de 20 a 40C, sendo 37C a temperatura ideal, e um pH timo que

varia de 6.6 a 7.4 (PAJUABA, 2006; OIE, 2009).

Classicamente, as bactrias do gnero Brucella podem ser divididas em grupos

antigenicamente distintos, sendo denominadas lisas ou rugosas. Tais grupos so

embasados em caractersticas observadas durante o crescimento bacteriano em

meios de cultura e na constituio qumica da parede celular - presena ou ausncia

da cadeia O - um dos componentes do lipopolissacardeo (LPS) localizado na

superfcie externa da Brucella spp que possui relao com a virulncia de algumas

espcies (NIELSEN et al. 2004; CARDOSO et al., 2006).

1.4. CARACTERSTICAS PATOGNICAS DA BACTRIA Brucella sp. E MANIFESTAES CLNICAS DA ZOONOSE

A patogenicidade das bactrias do gnero Brucella est intimamente

relacionada a suas caractersticas morfolgicas, aliadas aos mecanismos de evaso

do microrganismo que favorecem a penetrao, sobrevivncia e multiplicao no

hospedeiro (ARSTEGUI et al., 2001; NIELSEN et al., 2004; XAVIER, 2009).

Em humanos, a brucelose pode ser veiculada pela ingesto de produtos de

origem animal contaminados, principalmente leite e derivados que no passaram por

processamento trmico. Essa doena transmitida tambm atravs do contato

direto ou indireto com animais infectados, fetos abortados ou anexos fetais, alm da

manipulao de carcaas e vsceras provenientes de animais infectados, sem a

utilizao de equipamentos de segurana (PAULIN e FERREIRA, 2008). Em regies

endmicas, a via de infeco mais comum o consumo de produtos lcteos no

pasteurizados, principalmente o leite e o queijo (JONG; ROLAN e TSOLIS, 2010;

EKICI et al., 2012; AVILA-CALDERON et al., 2013).

Uma vez no interior do hospedeiro, seja em humanos ou outros animais, as

bactrias do gnero Brucella podem persistir nas clulas do sistema monoctico

fagocitrio, nas secrees uterinas, na glndula mamria e na medula ssea. Sendo

assim, o descarte adequado dos tecidos que concentram um grande nmero de

bactrias pode reduzir e evitar a contaminao de carcaas e vsceras durante o

abate (CARVALHO et al., 1995; PESSEGUEIRO, BARATA e CORREIA, 2003;

PARDI et al., 2006).

A capacidade de penetrao pela pele lesada ou ntegra e pelas membranas

mucosas favorece a classificao dessa zoonose como uma enfermidade de carter

ocupacional, visto que acomete profissionais que desenvolvem atividades com maior

risco de exposio ao agente causador da doena, sendo estes, consequentemente,

mais propcios infeco conforme tem sido observado em veterinrios,

laboratoristas e trabalhadores de matadouros e frigorficos (LAGE et al., 2008;

MINHARRO, 2009; OIE, 2009). Corroborando esses dados, estudos apontam a

brucelose como a doena bacteriana mais comumente adquirida em laboratrio no

mundo (LUNAMARTNEZ e MEJA-TERN, 2002; PAPPAS et al., 2006a).

As bactrias do gnero Brucella sp podem apresentar dose infecciosa at

mesmo em baixas quantidades, alm de possurem grande potencial de disperso

pelo ar facilitando assim sua transmisso, visto que so bactrias facilmente

aerossolizadas. Sabe-se tambm que infeces humanas com estas bactrias so

debilitantes e difceis de tratar (FRANZ et al., 1997; PAPPAS e PAPADIMITRIOU,

2007). Em funo dessas caractersticas, estas bactrias encontram-se na lista dos

agentes etiolgicos que requerem ateno com relao ao seu potencial uso em

bioterrorismo (GREENFIELD et al., 2002; PAPPAS et al., 2006b).

Em diversos grupos animais, a brucelose apresenta-se como uma infeco

crnica que persiste por toda a vida. O tropismo da bactria pelos rgos

reprodutores responsvel por suas principais manifestaes que so o aborto, a

infertilidade e falhas reprodutivas (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003;

FRANCO et al., 2007).

Com relao aos seres humanos, essa infeco pode causar sintomas como

febre ondulante, endocardite, artrite, osteomielite alm de complicaes

neurolgicas. Tem sido relatado que formas agudas e crnicas da brucelose podem

afetar tambm a coluna vertebral (PAPPAS et al., 2005) causando uma derivao da

doena conhecida como brucelose espinhal que afeta principalmente idosos. A

brucelose tambm pode levar inflamao das articulaes causando artrite,

geralmente registrada nos pacientes com at 30 anos (ALP e DOGANAY, 2008).

A doena raramente fatal em seres humanos, apresentando um percentual

de cerca de 2% de bito, entretanto essa infeco pode provocar debilidade severa

e levar incapacidade do hospedeiro. A doena tende cronicidade e persistncia,

podendo se tornar uma doena granulomatosa capaz de afetar qualquer rgo

(CHRISTOPHER; UMAPATHY e RAVIKUMAR, 2010).

Diagnosticar a brucelose humana de forma rpida e precisa ainda

considerado um desafio para profissionais da sade em virtude de suas

caractersticas clinicas no especificas, sendo frequentemente confundida com a

gripe em funo da similaridade entre os sintomas iniciais (MEMISH et al., 2000).

Dentre os mtodos para diagnstico, o isolamento do microrganismo, tambm

conhecido como teste direto, o teste padro para confirmar a infeco, porm esse

mtodo requer tempo e tcnicos qualificados. Alm disso, o manuseio das amostras

contendo o patgeno representa um alto risco de contaminao (LUNAMARTNEZ e

MEJA-TERN, 2002; PAPPAS et al., 2006a). J os testes indiretos ou sorolgicos

detectam os anticorpos contra Brucella spp presentes em diversos fluidos corporais

como sangue, muco vaginal, smen e leite (POESTER et al., 2009).

At o momento, a ausncia de uma vacina eficaz para a preveno desta

zoonose em seres humanos faz com que a erradicao ou controle da doena sejam

feitos a partir de medidas aplicadas ao animal hospedeiro. O tratamento dessa

infeco alvo de discusso visto que ainda no existe acordo em relao ao

melhor protocolo a ser usado, mas este geralmente requer a utilizao prolongada

de uma combinao de antibiticos, que produz um alvio na sintomatologia,

diminuindo a durao da doena e a ocorrncia de complicaes, podendo assim

prevenir uma possvel recada (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003;

ARIZA et al., 2007; FANNI et al., 2013).

Alm de apresentar relevncia clnica quando acomete o homem, a ocorrncia

da brucelose em outros animais pode resultar em perdas econmicas significativas

como a imposio de barreiras sanitrias e tarifrias ao comrcio internacional de

produtos de origem animal levando a perdas no rendimento industrial, gastos

significativos devido aos altos custos para a implementao dos programas de

controle e erradicao da doena, alm de prejuzos envolvendo a produo animal,

devido ao elevado nmero de abortos, nascimento de animais fracos, baixa

fertilidade nas propriedades rurais e, principalmente, o declnio na produo de leite

e carne (POESTER et al., 2009).

1.5. RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA Brucella sp.

A resposta imune efetiva contra a Brucella sp se inicia com o reconhecimento

de padres moleculares associados ao patgeno (PAMPs - do ingls, pathogen

associated molecular patterns) por receptores de reconhecimento de padres (PRRs

- do ingls, Pattern recognition receptor) (KAWAI e AKIRA, 2007) presentes na

membrana plasmtica ou em compartimentos intracelulares que permitem ao

hospedeiro distinguir bactrias de agentes virais e parasitrios (JANEWAY e

MEDZHITOV, 2002; HOEBE, JANSSEN e BEUTLER, 2004). Entre os PRRs, os

receptores do tipo Toll (TLR do termo em ingls Toll Like Recepor) recebem

destaque uma vez que, aps o reconhecimento e ligao aos PAMPs, atuam de

forma direta ou indireta no processo de gerao de respostas imunolgicas inatas e

adaptativas contra organismos invasores atravs de sinalizaes distintas,

exercendo tambm importante papel na ativao de linfcitos (ONEILL, 2006). Alm

de atuarem na deteco e reconhecimento de patgenos, os TLRs ativam cascatas

de sinalizao induzindo a expresso de molculas coestimulatrias como CD80 e

CD86 expressas sobre a superfcie das clulas apresentadora de antgenos (APC,

do ingls, antigen presented cell) - clulas dendrticas, macrfagos e clulas B -

favorecendo assim o estabelecimento de respostas imunolgicas (HOLGATE, 2012;

DEURLOO et al. 2003).

Em relao aos receptores TLRs envolvidos no reconhecimento da Brucella sp,

estudos anteriores sugerem que os receptores TLR2 e TLR4 reconhecem esse

patgeno e participam da sinalizao que consequentemente induz a produo de

diferentes citocinas (OLIVEIRA et al., 2008).

Em 2005, Huang e colaboradores demonstraram que o DNA (DNA do termo

em ingls desoxyribonucleic acid) da Brucella sp apresenta ligantes para o receptor

TLR9 e que a resposta de citocinas do tipo TH1 (T helper 1) dependente dessa

ativao (HUANG et al., 2005).

Colaborando com esses dados, em 2008, Macedo e colaboradores

evidenciaram a importante participao do TLR9 nesta resposta uma vez que sua

ausncia acarretou significativo aumento da carga bacteriana esplnica, associado a

uma reduo na produo da citocina IL-12 em macrfagos e em clulas dendriticas.

Apesar disso, a produo da citocina TNF- (Fator alfa de Necrose Tumoral) e de

NO (NO - do ingls nitric oxide) no foi afetada pela ausncia de TLR9, sugerindo a

existncia de outros receptores envolvidos nesta resposta. (HUANG et al., 2005;

MACEDO et al., 2008). Alm disso, em estudos mais recentes (2013), Almeida e

colaboradores demonstraram que o TLR6 tambm um importante componente

envolvido no combate ao patgeno e est associado a produo de IL-12 e TNF-

por macrfagos e clulas dendrticas. (ALMEIDA et al., 2013).

Aps serem reconhecidas por tais receptores, bactrias intracelulares como a

Brucella sp sero combatidas principalmente atravs de mecanismos mediados por

clulas que so atradas para o stio infeccioso por meio de quimiocinas como a IL-8

e MCP-1, bem como a produo de citocinas inflamatrias como a IL-1, IL-6 e o

TNF- (COELHO-CASTELLO et al., 2009).

Dentre os diversos tipos celulares envolvidos, os macrfagos so

especialmente importantes na infeco pela Brucella abortus uma vez que so os

principais locais de sobrevivncia e replicao da bactria (BALDWIN e GOENKA,

2006). A ativao de macrfagos leva a fagocitose e a destruio do microrganismo

atravs da produo de uma variedade de mediadores bioqumicos que atuam

diretamente contra as bactrias, dentre eles o perxido de hidrognio (H2O2), nion

superxido (O2- ) e o xido ntrico (NO) so os mais eficazes (COELHO-CASTELLO

et al., 2009). Alm disso, a ativao de macrfagos e de clulas dendrticas

estimula a produo da citocina IL-12 que, como j mencionado, possui um papel

de extrema relevncia. Esta citocina a grande responsvel pela diferenciao dos

linfcitos T para o perfil TH1, relacionado a liberao de citocinas de carter pr-

inflamatrio como IFN- e o TNF- que ativam mais macrfagos e potencializam a

destruio do patgeno (BIRON, 1999; HUANG et al., 2001). Adicionalmente, a IL-

12 tambm ativa clulas Natural Killer (NK) que respondem produzindo mais IFN-

potencializando a ativao de macrfagos (MURPHY et al., 2001).

Tendo em vista que a atuao exclusiva da resposta imunolgica inata no

capaz de promover a eliminao de bactrias patognicas, h necessidade da

participao da resposta imunolgica adaptativa. Nesta etapa destacam-se os

mecanismos efetores que envolvem linfcitos TCD4 e TCD8 (COELHO-CASTELLO

et al., 2009).

A ativao dos linfcitos T CD4 ocorre mediante dois sinais. O primeiro

estimulo recebido por esta clula a partir de um receptor presente em sua

superfcie, chamado TCR (do ingls, T cell receptor) que se liga especificamente a

um peptdeo antignico que apresentado via MHC II (MHC - do ingls, Major

Histocompatibility Complex), presente na superfcie de uma clula apresentadora de

antgenos (APC - do ingls, antigen presented cell). O segundo sinal essencial para

a ativao linfocitria fornecido por molculas coestimulatrias que so expressas

na superfcie de clulas apresentadoras de antgeno ativadas. Classicamente, as

molculas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) recebem destaque entre as molculas

coestimulatrias e exercem papel fundamental na ativao de linfcitos T a partir da

interao com o correceptor CD28 que constitutivamente expresso na superfcie

de clulas T (POD OJIL e MILLER, 2013).

Sabe-se tambm que a interao entre as molculas coestimulatrias CD40L-

CD40 possui papel fundamental em processos imunes celulares. Tem sido

demostrado que a ligao entre a molcula CD40L, expressa principalmente pelas

clulas T e B ativadas, a molcula CD40, presente na superfcie das APCs,

impulsiona a produo de citocinas e induz a expresso de molculas

coestimulatrias facilitando assim a apresentao antignica (ELGUETA et al.,2013).

Outro tipo celular importante na resposta imune contra B. abortus so os

linfcitos T CD8. Uma vez ativadas, estas clulas se diferenciam em linfcitos T

citotxicos (CTLs) capazes de reconhecer e eliminar clulas alvo atravs da

liberao de protenas citotxicas e secreo de citocinas pr-inflamatrias,

principalmente IFN- e TNF-, que ativam os fagcitos (MURPHY et al., 2001). J

foi demonstrado que camundongos que no so capazes de montar uma resposta

atravs de linfcitos T CD8+ (deficientes em MHC de classe I) apresentam um

quadro de brucelose exacerbado, com um aumento substancial na carga bacteriana

esplnica (OLIVEIRA e SPLITTER, 1995).

Os linfcitos B tambm desempenham importante papel no combate ao

patgeno uma vez que atuam na produo de anticorpos antgeno-especifico

capazes de neutralizar e opsonizar o microrganismo, alm de ativar o sistema do

complemento e promover a citotoxicidade mediada por clulas (ADCC) (SKENDROS

e BOURA, 2013).

Em resumo, uma resposta imune efetiva contra a Brucella depende

basicamente da ativao de linfcitos T via MHCI e MHCII, com auxlio dos

coestimuladores (CD80 e CD86). Estas clulas ativadas se diferenciam em linfcitos

TH1 ou CTLs que vo, respectivamente, potencializar a atividade dos macrfagos e

destruir clulas infectadas.

1.6. REGULAO E IMUNOMODULAO

Em paralelo a ativao imunolgica dita anteriormente, um organismo saudvel

frente a infeces apresenta tambm a atuao simultnea de uma resposta

regulatria que extremamente importante para a manuteno da homeostase

(HOLGATE, 2012). Tal resposta compe o repertrio imunolgico e obtida atravs

de clulas e molculas que possuem a funo de suprimir a atuao do sistema

imunolgico e, consequentemente, manter a autotolerncia e prevenir potenciais

efeitos patognicos (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009).

Tem sido relatado que, independente da linhagem, todas as clulas com

carter regulatrio identificadas at o momento podem exercer sua funo

supressora atravs de caractersticas atribudas a dois mecanismos essenciais,

sendo eles o contato direto ou a secreo de citocinas imunossupressoras

(SKAGGS, SINGH e HAHN, 2008).

Dentre as principais citocinas relevantes para o perfil regulatrio esto o TGF-

, IL-10 e a IL-35 que, em geral, promovem a anergia de clulas T e/ou disfuno de

clulas apresentadoras de antgenos (BELKAID, 2007).

O TGF- apresenta efeitos antiproliferativos uma vez que capaz de inibir a

produo da citocina IL-2, essencial para a proliferao de clulas T (BRABLETZ et

al.,1993). Alm disso, essa citocina capaz de induzir a diferenciao de clulas

dendrticas para um perfil tolerognico, limitando a expresso de CD40, CD86 e de

MHCII, alm de aumentar a expresso de CD45RB que considerado um

importante marcador de clulas dendrticas tolerognicas. A citocina em questo

tambm apresentou potencial indutor de IDO (Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase)

que responsvel pela degradao de triptofano (Song et al, 2014). Sabe-se que a

falta desse aminocido essencial tem sido apresentada como causa da inibio da

ativao de clulas T e, consequentemente, responsvel pela induo de apoptose

dessas clulas (FALLARINO et al., 2003).

A citocina IL-10 tambm uma importante molcula imunorregulatria, sendo

produzida principalmente por linfcitos T, clulas B, macrfagos, neutrfilos e

tambm por alguns subconjuntos de clulas dendrticas (SARAIVA; OGARRA,

2010). Essa citocina apresenta proeminente atividade anti-inflamatria tendo sua

atuao primria em fagcitos e em clulas apresentadoras de antgeno, reduzindo

a produo de citocinas pr-infamatrias, tais como TNF- e IL-12, a expresso de

molculas de MHC II e coestimulatrias, bem como a produo de intermedirios

reativos de oxignio e nitrognio (FIORENTINO; BOND; MOSMANN, 1989; MOORE

et al., 2001).

Outra linha de atuao de clulas regulatrias o contato clula- clula. Nesse

contexto a elevada expresso de molculas coinibitrias como o CTLA-4 e PD-1,

tambm tem participao relevante para o perfil regulatrio (BELKAID, 2007)

(Figura1).

A molcula CTLA-4 (do ingls, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) leva a inibio

da ativao de clulas T por induo de um sinal negativo que coincide com a

estimulao do TCR e/ou por coestimulao inibitria competitiva devido alta

afinidade em ligar-se ao CD80 e/ou CD86 quando comparado com CD28. A ligao

entre clulas T e APCs via CTLA-4 B7 acarreta na inibio das APCs e,

consequentemente, na supresso das respostas de clulas T (VIGNALI, COLLISON

e WORKMAN, 2008).

Outra protena que merece destaque na via de inibio a molcula CD279

tambm conhecida como PD-1 (Programadora de morte celular-1) e seus ligantes

PDL-1 e PDL-2, pertencentes famlia B7:CD28. Tais molculas so expressas em

vrios tecidos, com maiores nveis nos pulmes, corao e fgado, sendo que a

expresso das mesmas induzida por diferentes citocinas (BROWN et al., 2003).

A molcula PD-1 encontrada em clulas T CD4 e CD8, clulas B e clulas

mieloides ativadas, entretanto, no encontrado em clulas no estimuladas. Sua

descrio foi concomitante a dos seus ligantes, PDL-1 e PDL-2, que so

encontrados em moncitos e clulas dendrticas ativadas, sendo que a expresso de

tais ligantes parece ser regulada pela citocina IFN- ou IFN- / LPS (LECHNER et

al., 2001).

A atuao do PD-1 na modulao da resposta imune diferente da utilizada

pela molcula CTLA-4, embora ambas tenham a capacidade de suprimir a ativao

de clulas T (PARRY et al., 2005). Sabe-se que aps interao com seus ligantes

ocorre recrutamento de fosfatases que atuam nas quinases responsveis pela

sinalizao via TCR, acarrentando a reduo dessa via de sinalizao e

consequentemente, inibindo a proliferao e produo de citocinas por clulas T

(GREENWALD, FREEMAN e SHARPE, 2005; MATSUMOTO et al., 2008).

Figura 1: Marcadores de superfcie envolvidos no desenvolvimento de respostas

imunolgicas. Expresso de molculas coestimulatrias e coinibitrias na superfcie de clulas

dendrticas, macrfagos, e clulas tumorais capazes de gerar respostas variadas de acordo com o

receptor alvo presente nas clulas T. FONTE: Adaptado de SHARMA, 2012; MELERO et al.,2013.

Embora a funo da molcula PD-1 j tenha sido bastante estudada na

regulao de clulas T, o seu papel na imunidade inata ainda no est bem

elucidado. O mecanismo de atuao dessa molcula foi estudado em macrfagos

por Huang e colaboradores, que demonstraram que a expresso de PD-1 pode ser

induzida em moncitos e macrfagos frente a resposta inflamatria e dano tecidual,

alm de apresentar sua expresso ampliada em respostas imunolgicas contra

bactrias. Foi visto tambm que animais PD-1 -/- spticos apresentaram os nveis

citocinas pr-inflamatrias elevados e reduzida capacidade de combater/reveter o

quadro de septicemia (HUANG et al., 2009)

Colaborando com esses dados, tambm em 2009, Guitierrez mostrou que

frente a infeco com Trypanosoma cruzi ocorre aumento da expresso de PD-1 em

macrfagos, e que a deficincia dessa protena ocasiona o aumento da capacidade

tripanocida dessas clulas devido a otimizao da ativao celular por IFN- ,

acarretando o aumento da produo de NO (GUTIERREZ, 2009). Tais dados

sugerem que a a atuao da molcula PD-1 em fagcitos similar a que ocorre em

clulas T, sendo ento responsveis pela regulao das respostas imunolgicas.

1.5. SINALIZAO PURINRGICA

O termo purinrgico foi introduzido em 1972 por Burnstock ao sugerir que

molculas de ATP atuariam como um novo transmissor em clulas neuronais. Com

o avano das pesquisas, novos dados corroboraram o papel dos nucleotdeos como

compostos de sinalizao extracelular (KLES, FRST e ILLES, 2007;

BURNSTOCK, 2012).

Os purinoreceptores so representados por diversas famlias e provavelmente

so um dos receptores mais abundantes em mamferos (ABBRACCHIO et al.,

2006). Sua sinalizao dependente de uma variedade de fatores, tais como a

expresso do receptor, sua sensibilidade aos ligantes e a concentrao de

nucleotdeos extracelulares (BOURS et al., 2006).

Os receptores purinrgicos so caracterizados como protenas

transmembranares agrupadas em duas grandes famlias, P1 e P2, de acordo com os

efeitos farmacolgicos de antagonistas e agonistas dos nucleosdeos e nucleotdeos

(BOURS et al., 2006).

Os receptores P1 pertencem a superfamlia de receptores do tipo serpentina,

sendo subdivididos em receptores A1, A2A, A2B e A3, que se ligam a adenosina

extracelular com diferentes afinidades (RALEVIC e BURNSTOCK, 1998).

Com relao a famlia dos receptores do tipo P2, sabe-se que subdivida em

duas sub-famlias, sendo elas P2X e P2Y (BURNSTOCK, G.; KNIGHT, G.E. 2004).

Os receptores do tipo P2X so protenas transmembranas em forma de canal inico

que respondem primariamente ao ATP extracelular e os receptores do tipo P2Y so

protenas transmembrana que apresentam responsividade especifica de acordo com

as subdivises existentes nesse grupo (ABBRACCHIO et al., 2006). Atualmente j

foram descritos oito subtipos do receptor P2Y (P2YR1,2,4,6,11,12,13,14), sendo eles

responsivos a nucleotdeos purnicos (ATP, ADP) e pirimidnicos (UDP e UTP)

(RALEVIC e BURNSTOCK, 1998; JACOBSON, JAYASEKARA e COSTANZI, 2012).

Considerando que o controle dos nveis de nucleotdeos bem como a ativao

dos seus receptores especficos so fatores essenciais para manuteno dos

processos fisiolgicos dependentes da sinalizao purinrgica, tais como inflamao

e tromborregulao (ROBSON, SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006), cabe salientar a

importncia das enzimas capazes de hidrolisar nucleotdeos di e trifosfatados em

seus respectivos mononucleotdeos permitindo assim sua ligao a purinoreceptores e

consequentemente, a sinalizao depentende dessa via (ZIMMERMANN, 2001).

1.5.1. AS ECTO-NUCLEOTIDASES

Os principais nucleotdeos que exercem funo biolgica so o ATP, ADP e

AMP. Essas molculas so formadas a partir de uma base nitrogenada e uma

pentose - ribose - constituindo os nucleosdeos, que posteriormente so fosforilados

por quinases (ATKINSON et al., 2006). Os nucleotdeos representam uma

importante classe de compostos extracelulares que, ao interagirem com seus

receptores especficos, so responsveis pela ativao de vias de sinalizao

fundamentais para o funcionamento celular (SOSLAU e YOUNGPRAPAKORN,

1997).

Sabe-se que tanto nucleotdeos quanto nucleosdeos podem ser liberados no

espao extracelular durante leso mecnica, necrose, apoptose, ativao de clulas

inflamatrias (IDZKO, FERRARI e ELTZSCHIG, 2014) e/ou em resposta a

patgenos exgenos (BOURS et al., 2006).

J foi relatado tambm que molculas de ATP, alm de participarem do

processo de neurotransmisso, contrao muscular, vasodilatao, metabolismo

sseo e metabolismo do glicognio no fgado (BOURS et al., 2006), tambm atuam

como um importante sinalizador na inflamao juntamente com o produto da sua

hidrlise, o ADP (SOUZA et al., 2011).

Adicionalmente, o AMP, um metablito intermedirio da hidrlise do ATP,

funciona como importante molcula sinalizadora intracelular, sendo tambm

substrato para a formao de adenosina (figura 2) que participa da regulao do

processo inflamatrio e apresenta efeitos imunomodulatrios (SOUZA et al., 2011).

J foi demonstrado que o acmulo de adenosina capaz de reduzir a fagocitose e a

produo de reativos de oxignio por macrfagos e neutrfilos alm de inibir a

produo de IL-12 e TNF-. Alm disso, tem sido sugerido que esta molcula

capaz de transformar macrfagos classicamente ativados (M1), relacionados com

processos inflamatrios, em macrfagos alternativamente ativados (M2) (HASK e

PACHER, 2012). Esses ltimos esto associados a um perfil regulador, sendo

grandes produtores de IL-10 e TGF- (BELKAID, 2007)

Figura 2: Exemplificao da produo de adenosina aps degradao sequencial de ATP/ ADP

via CD39 (ENTPD1; ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1) e CD73 (ecto-5'-

nucleotidase) em macrfagos. ATP intracelular, gerado em resposta a padres moleculares

associados a agentes patognicos (PAMPS), liberado e convertido a adenosina pela ao das

molculas CD39 e CD73. A ligao da adenosina a seus receptores capaz de reduzir a produo

de citocinas inflamatrias e estimular a produo de citocinas imunomoduladoras. FONTE: Adaptado

de HAMIDZADEH e MOSSER, 2016.

Nesse contexto, as ecto-nucleotidases, enzimas que podem tanto ser

secretadas quanto localizadas nas membranas celulares (IVANENKOV, MURPHY-

PIEDMONTE e KIRLEY, 2003; MURPHY-PIEDMONTE, CRAWFORD e KIRLEY,

2005), tem sido foco de diversos estudos visto que possuem como funo primria o

metabolismo de nucleotdeos. Sabe-se que os produtos deste metabolismo esto

envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a mediao da resposta

imunolgica (figura 2) e interao parasito-hospedeiro (DE MARCO et al., 2003;

MAIOLI et al., 2004).

A presena destas enzimas foi demostrada em animais vertebrados e

invertebrados, plantas, leveduras (HANDA e GUIDOTTI, 1996; ZIMMERMANN E

BRAUN, 1996; SMITH e KIRLEY, 1998) e diferentes protozorios como Toxoplasma

gondii (BERMUDER et al., 1994; SILVERMAN et al., 1998), Leishmania

amazonensis (BERREDO-PINHO et al., 2001; COIMBRA et al., 2002; PINHEIRO et

al., 2006), Entamoeba histoIitica (BARROS et al., 2000), Trichinella spiralis

(GOUNARIS, 2002), Trichomona vaginalis (DE AGUIAR MATOS et al., 2001), e

Crithidia deanei (DOS PASSOS LEMOS et al., 2002). Em 2007, foi descrita tambm

em procarioto, a Legionella pneumophila, um agente causal de pneumonia

(SANSOM et al., 2007).

Alguns trabalhos apresentam tambm uma correlao entre a ativao de

hidrlise de ATP e um dado efeito biolgico na interao parasito-hospedeiro

(SILVERMAN et al., 1998; SANSOM et al., 2007; DE ALMEIDA MARQUES DA

SILVA, E. et al., 2008; SANSOM, ROBSON e HARTLAND, 2008; Santos et al.,

2009). Estes estudos, aliados a outros trabalhos, fazem associaes entre fatores

como a presena gentica, a expresso gnica e/ou a atividade enzimtica de ecto-

nucleotidases de parasitos com a virulncia, adeso celular, sada do parasito da

clula infectada, controle da concentrao de nucleotdeos das clulas hospedeiras

e do meio extracelular e escape do sistema de defesa do hospedeiro (DE MARCO et

al., 2003; MAIOLI et al., 2004).

Na literatura existem sinnimos para este grupo de enzimas, como ecto-

apirase e ecto-ATPDase. A fim de facilitar a comunicao no meio cientifico, em

2001, Zimmermann e colaboradores propuseram uma nomenclatura nica para este

grupo enzimtico, NTPDases. Contudo, o termo CD39 usado para designar a

NTPDase 1 ainda utilizado na imunologia (ZIMMERMANN et al., 2001; ROBSON,

SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006).

A NTPDase 1, ou CD39, foi caracterizada primeiramente como um marcador

de ativao linfide expresso em linfcitos B (MALISZEWSKI et al., 1994).

Posteriormente sua expresso foi observada tambm em clulas T ativadas, clulas

Natural Killer (NK), moncitos, clulas dendrticas (KOZIAK et al., 1999), clulas T

Regulatrias (TReg) e macrfagos (DWYER et al., 2007), desempenhando

importante funo na sinalizao purinrgica e, consequentemente, na resposta

imune visto que essa enzima responsvel pela degradao de ATP em AMP

(ANTONIOLI et al., 2013). Sabe-se ainda que CD39 pode ter participao na adeso

celular, proliferao, apoptose mediada por ATP e na secreo de citocinas

(DWYER et al., 2007).

Outra enzima que desempenha importante papel no metabolismo extracelular

de nucleotdeos a CD73 (ecto5-nucleotidase). Essa molcula considerada um

antgeno de diferenciao leucocitrio, alm de ser caracterizada como um

marcador de ativao de linfcitos T (CHRITENSEN, ANDERSEN e RYDER, 1996).

Em relao a sinalizao purinrgica, o CD73 responsvel pela concluso da

cascata de hidrlise do ATP, atuando na converso de AMP em adenosina

(ANTONIOLI et al., 2013) que, como j citado, apresenta importante efeitos

imunomodulatrios.

A atuao enzimtica das molculas CD39 e CD73 no sistema imune tem sido

alvo de diversos estudos uma vez que claramente exercem importante papel em sua

funo, bem como na regulao das respostas imunolgicas.

1.6. Brucella sp. E EVASO DA RESPOSTA IMUNOLGICA

Com a finalidade de assegurar a sobrevivncia e a progresso da infeco,

sabe-se que diversos patgenos utilizam as mais variadas estratgias de escape

para manipular os mecanismos regulatrios do sistema imune (BELKAID, 2007).

Como exemplo dessas estratgias, h mecanismos que envolvem a induo

de respostas regulatrias normalmente associadas com o trmino das respostas

imunes efetoras do hospedeiro. Essa induo pode ser feita diretamente, atravs da

produo de citocinas regulatrias em resposta aos constituintes do patgeno, ou de

forma indireta, atravs da gerao de clulas com caractersticas regulatrias

(BELKAID, 2007).

A manipulao de clulas apresentadoras de antgenos tambm pode ser

caracterizada como um mecanismo de evaso visto que interfere na expresso de

molculas coestimulatrias, alm de ser capaz de induzir a produo de citocinas

que podem direcionar os linfcitos para um perfil regulatrio (BELKAID, 2007).

Em relao a Brucella, sabe-se que dentre os mecanismos que impedem a

deteco destas bactrias pelo sistema imunolgico do hospedeiro esto a infeco

intracelular prolongada com modificao da expresso dos genes, a sobrevivncia

em vesculas acidificadas, a alterao da apoptose de macrfagos com bloqueio da

fuso do fagolisossomo e reduo da ativao dos mecanismos inflamatrios

(RAJASHEKARA et al., 2006).

Os microrganismos pertencentes a essa linhagem bacteriana so fagocitados

principalmente por macrfagos logo aps penetrarem na mucosa. Desse modo, sem

ativarem fortemente o sistema imune tais bactrias coordenam a expresso de

mltiplos fatores de virulncia relacionados a sua entrada e trfego, favorecendo

assim a ocupao e permanncia em seu nicho de replicao (RAMBOW-LARSEN

et al., 2009). Diversos mecanismos reguladores da expresso gnica foram

identificados no gnero Brucella, entre eles o Quorum sensing, stringent response,

sistema regulatrio de dois componentes e, mais recentemente, o blue-light

responsive LOV-HK protein, que responsvel pela adaptao da bactria a

diferentes ambientes (RAMBOW-LARSEN et al., 2009).

Alm dos mecanismos j descritos acima, tem sido sugerido que este patgeno

capaz de modular as clulas apresentadoras de antgenos de forma a favorecer

sua sobrevivncia. De fato, j foi demonstrado que esta bactria capaz de infectar

macrfagos (BALDWIN e GOENKA, 2006), linfcitos B (GOENKA et al.; 2012) e

clulas dendrticas (SALCEDO et al., 2008), sendo tambm capaz de inibir a

produo de citocinas pr-inflamatrias, como a IL-12 (SATHIYASEELAN et al.,

2006). Alm disso, APCs infectadas com Brucella apresentam uma reduo na

expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86 (ZAITSEVA et al., 1996;

BILLARD, DORNAND e GROSS, 2007; SALCEDO et al., 2008), bem como uma

influncia negativa sobre a expresso da molcula apresentadora MHC II (HELLER

et al., 2012). A reduo na expresso dessas molculas resulta em uma menor

ativao e proliferao de linfcitos, podendo favorecer a sobrevivncia do

patgeno. Entretanto, apesar de importantes, os mecanismos envolvidos nesta

imunomodulao ainda no foram completamente elucidados.

Sendo assim, uma vez que diversos estudos tm evidenciado a influncia da

molcula PD-1 e das ecto-nucleotidases CD39 e CD73 na ativao e produo de

citocinas por clulas apresentadoras de antgenos, aliado ao fato de no existirem

estudos que relacionam estes marcadores Brucella, o objetivo deste trabalho

determinar se a infeco com B. abortus capaz de alterar a expresso destas

molculas e assim limitar a ao do sistema imune, favorecendo a sobrevivncia do

patgeno.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a participao das molculas PD-1, CD39 e CD73 na imunomodulao

induzida pela bactria Brucella abortus em clulas da imunidade inata.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

2.2.1. Avaliar a expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86,

bem como da molcula apresentadora MHC II em macrfagos, clulas dendrticas e

linfcitos B frente a infeco com B.abortus.

2.2.2. Avaliar a expresso das molculas CD39 e CD73 em macrfagos,

clulas dendrticas e linfcitos B infectados por B. abortus.

2.2.3. Caracterizar os mecanismos de ao do efeito imunomodulador

desempenhado pela bactria B.abortus.

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. ANIMAIS

Foram utilizados camundongos fmeas da linhagem C57BL/6 com idade entre

8 e 10 semanas, pesando cerca de 18 a 20 g, que foram adquiridos do Centro de

Biologia da Reproduo da Universidade Federal de Juiz de Fora. Os animais foram

acondicionados em gaiolas plsticas e mantidos no Biotrio do laboratrio de

Imunologia da Universidade Federal de Juiz de Fora com gua e rao ad libitum.

3.2. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIES DE CULTIVO

Foram utilizadas nesse trabalho bactrias B. abortus pertencentes as linhagens

S2308 e RB51, ambas disponveis no Laboratrio de Imunologia de doenas Infecto-

Parasitrias da Universidade Federal de Juiz de Fora.

As linhagens utilizadas nos ensaios foram cultivadas em meio Brucella Broth

(BB) lquido (DIFCO), a 37C sob agitao constante. Aps trs dias de crescimento,

a cultura bacteriana foi centrifugada e o sedimento foi ressuspendido em tampo

salina fosfato (PBS) 0,15 M pH 7,4 (2,8 mM Na2PO4; 7,2 mM Na2HPO4; 0,14 M

NaCl). As alquotas foram armazenadas em glicerol a 30%, a uma temperatura de -

80C. Para realizao da contagem bacteriana, alquotas destas culturas foram

diludas serialmente e plaqueadas em meio BB solidificado com 1,5% de gar

bacteriolgico. Aps incubao por 72 horas a 37C, foi possvel determinar a

concentrao bacteriana presente na suspenso por meio da contagem do nmero

de unidades formadoras de colnias (UFC) visualizadas na placa.

3.3 INFECO

Os animais foram infectados intraperitonealmente com 1x106 UFC da linhagem

S2308 ou RB51 da bactria B. abortus diludas em 200l de PBS. Aps os tempos

de infeco (24, 48, 72 e 168 horas), os animais foram eutanasiados, por

deslocamento cervical, para a retirada do bao e realizao dos ensaios ex vivo.

3.4. LINHAGEM CELULAR

Os ensaios desenvolvidos nesse trabalho foram realizados em macrfagos

murino pertencentes a linhagem RAW 264.7 (ATCC TIB-71 TM), gentilmente

cedida pelo Prof. Dr. Jair Adriano Kopke de Aguiar.

3.5. CULTURA DE CLULAS

As linhagens RAW 264.7 foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm3

(SARSTEDT) com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de

antibitico e mantidas em estufa incubadora umidificada a 37C com atmosfera de

5% de CO2. Periodicamente as clulas tinham seu crescimento e morfologia

monitorados sendo que, de acordo com o ndice mittico, foram realizadas trocas do

meio de cultura, havendo monitoramento at estas alcanarem confluncia de

aproximadamente 80%. Tal caracterstica possibilitou que as clulas fossem ento

congeladas em meio apropriado de congelamento (90% SFB, 10% Dimetilsulfxido

(DMSO), VETEC), transferidas para garrafas de maiores dimenses (75 cm3,

SARSTEDT) ou utilizadas nos ensaios.

Uma vez que as linhagens celulares utilizadas so aderentes, suportes

plsticos (cell scraper 71 SARSTED) foram utilizados para sua remoo do interior

das garrafas.

3.6. MACRFAGOS INTRAPERITONEAIS

O recrutamento dos macrfagos intraperitoneais foi realizado pela injeo

intraperitoneal de 2 mL de tioglicolato 3% estril (GORDON, UNKELESS e COHN,

1974). Aps 4 dias, os animais foram eutanasiados para a realizao de uma

lavagem peritoneal onde 5 mL de tampo fosfato-salino (PBS, do ingls phosphate

buffered saline) gelado foram injetados e, em seguida, recolhidos com seringa. O

lquido coletado do peritneo foi acrescido de PBS estril at o volume final de 10

mL e submetido centrifugao a 1500 RPM, por 10 minutos. As clulas obtidas

foram ressuspendidas em 2 mL de meio de cultura RPMI-1640 suplementado com

5% de SFB e 1% de antibitico. A concentrao celular foi determinada utilizando-se

em cmara de Neubauer com corante azul de tripan.

3.7. DETERMINAO DA PRODUO DE XIDO NTRICO

A quantidade de nitrito presente no sobrenadante das culturas estimuladas de

clulas RAW 264.7 foi mensurada como um indicador da produo de NO por meio

da Reao de Griess (GUEVARA et al., 1998). Para tanto, foram adicionadas 100 L

do sobrenadante das culturas tratadas a igual volume do Reagente de Griess. Em

seguida, foi efetuada a incubao temperatura ambiente por 10 minutos e posterior

leitura em espectrofotmetro a 540 nm. A quantidade de nitrito (NO2-) nas amostras

foi obtida por meio de curva padro

3.8. CULTURA DE ESPLENCITOS

O bao extrado de cada animal foi macerado em 10 mL de PBS, com o auxlio

de uma peneira de ao. Aps serem macerados foram submetidos centrifugao

por 10 minutos a 1500 RPM. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as

clulas foram ressuspendidas em 2 mL de tampo ACK (Ammonium-Chloride-

Potssium - 1% KHCO3 e 8% NH4Cl em gua destilada) e incubadas por 5 minutos,

a temperatura ambiente, ocorrendo a lise osmtica dos eritrcitos. Aps a

incubao, 28 mL de PBS foram acrescentados e seguiu-se nova centrifugao.

Novamente o sobrenadante foi descartado e as clulas foram ressuspendidas em 2

mL de meio RPMI (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% dos

antibiticos penicilina (100 U/mL, GIBCO) e estreptomicina (1 g/mL, GIBCO). Em

seguida a concentrao das clulas foi determinada na cmara de Neubauer.

As clulas foram plaqueadas na concentrao de 1x106 clulas/poo em placas

de 96 poos de fundo em U (NUNC), submetidas a marcao e realizao da

citometria de fluxo.

3.9. DETERMINAO DA PROLIFERAAO CELULAR

Esplencitos derivados de animais de animais infectados ou no foram

cultivados conforme descrito acima e estimulados com o mitgeno Concanavalina A

(5g/ml- Sigma-Aldrich). Aps 72 horas de incubao 37oC e sob atmosfera com

5% de CO2, o sobrenadante ser retirados para a adio de 90 l/poo de meio

RPMI suplementado (10% de soro fetal bovino e 1% de antibitico) e 10 l/poo de

3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazolium bromido (MTT - Sigma-Aldrich),

(5mg/ml). As clulas sero ento novamente incubadas a 37C e sob atmosfera com

5% de CO2 durante 4 horas. Aps esse perodo, o sobrenadante ser retirados para

adio de 100 l de DMSO (Dimetilsulfxido- Synth). A reao ser avaliada em

leitor de microplaca (Biorad) em comprimento de onda de 550 nm. O ndice de

proliferao ser ento calculado levando-se em conta a metabolizao do MTT de

clulas estimuladas e clulas no estimuladas.

3.10. CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAO DA EXPRESSO DOS MARCADORES CELULARES DE SUPERFCIE

Aps serem mantidas em cultura (clulas RAW 254.7) ou serem coletadas

(macrfagos intraperitoneais), as clulas foram contadas em cmara de Neubauer

utilizando o corante Azul de Tripan (Sigma), e posteriormente transferidas para

placas de 96 poos de fundo chato, na concentrao de 5 x 105 clulas por poo

(adaptado do estudo de Huo et al.,2012). As clulas foram ento incubadas por 24

horas e posteriormente infectadas com MOI (MOI do ingls, multiplicity of infection)

de 50:1 (WEISS, D. S. et al., 2005) das linhagens S2308 ou RB51 da bactria

Brucella abortus. Aps 2 horas as placas foram ento centrifugadas por 5 minutos,

1500 Rpm, 4 C e lavadas com soluo estril de tampo fosfato-salino (PBS- do

ingls, phosphate buffered saline) acrescido de 1% de antibitico. Foram ento

adicionados o estmulo lipopolissacardeo (LPS) de Escherichia coli a 1 g/mL

(Sigma) como controle positivo e meio RPMI (GIBCO) administrado nas clulas no

estimuladas sendo essas usadas como controle negativo. Aps mais 24 horas de

incubao 37C e sob atmosfera com 5% de CO2 iniciou-se o processo de

marcao celular. Com relao aos esplenocitos oriundos de animais infectados, o

contedo celular foi obtido conforme descrito no item____e em seguida submetido a

marcao celular.

Inicialmente, as placas contendo as clulas foram lavadas com 200 l de

tampo de FACS (PBS acrescido 1% de soro fetal bovino e 0,09% de azida (NaNO3)

gelado a fim de remover as clulas aderidas. Em seguida o contedo celular foi

transferido para uma placa de fundo em U que foi ento centrifugada a 1500 RPM

por 5 minutos a 4C e o sobrenadante foi removido por inverso rpida da placa.

O contedo celular foi ento ressuspenso em 200 l de PBS e posteriormente

centrifugado a 1500 RPM por 5 minutos a 4C. Aps a remoo do sobrenadante

por inverso rpida da placa, as clulas receberam o marcador de viabilidade celular

FVS (VER DADOS) na concentrao de (VER DADOS) por poo. As clulas foram

ento incubadas por 15 minutos a 4C. Poos que tiveram a morte celular induzida

pela administrao de DMSO na concentrao de (VER DADOS) por poo durante

15 minutos foram utilizados como controle positivo na marcao com o corante de

viabilidade celular visto que esse atua sob clulas inviveis.

Posteriormente as placas contendo as clulas foram lavadas duas vezes com

200 l de tampo de FACS gelado e aps remoo do contedo por inverso rpida

da placa, as clulas foram ressuspensas no volume residual e foram adicionados a

cada poo 20L de soluo de tampo de FACS acrescida de anticorpo de bloqueio

anti- CD16/CD32 (Clone 93) na concentrao de 0,3 g por poo. O contedo

celular foi ento incubado por 15 minutos a 4C e posteriormente foram adicionados

100 l/poo de tampo de FACS seguido de centrifugao por 5 minutos, 1500

Rpm, 4 C.

O sobrenadante foi ento removido por inverso rpida da placa e as clulas

foram ressuspendidas no volume residual, sendo adicionado a cada poo 20L de

soluo de tampo de FACS acrescida de 0,3 g por poo dos diferentes anticorpos

de interesse, conforme descrito na tabela abaixo (Tabela 1).

Tabela 1: Anticorpos utilizados nos ensaios de citometria (Becton & Dickinson).

Anticorpos Clone Fluorocromos

anti-CD80 Clone 16-10A1 APC

anti-CD86 Clone GL1 FITC

anti-MHC Clone AF6-120 PE

anti-CD40 Clone 3/23 BV421

anti-PD-1/CD279 Clone J43 BV421

anti-CD39 Clone 24DMS1 PE

anti-CD73 APC

anti-CD25

anti- CD16/CD32 Clone 93 APC

Posteriormente, as amostras foram incubadas por 30 minutos a 4C no escuro

e em seguida foram adicionados 100 l/poo de tampo de FACS seguido de

centrifugao por 5 minutos, 1500 Rpm, 4 C, sendo esse procedimento realizado

duas vezes. As clulas foram ento ressuspensas em 150 l de tampo de FACS e

transferidas para tubos especficos para FACS (CORNING). As amostras foram

coletadas em citmetro de fluxo FACScanto II (Becton & Dickinson), onde 30.000

eventos foram adquiridos e os resultados foram analisados pelo software Flowjo.

A estratgia de gate utilizada para determinao dos fentipos celulares

consistiu inicialmente na retirada dos doublets, seguida da determinao da zona de

demarcao celular de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade (SSC)

caractersticos das clula alvo. As clulas viveis foram ento determinadas a partir

da utilizao do corante de viabilidade clulas VFS e a mdia de intensidade de

fluorescncia (MIF) destas clulas foi determinada.

3.11. CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAO DA EXPRESSO DO MARCADOR INTRACELULAR FOXP3

Aps serem extradas e plaqueadas conforme o item__, clulas esplnicas

foram submetidas a marcao intracelular com kit especfico para FoxP3 (Mouse

FoxP3 Buffer Set Becton & Dickinson). Primeiramente as placas contendo as

clulas foram centrifugadas a 1500 RPM por 10 minutos e o sobrenadante removido

por inverso rpida da placa.e posteriormente as clulas foram ento

ressuspendidas em 100l de tampo de FACS (PBS com 1% de soro fetal bovino e

0,09% de azida (NaNO3). Em seguida, as placas de cultura foram submetidas a

nova centrifugao (1500 RPM, 10 minutos) e foram adicionados a cada poo, 20L

de soluo de tampo de FACS acrescida de anticorpos destiados a marcao de

protenas de superfcie (tabela 1). Seguiu-se ento uma incubao por 20 minutos a

temperatura ambiente e acrescentou-se 200 l/poo de tampo de FACS seguida de

centrifugao (1500 RPM, 10 minutos). O sobrenadante foi removido e as clulas

foram ressuspendidas em 200 l do tampo de fixao (Fixation Buffer) e incubadas

por 30 minutos a 4C. Seguiu-se nova centrifugao a 1500 RPM por 5 minutos e

remoo do sobrenadante. As clulas foram ento ressuspendidas em 200 l de

tampo de permeabilizao (Permeabilization Buffer) pr-aquecido (37C).

As placas contendo o contedo celular foram novamente centrifugadas (1500

RPM, 5 minutos), o sobrenadante descartado e as clulas ressuspendidas em 200 l

de tampo de permeabilizao pr-aquecido novamente e posteriormente foi

realizada incubao por 30 minutos a 37C. Em seguida, a placa foi submetida a

nova centrifugao (1500 RPM, 5 minutos), o sobrenadante foi descartado e foram

adicionados a cada poo, 20L de soluo de tampo de FACS acrescida do

anticorpo anti-FoxP3 (Clone MF23), com a marcao PE. Seguiu-se uma incubao

por 20 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, foi acrescentado 200 l/poo de tampo de FACS seguida de

nova centrifugao (1500 RPM, 5 minutos), sendo esse procedimento realizado duas

vezes. As clulas foram ento ressuspendidas em 250 l de tampo de FACS e

transferidas para tubos especficos para FACS (CORNING). As amostras foram lidas

em citmetro de fluxo FACScanto II (Becton & Dickinson), onde 30.000 eventos

foram adquiridos.

A estratgia de gate utilizada para determinao dos fentipos celulares consistiu

inicialmente na retirada dos doublets, seguida da determinao da zona de

demarcao celular de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade (SSC)

caractersticos das clula alvo. As clulas viveis foram ento determinadas a partir

da utilizao do corante de viabilidade clulas VFS e a mdia de intensidade de

fluorescncia (MIF) destas clulas foi determinada.

3.12. CULTURA DE MACRFAGOS E PREPARO DE HOMOGENEIZADO

CELULAR PARA REALIZAO DA TCNICA WESTERN BLOTTING

Para qualificar a NTPDase CD39 foram utilizados macrfagos pertencentes a

linhagem RAW 264.7 cultivados em garrafas de cultura de 25 cm3 (SARSTEDT)

com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de antibitico e

mantidas em estufa incubadora umidificada a 37C com atmosfera de 5% de CO2.

As clulas foram ento contadas, plaqueadas na concentrao de 1 x 107 e

posteriormente infectadas e estimuladas conforme descrito anteriormente (item 3.4).

Aps 3 dias de cultura, as clulas foram tradadas com tripsina-EDTA (0,25% Sigma-

Aldrich), coletadas e centrifugadas a 1500 Rpm por 10 minutos. Esse processo foi

seguido por duas lavagens com PBS estril e uma nova centrifugao.

As clulas foram ento ressuspendidas em tampo Tris-HCL 50 mM, pH 7,4,

com sacarose 8% e inibidores de proteases leupeptina (0,5 ug/ml), pepstatina (0,07

ug/ml), inibidor de tripsina (50 ug/ml) e fluoreto de fenilmetilsufonil (2 ug/ml). O

rompimento da membrana celular e liberao de antgenos foram obtidos por meio

de 5 ciclos de congelamento e descongelamento em nitrognio lquido e 5 ciclos no

UltraSonic Cleaner (Unique) por 10 minutos. O homogeneizado de clulas foi

estocado a -20C at o momento de uso. A determinao de protenas totais foi

realizada pelo mtodo de Lowry (LOWRY et al., 1951).

3.13. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E IDENTIFICAO DA PROTENA CD39 PELA TCNICA WESTERN BLOTTING

As amostras de homogeneizado celular foram ento solubilizadas em tampo

de amostra, aquecidas por 5 minutos a 100C e aplicadas em gel de poliacrilamida

10% com 0,1% de dodecil sulfato de sdio (SDS), de acordo com Laemmli (1970).

Tambm foi aplicado um padro de peso molecular pr-corado. A corrida foi

realizada por cerca de 2 horas a 100 V em um sistema de eletroforese (Mini Protean

III, BioRad). Uma parte do gel foi corada com Azul de Comassie (1% de azul de

comassie R (m/v), 30% de cido actico glacial e 40% de metanol) e as protenas da

outra parte foram eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Mini Trans-

Blot III, BioRad). As membranas foram cortadas em poos, bloqueadas por 2 h com

tampo fosfato (PBS) + 3% de caseina + Tween 20 0,1% e incubadas com o

anticorpo anti-CD39 na diluio de 1:500. Os ensaios foram revelados por

quimioluminscia utilizando anticorpos secundrios anti-IgG de coelho acoplado a

peroxidase na diluio de 1:1000 (Bethyl Laboratories INC., Montgomery, TX, USA)

e o luminol como substrato, seguido de exposio a filmes de raio-X, de acordo com

as instrues do fabricante (ECL Western blotting System; GE Healthcare Life

Sciences, Brasil).

4. ANLISE ESTATSTICA

Os resultados obtidos neste estudo foram analisados por meio do programa

estatstico Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software, Inc), sendo utilizado o teste -

paramtrico ANOVA seguido do ps-teste Dunnet. O nvel de significncia adotado

nas anlises foi de p < 0,05.

5. RESULTADOS

5.1. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD80, CD86 E MHC II EM CLULAS RAW

264.7 INFECTADAS COM B. abortus

O reconhecimento de antgenos um fator de suma importncia para o

desenvolvimento de respostas imunolgicas frente a infees e, nesse contexto, a

expresso do complexo de histocompatibilidade (MHC) aliada a expresso de

molculas coestimulatrias desempenha papel fundamental na efetivao das

respostas imunolgicas (KHAN et al., 2012). Dados descritos na literatura sugerem

que diversos patgenos evadem das respostas imunolgicas do hospedeiro atravs

da reduo da expresso de tais molculas. Essa caracterstica auxilia no escape de

mecanismos de imunovigilncia favorecendo dessa forma a cronicidade da infeco

(TOBIAN et al., 2003; ANTONIOU e POWIS, 2008).

Diferentes estudos tm sugerido que um dos mecanismos de evaso utilizado

pela bactria Brucella a diminuio da expresso das molculas coestimulatrias

CD80 e CD86, bem como da molcula apresentadora MHCII. Esta reduo poderia

inibir a ativao de linfcitos T especficos e assim facilitar a sobrevivncia do

patgeno (HELLER et al., 2012).

Para avaliar esta proposio, clulas RAW 264.7 foram cultivadas e infectadas

com as linhagens S2308 ou RB51 da bactria B. abortus. Alm disso, para

determinar a intensidade da imunomoduo, clulas infectadas foram estimuladas

com LPS de E.coli, a fim de induzir a expresso das molculas em questo.

Conforme demonstrado nas figuras 4 e 5, o estmulo com LPS foi efetivo na

induo da expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86 quando

comparado a clulas no estimuladas (meio). De maneira interessante, a infeco

com B. abortus, tanto da linhagem S2308 quanto da RB51, no foi capaz de

aumentar a expresso dessas molculas de maneira significativa. A estimulao de

clulas infectadas restaurou a expresso das molculas em questo sugerindo que

a bactria no capaz de manter a imunomodulao na presena de outros

estmulos.

Figura 3: Estratgia de gate e eterminao da zona de macrfagos. Clulas pertencentes a

linhagem de macrfagos RAW 264.7 foram mantidas em cultura, e aps realizao do protocolo de

marcao da tcnica de citometria de fluxo, as medidas de disperso foram usadas para determinar

as Single cells. A populao celular foi demarcada de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade

(SSC) caractersticos destas clulas, e atravs do marcador de viabilidade FVS 510 a populao

clular vivel foi determinada. A mdia de intensidade de fluorescncia (MIF) foi determinada com

ndice de 70,6%.

Figura 4: Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD80. Macrfagos RAW 264.7

(5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella

abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de

Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e

clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD80 foi determinada por

citometria de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da

expresso de CD80. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

Figura 5: Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD86. Macrfagos RAW 264.7

(5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella

abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de

Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e

clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD86 foi determinada por

citometria de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da

expresso de CD86. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

A avaliao da expresso das molculas de MHCII evidenciou um perfil

diferente do observado anteriormente. Conforme demonstrado na figura 6, a

infeco com a bactria no foi capaz de estimular significativamente a expresso

de molculas de MHCII.

Meio LPS S23 S23+LPS RB RB+LPS

0

20

40

60

80

MH

C II (M

IF)

Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0

20

40

60

80RAW

MH

C II (M

IF)

Figura 6: Anlise da expresso de molculas MHC II. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram

infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2

horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli.

Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas

estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de MHCII foi determinada por citometria

de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de

MHCII. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

5.2. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD40 EM CLULAS RAW 264.7

INFECTADAS COM B. abortus

Como j mencionado, a interao entre a molcula CD40 e seu ligante possui

papel fundamental em processos imunolgicos uma vez que, embora a ativao de

clulas T possa ocorrer na ausncia dessa via de sinalizao, funes imunolgicas

como produo de citocinas e expresso de molculas coestimulatrias so

ineficientes na sua ausncia (ELGUETA et al.,2013). Desse modo, a fim de

verificarmos o grau de ativao celular avaliamos a expresso da molcula CD40

em macrfagos RAW 264.7 infectados com a linhagem S2308 da bactria Brucella

abortus.

Conforme demonstrado nos grficos da figura 7, o estmulo com LPS foi capaz

de induzir aumento na expresso da molcula CD40 quando comparado ao controle

negativo (meio). Em relao as clulas infectadas com a bactria Brucella abortus foi

observado que, em relao ao grupo estimulado com LPS, o patgeno em questo

capaz de modular negativamente a expresso desse marcador. Quando as clulas

infectadas so estimuladas com LPS vista uma elevao na expresso de CD40,

sugerindo mais uma vez que o efeito modulador exercido pela bactria no

mantido frente a outros estmulos.

Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0

5

10

15

** *

RAWC

D40 (

MIF

)

Figura 7: Avaliao da expresso de molculas CD40. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram

infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas

de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como

controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas

somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD40 foi determinada por citometria de fluxo. (A)

Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD40. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0

20

40

60

80

* * *

*

PD

-1 (

MIF

)

RAW

Figura 10: Avaliao da expresso de molculas PD-1. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo)

foram infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2

horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli.

Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas

somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de PD-1 foi determinada por citometria de fluxo. (A)

Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de PD-1. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

5.4. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD39 POR WESTERN BLOTTING

Conforme mencionado anteriormente, sabe-se que diversos patgenos

expressam naturalmente a NTPDase CD39 e utilizam dessa via para evadir das

respostas imunolgicas do hospedeiro favorecendo assim a progresso da infeco.

Dessa forma, a fim de verificarmos a expresso dessa protena na bactria B.

abortus e consequentemente avaliarmos a manipulao do fentipo celular do

hospedeiro frente a infeco com o patgeno em questo, avaliamos pela tcnica de

Western Blotting a expresso de CD39 na bactria B. abortus e utilizamos como

controle positivo macrfagos RAW 264.7

Conforme mostrado na figura 9, foi possvel detectar a protena alvo a

aproximadamente 66 kDa, valor que corresponde a massa molecular da enzima

NTPase-1/CD39 (FIETTO et al., 2004). Os dados obtidos indicam que

diferentemente dos macrfagos RAW 264.7 (figura 9/ banda 1), bactrias B. abortus

S2308 no expressam a protena em questo (figura 9/ bandas 2). Tais resultados

indicam que a variao na expresso da NTPDase CD39 em clulas infectadas se

deve a modificaes induzidas pelo patgeno.

Figura 9: Identificao da NTPDase 1/ CD39 em macrfagos pela tcnica de Western blotting. Alquotas contendo protenas extradas de homogeneizado de clulas foram submetidas a corrida

eletrofortica em gel de poliacrilamida e eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose e

incubados com anticorpos anti-CD39 na diluio de 1:500. Em (1) controle positivo RAW 264.7; (2)

Bactria Brucella abortus S2308.

5.5. DETERMINAO DA EXPRESSO DA MOLCULA CD39 EM CLULAS

RAW 264.7 INFECTADAS POR B. abortus

Uma vez que a infeco por Brucella foi capaz de inibir a expresso dos

coestimuladores CD80 e CD86, CD40 e PD-1, avaliamos se esta imunomodulao

est relacionada ao aumento da expresso da NTPDase CD39. Conforme

demonstrado nos grficos da figura 8, de forma surpreendente, foi percebida

reduo significativa na expresso do marcador CD39 em clulas infectadas quando

comparadas ao controle positivo (LPS). Essa reduo tambm evidenciada no

grupo celular infectado e estimulado com LPS embora de maneira menos efetiva.

Estes resultados sugerem que a diminuio na expresso dos coestimuladores

(figuras 4 e 5) em resposta a infeco por B. abortus no est relacionada ao

aumento da expresso de CD39.

Figura 8: Anlise da expresso de molculas CD39. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram

infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de

infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como

controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas

somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD39 foi determinada por citometria de fluxo. (A)

Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD39. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

Figura 12: Anlise da expresso de molculas CD73. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram

infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de

infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como

controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas

somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD73 foi determinada por citometria de fluxo. (A)

Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD73. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P

Visto que o xido ntrico uma molcula sintetizada por diferentes tipos

celulares e participa de diversas funes fisiolgicas incluindo o combate a

patgenos (BOGDAN, ROLLINGHOFF e DIEFENBACH, 2000), ns avaliamos a

produo desse composto atravs de anlises no sobrenadante das clulas RAW

264.7 infectadas e infectadas e estimuladas com LPS de Escherichia coli.

Como apresentado na figura___, vimos que a infeco com B. abortus foi

capaz de promover aumento significativo da produo de NO em clulas RAW 204.7

quando comparado com controle positivo (LPS). Tal variao foi vista tambm em

clulas infectadas e estimuladas com LPS.

Meio LPS S2308 S2308 + LPS0

5

10

15

20 RAW

******

NO

(

xid

o N

tri

co

)

Figura 12: Determinao da produo de xido ntrico em clulas Raw 264.7 infectadas com B.

abortus. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308

da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com

1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no

estimuladas (meio) e clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a produo de NO foi

determinada por meio da Reao de Griess. * significativo em relao ao controle estimulado com

LPS (P

24 horas aps a infeco. Para isso, macrfagos foram coletados, cultivados e

infectados com as linhagens S2308 ou RB51 da bactria B. abortus. Visando

determinar a intensidade da imunomoduo, clulas infectadas foram estimuladas

com LPS de E.coli, a fim de induzir a expresso das molculas em questo.

A partir da estratgia de gate utilizada em nossas anlises, visando selecionar

clulas maduras capazes de induzir proliferao de linfcitos T, foram selecionadas

clulas com expresso elevada do marcador CD11b (CD11b hi). Como apresentado

na figura 13, o estmulo com LPS foi efetivo na induo da expresso das molculas

coestimulatrias CD80 e CD86 quando comparado a clulas no estimuladas

(meio). Vimos tambm que a infeco com B. abortus, tanto da linhagem S2308

quanto da RB51, no foi capaz de aumentar a expresso dessas molculas de

maneira significativa. Assim como em clulas RAW 264.7, vimos que a estimulao

de clulas infectadas restaurou a expresso das molculas em questo sugerindo

que a bactria no capaz de manter a imunomodulao na presena de outros

estmulos.

Figura 3: Estratgia de gate e eterminao da zona de clulas CD11bhi. Macrfagos

intraperitoneais foram coletados e mantidos em cultura. Aps realizao do protocolo de marcao da

tcnica d