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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE
MATO GROSSO– BRASIL
Joziane Agnoria da Silva Seidel
CUIABÁ
2014
ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE
MATO GROSSO– BRASIL
Joziane Agnoria da Silva Seidel
Orientadora: Profa. Dra. Bianca Borsatto Galera
Coorientador: Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Concentração Reprodução Humana e Climatério.
CUIABÁ
2014
JOZIANE AGNÓRIA DA SILVA SEIDEL
ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO 14PB INS/DEL DO GENE HLA-G
COM A ENDOMETRIOSE EM MULHERES DE MATO GROSSO– BRASIL
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso,
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre
em Ciências da Saúde. Aprovação em 18/12/2015
Bianca Borsatto Galera
_____________________________________________
1º Membro da banca (UFMT)
Sebastião Freitas de Medeiros
_____________________________________________
2º Membro da banca (UFMT)
José Meireles Filho
_____________________________________________
3º Membro da banca (UNIC)
Cuiabá, 2014
v
À Trindade Santa (Deus Pai, Deus Filho e Deus Espírito Santo) por aliviarem
a caminhada, carregando-me no colo quando humanamente meus pés não tinham
força para continuar... A Ti Jesus, Fonte de Eterno Amor, dedico esta pesquisa, para
que ela sirva para melhorar a qualidade de vida de tantas mulheres que sofrem pela
dor cíclica ou pelo desejo da maternidade.
Aos meus pais, José Astrogildo da Silva e Doralice Dias de Oliveira, meus
eternos intercessores e exemplo de vida Cristã.
Ao meu Esposo, Roberson Gustavo Seidel, pela confiança e renuncia diante
de tantas coisas para junto comigo percorrer esse caminho de sonhos, onde
encontramos realidades tão difíceis, mas que só foi possível superar por
acreditarmos que somos uma só carne.
Ao meu filho Arthur Gustavo, por desde o meu ventre estar me ensinando o
quanto a prática do amor materno supera todas as dificuldades.
vi
AGRADECIMENTO
À minha orientadora Bianca Borsatto Galera por ter acreditado em mim e
confiado que eu seria capaz de superar as fragilidades existentes. Obrigada por
fazer o possível e o impossível para não deixar faltar material no laboratório, mesmo
às vezes precisando tirar dinheiro do próprio bolso para que a pesquisa não
parasse. Agradeço a Deus pelo ser humano que você é, serei eternamente grata por
você se preocupar com a minha pessoa quando a pesquisadora se demonstrou tão
frágil.
Ao Dr. Sebastião de Freitas Medeiros, figura imponente e que possui um
sorriso muito mais contagiante do que sua face de seriedade, obrigada pela atenção
disponibilizada a cada orientação.
À professora Carmem Lúcia Bassi Branco por se disponibilizar e me atender
com tanta calma e paciência, algo que fazia com que eu me sentisse única.
Obrigada por me socorrer intelectualmente e com alguns não poucos insumos para
a pesquisa.
À minha amiga e companheira de provações, Eloísa Helena Kubiszeski,
obrigada por ter sido canal para que eu iniciasse essa aventura e principalmente por
não ter me deixado sozinha durante todo o percurso.
Ao meu amigo Aguiar Farina, que eu aprendi a admirar como pessoa,
obrigada por ter doado seu tempo para me ajudar.
À toda equipe da INTRO, da recepção passando pela equipe de enfermagem
até os cirurgiões e anestesistas, aqui em especial a figura da Arlene Alves Serra que
sempre me atendeu nos incansáveis telefonemas para saber da agenda cirúrgica, as
enfermeiras Sabrina Lira e Camila Bahama, ao Dr. Fernando Bahia e Dr. Victor
Alves por sempre que houve necessidade ter esperado o término da entrevista para
sedar a paciente, à Dra. Marcia Yamamoto e Dr. Matheus Medeiros por dividir a
alegria conosco a cada paciente controle. Obrigada à enfermeira Jacklyne Silva
Barbosa companheira e intermediária para marcações de orientações com o
professor Sebastião.
À equipe do Hospital e Maternidade Femina na pessoa do Dr. Acir André
Novaczyk, valeu a pena ter acordado você às 6h da manhã quando na verdade você
estaria de plantão até as 12h, desculpa novamente e obrigada.
vii
Ao professor e Dr. Dalton Ferreira juntamente com o Dr. Oacir Monteiro da
Silva Junior pelas pacientes confiadas à nossa pesquisa.
A todas as mulheres que aceitaram participar desta pesquisa, por confiarem a
nós seus dados pessoais além de aceitarem levar uma ―picadinha do bem‖ para que
pudéssemos realizar a parte laboratorial, bem como por acreditarem junto conosco
que a ciência pode mudar o rumo da história.
Aos membros da banca da qualificação e/ou defesa, professora Carmem
Lúcia Bassi Branco, professor Marcial Francis Galera, professor Sebastião Freitas de
Medeiros e professor José Meireles Filho pelo carinho e tempo disponibilizado a
correção da minha dissertação, obrigada por cada sugestão.
Obrigada Hélida Leseux, secretária do Programa de Pós-Graduação por
continuar sorrindo diante de tantas perguntas e atrasos!! Adoooro você, Deus lhe
pague.
Aos meus colegas de bioestatística e epidemiologia, Letícia, Nayara,
Thamires, Ruberlei, Lucas e Eloisa, pelas incansáveis rodas de estudo e discussões
sobre as disciplinas e fé cristã. Vocês moram em meu coração.
Às minhas colegas de laboratório, Regiane Festi e Naiana Leotti pelas
orientações de organização e uso do Laboratório, essa convivência nem sempre
pacífica me ajudou a crescer nos desafios que os relacionamentos interpessoais me
propôs. Obrigada aos técnicos do Laboratório de Histologia e Genética, Ronaldo, Jô,
Cáceres e Denésio pelo respeito, torcida e auxílio diante de cada uma das etapas do
mestrado.
Às pessoas que por muitas vezes foram a extensão das minhas mãos dentro
do laboratório ou na digitação interminável dos protocolos de entrevista: Eloísa
Kubiszeski, Ana Luisa, Ariane Queiroz, Daniela, Iara Nascimento e Luíza Thicaci.
Aos meus amigos da Secretaria de Saúde por me apoiarem e segurarem as
pontas sem nunca reclamar para que eu pudesse conciliar estudo e serviço.
Obrigada Karina Toniasso, Maria Carolina Lopes e Janaina Lugli, vocês são MARA!
Obrigada meu ―paizinho‖ e minha ―mãezinha‖, meus eternos amores, pela
inesgotável fonte de amor, paciência e renuncia. Obrigada por me ajudarem a
conquistar mais esta formação e por ter dado a mim um lar saudável para que eu me
desenvolvesse como pessoa.
Ao meu esposo, obrigada por estar comigo, por ser paciente diante de tantos
momentos de ―TPMs‖ fora do ciclo, obrigada por me fazer acreditar que a família é o
viii
maior bem que podemos ter nesta vida. Ao meu filho, obrigada meu pequenino por
sorrir para mim, seu sorriso faz tudo valer a pena.
Aos meus irmãos e irmãs Julimar, Gilberto, Jouvane, Jonatham, Jaine e
Joselaine, bem como cunhadas Marcilene, Erinete, Gisele, Jackeline e cunhado
Clesio e aos meus sobrinhos e afilhados (são muitos!!!) pela torcida e paciência
diante das minhas ausências.
ix
―Pai nosso que estais no céu, santificado seja o teu nome, venha o teu reino; seja
feita a tua vontade, assim na terra como no céu‖
(Mateus 6, 9-10)
x
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 .................................................................................................. 8
Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de
Medicina Reprodutiva (1996).
Figura 2 .................................................................................................. 11
Esquema do gene do antígeno leucocitário humano-G (HLA-G) e sua
transcrição.
Figura 3 .................................................................................................. 13
Esquema do processamento alternativo na região 3’-UTR, com presença do
14pb e marcação de onde são removidos 92pb do RNAm de HLA-G.
Figura 4 .................................................................................................. 21
Eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata para
observação do polimorfismo HLA-G 14pb ins/del.
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 ................................................................................................. 24
Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do
gene HLA-G nas mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose
(controle).
Tabela 2 ................................................................................................. 24
Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do
gene HLA-G nas mulheres com endometriose conforme o grau da doença.
Tabela 3 ................................................................................................. 25
Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do
gene HLA-G nas mulheres com endometriose, reagrupadas em estágio menos
avançado e mais avançado.
Tabela 4 ................................................................................................... 25
Distribuição das variáveis clínicas entre as mulheres com endometriose (caso)
e sem endometriose (controle).
Tabela 5 ................................................................................................. 26
Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-
G nas mulheres com endometriose que apresentaram infertilidade.
Tabela 6 ................................................................................................. 26
Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-
G nas mulheres que tiveram endometriose (caso) e que apresentaram
abortamento.
xii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
µL- Microlitro
3’UTR- 3´ Untranslated region – Região 3’ não traduzida
ACs- Anticorpos
ASRM- American Society for Reproductive Medicine – Sociedade Americana de
Medicina Reprodutiva
DNA- Deoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonucléico
dNTP's- Deoxyribonucleotide - Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA- Ethylenediamine tetraacetic acid - Ácido etileno diamino tetracético
FP- fluido peritoneal
HLA-G – Human leukocyte antigen- Antígeno leucocitário humano-G
HW- Hardy-Weinberg
IC- Intervalo de confiança
ILs- Interleucinas
INS/DEL- Inserção/deleção
INTRO – Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Climatério
Kb- Kilo base
KDa- Kilo Dalton
MHC- Major histocompatibility complex – Complexo principal de histocompatibilidade
mL- Mililitro
mM- Milimolar
Ng- Nanograma
OR- Odds Ratio – Razão de chance
Pb- Par de base
PCR- Polymerase Chain Reaction- Reação em cadeia de polimerase
Ph- Potencial hidrogeniônico
RNAm- Ribonucleic acid messenger – Ácido ribonucleico mensageiro
SDS- Dodecil sulfato de sódio
TCLE- Termo de consentimento livre e esclarecido
Tris- Hidroximetil-aminometano
Xg- gravidade
IFN-γ: interferon gama
xiii
RESUMO
A endometriose é uma condição nosológica caracterizada pela presença de tecido
funcional semelhante ao endométrio eutópico em locais como peritônio pélvico,
ovários, septo reto-vaginal. Sua prevalência varia entre 30 a 50% nas mulheres
inférteis. O quadro clínico inclui dispareunia profunda, dismenorreia incapacitante,
dor pélvica crônica e infertilidade. A influência de genes envolvidos com o sistema
imunológico e suas variantes têm sido investigadas quanto à suscetibilidade e
evolução da endometriose. O gene antígeno leucocitário humano-G (HLA-G)
pertence ao complexo de histocompatibilidade principal classe I, mapeado e 6p21 e
contem o polimorfismo 14pb inserção/deleção (ins/del). O presente estudo objetiva
identificar possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G e
endometriose em mulheres de Mato Grosso, Brasil. O desenho epidemiológico é
observacional do tipo caso-controle. Foram incluídas 349 mulheres (209 casos e 140
controles) com idades entre 16 a 50 anos, atendidas e diagnosticadas através de
videolaparoscopia em serviço de referência em reprodução humana de Mato
Grosso. Entrevistas semipadronizadas e coleta de amostras de sangue periférico
foram realizadas. Obtiveram-se DNA através do método com utilização de sais, foi
realizada reação em cadeia de polimerase utilizando iniciadores específicos, os
fragmentos foram visualizados em gel de poliacrilamida 10%. As frequências
genotípicas e alélicas do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G entre casos e
controles mais observadas foram os genótipos heterozigotos ins/del 111 (53,1%) e
69 (49,3%) e alelos del 249 (59,6%), 151 (54,0%), respectivamente. Em relação ao
estadiamento, as frequências genotípicas ins/del no grau I foram 28 (58,3%); grau II,
36 (46,2%); grau III, 21 (48,8%) e grau IV, 26 (65,0%). As frequências alélicas del no
grau I foram 54 (56,3%); grau II, 98 (62,8%); grau III, 49 (57,0%) e grau IV, 48
(60,0%). Não houve diferença estatisticamente significante em nenhuma variável
analisada. Quanto a avaliação do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas
variáveis clínicas entre casos com ou sem infertilidade, a maior frequência obtida
foram os genótipos heterozigotos ins/del em 88 (55,0%) das pacientes com
infertilidade e em 23 (47,0%) das pacientes sem infertilidade. O alelo del foi
observado nas inférteis com frequência de 186 (58,1%) e nas mulheres sem
infertilidade apresentou frequência de 63 (51,7%). Analisando as mulheres com
xiv
endometriose e que relataram ter tido abortamento ou não, observou-se que os
genótipos heterozigotos foram mais frequentes. Nas mulheres com abortamento a
frequência foi de ins/del 13 (48,1%) e sem abortamento ins/del 98 (53,8%). Os
resultados não foram estatisticamente significantes em todas as variáveis clínicas
analisadas p>0,05. Nosso estudo verificou que o polimorfismo 14pb ins/del no gene
HLA-G não está associado à endometriose em mulheres de Mato Grosso – Brasil.
As frequências genotípicas e alélicas não estão associadas com a doença ou com o
estadiamento da mesma, as frequências genotípicas também não estão associadas
com infertilidade e com abortamento.
Palavras-chave: Endometriose, HLA-G, 14pb.
ABSTRACT
Endometriosis is a nosological condition characterized by the presence of functional
tissue similar to eutopic endometrium in pelvic peritoneum, ovaries, rectovaginal
septum. Its prevalence in infertile women varies between 30 and 50%. The clinical
manifestations are variable, including deep dyspareunia, disabling dysmenorrhea,
chronic pelvic pain and infertility. The influence of genes involved in the immune
system and its variants have been investigated for their susceptibility and
progression of endometriosis. The gene of human leukocyte antigen-G (HLA-G)
belongs to the main histocompatibility complex class I. It´s mapped on 6p21, has
eight exons and seven introns being translated region where polymorphism is
present 14pb insertion/deletion (ins/del). This study aims to identify possible
association between the polymorphism 14pb ins/del in HLA-G gene and
endometriosis in women of Mato Grosso-Brazil. The epidemiological design is
observational case-control type. 349 women were included (209 cases and 140
controls) aged 16-50 years, seen and diagnosed by laparoscopy in a human
reproduction center of Mato Grosso. Interviews and collection of peripheral blood
samples were performed for each participant. DNA was extracted by salting out
method, polymerase chain reaction using specific primers, was performed and the
fragments were visualized on 10% polyacrylamide gel. The genotypic and allelic
frequencies of polymorphism 14pb ins/del HLA-G gene between cases and controls
were observed more heterozygous genotypes ins/del 111 (53.1%) and 69 (49.3%)
and alleles del 249 (59, 6%), 151 (54.0%), respectively. As regards staging, the
genotypic frequencies ins/del grade I were 28 (58.3%); grade II, 36 (46.2%); grade
III, 21 (48.8%) and grade IV, 26 (65.0%). The allelic frequencies del grade I were 54
(56.3%); grade II, 98 (62.8%); grade III, 49 (57.0%) and grade IV, 48 (60.0%). There
was no significant difference in any variable analyzed. As the evaluation of
polymorphisms 14pb ins/del HLA-G gene in the clinical variables between cases with
or without infertility, most often heterozygous genotypes obtained were ins/del in 88
(55.0%) patients with infertility and 23 (47.0%) patients without infertility. The allele
del was observed in infertile woman with a frequency of 186 (58.1%) and in no
infertile women showed frequency of 63 (51.7%). Analyzing women with
endometriosis and who reported abortion or not, it was noted that heterozygous
genotypes were more frequent. In women with abortion was the frequency of ins/del
13 (48.1%) and without abortion ins/del 98 (53.8%). The results were not statistically
significant in all clinical variables p>0.5. Our study found that the polymorphism 14pb
ins/del in HLA-G gene did not influence the susceptibility to endometriosis in women
Mato Grosso - Brazil. The genotypic and allelic frequencies are not associated with
the staging and/or severity of the disease, infertility and miscarriages.
Keywords: Endometriosis, HLA-G, 14pb
SUMÁRIO
Dedicatória...................................................................................... v
Agradecimentos.............................................................................. vi
Epígrafe........................................................................................... ix
Lista de figuras................................................................................
Lista de gráficos..............................................................................
Lista de siglas e abreviações..........................................................
x
xi
xii
Resumo...........................................................................................
Abstract...........................................................................................
xiii
xiv
I Introdução....................................................................................... 1
II Objetivos
II.1 Objetivo geral............................................................................
II.2 Objetivos específicos................................................................
4
5
5
III Revisão da literatura
III.1 Endometriose: considerações gerais.......................................
III.2 Etiopatogenia ..........................................................................
III.3 O antígeno leucocitário humano-G (HLA-G)............................
III.4 O polimorfismo 14pb no gene HLA-G......................................
6
7
9
10
12
IV Métodos
IV.1 Tipo de estudo.........................................................................
IV.2 População de estudo e amostra..............................................
IV.3 Considerações éticas...............................................................
IV.4 Tamanho da amostra...............................................................
IV.5 Critérios de inclusão................................................................
IV.6 Critérios de exclusão...............................................................
IV.7 Variáveis estudadas.................................................................
IV.8 Processamento de amostras biológicas..................................
IV.8.1 Coleta de amostras.......................................................
IV.8.2 Extração de DNA..........................................................
IV.8.3 Quantificação do material extraído...............................
IV.9 Técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR)...............
IV.10 Análise de dados
15
16
16
16
16
17
17
17
18
18
18
19
20
21
V Resultados...................................................................................... 22
VI Discussão....................................................................................... 28
VII Conclusões..................................................................................... 32
VIII Anexos............................................................................................ 34
IX Referências bibliográficas.............................................................. 40
1
I.INTRODUÇÃO
2
I. INTRODUÇÃO
A endometriose é uma condição nosológica caracterizada pela presença de
tecido funcional semelhante ao endométrio eutópico em locais como peritônio
pélvico, ovários, septo reto-vaginal e mais raramente no pericárdio, pleura e sistema
nervoso central (NÁCUL; SPRITZER, 2010). Tem prevalência que varia entre 30 a
50% das mulheres inférteis (HOLOCH; LESSEY, 2010, NAVARRO et al., 2006).
Além do quadro clínico e de marcadores biológicos, a precisão diagnóstica da
endometriose envolve a utilização da vídeolaparoscopia, procedimento que permite
a visualização de lesões suspeitas, o estadiamento da doença e a obtenção de
amostras para exame histopatológico (BERBEL et al., 2008).
Cerca de 20 a 25% das mulheres acometidas pela endometriose são
assintomáticas, permanecendo o restante dos casos com quadros clínicos variáveis,
incluindo dispareunia profunda e às vezes dismenorreia incapacitante, dor pélvica
crônica e infertilidade (BULLETTI et al., 2010).
A intensidade da dismenorreia independe do grau de comprometimento
pélvico causado pela endometriose e do tempo de manifestação da doença, a dor
pode ainda ser influenciada por fatores psicológicos. Mulheres sintomáticas para
referem ter seu cotidiano de trabalho, lazer, prática esportiva e vida sexual
comprometida devido às dores cíclicas (MATTA; MULLER, 2006, MISON et al.,
2012). Portanto, o impacto bio-psico-social desta doença é elevado, tanto para a
paciente quanto para a saúde pública (NAVARRO et al., 2006).
Fatores genéticos têm sido investigados quanto a influência na fisiopatologia.
No entanto, o papel de genes envolvidos com o sistema imunológico e suas
variantes na suscetibilidade a endometriose ainda é incipiente, mostrando-se um
caminho promissor a ser explorado. Estudos devem avançar no sentido de definir o
tipo de resposta linfocitária predominante e quais as citocinas que participam
efetivamente deste processo (POPPE, 2008).
O gene do Antígeno leucocitário humano-G (HLA-G) pertence ao complexo de
histocompatibilidade principal (MHC) classe I, localizado no braço curto do
cromossomo 6 (6p21), possui oito éxons e sete íntrons e uma região 3’não traduzida
3
(3’-UTR) sendo este último o local onde esta presente o polimorfismo 14pb
inserção/deleção (ins/del). O gene HLA-G está associado a resposta imunológica
por participar do balanço à resposta imune, influenciando a atividade das células
citotóxicas (HORNUNG, 2001; KAWASHIMA, 2009). Embora ainda de maneira
inconclusiva, a endometriose é uma doença inflamatória que envolve aumento de
citocinas que são características do padrão imune. Portanto, estudos com
marcadores genéticos da resposta imunitária são promissores para melhor
compreensão da fisiopatogênese da doença (PODGAEC et al., 2007). Trabalhos
semelhantes a este, que busquem respostas para o mecanismo etiopatogênico da
endometriose envolvendo o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G inexistem na
população de mulheres em Mato Grosso. A literatura demonstra que a endometriose
pode ser uma doença autoimune, que o gene HLA-G está envolvido com a resposta
imunológica e que de fato há influência do polimorfismo 14pb ins/del na expressão
deste gene, sendo assim, esta pesquisa tem como objetivo identificar as frequências
alélicas e genotípicas do polimorfismo 14pb ins/del neste gene em mulheres com
endometriose neste Estado.
4
II. OBJETIVOS
5
II. OBJETIVOS
II.1 Objetivo Geral
Examinar a possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene
HLA-G e endometriose em mulheres de Mato Grosso, Brasil.
II.2 Objetivos Específicos
Identificar as frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo 14pb ins/del
no gene HLA-G em mulheres com e sem endometriose.
Examinar possível associação entre o polimorfismo 14pb ins/del no gene
HLA-G, presente em mulheres com endometriose, e variáveis clínicas.
6
III. REVISÃO DA LITERATURA
7
III. REVISÃO DA LITERATURA
III.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A ENDOMETRIOSE
A endometriose é uma doença benigna crônica e que na maioria das vezes
acomete mulheres na idade reprodutiva causando diminuição da qualidade de vida,
infertilidade e altos custos sociais. Os depósitos ectópicos de endométrio podem ser
encontrados no peritônio pélvico, ligamentos útero-sacros, fundo de saco de
Douglas, ovários ou mesmo em estruturas fora da pelve (KONDO et al., 2011).
Observam-se mulheres que manifestam sintomas cíclicos de dor no período
menstrual, como dor pélvica crônica, dispareunia de profundidade e/ou sintomas
intestinais e urinários cíclicos como dor ou sangramento ao evacuar/urinar durante o
período menstrual (PODGAEC et al., 2010).
Achados nos exames laboratoriais e de imagem podem predizer com
aceitável acurácia se a paciente tem endometriose, embora o diagnóstico definitivo
seja dado pela videolaparoscopia. Esta possibilita não só o diagnóstico como
também o tratamento cirúrgico, com a cauterização e excisão dos focos, lise das
aderências e estadiamento da doença (KONDO et al., 2011, NÁCUL;SPRITZER,
2010). Há uma maior suspeita no diagnóstico de endometriose quando a mulher
apresenta dor pélvica e infertilidade (HOLOCH; LESSEY, 2010). Trabalhos sugerem
um possível papel da endometriose na etiopatogenia da infertilidade, visto que 20 a
50% das mulheres inférteis apresentam endometriose e 30 a 50% das mulheres com
endometriose são inférteis (NAVARRO et al., 2006). Pesquisa realizada em Mato
Grosso mostrou que 76,4% das mulheres inférteis apresentaram endometriose
(MEDEIROS et al., 2012)
A endometriose pélvica pode ser classificada durante a laparoscopia pelos
critérios da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva - American Society for
Reproductive Medicine (ASRM), revisado em 1996, em: estadiamento I (mínimo),
estadiamento II (leve), estadiamento III (moderado) e estadiamento IV (severo), de
acordo com número, tamanho e porcentagem de implantes superficiais ou profundos
conforme mostra a Figura 1.
8
4.5 Coletas de sangue e processamento das
Figura 1. Estadiamento da endometriose proposto pela Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (1996).
9
III.2 ETIOPATOGENIA
A etiopatogenia da endometriose ainda não foi totalmente elucidada.
Sampson, em 1921, durante cirurgia abdominal de duas mulheres visualizou lesões
na região peritoneal, estruturalmente e funcionalmente parecidas com o endométrio,
e as denominou ―adenomas do tipo endometrial‖. Fez duas importantes
observações: primeiro, percebeu que os cistos hemorrágicos ovarianos (do tipo
achocolatado- hoje denominado endometriomas) rompiam-se facilmente durante o
procedimento e pensou que os mesmos podiam ser responsáveis pelos ―adenomas
do tipo endometrial‖. Segundo, observou que estas mulheres estavam menstruadas
durante a cirurgia e que parte do sangramento uterino drenava na cavidade
abdominal. Em 1927, o mesmo reformulou o conceito que cunhou o termo
endometriose, hipotetisando que, devido à menstruação retrógrada, o tecido do
endométrio se implantaria na cavidade peritoneal. Essa teoria é ainda uma das mais
aceitas nos dias atuais (SAMPSON, 1927 apud BENAGIANO, 2006). No entanto,
esta hipótese não explica todas as formas clínicas de endometriose encontradas.
Em adição à menstruação retrógrada, há a hipótese de imunidade alterada,
na qual se sugere que as células do endométrio migradas para a cavidade pélvica
invadiriam o tecido pélvico e seriam responsáveis por influenciar uma cascata de
eventos, podendo inclusive causar irritação na cavidade e instalando neste local
uma doença inflamatória como a endometriose, com possível acometimento de
nervos, ovários, uretra e intestino. Como o sistema imune é o responsável pela
remoção de células do endométrio ou detritos menstruais, o que não é retirado pode
permanecer na superfície peritoneal e até mesmo invadir o espaço retoperitoneal
(HOLOCH; LESSEY, 2010). Acredita-se que este excesso de endométrio que por
alguma falha na vigilância imunológica não foi eliminado da cavidade, elevaria os
níveis de antígenos, provocando uma resposta auto-imune, seja pela tolerância
imunológica ou falha na rejeição das células invasoras (MATHUR, 2000).
Além da hipótese da menstruação retrógrada e imunidade alterada, há a
hipótese da metaplasia celômica. Esta teoria sugere que como o peritônio contém
células indiferenciadas, as mesmas poderiam diferenciar-se em células do
10
endométrio, e isso poderia contribuir para o desenvolvimento da endometriose
(MACER, 2012). Essa hipótese seria possível devido a cavidade pericárdica,
cavidade pleural e cavidade peritoneal serem formadas a partir do mesmo espaço, o
celôma intraembrionário (MOORE, 2008).
O estudo em genética como base na busca de mecanismos que possam
influenciar no desenvolvimento da endometriose tem sido fortemente discutido
(MATHUR, 2000). Estudos de polimorfismos em genes e sua associação com
endometriose têm sido frequentemente pesquisados, tais como, estudo envolvendo
o receptor de estrogênio α e o citocromo P450c17α (CYP17) (HSIEH, 2004).
Polimorfismos nos genes GSTM1 e GSTT1 (KUBISZESKI, 2013). Polimorfismo
promotor funcional fator nuclear-kB (BIANCO et al., 2012).
A busca por uma definição molecular da patogênese da endometriose ainda
está em seus primórdios (BENAGIANO, 2006). A observação da expressão do HLA-
G em doenças imunes e inflamatórias é relativamente recente, porém, torna-se cada
vez mais evidente que a molécula HLA-G é capaz de exercer ação direta ou
sustentada no sistema imunológico por meio dos seus efeitos imunorregulatórios
(BRENOL et al., 2012).
III.3 ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO-G (HLA-G)
O gene HLA-G pertencente ao MHC que é subdividido em classes I, II e III,
mapeado no braço curto do cromossomo 6 (6p21), aproximadamente, 230 kb
telomérica (Figura 2A). O HLA-G pertence a classe I e possui oito éxons, sete
íntrons e uma região 3’-UTR (GERAGHTY et al., 1987). O RNAm do gene HLA-G
codifica uma proteína de 39kDa de comprimento que contém três domínios
extracelulares ligados a membrana α1, α2, α3, (Figura 2B) (CAROSELLA et al.,
1996). O transcrito primário de HLA-G apresenta sete isoformas de RNAm que vai
de HLA-G1 a G7 devido ao processamento alternativo (Figura 2C) (CAROSELLA et
al., 1999).
O processamento remove os íntrons e une os éxons, formando o RNAm
maduro, que continua a ser modificado (poliadenilação) até ser exportado do núcleo
para ser traduzido em produto proteico. O processamento que converte o pré-RNA
11
em RNAm maduro precisa ocorrer com precisão, evitando perda ou adição de
nucleotídeos nos sítios de junção dos éxons. Sendo assim, os pré-RNAs alternativos
devido a esta estratégia pode dar origem a mais de um produto polipeptídico, ou
seja, mais de uma proteína por gene (WATSON et al., 2006).
Figura 2 - Esquema do gene do Antígeno Leucocitário Humano-G (HLA-G) e sua
transcrição. Adaptado.
Fonte: http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_HLA-G.html
À partir de 1990, foi observado que a molécula HLA-G encontra-se na
interface feto placentária e é expresso na superfície do trofoblasto, sendo
responsável pela proteção do feto contra a resposta imune da mãe (BRENOL et al.,
2012). Porém, não está restrito a tecidos fetais, foi relatado que o HLA-G também é
expresso nas células epiteliais do timo adulto, ilhotas pancreáticas e em células-
tronco (CAROSELLA et al., 1999).
12
A função da molécula HLA classe I é o reconhecimento de células alvos pelos
linfócitos T citotóxicos (LTC); esta molécula é reconhecida juntamente com o
antígeno por um receptor expresso em sua superfície. Todas as células nucleadas
possuem o MHC classe I e este pode estimular os linfócitos T (CD8+) a produzir
citocinas, capazes de estimular a atividade citotóxica das células natural Killer (NK) e
dos macrófagos. As NK são responsáveis pela apoptose de células infectadas e
podem secretar citocinas como o interferon gama(IFN-γ) que ativam os macrófagos
e aumentam a capacidade destes em fagocitar (DELVES, ROITT, 2000). Porém, a
classe I do MHC, em contato direto com a NK, pode ativar o receptor inibitório deste,
e assim, não haverá destruição da célula (MORETTA et al., 2002).
A expressão do HLA-G foi estudada nas mulheres com endometriose,
principalmente no fluído peritoneal (FP) (EIDUKAITE; TAMOSIUNAS, 2008,
HORNUNG et al., 2001, KAWASHIMA et al., 2009), e no epitélio do estroma e
epitélio glandular retirados dos tecidos eutópicos e ectópicos (BARRIER et al., 2006,
HORNUNG et al., 2001, KAWASHIMA et al., 2009).
Na literatura, existem descrições da expressão do HLA-G com esclerose
múltipla, doença celíaca, asma, doença de Behçet, sarcoidose, pênfigo vulgar e
miocardiopatia dilatada idiopática, transplantes, tumores celulares, estados
inflamatórios e infecções virais (SCHNEIDER, 2009).
III.4 POLIMORFISMO 14 PB INSERÇÃO/DELEÇÃO (INS/DEL)
O HLA-G tem sido foco de estudos, principalmente devido a variações
nucleotídicas presentes nele, sendo o polimorfismo 14pb ins/del um dos mais
estudados, uma vez que estes podem influenciar na regulação da expressão do
HLA-G (TURECK, 2011).
Em estudo prévio, o polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G foi analisado
em 121 indivíduos humanos e 41 macacos divididos em cinco espécies diferentes.
Foi observado que a sequência de 14pb estava presente (ins) em todas as espécies
de macacos, enquanto nos humanos, a sequência de 14pb ins poderia estar
13
presente ou ausente. Sendo assim, provavelmente o gene polimórfico é o 14pb
deleção (CASTRO et al., 2000).
Análise detalhada da região 3’-UTR do gene HLA-G pode auxiliar no
esclarecimento de mecanismos subjacentes de controle da expressão do HLA-G.
Autores inferem que a região 3’-UTR que apresenta o alelo 14pb ins pode estar
associado a baixa disponibilidade do RNAm, enquanto que o 14pb del causaria alta
disponibilidade do mesmo (CASTELLI et al., 2010). O alelo HLA-G que possui 14pb
ins ao ser submetido ao processamento alternativo perde 92 bases da região 3’-
UTR, sendo que essas são retiradas transversalmente de parte do transcrito (Figura
3). Embora este alelo esteja associado com um RNAm mais estável, ainda assim,
representam a minoria dos transcritos (VEIT; CHIES, 2009).
Figura 3 – Esquema do processamento alternativo na região 3’-UTR, com presença do 14pb e marcação de onde são removidos 92pb do RNAm. Adaptado. Fonte: Rosseau et al., 2003.
Estudos avaliaram isoformas do polimorfismo 14pb ins na região 3’-UTR
através de biópsia de trofoblasto e demonstraram que o produto do gene que
contem este polimorfismo está presente em níveis bem menores que as mesmas
isoformas com sequência de polimorfismo que apresenta o 14pb del (HVIID et al.,
2003). Sendo assim, na gestação, o HLA-G parece desequilibrar o balanço da
resposta imune Th1/Th2 vindo a favorecer respostas do tipo Th2, levando a inibição
das células NK e prosseguimento da gestação, dessa forma o HLA-G atuaria como
molécula imunossupressora (VIANA et al., 2007). Como o polimorfismo 14pb ins
diminui os níveis de HLA-G, isto permitiria a ocorrência de uma resposta T auxiliares
do tipo 1 (Th1), com ativação das células NK, o que levaria a ocorrência da pré-
14
eclâmpsia ou até ocasionaria o abortamento (SCHNEIDER, 2009, VIANA et al.,
2007).
As células Th1 são secretoras de citocinas pró-inflamatórias como o IFN-γ e
IL-2, que servem de gatilho para o envolvimento de células imunes como as NK,
macrófagos e linfócitos T. Enquanto as células Th2 são produtoras de citocinas
antiinflamatória, principalmente o IL-4 e IL-10 (MOSMANN et al., 1986 apud
PODGAEC et al., 2007). As respostas Th1 e Th2 coexistem e raramente se
enquadram exclusivamente em Th1 ou Th2, mas uma predomina sobre a outra,
levando em consideração o tipo e quantidade de antígenos envolvidos, bem como o
local onde a resposta imune tem início (RIZZO et al., 1995). Embora IL-10 tenha sido
descrito como um produto Th2 foi observado que ela também é secretada por Th1 e
por macrófagos ativados (ABBAS et al., 1996). Nas mulheres com endometriose, foi
observado que quando o padrão de resposta Th1 está ativo, o padrão Th2 também
pode estar presente, sugerindo que ambos os braços da resposta imune estão
envolvidos (PODGAEC et al., 2007).
No Brasil, não foram encontrados trabalhos com o polimorfismo 14pb do gene
HLA-G em mulheres com endometriose, porém o mesmo tem sido estudado em
distúrbios gestacionais como o abortamento e pré-eclâmpsia (VIANNA, 2007), na
população de Belém do Pará foi realizado pesquisa genética populacional com este
polimorfismo (BARBOSA, 2009). Também foi investigado em amostra afro-brasileira
do residente no Paraná (TURECK, 2011), em patologias como o Lupus Eritematoso
Sistêmico (VEIT et al., 2009), em doenças reumatológicas (BRENOL et al., 2012) e
em doenças inflamatórias intestinais (SCHNEIDER, 2009).
15
IV. MÉTODOS
16
IV. MÉTODOS
IV.1 TIPO DE ESTUDO
O desenho epidemiológico do estudo foi observacional do tipo caso-controle.
IV.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO E AMOSTRA
A população do estudo compreendeu 349 mulheres em idade fértil entre 16 a
50 anos com queixas de dor pélvica ou infertilidade, encaminhadas para realização
de videolaparoscopia, padrão ouro para o diagnóstico de endometriose (PRIETO et
al., 2012). O recrutamento das participantes ocorreu no Instituto Tropical de
Medicina Reprodutiva e Menopausa (INTRO) de Cuiabá- MT entre o período de
janeiro de 2010 a janeiro de 2013.
Considerou como casos 209 mulheres com diagnóstico de endometriose
confirmado por videolaparoscopia e exame histopatológico. Enquanto 140 mulheres
que realizaram videolaparoscopia sem confirmação diagnóstica de endometriose,
foram incluídas como controles.
IV.3 CONSIDERAÇÕES ÈTICAS
O protocolo da pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa envolvendo Seres Humanos do Hospital Universitário Júlio Müller, com o
número de parecer: 267.286 (Anexo 2). Todas as mulheres pesquisadas assinaram
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 3).
IV.4 TAMANHO DA AMOSTRA
O cálculo da amostra foi realizado com α=5% e para poder de teste β=90%,
Z é o valor bicaudal relacionado com a hipótese nula e Z é o valor unicaudal
inferior relacionado com a hipótese alternativa, sendo assim Z =1,96 e Z =1,28,
17
1 0,24 corresponde a menor frequência polimórfica do gene HLA-G 14pb
(genótipo ins/ins) encontrado em um estudo com uma população de Mato Grosso-
Cuiabá (LEOTTI, 2010) e 2 0,28, assume uma proporção de 20% acima do valo
de 1 . com a seguinte fórmula
2
21
221111 )1()1()1(2
ZZn
Assim, seriam necessárias 100 mulheres com endometriose e 100 mulheres sem a
patologia.
IV.5 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídas no estudo mulheres encaminhadas para videolaparoscopia
que se encontravam em idade fértil (16 a 50 anos). As pacientes incluídas como
casos foram aquelas cujo diagnóstico de endometriose pélvica ficou confirmado pela
visualização dos focos com biopsia confirmatória de endometriose. As pacientes
controles foram aquelas em que não houve visualização de lesões endometrióticas
na cavidade pélvica.
IV.6 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Atendendo a proposta da pesquisa, foram excluídas mulheres que não
residiam no estado de Mato Grosso, além de mulheres que já se encontravam na
menopausa devido a necessidade de análise alélica e genotípica e sua associação
com sinais clínicos. Mulheres que não concordaram com a punção venosa para
coleta de material biológico e/ou assinatura do TCLE também foram excluídas desta
pesquisa.
IV.7 VARIÁVEIS ESTUDADAS
As participantes responderam a um questionário semi-padronizada, onde se
coletou variáveis de interesse como idade, naturalidade, procedência, etnia
(autoreferida), profissão, situação marital, dados ginecológicos e obstétricos,
18
presença ou não de focos de endometriose e estadiamento da doença; as lesões
foram observadas na videolaparoscopia e classificadas de acordo com os critérios
da ASRM, revisados em 1996 (Figura 1).
IV.8 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS
IV.8.1 Coleta de amostras
Após aplicação do questionário, foi realizado venopunção com técnica
asséptica com coleta de 8mL de sangue distribuídos em dois tubos de 4mL
contendo anticoagulante EDTA (VACUPLAST®), os mesmos foram armazenados em
freezer -20°C (CONSUL®), até a data de extração.
IV.8.2 Extração de DNA
Todos os experimentos foram executados no laboratório de genética da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso. O protocolo para a
extração de DNA baseou-se no método salting out, proposto por John et al. (1990),
modificado por Lahiri e Nurnberger em 1991, executado com pequenas
modificações. Foram utilizadas micropipetas (EPPENDORF®) calibradas para o
preparo de todos os reagentes e utilização destes nos experimentos. Os preparos
das soluções se deram da seguinte maneira: Solução de lise I com água bidestilada
autoclavada, adicionou-se o tris (10mM), acertou-se o pH da solução entre 7,5 e 8,0
com HCl, dissolveu-se sacarose (0.32mM), MgCl2 (5mM) e Triton 100. Esta solução
foi acondicionada na geladeira (CONSUL®) em frasco envolvido com papel alumínio.
Na solução de lise II utilizou-se água bidestilada autoclavada como solvente e
adiciona-se o tris (10mM), EDTA (10mM), NaCl (10mM) e SDS 0,5% no mesmo,
este foi acondicionado em temperatura ambiente. No preparo para a solução de
precipitação de proteína utilizou-se água bidestilada autoclavada como solvente e
como soluto apenas o NaCl (6M), este foi acondicionado em temperatura ambiente.
Na data de extração de DNA o sangue foi retirado do freezer para alcançar a
temperatura ambiente. Colocou-se o sangue em tubo para centrifugação com fundo
cônico (Tipo Falcon®) com tampa rosqueável de volume 15 mL, livre de Dnase,
Rnase, pirogênios e toxinas, adicionou-se 8mL de solução de lise I, passou-se no
vórtex (FANEM®) até homogeneizar e em seguida foi agitado manualmente. Marcou-
19
se 10 min da hora em que foi adicionada a solução e o mesmo foi centrifugado
(SIGMA®) por 5min em 8.000xg. Despejou-se o sobrenadante deixando no fundo do
tubo o sedimento e adicionou-se a este 4mL de solução de lise I, novamente o tubo
foi agitado em vórtex até homogeneizar, em seguida agitou-se manualmente até
completar mais 10mim; centrifugou-se por 5min em 8.000xg. Despejou-se o
sobrenadante deixando o sedimento no fundo do tubo, adicionou-se a este 2mL de
solução de lise I, novamente passou-se no vórtex até homogeneizar, em seguida
agitou-se manualmente até completar os 10mim, centrifugou-se por 5min em
8.000xg. Desprezou-se o sobrenadante deixando o sedimento no fundo do tubo e
adicionou-se a este 1mL de solução de lise II, passou-se no vórtex até
homogeneizar; em seguida adicionou-se 0,33µL da solução de precipitação de
proteína e passou-se no vórtex novamente até homogeneizar; centrifugou-se por
5min em 8.000xg; foi aspirado 1100µL do sobrenadante e distribuído 550µL em dois
microtubos de polipropileno (Corning®) com tampa de pressão, livre de
Rnase/Dnase, autoclavável, adicionou-se 550µL de isopropanol a este e agitou-se
manualmente até que o DNA fosse revelado, em seguida os microtubos foram
acondicionado em centrifuga (SIGMA®) por 10min a 14.000xg; ao serem retirados,
desprezou o sobrenadante e adicionou-se 500µL de álcool etílico 70% para
purificação do DNA; passou-se no vórtex até desprender o sedimento, centrifugou-
se por 10min em 14.000xg; (repete-se esse procedimento de lavagem com etanol
70% três vezes). Desprezou-se o sobrenadante e o sedimento foi deixado em
dequitação por aproximadamente 3h (tempo o suficiente para evaporação do álcool
etílico); após esse período, foi adicionado 200µL de água bidestilada e autoclavada
ao sedimento e passado no vórtex até homogeneizar.
IV.8.3 Quantificação do material extraído
A quantificação do DNA foi realizada em aparelho NanoDrop modelo
2000/2000c Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific®), com este aparelho
pode-se também observar o grau de pureza dos DNAs. As amostras com pouco
DNA (abaixo de 20ng/ µL) e fora do padrão de pureza (A 260/280 entre 1.6 a 2.0 e
A260/230 entre 1.7 a 2.1) foram desprezadas por não permitir identificação
satisfatória do polimorfismo em reação em cadeia de polimerase (PCR), portanto
uma nova extração foi realizada. Foi retirado 10µL das amostras de DNA e
20
armazenadas em outro microtubo para manuseio, todas as amostras foram
guardadas em freezer -80ºC até a data da técnica de PCR.
IV.9 GENOTIPAGEM POR REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
Inicialmente foi preparado o mix em capela Workstation para PCR modelo
WS-02. O mix utilizado foi composto de água bidestilada autoclavada,
desoxinucleotídeos dNTP's (Biotecnologia®), tampão (10X PCR com 100mM Tris-
HCL, Ph 8.6; 500mM KCL, 15mM MgCl2), MgCl2 (25mM) e enzima Taq DNA
Polimerase (Affymetrix®), iniciadores para HLA-G 14pb (Eurofins®). Por fim, foi
adicionado 1,5µL das amostras de DNA, onde o volume final de cada microtubo foi
de 15µL. Em seguida, os mesmos foram acondicionados em termociclador
(Amplitherm Thermal Cyclers® 96X) para amplificação da molécula de DNA,
programado com temperatura/tempo de desnaturação inicial 94ºC-5’, 30 ciclos com
desnaturação 94ºC-45‖; anelamento 56ºC-45’’ e alongamento 72ºC-1’ e
alongamento final 72ºC-7’ (TEXEIRA et al., 2013). A sequência de iniciadores
utilizados para análise em PCR do polimorfismo 14pb (forward 5’-
TGTGAACAGCTGCCCTGTGT-3’ e reverse 5’- AAGGAATGCATTCAGCATGA-3’. Após a
amplificação, os fragmentos obtidos foram analisados em gel poliacrilamida a 10%
por aproximadamente 1h00min a 250v e corados com nitrato de prata. Foram
observados fragmentos 14pb ins (152 pb) e 14pb del (138 pb) como mostrado na
Figura 4:
21
FIGURA 4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata para observação do polimorfismo 14pb ins/del do HLA-G, entre colunas de 01 a 14. 01- Marcador de peso molecular 100pb; 02- homozigotos para inserção; 03, 05, 08 e 12- homozigotos para deleção; 04, 06, 07, 09, 10 e 13 heterozigotos inserção/deleção; 11- branco (amostra sem DNA); 14- controle positivo.
IV.10 ANÁLISE DE DADOS
Para as variáveis continuas com distribuição normal foram calculado a média
e o desvio padrão. Para a associação do genótipo entre os polimorfismo do gene
HLA-G 14pb ins/del e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-
quadrado (χ2) de Pearson. Para associação alélica entre os polimorfismo do gene
HLA-G 14pb ins/del e a endometriose foram utilizados teste de proporção qui-
quadrado (χ2) de Pearson e Razão de Chance (OR), com intervalo de confiança de
95%. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significante. Os dados
foram digitados em dupla entrada, armazenados e analisados com auxílio do
Programa EpiData Software, version 2.2.2 build 177, Dinamarca.
22
V. RESULTADOS
23
V. RESULTADOS
As pacientes incluídas no estudo com endometriose apresentaram uma média
de idade de 32,04 anos (±5,87), e nas mulheres sem endometriose foi de 31,90 anos
(±5,74). A idade da menarca ocorreu em torno dos 12,55 anos para ambos os
grupos. O estado civil predominante foi convivência marital tanto entre os casos 168
(80,4%) como entre os controles 110 (78,6%). Quanto à etnia, as raças branca e
parda foram igualmente autorreferidas no grupo de casos, sendo 95 (45,5%) cada
uma; entre controles a etnia predominante foi a parda em 66 mulheres (47,1%). O
grau de escolaridade de maior frequência foi as com ensino superior 141 (67,5%) e
80 (57,1%) nos grupos de casos e controles, respectivamente.
As frequências genotípicas, referentes ao polimorfismo 14pb ins/del no gene
HLA-G, observadas entre casos (X2=5,779; GL=2, P=0,06) e controles (X2=0,024;
GL=2, p=0,99) demonstrou que a população da pesquisa encontra-se em equilíbrio
de Hardy-Weinberg.
Na Tabela 1 estão apresentadas as frequências genotípicas observadas entre
os grupos de casos e controles, sendo os heterozigotos os mais frequentes,
correspondendo a ins/del em 111 (53,1%) e 69 (49,3%), respectivamente. A maior
frequência alélica observada entre as pacientes com endometriose foi del 249
(59,6%); e entre as pacientes sem endometriose del em 151 (54,0%). Não houve
diferença estatisticamente significante em nenhuma variável analisada.
24
Tabela 1. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle).
Variável Caso
(n=209)
Controle
(n=149)
X2 p OR/ IC95%
Genótipo
ins/ins 29(13,9%) 30(21,4%) Referência
ins/del 111(53,1%) 69(49,3%) 2,868 0,090 0,6022 (0,3312-1,093)
del/del 69(33,0%) 41(29,3%) 2,905 0,088 1,661 (0,9122-3,314)
Alelo
ins 169(40,4%) 129(46,0%) Referência del 249(59,6%) 151(54,0%) 2,181 0,1398 0,7947
(0,5851-1,079)
Na Tabela 2, estão apresentados o grupo de casos e os diferentes graus de
apresentação da doença. Observa-se que as frequências genotípicas não se
diferenciaram conforme o estadiamento da endometriose, sendo o genótipo
heterozigoto mais observado, ins/del no grau I, 28 (58,3%); grau II, 36 (46,2%); grau
III, 21 (48,8%) e grau IV, 26 (65,0%), não houve diferença estatisticamente
significante em nenhuma categoria. As frequências alélicas mais presentes foi del
em todos os estágios, o alelo del no grau I, 54 (56,3%); grau II, 98 (62,8%); grau III,
49 (57,0%) e grau IV, 48 (60,0%), sem significância estatística.
Tabela 2. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose conforme o grau da doença.
Variável Grau I (n=48)
Grau II (n=78)
Grau III (n=43)
Grau IV (n=40)
p
Genótipo ins/ins 07 (14,6%) 11 (14,1%) 08 (18,6%) 03 (7,5%) Referência
ins/del a 28 (58,3%) 36 (46,2%) 21 (48,8%) 26 (65,0%) 0,3993
del/del b 13 (27,1%) 31 (39,7%) 14 (32,6%) 11 (27,5%) 0,6948
Aleloc
ins 42 (43,7%) 58 (37,2%) 37 (43,0%) 32 (40,0%)
Referência
del 54 (56,3%) 98 (62,8%) 49 (57,0%) 48 (60,0%) 0,7126
aTeste X2= 2,950; GL=3, bTeste X2
=1,446; GL=3, cTeste X2=1,370; GL=3
25
Na Tabela 3, as mulheres com endometriose foram reagrupadas de acordo
com gravidade da doença, sendo a endometriose de grau I e II as formas menos
agressivas e os graus III e IV as formas mais agressivas. As frequências genotípicas
e alélicas entre os dois grupos foram bem próximas, não havendo diferença
estatisticamente significante em nenhuma das duas observações, com p>0,05 para
todas as variáveis. As frequências alélicas foram maiores do polimorfismo del, com
152 (60,3%) nos estágios menos avançados e 97 (58,4%) nos mais avançados.
Tabela 3. Distribuição e frequência genotípica/alélica do polimorfismo 14pb ins/del do gene HLA-G nas mulheres com endometriose, reagrupadas em estágio menos avançado e mais avançado.
Graus I e II Graus III e IV p
Genótipo ins/ins 18 (14,3%)
11 (13,3%)
referência
ins/del a 64 (50,8%)
47 (56,6%)
0,6676
del/del b 44 (34,9%) 25 (30,1%) 0,8735
Aleloc
ins 100 (39,7%)
69 (41,6%)
referência
del 152 (60,3%)
97 (58,4%) 0,70
aTeste X2= 0,1844; GL=1, bTeste X2= 0,0253; GL=1, cTeste X2=0,147; GL=1
Na Tabela 4, analisou-se duas das principais variáveis clínicas associadas a
endometriose: infertilidade e abortamento. Observa-se nesta população que as
mulheres com endometriose apresentaram uma frequência de infertilidade de 160
(76,6%), sendo estatisticamente significante (p=0,012). Abortamento tanto entre o
grupo caso e controle não foi estatisticamente significante, com p>0,05.
Tabela 4. Distribuição das variáveis clínicas entre as mulheres com endometriose (caso) e sem endometriose (controle).
Variável Caso (n=209)
Controle (n=140)
X2 p OR/IC 95%
Infertilidade
Sim 160 (76,6%) 90 (64,3%) 6,211 0,012 1,811 (1,129-2,909)
Não 49 (23,4%) 50 (35,7%)
Abortamento
Sim 27 (12,9%) 18 (12,9%) 0,000 0,986 1,005 (0,5308-1,905) Não 182 (87,1%) 122 (87,1%)
26
Na Tabela 5, as frequências genotípicas observadas entre as mulheres com
endometriose e infertilidade foram: ins/ins 23 (14,4%), ins/del 88 (55,0%) e del/del 49
(30,6%) e no grupo controle foram ins/ins 06 (12,2%), ins/del 23 (47,0%) e del/del 20
(40,8%) com p=0,41.
Tabela 5. Distribuição e frequência genotípica do polimorfismo 14pb ins/del do gene
HLA-G nas mulheres com endometriose que apresentaram infertilidade.
Genótipo Infertilidade
SIM % NÃO %
(n=168) (n=41)
X2 p OR
IC
95%
ins/ins 23 (14,4) 06 (12,2) referência 1
ins/del 88 (55,0) 23 (50,0) 0,000 0,9971 1,002 0,3729-2,976
del/del 49 (30,6) 20 (40,8) 0,7209 0,3958 1,558 0,5612-4,752
Conforme apresentado na Tabela 6, as frequências genotípicas entre as
mulheres com endometriose e que relataram abortamento foram ins/ins 5 (18,5%),
ins/del 13 (48,1%) e del/del 09 (33,3%) e sem abortamento ins/ins 24 (13,2%),
ins/del 98 (53,8%) e del/del 60 (33,0%). Os resultados não apresentaram diferença
estatisticamente significante, em todas as variáveis analisadas p>0,05.
Tabela 6. Distribuição e frequência genotípica do HLA-G nas mulheres que tiveram endometriose (caso) e que apresentaram abortamento.
Genótipo Abortamento
------------------------------
Sim % Não %
(n=27) (n=182)
X2 p OR
IC
95%
ins/ins 5 (18,5%) 24(13,2%) referência 1
ins/del 13(48,1%) 98(53,8%) 0,6275 0,4283 1,565 0,4612-4,745
del/del 9(33,3%) 60(33,0%) 0,2939 0,5878 1,384 0,3847-4,582
ins/del + del/del 22(18,5%) 158 (86,8%) 0,5593 0,4545 1,493 0,4646-4,183
27
VI.DISCUSSÃO
28
VI. DISCUSSÃO
A endometriose é uma condição nosológica que tem influenciado a qualidade
de vida da mulher adulta moderna, por muitas vezes estar associada a desconfortos
como dor pélvica importante, fluxo menstrual intenso, irregular e a infertilidade
(NÁCUL; SPRITZER, 2010).
No presente trabalho, foram estudados polimorfismo genético e variáveis
clínicas de mulheres com endometriose e mulheres hígidas para esta condição,
oriundas de serviço considerado referência em reprodução humana de Mato Grosso.
A maioria das mulheres encontrava-se na quarta década de vida, possuíam
convivência marital e nível superior de escolaridade, sendo estes dados
concordantes com a literatura (BELLELIS et al., 2010; ZIMMERMMANN et al., 2010).
Tais achados eram esperados, uma vez que as mesmas foram recrutadas em uma
clínica cuja demanda se restringe a pacientes conveniadas e particulares.
As frequências genotípicas, referentes ao polimorfismo 14pb ins/del no gene
HLA-G observadas entre casos e controles, demonstrou que a população da
pesquisa encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
A análise do polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G mostrou que os
genótipos heterozigotos, bem como o alelo del apresentaram uma frequência maior
no grupo de mulheres com endometriose, porém, não foi estatisticamente
significante.
Na literatura, não foram encontrados trabalhos semelhantes utilizando este
polimorfismo. No entanto, estudos analisando a expressão do gene HLA-G são
relativamente frequentes (HORNUNG et al., 2001; BARRIER et al., 2005,
KAWASHIMA et al., 2009; EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008).
Pesquisa através de western blotting, verificou a expressão do gene HLA-G
no fluído peritoneal de mulheres com e sem endometriose, além do cultivo de
células do estroma eutópico e ectópico de mulheres com endometriose. A presença
do HLA-G não foi encontrada em nenhuma das amostras de mulheres com
endometriose (HORNUNG et al., 2001). Em outro trabalho, a expressão do HLA-G
29
foi analisada através da imuno-histoquímica, onde também não encontraram HLA-G
no epitélio do estroma e no epitélio glandular. Porém, no mesmo estudo, foi
demonstrada a presença do transcrito de HLA-G em 92,8% das amostras do epitélio
glandular retirado das lesões peritoneais, a técnica utilizada foi a de hibridação in
situ. Nas biópsias de endométrio eutópico não se identificou o transcrito do HLA-G
em nenhum grupo (BARRIER et al., 2005).
O achados na literatura diferem dos encontrados no presente trabalho, pois o
fato da maioria dos autores não terem observado HLA-G solúvel se justificaria se
população do presente estudo apresentasse uma frequência do genótipo 14pb ins
maior que o 14pb del, uma vez que a diminuição da expressão da proteína do HLA-
G está associada ao alelo ins (VEIT et al., 2009). Porém, deve-se levar em
consideração que nos trabalhos de Hornung e Barrier, uma amostragem
relativamente pequena foi utilizada.
Em outro estudo, a expressão do HLA-G foi analisada por citometria de fluxo
e coloração imuno-histoquímica no FP e no epitélio do endométrio eutópico de
mulheres com e sem endometriose durante todas as fases do ciclo menstrual e
observaram que o mesmo é expresso no endométrio eutópico, porém, apenas
durante a fase menstrual. Durante esta mesma fase, há um aumento da expressão
do HLA-G no FP, independente do grupo ter ou não endometriose, algo que
caracteriza o ambiente intra-uterino no período menstrual como um espaço
fisiologicamente instável, além de apoiar a teoria da menstruação retrógrada
(KAWASHIMA et al., 2009). O HLA-G solúvel foi observado no FP de mulheres com
e sem endometriose, através do método ELISA, mas não foi encontrada diferença
estatisticamente entre os dois grupos (EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008).
O presente trabalho é concordante com estes achados, pois o polimorfismo
14pb del foi observado em maior frequência e isto faz com aumente a possibilidade
da expressão do HLA-G ser detectado. O HLA-G5/HLA-G1 são detectados no soro
apenas quando o HLA-G apresenta 14pb del/del na região 3’-UTR (RIZZO et al.,
2005). Porém, mesmo havendo uma frequência expressiva do polimorfismo 14pb del
em nosso estudo e sendo encontrado HLA-G solúvel nos trabalhos mencionados, os
achados não foram estatisticamente significantes.
30
Em todos os graus de acometimento da endometriose, nenhum genótipo ou
alelo chamou atenção por ser mais ou menos frequente no presente estudo. O grupo
com endometriose foi ainda reagrupado em estágios iniciais (grau I e II) e estágios
mais avançados (grau III e IV) e, novamente, o polimorfismo analisado não conferiu
associação com nenhuma das variáveis avaliadas. Estes achados corroboram com
um estudo prévio que analisou a presença de HLA-G solúvel e estadiamento da
endometriose e não observaram diferença estatisticamente significante nas
concentrações de HLA-G solúvel tanto nos estágios iniciais como nos estágios mais
avançados (EIDUKAITE, TAMOSIUNAS, 2008). Embora não se tenha analisado a
expressão do HLA-G no presente trabalho, os resultados de quem o fizeram são
concordantes com a frequência do polimorfismo 14pb ins/del observado neste
estudo.
Aproximadamente 77% das mulheres com diagnóstico de endometriose,
apresentavam infertilidade, concordando com pesquisa publicada em Mato Grosso,
com 76,4% (MEDEIROS et al., 2007), dado esperado, uma vez que as mulheres
recrutadas nesta e na outra pesquisa foram em sua grande maioria pertencentes a
mesma clínica. Estes dados estão acima do encontrado na literatura, que afirmam
que 20 a 50% das mulheres inférteis apresentam endometriose. Também vale
ressaltar que as mulheres foram recrutadas em uma clínica de infertilidade, algo que
pode justificar essa diferença. Pressupõe-se que a cavidade pélvica de uma mulher
acometida por endometriose apresente um ambiente desfavorável para o sucesso
gestacional, uma vez que existe um desequilíbrio no FP, como a produção de
autoanticorpos específicos para o endométrio (INAGAKI et al., 2011).
A investigação do polimorfismo 14pb na amostra de mulheres de Mato Grosso
foi uma tentativa de se identificar um possível marcador molecular para
endometriose e suas características clínicas, considerando uma de suas hipóteses
etiológicas vinculada ao sistema imunológico (HOLOCH; LESSEY, 2010)
O abortamento é frequentemente relatado em mulheres com esta patologia
(D’HOOGHE et al, 2003; VIANA, 2007), No presente estudo não houve diferença
estatisticamente significante entre endometriose e abortamento. Porém, analisando
os grupos, observou-se um percentil menor do alelo 14 pb ins nas pacientes com
endometriose que apresentaram abortamento, mas não houve diferença
31
estatisticamente significante como o encontrado por Wang (2013) que sugeriu que o
14pb ins quando encontrado em níveis diminuídos é uns dos responsáveis para o
insucesso gestacional e pré-eclâmpsia.
Hipóteses tentam relacionar o HLA-G com a resposta imunológica Th1 e Th2.
Pesquisa analisou que a secreção de HLA-G5/HLA-G1 é precedida pela expressão
de IL-10, e embora a expressão do mesmo seja menor na presença do genótipo
14pb del, não apresentou diferença estatisticamente significante na concentração de
IL-10 no soro quando os três genótipos foram comparados (RIZZO, 2005). Outro
estudo encontrou diferença estatisticamente significante quando observaram a
secreção dessas citocinas no FP de mulheres com endometriose e sem
endometriose, onde o IFNγ e do IL-10 nas pacientes com endometriose foi maior.
Isso demonstra que enquanto um padrão de resposta está ativo, o outro também
pode estar presente, porém sugerem que na endometriose o equilíbrio no sistema
imunológico tende para a resposta Th2 (PODGAEC, 2007). Embora o IL-10 tenha
sido inicialmente descrito como um produto Th2 é claro que esta citocina também é
secretada por Th1 e por macrófagos ativados (ABBAS et al., 1996). Outra pesquisa
avaliando o percentual de NK e de autoanticorpos em sangue periférico de mulheres
com e sem endometriose pélvica, demonstrou que a concentração de NK foi mais
elevada nas pacientes com endometriose, e muito mais elevada ainda nas pacientes
com estadiamento avançado. Essa resposta de ativação das NK é uma resposta
Th1 (DIAS, 2010). Assim, o envolvimento do HLA-G com as citocinas ainda não é
bem claro.
Embora o polimorfismo 14pb do gene HLA-G seja considerado responsável
pelo processamento alternativo que ocorre na extremidade 3’-UTR e esteja
associado com maior ou menor expressão da molécula, vale lembrar que existe o
polimorfismo 3142 localizado também na região 3’-UTR, bem próximo do
polimorfismo 14pb ins/del, algo que pode causar desequilíbrio de ligação com o
mesmo. O polimorfismo 3142 tem sido estudado e parece ser um fator importante
para a regulação da expressão do HLA-G (VEIT, 2009). Se este polimorfismo tem ou
não implicação na etiopatogenia da endometriose, não se sabe.
32
Diante da complexidade etiológica da endometriose, da inexistência de outros
estudos com o polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G em mulheres acometidas,
pode se inferir que outros fatores devem estar influenciando sua fisiopatologia.
33
VII.CONCLUSÕES
34
VII. CONCLUSÕES
O polimorfismo 14pb ins/del no gene HLA-G não apresenta associação com a
endometriose em mulheres de Mato Grosso - Brasil.
Nas mulheres com endometriose, as frequências genotípicas e alélicas não
estão associadas com o estadiamento e/ou gravidade da doença, com infertilidade e
com abortamento.
35
VIII.ANEXOS
36
Anexo 1
37
38
39
Anexo 2
PROTOCOLO DE ENTREVISTA E COLETA DE AMOSTRA
Entrevistador: ______________________ Data:____/____/______. Grupo: Caso ( ) Controle ( )
1- Nome: ____________________________________________ 2. Registro:___________________
3- Data de Nasc: _______________4- Telefone: _______________5- Naturalidade:
________________
6 –Estado Civil:_______________8 – End. Completo:______________________________________
Bairro:_____________________Cidade:_______________Estado:___CEP:____________________
7 – Naturalidade do Pai:_________________da Mãe:______________________________________
8 – Naturalidade do Avô Paterno:___________________da Avó Paterno:_______________________
9 – Naturalidade do Avô Materno:__________________da Avó Materno: ______________________
10- Peso: _______________11 – Altura: ______________ 12 – Escolaridade: __________________
13 – Etnia:( ) branco ( ) negro ( ) pardo ( ) asiático ( ) índio 14 – Profissão: _________________
15- Idade da menarca:__________ 16 – Gesta:________ 17- Paridade:________ 18-
Abortamento:_______
19 - Ciclos menstruais: ( )regulares ( )irregulares Intervalo de dias: ________ 20 – DUM:__________
21- Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos
22– Data do Diagnóstico da endometriose:________anos. (OBS: se portadora da patologia)
23 - Principal sintoma na época do diagnóstico: ( )Infertilidade ( ) dor a menstruação ( ) Dor
pélvica ( ) Dor a relação sexual ( ) Sintomas urinários, se sim,
quais:_________________________________ ( ) Sangramento menstrual Anormal, como:
__________ ( ) Sintomas gástricos, se sim, quais:_____________________ ( ) Cefaléia ( )
Enxaqueca ( ) Outras_________________________
24- Outras doenças que possa ter tido: ( ) Ca de mama ( ) Ca de ovário ( ) outras
neoplasias_______________ ( ) disfunção tireoidiana ( ) doença autoimune __________________
( ) dislipidemia ( )leiomioma ( ) ovário policístico ( )
E_______S
40
25 - Idade na época do inicio dos sintomas: _______ anos
26- Números de médicos que a assistiram antes do diagnóstico: _______________________________
27- No caso de gravidez, complicações pré-natais: _________________________________________
28 - A senhora faz algum tipo de reposição hormonal?( )sim ( )não Há qto tempo ________________
29- Usou Anticoncepcional?( )não ( ) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não
30 – Usou AINES? ( ) Não ( ) Sim. Houve melhora dos sintomas? ( ) Sim ( ) Não.
31- Diagnóstico da cirurgia: ( ) Endometriose ( ) Sem doença
32-Grau da endometriose: ( )mínima (I); ( )Leve (II); ( )moderada (III); ( ) Severa(IV)
33 - Resultado da patologia comprova endometriose: ( ) Sim ( ) Não
34- Familiares com endometriose: ( ) Não ( ) Sim. quem?_________________________________
35- História familiar de câncer de ovário, mama e/ou linfoma?( ) Sim ( )Não ( ) Outras
36- Aspecto emocional (como você se sente?
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
37- Fumo: ( )sim ( ) não 38– Álcool: ( ) sim ( ) não ( ) 39 – Atividade Física: ( ) sim ( )
não
40– Alimentação: ___________________________________________________________________
41– Amostra de Sangue: ____________ml
41
IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
42
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