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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO
NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS
JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA
BELO HORIZONTE
2019
JULIANA DE FREITAS TEIXEIRA
COMUNIDADES DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM FERRÃO
NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS
BELO HORIZONTE
2019
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do
Título de Mestre em Microbiologia.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do
Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFMG
Teixeira, Juliana de Freitas
COMUNIDADE DE LEVEDURAS ASSOCIADAS A ABELHAS SEM
FERRÃO NA REGIÃO DE MATA SECA EM MINAS GERAIS
[manuscrito] / Juliana de Freitas Teixeira. - 2019.
66 f. : il.
Orientador: Carlos Augusto Rosa.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Minas
Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.
1.Leveduras. 2.Mata seca. 3.Abelhas nativas sem ferrão.
4.Biodiversidade. I.Rosa, Carlos Augusto . II.Universidade Federal
de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III.Título.
i
Dedico este trabalho a minha família,
que está sempre ao meu lado me
apoiando.
ii
“Certa vez alguém disse que emoções são como cavalos selvagens. Elas são
indomáveis, e os sentimentos são como corredeiras de água que você não
controla e não sabe para onde irão levá-lo. Mas, em algum momento, você terá
que lidar com isso. Precisará aprender a enfrentar a vulnerabilidade e a incerteza
que os sentimentos trazem. Ao mesmo tempo em que os sentimentos podem
levá-lo a visitar os calabouços do inconsciente e ativar pavores, desesperos e
angústias que não se podem traduzir em palavras, eles também podem conduzi-lo
a experiências maravilhosas e fazê-lo chorar de alegria e gratidão."
Sri Prem Baba
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por todo seu amor.
Aos meus pais Elaine e Milton e aos meus irmãos Job e Jon, pelo amor, cuidado e apoio
incondicional. À minha avó Geralda de Jesus por todas as orações. À minha tia Kênia
Raydan. À minha prima Alexsana.
À todos os amigos por cada abraço, ajuda e palavra de incentivo, em especial Michele,
Beatriz, Ludmylla, Taísa, Flávia, Gabriela, Glauciane, Diego, Patrícia, Larissa e Túlio.
Ao Prof. Carlos Augusto Rosa pela oportunidade, ensinamentos e suporte.
À minhas amigas e todos os colegas do Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e
Biotecnologia de Fungos. Especialmente à Thelma pelo carinho, amizade, contribuição
e toda atenção durante este processo. À Ana Raquel por toda a ajuda e contribuição
neste trabalho. Agradeço a Elisa, Mayara, Rafaela, Katharina, Flávia, Ana Luíza,
Mariana Anzai, Raquel, Thais e Thamar. Agradeço também a Paula Calaça, sempre
atenciosa e a disposição para me ajudar.
À FAPEMIG pelo apoio a pesquisa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e ao Instituto de Ciências
Biológicas.
À Universidade Federal de Minas Gerais pela acolhida.
iv
RESUMO
O ecótono mata seca, região de transição entre cerrado e caatinga, abriga grande
biodiversidade de espécies de abelhas nativas sem ferrão. Estas abelhas estão
intimamente relacionadas a diversas espécies de leveduras, principalmente dos gêneros
Starmerella e Zygosaccharomyces. No presente trabalho, as comunidades de leveduras
associadas a duas espécies de abelhas nativas sem ferrão, Tetragonisca angustula (jataí)
e Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), e a espécie com ferrão Apis mellifera foram
estudadas em área de mata seca. Três coletas foram realizadas em área de preservação
de mata seca (Janaúba, Minas Gerais), durante a estação chuvosa, no início da estação
seca durante o período de floração das arvores da região, e no auge na estação seca.
Amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e indivíduos adultos foram coletados em
três ninhos de cada espécie de abelha. Durante o período de floração, amostras de flores
de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) foram coletadas por serem a principal fonte de
néctar e pólen para as abelhas na região. As amostras foram processadas e semeadas em
ágar extrato de malte – extrato de levedura (YM). Oitenta e seis isolados de leveduras
foram obtidos das amostras coletadas dos ninhos de T. angustula, 184 isolados a partir
das amostras de Scaptotrigona, 78 isolados das amostras de A. mellifera e 33 isolados a
partir das amostras de flores de Aroeira, totalizando 381 isolados de leveduras.
Cinquenta e três espécies de leveduras foram obtidas, incluindo novas espécies. A
espécie associada com mais frequência à T. angustula foi Starmerella etchellsii;
Candida parapsilosis foi a mais frequente associada à A. mellifera. A possível nova
espécie Zygosaccharomyces sp.1, próxima à Z. mellis, foi a espécie mais frequente
associada à S. cfr. bipunctata. As leveduras do gênero Starmerella foram isoladas em
número elevado, distribuídas entre os substratos e entre as três espécies de abelhas,
indicando endemismo. As comunidades de leveduras estudadas apresentam alto número
de espécies exclusivas, indicando segregação nos locais de forrageio. A identificação
das espécies de leveduras associadas a estes insetos contribui para elucidação do
microbioma das abelhas nativas sem ferrão e sua biodiversidade.
Palavras chave: abelha nativa, abelha sem ferrão, levedura, biodiversidade, microbiota,
mata seca.
v
ABSTRACT
The dry forest ecotone, a transition region between cerrado and caatinga, shelters a great
biodiversity native stingless bee species. These bees are closely related to several
species of yeast, mainly species of the genera Starmerella and Zygosaccharomyces. In
the present study, the yeast communities associated with two species of native stingless
bees, Tetragonisca angustula (jataí) and Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), and the
specie Apis mellifera were studied in a dry forest area. Three collections were carried
out in a dry forest preservation area (Janaúba, Minas Gerais), during the rainy season, at
the beginning of the dry season during the flowering period, and at the peak of the dry
season. Samples of immature honey, mature honey, pollen and adult individuals were
collected in three nests of each species of bee. During the flowering period, samples of
flowers of Myracrodruon urundeuva (Aroeira) were collected for being the main source
of nectar and pollen for bees in the region. The samples were processed and plated on
agar malt extract – yeast extract (YM). Eighty-six yeast isolates were obtained from the
samples collected from nests of T. angustula, 184 isolates from the samples of
Scaptotrigona, 78 isolates from the samples of A. mellifera and 33 isolates from the
flower samples of Aroeira, totaling 381 yeast isolates. Fifty-three yeast species were
obtained, including new species. The most frequent species associated with T. angustula
was Starmerella etchellsii; Candida parapsilosis was the most frequent associated with
A. mellifera. The possible new species Zygosaccharomyces sp.1, next to Z. mellis, was
the most frequent species associated with S. cfr. bipunctata. The yeasts of the genus
Starmerella were isolated in high numbers, distributed among the substrates and among
the three species of bees, indicating endemism. The studied yeast communities present a
high number of exclusive species, indicating segregation in the forage sites. The
identification of yeast species associated with these insects contribute to the elucidation
of the microbioma of native stingless bees and its biodiversity.
Keywords: native bee, stingless bee, yeast, biodiversity, microbiota, dry forest.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie
de abelha eussocial (fonte: Autora) .......................................................................................... 19
Figura 2: Mapa de localização do Município de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais,
Brasil. Construído utilizando software QGIS 3.4.2, dados espaciais obtidos no portal de
mapas do IBGE (https://portaldemapas.ibge.gov.br) ............................................................... 28
Figura 3: As espécies de abelhas Tetragonisca angustula (A, jataí), Scaptotrigona cfr.
bipunctata (B, tubuna) e Apis mellifera (C) (fonte: A, http://www.ib.usp.br/beesp/; B, Paula
de Souza São Thiago Calaça; C, Prof. Dr. Clemens Schlindwein) .......................................... 29
Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr.
Clemens Schlindwein) .............................................................................................................. 30
Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago
Calaça) ...................................................................................................................................... 31
Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça) . 31
Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr.
bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora) ............................ 32
Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa
com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora) .......................................................... 33
Figura 9: Número de isolados de leveduras em relação à cada espécie de abelha estudada (A.
mellifera; S. bipunctata; T. angustula) obtidos nas diferentes datas de coletas (PC, primeira
coleta - 01/04/16; SC, segunda coleta - 09/06/16; TC, terceira coleta - 07/10/16). Os valores
foram expressos como média ± desvio padrão. * p < 0,05 quando comparado o grupo SC com
o grupo TC. Análise de variância de Friedman seguida de pós-teste de Bonferroni................ 39
Figura 10: Diagrama de Venn com o número de espécies de leveduras exclusivas e
compartilhadas entre abelhas adultas (Apis mellifera, T. angustula e S. cfr. bipunctata) e
substratos associados (mel e própolis) ..................................................................................... 40
Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de
abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard ..................................................... 42
vii
Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a
abelhas e substratos relacionados ............................................................................................. 44
Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. A seta indica o esporo dentro da asca
em forma de haltere .................................................................................................................. 53
Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces
sp. 1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios
D1/D2 do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é
mostrada próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2
parâmetros―. A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise
realizada no programa MEGA 7 ............................................................................................... 54
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato ........................ 39
Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às
abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera. ................... 41
Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas
S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera. ........................................................ 42
Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula ............. 46
Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr.
bipunctata. ................................................................................................................................ 49
Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera ............................ 51
Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras ..................................................................... 55
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico
dNTP – Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
g – Grama
GYMP – Caldo glicose, extrato de levedura, malte e peptona
h – Hora
kb – Kilobase
M – Massa molar
mL – Mililitro
mm – Milímetro
mM – Milimolar
min – Minuto
MRS – Ágar de Man, Rogosa e Sharpe
NaCl – Cloreto de sódio
ng – Nanograma
nm – Nanômetro
PCR – Reação em cadeia da polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
pmol – Picomol
rpm – Rotações por minuto
rRNA – RNA ribossomal
SDS – Dodecil sulfato de sódio
TBE – Tampão tris-hidroximetilaminometano, ácido bórico e EDTA
Tris-EDTA – Tampão tris-hidroximetilaminometano e EDTA
Tris-HCl – Tampão tris-hidroximetilaminometano hidrocloreto
U – Unidade
UV – Ultravioleta
V – Volt
X – Multiplicação
x
YM – Ágar extrato de levedura e malte
µg – Micrograma
µL – Microlitro
oC – Grau Celsius
> – Maior
+ – Somatória
% – Porcentagem
xi
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................ iv
ABSTRACT ..................................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... vi
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................. ix
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13
2 JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 15
3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 16
3.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 16
3.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 16
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 17
4.1 Bioma Mata Seca ...................................................................................................... 17
4.2 Abelhas Nativas ........................................................................................................ 18
4.3 Ecologia de leveduras ............................................................................................... 22
4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e as leveduras ............................................. 24
5 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 28
5.1 Coleta das amostras .................................................................................................. 28
5.2 Preservação e identificação morfológica .................................................................. 32
5.3 Extração de DNA...................................................................................................... 33
5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5 .................................... 34
5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4 ................................................................... 35
5.6 Purificação e reação de sequenciamento .................................................................. 35
5.7 Análise das sequências ............................................................................................. 36
5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade ................ 37
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 38
6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico .............................................. 38
6.2 Identificação das leveduras ....................................................................................... 45
6.3 Espécies novas de leveduras ..................................................................................... 52
xii
7 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 57
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 58
13
1 INTRODUÇÃO
A mata seca é uma área transicional de ampla biodiversidade, sendo considerada
um dos ecossistemas brasileiros menos estudados. A mata seca é fortemente ameaçada
pelas atividades humanas como, por exemplo, o desmatamento visando à agricultura e
pecuária extensiva, fragmentando e reduzindo a vegetação nativa causando o
desequilíbrio ecológico da região. Considerada um ecótono, a mata seca é uma região
de transição ambiental entre os biomas cerrado e caatinga, ocorrendo principalmente no
nordeste do Brasil e região do norte do estado de Minas Gerais, abrangendo 1,3% do
território nacional.
Diversas espécies de abelhas sem ferrão são encontradas no ecossistema de Mata
Seca, mas ainda com poucos estudos ecológicos sobre estes insetos. As abelhas nativas
sem ferrão fazem parte da ordem Hymenoptera, da família Apidae e da tribo Meliponini
e estão distribuídas pelo mundo basicamente em regiões tropicais. Estes insetos são
altamente adaptáveis a desafios ecológicos e desempenham grande importância como
polinizadoras, sendo consequentemente essenciais para produção de alimentos em
escala global. Os meliponíneos representam o maior grupo existente de abelhas
altamente eusociais, com mais de 500 espécies descritas, sendo que além dos
meliponíneos, apenas a tribo dos apíneos apresenta abelhas eusociais. Apesar da ampla
distribuição e do grande número de espécies das abelhas sem ferrão, a biologia destes
insetos é consideravelmente pouco estudada se comparada à das abelhas europeias
africanizadas (Apis mellifera) pertencentes à tribo Apini. Além disso, as abelhas se
encontram em crescente declínio, ameaçadas especialmente pela perda de habitat e a
redução de biodiversidade nos ambientes ainda ocupados por elas, em decorrência de
sua dependência de flora nativa como recurso alimentar apícola.
Em vista disto, outro aspecto de grande relevância surge através da associação
íntima das abelhas nativas sem ferrão às leveduras, microrganismos ubíquos e
fermentadores. Durante o forrageamento, as abelhas estocam em seus ninhos uma ampla
variedade de alimentos como néctar e pólen. Estes substratos podem ser fontes de
microrganismos que irão colonizar os alimentos produzidos por estes insetos no interior
das colmeias. Leveduras já foram encontradas em provisões de pólen e mel, e no trato
intestinal de larvas de abelhas adultas. As leveduras podem produzir enzimas que
auxiliam na transformação e enriquecimento nutricional do pólen. Estes substratos
14
servem como alimento para aquisição de nutrientes essenciais durante o processo de
desenvolvimento larval de abelhas sem ferrão.
Ainda há muitos aspectos a serem explorados sobre a relação entre abelhas sem
ferrão e leveduras, incluindo maiores estudos a respeito da biodiversidade e biologia
desses microrganismos. As abelhas nativas sem ferrão auxiliam na sustentação de outras
formas de vida que são essenciais através da polinização, e fornecem produtos de valor
comercial como o mel e o própolis. As interações entre abelhas e leveduras influenciam
intrinsecamente e ativamente a saúde, comportamento, distribuição e reprodução destes
insetos. Portanto, o conhecimento da associação destes microrganismos e abelhas sem
ferrão no bioma de mata seca poderá fornecer novas informações sobre a ecologia desta
interação, e a ocorrência de espécies de leveduras ainda desconhecidas pela ciência.
15
2 JUSTIFICATIVA
Muito pouco é conhecido ainda sobre a associação entre leveduras e abelhas sem
ferrão. As leveduras provavelmente desempenham papel importante na maturação do
pólen e do mel no interior das colmeias. Isto ocorre pela produção de enzimas que
hidrolisam compostos complexos presentes nestes substratos, além de compostos
voláteis que influenciam no desenvolvimento de larvas e pupas. Portanto, o
conhecimento de espécies de leveduras associadas a estes insetos pode gerar novos
dados sobre a ecologia desta associação. Também, estes insetos são fontes de novas
espécies de leveduras, principalmente dos gêneros Starmerella e Zygosaccharomyces.
Estas espécies podem ter relevância em biotecnologia, como na produção de
biosurfactantes e outros polímeros microbianos. Todos estes aspectos levam
consequentemente à valorização e busca pela preservação do bioma mata seca e da
amplitude de espécies nele encontradas, dentre elas, as abordadas neste estudo,
Myracrodruon urundeuva (aroeira), as abelhas nativas sem ferrão Tetragonisca
angustula e Scaptotrigona cfr. bipunctata, e as leveduras associadas a este bioma.
16
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Descrever as comunidades de leveduras associadas a duas abelhas sem ferrão, a
Apis mellifera e a flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) em uma região de mata
seca no norte do estado de Minas Gerais.
3.2 Objetivos específicos
• Isolar colônias de leveduras presentes em mel imaturo, mel maduro, pólen,
flores (Myracrodruon urundeuva) e associadas ao corpo de abelhas adultas dos
ninhos das espécies Apis mellifera, Tetragonisca angustula e Scaptotrigona cfr.
bipunctata.
• Identificar por métodos moleculares as espécies isoladas de leveduras.
• Descrever novas espécies de leveduras.
• Comparar as comunidades de leveduras isoladas dos diferentes
substratos de acordo com a estação do ano.
17
4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Bioma Mata Seca
A mata seca representa 42% da cobertura florestal global, e é considerada como
área de floresta tropical transicional. No Brasil, a mata seca se encontra entre regiões de
cerrado e caatinga, com temperaturas anuais acima de 17º C, com média >25º C,
precipitação anual em torno de 1.800 mm, e um período de 3 a 6 meses com menos de
100 mm por mês (MURPHY & LUGO, 1986; CAETANO et al., 2008; PORTILLO-
QUINTERO & SÁNCHEZ-AZOFEIFA, 2010; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). A mata
seca é uma região que enfrenta vários meses de aridez e períodos de distribuição de
chuva com sazonalidade bem demarcada (MILES et al., 2006), possui vegetação
predominantemente decídua e durante a seca pode ocorrer perda de até 50% da
cobertura arbórea (MURPHY & LUGO, 1986; ARRUDA et al., 2011).
A região norte do estado de Minas Gerais, que faz parte do polígono das secas,
apresenta áreas de mata seca nos pontos transicionais entre cerrado e caatinga
(ARRUDA et al., 2011). A fisionomia deste ecossistema apresenta árvores emergentes
atingindo 30 m de altura, sendo que em afloramentos rochosos podem ser encontradas
árvores com dossel superior de 6 m a 15 m. Dentre as espécies que compõem o estrato
arbóreo estão Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão), Anadenanthera colubrina
(angico-vermelho), Astronium fraxinifolium (gonçalo-alves), Dilodendron bipinnatum
(mulher-pobre, mamoninha), Sterculia striata (chichá), Amburana cearensis
(amburana), Schinopsis brasiliensis (pau-preto), Cavanillesia arborea (imbaré),
Commiphora leptophloeos (amburaninha), Goniorrhachis marginata (itapicuru), entre
outras. Também podem ser observadas cactáceas e bromeliáceas terrestres (OLIVEIRA-
FILHO, 2006).
O clima e o solo fértil favoreceram a ocupação populacional em áreas de mata
seca, levando ao desmatamento e acelerada degradação devido a cultivos intensivos
como cana de açúcar e soja, e pela conversão em pasto para pecuária (BLACKIE et al.,
2014; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). Outro aspecto relevante é o valor econômico do
corte de madeira, geralmente explorado pela população local, podendo resultar em
significativo impacto ambiental se o recurso não for acessado de maneira sustentável
(MURPHY & LUGO, 1986; MCLAREN et al., 2005).
No âmbito das regiões florestais que se encontram em situação de
vulnerabilidade, a mata seca foi identificada como um dos biomas mais ameaçados no
18
mundo, apesar de sua riqueza de espécies (PORTILLO-QUINTERO & SÁNCHEZ-
AZOFEIFA, 2010; GILLESPIE et al., 2012; FERNANDEZ & DIAZ, 2016). O
desequilíbrio ecológico e a perda de biodiversidade causam impactos econômicos e
sociais. As espécies endêmicas, por exemplo, são responsáveis pela polinização de
plantações que são fontes de abastecimento alimentar, e de coberturas florestais que
garantem a captação e renovação de recursos hídricos além do armazenamento de
carbono (HOEKSTRA et al., 2005).
Mundialmente a área total de floresta tropical de mata seca remanescente é
estimada em 1.048.700 km2, sendo que 97% desta área encontra-se ameaçada e 54,2%
está localizada na América do Sul (MILES et al., 2006). Algumas das principais
ameaças que levam ao risco de perda florestal são a extinção de espécies, a disfunção
ecológica e o decréscimo de biodiversidade, estas ameaças comprometem a conservação
de um ecossistema e dentre seus causadores estão o aumento da densidade populacional
humana, as mudanças climáticas, queimadas, a fragmentação de habitat e degradação, a
invasão de espécies não nativas, e a conversão de terras para atividade agropecuária
(HOEKSTRA et al., 2005; MILES et al., 2006; GILLESPIE et al., 2012; RODRIGUES
et al., 2015; NOTARO et al., 2018).
Os ecossistemas sustentam diversas interações ecológicas e proporcionam
pressões evolucionárias que mantém a biodiversidade, permitem a evolução de novas
espécies e geram características utilitárias que beneficiam os seres humanos
(HOEKSTRA et al., 2005). A mata seca apresenta grande biodiversidade e a maioria
das ameaças a este ecossistema resulta da atividade humana, são necessárias decisões
que colocam estas áreas como alvo de alta prioridade de conservação e pesquisa.
Portanto iniciativas de proteção e manejo de fragmentos florestais deste tipo de
ecossistema são imprescindíveis (MILES et al., 2006; ARRUDA et al., 2011;
FERNANDEZ & DIAZ, 2016; PRIETO-TORRES et al., 2016).
4.2 Abelhas Nativas
As abelhas sem ferrão (Hymenoptera: Apidae: Meliponini) compreendem o
maior grupo de abelhas eussociais do planeta, incluindo mais de 500 espécies descritas,
distribuídas pelas regiões Neotropicais (América tropical, África, sudeste da Ásia e
Austrália) (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). O território brasileiro abriga diversos
19
gêneros e espécies de abelhas nativas sem ferrão, sendo, 244 espécies válidas e 89 ainda
não descritas, pertencentes a 29 gêneros diferentes. Estes insetos não somente exercem
grande importância socioeconômica em relação à população humana, como também
interferem diretamente na estruturação ecológica dos ecossistemas em que estão
inseridos (PEDRO, 2014).
As abelhas eussociais se estabelecem em ninhos (figura 1) que apresentam alta
complexidade em sua estrutura e funcionamento, possuindo adultos de duas gerações,
trabalho cooperativo, divisões de classes e manutenção de células de alimento e criação
(HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). Os indivíduos adultos fazem a maior parte ou
todo o forrageamento para obtenção de alimento, enquanto a rainha acasala e faz a
oviposição. A rainha normalmente apresenta maior tamanho corporal que as abelhas
operárias, e sua diferenciação na fase larval se da pela quantidade muito maior de
alimento disponibilizada para a rainha (MICHENER, 2007; LUNA-LUCENA,
RABICO & SIMOES, 2019). As abelhas operárias forrageadoras são generalistas, ou
seja, visitam uma grande diversidade floral coletando néctar e pólen (RAMALHO,
1990).
Figura 1: Ninho da abelha nativa sem ferrão Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), espécie de
abelha eussocial (fonte: Autora).
20
As colônias de abelhas sem ferrão são perenes e resistem a longos períodos de
adversidades pelo consumo de alimento estocado nos ninhos (potes contendo mel e
pólen) (MICHENER, 1969; WILLE, 1983). A nidificação ocorre normalmente em
buracos pré-existentes como, cavidades subterrâneas e arbóreas, associada a outros
insetos como formigas, cupins e vespas, e ainda pode haver ninhos expostos
(SAKAGAMI & ZUCCHI, 1967; HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016). A entrada dos
ninhos é construída utilizando cera e resina, geralmente no formato de um tubo
estendido permitindo a passagem de apenas um indivíduo por vez, tanto para entrada
quanto saída, o que confere mais segurança para os ninhos (WILLE, 1983; ROUBIK,
2006).
As abelhas sem ferrão são importantes propagadoras da polinização de diversas
plantas cultivadas, devido a influencia positiva direta no rendimento e na qualidade das
plantações. Estas estão sendo cada vez mais utilizadas por serviços de polinização
comercial, além disso, forrageiam efetivamente em ambientes fechados o que mostra
seu potencial para polinização em estufas. Alguns exemplos de cultivo são morango,
abacate, pepino, cupuaçu e tomate (SLAA et al., 2006).
O mel dos meliponíneos possui atividade antioxidante e alta quantidade de
compostos fenólicos, apresenta bastante variabilidade em sua composição física e
química dependendo da espécie da abelha, da florada predominante, das condições
climáticas e da origem geográfica (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016). Apesar
dessa variação, o mel normalmente contém açúcares como frutose e glicose, que
compreendem até 95% de sua composição, ácidos orgânicos, ácidos fenólicos (ex.
cafeico, elágico, ferúlico e p-cumárico), flavonóides (ex. apigenina, crisina, galanina,
quercetina, pinocembrina), antioxidantes (ex. ácido ascórbico, superóxido dismutase,
catalase, glutationa reduzida), proteínas, aminoácidos, enzimas, vitaminas (ex. ácido
fólico, riboflavina, biotina, cianocobalamina) e minerais. Cada componente possui
funções nutricionais e medicinais (PATRICIA et al., 2015; RAO et al., 2016).
O mel produzido pelas abelhas sem ferrão é diferenciado em relação ao
produzido por apíneos, em aspectos fisicoquímicos como cor, sabor e viscosidade,
fluido e adocicado com um toque de acidez, sendo mais valorizado economicamente,
porém necessita de maiores estudos para caracterização e definição de padrões de
qualidade (BILUCA et al., 2016; RAO et al., 2016; ÁVILA et al., 2018; COSTA et al.,
21
2018). Este mel também apresenta propriedades biológicas anti-inflamatória,
antimicrobiana, antiviral e anticancerígena (OTHMAN, 2012; RAO et al., 2016);
diminui o risco de acidente cardiovascular (AL-WAILI, 2004); reduz o stress oxidativo
do cérebro; e aumenta as concentrações de acetilcolina e fator neurotrófico (OTHMAN
et al., 2015). Ainda auxilia na cicatrização de feridas através do aumento da viabilidade
celular e proliferação de fibroblastos dérmicos (NORDIN et al., 2018). Estudos indicam
que o mel produzido pela abelha sem ferrão Tetragonisca angustula possui atividade
antimicrobiana contra bactérias patogênicas como Staphylococcus aureus (MIORIN et
al., 2003), Bacilus cereus, Pseudomonas aeruginosa, e contra leveduras como Candida
albicans e Saccharomyces cerevisiae (DEMERA & ANGERT, 2004; TORRES et al.,
2018), além de ótima capacidade antioxidante (RAO et al., 2016). A produção de mel
por abelhas sem ferrão ainda é pouco explorada, sua valorização pode estimular o
crescimento socioeconômico de comunidades rurais e ao mesmo tempo ser uma via para
atividades educacionais de conservação, criando a possibilidade da implantação de
fontes de renda sustentável e manutenção de abelhas para polinização de plantas
(MUSTAFA, YAACOB & SULAIMAN, 2018).
A domesticação das abelhas pelo ser humano enraizou-se de maneira cultural e
econômica em nossa sociedade, levando à criação destes insetos também conhecida
como apicultura ou meliponicultura para os meliponíneos, a criação de abelhas sem
ferrão data de períodos remotos em nossa história (QUEZADA-EUÁN et al., 2018). Na
América tropical há registros de uma relação desenvolvida durante milênios entre
comunidades indígenas e abelhas. O mel das abelhas sem ferrão era tradicionalmente
utilizado em trocas de valor econômico. Na medicina e em cerimônias, nas sociedades
Maias pré-colombianas constituíam inclusive parte importante da mitologia. Porém com
o processo de colonização europeu no século XVI, tribos indígenas foram extintas e
grandes áreas florestais desmatadas para ocupação e agricultura. Este último fato afetou
profundamente os processos de nidificação, forrageamento e reprodução de diversas
espécies de abelhas (HRNCIR, JARAU & BARTH, 2016; QUEZADA-EUÁN et al.,
2018).
Desde a antiguidade as abelhas fornecem alimento e outros produtos para o
homem, e é de grande importância reavivar e manter a herança cultural milenar dessa
relação com as abelhas sem ferrão, e com isso auxiliar na valorização do uso sustentável
22
de seus produtos. O reconhecimento de sua função essencial na manutenção e
conservação de ecossistemas é fundamental (QUEZADA-EUÁN et al., 2018).
4.3 Ecologia de leveduras
As leveduras são fungos ubíquos e geralmente unicelulares, que se reproduzem
predominantemente de forma assexuada por brotamento ou fissão binária, podem
apresentar formas sexuadas, porém, não desenvolvem corpos frutificantes como os
fungos filamentosos. As espécies de leveduras estão distribuídas em dois filos do reino
Fungi, Basidiomycota e Ascomycota (KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011a).
As leveduras são consideradas modelo biológico de estudo laboratorial, células
eucarióticas de fácil e segura manipulação além de rápida reprodução, apresentam curto
tempo entre gerações e genomas de pequeno tamanho, sendo muito interessantes para
manipulação genética e estudos evolucionários (BORNEMAN & PRETORIUS, 2014).
A espécie mais empregada com este propósito é Saccharomyces cerevisiae, utilizada em
experimentos há mais de um século, e em 1996, o primeiro organismo eucariótico a ter
seu genoma completamente sequenciado (GOFFEAU et al., 1996; LITI, 2015). O
histórico de pesquisas sobre leveduras se inicia ao final do século XVIII, em 1789 com
estudos da fermentação alcoólica por Lavoisier (BARNETT, 1998). Este fenômeno é
uma das características metabólicas de maior destaque das leveduras, e já era observado
a 7000 anos a.C. nas regiões da Mesopotâmia e Cáucaso. Nesta época, a humanidade
teve os primeiros contatos com a fermentação espontânea de acordo com registros
arqueológicos, e passou a produzir e preservar uma diversidade de alimentos, dentre
eles pão, queijos, cerveja, vinho e outras bebidas alcoólicas (PRETORIUS, 2000). A
utilização milenar de leveduras na fermentação em ambientes antrópicos levou a
exposição destes microrganismos a diferentes fatores de pressão seletiva resultando em
adaptações genéticas, o que foi chamado de processo de domesticação (SICARD &
LEGRAS, 2011; LITI, 2015).
Entretanto, o interesse no estudo sobre as leveduras em seu ambiente natural,
tanto de espécies selvagens quanto associadas a atividades humanas se inicia
principalmente na década de 1950 (LITI, 2015). As leveduras estão distribuídas em
todos os biomas do mundo e nos ambientes naturais podem assumir diversas funções.
São essencialmente decompositoras, colonizam substratos ricos em nutrientes e são
23
seguidas por uma variedade de outros microrganismos completando a degradação da
matéria orgânica. Além disso, como parte de um ecossistema, interagem com os
organismos que o compõem em relações de mutualismo, competição, parasitismo e
patogenicidade (STARMER & LACHANCE, 2011). Em situações onde há escassez de
nutrientes as leveduras podem formar esporos, que são estruturas de resistência capazes
de sobreviver mais tempo que as células vegetativas. Em circunstâncias extremas, como
altas ou baixíssimas temperaturas e seca, os esporos persistem até que haja novamente
condições de desenvolvimento favoráveis (LITI, 2015).
Leveduras ascomicéticas como S. cerevisiae podem formar esporos chamados
ascósporos contidos em ascas, enquanto em ambiente rico em nutrientes células
diploides se reproduzem por divisão mitótica. Porém quando há baixa de nutrientes, as
células diploides entram em meiose produzindo esporos haploides com, geralmente,
dois (a e α) tipos reprodutivos diferentes (mating types) (VAUGHAN-MARTINI &
MARTINI, 2011; BOYNTON & GREIG, 2014). Quando as condições favoráveis ao
desenvolvimento retornam, os esporos germinam em células viáveis haploides, que
podem se reproduzir mitoticamente (KNOP, 2006; BOYNTON & GREIG, 2014; LITI,
2015). O cruzamento entre indivíduos não relacionados pode ocorrer entre espécies
próximas de leveduras diferentes, levando à formação de híbridos, como por exemplo,
S. pastorianus, que é um híbrido do cruzamento entre S. cerevisiae e S. eubayanus,
amplamente utilizada na indústria cervejeira para produção de cerveja larger (LIBKIND
et al., 2011).
A diversidade dos habitats naturais de leveduras e sua ubiquidade é
consequência da capacidade desses microrganismos de assimilar nutrientes, como
carbono e nitrogênio, a partir de uma enorme variedade de fontes, além do fato de
tolerarem uma ampla variação na escala de pH, altas pressões osmóticas e salinidade,
dessecação e altos índices de radiação UV. As leveduras podem se tornar especializadas
em apenas um nicho e apresentar características fisiológicas próprias para aquele
ambiente (STARMER & LACHANCE, 2011).
As interações com os ambientes naturais e entre espécies no mesmo habitat
levam ao desenvolvimento de características adaptativas, convergências fenotípicas e o
estabelecimento de estratégias de sobrevivência (LITI et al., 2009). A temperatura pode
influenciar diretamente na velocidade de crescimento. A disponibilidade de recursos
24
pode determinar a formação ou não de esporos. Ao longo de um dia ocorrem alterações
de luz, umidade, temperatura, incidência de ventos, a chamada variação circadiana, este
aspecto ambiental permite que duas espécies ou mais se desenvolvam em simpatria; ou
seja, que se desenvolvam no mesmo habitat com, por exemplo, as espécies mais
adaptadas a altas temperaturas ou termotolerantes apresentando melhor atividade nos
períodos mais quentes do dia; as espécies criotolerantes, que se desenvolvem melhor a
temperaturas mais baixas, apresentando um desempenho superior nos períodos mais
frios (SAMPAIO & GONÇALVES, 2008; SALVADÓ et al., 2011).
Em resumo, leveduras como seres ubíquos estão amplamente dispersas, podem
ocorrer nos principais ambientes bióticos e abióticos, como solo, água, na atmosfera, em
plantas, animais e insetos. Em certos momentos alguns destes habitats são apenas
transitórios; ventos podem atuar na dispersão destes microrganismos, tal qual, o
carreamento na superfície de um inseto, ou o decaimento de uma fruta ao solo. Além
disto, a migração humana também contribui para a dispersão destes microrganismos,
como ocorreu no caso das leveduras fermentadoras de bebidas alcoólicas (BARBOSA
et al., 2018). Leveduras que se especializaram no crescimento e reprodução em
determinado habitat podem persistir, por exemplo, produzindo esporos, até surgir a
oportunidade de retornarem ao seu reservatório ideal (STARMER & LACHANCE,
2011).
Com o advento das análises biomoleculares, a ferramenta de genômica
populacional, assim como, o estudo de diferentes biomas ao redor do globo, tem
auxiliado na construção da história natural das linhagens de leveduras, suas adaptações
genotípicas e fenotípicas. Isto tem possibilitado o aperfeiçoamento do conhecimento
biológico a respeito dessas espécies de microrganismos, colaborando para melhor
compreensão dos fatores seletivos aos quais são expostas durante seus ciclos de vida,
suas interações ambientais e seu processo evolucionário (LITI, 2015; BARBOSA et al.,
2018).
4.4 A relação entre abelhas, seus produtos e leveduras
A associação entre abelhas sem ferrão e comunidades microbianas vem sendo
mostrada em diversos estudos. Leveduras já foram encontradas no corpo de abelhas
25
adultas, em larvas, provisões larvais e pupas (ROSA et al., 2003). Microrganismos
podem colonizar diversas partes no corpo de um inseto, que representam habitat
diferentes, alguns exemplos são o exoesqueleto e o lúmen intestinal. A composição e
abundância desta microbiota são determinadas por condições físico-químicas e o
sistema imune do inseto, além das interações entre os microrganismos naquele habitat
(DOUGLAS, 2015). Uma vez que a relação é estabelecida pode haver variados tipos de
interações, desde neutra (0/0), passando por mutualística que é positiva para ambos
(+/+), comensal (+/0), amensal (-/0) e até o parasitismo onde um participante é lesado e
o outro beneficiado (-/+) (STARMER & LACHANCE, 2011; STEFANINI, 2018).
Normalmente a relação é benéfica, onde a levedura oferece nutrientes essenciais ao
inseto e este atua como veículo de dispersão das células fúngicas. Observa-se ainda a
interação entre leveduras e plantas, ricas em compostos orgânicos e umidade,
estabelecendo a tríade inseto-levedura-planta (STARMER & LACHANCE, 2011).
Leveduras foram encontradas no intestino de Apis mellifera com a dominância
de espécies variando de acordo com a posição social do hospedeiro, o intestino de
abelhas operárias apresentou maior dominância do gênero Saccharomyces, enquanto o
de forrageiras e rainhas apresentou maior dominância pelo gênero Zygosaccharomyces
(YUN et al., 2018). O gênero Zygosaccharomyces também foi encontrado em relação de
simbiose mutualística com larvas da espécie de abelha sem ferrão Scaptotrigona depilis.
As larvas desta abelha necessitam consumir a levedura para seu desenvolvimento, em
ordem de ingerir precursores esteroidais essenciais para o processo de formação de
pupas. Estes esteróis não são produzidos pelas abelhas, e sim pelas leveduras
(PALUDO et al., 2018).
A levedura Starmerella meliponinorum foi isolada de abelhas adultas das
espécies nativas sem ferrão Tetragonisca angustula e Melipona quadrifasciata,
Starmerella etchellsii foi encontrada associada somente à T. angustula. As espécies de
leveduras Starmerella apicola, Debaryomyces hansenii e Zygosaccharomyces sp. foram
encontradas em associação à abelhas adultas de M. quadrifasciata (ROSA et al., 2003).
Além disso, S. meliponinorum foi identificada em amostras de pão de abelha, uma
mistura de mel e polén que serve de alimento para as abelhas operárias, e também no
mel, no pólen, em ―pellets‖ de refugo e própolis da abelha T. angustula (ROSA et al.,
2003; TEIXEIRA et al., 2003; STEFANINI, 2018). Leveduras ascomicéticas foram
similarmente obtidas de amostras de himenópteros da tribo Bombini, do gênero Bombus
26
sp., mais conhecidas como abelhas mamangava, onde foram identificadas leveduras dos
clados Metschnikowia e Starmerella, e dos gêneros Debaryomyces e
Zygosaccharomyces nos potes de mel, no trato digestivo das abelhas, na superfície do
corpo das operárias, e no néctar das flores de Helleborus foetidus visitadas pelas abelhas
(BRYSCH-HERZBERG, 2004). As visitas florais por estas abelhas influenciam
diretamente a frequência e abundância de leveduras no néctar (HERRERA et al., 2009).
O comportamento de visitação de flores pelas abelhas depende de diferentes aspectos
como a composição do néctar, que apresenta altas concentrações de açúcares. O néctar é
a fonte primária de carboidratos para as abelhas, possui aminoácidos e compostos
voláteis, responsáveis por atrair insetos polinizadores. Quanto mais atrativas as
características da composição do néctar, maior a probabilidade de visitação e de células
de leveduras serem inoculadas após a abertura da corola da flor (GILLIAM, 1979;
BRYSCH-HERZBERG, 2004; GONZÁLEZ-TEUBER & HEIL, 2009; HEIL, 2011).
O pólen coletado pelas abelhas sem ferrão é acumulado nas corbículas, parte da
tíbia posterior da abelha que serve como um ―cesto‖, e armazenado posteriormente no
ninho em potes de cerúmen, formando um agregado constituído por diversos pólens
florais com composições diferentes, resquícios de néctar e enzimas salivares das
abelhas. Este é um alimento nutritivo, fonte de proteínas, lipídeos, vitaminas e minerais
para estes insetos (GILLIAM, 1979; LINS et al., 2003). No pólen também são
encontradas espécies de leveduras como S. neotropicalis e S. meliponinorum,
respectivamente em ninhos de Melipona quinquefasciata e T. angustula (ROSA et al.,
2003; TEIXEIRA et al., 2003; DANIEL et al., 2013). Estas leveduras podem fermentar
o pólen após estocado (MENEZES et al., 2013).
O mel por sua vez, apresenta propriedades físico-químicas que usualmente
impedem o crescimento de microrganismos, como baixa atividade de água, baixo pH e
alta concentração de açúcares. Acredita-se que as abelhas sejam responsáveis pela
inoculação das leveduras que se encontram presentes no mel. Geralmente, estas são
resistentes às condições de estresse deste substrato (ESTEVINHO et al., 2012;
RÓZAŃSKA & OSEK, 2012). O mel é armazenado pelas abelhas sem ferrão em potes
de cerúmen. Estes potes são preenchidos com o néctar coletado das flores que após o
armazenamento passa por transformações, onde a maior parte da água evapora. As
leveduras e bactérias presentes iniciam um processo de fermentação, e enzimas das
glândulas salivares das abelhas operárias, como amilases e invertases, são secretadas
27
quebrando as moléculas de sacarose do néctar em glicose e frutose (VENTURIERI et
al., 2007; MENEZES et al., 2013). Espécies dos gêneros Metschnikowia, Starmerella e
Zygosaccharomyces são recorrentemente observados no mel de abelhas sem ferrão
(ROSA et al., 2003; TEIXEIRA et al., 2003; SEIJO, ESCUREDO & FERNÁNDEZ-
GONZÁLEZ, 2011; SAKSINCHAI et al., 2012).
Maiores conhecimentos sobre qual a função das leveduras em sua associação
com as abelhas são necessários. Os microrganismos podem contribuir na nutrição das
abelhas, provendo nutrientes ou quebrando moléculas que o inseto é incapaz de digerir,
preservando alimentos na colônia e protegendo o inseto contra microrganismos
patogênicos, produzindo toxinas contra o patógeno e modulando o sistema imune do
inseto (MENEZES et al., 2013; DOUGLAS, 2015; STEFANINI, 2018). Em benefício
das leveduras, os insetos atuam como vetores de dispersão, influenciando na
biodiversidade das populações de leveduras no meio ambiente (STEFANINI, 2018).
Portanto, o estudo de leveduras associadas a abelhas e flores de um ecossistema de Mata
Seca poderá fornecer novas informações sobre a associação entre estes organismos,
além de possibilitar a descoberta de novas espécies destes fungos novas para a ciência.
28
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Coleta das amostras
Foram realizadas três coletas na cidade de Janaúba, norte do estado de Minas
Gerais (figura 2), com suporte e colaboração da equipe do Serviço de Recursos Vegetais
e Opoterápicos da Fundação Ezequiel Dias. As coletas foram realizadas em área de
preservação de mata seca em 2016 nas respectivas datas: 01/04, durante a estação
chuvosa; 09/06, no início da estação seca durante o período de floração; e 07/10 no auge
na estação seca.
Figura 2: Mapa de localização do Município de Janaúba, norte do estado de Minas Gerais,
Brasil. Construído utilizando software QGIS 3.4.2, dados espaciais obtidos no portal de mapas
do IBGE (https://portaldemapas.ibge.gov.br).
Foram analisadas três espécies (figura 3) Tetragonisca angustula (jataí),
Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna) e Apis mellifera (ninhos em apiário próximo à
área preservada de mata seca). As coletas de cada substrato analisado foram feitas em
triplicata: mel imaturo, mel maduro, pólen, alimento larval. Foi considerado mel
29
imaturo aquele depositado em potes ainda abertos e, mel maduro aquele depositado em
potes fechados. No total foram coletados dos ninhos 40 indivíduos adultos de T.
angustula, 55 de S. cfr. bipunctata e 35 de A. mellifera. Em relação ao mel imaturo
foram coletadas 4 amostras dos ninhos de T. angustula, 16 amostras de S. cfr.
bipunctata e 21 de A. mellifera. A amostragem de mel maduro foi 15 de T. angustula,
26 de S. cfr. bipunctata e 21 de A. mellifera. Em relação ao pólen foram coletadas 6
amostras dos ninhos de T. angustula, 33 dos ninhos de S. cfr. bipunctata e 18 de A.
mellifera.
Figura 3: As espécies de abelhas Tetragonisca angustula (A, jataí), Scaptotrigona cfr.
bipunctata (B, tubuna) e Apis mellifera (C) (fonte: A, http://www.ib.usp.br/beesp/; B, Paula de
Souza São Thiago Calaça; C, Prof. Dr. Clemens Schlindwein).
No período de floração em junho foram coletadas treze amostras de flores
(figura 4), de quatro indivíduos masculinos e um feminino de Myracrodruon urundeuva
(Aroeira). As flores de Aroeira são o principal recurso alimentar utilizado pelas abelhas
na área.
30
Figura 4: Coleta de amostras de flores de Myracrodruon urundeuva (Aroeira) (fonte: Prof. Dr.
Clemens Schlindwein).
As amostras de mel imaturo e maduro foram coletadas com o auxílio de
micropipetador (figura 5), e as de pólen foram coletadas diretamente dos potes de
alimento com alça estéril (figura 6). Alíquotas de 0,1 mL de mel e 0,1 g de pólen foram
diluídas em 0,9 mL água peptonada 0,1%. Um mililitro da diluição decimal 10-1
de cada
amostra foi semeado, em duplicata, em placas contendo ágar extrato de levedura e malte
(YM – ágar 2%, peptona 1%, glicose 2%, extrato de malte 0.3%, extrato de levedura
0.3% e cloranfenicol 100 mg%), pelo método pour plate, as colônias foram contadas e
foi calculado o número de unidades formadoras de colônia (UFC).
31
Figura 5: Coleta de mel com o auxílio de micropipetador (fonte: Paula de Souza São Thiago
Calaça).
Figura 6: Coleta de pólen utilizando alça estéril (fonte: Paula de Souza São Thiago Calaça).
Além disso, foram coletados cinco indivíduos adultos de cada espécie, colocados
para caminhar por até 15 minutos em placas de ágar YM (figura 7), sendo liberados
após esse período. Este procedimento visou o isolamento de leveduras presentes no
corpo das abelhas ou de fezes liberadas por estas. As placas de YM foram incubadas por
até sete dias em estufa a 25º C. As amostras de flores foram inoculadas em meio líquido
contendo 50% de glicose e em caldo YM, cinco flores para cada tubo. Os tubos foram
incubados em shaker a 200 rpm e 25º C por cinco dias até turvação do meio pelo
crescimento das leveduras. A partir dos tubos com crescimento, 100 µL de diluições
decimais apropriadas foram semeadas em placas de ágar YM para o isolamento das
leveduras. Estas placas foram incubadas em estufa a 25º C (KURTZMAN et al., 2011).
32
Figura 7: Indivíduos adultos das espécies Tetragonisca angustula (A), Scaptotrigona cfr.
bipunctata (B) e Apis mellifera (C) em placas de ágar YM (fonte: Autora).
5.2 Preservação e identificação morfológica
Após o período de incubação, as colônias foram contadas e descritas
morfologicamente de acordo com a cor, tamanho, textura, borda, formato e foram
agrupadas. Cada morfotipo foi contado, isolado (figura 8 B), purificado (figura 8 C) e
posteriormente inoculado em 2 mL de caldo GYMP. Após o crescimento, foi
acrescentado 200 µL de glicerol para criopreservação das leveduras em freezer a -80º C
(KURTZMAN et al., 2011).
33
Figura 8: Placa inoculada em campo (A), placa com colônias de levedura isoladas (B), placa
com colônia de levedura purificada (C) (fonte: Autora).
5.3 Extração de DNA
Para a extração de DNA, as leveduras foram inoculadas em ágar YM, e
incubadas em estufa a 25º C por 24 h. Após o crescimento, uma alçada de cada colônia
foi adicionada em tubos com 100 µL de tampão de lise (Tris-HCl pH 8, EDTA pH 8,
NaCl e SDS) para rompimento da parede e membrana celular. Os tubos foram agitados
em vortex e incubados em banho seco a 65º C por 30 min. Após este período, 200 µL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, solvente orgânico para desnaturar as proteínas e
purificar o DNA) foi adicionado a cada tubo, homogeneizado manualmente, e
centrifugado à 14000 rpm por 15 min. Após,70 µL do sobrenadante de cada amostra foi
transferido para um novo tubo. Em seguida, adicionou-se 70 µL de isopropanol, e os
tubos foram homogeneizados por inversão, e incubados à temperatura ambiente por 15
min para precipitação do DNA. Após, as amostras foram centrifugadas 14000 rpm por
34
10 min. O sobrenadante foi descartado por inversão e acrescentou-se 200 µL de etanol
gelado em cada microtubo. Estes foram homogeneizados por inversão e centrifugados a
14000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi descartado e esse procedimento foi realizado
mais uma vez para remoção de resíduos de sais. As amostras foram incubadas em estufa
à 37º C para secagem ou mantidas em temperatura ambiente overnight. O pellet
formado no fundo do microtubo foi resuspendido em 50 µL de tampão TE (Tris-EDTA
0,1 M, pH 8) para hidratação e as amostras foram incubadas em estufa à 37º C por 1 h.
O DNA total obtido foi dosado utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000
(NanoDrop Technologies). Ao final, o DNA foi diluído para atingir a concentração de
aproximadamente 200 ng/µL e armazenado a -20º C.
5.4 Agrupamento por PCR fingerprinting com iniciador GTG5
As linhagens de leveduras com características morfológicas similares foram
agrupadas utilizando a técnica de PCR fingerprinting, com o iniciador GTG 5 (5’ -
GTGGTGGTGGTGGTG - 3’), que permite agrupar os isolados de acordo com seus
perfis moleculares. Cada reação realizada continha: 16,8 µL de água deionizada estéril,
2,5 µL de tampão de PCR 5X (Thermo), 1,5 µL de MgCl2 25mM (Thermo), 1,0 µL de
dNTP 10 pmol, 2,0 µL do iniciador GTG5 10 pmol (Invitrogen), 0,2 µL de Taq DNA
polimerase 5U/µL (Sinapse) e 1 µL de DNA, totalizando volume final de 25 µL. Um
tubo denominado branco contendo todos os reagentes exceto DNA foi preparado, e
utilizado como controle de possíveis contaminações do processo de PCR. O ciclo básico
de amplificação utilizado para reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a
94°C por 2 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 93°C por 45 segundos, anelamento a
50°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto; um ciclo de extensão final a 72º C
por 6 minutos. Por fim, os produtos da amplificação foram visualizados por eletroforese
em gel de agarose 1,5%, eluidos por 2 h à 80 V em tampão TBE 0,5X (Tris-base 0,045
M; Ácido bórico 0,045 M; EDTA 0,001 M, pH 8,0). Foram aplicados nos géis 3 µL de
solução Gel Red (Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 5 µL do produto da reação
de PCR, após a corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta
(WHILE et al., 1990).
35
5.5 PCR utilizando iniciadores ITS1 e NL4
Os representantes de cada agrupamento molecular obtido foram submetidos à
PCR utilizando os iniciadores ITS1 e NL4, que amplificam as regiões ITS1/ITS2
(espaçadores transcritos internos) e os domínios D1/D2 da subunidade maior (26S) do
gene do RNA ribossomal (rRNA) (KURTZMAN & ROBNETT, 1998; FELL et al.,
2000; KURTZMAN, FELL & BOEKHOUT, 2011). Cada reação de PCR, totalizando
volume de 50 µL, continha: 32,8 µL de água deionizada estéril, 5,0 µL de tampão de
PCR 5X (Sinapse), 3,0 µL de MgCl2 25mM (Sinapse), 2,0 µL de dNTP 10 pmol, 1,0 µL
do iniciador ITS1 10 pmol (Invitrogen), 1,0 µL do iniciador NL4 10 pmol (Invitrogen),
2,0 µL de betaína, 1,0 µL de DMSO, 0,2 µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Sinapse)
e 2 µL de DNA. Foi preparado também um branco da reação contendo todos os
reagentes exceto DNA. O ciclo básico de amplificação utilizado no termociclador para
reação de PCR foi: um ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 35 ciclos de
desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento a 54°C por 25 segundos e extensão a
72°C por 20 segundos; um ciclo de extensão final a 72°C por 10 minutos. Os amplicons
foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1%, eluidos por 20 min à
120 V em tampão TBE 0,5X, foi aplicado ao gel de agarose 3 µL de solução Gel Red
(Biotium) + Tampão na proporção de 1:1 e 1 µL do produto da reação de PCR, após a
corrida as bandas moleculares foram visualizadas sob luz ultravioleta (WHILE et al.,
1990).
5.6 Purificação e reação de sequenciamento
Os amplicons obtidos através da reação de PCR utilizando os iniciadores
ITS1/NL4 foram submetidos a um processo de purificação para serem enviados ao
sequenciamento. Foram adicionados a cada produto de PCR, 11,75 µL de EDTA a 125
Mm e 141,0 µL de etanol absoluto. As amostras foram homogeneizadas por inversão, e
mantidas em repouso por 15 min em temperatura ambiente para precipitação do DNA.
Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm por 25 min, retirou-se o
sobrenadante por inversão, adicionou-se 120,0 µL de etanol 70% gelado à parede do
tubo para lavar o sedimento, homogeneizando por inversão. As amostras foram
36
centrifugadas novamente, por 10 min, o sobrenadante foi descartado por inversão e as
amostras foram mantidas em temperatura ambiente overnight, para total evaporação do
etanol. O DNA foi ressuspendido em 10,0 µL de água ultrapura e incubado em banho
seco a 37º C por 30 min, para hidratação. O DNA purificado obtido, foi dosado
utilizando espectrofotômetro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies), diluído
para atingir a concentração final de aproximadamente 10 a 20 ng/µL e armazenado a -
20º C. Para as reações de sequenciamento foi utilizado o kit Big Dye versão 3.1
(Applied Biosystems, EUA), a placa de sequenciamento foi armazenada a 4°C,
protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado de sequenciamento
por eletroforese capilar ABI3130, utilizando-se polímero POP7 no Laboratório de
Parasitologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou de Belo
Horizonte, Minas Gerais.
5.7 Análise das sequências
As sequências de DNA obtidas foram analisadas utilizando o programa Phred
quality scores, disponibilizado pela EMBRAPA
(http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/), selecionou-se bases contíguas com
parâmetro de qualidade Phred (score de qualidade ou Q score) maior que 20. Utilizando
o programa BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool – NCBI – NIH; disponível
em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) as sequências de interesse foram
comparadas com as sequências depositadas no banco de dados do GenBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), permitindo identificar assim a identidade da
sequência de interesse (KURTZMAN, 2014). As sequências das leveduras obtidas no
presente trabalho foram comparadas com aquelas depositadas no GenBank, utilizando o
programa Blastn. As espécies que apresentaram sequencias da região D1/D2 idênticas
às espécies conhecidas foram consideradas como pertencentes a aquela espécie. As
espécies que apresentaram mais de seis diferenças não contíguas nesta região, em
relação a todas as espécies conhecidas, foram consideradas como possíveis novas
espécies de leveduras (KURTZMAN, 2014).
37
5.8 Análise estatística dos dados e determinação dos índices de diversidade
A Análise de Variância não paramétrica de dois fatores de Friedman foi aplicada
na análise dos dados, seguida da correção de Bonferroni para comparação por método
pairwise, com o objetivo de comparar os isolados de leveduras obtidos a partir de cada
espécie de abelhas estudada (T. angustula; S. bipunctata; A. mellifera) e as coletas
realizadas. Os gráficos e as análises estatísticas foram gerados usando o software IBM
SPSS Statistics (Versão 24). Os resultados foram apresentados com média ± desvio
padrão, sendo considerado o nível de significância de 5 % (p < 0,05).
Análises comparativas entre as comunidades de leveduras associadas às três
espécies de abelhas e aos substratos relacionados (mel e própolis) foram conduzidas
utilizando o índice de diversidade diferencial β. Este índice reflete o quanto duas
comunidades diferem em função dos conjuntos de espécies que abrigam
(WHITTAKER, 1972, MAGURRAN, 2004). Para o estudo da diversidade β foi
utilizado o índice βH1 [βH1 = (S /∝med) – 1] de Harrison et al. (1992), onde S = total
de espécies encontrado nas duas comunidades e ∝med = média da riqueza das duas
comunidades.
A análise de similaridade foi realizada com base em uma matriz de presença e
ausência das comunidades de leveduras isoladas de cada espécie de abelha, incluindo-se
os substratos associados (mel e própolis). A análise foi realizada por meio de um
dendograma (UPMG) pelo método de ligação por grupos pareados, empregando os
índices de similaridade Jaccard (VALENTIN,1995; RAMETTE, 2007). Foi utilizado o
programa PAST v3.25. O compartilhamento de espécies de leveduras entre as abelhas
foi visualizado em diagramas de Venn, disponível online (http://jvenn.toulouse.inra.fr)
(BARDOU et al., 2014). O esforço amostral foi avaliado utilizando-se curvas de
acumulação (GOTELLI & CHAO, 2013). A árvore filogenética foi construída com base
em sequências alinhadas dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal utilizando-
se o programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis versão 7 (KUMAR et
al., 2016). A árvore filogenética foi construída utilizando-se o algoritmo de Neighbor-
joining. Uma análise de bootstrap foi realizada com 1000 iterações, utilizando os
softwares incluídos no programa Mega Molecular Evolutionay Genetics Analysis
versão 7 (KUMAR et al., 2016).
38
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Isolamento, preservação e agrupamento morfológico
Oitenta e seis isolados de leveduras foram obtidos a partir das amostras
coletadas dos ninhos de T. angustula (jataí), 184 isolados das amostras coletadas dos
ninhos de Scaptotrigona cfr. bipunctata (tubuna), 78 isolados das amostras dos ninhos
de A. melífera e 33 isolados das amostras de flores de Aroeira, M. urundeuva (Tabela
1). Em um dos ninhos de S. cfr. bipunctata observou-se massa de refugo descartada
pelas abelhas, este material foi coletado, plaqueado e a partir dele houve o crescimento
de quatro isolados de levedura (Tabela 1).
Devido a situações adversas durante o período de coleta, os ninhos
apresentaram-se fracos e com pouca ou nenhuma oferta de alimento, sendo possível a
coleta de um número reduzido de amostras. Devido à baixa disponibilidade de alimento
larval e ninhos com poucos discos de cria, estes substratos não foram coletados. De
colmeia de A. mellifera apenas uma amostra foi plaqueada, havendo o crescimento de
dois isolados de levedura (Tabela 1).
Na primeira coleta realizada em primeiro de abril de 2016, durante a estação
chuvosa, foram obtidos 112 isolados de leveduras. Na segunda coleta, realizada em
nove de junho de 2016, no início da estação seca e durante o período de floração foram
obtidos 223 isolados de leveduras. Na terceira coleta, realizada em sete de outubro de
2016, no auge na estação seca foram obtidos apenas 46 isolados de leveduras.
O período de floração é a época do ano onde há maior disponibilidade de
alimento, as abelhas nativas estocam a maior quantidade possível de recursos
alimentares para manter suas colônias perenes, enfrentando posteriormente o auge da
temporada de seca (WILLE, 1983), além disso, quando as temperaturas estão mais altas
a taxa de crescimento das leveduras aumenta e também a diversidade de populações
(BRYSCH-HERZBERG, 2004). Comparando o número de isolados de leveduras
obtidos em cada coleta e de acordo com cada espécie de abelha estudada (Figura 9), foi
possível observar que um número maior de leveduras foi isolado no período da segunda
coleta, sendo significante a diferença na quantidade de isolados obtidos na segunda
coleta (período de floração) em comparação à terceira coleta (auge da estação seca).
39
Tabela 1: Número de leveduras isoladas de acordo com a espécie e substrato.
Espécies Adulto Mel
imaturo
Mel
maduro
Pólen Alimento
larval
Refugo Flores Total
Tetragonisca
angustula
(n=40)
36
(n=4)
19
(n=15)
30
(n=6)
1
— — — 86
Scaptotrigona
cfr. bipunctata
(n=55)
70
(n=16)
36
(n=26)
37
(n=33)
37
— (n=1)
4
— 184
Apis mellifera (n=35)
50
(n=21)
17
(n=21)
6
(n=18)
3
(n=2)
2
— — 78
Myracrodruon
urundeuva
— — — — — — (n=12)
33
33
Total 156 72 73 41 2 4 33 381
n = número de amostras coletadas dos ninhos.
Figura 9: Número de isolados de leveduras em relação à cada espécie de abelha estudada (A.
mellifera; S. bipunctata; T. angustula) obtidos nas diferentes datas de coletas (PC, primeira
coleta - 01/04/16; SC, segunda coleta - 09/06/16; TC, terceira coleta - 07/10/16). Os valores
foram expressos como média ± desvio padrão. * p < 0,05 quando comparado o grupo SC com o
grupo TC. Análise de variância de Friedman seguida de pós-teste de Bonferroni.
40
O diagrama de Venn apresentado na Figura 10 representa o compartilhamento de
espécies de leveduras pelas três espécies de abelhas e os substratos associados (mel e
pólen). Aureobasidium pullulans foi a única espécie de levedura encontrada em
associação às três espécies de abelhas. Dezenove espécies de leveduras foram isoladas
exclusivamente de insetos adultos, mel e pólen de T. angustula. A abelha Apis mellifera
apresentou 13 espécies não compartilhadas com quaisquer outras abelhas. Já em
associação exclusiva a S. cfr. bipunctata foram encontradas 15 espécies, incluindo três
espécies novas de Starmerella e duas espécies novas de Zygosaccharomyces.
Figura 10: Diagrama de Venn com o número de espécies de leveduras exclusivas e
compartilhadas entre abelhas adultas (Apis mellifera, T. angustula e S. cfr. bipunctata) e
substratos associados (mel e pólen).
O baixo número de espécies compartilhadas e o grande número de espécies
exclusivas de cada abelha pode indicar uma segregação de locais de forrageio. Ao
compartilhar poucos substratos de visitação é criada uma estratégia alimentar que evita
a competição entre as espécies de abelhas. As espécies R. ruineniae, Rh. mucilaginosa,
41
S. apicola, S. bombicola e S. etchellsii foram encontradas em associação a duas espécies
de abelhas, S. cfr. bipunctata e T. angustula. Em relação às espécies de Starmerella, em
especial à S. etchelsii, a levedura isolada em maior frequência na comunidade associada
à T. angustula e a terceira mais frequente juntamente com S. apicola associada à S. cfr.
bipunctata. O compartilhamento de leveduras desse gênero pode indicar tanto um
compartilhamento de locais de forrageio como também uma relação espécie específica
de leveduras do gênero Starmerella e estas espécies de abelhas. Scaptotrigona cfr.
bipunctata compartilha com A. mellifera as espécies de leveduras C. parapsilosis, Ha.
siamensis e Pa. laurentii. Já T. angustula e A. mellifera compartilham apenas uma
espécie de fungo leveduriforme, A. melanogenum.
Os índices de diversidade (Dominância e Simpson) e de riqueza (Margalef)
foram analisados para as comunidades de leveduras associadas à três espécies de
abelhas estudadas (Tabela 2).
Tabela 2: Índices de diversidade e riqueza das comunidades de leveduras associadas às
abelhas Scaptotrigona cfr. bipunctata, Tetragonisca angustula e Apis mellifera.
Espécies_S Indivíduos Dominância (D) Simpson (1-D) Margalef
Scaptotrigona
cfr.
bipunctata
24 93
0,1483 0,8517 5,0740
Tetragonisca
angustula
26 43 0,0622 0,9378 6,6470
Apis melifera 18 37 0,0928 0,9072 4,7080
Os índices de Dominância (D) e Simpson (1-D) expressam a diversidade das
comunidades levando em consideração a riqueza e equitabilidade. A comunidade que
apresentou a maior diversidade foi a associada à abelha T. angustula, seguida pela
comunidade associada a A. mellifera. Apesar de a comunidade associada a S. cfr.
bipunctata apresentar um número maior de espécies que a comunidade associada a A.
melifera, em S. cfr. bupunctata houve dominância de Starmerella sp. 1 e
Zygosaccaromyces sp. 1. A riqueza de espécies foi medida utilizando-se o índice de
Margalef e as análises mostram que a comunidade de leveduras associadas a T.
42
angustula apresentam maior riqueza, seguida pela comunidade associada a S. cfr.
bipunctata e A. mellifera.
Tabela 3: Índices de diversidade β das comunidades de leveduras associadas às abelhas
S. cfr. bipunctata, Tetragona angustula e Apis mellifera.
Scaptotrigona cfr.
bipunctata
Tetragonisca
angustula
Apis
mellifera
Scaptotrigona cfr.
bipunctata
0 0,7600 0,8095
Tetragonisca angustula - 0 0,9091
Apis mellifera - - 0
Foram analisados ainda os índices de diversidade β, que expressam o quão
similar ou diferente são duas comunidades (Tabela 3). Este índice varia de 0, para
comunidades similares, a 1, para comunidades bastante heterogêneas. A similaridade na
composição da comunidade de leveduras entre as abelhas e substratos associados foi
maior entre T. angustula e S. cfr. bipunctata (0,76). Essa mesma dinâmica pode ser
observada na figura 11, que mostra o dendrograma construído a partir da matriz de
similaridade de Jaccard.
Figura 11: Dendrograma de similaridade das leveduras vetorizadas por diferentes espécies de
abelhas. Agrupamento realizado pela similaridade Jaccard.
43
As curvas de acumulação das espécies de leveduras associadas às abelhas
estudadas não atingiram a estabilidade (i.e. assíntota), indicando que um maior esforço
amostral poderia cobrir a riqueza de espécies esperada.
44
Figura 12: Curvas de acumulação de espécies das comunidades de leveduras associadas a
abelhas e substratos relacionados.
45
6.2 Identificação das leveduras
A levedura Starmerella etchellsii foi a espécie associada com mais frequência à
T. angustula e S. cfr. bipunctata. Em T. angustula foi encontrada apenas em associação
ao corpo de abelhas adultas, enquanto em relação à S. cfr. bipunctata foi identificada em
amostras de mel imaturo, mel maduro, pólen e no corpo de abelhas adultas. Além disso,
também foi isolada do pólen de A. mellifera. Esta levedura é osmofílica e tem sido
recuperada a partir de substratos diversificados, tendo sido já anteriormente isolada de
abelhas sem ferrão. Além de S. etchellsii, as espécies associadas com mais frequência a
T. angustula foram A. pullulans, S. apicola, Starmerella sp. 3 e S. meliponinorum. As
espécies do clado Starmerella são leveduras ascomicéticas, frequentemente encontradas
em associação a espécies de abelhas ou substratos visitados por estes insetos (ROSA et
al., 2003). Pelo fato de apresentarem características bioquímicas muito similares, a
identificação das espécies deste gênero pelo método de sequenciamento de regiões do
gene do rRNA é o mais indicado (TEIXEIRA et al., 2003; LACHANCE et al., 2011;
SANTOS et al., 2018).
A levedura S. apicola é uma espécie de ampla distribuição, comumente isolada
de insetos que visitam flores, dentre eles as abelhas, sendo produtora de soforolipídeos,
um biosurfactante anfifílico (ROSA et al., 2003; KURTZMAN et al., 2010;
LACHANCE et al., 2010; SANTOS et al., 2018). No presente trabalho, esta espécie foi
encontrada em amostras de mel maduro, pólen e em associação à abelhas adultas.
Starmerella bombicola foi isolada de amostras de mel imaturo de T. angustula e S. cfr.
bipunctata. Leveduras desta espécie também são frequentemente encontradas
associadas a flores visitadas por abelhas (LACHANCE et al., 2011). A espécie S. lactis-
condensi foi isolada de amostra de pólen coletado por Scaptotrigona cfr. bipunctata, é
uma espécie de levedura considerada nutricionalmente especializada, capaz de crescer
apenas em glicose e lactose como fontes de carbono, além de tolerar substratos com
baixa atividade de água, podendo causar deterioração em alimentos, sendo vetorizada
por insetos (LACHANCE et al., 2011; STRATFORD et al, 2002). Três isolados de S.
meliponinorum foram obtidos a partir de amostras de mel maduro de T. angustula.
Teixeira et al. (2003) descreveram S. meliponinorum a partir de isolados obtidos de
vários substratos associados a espécies de abelhas sem ferrão da tribo Meliponini,
incluindo amostras de mel, própolis, provisões de pólen e abelhas adultas de T.
angustula.
46
Quatro isolados de S. sorbosivorans foram obtidos a partir de amostras de
alimento larval, mel imaturo e adultos de A. mellifera. Essa espécie de levedura é
frequentemente isolada de vespas e abelhas e dos substratos por esses insetos visitados
(LACHANCE et al., 2001a; LACHANCE et al., 2001b). Outras quatro espécies de
leveduras pertencentes ao clado Starmerella, isoladas nesse trabalho, representam
possíveis espécies novas. Estas novas espécies são filogeneticamente pŕoximas às
espécies Starmerella etcheslsii, S. davenportii, S. lactis-condensie S. bombicola. Outras
espécies mais frequentemente associadas à A. mellifera foram A. pullulans,
Papiliotrema laurentii e S. sorbosivorans (tabela 6).
Tabela 4: Frequência de espécies de leveduras associadas à Tetragonisca angustula.
Espécies
Substratos
Mel imaturo
n=4
Mel maduro
n=15
Pólen
n=6
Adulto
n=40
Total Média
UFC/mL,
ou g
Aureobasidium melanogenum 1 1 10
Aureobasidium pullulans 1 4 5 68
Aureobasidium sp. 1 1 10
Blastobotrys chiropterorum 1 1 10
Candida intermedia 1 1 2,4x102
Citeromyces siamensis 1 1 20
Cystobasidium sp. 1 1 10
Hannaella luteola 1 1 2,4x102
Hannaella zeae 1 1 1,1x102
Kwoniella mangrovensis 1 1 10
Papiliotrema flavescens 1 1 10
Papiliotrema rajasthanensis 1 1 1,2x102
Papiliotrema sp. 1 1 10
Rhodosporidiobolus ruineniae 1 1 10
Rhodotorula mucilaginosa 2 2 2x103
47
Rhodotorula toruloides 1 1 10
Schizosaccharomyces octosporus 1 1 10
Spencerozyma crocea 1 1 10
Starmerella apicola 2 1 3 20
Starmerella bombicola 1 1 10
Starmerella etchellsii 6 6 27
Starmerella meliponinorum 3 3 2,1x102
Starmerella sp. 3 1 1 2 35
Ustilago sp. 1 1 1 20
Vishniacozyma sp. 1 1 20
Yamadazyma siamensis 1 1 10
Zygosaccharomyces sp. 1 1 1 30
Total 10 13 — 20 42
n = número de amostras coletadas.
A levedura Candida parapsilosis foi a espécie obtida com maior frequência dos
insetos adultos e substratos associados a A. mellifera. Esse microrganismo é encontrado
em uma grande variedade de substratos e localidades, e é considerado um patógeno
oportunista (LACHANCE et al., 2011). Um representante de Cryptococcus gattii foi
isolado de pólen de S. cfr. bipunctata, uma espécie de levedura patogênica que pode
causar doença em indivíduos imunocompetentes (tabela 5). A RDC 12/2001 atribuída
pela ANVISA determina o regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para
alimentos, e a Instrução normativa nº 3 de 19 de janeiro de 2001, regulamenta a
qualidade do pólen e outros produtos apícolas, porém ambos os documentos não
estabelecem parâmetros de qualidade comercial em relação a presença ou quantidade de
leveduras no pólen, considerando que o pólen e os outros produtos das abelhas são
utilizados como alimento e suplemento alimentar, é necessária a definição de
parâmetros de segurança microbiológica para os mesmos (BÁRBARA et al., 2018).
Também foram encontradas nesta pesquisa outras leveduras ascomicéticas
pertencentes aos clados Clavispora, Citeromyces, Debariomyces, Meyerozyma,
Schizosaccharomyces, Spencerozyma, Wickerhamiella, Yamadazyma e
Zygosaccharomyces. Debariomyces hansenii e espécies de Zygosaccaromyces já foram
48
isoladas anteriormente das espécies das abelhas T. angustula e Melipona quadrifasciata
e substratos associados a esses insetos (mel e pópolis) (ROSA et al., 2003).
Debaryomyces hansenii é uma espécie xerotolerante com crescimento ótimo em
elevadas concentrações de NaCl (RASPOR et al., 2006). Pode ser isolada de substratos
diversos, tais como solo, filoplano de algumas plantas, ambiente marinho, produtos
fermentados a base de soja e outros alimentos ricos em sal (SUZUKI et al., 2011).
A possível espécie nova Zygosaccharomyces sp. 1 foi a segunda espécie mais
frequente associada à S. cfr. bipunctata. Foram obtidos 20 isolados de
Zygosaccharomyces sp.1 (tabela 5), a partir de amostras de mel e adultos de S. cfr.
bipunctata, e um isolado a partir de mel maduro de T. angustula (tabela 4).
Filogeneticamante a espécie descrita mais próxima a Zygosaccharomyces sp.1 é Z.
mellis, um microrganismo considerado osmotolorante e halotolerante, capaz de manter o
pH intracelular regulado mediante situação de choque hiperosmótico (VINDELØV &
ARNEBORG, 2002). Espécies de Schizosaccharomyces também são resistentes a
substratos com baixa atividade de água, e são geralmente isoladas de ambientes ricos
em açúcar (VAUGHAN-MARTINI et al., 2011b). Nesse trabalho um isolado de
Schizosaccharomyces octosporus foi obtido a partir de mel maduro de T. angustula
(tabela 4).
A espécie Wickerhamiella versatilis é halotolerante e osmotolerante,
sintetizadora de ésteres e glicerol, muito utilizada na fermentação de molho de soja
(HOU et al., 2016; RUAN et al., 2019). Nesse trabalho foi isolada de amostras de mel
imaturo, pólen e de abelhas adultas. Candida intermedia pertence ao clado Clavispora
(DANIEL et al, 2015) e é considerada uma espécie generalista (LACHANCE et al.,
2011).
Também foi isolada neste estudo a levedura Citeromyces siamensis, de mel
maduro produzido por T. angustula, é considerada uma espécie halotolerante e foi
descrita a partir de isolados obtidos na Tailândia (NAGATSUKA, et al., 2002). Além
disso, foi isolada a partir de inseto adulto de T. angustula a espécie. Blastobotrys
chiropterorum, descrita em associação a fígado de morcegos (Mormoops
megalophylla), na Colômbia (GROSE et al. 1968; SMITH et al., 2011). Há também um
relato clínico do isolamento dessa espécie de levedura em água de diálise de um
paciente do Havaí (FURMAN et al., 1983). Recentemente essa espécie foi isolada de
49
sedimento de manguezal na Tailândia (KUNTHIPHUN et al., 2018). Yamadazyma
siamensis foi descrita em 2013 a partir de um isolado obtido do filoplano de cana de
açúcar na Tailândia (KAEWWICHIAN et al., 2013). Nesse trabalho foi isolada a partir
de inseto adulto de T. angustula (tabela 4).
Tabela 5: Frequência de espécies de leveduras associadas à Scaptotrigona cfr.
bipunctata.
Espécies
Substratos
Mel imaturo
n=16
Mel maduro
n=26
Pólen
n=33
Adulto
n=55
Total Média
UFC/mL,
ou g
Aureobasidium pullulans 1 1 2x103
Candida parapsilosis 1 1 10
Coniochaeta sp. 1 1 20
Cryptococcus gattii 1 1 10
Cyrenella sp. 1 1 10
Cystobasidium calyptogenae 1 1 10
Debaryomyces hansenii 1 1 2 103
Hannaella sinensis 1 1 10
Papiliotrema laurentii 1 2 3 10
Piskurozyma sp. 1 1 10
Rhodosporidiobolus ruineniae 2 1 3 90
Rhodotorula mucilaginosa 1 1 60
Sporidiobolus pararoseus 1 1 20
Starmerella apicola 1 1 9 11 7,3x102
Starmerella bombicola 2 2 4,2x102
Starmerella cf. etchellsii 1 2 2 6 11 8,3x102
Starmerella lactis-condensi 1 1 1,7x102
Starmerella sp. 1 5 3 4 1 13 5,6x102
Starmerella sp. 2 2 2 2x103
50
Starmerella sp. 4 1 1 4,5x102
Ustilago sp. 2 1 1 10
Wickerhamiella versatilis 4 1 2 7 33
Zygosaccharomyces sp. 1 10 9 1 2 22 3,4x102
Zygosaccharomyces sp. 2 2 1 3 9,9x102
Total 24 22 19 27 92
n = número de amostras coletadas.
Aureobasidium é um gênero de fungo negro, do filo Ascomycota, que apresenta
estágio leveduriforme, sendo A. pullulans a espécie mais conhecida. São
frequentemente isolados de ambientes com baixa atividade de água e considerados
como microrganismos halotolerantes (KOGEJ et al., 2005). Aureobasidium pullulans é
uma espécie generalista, encontrada com frequência em matéria orgânica em
decomposição, na superfície de folhas, solo, água doce e ar (POZO et al., 2011).
Espécies de Aureobasidium foram isoladas de adultos de todas as três abelhas
estudadas. A associação de espécies de Aureobasidium a abelhas pode ser explicada
pelo caráter generalista dessas espécies, que podem estar associadas à superfície das
plantas visitadas por esses insetos. Além disso foram obtidos três isolados de
Aureobasidium a partir de amostras de mel e um isolado de amostra de pólen. A
presença de A. pullulans no mel imaturo pode ser relacionada à capacidade desse
microrganismo de tolerar ambientes com baixa atividade de água.
Algumas espécies de leveduras basidiomicéticas generalistas foram isoladas do
mel e adultos das abelhas estudadas. Espécies de leveduras do gênero Hannaella,
Kwoniella, Papiliotrema,Rhodosporidiobolus, Rhodotorula e Vishniacozyma podem ser
consideras ubíquas e são frequentemente isoladas de substratos vegetais, como filoplano
e flores. Rosa et al. (2003) também isolaram espécies generalistas de leveduras
basidiomicéticas a partir de mel e adultos de T. angustulata, onde foram obtidos
isolados de Cryptococcus albidus-like (= Naganishia albida), Cryptococcus spp. e
Rhodotorula spp. em amostras coletadas em Belo Horizonte e Betim, Minas Gerais.
Para algumas espécies de leveduras basidiomicéticas, apenas um isolado foi
obtido a partir das abelhas estudadas e substratos associados (mel e pólen). Apiotrichum
51
porosum já foi isolada de solo, exsudato de árvore e guano de morcego (SUGITA,
2011).
Tabela 6: Frequência de espécies de leveduras associadas à Apis mellifera.
Espécies
Substratos
Alimento
larval
n=2
Mel
imaturo
n=21
Mel
maduro
n=21
Pólen
n=18
Adulto
n=35
Total Média
UFC/mL,
ou g
Apiotrichum posorum 1 1 9,4x102
Apiotrichum sp. 1 1 12,5x102
Aureobasidium melanogenum 1 1 30
Aureobasidium pullulans 1 5 6 40
Aureobasidium thailandense 1 1 10
Candida parapsilosis 2 4 6 3,5x102
Coniochaeta rhopalochaeta 1 1 10
Cutaneotrichosporon mucoides 1 1 10
Hannaella siamensis 1 1 10
Meyerozyma guilliermondii 1 1 2x103
Meyerozyma sp. 1 1 2x103
Papiliotrema aurea 1 1 10
Papiliotrema laurentii 4 4 13
Rhynchogastrema tunnelae 1 1 10
Saitozyma flava 1 1 10
Starmerella cf. etchellsii 2 2 15
Starmerella sorbosivorans 2 1 1 4 1,6x102
Total 2 7 2 3 20 34
n = número de amostras coletadas.
Cutaneotrichosporon mucoides é uma espécie com importância médica, capaz
de causar infecção disseminada, e já foi isolada de pacientes com pneumonia e
52
meningite. Pode causar onicomicose e piedra branca (SUGITA, 2011). Já foi isolada de
amostras de água coletadas na costa do Mar Vermelho em Israel e do Mar Morto
(BUTINAR et al., 2005). Cystobasidium calyptogenae é uma espécie de levedura
isolada inicialmente de um molusco (Calyptogena sp.) em ambiente marinho profundo
do mar da Baía de Sagami, Japão (SAMPAIO, 2011). Em 2008 também foi isolada de
água marinha em Taiwan (TIEN et al., 2008). Rhinchogastrema tunnelae foi descrita a
partir de isolados obtidos de unha e de substrato desconhecido na Finlândia (VALENTE
et al., 2012). Spencerozyma crocea já foi isolada de besouro, árvore e bebida
fermentada (SAMPAIO, 2011). Para todas essas espécies o habitat natural ainda não
está bem estabelecido, uma vez que há poucos trabalhos que relatam o isolamento das
mesmas de substratos naturais ou mesmo um número muito pequeno de isolados da
espécie é conhecido.
Trinta e três isolados foram obtidos a partir das flores de Aroeira, distribuídas
em 4 espécies diferentes. Os isolados das flores de Aroeira foram identificados como
Rhodosporidiobolus ruineniae, Pseudosydowia eucalypti, Kwoniella heveanensis e
Aureobasidium thailandense. A espécie prevalente foi R. ruineniae, levedura
basidiomicética, produtora de óleo antimicrobiano, e geralmente associada com
superfície de folhas (WANG et al., 2016; SITEPU et al., 2017). Esta espécie também foi
encontrada em amostra de mel maduro de T. angustula, e no mel maduro e pólen de S.
cfr. bipunctata. A ocorrência desta espécie associada à flores justifica a presença no mel
das duas abelhas sem ferrão, já que seria coletada juntamente com o néctar de aroeira e
transportada para os ninhos dos insetos.
6.3 Espécies novas de leveduras
Quinze espécies identificadas no presente trabalho apresentaram divergência
considerável na análise da sequência dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal
e representam possíveis espécies novas (Tabela 7). Quatro possíveis espécies novas
pertencem ao clado Starmerella. Starmerella sp.1 possui 13 isolados obtidos a partir de
amostras de mel e pólen de Scaptotrigona cfr. bipunctata e também de abelhas adultas.
Essa espécie é filogeneticamente próxima a S. etchellsii, com seis pares de bases
divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. Starmerella sp.2 possui
dois isolados obtidos a partir de amostras de pólen de S. cfr. bipunctata, e é
53
filogeneticamente próxima a S. davenpotii, com 16 pares de bases de divergência nos
domínios D1/D2. Starmerella sp. 3 possui três linhagens obtidas a partir de amostras de
mel da abelha T. angustula. Essa espécie é filogeneticamente relacionada a S. lactis-
condensi, e a divergência em relação à sequência da linhagem tipo é de seis pares de
bases. Starmerella sp. 4 possui apenas 1 isolado obtido a partir de amostra de pólen
coletado em colmeia de S. cfr. bipunctata, e é filogeneticamente próxima a S.
bombicola, com divergência de 4 pares de bases em relação à linhagem tipo.
Duas possíveis novas espécies pertencentes ao clado Zygosaccharomyces foram
obtidas a partir de abelhas adultas e substratos associados a Scaptotrigona cfr.
bipunctata. Zygosaccharomyces sp. 1 possui 20 isolados obtidos a partir de mel, pólen e
abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a Z. rouxii (Figura 14), e
apresenta 16 pares de bases divergentes em reação à linhagem tipo (CBS:732) na
comparação das sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal.
Zygosaccharomyces sp. 2 é filogeneticamente próxima a Z. siamensis e possui 3
isolados obtidos a partir de amostras de abelha adulta e mel maduro. Ensaios de
esporulação foram realizados e foi possível observar a formação de esporos sexuais pela
espécie Zygosaccharomyces sp. 1. (Figura 13). Os esporos observados estão contidos
em uma asca permanente, com 2-4 esporos, que apresentam morfologia esferoidal a
elipsoidal. Ascas em forma de haltere, típicas do gênero Zygosaccharomyces também
foram observadas. A ascosporulação foi observada em meio YM após sete dias de
incubação a 25ºC.
Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. Esporo dentro da asca em forma de
haltere.
54
Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces sp.
1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios D1/D2
do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é mostrada
próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2 parâmetros―.
A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise realizada no
programa MEGA 7.
Apiotrichum sp.1 foi isolada a partir de abelha adulta e mel imaturo de A.
mellifera e é filogeneticamente próxima a A. posorum, com 27 bases divergentes na
comparação de sequências dos domínios D1/D2. As outras possíveis espécies novas
obtidas possuem apenas um isolado obtido e a designação de possível espécie nova foi
baseada na divergência apresentada na comparação de sequencias do domínio D1/D2 do
gene do RNA ribossomal. Cyrenella sp. foi isolada de adulto de T. angustula e
apresenta 12 pares de bases divergentes em relação a C. elegans. Cystobasidium sp. foi
isolado a partir de adulto de S. cfr. bipunctata, com quatro pares de bases diferentes em
relação a C. benthicum.
55
Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras.
Gênero Espécie aproximada/ % identidade/
Acesso GenBank
Substrato de
isolamento Quantidade
Apiotrichum sp. A. porosum (90%) / (MG707703.1) mel imaturo 1
Cyrenella sp. Cy. elegans (97%) / (KJ708454.1) abelha 1
Cystobasidium sp. Cys. benthicum (99%) /
(KY107427.1)
abelha 1
Meyerozyma sp. M. guilliermondii (98%) /
(MG707678.1)
mel maduro 1
Papiliotrema sp. P. rajasthanensis (98%) /
(KY108743.1) abelha 1
Piskurozyma sp. P. taiwanensis (98%) /
(KY107271.1) abelha 1
Starmerella sp. 1 S. cf. etchellsii (98% - 99%) /
(AY257049.1) abelha, pólen, mel
imaturo, mel maduro 13
Starmerella sp. 2 S. davenportii (95% - 96%) /
(EF452219.1) pólen 2
Starmerella sp. 3 S. cf. lactis-condensi (96% - 99%)
/ (AY257059.1) mel imaturo, mel
maduro 2
Starmerella sp. 4 S. bombicola (99%) /
(HQ111045.1) pólen 1
Ustilago sp. 1 U. calamagrostidis (99%) /
(AY740119.1) mel imaturo 1
Ustilago sp. 2 U. sporoboli-indici (99%) /
(MF716450.1) mel maduro 1
Vishniacozyma sp. V. victoriae (92%) /
(MG735809.1)
mel imaturo 1
Zygosaccharomyces sp.1 Z. mellis (97%) / (KY110273.1) abelha, mel imaturo,
mel maduro, pólen 23
Zygosaccharomyces sp.2 Z. siamensis (99%) /
(KY110251.1)
abelha, mel maduro 3
Total 53
Meyerozyma sp. foi isolada de mel maduro de A. melifera e apresenta seis pares
de bases divergentes em relação a M. gulliermondii. Papiliotrema sp. foi obtida a partir
de adulto de A. mellifera e apresenta quatro pares de base divergentes em relação a P.
rajasthanensis. Piskurozyma sp. foi isolada de adulto de S. cfr. bipunctata e apresenta
uma divergência de oito pares de bases em relação a P. taiwanensis. Ustilago sp. 1 foi
isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 14 pares de bases divergentes em
56
relação a U. calamagrostidis. Já Ustilago sp. 2 foi obtida a partir de mel maduro de S.
cfr. bipunctata e apresenta 32 pares de bases divergentes em relação a U. sporoboli-
indici. Vishiniacozyma sp. foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 30
pares de bases divergentes em relação à sequência de V. victoriae. Futuramente serão
realizadas novas análises de sequenciamento utilizando os primers ITS1/ITS4 para
confirmação das novas espécies e posterior descrição.
57
7 CONCLUSÃO
As comunidades de leveduras estudadas apresentaram baixo compartilhamento
de espécies e elevado número de espécies exclusivas o que indica que
possivelmente as abelhas possuem segregação de locais de forrageio, que pode
resultar em uma menor competição por alimentos.
O elevado número de espécies de leveduras do gênero Starmerella, aliado ao
grande compartilhamento de espécies desse gênero entre as espécies de abelhas,
indica forte endemismo de espécies de Starmerella a abelhas e substratos a estas
relacionados.
A similaridade apresentada entre as três comunidades de leveduras estudadas
apresentou baixos valores. Além disso, a curva de acumulação de espécies não
apresentou estabilidade para nenhuma das três comunidades. Esses dados
indicam que um maior esforço amostral é necessário para cobrir a riqueza de
leveduras das comunidades estudadas.
O isolamento de 15 possíveis espécies novas no presente trabalho mostra o
potencial dos substratos estudados para o isolamento de espécies ainda não
descritas, além de evidenciar a importância de estudos de biodiversidade de
leveduras associadas a abelhas.
58
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