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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e
desenvolvimento de gel à base do extrato
ALEXANDRE BEZERRA GALINDO
RECIFE 2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e
desenvolvimento de gel à base do extrato
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ALEXANDRE BEZERRA GALINDO Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
RECIFE 2007
ii
Galindo, Alexandre Bezerra
Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato / Alexandre Bezerra Galindo. – Recife: O Autor, 2007.
xii, 86 folhas : il., fig., tab., quadros.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Própolis vermelha – Atividades biológicas.2. Própolis vermelha - Medicamento . I. Título.
615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.18 CDD (20.ed.) CCS2007-92
iii
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Jane Sheila Higino
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Samuel Daniel de Souza Filho
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Beate Saegesser Santos
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as bênçãos concedidas na minha vida e pela força durante toda essa
jornada.
À Universidade Federal de Pernambuco, em particular ao Programa de Pós-Graduação
em ciências Farmacêuticas, pela oportunidade de realização deste curso.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto, pela oportunidade, orientação e
apoio.
À minha família, mãe, pai, irmã e irmão, por todo investimento, compreensão e
confiança, muito importantes para meu sucesso.
Às minhas amigas Sarah Lustosa, Aíla Karla e Dra. Karina Randau, por todo incentivo e
carinho que demonstraram por mim durante o mestrado, além do apoio incondicional
em todos os momentos.
Aos colegas do Laboratório de Tecnologia de Medicamentos (LTM), pela convivência e
apoio recebido, em especial aos colegas Ádley, Mariana, Januária, Diego, Regina,
Magaly, Jeckson, Tacizo, Luciana e Amanda.
Aos colegas de Mestrado, pela convivência e experiências compartilhadas durante o
curso, em especial aos colegas Júlio, Rafael, Mariana e Fabiana.
Aos amigos, Jenayce, Marília, Michelle, Rafaella e Jurandy, pelo incentivo e paciência.
À empresa Mel Brasil, na pessoa do Sr. José Maria Pereira, pelo fornecimento da
matéria-prima (própolis), indispensável para a realização deste trabalho.
vi
“Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz somente até onde os outros chegaram.”
Alexandre Graham
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SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas e Siglas........................................................................................ ix Lista de Símbolos........................................................................................................... x Lista de Figuras.............................................................................................................. xi Lista de Tabelas e Quadros............................................................................................ xii Resumo.......................................................................................................................... xiii Abstract.......................................................................................................................... xiv Introdução...................................................................................................................... 1 Objetivos........................................................................................................................ 4 Geral............................................................................................................................... 4 Específicos..................................................................................................................... 4 Capítulo I - Própolis: Química e Farmacologia (Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)......................................................................................... 5 Capítulo II – Variabilidade Sazonal dos Constituintes da Própolis Vermelha e Bioatividade em Artemia salina (Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia).............................................................................................................. 22 Capítulo III - Influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de extratos de própolis vermelha (Artigo a ser submetido à Revista LWT).................. 36 Capítulo IV – Perfil fitoquímico e avaliação da atividade cicatrizante da própolis vermelha em lesões provocadas em dorso de ratos........................................................ 55 Capítulo V – Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do método analítico para doseamento de flavonóides (Artigo a ser submetido à RBCF)................................... 69 Conclusões e Perspectivas.............................................................................................. 80 Conclusões..................................................................................................................... 81 Perspectivas.................................................................................................................... 82 Referências Bibliográficas............................................................................................. 83 Anexos............................................................................................................................ 86
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de Variância CCD Cromatografia em camada delgada CG-MS Cromatografia a gás – Espectrometria de massa COX Ciclooxigenase DL50 Dose letal para 50% de morte das cobaias DMSO Dimetilsulfóxido DP Desvio padrão DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil EEP Extrato etanólico de própolis EROs Espécies reativas de oxigênio LTM Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos pH Potencial de hidrogênio iônico PE Pernambuco PI Piauí UFPE Universidade Federal de Pernambuco
ix
LISTA DE SÍMBOLOS
% porcentagem µL microlitro mL mililitro L litro µg micrograma mg miligrama g grama nm nanômetro cm centímetro M molar mM milimolar Mo molibdênio min minuto h hora ± mais ou menos < menor que n número de amostras R2 coeficiente de correlação oC graus Celsius v/v porcentagem volume por volume m/v porcentagem massa por volume ® marca registrada rpm rotações por minuto cP centipoise
x
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 3 Figura 1 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de fevereiro de 2006 em função do tempo........................ 47 Figura 2 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de junho de 2006 em função do tempo.............................. 47 Figura 3 - Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de outubro de 2006 em função do tempo.......................... 47 Capítulo 4 Figura 1 - Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico.................................. 61 Capítulo 5 Figura 1 - Curva de regressão linear obtida a partir da média de três curvas............ 75
xi
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Capítulo 2 Tabela 1 – Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha de Pernambuco (% do íon corrente total)........................................................................ 30 Capítulo 3 Tabela 1 - Conteúdo de fenóis totais das amostras de própolis coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006........................................................................ 45 Tabela 2 – Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)...................... 47 Tabela 3 – Atividade antioxidante total dos extratos metanólicos de própolis em AAR% rutina............................................................................................................... 48 Tabela 4 – Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio............. 49 Capítulo 4 Tabela 1 - Formulação da emulsão a frio................................................................... 60 Quadro 1 - Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização.................................................................................................................. 61 Quadro 2 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo....... 63 Quadro 3 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo........ 64 Quadro 4 - Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste............................ 64 Capítulo 5 Tabela 1 – Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos................................... 72 Tabela 2 – Resultado da linearidade.......................................................................... 75 Tabela 3 – Resultados da exatidão, comprovada pelo teste t-Student....................... 76 Tabela 4 – Resultados da repetitividade..................................................................... 76 Tabela 5 – Controle físico-químico dos géis obtidos................................................. 77
xii
RESUMO
CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS VERMELHA, AVALIAÇÃO
DE SUAS PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E DESENVOLVIMENTO DE GEL À
BASE DO EXTRATO
A própolis é um material resinoso e balsâmico produzido pelas abelhas a partir do
exudato de árvores, ramos, pólen e flores. Sua composição depende da época, vegetação
e local de coleta, entre outros fatores, sendo, portanto, bastante variada. A própolis tem
sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas propriedades antibacteriana,
antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora, antioxidante, antitumoral,
cicatrizante, entre outras. O presente trabalho teve por objetivos a caracterização do
extrato de própolis vermelha de Goiana-PE, Brasil, através da determinação dos seus
constituintes voláteis por CG-EM; biomonitoramento, através da avaliação de sua
toxicidade sobre Artemia salina Leach; avaliação de suas propriedades biológicas,
antioxidante e cicatrizante; e desenvolvimento de gel à base do extrato, avaliando a
estabilidade das preparações obtidas, bem como validando a metodologia para o
doseamento de flavonóides nos géis. Através da extração por headspace dinâmico e
identificação por cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas (CG-
EM), foram identificados 34 constituintes voláteis, tendo como constituintes
majoritários o trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. O ensaio de letalidade
em Artemia salina Leach demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL, sugerindo uma possível
atividade antitumoral. Quanto à atividade antioxidante, os resultados demonstraram que
a própolis vermelha analisada possui atividade antioxidante, comprovada por diferentes
métodos, e que tal atividade está relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem
como à época de sua coleta. A própolis em estudo apresentou bons resultados no estudo
de cicatrização por segunda intenção em dorso de ratos, quando comparada ao padrão
D-pantenol. Os resultados obtidos na validação do método analítico para doseamento de
flavonóides foram tratados estatisticamente por Análise de Variância one-way
(ANOVA) e teste t de Student. O método demonstrou atender aos requisitos exigidos
pela legislação vigente, RE nº 899, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, sendo
linear, exato e preciso.
Palavras-chave: própolis vermelha, constituintes químicos, atividades biológicas, gel
xiii
ABSTRACT
CHARACTERIZATION OF THE RED EXTRACT OF PROPOLIS, EVALUATION
OF ITS BIOLOGICAL PROPERTIES AND GEL DEVELOPMENT TO BASE OF
THE EXTRACT
Propolis is a resinous and balsamic substance collected by bees from the tree (branches,
pollen and flowers) exsudates. Its composition is dependent of the season, vegetation
and site of collection, among other features, and furthermore, it is widely varied.
Propolis has been an object of pharmacological investigations in consequence of its
antibacterial, antifungal, antiviral, anti-inflammatory, hepatoprotector, antioxidant,
antitumoral, immune-modulatory properties, among others. The objective of this study
was the characterization of the extract of red propolis form Goiana-PE through the
determination of its volatile constituents by GC-MS; biomonitoring through the
evaluation of its toxicity on Artemia salina Leach; evaluation of its biological
properties, antioxidant and cicatrizant; and development of gel using the extract,
evaluating the stability of solutions obtained, as well validating the methodology to the
doses of flavonoids into the gels. Through the extraction by dynamic headspace and
identification by Gas Chromatography connected with Mass Spectrometry (GC-MS)
were identified 34 sesquiterpenoids constituents, as majority constituents presenting the
trans-anethol, α-copaene and methyl cis-isoeugenol. The essay of lethality in Artemia
salina Leach showed DL50 of 18.9 µg.mL-1, suggesting a possible antitumoral activity.
The results showed that this red propolis has an antioxidant activity, evidenced by
different methods, and this activity is related with its contents of fenolic compounds, as
well as the season of the collection. This propolis showed good cicatrisation after a
second intention in rats when is compared to the D-pantenol standard. The method is
adequate to the condition required by the current legislation, RE no 899, of the National
Agency of Sanitary Vigilance, and is linear, exact and accurate.
Keywords: red propolis, chemical constituents, biological activities, gel
xiv
INTRODUÇÃO
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
INTRODUÇÃO
A própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico
coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além
desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (PEREIRA et
al., 2002; FRANCO et al., 2000). Sua composição química é bastante complexa e
variada, estando intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região
visitada pelas abelhas (PARK et al., 2002) e com o período de coleta da resina (ROCHA
et al., 2003). Por isso, é considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas
em fontes naturais. Hoje mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou
caracterizados em diferentes amostras (BURDOCK, 1998).
A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas
propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora,
antioxidante, antitumoral, cicatrizante, imunomodulatória, entre outras (BANKOVA,
2005; KOSALEC et al., 2005; ALENCAR et al., 2005). No Brasil, são descritas
propriedades biológicas e composição química distintas para diferentes amostras
coletadas em diferentes partes do país. Porém, essa variação é facilmente explicada pela
grande biodiversidade brasileira (PEREIRA et al., 2002).
As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as propriedades
biológicas mais extensivamente estudadas (KUJUNGIEV et al., 1999). Entretanto, a
atividade antioxidante merece especial interesse, pois a própolis poderia ser aplicada
topicamente com sucesso para prevenir e tratar a pele danificada (MARQUELE et al.,
2006), sendo os flavonóides relatados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes
na própolis. A propriedade cicatrizante da própolis, assim como várias outras
2
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
propriedades biológicas, também está relacionada com flavonóides e ácidos fenólicos
(ARVOUET-GRAND et al., 1994).
A maioria dos estudos, porém, tem como objeto a própolis verde, já bem
caracterizada e conhecida em todo mundo. Com relação à própolis vermelha, a qual foi
utilizada neste estudo, há poucos relatos na literatura, tanto sobre sua composição
química, como de suas atividades biológicas.
Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando caracterizar e quantificar
constituintes químicos da própolis vermelha, como compostos fenólicos (dentre eles os
flavonóides) e compostos voláteis (por CG-EM). Avaliaram-se também suas
propriedades biológicas (citotoxicidade, atividade antioxidante e cicatrizante), as quais,
como demonstradas, podem ser correlacionadas à constituição química, para o
desenvolvimento de um produto farmacêutico à base do extrato de própolis vermelha.
Assim, algumas lacunas deixadas nas pesquisas científicas sobre a própolis vermelha
poderão ser esclarecidas e as informações obtidas, sobre um tipo de própolis tão pouco
explorado, servirão de base para estudos posteriores.
3
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
OBJETIVOS
Geral
• Caracterização do extrato de própolis vermelha da região de Goiana–PE, Brasil,
avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do
extrato.
Específicos
• Caracterização e quantificação dos constituintes voláteis do extrato de própolis
vermelha por cromatografia gasosa acoplada a espectrofotômetro de massa (CG-
EM), avaliando sua variabilidade sazonal;
• Testar a bioatividade (toxicidade) em Artermia salina Leach;
• Quantificação do teor de fenóis totais e flavonóides;
• Avaliar a influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de
extratos da própolis;
• Avaliação da atividade cicatrizante em lesões provocadas em dorso de ratos;
• Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do
método analítico para doseamento dos flavonóides na forma farmacêutica.
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CAPÍTULO 1
PRÓPOLIS: QUÍMICA E FARMACOLOGIA
(Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Própolis: Química e Farmacologia
Sarah R. Lustosa1, Alexandre B. Galindo1, Karina P. Randau2, Pedro J. Rolim Neto1∗
1Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,
2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.
Resumo
Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico. Sua
composição química é complexa e variada, estando relacionada com a flora de cada
região visitada pelas abelhas e com o período de coleta da resina. Inclui flavonóides,
ácidos aromáticos, terpenóides e fenilpropanóides, ácidos graxos e vários outros
compostos. A própolis tem sido objeto de intensos estudos farmacológicos e químicos
nos últimos 30 anos. Em várias partes do mundo é indicada para melhorar a saúde e
prevenir doenças. Atualmente, é disponível em várias formas farmacêuticas como
cápsulas, extratos, enxaguatório bucal, na forma de pó, entre outras. Ainda são
necessários estudos correlacionando a composição química com a atividade biológica,
definindo cada tipo de própolis com a sua aplicação terapêutica. É uma tarefa
imprescindível para um mercado cada vez maior e exigente em todo o mundo.
Unitermos: Própolis, constituintes químicos, atividade biológica.
Abstract: “Propolis: Chemistry and Pharmacology”. Propolis (bee glue) is a complex
mixture, formed by resinous and balsamic material. It is variable and complex chemical
∗ [email protected] Tel/Fax: (81) 3272 1383
6
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
composition, being related with the flora of each region visited by the bees and with the
period of resin´s collection. Chemical compositon as flavonoids, aromatic acids,
terpenoids and phenylpropanoids, fat acid, and others compounds are found in such
propolis. For the last 30 years, propolis has become the subject of intense
pharmacological and chemical studies. In different parts of the world it is indicated to
improve the health and to prevent illnesses. Currently, it is available in some
pharmaceutical forms as capsules, extracts, mouthrinses, powder form, among others.
Indeed, there are necessit correlating studies the chemical composition with the
biological activity, defining each type of propolis with its therapeutical application. It´s
an essential task for a market ever bigger and demanding in the whole world.
Keywords: Propolis, chemical constituents, biological activity
Introdução
A palavra própolis é derivada do grego pro-, em defesa, e polis-, cidade ou
comunidade, isto é, em defesa da comunidade (Pereira et al., 2002). É uma mistura
complexa, formada por material resinoso e balsâmico coletado pelas abelhas dos ramos,
flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além desses, na colméia, as abelhas
adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al., 2002; Franco et al., 2000).
Para produção de própolis, abelhas usam materiais resultantes de uma variedade
de processos botânicos em diferentes partes das plantas. São substâncias ativamente
secretadas pelas plantas bem como exudatos de feridas nas plantas: materiais lipofílicos
nas folhas e germes, látex, resinas, etc (Bankova (b), 2005; Capasso; Castaldo, 2002).
As abelhas de fato usam a própolis para protegê-las contra insetos e
microrganismos, no reparo de frestas ou danos à colméia, no preparo de locais
7
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
assépticos para postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores
(Marcucci, 1996).
De modo geral, contém 50-60% de resinas e bálsamos, 30-40% de ceras, 5- 10%
de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, além de microelementos como alumínio,
cálcio, estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2,
BB6, C e E (Park, et al., 2002; Burdock, 1998; Funari; Ferro, 2006; Menezes, 2005;
Woisky et al., 1998).
A coloração da própolis depende de sua procedência. Varia de marrom escuro
passando a uma tonalidade esverdeada até o marrom avermelhado. Possui odor
característico que pode variar de uma amostra para outra (Marcucci, 1996).
Na Europa, América do Norte e oeste da Ásia, a fonte dominante de própolis é o
exudato do botão de álamo (Populus sp.). Entretanto, na América do Sul a espécie
vegetal do gênero Populus não é nativa, existindo uma grande diversidade vegetal para
retirada de resina, o que dificulta a correlação da própolis com a fonte produtora (Park
et al., 2002). Outras espécies vegetais empregadas como fontes de própolis em várias
partes do mundo são pinheiros, carvalho, salgueiro, acácia, entre outras (Markham et al.,
1996).
A própolis vermelha é reportada como sendo típica de Cuba e da Venezuela,
onde as origens botânicas foram identificadas como Clusia nemorosa (Clusiaceae) e
Clusia scrobiculata, respectivamente (Trusheva et al., 2006).
A própolis é um dos muitos produtos naturais que vem sendo utilizado durante
séculos pela humanidade (Vargas et al., 2004). Os egípcios conheciam as propriedades
anti-putrefativas da própolis e empregavam para embalsamar cadáveres. Além disso, foi
reconhecida por suas propriedades medicinais por médicos gregos e romanos como
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (Capasso; Castaldo, 2002). O uso de extratos
de própolis na medicina popular data de 300 a.C. (Da Silva et al., 2006).
Na África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada
devido às suas propriedades cicatrizantes e na segunda guerra mundial foi empregada
em várias clínicas soviéticas (Pereira et al., 2002).
A própolis começou a ser apreciada como meio para tratamento de problemas de
saúde nos anos de 1950 e 1960 na ex-União Soviética e em países do leste da Europa,
como Bulgária, República Tcheca e Polônia. Nos países do oeste europeu, na América
do Sul e do Norte e no Japão, a própolis não adquiriu popularidade até 1980. Na metade
dos anos 80, tornou-se um importante produto na medicina alternativa e complementar.
Hoje, o Japão é o principal importador de própolis, com preferência pela própolis
brasileira (Salatino et al., 2005).
O termo própolis já era descrito no século XVI na França e a Farmacopéia de
Londres do século XVII lista a própolis como droga oficial (Capasso; Castaldo, 2002;
Pereira et al., 2002; Cao et al., 2004). Em 1908 surgiu o primeiro trabalho científico
sobre suas propriedades químicas e “composição”, indexado no Chemical Abstracts
(referência n° 192). Em 1968 surgiu no Chemical Abstracts o resumo da primeira
patente utilizando a própolis (Romena, para a produção de loções para banho). Até
meados do ano 2000, o número de trabalhos publicados citados no Chemical Abstracts
totaliza 450, oriundos de 39 países (dos cinco continentes), além de 239 patentes
(Pereira et al., 2002).
No Brasil, o interesse pela própolis aconteceu somente na década de 80 com o
trabalho pioneiro de Ernesto Ulrich Breyer (1981), demonstrando em seu livro,
“Abelhas e saúde”, as propriedades terapêuticas da própolis e sua utilização como
antibiótico natural (Lima, 2006).
9
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Composição Química
A composição química é bastante complexa e variada, estando intimamente
relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas (Park et al.,
2002) e com o período de coleta da resina (Rocha et al., 2003). Além disso, a
variabilidade genética das abelhas rainhas também influencia na composição química
(Park, 1998). Deste modo, um número significativo de trabalhos com a química da
própolis foi publicado para entender que sua composição química varia grandemente e
depende da flora local e da região de coleta (Bankova (a), 2005).
O melhor indicador da origem botânica da própolis é análise da sua composição
química comparada com a provável fonte vegetal. A determinação da origem geográfica
e, principalmente, a origem vegetal, se faz importante no controle de qualidade e até
mesmo na padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação terapêutica
(Park et al., 2002).
Alguns componentes estão presentes em todas as amostras de própolis, enquanto
outros ocorrem somente em própolis derivadas de espécies particulares de plantas
(Vargas et al., 2004).
A composição química da própolis inclui flavonóides (como a galangina,
quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas,
terpenóides e fenilpropanóides (como os ácidos caféico e clorogênico), esteróides,
aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e vários outros compostos
em pequenas quantidades (Hu et al., 2005; Hayacibara et al., 2005; Ozkul et al., 2004;
Matsuda et al., 2002; Rocha et al., 2003). Há também na sua constituição elementos
inorgânicos como o cobre, manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício
(Marcucci, 1996). De todos esses grupos de compostos, certamente o que vem
chamando mais atenção dos pesquisadores é o dos flavonóides (Lima, 2006). A eles,
10
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
bem como aos ácidos fenólicos, são atribuídas as propriedades antibacteriana, antiviral e
antioxidante (Volpi; Bergonzini, 2006).
Pelo menos 300 compostos foram identificados em diferentes amostras de
própolis, com mais de 100 em cada uma (Marcucci et al., 2001). Em 2000, doze tipos
distintos de própolis brasileira foram quimicamente caracterizados e classificados de
tipo 1 a 12 por Park et al. (Alencar et al., 2005; Hayacibara et al., 2005).
As amostras tropicais de própolis, especialmente as brasileiras, têm mostrado
diferenças significantes nas suas composições químicas em relação à própolis da zona
temperada. Por essa razão, a própolis brasileira têm se tornado objeto de grande
interesse por parte dos cientistas (Trusheva et al., 2006). A própolis verde brasileira,
produzida em São Paulo e Minas Gerais é constituída principalmente de derivados
prenilados do ácido p-cumárico e possui grande quantidade de flavonóides, muitos dos
quais não estão presentes em própolis da Europa, América do Norte e Ásia (Simões et
al., 2004).
Propriedades Biológicas
A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas
propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora,
antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras. (Bankova (a), 2005; Kosalec
et al., 2005; Alencar et al., 2005). Esse potencial biológico se deve a um sinergismo que
ocorre entre os muitos constituintes (Marcucci, 1996).
Antimicrobiana
As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as propriedades
biológicas mais extensivamente estudadas (Kujungiev et al., 1999). São atribuídas
principalmente à flavonona pinocembrina, ao flavonol galangina e ao éster feniletil do
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
ácido caféico, com um mecanismo de ação baseado provavelmente na inibição do RNA-
polimerase bacteriano (Uzel et al., 2005). Outros componentes como os flavonóides, o
ácido caféico, ácido benzóico, ácido cinâmico, provavelmente agem na membrana ou
parede celular do microorganismo, causando danos funcionais e estruturais
(Scazzocchio et al., 2005).
A própolis possui atividade antibacteriana maior contra bactérias Gram-positivas
e limitada contra Gram-negativas (Lu et al., 2005; Marcucci et al., 2001). Estudo
realizado com extratos de própolis comercializados no Brasil mostrou atividade
antimicrobiana pronunciada contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans ATCC
10231, e atividade menos evidente contra Gram-negativos e Candida albicans FT 2010
(Rezende et al., 2006).
Até o momento, não se tem dados que respondam o porquê desta menor
atividade dos extratos de própolis contra bactérias Gram-negativas. Estas bactérias
possuem uma parede celular quimicamente mais complexa e um teor lipídico maior, o
que pode explicar essa maior resistência (Vargas et al., 2004).
Própolis também tem demonstrado excelentes atividades fungistática e
fungicida, em testes in vitro, contra leveduras identificadas como agentes causadores de
onicomicoses (Oliveira et al., 2006).
Antiinflamatória
A atividade antiinflamatória observada na própolis parece ser devida à presença
de flavonóides, especialmente galangina. Este flavonóide apresenta atividade inibitória
contra a ciclooxigenase (COX) e lipooxigenase. Tem sido relatado também que o ácido
fenil éster caféico (CAPE), possui atividade antiinflamatória por inibir a liberação de
ácido aracdônico da membrana celular, suprimindo as atividades das enzimas COX-1 e
COX-2 (Borrelli et al., 2002).
12
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
A própolis tem demonstrado ação antiinflamatória também por inibir a síntese
das prostaglandinas, ativar a glândula timo, auxiliando o sistema imune pela promoção
da atividade fagocítica e estimulando a imunidade celular (Kosalec et al., 2005).
Antioxidante
A atividade antioxidante merece especial interesse, pois a própolis poderia ser
aplicada topicamente com sucesso para prevenir e tratar a pele danificada (Marquele et
al., 2006).
Flavonóides são relatados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes na
própolis. Existe uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade
anti-radicais livres em extratos de própolis da Argentina (Ahn et al., 2007). Da Silva et
al. (2006) sugerem que os flavonóides desempenham importante papel na atividade
antioxidante de extratos de própolis brasileira, mas outros fatores poderiam estar
envolvidos (Choi et al., 2006). Embora estudos com extratos etanólicos de própolis
sejam mais comuns, é relatado que o extrato aquoso da própolis possui uma boa
atividade antioxidante, associada ao alto teor de compostos fenólicos (Mani et al.,
2006).
Antiviral
Não existem muitos relatos sobre a atividade antiviral da própolis. Marcucci
(1995) cita uma ação virucida da própolis nos vírus do herpes simplex (HSV) e da
estomatite vesicular (VSV). Em estudo realizado na Ucrânia, foi comparada a eficácia
de pomada de própolis canadense com pomadas de aciclovir e placebo (veículo) no
tratamento de pacientes com herpes genital tipo 2 recorrente. A preparação de própolis
contendo flavonóides apresentou-se mais efetiva que as outras duas na cicatrização das
lesões e redução dos sintomas locais (Vynograd et al., 2000).
13
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Estudos in vitro sugerem que a própolis tem uma potente atividade antiviral
contra as variantes X4 e R5 do HIV-1. Atividade similar foi observada com linfócitos
CD4+ operando, pelo menos em parte, como inibidor da entrada viral (Gekker et al.,
2005).
Cicatrizante
A propriedade cicatrizante da própolis, assim como várias outras propriedades
biológicas, está relacionada com flavonóides e ácidos fenólicos (Arvouet-Grand et al.,
1994). Em estudo no qual foi comparada a propriedade cicatrizante de um creme de
própolis com um creme de sulfadiazina de prata, foi demonstrado que os ferimentos
tratados com própolis apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização do que
aqueles tratados com sulfadizina de prata (Gregory et al., 2002).
Imunomodulatória
Sy et al. (2006) demonstraram que o tratamento com extrato de própolis atenua
as inflamações das vias aéreas em ratos, provavelmente por sua habilidade em modular
a produção de citocina. Sendo assim, seria um novo agente no tratamento da asma.
Orsolic et al. (2004) demonstraram que derivados hidrossolúveis de própolis, ácido
caféico, éster feniletil do ácido caféico e quercetina poderiam ser extremamente úteis no
controle do crescimento tumoral em modelos experimentais.
Outras propriedades
Há relatos de que a própolis baixa a pressão arterial e os níveis de colesterol no
sangue (Capasso; Castaldo, 2002). Em muitos países, a própolis e o mel são usados
para o tratamento de infecções das vias aéreas (Tavares et al., 2006).
Como antiprotozoário, a própolis mostrou-se ativa contra Toxoplasma gondii,
Trichomonas spp. e Giardia lamblia (Dantas et al., 2006). Testes in vitro com extratos
de própolis foram realizados contra Trypanosoma cruzi e mostraram atividade contra as
14
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
formas epimastigotas desse parasita, sendo uma possível alternativa para o tratamento
da Doença de Chagas (Prytzyk et al., 2003).
Própolis também tem sido bastante utilizada em odontologia, estando presente
em enxagüatórios bucais e cremes dentais para prevenir cáries e tratar gengivites e
estomatites (Pietta et al., 2002). Em experimentos na área de Endodontia, Cariologia,
Cirurgia Oral, Periodontia e Patologia Oral, teve uma atuação positiva na reorganização
tecidual, ação antiinflamatória e antibacteriana (Manara et al., 1999).
Panorama Atual
A própolis é usada em várias partes do mundo onde é indicada para melhorar a
saúde e prevenir doenças como inflamação, doenças do coração, diabetes e câncer
(Kadota et al., 2002). Problemas tratados com própolis incluem mau hálito (halitose)
eczema, infecções na garganta, úlceras e infecções urinárias. (Pereira et al., 2002).
Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na
forma de cápsulas, como um extrato (hidroalcoólico ou glicólico), como enxaguatório
bucal, na forma de pó, entre outras (Capasso; Castaldo, 2002). Também é empregada
em cosméticos e na indústria alimentícia na forma de alimentos funcionais (Alencar et
al., 2005; Sforcin et al., 2000).
Muitos produtos à base de própolis comercializados no Brasil possuem registro
no Ministério da Agricultura, que preconiza os limites para fixação de identidade e
qualidade da própolis na Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2001 (Brasil,
2001). Os produtos que contêm própolis e que apresentem indicações terapêuticas
podem ser registrados como medicamentos específicos segundo a Resolução-RDC nº
132, de 29 de maio de 2003, D.O.U. de 02/10/2003, sendo classificados como
15
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
opoterápicos (Brasil, 2003). A comprovação de segurança e eficácia segue a nota
técnica da CATEF - Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos (CATEF, 2005).
O consumo de própolis no mundo é estimado em cerca de 700-800 toneladas/
ano (Da Silva et al., 2005). Faltam estatísticas oficiais sobre o volume de própolis
produzido anualmente no Brasil, o que é exportado e o que é consumido pelo mercado
interno. Existem apenas avaliações de produtores e exportadores que situam a produção
brasileira entre 49 e 150 toneladas anuais. O cálculo de 150 toneladas pode estar
superestimado, mas é mais realista. O consenso é que o Brasil é o segundo maior
produtor mundial, logo atrás da China (Lima, 2006).
Nas últimas décadas, foi observado um aumento, em todo o mundo, no uso de
produtos naturais (Hayacibara et al., 2005). Entretanto, apesar desse aumento e do fato
de existir uma considerável quantidade de informações disponíveis no que concerne aos
aspectos químicos e biológicos da própolis, sua aplicação terapêutica ainda pode ser
considerada incipiente (Funari & Ferro, 2006).
Atualmente, inúmeros trabalhos demonstram as atividades biológicas da própolis
bem como suas aplicações terapêuticas. Essas virtudes conduzem a própolis a um
verdadeiro modismo. Porém, é preciso estabelecer alguns pontos importantes. Apesar de
ser aceita por órgãos regulatórios como produto com finalidade terapêutica, a própolis
precisa ser padronizada quimicamente para garantir sua qualidade, eficácia e segurança.
O que não é fácil, pois, como já foi visto vários fatores podem interferir na sua
composição química. Também são necessários estudos que relacionem a composição
química com a atividade biológica, pois assim seria possível correlacionar o tipo de
própolis com a sua aplicação terapêutica. Isso é uma tarefa imprescindível para um
mercado cada vez maior e exigente em todo o mundo.
16
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
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21
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CAPÍTULO 2
VARIABILIDADE SAZONAL DOS CONSTITUINTES DA
PRÓPOLIS VERMELHA E BIOATIVIDADE EM Artermia salina
(Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia)
22
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Variabilidade sazonal dos constituintes da própolis vermelha e
bioatividade em Artermia salina
Lívio César Cunha Nunes1, Alexandre Bezerra Galindo3, Annalu da Silva Oliveira de
Deus1, Daniel Arcanjo Rufino1, Karina Perrelli Randau2, Haroudo Satiro Xavier2,
Antônia Maria das Graças Lopes Citó1, Pedro José Rolim Neto3∗
1Núcleo de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Piauí, 60400-000,
Teresina, PI, Brasil,
2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,
3Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.
Resumo
A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas de diversas partes das
plantas. Sua composição depende da época, vegetação e local de coleta. Apresenta
diversas atividades biológicas como antimicrobiana, antioxidante, antitumoral, dentre
outras. Foi realizado estudo da variabilidade sazonal, nos meses de fevereiro, junho e
outubro de 2006, dos constituintes voláteis da própolis vermelha de Pernambuco através
da extração por headspace dinâmico e identificação por cromatografia gasosa acoplada
com espectrometria de massas (CG-EM). Foram identificados 34 constituintes voláteis,
sendo monoterpenos e monoterpenóides, sesquiterpenos e sesquiterpenóides,
fenilpropanóides, aldeídos, cetonas e n-alcanos. Os constituintes majoritários foram o
trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. Também foi realizado o perfil
fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD), através da qual os
∗ [email protected] Tel/Fax: (81) 3272 1383
23
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
constituintes fenólicos foram identificados como majoritários. Com o extrato bruto
metanólico da própolis, realizou-se o ensaio de letalidade em Artemia salina, que
demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL, sugerindo uma possível atividade antitumoral.
Unitermos: Própolis vermelha, constituintes voláteis, Artemia salina
Abstract: “Seasonal Variability of Red Propolis Constituents and Brine shrimp
bioassay”. Propolis is a resinous hive product collected by honeybees from plant
sources. The composition of the propolis depends upon the season, vegetation, and the
area of collection. It presents a diverse biological activities such as antimicrobial,
antioxidant and antitumoral. The seasonal variability of the red propolis constituents
from Pernambuco State were accomplished in the months of February, June and
October of 2006. The volatile red propolis constituients were captured by the dynamic
headspace technique and analyzed by GC-MS. In the analysis of the samples, 34
constituents were identified such as the mono and sesquiterpens, phenylpropanoids,
aldehydes, cetons and n-alcanes, presenting as majority constituents the trans anethol,
α-copaene and methyl cis-isoeugenol. The phytochemistry profile was performad by
Thin Layer Chromatography (TLC), throught this technique the majorities constituents
were identified as phenols. The Brine shrimp bioassay were evaluated of the red
propolis methanolic extract, which demonstrated a DL50 of 18,9 µg/mL and a activity
antitumoral was suggesting possible.
Key words: Red propolis, volatile constituents, Artemia salina
Introdução
A própolis é considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas em
fontes naturais, sendo que mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou
24
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
caracterizados em diferentes amostras (Burdock, 1998). As abelhas (Apis mellifera)
usam esta substância para protegê-las contra insetos e microorganismos, empregando-a
em finas camadas nas paredes internas das colméias para vedar buracos e rachaduras,
reparar e fortalecer os favos de mel, proteger a entrada da colméia, no preparo de locais
assépticos para a postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores
(Bankova et al., 2000).
A própolis é coletada por abelhas a partir de diversas partes das plantas como
brotos, botões florais, casca e exsudatos resinosos (Park et al., 1997). As propriedades
biológicas da própolis estão diretamente ligadas a sua composição química e este
possivelmente é o maior problema para o uso da própolis na terapia, tendo em vista que
a sua composição química varia com a flora da região, locais e épocas de coleta, com a
técnica empregada para a produção (tipo de coletores) e com as características genéticas
(gênero e espécie das abelhas). Este conjunto de fatores exerce, portanto, uma enorme
importância nas suas propriedades físicas, químicas e biológicas (Pereira et al., 2002;
Park et al., 1998; Bianchini, 1998).
No Brasil, são descritas propriedades biológicas e composição química distintas
para diferentes amostras coletadas em diferentes partes do país. Essa variação é
facilmente explicada pela grande biodiversidade brasileira (Pereira et al., 2002). Com
relação à variação sazonal, a diminuição em alguns componentes biologicamente ativos,
como no caso dos fenólicos, é acompanhada pelo aumento de outros, por exemplo
ácidos diterpênicos. Deste modo, pode-se esperar que algumas atividades biológicas,
relacionadas a estes compostos (antibacteriana, antifúngica), sejam similares em
diferentes estações do ano (Bankova et al, 1998).
Park et al. (2002) classificaram a própolis brasileira em 12 tipos de acordo com a
região geográfica de origem, composição química e vegetação de onde foi extraída.
25
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Porém, a própolis vermelha, a qual é encontrada sobretudo nas áreas litorâneas das
regiões norte e nordeste, ainda é pouco estudada. O presente trabalho objetiva
caracterizar os constituintes químicos, principalmente os voláteis, da própolis vermelha
de Pernambuco e realizar o biomonitoramento através da avaliação de sua
citotoxicidade sobre Artemia salina Leach.
Material e Métodos
As amostras foram coletadas numa área de restinga, cidade de Goiana-PE
(distrito de Atapuz), nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006, acondicionadas
em recipiente plástico opaco, hermeticamente fechado e conservadas sob refrigeração.
Identificação dos constituintes voláteis
7,5 g de cada uma das amostras de própolis foram submetidos à técnica de
headspace dinâmico por duas horas, utilizando-se como armadilha para a captura dos
voláteis o Porapak-Q® (Divinilbenzeno/Etilvinilbenzeno). Os constituintes voláteis
foram dessorvidos do polímero pela adição de diclorometano, que em seguida foi
eliminado por um jato de nitrogênio. Posteriormente, a análise dos constituintes foi
realizada num cromatógrafo SHIMADZU GC-17A acoplado a um espectômetro de
massas GCMS-QP5050A equipado com uma coluna capilar de sílica fundida DB-5
(95% polidimetilsiloxano e 5% difenil, 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro
externo, 0,25 µm de diâmetro interno). A programação utilizada para injeção e corrida
das amostras foi a seguinte: injetor: 220ºC, detetor: 240ºC, coluna: 60ºC a 240ºC,
3ºC.min-1. O gás de arraste foi hélio com vazão de 1 mL. min-1.
A identificação dos constituintes foi realizada por inspeção visual dos seus
espectros de massas comparando-os com espectros da literatura (Adams, 1995),
26
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
observando principalmente os parâmetros pico do íon molecular e pico base, além de
comparação com espectros de uma biblioteca computacional (Wiley 299) através da
comparação dos índices de Kovats calculados em co-injeção de uma série homóloga de
n-alcanos, com os índices de Kovats encontrados na literatura (Adams, 1995).
Perfil fitoquímico da própolis através da CCD
1,0 g de própolis triturado de cada um dos três meses de coleta foi submetido à
extração metanólica (20 mL). Alíquotas de 10 μl foram analisadas por cromatografia em
camada delgada (placas de gel de sílica Merck - Alemanha, art.105554) para análise da
presença de grupos de metabólitos, empregando-se diversas fases móveis e reveladores
adequados (Harborne, 1984; Wagner; Bladt, 1996; Sena Filho et al., 2006).
Bioensaio de letalidade sobre Artemia salina
O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina Leach foi realizado de acordo
com a metodologia proposta por Meyer (1982). 1g da própolis foi submetido à extração
em metanol por 24 horas sob agitação (EB-MeOH). A partir de 20 mg do extrato seco,
foram preparadas soluções de 1, 3, 10, 30, 100, 300 e 1000 µg/mL, em triplicata, que
foram ressuspensas em clorofórmio (CHCl3) e 0,1mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
Para o teste de letalidade, 10 espécimes do microcrustáceo, com 48 horas de eclosão em
água do mar e água destilada (1:1), foram colocados em cada um dos tubos e em três
tubos controle (CHCl3 + DMSO). Após 24 horas, contou-se o número de mortos e os
resultados obtidos foram tabulados e submetidos à análise de Probitos no software
estatístico SPSS® for Windows 10.0, obtendo-se o valor da DL50, com intervalo de
confiança de 95%.
27
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Resultados e Discussão
Constituintes voláteis
Através da técnica de headspace dinâmico e da análise por CG-EM, foram
identificados 34 constituintes voláteis, considerando as três amostras da própolis
vermelha. A Tabela 1 apresenta os constituintes voláteis identificados de acordo com a
classe química. Pelos resultados, evidencia-se uma composição química em voláteis
bastante variada, destacando-se como constituintes majoritários trans-anetol, α-copaeno
e metil cis isoeugenol. O trans-anetol, bem como o elemicin, foram apresentados em
estudo recente por Marcucci et al. (2006) como componentes majoritários de uma
amostra de própolis vermelha de Maceió-Alagoas, o que nos leva a correlacionar as
origens comuns para esse tipo de própolis. O elemicin foi citado como componente da
própolis pela primeira vez no estudo de Marcucci et al. (2006). Nesse estudo, nas três
amostras de própolis, o fenilpropanóide elemicin foi também identificado. Petri et al.
(1988) classificaram a própolis de clima temperado em dois tipos, conforme o
constituinte volátil majoritário o ß-eudesmol ou o benzoato de benzila. Vários estudos
evidenciaram que a própolis destas regiões origina-se principalmente de botões florais
de plantas da espécie Populus, choupo, (Bankova, 2000). Nos países de clima tropical, a
composição química da própolis é de difícil caracterização, dada a grande diversidade
da flora e por sua composição química diferir bastante da própolis produzida em regiões
de clima temperado.
A variação na composição química em voláteis, entre as três amostras coletadas,
em diferentes épocas do ano, foi pequena, havendo 17 constituintes comuns dentre os
compostos identificados. Contudo, apenas na amostra coletada em outubro foi
evidenciado o sesquiterpenóide δ-cardinol e os sesquiterpenos ß-gurjuneno,
28
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
isocariofileno e δ-cadineno. Os n-alcanos foram identificados na amostra do mês de
junho, assim como o monoterpenóide 1,8 cineol e o sesquiterpeno α-selineno.
No entanto, vale ressaltar que o constituinte majoritário foi o mesmo nas três
amostras, o trans-anetol, e que o percentual deste composto foi relativamente alto,
particularmente na amostra coletada em outubro 52,58%. Também destaca-se nas três
amostras o alto teor de fenilpropanóides, sendo cerca de 66% para a amostra coletada
em outubro. Os constituintes dos óleos essenciais pertencem a dois grupos de
metabólitos originados de rotas biossintéticas diferentes: o grupo dos terpenos, cuja rota
biossintética deriva de unidades de isopreno; e o grupo dos compostos aromáticos,
derivados dos fenil-propanóides e que tem como precursor o ácido chiquímico (Dewick,
2003). A amostra coletada no mês de outubro corresponde a estação após o período das
chuvas no Nordeste, época em que a maioria das espécies vegetais nativas floresce e por
isso a produção de própolis é maior nesta época do ano. Na estação das chuvas, as
abelhas visitam arbustos e subarbustos, enquanto que no período seco as espécies
lenhosas são as principais fontes de néctar, pólen e resina para as abelhas, mostrando
assim uma mudança no pasto apícola e, conseqüentemente, uma variação na
composição química da própolis (Costa, 2005). Ainda nas três amostras estudadas
observa-se grande percentual de sesquiterpenos. Esses compostos, juntamente com
fenilpropanóides, são responsáveis por diversas atividades farmacológicas, com
destaque para o constituinte majoritário trans-anetol, o qual apresenta atividades
comprovadas, tais como: analgésica, anestésica, antigenotóxica, antioxidante, dentre
outras (Nirmala et al., 2005). Este mostrou-se ainda como sendo o principal constituite
do óleo essencial de anis (Pimpinella anisum), dotado de atividade inseticida e
antifúngica (Costa, 2002; Harbone, 1998; Moersdorf, 1966; Shukla, 1987). Essas e
29
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
outras atividades atribuídas aos demais constituintes indicam um bom potencial
farmacológico para a própolis em estudo.
Tabela 1. Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha de Pernambuco (% do íon corrente total)
Fev Jun Out Composto IK* IK**
% área
Hidrocarbonetos monoterpênicos 4,11 5,26 0,90
p-cimeno 1026 1026 0,60 0,52 --
Limoneno 1031 1031 3,51 4,74 0,90
Monoterpenos oxigenados 1,52 3,17 1,22
1,8-cineol -- 1034 -- 0,39 --
Linalool 1098 1099 1,52 2,78 1,22
Hidrocarbonetos sesquiterpênicos 32,00 17,08 20,96
α-cubebeno 1351 1355 1,17 0,33 2,49
α-copaeno 1376 1382 14,70 5,97 7,27
β-gurjuneno 1409 1417 -- -- 0,34
β-cariofileno 1418 1420 0,85 3,45 1,48
α-bergamoteno 1436 1440 0,51 0,88 0,49
Farneseno -- 1420 7,54 1,82 1,16
trans-β-farneseno -- 1458 0,58 -- 1,02
D-Germacreno 1480 1482 0,65 - --
α-selineno 1494 1503 -- 0,41 --
Isocarofileno -- 1502 -- -- 0,33
β-bisaboleno 1509 1513 6,00 2,39 5,29
δ-cadineno -- 1530 -- -- 1,09
cadineno 1538 1530 -- 1,83 --
Sesquiterpenos oxigenados -- -- 0,32
δ-cadinol -- 1500 -- -- 0,32
30
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Hidrocarbonetos aromaticos -- -- 0,48
Naftaleno -- 1186 -- -- 0,48
Álcoois, aldeídos e cetonas 20,48 6,00 9,09
4-hiroxi-4-metil -heptan-2-ona -- 851 14,42 -- 0,41
6-metil-5-hepten-2-ona 985 985 1,00 1,01 --
Octanal 1001 1001 0,50 0,58 0,78
Nonanal 1102 1103 1,52 1,90 2,46
n-Decanal 1204 1205 1,14 1,31 4,49
anisaldeido 1252 1255 1,20 1,20 0,95
n-Dodecanal 1417 1409 0,70 -- --
Hidrocarbonetos alifáticos -- 1,84 --
Tetradecano -- 1399 -- 0,55 --
Pentadecano 1500 1499 -- 0,85 --
hexadecano 1600 1598 -- 0,44 --
Fenil propanoides 37,10 65,92 66,32
Estragol -- 1200 3,62 6,16 3,61
trans-anetol 1283 1288 25,58 48,05 52,58
Metil-cis isoeugenol 1402 1404 5,61 8,18 7,38
trans-metil isoeugenol 1447 1497 0,83 1,35 1,16
Elemicin 1554 1555 1,46 2,18 1,59
Não identificados 4,79 0,73 1,19
IK* (Índice de Kovats calculado) IK** (Índice de Kovats da literatura)
Análise Fitoquímica
A cromatografia em camada delgada mostrou um mesmo perfil fitoquímico para
a própolis entre os meses de coleta. Os metabólitos secundários majoritários da própolis
foram os derivados fenólicos (flavonóides, antraquinonas) e terpenos (monoterpenos,
31
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
sesquiterpenos, triterpenos e esteróides), além da presença de açúcares. Não foi
detectada a presença de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados
cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e
leucoantocianidinas. Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina,
também não foram detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis
(Pietra et al., 2002; Salatino et al., 2005). Porém, há uma grande controvérsia em
relação ao teor de flavonóides nas amostras brasileiras (Pereira et al., 2002). Bankova et
al. (1995) concluíram que as própolis brasileiras têm uma baixa concentração de
flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos, possuindo altas concentrações de ácido
dihidroxicinâmico, acetofenonas preniladas e alguns terpenóides específicos. Ainda
Bankova et al. (2000) citam que em alguns casos os flavonóides são importantes
componentes presentes na própolis brasileira. Aga et al. (1994) determinam os
compostos prenilados como os maiores constituintes da própolis brasileira e relatam que
a atividade antibacteriana destes compostos pode ser aumentada com o aumento do
número de resíduos prenil na molécula, como citado por Marcucci et al. (2001).
Bioensaio com Artemia salina Leach
No ensaio de toxicidade sobre Artemia salina, o extrato bruto metanólico da
própolis apresentou DL50 igual a 18,9 µg/mL, com intervalo de confiança a 95% entre
14,6 - 24,8 µg/mL. Este resultado sugere uma atividade antitumoral, devido a DL50 ser
menor que 1000 µg/mL, dosagem letal máxima para uma substância ser considerada
ativa, além de uma correlação estatística entre a DL50 e a atividade antitumoral
(McLaughlin, 1993). Banskota et al. (1998) demonstraram que o extrato metanólico de
uma amostra de própolis possui uma citotoxicidade considerável contra células de
32
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
tumor de cólon, devido ao seu conteúdo de compostos fenólicos. Testes in vitro têm
demonstrado atividade antitumoral da própolis tanto citostática quanto citotóxica.
Conclusão
A composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha do Estado
de Pernambuco mostrou-se variada, destacando-se como constituintes majoritários o
trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. A própolis apresenta como
constituintes majoritários os compostos fenólicos, do tipo flavónoides, antraquinonas e
fenóis. Estas substâncias na própolis são representadas pelas agliconas de flavonóides,
ácidos fenólicos e seus ésteres, os quais são responsáveis pela grande variedade das
propriedades biológicas (Banskota et al., 1998; Burdock, 1998; Koo & Park, 1997;
Banskota et al., 2000).
O bioensaio de letalidade em Artemia salina sugere uma promissora atividade
antitumoral para esta própolis a partir de seu conteúdo em compostos fenólicos
confirmado. Dessa maneira, a expansão da indústria de própolis vermelha só será
possível, de forma segura, com a padronização da matéria-prima e dos produtos
acabados, levando-se em conta a diversidade da vegetação regional, a atividade de
coleta das diferentes variedades de abelhas e com o estabelecimento da eficácia e
segurança dos produtos obtidos.
Agradecimento(s)
A CAPES a ao CNPq pelo apoio financeiro e a Mel Brasil pelas amostras de própolis.
Referências Bibliográficas
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35
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CAPÍTULO 3
INFLUÊNCIA DA VARIAÇÃO SAZONAL NA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE E FENÓIS TOTAIS DE EXTRATOS DE
PRÓPOLIS VERMELHA
(Artigo a ser submetido à Revista LWT)
36
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Influência da variação sazonal na atividade antioxidante e fenóis totais de
extratos de própolis vermelha
Alexandre Bezerra Galindoa, Sarah Rodrigues Lustosaa, Mariana Trycia Brasileiroa,
Amanda Alencar do Egitoa, Jeckson Luiz da Silvaa, Karina Perrelli Randaub, Lívio
César Cunha Nunesc, Pedro José Rolim Netoa∗
aLaboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,
bLaboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,
cNúcleo de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal do Piauí, 60400-000,
Teresina, PI, Brasil.
Resumo
Recentemente, tem crescido consideravelmente o interesse pela descoberta de
antioxidantes de ocorrência natural para uso em alimentos ou produtos medicinais, em
substituição aos antioxidantes sintéticos. A própolis tem sido objeto de estudos
farmacológicos devido às suas propriedades biológicas, dentre elas a antioxidante. Neste
trabalho avaliou-se a influência da sazonalidade na atividade antioxidante e teor de
fenóis de extratos etanólicos de própolis vermelha, bem como se estabeleceu a
correlação entre ambos, sendo a capacidade antioxidante avaliada por diferentes
métodos (DPPH, H2O2 e atividade antioxidante total). Os resultados demonstraram que
a própolis vermelha analisada possui atividade antioxidante, comprovada pelos
37
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
diferentes métodos, e que tal atividade está relacionada ao seu teor de compostos
fenólicos, bem como à época de sua coleta.
Palavras-chave: própolis vermelha, fenóis totais, atividade antioxidante
Abstract
Recently, the discovery interest for natural antioxidant substances growing increasingly
for the use of the medicinal and foods products, in substitution to synthetic antioxidant
substances.The propolis have been object of pharmacologyc studies due its biological
activity, amongst the antioxidant properties. In this work it was evaluated the
sazonalidade influence in the antioxidant activity and total phenolic content of red
própolis ethanolic extratcts, as well as if it established the correlation between both,
being the antioxidant capacity evaluated by different methods (DPPH, H2O2 and total
antioxidant activity). The results had demonstrated that the red propolis analyzed
possess antioxidant activity, demonstrate for the different methods. This activity is
related with total phenolic content, as well as, on the time of its collection.
Key words: red propolis, total phenols, antioxidant activity
1. Introdução
Espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas continuamente nas células
como conseqüência tanto de reações bioquímicas oxidativas como de fatores externos
(RUSSO et al., 2002). Estas incluem radicais livres, como o ânion superóxido (O2-) e o
radical hidroxil (–OH), e espécies não-radicais livres, como o H2O2 e o oxigênio singleto
(1O2) (Gülcin et al., 2005; Kumar et al., 2005; Ardestani & Yazdanparast, 2006).
O estresse oxidativo, induzido por radicais de oxigênio, provoca danos em
biomoléculas essenciais como carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídios, ácidos
38
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
nucléicos, entre outra substâncias oxidáveis (Nagai et al., 2001; Melo et al., 2006;
Ardestani & Yazdanparast, 2006; Sharififar et al., 2006), contribuindo, então, para o
envelhecimento e a instalação de doenças crônico-degenerativas, como câncer, doenças
cardiovasculares, artrite, úlcera gástrica, entre outras (Melo et al., 2006; Siddhuraju,
2007; Stratil et al., 2007; Kumaran & Karukumaran, 2007).
Nos seres vivos, a produção de radicais livres é controlada por diversos
compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena, como, por exemplo, as
enzimas antioxidativas (superóxido dismutase, catalase, glutation peroxidase, entre
outras), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes (por exemplo,
tocoferóis, ácido ascórbico, polifenóis, selênio e carotenóides) (Sousa et al., 2007;
Ardestani & Yazdanparast, 2006; Zhenbao et al., 2007).
De uma forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes
em concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável, retardam
significativamente ou inibem a oxidação do substrato (Sousa et al., 2007). Eles podem
agir através de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e
complexação de metais (Duarte-Almeida, 2007).
Recentemente, tem crescido consideravelmente o interesse pela descoberta de
antioxidantes de ocorrência natural para uso em alimentos ou produtos medicinais, em
substituição aos antioxidantes sintéticos, os quais estão sendo restritos devido aos seus
efeitos carcinogênicos (Kumaran & Karukumaran, 2007).
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os
compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos (Siddhuraju, 2006;
Stratil et al., 2006). Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais
livres e algumas vezes como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação
como na propagação do processo oxidativo (Soares, 2002, Duarte-Almeida et al., 2006).
39
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico
coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além
desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al.,
2002; Franco et al., 2000). Sua composição é bastante variada e já foram identificados
mais de 300 constituintes (Cunha et al., 2004; Silici & Kutluca, 2005), dentre eles
podemos citar ácidos graxos e fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis),
terpenos, esteróides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, entre outros
(Marcucci et al., 2001). Contudo, a proporção dessas substâncias varia e depende do
local e da época da coleta (Da Silva et al., 2005).
A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas
propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora,
antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras (Bankova, 2005; Kosalec et
al., 2005; Alencar et al., 2005). Esse potencial biológico se deve a um sinergismo que
ocorre entre os muitos constituintes (Marcucci, 1996).
Vários autores relatam que algumas das propriedades biológicas,
particularmente a atividade antioxidante, em extratos etanólicos de própolis, se deve em
parte ao seu alto conteúdo de flavonóides (Adelmann, 2005). Embora estudos com
extratos etanólicos de própolis sejam mais comuns, é relatado que o extrato aquoso da
própolis possui uma boa atividade antioxidante, associada ao alto teor de compostos
fenólicos (Mani et al., 2006).
Existe uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade
anti-radicais livres em extratos de própolis da Argentina (Ahn et al., 2007). Da Silva et
al. (2006) sugerem que os flavonóides desempenham importante papel na atividade
antioxidante de extratos de própolis brasileira, mas outros fatores poderiam estar
envolvidos (Choi et al., 2006).
40
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Há vários estudos comparativos da atividade antioxidante de própolis de
diferentes origens geográficas, como Japão, China, Brasil e Estados Unidos. Porém, há
poucos estudos relacionando a atividade antioxidante da própolis com seus constituintes
químicos (Kwmazawa et al., 2004), bem como estudos que relatem atividades
biológicas, dentre elas a antioxidante, da própolis vermelha.
Paralelamente ao crescimento do interesse por antioxidantes de origem natural,
há um aumento no uso de métodos para estimar a eficiência de substâncias como
antioxidante (Molyneux, 2004). Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a
atividade antioxidante in vitro (Duarte-Almeida et al., 2006), porém, apesar da
diversidade de métodos, não existe um procedimento metodológico universal (Melo et
al., 2006).
A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio de
uma variedade de técnicas, porém a que utiliza o reagente Folin-Ciocalteau é a mais
comumente empregada (Sousa et al., 2007; Stratil et al., 2006).
Este trabalho objetivou avaliar a influência da sazonalidade na atividade
antioxidante e teor de fenóis de extratos etanólicos de própolis vermelha, bem como
estabelecer a correlação entre teor de fenóis e a capacidade antioxidante, sendo esta
avaliada por diferentes métodos.
2. Materiais e métodos
2.1. Preparação dos extratos
Foram preparados extratos etanólicos de própolis vermelha (EEP) a 20% (m/v)
de três amostras do apiário da região de Goiana, PE, Brasil, coletadas nos meses de
fevereiro, junho e outubro de 2006. Realizou-se maceração durante 48 h em soluções
41
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
hidroalcoólicas a 70%, 80% e 90%. Após esse tempo, os extratos foram filtrados e
acondicionados em frasco de vidro âmbar.
2.2. Determinação dos fenóis totais
Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância de referência o
ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de ácido tânico a
100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e adicionados 5 mL
de Folin-Ciocalteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de solução de carbonato
de sódio 15% e o volume foi completado com água destilada. As soluções foram
deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As amostras foram
preparadas utilizando 3 mL dos extratos hidroalcoólicos de própolis a 2 mg/mL
(referentes aos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006). O branco do sistema foi
preparado da mesma forma, sem a alíquota da amostra.
2.3. Atividade antioxidante
2.3.1. Análise qualitativa
Os extratos de própolis (hexânico, clorofórmico, metanólico e hidroalcoólicos a
20% m/v) foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD), usando
rutina como padrão positivo. As placas foram eluídas em AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O
(100:0.2:0.2:0.2v/v) e AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O (100:0.3:0.3:0.3 v/v) (Wagner &
Bladt, 1996) e, após secagem, foram nebulizadas com solução a 0,4 mM do radical
DPPH em MeOH. As placas foram observadas até o aparecimento de manchas amarelas
sob fundo de coloração púrpura, indicativa de possível atividade antioxidante (Soler-
Rivas et al., 2000).
42
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
2.3.2. Método do radical livre DPPH• (1,1-difenil-2-picrilhidrazil)
Foi preparada uma solução estoque de DPPH em metanol na concentração de 0,4
mM. A partir desta, foram feitas diluições de 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 e 0.0125 mM. A
curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a 517 nm de todas
as soluções.
Alíquotas (0,6 mL) das soluções metanólicas de própolis, preparadas a partir dos
extratos hidroalcoólicos a 90%, com concentrações totais de própolis de 25, 50 e 100
μg/mL, foram colocadas em diferentes tubos de ensaio. Em seguida, 5,4 mL da solução
de DPPH em metanol (0,05 mM) foram adicionados e, após agitação, os tubos foram
deixados em repouso ao abrigo da luz. Ao final de 15, 30, 45 e 60 min, a absorbância foi
medida a 517 nm e a capacidade de seqüestrar o radical, expressa como percentual de
inibição, calculada de acordo com a seguinte equação matemática:
% inibição = Abs controle – Abs da amostra x 100 Abs controle
Onde: Abs controle = absorbância do controle (solução de DPPH sem antioxidante)
Abs amostra = absorbância da amostra a ser testada
O mesmo procedimento foi realizado empregando-se soluções metanólicas de
padrão rutina, nas concentrações de 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 e 200.0 μg/mL, para a
construção de uma curva padrão (Melo et al., 2006).
2.3.3. Determinação da capacidade antioxidante total
A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pelo método do
fosfomolibdênio, descrito por Prieto, Pineda e Aguilar (1999). O ensaio baseia-se na
redução do Mo(VI) – Mo(V) pelo extrato e subseqüente formação do complexo verde
de fosfato/Mo(V). A 0,6 mL das soluções metanólicas (25, 50 e 100 μg/mL) foram
adicionados 6 mL da solução reagente (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e
43
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
molibdato de amônio 4 mM). Os tubos contendo a solução reacional foram incubados a
95oC por 90 minutos. Em seguida, a absorbância da solução foi medida a 695 nm,
usando como branco uma solução contendo metanol no lugar do extrato. A atividade
antioxidante foi expressa em atividade antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR%),
dada pela fórmula (Kumaran & Karukumaran, 2007):
AAR% = Abs (amostra) – Abs (branco) x 100 Abs (rutina) – Abs (branco)
2.3.4. Método do Peróxido de Hidrogênio
Uma solução (4 mM) de peróxido de hidrogênio foi preparada em tampão
fosfato (pH 7,4). A concentração de peróxido de hidrogênio foi determinada
espectrofotometricamente no comprimento de onda de 230 nm, usando absortividade
molar de 81 (mol/L)-1 cm-1 (Yen & Chen, 1995). Às soluções metanólicas de própolis
(25, 50 e 100 μg/mL), adicionou-se a solução de peróxido de hidrogênio (0,6 mL).
Após 10 minutos de reação, à temperatura ambiente (25ºC), realizou-se leitura em
espectrofotômetro, em comprimento de onda de 230 nm, contra solução branco
contendo o extrato em tampão sem peróxido de hidrogênio. A atividade antioxidante foi
expressa em percentual conforme a seguinte fórmula:
(%) = 1 – (Abs da amostra – Abs branco) x 100 Abs controle
2.3.5. Análise estatística
Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados são apresentados
como média ± desvio padrão (DP). O teste t, a análise de variância (ANOVA) e o teste
de Tukey foram utilizados para a análise estatística. Valores de p≤0,05 foram
considerados como indicativos de significância.
44
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
3. Resultados e Discussão
3.1. Determinação dos fenóis totais
O índice de fenóis totais foi determinado pelo método de Folin & Ciocalteau
(1927). O reagente consiste da mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico,
no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+, porém, em
presença de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os
chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação
dos metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a determinação da concentração das
substâncias a 765 nm (Kuskoski et al., 2006; Sousa et al., 2007).
O teor de fenóis totais, bem como a variação entre as amostras analisadas,
encontram-se na Tabela 1. Observou-se que o índice de fenóis foi maior para extratos
etanólicos a 90%. No que se refere à sazonalidade das amostras analisadas, o teor de
fenóis foi crescente na seguinte ordem: fevereiro < junho < outubro.
Tabela 1 Teor de fenóis totais das amostras de própolis coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006
Amostras Extrato etanólico *Fenóis totais (%)±DP
70% 7,116 ± 0,053 80% 7,613 ± 0,042 Fevereiro/06 90% 8,440 ± 0,034 70% 9,095 ± 0,053 80% 8,039 ± 0,069 Junho/06 90% 9,315 ± 0,099 70% 13,334 ± 0,077 80% 13,617 ± 0,117 Outubro/06 90% 13,476 ± 0,113
*Média ± DP, n = 3
3.2. Análise qualitativa
A avaliação preliminar qualitativa dos extratos por CCD, revelada com solução
metanólica a 0,4 mM de DPPH, revelou a existência de substâncias com atividade
45
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
antioxidante, evidenciadas pela presença de manchas amarelas sobre fundo púrpuro,
resultantes da redução do radical DPPH. Porém, para os extratos etanólicos a 90%, a
existência de substâncias com atividade antioxidante ficou mais evidente. Por isso,
levando-se também em consideração o teor de fenóis totais, esses extratos foram eleitos
para dar continuidade ao estudo.
3.3. Método do radical livre DPPH
Entre os métodos químicos aplicados para determinar a capacidade antioxidante
de um composto em capturar radicais livres, o método DPPH (1,1,-difenil-2-
picrilhidrazil) é um dos mais utilizados por ser considerado prático, rápido e estável
(Kuskoski et al., 2006).
A equação da curva de calibração do DPPH foi A = 10,489C + 0,0053, onde A é
a absorbância no comprimento de onda de 517 nm e C corresponde à concentração de
DPPH, e o coeficiente de correlação R2 = 0,9999.
As amostras testadas foram obtidas a partir dos extratos hidroalcoólicos a 90%,
visto que foram os que apresentaram o maior teor de fenóis totais, procedendo-se da
mesma forma para os demais testes.
A capacidade de seqüestrar o radical DPPH, expressa em % de inibição exibida
pelos extratos e padrão rutina nas concentrações de 25, 50 e 100 µg/mL e no intervalo
de tempo entre 0-60 min, encontra-se na Tabela 2.
Todas as amostras de própolis apresentaram atividade seqüestradora do radical
DPPH e essa atividade foi crescente à medida que se aumentou a concentração da
amostra, conforme pode ser observado nas Figuras 1, 2 e 3. Além disso, a amostra de
própolis referente ao mês de outubro/06, a qual apresentou o maior teor de fenóis,
demonstrou também maior atividade seqüestradora do radical DPPH.
46
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Tabela 2 Capacidade de seqüestrar o radical DPPH (% de inibição)
15 min 30 min 45 min 60 min Amostras [ ] de 25 µg/mL* Rutina 37,48a±0,50 39,74a±0,78 41,62a±0,91 43,29a±1,15
Própolis outubro/06 30,50b±1,02 31,48b±0,94 33,31b±2,51 33,71b±2,52 Própolis junho/06 27,36c±1,08 25,86bc±1,44 29,24b±2,49 29,58b±2,29
Própolis fevereiro/06 20,86d±0,46 22,20c±1,48 22,96c±1,28 22,74c±1,82 [ ] de 50 µg/mL*
Rutina 58,99a±0,98 62,75a±2,01 65,26a±0,95 66,94a±1,65 Própolis outubro/06 38,73b±1,66 39,50b±0,70 41,66b±2,65 41,60b±1,09 Própolis junho/06 31,97b±0,89 34,51c±1,69 35,31c±1,80 35,30c±0,57
Própolis fevereiro/06 27,41d±1,02 28,17d±1,29 29,15d±2,16 29,22d±1,79 [ ] de 100 µg/mL*
Rutina 81,80a±1,03 84,07a±1,52 84,31a±1,22 84,52a±1,33 Própolis outubro/06 46,76b±2,62 49,24b±2,99 49,24b±3,14 52,67b±3,13 Própolis junho/06 42,22b±0,77 43,96b±0,26 43,96b±0,48 46,46bc±1,07
Própolis fevereiro/06 41,50b±3,70 43,45b±3,46 43,45b±3,54 45,68c±3,58 *Média ± DP, n=3; letras iguais, na mesma coluna e numa mesma concentração, indicam que, no nível de 5%, não há diferença estatisticamente significativa entre as respectivas médias pelo teste de Tukey.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
15 30 45 60Tempo (min)
% In
ibiç
ão
25µg/ml 50µg/ml 100µg/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
15 30 45 60Tempo (min)
% In
ibiç
ão
25µg/ml 50µg/ml 100µg/ml
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
15 30 45 60Tempo (min)
% In
ibiç
ão
25µg/ml 50µg/ml 100µg/ml
Figura 2. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de junho de 2006 em função do tempo.
Figura 1. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de fevereiro de 2006 em função do tempo.
Figura 3. Porcentagem de inibição do radical DPPH pelo extrato etanólico de própolis referente ao mês de outubro de 2006 em função do tempo.
47
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Segundo alguns autores, o tempo de medida de reação entre o radical e a amostra
de 30 minutos é suficiente, embora outros autores determinem 20 minutos (Kuskoski et
al., 2006). Avaliamos os intervalos de 15, 30, 45 60 minutos de reação, porém a análise
estatística revela que não há diferenças significativas entre as determinações efetuadas
nos diferentes intervalos de tempo para uma mesma concentração de amostra.
3.4. Determinação da capacidade antioxidante total
O método fosfomolibdênio é baseado na redução do Mo(VI) para Mo(V), pelo
composto antioxidante, e formação do complexo verde fosfato/Mo(V), o qual tem
absorção máxima a 695 nm (Kumaran & Karukumaran, 2007).
A atividade antioxidante total das soluções metanólicas de própolis a 25, 50 e
100 µg/mL é mostrada na Tabela 3. Os resultados estão expressos em atividade
antioxidante relativa ao padrão rutina (AAR% rutina). O estudo revelou que a atividade
antioxidante é maior para a própolis referente ao mês de outubro/06 (3ª coleta) e que seu
aumento ocorre concomitantemente com o aumento da concentração das amostras.
Tabela 3 Atividade antioxidante total dos extratos metanólicos de própolis em AAR% rutina
Amostras AAR% rutina ± DP* Própolis fevereiro/06
25 µg/ml 19,27±3,36 50 µg/ml 27,72±2,37 100 µg/ml 39,72±2,16
Própolis junho/06 25 µg/ml 28,44±3,64 50 µg/ml 32,78±1,79 100 µg/ml 40,83±2,63
Própolis outubro/06 25 µg/ml 38,34±4,58 50 µg/ml 44,36±2,13 100 µg/ml 55,41±2,83
*Média ± DP, n=3
48
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
3.5. Método do Peróxido de Hidrogênio
A capacidade de inibir o efeito oxidativo do H2O2 também demonstrou ser maior
com o aumento da concentração dos extratos de própolis (Tabela 4). Neste método, a
própolis referente ao mês de outubro/06 também apresentou maior atividade
antioxidante. Apesar de, numericamente, a atividade antioxidante ter sido mais elevada
neste método, tal resultado não pode ser comparado aos demais, visto que não há um
procedimento metodológico universal para se avaliar a capacidade antioxidante, pois
cada um deles avalia um mecanismo de ação diferente.
Tabela 4 Atividade antioxidante pelo método do peróxido de hidrogênio
Amostras Atividade antioxidante (%) ± DP* Própolis fevereiro/06
25 µg/ml 53,12±2,19 50 µg/ml 56,23±1,57 100 µg/ml 59,81±1,82
Própolis junho/06 25 µg/ml 64,48±1,96 50 µg/ml 67,58±1,80 100 µg/ml 69,52±1,16
Própolis outubro/06 25 µg/ml 71,41±1,26 50µg/ml 74,65±1,75
100 µg/ml 75,50±1,15 *Média ± DP, n=3
4. Conclusão
Os resultados demonstraram que o teor de fenóis totais varia com a sazonalidade
e concentração da solução hidroalcoólica empregada na extração, sendo maior para
extratos hidroalcoólicos a 90% e para a própolis referente ao mês de outubro de 2006.
Esta mesma amostra apresentou maior capacidade antioxidante em todos os métodos
empregados, levando à correlação entre a atividade antioxidante, o teor de fenóis totais
e a sazonalidade.
49
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Portanto, conclui-se que a própolis vermelha analisada possui atividade
antioxidante, comprovada por diferentes métodos, e que tal atividade pode ser
relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem como à época de sua coleta.
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54
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CAPÍTULO 4
PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
CICATRIZANTE DA PRÓPOLIS VERMELHA EM LESÕES
PROVOCADAS EM DORSO DE RATOS
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Perfil fitoquímico e avaliação da atividade cicatrizante da própolis
vermelha em lesões provocadas em dorso de ratos
Introdução
A capacidade auto-regenerativa é um fenômeno universal nos organismos vivos.
Nos organismos unicelulares, está restrita à presença de enzimas responsáveis pela
regeneração de elementos estruturais e de moléculas de alta complexidade. Em
organismos superiores, além destes, também ocorre o reparo de tecidos que pode se dar
de duas formas: pela regeneração com a reposição da atividade funcional do tecido ou
pela cicatrização com restabelecimento da hemostasia do tecido com perda da sua
atividade funcional pela formação de cicatriz fibrótica (BALBINO et al., 2005).
A cicatrização constitui um processo biológico complexo e dinâmico de
restauração de estruturas celulares e camadas teciduais (AQUINO et al., 2006; GOMES
et al., 2006), envolvendo fenômenos bioquímicos e fisiológicos que se comportam de
forma harmoniosa a fim de garantir a restauração tissular (MANDELBAUM et al.,
2003). Tem início a partir da perda de integridade da pele, gerando uma solução de
continuidade que atinge os planos subjacentes em diversos graus (MARTINS et al.,
2003). Fatores ambientais e fisiológicos exercem grande impacto na evolução da
cicatrização, podendo exercer influência na qualidade da cicatriz, no tempo de
cicatrização e na presença ou não de complicações (BIONDO-SIMÕES et al., 2006).
Diferentes classificações didáticas são utilizadas para facilitar o entendimento de
um processo totalmente dinâmico e com fases interdependentes como a cicatrização
(MANDELBAUM et al., 2003). Existem autores que consideram três (GOMES et al.,
2006) ou quatro estágios (MARTINS et al., 2003). Outros autores classificam de uma
forma mais completa dividindo o processo em cinco fases principais: coagulação,
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
inflamação, proliferação, contração da ferida e remodelação (MANDELBAUM et al.,
2003).
Na cicatrização por segunda intenção, o tecido de granulação, formado pela
proliferação de fibroblastos e capilares, constitui barreira contra infecção, superfície
para migração do epitélio e tem papel na contração da ferida (RAHAL et al., 2001).
Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, biologia molecular e
biologia industrial, parte dos fármacos empregados na cicatrização permanece sendo
obtida de matérias-primas naturais (AQUINO et al., 2006). Por isso, a descoberta de
substâncias que possam modelar a resposta à agressão tecidual tem sido objeto de
pesquisas (BATISTA et al., 2006), havendo, atualmente, um crescente interesse em
produtos medicinais naturais (RAHAL et al., 2001).
A própolis é um complexo resinoso formado pela mistura de substâncias
retiradas de botões de flores de árvores ou cascas de árvores com substâncias do próprio
organismo da abelha. Sua composição química varia de acordo com o local da coleta e
com a vegetação nativa no qual o apiário está instalado (WOISKY & SALATINO,
1998; BURDOCK, 1998; FRANCO et al., 2000) e inclui flavonóides (como a
galangina, quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres,
aldeídos e cetonas, terpenóides e fenilpropanóides (como os ácidos caféico e
clorogênico), esteróides, aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e
vários outros compostos em pequenas quantidades (HU et al., 2005; HAYACIBARA et
al., 2005; OZKUL et al., 2004; MATSUDA et al., 2002; ROCHA et al., 2003).
A utilização medicinal da própolis na cicatrização foi descrita primeiramente
pelos gregos, especialmente Aristóteles, Dioscorides e Hipócrates. Romanos, como
Plínio e Galeno, também descreveram esse uso medicinal (FUNARI et al., 2007). Na
África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada devido às
57
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
suas propriedades cicatrizantes e na Segunda Guerra Mundial foi empregada em várias
clínicas soviéticas (PEREIRA et al., 2002).
As propriedades de regeneração tecidual, como cicatrização de úlceras, feridas
hepatoproteção, possivelmente estão relacionadas com a atividade antioxidante da
própolis. Quando os radicais livres são produzidos, dificultam ou mesmo impedem que
ocorra a regeneração das células no local. A remoção dos mesmos pelos flavonóides da
própolis permitiria que o órgão ou tecido doente pudesse se regenerar normalmente
(MENEZES, 2005; LIMA, 2006).
Em estudos histológicos do processo de cicatrização, os resultados preliminares
indicaram uma aparente mudança na atividade celular nos tecidos que passaram por
tratamento com extrato etanólico de própolis (EEP) com aumento visual no número de
fibroblastos e colágeno em relação aos tecidos de grupos controle observados (LIMA,
2006).
Em estudo, no qual foi comparada a propriedade cicatrizante de um creme de
própolis com um creme de sulfadiazina de prata, foi demonstrado que os ferimentos
tratados com própolis apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização do que
aqueles tratados com sulfadiazina de prata (GREGORY et al., 2002).
Este trabalho teve como objetivos realizar o perfil fitoquímico da própolis
vermelha, quantificar seu teor de flavonóides e avaliar in vivo a atividade cicatrizante do
extrato hidroalcoólico de própolis vermelha, veiculado num creme, no reparo de
ferimentos (queimaduras) com perda de substância tecidual e cicatrização por segunda
intenção em dorso de ratos.
58
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Parte Experimental
Preparação do extrato
Foi preparado extrato etanólico de própolis vermelha (EEP) a 20% (m/v) de
amostra do apiário da região de Goiana-PE, Brasil. Realizou-se maceração durante 48 h
em solução hidroalcoólica a 70%. Após esse tempo, o extrato foi filtrado e
acondicionado em frasco de vidro âmbar.
Perfil fitoquímico através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Alíquotas de 5µL dos EEPs a 70% foram submetidas à CCD (cromatoplacas de
gel de sílica Merck-Alemanha), empregando-se diversas fases móveis: A [AcOEt-
HCOOH-AcOH- H2O (100:11:11:27v/v)]; B [B-Benzene–AcOEt (97: 3 v/v)]; C
[AcOEt-HCOOH-AcOH- H2O (100:0,5:0,5:0,5v/v) ]; D [n-BuOH-Me2CO- Tampão
fosfato pH= 5,0 (40:50:10v/v)], E [Éter-tolueno-AcOH 10% (50:50:50 v/v)] e
reveladores adequados. Também foram utilizados padrões de flavonóides.
Teor de Flavonóides Totais
O teor de flavonóides foi determinado segundo metodologia descrita por Funari
& Ferro (2006) para doseamento de flavonóides em própolis. Inicialmente, uma curva-
padrão com quercetina di-hidratada, tomada como substância de referência, foi
construída. Alíquotas de 2 a 6 mL de solução etanólica de quercetina, a 50 µg/mL,
foram transferidas para balões volumétricos de 25 mL, contendo 1 mL de solução de
cloreto de alumínio a 5,0%. O volume final de cada balão foi ajustado com etanol.
Como branco do sistema, 1 mL da solução aquosa de cloreto de alumínio diluído em
balão de 25 mL foi utilizada. Decorridos 30 min, foi tomada a leitura de cada solução a
59
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
425 nm, em espectrofotômetro. Para a quantificação de flavonóides na amostra, foram
utilizados 2 mL de solução de própolis.
Obtenção do creme
Para veiculação do extrato, foi preparada uma emulsão a frio, conforme
formulação descrita na Tabela 1. O Permulen (TR-1) foi disperso em óleo mineral. Em
seguida, acrescentou-se o novemer (EC-1) até homogeneização. Em outro recipiente,
dissolveu-se o silense em água destilada e esta mistura foi adicionada a anterior.
Procedeu-se agitação até completa homogeneização. Por último, adicionaram-se os
conservantes, previamente dissolvidos em álcool, e o extrato de própolis.
Tabela 1. Formulação da emulsão a frio Componentes Quantidade (%)
Permulen (TR-1) 0,4 Novemer (EC-1) 2,0 Silsense (DW-18) 1,0 Óleo mineral 4,0 Nipagim 0,15 Nipazol 0,05 Extrato de própolis 15,0 Água destilada q.s.p. 100
Estudo de cicatrização in vivo
O estudo de cicatrização in vivo foi realizado com ratos Wistar (Ratus
norvegicus) machos adultos, com idade de 2-3 meses e peso de 180-250 g, os quais
foram mantidos durante o período experimental em gaiolas plásticas (polipropileno),
forradas com maravalha trocada a cada dois dias.
Os animais foram divididos em três grupos de cinco animais cada, conforme
descrito no Quadro 1. Após marcados e pesados, todos foram anestesiados com 0,2
mL, para cada 100 g de peso corpóreo, de uma mistura de 1:1 dos anestésicos ketamina
60
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
a 5% e xilazina a 2%. A administração da solução anestésica foi realizada por via
intraperitoneal, sendo utilizadas para isso agulhas de insulina e seringas de 1,0 mL.
Quadro 1. Grupos de animais e esquemas de tratamento para o estudo de cicatrização
Grupo I (controle negativo)
Animais tratados dermatologicamente com placebo (creme sem extrato de própolis)
Grupo II (controle positivo)
Animais tratados dermatologicamente com D-pantenol
Grupo III (teste)
Animais tratados dermatologicamente com creme à base de extrato de própolis
Em seguida, procedeu-se a tricotomia do dorso dos animais, os quais foram
postos em decúbito dorsal sobre mesa operatória com campo cirúrgico estéril, para a
realização da assepsia do dorso com álcool iodado a 0,3%.
Figura 1. Cauterização com ponta esférica de bisturi elétrico
Posteriormente, foram realizadas as cauterizações (queimaduras), utilizando-se,
para este fim, a ponta esférica de um bisturi elétrico, o qual proporcionou um dano
tecidual cutâneo (queimadura de 3º grau) de 0,3cm de diâmetro e uma profundidade que
atingiu os tecidos subcutâneos, porém preservando a fascia muscular da região,
conforme descrito por Martorelli (2006).
O tratamento dos animais foi realizado conforme determinado para cada grupo.
As aplicações (controle positivo, controle negativo ou amostra teste) foram realizadas
com uma posologia padrão, por via tópica, e realizada a cada 24 horas durante 14 dias.
No 3º, 7º e 14º dias de tratamento, os animais foram sedados para que fossem realizadas
61
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
fotografias da região do ferimento e para a análise macroscópica das fases de
cicatrização.
As avaliações macroscópicas das feridas foram realizadas em todos os animais,
sendo os critérios de avaliação previamente estabelecidos nos seguintes padrões:
presença de infecção, presença de halo hiperêmico, formação de crosta cicatricial,
presença de borda necrótica, fundo sangrante da ferida e cicatriz final (MARTORELLI,
2006).
Resultados e Discussão
Perfil Fitoquímico
O ensaio fitoquímico evidenciou a presença de mono e sesquiterpenos,
triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides. Não foi detectada a presença
de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados cinâmicos,
fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas.
Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina, também não foram
detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis (PIETTA et al.,
2002; SALATINO et al., 2005).
Teor de flavonóides totais
O teor de flavonóides na amostra analisada foi de 2,300% (±0,005), sendo quase
cinco vezes maior do que mínimo especificado (0,5%) pelo Ministério da Agricultura,
na Instrução Normativa nº3 – ANEXO VI – Regulamento técnico para fixação de
identidade e qualidade de própolis (Diário Oficial da República Federativa do Brasil,
DOU de 19/01/2001).
62
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Estudo de cicatrização in vivo
Os critérios utilizados para avaliação macroscópica foram a presença de
infecção, presença de halo hiperêmico, formação de crosta cicatricial, presença de borda
necrótica, fundo sangrante da ferida e cicatriz final (MARTORELLI, 2006).
Na fase inicial (3 dias), foi verificada a ação do produto na etapa de inflamação
aguda. Verificamos que, na fase intermediária, a reparação conjuntiva, através da
deposição extracelular de colágeno, ficou demonstrada a eficácia do creme à base de
extrato de própolis, dada a rapidez do processo cicatricial seguido da regressão do
processo inflamatório. Esta fase intermediária é que divide o processo de cicatrização,
com a reparação conjuntiva e inflamação crônica, que se caracteriza pelo infiltrado
mononuclear.
A última etapa permite avaliar a qualidade do tecido cicatricial, presença ou
ausência de fibrose e falha na recomposição do tecido. Observamos excelente qualidade
do tecido cicatricial na região dorsal dos animais tratados, quando comparados com o
grupo controle. Os Quadros 2, 3 e 4 trazem os resultados das avaliações macroscópicas
dos grupos controle negativo, controle positivo e teste realizados nos 3º, 7º e 14º de
tratamento.
Quadro 2. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle negativo Dias de Tratamento Aspectos
Macroscópicos 3 7 14 Infecção ausente ausente sem vestígios
Halo hiperêmico presente visível ausente Bordas necróticas ausente ausente ausente
Crosta espessa visível ausente Fundo sangrante vestígios não verificado ausente
Cicatriz final - - ausente
63
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Quadro 3. Resultados da avaliação macroscópica do grupo controle positivo Dias de Tratamento Aspectos
Macroscópicos 3 7 14 Infecção ausente ausente ausente
Halo hiperêmico discreto ausente ausente Bordas necróticas não verificadas ausente não verificadas
Crosta vestígios ausente ausente Fundo sangrante espessa sem vestígios recuperado
Cicatriz final espessa normal pêlo recuperado Quadro 4. Resultados da avaliação macroscópica do grupo teste
Dias de Tratamento Aspectos Macroscópicos 3 7 14
Infecção ausente ausente ausente Halo hiperêmico vestígios ausente ausente Bordas necróticas ausente ausente ausente
Crosta ausente ausente ausente Fundo sangrante ausente ausente ausente
Cicatriz final não verificada sem vestígios pêlo recuperado
Os resultados obtidos do perfil fitoquímico, teor de flavonóides totais e ensaio de
cicatrização corroboram com os relatos descritos na literatura, nos quais relata-se que as
propriedades de regeneração tecidual, como cicatrização de úlceras e feridas,
possivelmente estão relacionadas aos flavonóides, os quais removem radicais livres
produzidos que são responsáveis por difilcutar ou mesmo impedir que ocorra a
regeneração das células no local. A remoção dos mesmos pelos flavonóides da própolis
permitiria que o órgão ou tecido doente pudesse se regenerar normalmente (MENEZES,
2005; LIMA, 2006).
Conclusão
O ensaio fitoquímico evidenciou a presença de mono e sesquiterpenos,
triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides, sendo estes presentes em
teores maiores do que o especificado pelo Ministério da Agricultura, na Instrução
Normativa nº 3 – ANEXO VI – Regulamento técnico para fixação de identidade e
64
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
qualidade de própolis (Diário Oficial da República Federativa do Brasil, DOU de
19/01/2001).
A partir destes ensaios pré-clínicos de atividade cicatrizante, evidenciou-se que o
extrato de própolis vermelha de Pernambuco desenvolveu atividade cicatrizante do
ponto de vista de avaliação dos aspectos clínicos macroscópicos em relação ao padrão
D-pantenol.
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CAPÍTULO 5
DESENVOLVIMENTO DE GEL À BASE DE EXTRATO DE
PRÓPOLIS VERMELHA E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
ANALÍTICO PARA DOSEAMENTO DE FLAVONÓIDES
(Artigo a ser submetido à RBCF)
69
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e
validação do método analítico para doseamento de flavonóides
Alexandre Bezerra Galindo1, Diego Cavalcanti Perrelli1, Jeckson Luiz da Silva1,
Karina Perrelli Randau2, Pedro José Rolim Neto1∗
1Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil,
2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.
RESUMO
Os géis hidrofílicos têm sido muito usados em produtos cosméticos e como base
dermatológica. A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas
propriedades antibacteriana, antiinflamatória, antioxidante, cicatrizante, entre outras. O
presente trabalho teve por objetivo desenvolver formulações de géis tópicos à base de
extratos hidroalcoólicos de própolis vermelha, da região de Goiana-PE, Brasil, e co-
validar o método descrito por Funari & Ferro (2006), para realizar o doseamento de
flavonóides na forma farmacêutica. Quanto à validação do método analítico, esta
proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de flavonóides totais na forma
farmacêutica, sendo linear, exato e preciso. As formulações obtidas foram avaliadas
após sua preparação e apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o
especificado.
Unitermos: própolis vermelha, gel, doseamento de flavonóides
70
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
INTRODUÇÃO
Os géis hidrofílicos têm sido muito usados em produtos cosméticos e como base
dermatológica, pois apresentam fácil espalhamento, não são gordurosos e podem
veicular princípios ativos hidrossolúveis e lipossomas. Dentre as matérias-primas usadas
na preparação de géis, tem-se destacado os ácidos carboxivinílicos (Carbopois®) e os
ácidos poliacrílicos (Pemulen®) (Corrêa et al., 2005).
Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico
coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e exudatos de árvores; além
desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares e enzimas (Pereira et al.,
2002; Franco et al., 2000). Sua composição é bastante variada e já foram identificados
mais de 300 constituintes (Cunha et al., 2004; Silici & Kutluca, 2005), dentre eles
podemos citar, ácidos graxos e fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis),
terpenos, esteróides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, entre outros
(Marcucci et al., 2001).
A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos devido às suas
propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória, hepatoprotetora,
antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, entre outras (Bankova, 2005; Kosalec et
al., 2005; Alencar et al., 2005). Vários autores relatam que algumas das propriedades
biológicas, particularmente a atividade antioxidante, em extratos etanólicos de própolis,
se deve em parte ao seu alto conteúdo de flavonóides (Adelmann, 2005).
O método utilizado para a quantificação de flavonóides totais baseia-se na
propriedade do cátion alumínio de formar complexos estáveis com flavonóides,
ocorrendo, na análise espectrofotométrica, um deslocamento para maiores
comprimentos de onda e uma intensificação de suas absorbâncias. Desta forma, é
possível determinar a quantidade de flavonóides na amostra, evitando-se a interferência
71
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
de outras classes de substâncias fenólicas, principalmente a dos ácidos fenólicos (Funari
& Ferro, 2006).
O presente trabalho teve por objetivo desenvolver formulações de géis tópicos à
base de extratos hidroalcoólicos de própolis vermelha da região de Goiana-PE, Brasil, e
co-validar o método descrito por Funari & Ferro (2006) de doseamento de flavonóides
em própolis, para realizar o doseamento de flavonóides na forma farmacêutica.
MATERIAIS E MÉTODOS
Extrato de própolis
Foi utilizado extrato hidroalcoólico de própolis a 20% (m/v) com 2,3% de
flavonóides em equivalentes de quercetina, o qual foi preparado a partir de amostras de
própolis vermelha da região de Goiana - PE, Brasil.
Obtenção dos géis
Para o desenvolvimento dos géis à base de extrato de própolis vermelha, foi
empregada uma planificação quali-quantitativa de excipientes, seguindo as formulações
descrias na Tabela I.
TABELA I - Formulações dos lotes de bancada desenvolvidos Lotes de bancada Componentes L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8
Carbopol 996 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,8% 0,8% 0,8% 0,8% Nipagim 0,1% 0,1% - - 0,1% 0,1% - - Nipazol 0,02% 0,02% - - 0,02% 0,02% - -
Sorbato de potássio - - 0,1% 0,1% - - 0,1% 0,1%
Extrato de própolis 10% 15% 10% 15% 10% 15% 10% 15%
Trietanolamina q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. q.s. Água destilada
q.s.p. 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
72
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Os géis que continham os conservantes nipagim e nipazol foram obtidos pela
adição destes, previamente dissolvidos em álcool, à água, sob agitação constante. Em
seguida, adicionou-se o carbopol, pouco a pouco, até completa homogeneização. Logo
após, fez-se a adição da trietanolamina em quantidade suficiente para se obter pH entre
6,0-6,5. Por último, acrescentou-se a quantidade pré-estabelecida de extrato de própolis,
até obter um produto homogêneo. O gel foi, então, acondicionado em recipiente plástico
hermeticamente fechado.
Para os géis que continham sorbato de potássio em sua fórmula, procedeu-se
primeiramente a adição do carbopol à água, sob agitação, para então acrescentar o
conservante. Em seguida, realizou-se o mesmo procedimento adotado para as
formulações anteriores.
Após a incorporação do extrato de própolis, quando necessário, fez-se a adição
de mais trietanolamina às preparações, de forma que estas apresentassem pH ente 6,0-
6,5 (levemente ácido).
Co-validação do método analítico para doseamento de flavonóides
O teor de flavonóides nos géis foi determinado segundo metodologia descrita
por Funari & Ferro (2006) para doseamento de flavonóides em própolis. Realizou-se
uma co-validação, avaliando-se os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão
(repetitividade).
Preparação das amostras
Alíquotas do gel referente à formulação L3 foram diluídas em etanol de modo a
obter-se soluções nas concentrações de 4.8, 7.2, 9.6, 12 e 14.4 μg/mL de flavonóides em
equivalentes de quercetina. A solução de concentração de 9,6 μg/mL foi definida como
73
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
100%. Ás soluções obtidas, foi adicionado 1 mL de cloreto de alumínio 5% e após 30
min realizaram-se as leituras em espectrofotômetro a 425 nm.Empregaram-se como
branco, soluções contendo placebo (gel sem extrato de própolis).
Linearidade
A linearidade foi avaliada através da análise de regressão linear pelo método dos
mínimos quadrados dos pontos médios de três curvas autênticas, utilizando cinco pontos
nas concentrações de 4.8, 7.2, 9.6, 12 e 14,4 μg/mL de flavonóides em equivalentes de
quercetina. O coeficiente de correlação obtido foi a partir das três curvas.
Exatidão
A exatidão do método foi avaliada em três níveis de concentração: 50, 100 e
150%, os quais correspondem às concentrações de 4.8, 9.6 e 14.4 µg/mL. Os testes
foram realizados em triplicata e avaliados por teste t de Student, comparando-se os
resultados em relação ao valor teórico definido para cada concentração analisada.
Precisão
A precisão foi verificada através da repetitividade, determinada pela análise de
seis amostras individuais com concentração de 9,6 µg/mL e expressa pelo coeficiente de
variação (CV).
Controle de qualidade dos géis
74
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Os géis obtidos foram analisados quanto as suas características macroscópicas
(cor, aspecto), pH e viscosidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Linearidade
Os resultados dos pontos das três curvas de linearidade foram plotados em um
gráfico (Figura 1) e estão apresentados na Tabela II. A concentração de flavonóides em
μg/mL de equivalentes de quercetina versos a absorbância, através do método dos
mínimos quadrados, origina a equação da reta: y = 0,0306x - 0,006 e o coeficiente de
correlação R2 = 0,9969, valor este que comprova a linearidade do método, no intervalo
de variação estudado.
TABELA II - Resultado da linearidade Absorbâncias/Determinações Concentração
(μg/mL) 1 2 3 Médias Desvio padrão CV (%)
4,8 0,149 0,142 0,130 0,143 0,0051 3,58 7,2 0,207 0,217 0,210 0,211 0,0051 2,43 9,6 0,283 0,282 0,287 0,284 0,0026 0,93 12,0 0,370 0,371 0,375 0,372 0,0026 0,71 14,4 0,425 0,435 0,430 0,430 0,0055 1,17
y = 0,0306x - 0,006R2 = 0,9969
00,05
0,10,15
0,20,25
0,30,35
0,40,45
0,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[ ] de flavonóides µg/mL
Abs
orbâ
ncia
FIGURA 1 - Curva de regressão linear obtida a partir da média de três curvas
75
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
Exatidão
A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações
diferentes, 4.8, 9.6 e 14.4 µg/mL (50%, 100%, 150%). Os dados estão representados na
Tabela III. O tratamento estatístico aplicado foi o teste t-Student o qual demonstrou que
o t-calculado foi menor que o t-tabelado comprovando que não houve diferença
estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações analisadas com
95% de confiança.
Tabela III - Resultados da exatidão, comprovada pelo teste t-Student Concentração de
flavonóides na amostra (%)
Quantidade determinada (%) t calculado t tabelado
50 50,47±1,81 0,45 4,30 100 101,07±0,94 1,96 4,30 150 154,92±1,96 2,94 4,30
Precisão
Nos ensaios de repetitividade foram realizadas 06 determinações a 9,6 μg/mL,
referente a 100% da concentração. Observando-se os resultados (Tabela IV), podemos
concluir que o método tem uma boa repetitividade, visto que, o coeficiente de variação
apresenta-se inferior ao limite especificado (5,0%) pela Resolução RE nº 899 (Brasil,
2003).
TABELA IV - Resultados da repetitividade Absorbâncias/Determinações
1 2 3 4 5 6 Média Desvio padrão CV %
0,289 0,284 0,287 0,282 0,275 0,276 0,282 0,0057 2,02
Controle de qualidade dos géis
Dos oito lotes de bancada obtidos, apenas quatro (L3, L4, L7 e L8) foram
avaliados quanto as suas características físico-químicas (Tabela V), visto que, não foi
possível realizar a quantificação de flavonóides nos géis que continham nipagim e
76
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
nipazol em sua formulação. Tal fato deve-se à interferência que estes conservantes
promovem na leitura espectrofotométrica por absorverem em comprimentos de onda
próximos ao do método empregado para o doseamento dos flavonóides (425 nm).
TABELA V - Controle físico-químico dos géis obtidos Resultados / Formulações Parâmetros Especificações 3 4 7 8
Características macroscópicas
Gel opaco, de cor vermelha, homogêneo
Gel opaco de cor
vermelha-marrom,
homogêneo
Gel opaco de cor
vermelha-marrom,
homogêneo
Gel opaco de cor
vermelha-marrom,
homogêneo
Gel opaco de cor
vermelha-marrom,
homogêneopH 6,0 - 6,5 6,01 6,38 6,06 6,23
Viscosidade (cP)*
200000-400000 223000 180000 378000 355000
*viscosidade determinada a 1 rpm (spindle S07), viscosímetro Brookfield VD-I.
CONCLUSÃO
Através da planificação quali-quantitativa, pôde-se observar a interferência que
conservantes do grupo dos parabenos promovem no método empregado para a
quantificação de flavonóides. As demais formulações obtidas, e que foram avaliadas
após sua preparação, apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o
especificado.
Quanto à validação do método analítico, este proporcionou resultados confiáveis
para o doseamento de flavonóides totais na forma farmacêutica, sendo linear, exato e
preciso. A especificidade do método foi garantida pelo uso de soluções contendo
placebo como branco para o doseamento.
ABSTRACT
Desenvolvimento de gel à base de extrato de própolis vermelha e validação do
método analítico para doseamento de flavonóides
77
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
The hydrophilic gel have been very used in cosmetic products and as dermatological
base. The propolis have been object of pharmacologyc studies had to its properties
antimicrobial, antiinflammatory, antioxidant, cicatrizing, among others. The present
work had for objective to develop formulations of topical gels to the extract base of
propolis red, from region of Goiana-PE, Brazil, and validation the described method for
Funari & Ferro (2006), to the doses of flavonoids into pharmaceutical form. How much
to the validation of the analytical method, this provided resulted trustworthy for the
doses of flavonoids total in the pharmaceutical form, being linear, exact and accurate.
The gotten formulations had been evaluated its preparation after and had presented
parameters compatible physicist-chemistries with the specified one.
Uniterms: red própolis, flavonoids assay, gel
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79
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
CONCLUSÕES E
PERSPECTIVAS
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
1. Conclusões • Na composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha, foram
identificados 34 constituintes, sendo monoterpenos e monoterpenóides,
sesquiterpenos e sesquiterpenóides, fenilpropanóides, aldeídos, cetonas e n-alcanos.
Destacaram-se como constituintes majoritários o trans-anetol, α-copaeno e o metil
cis-isoeugenol.
• No perfil fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD), os constituintes
fenólicos (do tipo flavónoides, antraquinonas e fenóis) foram identificados como
majoritários.
• O ensaio de letalidade em Artemia salina, que demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL,
sugeriu uma possível atividade antitumoral.
• Os resultados demonstraram que a própolis vermelha analisada possui atividade
antioxidante, comprovada pelos diferentes métodos, e que tal atividade está
relacionada ao seu teor de compostos fenólicos, bem como à época de sua coleta.
• A própolis em estudo apresentou bons resultados no estudo de cicatrização por
segunda intenção em dorso de ratos, quando comparada ao padrão D-pantenol.
• Através da planificação quali-quantitativa, pôde-se observar a interferência que
conservantes do grupo dos parabenos promovem no método empregado para a
quantificação de flavonóides. As demais formulações obtidas, e que foram avaliadas
após sua preparação, apresentaram parâmetros físico-químicos compatíveis com o
desejado.
• Quanto à validação do método analítico, este proporcionou resultados confiáveis
para o doseamento de flavonóides totais na forma farmacêutica, sendo linear, exato
e preciso.
81
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
2. Perspectivas
Este estudo aponta a necessidade de dar continuidade a pesquisas que envolvam
aspectos tanto químicos como biológicos da própolis vermelha, além daqueles que
envolvem o desenvolvimento de formas farmacêuticas à base do extrato.
Como algumas perspectivas, temos:
• Isolamento e identificação de compostos químicos da própolis vermelha, os quais
poderão ser empregados como marcadores;
• Estudo de outras atividades biológicas, como, por exemplo, antiinflamatória,
imunomodulatória, entre outras, bem como realizar estudo de cicatrização baseado
nos aspectos histológicos (microscópicos) da regeneração tecidual;
• Realizar estudo de estabilidade acelerada dos géis obtidos;
• Desenvolver outras formas farmacêuticas à base de extrato de própolis vermelha
com base nas propriedades biológicas já observadas ou em outras que venham a ser
demonstradas.
82
GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
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GALINDO, A.B. Caracterização do extrato de própolis vermelha, avaliação de suas propriedades biológicas e desenvolvimento de gel à base do extrato
ANEXOS
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----- Mensagem encaminhada de José Maria Barbosa Filho <[email protected]> ----- Data: Wed, 7 Feb 2007 05:48:29 -0300 De: José Maria Barbosa Filho <[email protected]> Reponder para: José Maria Barbosa Filho <[email protected]> Assunto: Revista Brasileira de Farmacognosia Para: [email protected] Prezado Prof. Dr. Pedro Rolim, Informo que foi dada entrada para publicação na Revista Brasileira de Farmacognosia o manuscrito intitulado "Própolis: Química e Farmacologia", de autoria de S.R. Lustosa, A.B. Galindo, K.P. Randau e P.J. Rolim Neto. Em breve lhe enviaremos o número do protocolo para acompanhamento de todo o processo. De acordo com as normas da revista este trabalho será encaminhado a dois avaliadores. Assim que tivermos os resultados da referagem, lhe comunicaremos. Atenciosamente, José M. Barbosa Filho Editor Chefe ----- Finalizar mensagem encaminhada -----
Artigo submetido à Revista Química Nova
PADRONIZAÇÃO DA PRÓPOLIS VERMELHA E VALIDAÇÃO
DE MÉTODO ANALÍTICO
Sarah R. Lustosa, Alexandre B. Galindo, Diego C. Perrelli, Karina P. Randau, Pedro
J. Rolim Neto∗
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, PE, Brasil
Zênia M. M. Lavra, Severino Granjeiro Júnior
LAFEPE – Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco
Livio C. C. Nunes
Núcleo de Tecnologia Farmacêutica - NTF, Universidade Federal do Piauí, Teresina, PI,
Brasil
STANDARDIZATION OF RED PROPOLIS AND VALIDATION OF
ANALYTICAL METHOD
ABSTRACT: Red propolis colleted from Goiana, Pernambuco, Brazil, was
standardized following the requirements of identity and quality of the Ministery of
Agriculture. The seasonal influence of the months February, June and October 2006 was
avaliated and flavonoids assay method was validated. It was observed that all the
samples collected showed good quality, with prominence to the sample collected in
October that was found to have a high concentration of flavonoids and total phenols,
and lesser wax content. The method was linear, accurate and precise.
Keywords: Propolis, standardization, flavonoids
INTRODUÇÃO
O homem tem utilizado muitos produtos naturais ao longo da história. Dentre
eles, destaca-se a própolis, um material resinoso produzido pelas abelhas e que é
empregado na construção e reparo das colméias1,2.
A composição básica da própolis é 55% de resinas e bálsamo, 30% de ceras,
10% de óleos essenciais e 5% de pólen e, em diferentes amostras, já foram identificados
mais de 300 constituintes3,4, dentre eles podemos citar ácidos graxos e fenólicos,
flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis), terpenos, β-esteróides, álcoois e aldeídos
aromáticos, sesquiterpenos, entre outros5. A proporção dessas substâncias varia e
depende do local e da época da coleta6 e a elas, especialmente aos flavonóides, são
atribuídas algumas propriedades farmacológicas da própolis, como cicatrizante7,
antioxidante8, antiinflamatória9, antimicrobiana10, entre outras.
No entanto, para ser utilizada na terapêutica, a própolis deve ser padronizada
quimicamente e os procedimentos analíticos de controle químico e microbiológico
adotados devem ser descritos e validados, o que irá garantir sua qualidade, segurança e
eficácia11,12. A validação, como parte integrante da qualidade, tem por objetivo garantir,
por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações
analíticas, assegurando confiabilidade aos resultados13.
O presente trabalho teve por objetivo padronizar o extrato da própolis vermelha,
utilizando como parâmetro as especificações estabelecidas no Regulamento de
Identidade e Qualidade de Extrato de Própolis, do Ministério da Agricultura, Brasil14;
avaliar as possíveis variações devido à sazonalidade e validar o método de doseamento
para flavonóides totais. A própolis utilizada é produzida por abelhas da espécie Apis
mellifera, as quais utilizam para este fim resina coletada da espécie Dalbergia
ecastophyllum (L.) Taub.
PARTE EXPERIMENTAL
Materiais
Reagentes
Álcool etílico absoluto (Cinética e Nuclear, Brasil), éter de petróleo, acetato de
etila, ácido fórmico, ácido acético, benzeno, acetona, tolueno, éter, butanol (todos da
Vetec, Brasil).
Padrões de Trabalho
Quercetina Dihidratada (Sigma, Alemanha, L. 39H0598), Ácido tânico (Merck,
Alemanha, 31761, USP). Cr, Zn, Co, Cd, Cu e Ni (Fluka Chemie GmbH, Suiça) e o
Mn e Pb (Sigma-Aldrich, USA).
Própolis
Para o estudo, foram utilizadas amostras de própolis vermelha de apiário da
região de Goiana, PE, Brasil, coletadas nos meses de fevereiro, junho e outubro de
2006. Foram preparados extratos etanólicos de própolis (EEP) a 20% (m/v), das três
amostras coletadas, por maceração durante 48 h, em soluções hidroalcoólicas a 70, 80 e
90%. Após esse tempo, os extratos foram filtrados e acondicionados em frasco de vidro
âmbar.
Métodos
Analise fitoquímica através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD):
Alíquotas de 5 µl dos EEP a 70, 80 e 90%, dos três meses de coleta (fevereiro, junho e
outubro), foram submetidas à CCD (cromatoplacas de gel de sílica Merck-Alemanha),
empregando-se diversas fases móveis e reveladores adequados15, de acordo com o grupo
de metabólitos secundários: Alcaloides, Mono e sesquiterpenos, Iridóides, Saponinas,
Cumarinas e Fenilpropanoglicosídeos16, Triterpenóides e Esteróides17, Açúcares
redutores18, Derivados cinâmicos e Flavonóides16,19, Proantocianidinas condensadas e
Leucoantocianidinas20.
Características Organolépticas: Foram avaliadas as características aroma, cor e sabor.
Perda por Dessecação: Determinada por termogravimetria segundo a Farmacopéia
Brasileira IV21. Esta análise foi realizada em triplicata e os resultados expressos em
porcentagem (% p/p).
Teor de Cinzas: Método utilizado segundo a Farmacopéia Brasileira IV21 e realizada
em triplicata. Os resultados foram expressos em porcentagem.
Teor de Cera: Pesou-se 1,0 g de própolis e colocou-se em erlenmeyers previamente
tarados. Submeteu-se à extração com três frações de 10 mL de éter de petróleo, sob
aquecimento. A própolis foi desprezada e a fração etérea evaporada. Os erlenmeyers
foram pesados e o teor de ceras calculado pela diferença entre o peso final e inicial. A
análise foi realizada em triplicada e expressa em porcentagem de ceras.
Resíduo Insolúvel em Etanol: Pesou-se 1,0 g de própolis e submeteu-se à extração
com três frações de 30 mL de etanol, filtrando após cada extração, utilizando papel de
filtro previamente tarado. Desprezou-se a fração etanólica e secou-se o resíduo em
estufa a 105º por 10 minutos. O teor de resíduo foi calculado pela diferença entre o peso
final e inicial. A análise foi realizada em duplicata e expressa em porcentagem de
resíduo insolúvel em etanol.
Determinação de Metais Pesados: Pesou-se aproximadamente 1,0 g de própolis bruta
(In natura) fez-se a digestão por 10 mL de HNO3 concentrado em bloco digestor aberto
por 10 minutos a 95±5°C. As amostras foram resfriadas e após a adição de mais 5 mL
de HNO3, novamente levadas ao bloco digestor para aquecimento a 95±5°C por mais 2
horas. Adicionou-se 5 mL de HCl e 10 mL de água destilada e foram aquecidas até que
terminasse o desprendimento de vapores de NO2 (vapor amarelado). O líquido
resultante foi filtrado, transferido para balão de 100 mL, completado o volume com
água destilada e guardados em geladeira em frasco plástico opaco. Alíquotas de 5 μL
das amostras foram injetadas em espectro de absorção atômica (Varian SPECTRA AA
220 FS), usando uma mistura de ar/acetileno tendo um fluxo de 13,5 L/min para o ar e
2,0 L/min do acetileno, tempo de leitura de 5 segundos, comprimento de onda de 228,8
nm. A curva de calibração foi feita com 7 pontos e, tanto o padrão quanto as amostras
foram feitas em triplicata Os metais pesados analisados foram: Pb, Cd, Co, Cr, Cu, Mn,
Zn e Ni.
Teor de Flavonóides Totais: Metodologia utilizada segundo Funari & Ferro22,
utilizando cloreto de alumínio na concentração de 5%. Os resultados foram expressos
em porcentagem de quercetina e representam a média de 3 determinações.
Teor de Fenóis Totais: Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância
de referência o ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de
ácido tânico a 100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e
adicionados 5 mL de Folin-Ciocauteau. Após 2 minutos, foram adicionados 10 mL de
solução de carbonato de cálcio 15% e o volume foi completado com água destilada. As
soluções foram deixadas em repouso por 30 minutos e foram lidas a 760 nm. As
amostras foram preparadas utilizando 3 mL do extrato hidroalcoólico de própolis a 2
mg/mL. O branco do sistema foi preparado da mesma forma, sem a alíquota da amostra.
Validação do Método Analítico para Teor de Flavonóides Totais: No estudo de
validação foram avaliados os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão
(repetitividade e precisão intermediária). A linearidade foi avaliada através da análise de
regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de três curvas
autênticas, utilizando cinco pontos nas concentrações de 4, 6, 8, 10 e 12 μg/mL do
padrão de quercetina. O coeficiente de correlação obtido foi a partir das três curvas. A
exatidão foi realizada em triplicata, através do método de adição de padrão e os
resultados expressos como percentual de recuperação. A precisão foi verificada em dois
níveis: repetitividade e precisão intermediária, sendo a primeira determinada pela
análise de seis amostras individuais e a segunda em dias diferentes por analistas
diferentes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O perfil fitoquímico da própolis foi analisado através da cromatografia em
camada delgada (CCD). Como a CCD requer apenas cromatoplacas e considerando que
a composição da própolis varia de acordo com a região onde foi coletada, esta
metodologia parece ser útil no rápido controle de qualidade da própolis23.
O ensaio fitoquímico evidenciou a presença de mono e sesquiterpenos,
triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides. Não foi detectada a presença
de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados cinâmicos,
fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas.
Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina, também não foram
detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis24,25.
Qualitativamente não foram observadas variações no perfil cromatográfico entre as
extrações etanólicas assim como entre as datas de coleta.
As amostras de própolis apresentaram cor avermelhada, sabor suave, aroma
resinoso e balsâmico e consistência maleável à temperatura ambiente, sendo que a
amostra de outubro apresentou-se um pouco mais clara e levemente mais rígida.
Segundo Funari & Ferro22, quando apresenta-se maleável, a própolis pode indicar um
elevado teor de ceras. Sendo rígida, pode indicar um elevado teor de resinas, o que é
desejável, pois as atividades biológicas vêm sendo atribuídas a substâncias contidas
nessa fração.
A tabela 1 mostra os resultados das análises gravimétricas realizadas nas três
amostras de própolis. As amostras foram avaliadas quanto aos testes de pureza
atendendo às especificações do Ministério da Agricultura15, com exceção da amostra de
fevereiro, no parâmetro teor de ceras, que se apresentou um pouco acima do
especificado. Ainda em relação a este parâmetro, a amostra coletada em outubro
apresentou um resultado menor que as demais sugerindo uma melhor atividade
biológica.
Tabela 1
A contaminação de vegetais com metais pode ter diversas origens, tais como
acidental, proposital, contaminação do solo, de materiais de origem natural ou mineral e
durante a manufatura. Estudos recentes, realizados no Brasil com plantas de origem
nacional e outras de diversas origens, mostraram a presença de metais em altas
concentrações26. Como a qualidade da própolis é dependente da origem vegetal, foi
realizada a determinação de metais pesados nas amostras coletadas nos meses de
fevereiro, junho e outubro. Dos teores totais dos metais pesados analisados Pb, Cd, Co,
Cr, Cu, Mn, Zn, Ni, verificou-se que nem o Co nem o Cr foram identificados em
nenhuma das amostras. A terceira coleta (outubro) foi onde se obteve o menor teor de
metais pesados seguindo da primeira coleta (fevereiro) e por fim a segunda (junho),
tabela 2.
Na coleta de fevereiro o Mn apresentou um elevado teor assim como Zn na
coleta de junho, quando comparado entre os teores apresentados.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA27, através de portarias
normativas, relaciona uma série de produtos alimentícios e determina as concentrações
máximas permitidas para diferentes metais, entretanto, não foi encontrada qualquer
referência a produtos oriundos da abelha, como a própolis, sob qualquer forma, no que
se refere ao chumbo.
Tabela 2
A amostra de outubro apresentou também um maior teor de flavonóides totais e
fenóis totais, conforme se observa na tabela 3. Quanto ao solvente utilizado, o álcool a
90% foi o que apresentou melhor poder de extração, tanto de flavonóides, quanto de
fenóis.
Tabela 3
Quanto à validação do método analítico, os resultados dos pontos das três curvas
de linearidade foram plotados em um gráfico (Figura 1) estão demonstrados na tabela 4.
A concentração de quercetina em μg/mL versus a absorvância Y, através do método dos
mínimos quadrados origina a equação da reta: y = 0,0757x - 0,0184 e o coeficiente de
correlação R2 = 0,9999, valor este que comprova a linearidade do método, no intervalo
de variação estudado.
Figura 1
Tabela 4
A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações
diferentes (50, 100, 150%), onde o percentual de recuperação médio das triplicatas de
cada concentração analisada apresentou-se dentro dos limites como mostram os
resultados da tabela 5. O tratamento estatístico aplicado foi o Teste t-Student, o qual
demonstrou que o t calculado foi menor que o t tabelado comprovando que não houve
diferença estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações
analisadas com 95% de confiança.
Tabela 5
Para a precisão, os ensaios de repetitividade foram realizadas seis determinações
a 160 μg/mL, referentes a 100% da concentração. Observando-se os resultados, conclui-
se que o método tem uma boa repetitividade, visto que o coeficiente de variação
apresenta-se inferior ao limite especificado de 5,0% pela Resolução RE nº 899 da
ANVISA28.
A precisão intermediária entre dias e entre analistas foi realizada e o Fcalculado
obtido para analistas foi 0,7871, e para dias foi 4,009745, com Ftabelado de 5,143 e 4,757
respectivamente, não havendo diferença estatisticamente significativa entre as médias,
sendo o método considerado preciso. Os dados analíticos do método validade são
apresentados na tabela 6.
Tabela 6
CONCLUSÃO
A partir dos resultados e evidências apresentadas, a própolis vermelha da região
de Goiana, Pernambuco, Brasil, mostrou atender às especificações de identidade e
qualidade estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, nos meses avaliados exceto a
amostra de fevereiro quanto ao teor de ceras. A amostra do mês de outubro apresentou
um maior teor de flavonóides e fenóis totais, bem como menor teor de ceras, o que
indica este mês como o mais apropriado para coleta, especialmente se a própolis for
utilizada para fins medicinais, uma vez que são atribuídas aos flavonóides várias
propriedades farmacológicas. A validação do método analítico para a quantificação do
na própolis vermelha proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de
flavonóides totais, sendo linear, exato e preciso. Atendendo às exigências especificadas
pela International Conference on Harmonization of Tecnical Requiriments for
Registration on Pharmaceutical for Human Use- ICH preconizadas nas recomendações
da ANVISA28,29.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Empresa Mel Brasil pelo fornecimento das amostras de própolis
e ao LAFEPE, pela parceria estabelecida para a realização da validação do método
analítico. A Capes e ao CNPq pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
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M.C.; Drezza, F.T.; Povia, G.S.; Carvalho, P.O.; J. Braz. Chem. Soc. 2004, 15,
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8. Ahn, M.; Kumazawa, S.; Usui, Y.; Nakamura, J.; Matsuka, M.; Zhu, F.;
Nakayama, T.; Food. Chem. 2007, 101, 1400.
9. Borrelli, F.; Maffia, P.; Pinto, L.; Ianaro, A.; Russo, A.; Capasso, F.; Ialenti, A.;
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10. Scazzocchio, F.; D’Auria, F.D.; Alessandrini, D.; Pantanella, F.;
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12. Bankova, V.; J. Ethnopharmacol. 2005, 100, 114.
13. Lima, L.R.; Xavier, H.S.; Meira, J.L.; Rolim Neto, P.J.; Rev. Bras. Farmacogn.
2006, 16, 562.
14. Ministério da Agricultura, 2001, Instrução Normativa nº3 – ANEXO VI –
Regulamento técnico para fixação de identidade e qualidade de própolis. Diário
Oficial da República Federativa do Brasil, DOU de 19/01/2001.
15. Sena Filho, J.G.; Melo, J.G.S.; Saraiva, A.M.; Gonçalves, A.M.; Psiottano,
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17. Harbone, J. B. Em Phytochemical Method; Chapman & Hall: London, 1998.
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19. Neu, R.; Naturswissenschaften 1956, 43, 82.
20. Roberts, E.A.H.; Cartwright, R.A.; Oldschool, M.; J. Sci. Food Agr. 1957, 8, 72.
21. Farmacopéia Brasileira; São Paulo Ltda: São Paulo, 1988, 4ª ed.
22. Funari, C.S.; Ferro, V.O.; Ciênc. Tecnol. Aliment. 2006, 26, 171.
23. Ackermann, T.; Food Chem. 1991, 42, 135.
24. Salatino, A.; Teixeira, E.W.; Negri, G.; Message, D.; eCAM 2005, 2, 33.
25. Pietta, P.G.; Gardana, C.; Pietta, A.M.; Fitoterapia 2002, 1, S7.
26. Santana, E.Q.; Tese de doutorado, Universidade Estadual Paulista Julio de
Mesquita Filho, Brasil, 2003.
27. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Portaria n° 685, de
27/08/1998.
28. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução RE nº 899, de
29/05/2003.
29. ICH International Conference on Harmonization of Tecnical Requiriments for
Registration on Pharmaceutical for Human Use. Q2A: ”Text on Validation of
Analytical Procedures” October 1994.
Tabela 1. Resultados das análises gravimétricas realizadas com amostras da própolis coletada nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006
Teste Especificações1 Amostra
Fevereiro/062
Amostra
Junho/062
Amostra
Outubro/062
Perda por
Dessecação
Máximo 8% 1,77 ± 0,03 2,10 ± 0,17 2,36 ± 0,40
Teor de Cinzas Máximo 5% 1,57 ± 0,19 1,46 ± 0,24 1,87 ± 0,16
Teor de Cera Máximo 25% 30,5 ± 1,5 25,0 ± 0,0 19,0 ± 3,0
Resíduo insolúvel
em etanol
Máximo 40% 31,3 ± 0,57 30,3 ± 0,57 11,6 ± 0,57
1Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em porcentagem.
Tabela 2. Determinação dos Metais Pesados Metais Pesados
Amostra
Fevereiro/062
Amostra
Junho/062 2Amostra
Outubro/06
Pb 13,2±1,368 21,9±1,713 6,7±0,788
Cd 0,05±0,090 0,19±0,171 0,30±0,097
Co 0,0 0,0 0,0
Cr 0,0 0,0 0,0
Cu 4,3±0,750 3,2±0,113 1,3±0,119
Mn 52,7±2,027 41,3±1,245 26,2±1,799
Zn 0,0 85,4±0,559 23,0±2,243
Ni 4,7±1,483 2,7±0,427 2,1±0,384
Tabela 3. Análises do teor de flavonóides totais e fenóis totais Especificações1 Amostra
Fevereiro/062
Amostra
Junho/062
Amostra
Outubro/062
Teste
70% 80% 90% 70% 80% 90% 70% 80% 90%
Flavonóides
Totais (%)
Mínimo de
0,5%
1,501±
0,005
1,524±
0,007
2,111±
0,002
1,590±
0,005
1,279±
0,016
1,615±
0,002
2,300±
0,005
2,351±
0,011
2,410±
0,002
Fenóis
Totais (%)
Mínimo de 5% 7,116±
0,053
7,613±
0,042
8,440±
0,034
9,095±
0,053
8,039±
0,069
9,315±
0,099
13,334±
0,077
13,617±
0,117
13,476±
0,113
1Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em porcentagem.
Tabela 4. Resultados em absorvância dos pontos da curva de linearidade Concentração
(ug/mL)
Curva 1 Curva 2 Curva 3
4,0 0,2929 0,2872 0,2754
6,0 0,4368 0,4346 0,4271
8,0 0,5954 0,5844 0,5851
10,0 0,7532 0,7353 0,7345
12,0 0,8935 0,8882 0,8814
Figura 1. Determinação gráfica da curva de linearidade
00,15
0,30,45
0,60,75
0,91,05
0 2 4 6 8 10 12 14[ ] µg/mL
Abs
orbâ
ncia
Seqüência1 Seqüência2Seqüência3 Linear (Seqüência2)Linear (Seqüência1) Linear (Seqüência3)
Tabela 5. Determinação dos resultados da exatidão Quantidade adicionada
(%)
Quantidade recuperada
(%)
Teste t- Student
calculado
t- tabelado
50 49,26 ± 1,2 2,12
100 100,97 ± 0,96 1,72 4,303
150 151,05 ± 0,44 4,03
Tabela 6. Dados analíticos do método validado Parâmetros Método validado
Comprimento de onda (nm) 425
Limite de detecção (LD) 0,3632
Limite de quantificação (LQ) 1,2103
Repetitividade (ug/mL) 2,52 ± 0,04
Artigo a ser submetido à Revista ECAM
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E PERFIL
FITOQUÍMICO DA PRÓPOLIS VERMELHA
Sarah Rodrigues Lustosa1, Alexandre Bezerra Galindo1, Karina Perrelli Randau3, Pedro
José Rolim Neto1, Eulália Azevedo Ximenes2
1 Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco
2 Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microorganismo, Departamento de
Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco
3Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil
Resumo: Própolis é um complexo resinoso produzido por abelhas a partir de resinas de
plantas. Sua composição química varia de acordo com o local da coleta e com a
vegetação nativa. Pesquisas têm revelado inúmeras atividades biológicas da própolis,
dentre essas, a atividade antimicrobiana têm sido exaustivamente estudada. O perfil
fitoquímico de extratos da própolis vermleha foi determinado, bem como realizada a
avaliação da atividade antimicrobiana in vitro, inclusive frente à cepas multiresistentes.
O teste de biocromatografia foi realizado para identificar substâncias bioativas. Os
resultados demonstraram a presença de mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteróides,
açúcares e flavonóides, sendo a atividade antimicrobiana visualizada na bioautocrafia
apenas para os flavonóides. Os microorganismos Gram-positivos (gêneros
Staphylococcus e Enterococccus) foram mais sensíveis quando comparados aos bacilos
Gram-negativos (Pseudomonas, Salmonella e Escherichia) e Candida albicans. As
cepas de S. aureus mostraram-se mais sensíveis ao extrato etanólico 70% , enquanto os
Enterococcus foram mais sensíveis ao extrato etanólico 80%.
INTRODUÇÃO
A própolis é um complexo resinoso formado pela mistura de substâncias
retiradas de botões de flores de árvores ou cascas de árvores com substâncias do próprio
organismo da abelha (1). Sua composição química varia de acordo com o local da coleta
e com a vegetação nativa no qual o apiário está instalado. Em geral, é composta por
50% de resina e bálsamo vegetal, 30% de cera, 10% de óleos, 5% de pólen e 5% de
várias outras substâncias e seu emprego na vida da colônia está relacionado com suas
propriedades mecânicas, sendo utilizada na construção e adaptação da colméia, e
antimicrobianas garantindo um ambiente asséptico (2-4).
Administrada sob diversas formas, é um dos produtos naturais mais utilizados
pela humanidade há vários séculos devido ao seu amplo espectro de ação, o qual está
intrinsecamente relacionado à sua composição química (5).
Várias pesquisas têm revelado inúmeras atividades biológicas da própolis:
antimicrobiana, antinflamatória, antioxidante, anti-tumoral e imunomoduladoras (6-10).
Dentre essas, a atividade antimicrobiana têm sido exaustivamente estudada, embora as
substâncias responsáveis por essas atividades ainda não tenham sido descritas em sua
totalidade. É sabido que os flavonóides contribuem mais que outros constituintes para
essa atividade biológica e que estes podem variar quali e quantitativamente de uma
amostra de própolis para outra (2,11-13).
Diferenças significativas na composição química e atividade biológica de
própolis originadas de regiões temperadas e tropicais têm aumentado o interesse de
vários pesquisadores que iniciaram vários estudos com novas amostras de própolis de
diversas regiões brasileiras (14-15).
Dos tipos de própolis brasileira, a mais popular e bem estudada é a própolis
verde, também denominada própolis alecrim a qual origina-se de Baccharis
dracunculifolia (Asteraceae) (16-18).
Recentemente Trusheva et al. (15) descreveram o isolamento e identificação de
quatorze compostos de uma amostra de própolis vermelha coletada na região nordeste
do Brasil, mais precisamente do Estado de Alagoas. Neste trabalho, compostos como
metil eugenol, metil isoeugenol, elemicina e isoelemicina foram isolados pela primeira
vez em própolis, alguns dos quais mostraram atividade antimicrobiana frente à S.
aureus, C. albicans e E. coli.
Com base neste estudo e sabendo que são escassas as pesquisas sobre própolis
vermelha brasileira, este trabalho objetivou a determinação do perfil fitoquímico de uma
amostra de própolis vermelha coletada no estado de Pernambuco, Brasil, bem como de
sua atividade antimicrobiana frente várias bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e
leveduras, algumas das quais resistentes a diversos antimicrobianos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras de Própolis. A amostra de própolis foi coletada em apiário localizado no
município de Goiana (7º41’20’’ S; 34º51’35’’), zona litorânea do estado de
Pernambuco, Brasil. Essa região caracteriza-se por um clima tropical úmido e uma
vegetação de restinga. Abelhas da espécie Apis mellifera são as responsáveis pela
produção da própolis do referido apiário, utilizando para isso resina coletada da espécie
Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub.
Preparação dos extratos. Extratos etanólicos de própolis (EEP) a 20% (p/v) foram
obtidos por maceração durante 48h, à temperatura ambiente, utilizando soluções
etanólicas de concentrações 70, 80 e 90% v/v. Após a maceração os EEPS foram
filtrados em papel de filtro e acondicionados em frascos de vidro âmbar para posterior
análise fitoquimica e antimicrobiana.
Perfil fitoquímico. Alíquotas de 5µl dos EEPS foram submetidas à cromatografia em
camada delgada (placas cromatográficas Merck, art. 105553, gel de sílica),
empregando-se diversas fases móveis: A [AcOEt- HCOOH-AcOH- H2O
(100:11:11:27v/v)]; B [B-Benzeno–AcOEt (97: 3 v/v)]; C [AcOEt-HCOOH-AcOH-
H2O (100:0,5:0,5:0,5v/v) ]; D [n-BuOH-Me2CO- Tampão fosfato pH= 5,0
(40:50:10v/v)], E [Éter-tolueno-AcOH 10% (50:50:50v/v)] e reveladores descritos na
Tabela 1.
Tabela 1. Sistemas cromatográficos e reveladores utilizados para o perfil fitoquímico da própolis vermelha.
Metabólitos Sistemas de eluição Reveladores Referência
Alcalóides A Dragendorff 19
Mono e sesquiterpenos B Vanilina sulfúrica 19
Triterpenóides e
Esteróides
C Lieberman/Burchard 20
Iridóides A Vanilina sulfúrica 19
Saponinas A Vanilina sulfúrica 19
Açúcares redutores D Trifeniltetrazólio 21
Cumarinas E U. V. (365 nm) 19
Derivados cinâmicos A NEU 19
22
Flavonóides A NEU 19,22
Fenilpropanoglicosídeos A NEU 19
Proantocianidinas
condensadas e
Leucoantocianidinas
A Vanilina clorídrica 23
Bioautografia. O teste de bioautografia foi realizado com o objetivo de identificar
substâncias bioativas. As suspensões bacterianas foram padronizadas segundo o tubo
0,5 da escala de MacFarland, que corresponde a 108 UFC/mL.
Alíquotas de 5 μL dos EEPs foram aplicadas sobre placas cromatográficas de gel
de sílica, as quais foram submetidas ao sistema eluente específico para cada grupo de
metabólitos secundários (Tabela 1). Após adsorção das amostras, as cromatoplacas
foram depositadas em placas de Petri de 180mm, sobre as quais foram vertidos 54 mL
de ágar Mueller-Hinton inoculado com as suspensões das culturas de Staphylococcus
aureus IC 404 ou Enterococcus faecalis IC 02, de modo a obter um inóculo equivalente
a 106 UFC/mL. Após 24 h de incubação à 35 °C, as substâncias cromatograficamente
separadas e que exibiram atividade antibacteriana foram reconhecidas por meio da
formação das zonas de inibição ao redor de suas bandas.
Atividade antimicrobiana. A atividade antimicrobiana dos EEPS foi avaliada pelo
método descrito por Bauer e Kirby (24) frente a 49 microrganismos pertencentes à
coleção de culturas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de
Pernambuco e isolados clínicos. Fizeram parte deste estudo os bacilos Gram-negativos:
Pseudomonas aeruginosa IC 01; IC 02 ; IC 03; IC 04; IC 05; IC 06; IC 07; IC10, IC 15;
UFPEDA 39), Salmonella enterica sorovar Panama 071; sorovar. Saint Paul 391;
sorovar. Rublislaw 3373; sorovar. Anatum 873; Salmonella sorovar. enteritidis
UFPEDA 415; Salmonella cholerae suis ATCC 14028, Escherichia coli IC18 e ATCC
8739; os bacilos Gram-positivos: Enterococcus faecalis IC 55671; IC 55918; IC 144; IC
68; IC 56671; IC 56354; IC 55995; IC 295; IC 222; IC 56288 e ATCC 29212 ,
Staphylococcus aureus IC 138; IC 27; IC 155; IC 311; IC 14; IC 15; IC 16; IC 404; IC
247; ATCC 6538; e levedura: Candida albicans IC 01; IC 03; IC 06; IC 07; IC 08;
IC09; IC10; IC11; IC12 e IC 15.
Culturas crescidas durante 24 horas em caldo Mueller-Hinton ou 48 horas em
caldo Sabourand foram diluídas de modo a obter suspensões microbianas de turbidez
equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, o que corresponde a 108UFC/mL. Em
seguida, estas suspensões foram novamente diluídas de 1:100 e semeadas com swabs
estéreis na superfície do ágar Mueller-Hinton para as bactérias ou ágar Sabourand para
as leveduras (25).
Discos de papel de filtro estéreis pesando 30 mg ± 4 mg/cm2 e 6mm de diâmetro
foram saturados com 20μL dos respectivos EEPS. As placas foram incubadas a 37 ˚C
durante 24horas para as bactérias e a 30 ˚C durante 48 horas para as leveduras. Ao fim
do período de incubação, o diâmetro do halo de inibição do crescimento microbiano foi
medido com auxilio de uma régua e expresso em milímetros (mm).
Os experimentos foram realizados em duplicada e expressos pela média
aritmética.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ensaio fitoquímico não detectou a presença de alcalóides, iridóides, saponinas,
cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas
condensadas e leucoantocianidinas. Entretanto, foram evidenciados mono e
sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, açúcares e flavonóides diferentes da quercetina,
kaempferol, luteolina e apigenina, reportadas na literatura em outras própolis (14-26).
Neste trabalho não foram visualizadas diferenças do perfil fotoquímico dos três
extratos etanólicos de própolis estudados.
A bioautografia realizada para mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteróides, e
flavonóides revelou apenas atividade antimicrobiana das bandas referentes aos
flavonóides, detectada pelas zonas de inibição do crescimento de S.aureus e E. faecalis.
A presença de flavonóides na própolis vermelha justifica sua atividade
antimicrobiana e corrobora aos dados obtidos por Burdock (2), que atribuiu aos
flavonóides e aos ácidos carboxílicos modificados, componentes majoritários e
estratégicos da própolis, a responsabilidade pela bioatividade, principalmente
antimicrobiana, contra vários microorganismos patogênicos. Como a composição da
própolis é variável, a qualidade e quantidade dos flavonóides presentes na amostra
exercem uma grande influência nesta atividade.
No Brasil, foram descritas propriedades biológicas e composição química
distintas para amostras de própolis coletadas em diferentes regiões do país. Essa
variação é devido à grande biodiversidade da flora brasileira, como também à
habilidade bioquímica das abelhas em alterar a composição nativa, adicionando-lhe
componentes próprios do seu metabolismo (5).
Há uma grande controvérsia em relação ao teor de flavonóides encontrados nas
amostras de própolis brasileiras (5). Bankova et al. (27) concluíram que as própolis
brasileiras têm uma baixa concentração de flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos,
mas possuem altas concentrações de ácido dihidroxicinâmico, acetofenonas preniladas e
alguns terpenóides específicos. No entanto Bankova et al. (28) descreveram a presença
de flavonóides como importantes componentes na própolis brasileira.
Os compostos prenilados descritos por Aga et al. (29) e majoritários em muitas
das amostras de própolis brasileira são responsáveis pela atividade antimicrobiana.
Marcucci et al. (30) afirmaram que a atividade antimicrobiana da própolis brasileira é
diretamente proporcional à quantidade de resíduos prenil presentes nas amostras.
Os resultados obtidos neste trabalho para a atividade antimicrobiana dos três
extratos etanólicos frente a 49 microrganismos estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos de própolis vermelha. Diâmetro do Halo de Inibição (mm)
Microorganismos
Extratos Etanólico 70% 80% 90%
Enterococcus faecalis IC 55671 9 11 11
Enterococcus faecalis IC 55918 12 10 12
Enterococcus faecalis IC 144 13 12 13
Enterococcus faecalis IC 068 11 12 9
Enterococcus faecalis IC 56671 9 15 10
Enterococcus faecalis IC 56354 11 10 11
Enterococcus faecalis IC 55995 11 12 11
Enterococcus faecalis IC 295 11 11 10
Enterococcus faecalis IC 222 12 15 12
Enterococcus faecalis IC 56288 12 11 10
Enterococcus faecalis ATCC 29212 10 10 9
Staphylococcus aureus IC 138 - - -
Staphylococcus aureus IC 27 - - -
Staphylococcus aureus IC 155 - - -
Staphylococcus aureus IC 311 11 10 10
Staphylococcus aureus IC 14 14 11 12
Staphylococcus aureus IC 15 12 12 11
Gram-positivos
Staphylococcus aureus IC 16 15 15 13
Staphylococcus aureus IC 404 16 16 8
Staphylococcus aureus IC 247 - - -
Staphylococcus aureus ATCC 6538 15 11 12
Pseudomonas aeruginosa IC 01 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 02 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 03 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 04 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 05 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 06 - - -
Gram-
negativos
Pseudomonas aeruginosa IC 07 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 10 - - -
Pseudomonas aeruginosa IC 15 - - -
Pseudomonas aeruginosa UFPEDA 39 - - -
Salmonella enterica sorovar. Panama 071 - - -
Salmonella enterica sorovar. Saint Paul 391 - - -
Salmonella enterica sorovar. Rublislaw 3373 10 8 -
Salmonella enterica sorovar. Anatum 873 - - -
Salmonella sorovar. enteritidis UFPEDA 415 - - -
Salmonella cholerae suis ATCC 14028 - - -
Escherichia coli 18 - - -
Escherichia coli ATCC 8739 - - -
Leveduras Candida albicans IC 01 9 10 11
Candida albicans IC 03 8 8 8
Candida albicans IC 06 7 8 7
Candida albicans IC 07 9 9 8
Candida albicans IC 08 8 8 8
Candida albicans IC 09 9 9 8
Candida albicans IC 10 9 8 8
Candida albicans IC 11 8 8 8
Candida albicans IC 12 10 8 8
Candida albicans IC 15 8 7 7
Os cocos Gram positivos representados pelos gêneros Staphylococcus e
Enterococccus foram os mais sensíveis aos EEPS quando comparados aos bacilos
Gram-negativos (Pseudomonas, Salmonella e Escherichia) e Candida albicans. Estes
resultados corroboram aos dados descritos por Grange e Davey, Fernandes Junior, Park
et al., Burdock, Fontana et al., Marcucci et al. (31,2,32-33, 30), que descreveram uma
atividade antimicrobiana de própolis direcionada para cocos e bacilos Gram-positivos
incluindo cepas de Staphylococcus meticilina resitentes e uma atividade limitada contra
bacilos Gram-negativos.
Os perfis de sensibilidade das cepas de S. aureus aos EEPS foram semelhantes e
discretamente superiores para o extrato etanólico a 70%, cuja média dos halos de
inibição do crescimento foi de 13,8 mm (Tabela 3). Todos os EEPS foram capazes de
inibir 60% dos estafilococos avaliados, incluindo cepas resistentes, mas os resultados
observados neste trabalho para a atividade antiestafilocócica dos EEPS 70%, 80% e 90%
não corroboram aos descritos por Fernandes Junior et al. (34) que encontraram as
maiores atividades antiestafilocócicas quando os extratos de própolis eram preparados
com solução de etanol de 60 a 80%v/v.
Todas as cepas de enterococcos foram sensíveis aos EEPS mas o EEP 80%
mostrou ser o mais eficaz, cuja média de inibição do crescimento foi da ordem de 11,7
mm.
Dos três EEPS avaliados, o EEP 70% foi discretamente mais ativo na inibição do
crescimento das cepas de Candida albicans, em média de 8,5mm.
Nenhum dos extratos avaliados apresentou atividade contra as cepas multi
resistentes do gênero Pseudomonas e Staphylococcus cepas IC 155, IC 27, IC 138, IC
247, nem sobre as salmonelas, à exceção de Salmonella enterica sorovar. Rublislaw
3373. Neste caso, os vários mecanismos específicos implicados no desenvolvimento da
multiresistência aos antimicrobianos estariam intrinsecamente relacionados à resistência
aos EEPS.
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