UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA

Avaliação do uso de probiótico, prebiótico e simbiótico na microbiota intestinal do camarão, Litopenaeus vannamei

Dissertação apresentada como requisito a obtenção do título de mestre em Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina Orientador: Edemar Roberto Andreatta, Dr. Co-orientador: Felipe do Nascimento Vieira, Dr.

Norha Constanza Bolívar Ramírez

Florianópolis 2011

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Avaliação do uso de probiótico, prebiótico e simbiótico na microbiota intestinal do camarão, Litopenaeus vannamei.

Por

NORHA CONSTANZA BOLÍVAR RAMÍREZ

Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de

MESTRE EM AQUICULTURA

e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.

_____________________________________ Prof. Evoy Zaniboni Filho, Dr.

Coordenador do Curso Banca Examinadora:

__________________________________________

Dr. Edemar Roberto Andreatta – Orientador

__________________________________________ Dra. Margherita Anna Antônia Maria Barracco

__________________________________________

Dr. Rubén Pablo Schocken-Iturrino

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador e amigo Edemar R. Andreatta pelos valiosos ensinos na área da carcinicultura e sua inestimável compreensão.

Ao meu coorientador e amigo Felipe Vieira pelo grande apoio,

compreensão e paciência durante todo o experimento. A José Luiz Mouriño pelas valiosas contribuições e ajuda. Aos meus amigos e colegas de trabalho do setor de Microbiologia

(LCM), Bruno, Jatobá, Gabriel, Gabi Pereira, Gabi Soltes, Kati e Mari por sua colaboração e por tornarem as horas de trabalho em horas mais amenas.

Ao Carlito pela prestatividade e paciência na secretaria da

PGAQI. A CAPES pelo apoio financeiro concedido para realização dos

meus estudos. A todos os professores do Departamento de Aquicultura. A todos os funcionários do LCM por sua prestatividade.

Ao Dimas por seu carinho e companhia durante esta fase da

minha vida. E finalmente, aos meus pais Germán e Cristina e minha irma

Marcela, por seu apoio e incentivo diário sendo minha fonte de inspiração, tornando tudo isto possível.

RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de prebiótico (inulina), probiótico (Lactobacillus plantarum) e simbiótico (Lactobacillus plantarum + inulina) no crescimento, microbiota intestinal, reposta imune e resistência ao desafio experimental com Vibrio alginolyticus em camarões Litopenaeus vannamei. A concentração de Vibrio spp. no trato digestório foi significativamente menor em camarões alimentados com dieta suplementada com prebiótico, probiótico e simbiótico, enquanto que a concentração de bactérias ácido lácticas foi significativamente superior somente nos camarões alimentados com probiótico e simbiótico. O valor aglutinante do soro frente à Vibrio alginolyticus foi significativamente maior no grupo probiótico e simbiótico antes da infecção, e maior em todos os tratamentos após infecção em relação ao controle. O número de hemócitos, a atividade da fenolixidase e a atividade antibacteriana do soro dos camarões não apresentaram diferenças significativas nos tratamentos comparados com o controle. Igualmente, não houve diferença no crescimento ou na sobrevivência dos camarões ao desafio por V. alginolyticus. Conclui-se que dietas probióticas, prebióticas e simbióticas, alteram a microbiota intestinal aumentando o título aglutinante do soro contra V. alginolyticus, contudo sem alterar o crescimento dos camarões ou a sobrevivência ao desafio por V. alginolyticus.

Palavras chaves: Camarões marinhos, Lactobacillus plantarum, inulina, simbiótico.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the use of prebiotics (inulin), probiotic (Lactobacillus plantarum) and synbiotic (Lactobacillus plantarum + inulin) on growth, intestinal microflora, immune response and resistance to experimental challenge with Vibrio alginolyticus in shrimp Litopenaeus vannamei. The concentration of Vibrio spp. in the digestive tract was significantly lower in shrimp fed diets supplemented with prebiotic, probiotic and synbiotic while the concentration of lactic acid bacteria was significantly higher only in shrimp fed probiotic and symbiotic. The value of serum agglutinating Vibrio alginolyticus front was significantly higher in the probiotic and synbiotic before infection, and increased in all treatments after infection compared to control. The number of hemocytes, phenoloxidase activity and serum antibacterial activity of the shrimp showed no significant differences of treatments compared with control. Also, no difference in growth or survival of shrimp were found to the challenge by V. alginolyticus. It was concluded that dietary probiotic, prebiotic and synbiotic alter intestinal microbiota and increase the serum agglutinating title against V. alginolyticus, yet without changing the shrimp growth or resistance to challenge by V. alginolyticus.

Keywords: Marine shrimp, Lactobacillus plantarum, inulin, synbiotic

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química da inulina (BOSSCHER, 2009)................ 23 Figura 2 Concentração de Vibrio spp (a) e bactérias ácido lácticas (b) no trato digestório de L vannamei alimentados com dietas suplementada com probiótico (Lactobacillus plantarum), prebiótico (inulina), simbiótico (L. plantarum + inulina) e controle nos dias 30 e 45. Letras diferentes indicam diferença significativa pela teste SNK de separação de média (p<0,05). .................................................. 36

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Contagem total de hemócitos (THC), atividade da enzima fenoloxidase (PO), título aglutinante contra Vibrio alginolyticus e Lactobacillus plantarum e atividade antimicrobiana do soro contra V. alginolyticus de camarões alimentados com dieta suplementada com probiótico (L. plantarum), prebióticos (inulina), simbiótico (L. plantarum + inulina) e grupo controle nos dias 30, 45 e após infecção com V. alginolyticus. .............................................................. 38 Tabela 2 Sobrevivência de camarões alimentados com prebiótico (inulina), probiótico (Lactobacillus plantarum), simbiótico (inulina + L. plantarum e grupo controle após 48 horas da infecção com Vibrio alginolyticus............................................................................... 39

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................... 17 1.1 VIBRIOSE E A CARCINICULTURA................................... 18 1.2 PROBIÓTICOS....................................................................... 19

1.2.1 Definição ................................................................ 19 1.2.2 Bactérias lácticas .................................................... 19 1.2.3 Probióticos na aquicultura ..................................... 20

1.3 PREBIÓTICOS....................................................................... 21 1.3.1 Definição ................................................................ 21 1.3.2 Inulina..................................................................... 22 1.3.3 Prebióticos na aquicultura ..................................... 23

1.4 SIMBIÓTICOS ....................................................................... 25 1.4.1 Definição ................................................................ 25 1.4.2 Simbióticos na Aquicultura .................................... 25

1.5 SISTEMA IMUNOLÓGICO DO CAMARÃO ...................... 26 2 OBJETIVOS.................................................................................... 27

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................... 27 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................. 27

3 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL E RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE LITOPENAEUS VANNAMEI ALIMENTADOS COM PREBIÓTICO, PROBIÓTICO E SIMBIÓTICO E DESAFIADOS COM VIBRIO ALGINOLYTICUS. 28 3.1 RESUMO ................................................................................ 29 3.2 ABSTRACT............................................................................ 30 3.3 INTRODUÇÃO ...................................................................... 31 3.4 MATERIAL E METODOS..................................................... 32

3.4.1 Material biológico e prebiótico.............................. 32 3.4.2 Condições experimentais ....................................... 32 3.4.3 Análise da microbiota do trato intestinal............... 33 3.4.4 Análises imunológicas ............................................ 33 3.4.5 Infecção experimental............................................ 35 3.4.6 Análises Estatísticas................................................ 35

3.5 RESULTADOS....................................................................... 35 3.5.1 Análise da microbiota do trato intestinal .................. 36 3.5.2 Análises imunológicas ................................................ 37

3.6 DISCUSSAO........................................................................... 39 3.7 CONCLUSOES....................................................................... 42 3.8 REFERENCIAS...................................................................... 42

4 REFERENCIAS DA INTRODUÇÃO............................................. 49

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1 INTRODUÇÃO A aquicultura mundial tem crescido significativamente nos

últimos 50 anos, sendo atualmente o setor de produção animal com maior incremento na produção. A produção da aquicultura mundial de organismos aquáticos, incluindo peixes, crustáceos, moluscos e outros animais aquáticos destinados ao consumo, alcançaram cerca de 52,5 milhões de toneladas em 2008 (FAO 2010). Na carcinicultura, o camarão branco do Pacífico, Litopenaeus vannamei, representa cerca de 95% da produção total na América Latina e 67% da produção mundial (FAO, 2008). O desenvolvimento da indústria levou à intensificação dos cultivos e consequentemente ao surgimento de enfermidades, principalmente de origens virais e bacterianas, resultando em perdas nos cultivos (LIGHTNER; REDMAN, 1998).

As enfermidades encontram uma fácil transmissão nos cultivos aquáticos devido às altas concentrações dos indivíduos e da rápida difusão dos agentes patogênicos no meio aquático (BERGER, 2000). A enfermidade bacteriana mais comumente encontrada no cultivo de camarões é a vibriose, causada por bactérias do gênero Vibrio. Estas bactérias são ubíquas no ambiente marinho e são encontradas naturalmente em camarões no ambiente de cultivo (ROQUE et al., 2001). Contudo, em condições de estresse são patógenos oportunistas ocasionando perdas significativas no cultivo de camarões marinhos. (AGUIRRE; ASCENCIO, 2000).

Os antibióticos têm sido comumente usados no tratamento contra as vibrioses. Embora, algum destes produtos possa diminuir a incidência de mortalidades, o mau uso na aquicultura tem levado ao aparecimento de bactérias resistentes (MORIARTY, 1997; BALCÁZAR et al., 2007; KESARCODI et al., 2008). Assim, é necessário buscar alternativas de enfrentamento a estas doenças, e entre elas, destacam-se as medidas preventivas.

A população microbiana do trato intestinal é um recurso natural complexo que pode ser utilizado em um esforço para reduzir o impacto de bactérias patogênicas nos cultivos (CALLAWAY et al., 2008). Estratégias como o uso de prebióticos, probióticos e simbióticos, têm sido desenvolvidas para reduzir as populações de bactérias patogênicas em animais durante a fase de cultivo. Estes produtos atuam modificando a microbiota intestinal, permitindo a colonização de bactérias benéficas e consequentemente impedindo a colonização por bactérias patogênicas no intestino do animal, melhorando o desempenho do mesmo (GÓMEZ-GIL et al., 2000). Adicionalmente, as bactérias benéficas presentes no

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trato digestório podem produzir substâncias imunoestimulantes (RINGO; GATESOUPE, 1998).

Além do mais, o potencial dos prebióticos, probióticos e simbióticos também estão baseados na ausência de toxicidade e de resíduos que possam gerar resistências e/ou contaminar o meio ambiente (BERGER, 2000).

1.1 VIBRIOSE E A CARCINICULTURA

As perdas na produção de camarões por conta das enfermidades, principalmente as de origem viral resaltando-se o WSSV, TSV e YHV (LIGHTNER, 2011), são incalculáveis. WSSV tem sido reportada por estar associada com o incremento das populações de Vibrio spp. nos tanques de cultivo de camarão (SUNG et al., 2001).

Diversas espécies de vibrios já foram reportadas como patogências para camarão como Vibrio dansela (SONG; CHENG; WANG, 1993), Vibrio harveyi (PASHARAWIPAS et al., 2005), Vibrio nigripulchritudo (GOARANT et al., 2006), Vibrio orientalis (ABRAHAM; PALANIAPPAN, 2004), Vibrio alginolyticus (VANDENBERGHE, 1998), Vibrio furnissii e Vibrio parahaemolyticus (SUNG et al., 1999). A vibriose ocasiona anorexia, inatividade, baixa taxa de crescimento e necrose muscular (CHIU et al., 2007). Em vibriose crônica, camarões mortos ou moribundos podem ser consumidos rapidamente pelos outros animais, contaminando outros indivíduos da população (LIGHTNER, 1996).

A presença do vibrio juntamente com alterações ambientais estressantes podem favorecer o aparecimento de infecção septicêmica localizada, afetando todos os órgãos e tecidos (LAVILLA-PITOGO; LEAÑO; PANER, 1998; AGUIRRE; ASCENCIO, 2000). O V. harveyi e V. alginolyticus são considerados como causa de doenças oportunistas durante o desenvolvimento de larvas e pós-larvas de camarões (MANEFIELD et al., 2000). Cepas da espécie V. harveyi causaram a “Síndrome da Gaivota” em 1989 e 1990 que foi a primeira enfermidade bacteriana em causar importantes perdas na produção de camarão no Equador (STERN, 1995). Estas bactérias também estão associadas com vibriose luminescente com a “síndrome de bolitas” que envolve o bloqueio da glândula digestiva com bolas de tecido (AUSTIN; ZHANG, 2006) e com a “síndrome de protozooéa” (AUSTIN; AUSTIN, 2007).

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1.2 PROBIÓTICOS

1.2.1 Definição

Elie Metchnikoff é considerado o primeiro pesquisador a trabalhar com o conceito de probióticos (FULLER, 1992). Ele descreveu os probióticos como “micróbios ingeridos com o objetivo de promover a boa saúde”. Esta mesma definição foi modificada a “organismos e substâncias que contribuem ao balanço microbiano intestinal” (PARKER, 1974), e posteriormente por Fuller (1989) a “um suplemento alimentício microbiano que afeta beneficamente o animal hospedeiro melhorando seu balanço microbiano intestinal”. Estas definições foram aplicadas originalmente para animais terrestres.

Porém para a aquicultura esta definição pode ser insuficiente, pois em ambientes aquáticos há uma constante interação entre os organismos cultivados e os micro-organismos presentes no ambiente.. Gatesoupe (1999) define os probióticos para aquicultura como “células microbianas que são subministradas de tal maneira que entrem no trato gastrointestinal e que sejam capazes de manter-se vivas, melhorando a saúde dos animais”. Também, Gram et al. (1999) ampliaram a definição eliminando a restrição a melhora apenas do intestino: “um suplemento microbiano vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro melhorando seu balanço microbiano”. 1.2.2 Bactérias lácticas

As bactérias ácido lácticas constituem um grupo de bactérias gram positivas, catalase-negativa, não esporuladas, em forma de cocos ou bacilos, e produzem ácido láctico como principal produto final durante a fermentação de carboidratos. São de hábitat anaeróbico, mas podem ser aeróbias facultativas e ácido tolerantes. Geralmente estão associadas com habitats ricos em nutrientes. No entanto podem estar presentes na flora nativa da boca, intestino e vagina de mamíferos. As delimitações do grupo tem sido assunto de algumas controvérsias, contudo os gêneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Streptococcus formam parte deste grupo (CARR; CHILL; MAIDA, 2002).

A classificação das bactérias lácticas em diferentes gêneros está baseada em grande medida na morfologia, no modo de fermentação da glicose, no crescimento a diferentes temperaturas, na configuração do ácido láctico produzido, na habilidade para crescer em altas salinidades, e na sua tolerância à acidez ou alcalinidade (SALMINEM, 2004).

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A utilização de bactérias ácido lácticas pode desempenhar um papel importante no controle de enfermidades ocasionadas por patógenos, inibindo-os por meio da produção de compostos como o ácido láctico, ácido acético, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas (VASQUEZ; GONZÁLEZ; MURADO ,2005).

1.2.3 Probióticos na aquicultura

Pesquisas com o uso de probióticos para animais aquáticos estão avançando junto com a demanda de um ambiente mais saudável na aquicultura (WANG, 2007).

Quando se fala do uso de probióticos na aquicultura é importante considerar alguns fatores importantes que são fundamentalmente diferentes aos fatores que se têm presentes na hora de selecionar probióticos para organismos terrestres, já que, os animais aquáticos tem uma relação muito mais estreita com seu ambiente externo (KESARCODI-WATSON et al., 2008). Os micro-organismos no ambiente aquático vivem em associação com o potencial hospedeiro (trato intestinal, brânquias ou epiderme/carapaça). Pelo contrario, no ambiente terrestre a maior atividade microbiana está localizada no intestino do hospedeiro. Desta forma, no meio aquático está estabelecido que as relações entre microbiota, incluindo probióticos e hospedeiros, não estão limitadas ao trato intestinal. As bactérias probióticas podem ser ativas nas brânquias, na pele e no intestino, como também no meio ambiente (VERSCHUERE, 2000).

Existem várias teorias que explicam o modo de atuação dos probióticos: exclusão competitiva de bactérias patogênicas, melhoramento da nutrição por subministro de nutrientes essenciais, incremento da nutrição por subministro de enzimas essenciais, obtenção direta de matéria orgânica transformada por bactérias e produção de substâncias que inibem o crescimento de patógenos oportunistas. (GARRIQUES; ARÉVALO, 1995).

Desta forma, a utilização de probióticos pode ajudar a reduzir as oportunidades dos ataques de patógenos nos casos previsíveis de estresse, como manipulações, transferências, variações ambientais, tratamentos químicos, e outros (BERGER, 2000).

Uma variedade de probióticos como Aeromonas hydrophila (IRIANTO, AUSTIN 2002), Bacillus subtilis (VASEEHARAN; RAMASAMY, 2003), Enterococcus faecium (CHANG; LIU, 2002), L. plantarum (VIEIRA et al., JATOBÁ et AL., 2008), L. rhamnosus (NIKOSKELAINEN et al., 2001) Pseudomonas fluorescens (GRAM et

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al.,1999) Saccharomyces cerevisiae (SCHOLZ; ACIL; SCHREZENMEIR, 1999), V. alginolyticus (AUSTIN et al., 1995; BALCÁZAR et al., 2007), têm sido considerados para uso na aquicultura. Contudo, destacam-se as bactérias ácido lácticas para uso como probióticos, por serem de fácil multiplicação, produzirem compostos antimicrobianos (bacteriocinas, peróxido de hidrogênio, ácidos orgânicos e ácido láctico) e por estimularem a resposta imune não específica nos hospedeiros (GATESOUPE, 2008).

Vários trabalhos já demonstraram os efeitos benéficos dos probióticos melhorando sua resistência frente a infecções atuando como imunoestimuladores em diferentes espécies de peixes como Oreochromis niloticus (KIM, AUSTIN, 2006, ALY et al., 2008), Labeo rohita (KUMAR et al., 2008) e Dicentrarchus labrax (PICCHIETTI et al., 2009)

Em camarões também se obtiveram resultados positivos. Camarões (Litopenaeus stylirostris) tratados com Pediococcus acicilactici alcançaram maiores sobrevivências quando comparado com o controle e uma menor prevalência de V. nigripulchritudo durante o ensaio (CASTEX et al., 2010). L. plantarum também demonstrou ser benéfica para o L. vannamei aumentando a resposta imune humoral e celular após desafio com V. alginolyticus (CHIU et al., 2007). VIEIRA et al., (2010) também comprovaram que L. plantarum aumentou a sobrevivência de L. vannamei após de infecção com V. harveyi.

1.3 PREBIÓTICOS

1.3.1 Definição

Anteriormente os prebióticos eram definidos como ingredientes alimentares não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro estimulando seletivamente o crescimento e/o atividade de uma o um determinado número de bactérias no intestino (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

Embora, o efeito prebiótico tem sido conferido a vários componentes dos alimentos, como oligosacarídeos e polisacarídeos, necessita-se considerar devidos critérios, pois nem todos os carboidratos da dieta são prebióticos.

Por isto, há uma necessidade de estabelecer critérios claros para classificar um ingrediente alimentar como prebiótico. Esta classificação requer uma demonstração científica de que o ingrediente: (1) resiste a acidez gástrica, hidrólise, enzimas e absorção gastrointestinal, (2) é fermentado pela microflora intestinal, (3) estimula seletivamente o

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crescimento de bactérias intestinais associadas com a saúde e o bem estar dos animais (GIBSON et al., 2004).

Os fructanos são uns dos prebióticos mais amplamente usados. Ocorrem naturalmente nos alimentos como também podem ser produzidos mediante processos hidrolíticos e enzimáticos dando origem a fructanos com cadeias de diversos tamanhos. Exemplos de fructanos incluem os fructooligossacarídeos (FOS). Os FOS de cadeia curta (scFOS), oligofructose (OF) e inulina, como também inúmeras combinações de diferentes comprimentos de cadeias. Geralmente, os fructanos contém uma cadeia linear de frutose, que pode variar de duas a 60 unidades de extensão com ou sem a unidade de glicose no final da cadeia e resistem a hidrólise digestiva devido a sua ligação ß –(2,1) (FLICKINGER et al., 2003).

Outros prébióticos muito estudados são os mananoligossacarídeos (MOS), que como os fructanos, possuem diferentes formas disponíveis, tendo diferenças na sua capacidade de influenciar a microbiota intestinal. Os MOS são capazes de se unir com determinada microbiota intestinal devido ao seu componente de manano em sua estrutura. A forma mais simples de MOS é a levedura Saccharomyces cerevisiae sem modificações, que parece atuar como um prebiótico, devido em parte à MOS que se encontra na parede celular (SPRING et al., 2000).

Os oligossacarídeos da soja também recebem atenção como suplementos prebióticos. São usados na forma intacta da soja ou como rafinose e estaquiose purificadas para determinar seu efeito individual ou em conjunto (BARREY, VESTER, FAHEY, 2009).

Por último, estão os galactooligossacarídeos (GOS) que são produzidos ao submeter lactose à galactosiltranferase microbiana (TZORTIS et al., 2005), e os trans-galactoolissacarídeos (TGOS/TOS) que são hidrossolúveis e contém unidades de galactose com ligação – ß que previne a hidrólise digestiva (HOUDIJK et al., 1998).

1.3.2 Inulina

Inulina é um termo aplicado a uma mistura heterogênea de polímeros de frutose diferindo dos fructooligossacarídeos, um subgrupo da inulina, pelo grau de polimerização (DP): inulina DP>10 e FOS DP ≤ 10 (NINESS, 1999). É constituída principalmente de enlaces ß (2-1) de fructosil-frutose onde o número destes enlaces ligados a uma glicose terminal pode variar de duas a 70 unidades. Isto significa que a inulina é uma mistura de oligômeros e polímeros (BOSSCHER, 2009) (Figura 1). A inulina pode ser encontrada naturalmente no alho, cebola, chicória,

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trigo, alcachofra e banana. Em escala industrial, os frutanos do tipo inulina são obtidos a partir das raízes de chicória e posteriormente a inulina e os oligossacarídeos são processados e purificados para serem usados como ingredientes de alimentos funcionais (ROBERFROID, 1993).

Figura 1: Estrutura química da inulina (BOSSCHER, 2009).

Existe uma grande evidência de estudos in vitro e em modelos animais e humanos, que a inulina possui efeitos positivos na regulação intestinal, e no combate a infecções e inflamações intestinais (LEENEN; DIELEMAN, 2007; WINKLER; BUTLER; SYMONDS, 2007), ao combate do câncer de cólon (POOL-ZOBEL; VAN LOO; ROBERFROID, 2002), atividade imuno-moduladora (SEIFERT; WATZ, 2007) e absorção mineral (SCHOLZ-AHRENS; ACIL; SCHREZENMEIR, 2002), mas também nos seus efeitos externos ao intestino que afetam o metabolismo do açúcar e lipídeos (FIORDALISO et al., 1995; DELZENNE et al., 2002).

A origem destes efeitos está baseada na sua fermentação pela microbiota endógena do intestino. Ela não é digerida nem absorvida pelo trato digestório e é seletivamente fermentada pela microbiota intestinal, incrementando o crescimento e atividade de bactérias probióticas como as bactérias lácticas (BOSSCHER, 2009).

1.3.3 Prebióticos na aquicultura

É sabido que a inclusão na dieta de pequenas quantidades de prebióticos pode estimular o crescimento de bactérias benéficas, como por exemplo, as bactérias ácido lácticas (MACFARLANE MACFARLANE; CUMMINGS, 2006). Assim, com o uso de prebiótico é possível alterar a microbiota intestinal propiciando o crescimento de bactérias probióticas, reduzindo a susceptibilidade a enfermidades e melhorando o desempenho do hospedeiro (BURR; GATLIN; RICKE,

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2005). Apesar dos benefícios para a saúde e desempenho obtidos em animais terrestres, o uso dos prebióticos na áxima tura tem sido pouco pesquisado.

Alguns parâmetros como o crescimento, microbiota intestinal, imunologia e conversão alimentar, entre outros, já foram estudados em peixes alimentados com prebióticos. Um exemplo destes estudos foi o realizado com o peixe vermelho (Sciaenops ocellatus) onde animais alimentados com prebióticos melhoraram sua eficiência alimentar e aumentaram sua proteção contra patógenos (BUENTELLO; NEILL; GATLIN, 2010). No linguado (Psetta áxima), a taxa de crescimento e o peso dos animais alimentados com oligofructose foi significativamente maior que a dos animais do grupo controle. Igualmente, a microbiota intestinal dos animais alimentados com o prebiótico foi alterada, encontrando-se uma maior concentração de Bacillus sp., bactérias conhecidas por possuir atividade probiótica (MAHIOUS et al., 2006). Em salmonídeos os parâmetros imunológicos melhoraram depois do fornecimento de FOS e MOS na alimentação, em comparação com os grupos controles (GRISDALE-HELLAND; HELLAND; GATLIN, 2008). Em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), alimentadas com mananoligossacarídeos houve um maior ganho de peso, menor mortalidades e incrementou a atividade de alguns parâmetros imunológicos como o título de anticorpos no soro, atividade bactericida e atividade da lisozima (YILMAZ et al., 2007).

Em crustáceos, estudos demonstraram que camarões L. vannamei aumentaram o número de hemócitos e sua capacidade de se ligar a espécies reativas de oxigênio em resposta a alimentação com dieta suplementada com 0,2% de scFOS (LI et al., 2009). Do mesmo modo, outro trabalho obteve resultados positivos ao alimentar L. vannamei com scFOS melhorando a taxa de crescimento, consumo de ração e conversão alimentar (ZHOU; DING; HUIYUAN, 2007).

Larvas de lagosta européia (Homarus gammarus) suplementadas com prebiótico apresentaram maior taxa de crescimento, sobrevivência e também um aumento no número de microvilosidades na superfície do trato digestivo (DANIELS et al., 2010)

Não obstante, também tem se obtido resultados negativos ou sem diferenças em alguns estudos. É o caso de pesquisas realizadas por Burr et al. (2010) com um peixe hibrido de Morone chrysops e Morone saxatilis, onde a alimentação com quatro prebióticos diferentes (GroBiotic®-A, inulina, MOS e GOS), não alteraram a eficiência alimentar, crescimento e nem a proteção contra possíveis bactérias patogênicas que poderiam colonizar o intestino. Igualmente

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CEREZUELA et al. (2008) não encontrou diferenças no sistema imune entre douradas (Spaurus aurata) suplementados com inulina e sem suplementação.

1.4 SIMBIÓTICOS

1.4.1 Definição

Simbióticos constituem uma aplicação combinada dos probióticos e prebióticos baseada no princípio de oferecer uma vantagem competitiva (uma fonte de energia fermentável), melhorando a sobrevivência e a colonização de microorganismos probióticos no trato gastrointestinal e promovendo a saúde do hospedeiro (DANIELS et al., 2010; MERRIFIELD et al., 2010). Uma boa combinação do probiótico com um prebiótico é um pré-requisito para obter o máximo efeito benéfico do simbiótico (BOSSCHER, 2009) reduzindo a concentração de patógenos e enfermidades (COLLINS; GIBSON, 1999; SCHREZENMEIR; DE VRESE, 2001).

1.4.2 Simbióticos na Aquicultura

O uso de probióticos na aquicultura, em muitos casos, é dificultado por causa da diminuição da viabilidade da bactéria durante a granulação, o tempo de armazenamento e lixiviação da partícula na água durante a alimentação, assim como os problemas relacionados ao manejo dos alimentos e sua preparação. Como alternativa, o uso de prebióticos associados a probióticos (simbióticos) têm sido avaliado para superar estes problemas (MERRIFIELD et al. 2010).

Na aquicultura, o uso de simbióticos não tem sido intensivamente estudado até o momento. Alguns estudos realizados evidenciaram bons resultados no uso de simbióticos. Por exemplo, um estudo realizado com pepino do mar (Apostichopus japonicus), demonstrou que dietas com B. subtilis e FOS tiveram ter um efeito sinérgico, melhorando a resposta imune e a resistência frente a enfermidades (ZHANG et al., 2010). Em outro estudo realizado em salmonídeos (RODRIGUEZ-ESTRADA et al., 2009) revelou que a alimentação simbiótica (E. faecalis + MOS) produzia resultados significativamente melhores com relação à resposta imune e sobrevivência no desafio com V. anguillarum, do que a aplicação individual do probiótico e o prebiótico. Igualmente o efeito sinérgico de prebiótico e probiótico foi comprovado por Li et al. (2009) em camarões L. vannamei em animais alimentados com isomaltooligosacarideos (IMO) em combinação com Bacillus sp. Obteve

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melhores resultados na resposta imune e na resistência frente a WSSV, comparado com camarões alimentados unicamente com IMO.

1.5 SISTEMA IMUNOLÓGICO DO CAMARÃO

Como invertebrados, os camarões carecem de um sistema imune

adaptativo, por tanto, seu sistema de defesa está baseado num sistema imune inato para reconhecer os patógenos invasores. O sistema imunológico dos crustáceos está intimamente relacionado ao seu sangue ou hemolinfa e às células circulantes, hemócitos (BARRACO et al., 2008)

O sistema imune de camarões pode ser utilizado para avaliar o estado de saúde dos animais, através de alguns parâmetros hemato-imunológicos. Vários autores têm trabalhado sobre a quantificação dos diferentes parâmetros celulares e humorais da resposta imune de espécies cultivadas de camarões. Entre as ferramentas disponíveis se encontram os hemogramas, quantificação da atividades da fenoloxidase, atividade antibacteriana e atividade aglutinante do soro (SUNG et al., 1996; LE MOULLAC et al., 1997; SANCHEZ et al., 2001; MAGGIONI et al., 2004).

Os hemogramas avaliam o número de hemócitos e a proporção de cada tipo celular presente na hemolinfa. O número de hemócitos presentes na hemolinfa tem um papel importante nos mecanismos imunes celulares (LORENZON et al., 2001; BARRACO, 2004; BARRACO et al., 2008). Alterações de fatores ambientais, a presença de infecções, alterações fisiológicas e fatores nutricionais, podem levar a uma deficiência imunológica (SANCHEZ et al., 2001).

O sistema pró-fenoloxidase (proPO), possui uma importante função no sistema de defesa do camarão. O sistema proPO pode ser ativado por componentes da superfície de microrganismos, como os lipopolissacarídeos (LPS ) de bactérias Gram-negativas, peptidoglicanos de bactérias Gram-positivas e β-1,3-glicanas de fungo, resultando numa série de reações proteolíticas em cascata, que levam a ativação da enzima fenoloxidase (PO) responsável pela reação de melanização. (PERAZZOLO; BARRACO, 1997). Durante este processo ocorre a produção de moléculas altamente tóxicas como quinonas e espécies reativas de oxigênio, que levam a neutralização e/ou destruição dos patógenos invasores . A avaliação da atividade da enzima PO constitui um dos parâmetros imunológicos mais importantes na avaliação da condição de saúde de camarões (RODRÍGUEZ; LE MOULLAC, 2000; BARRACO et al., 2008).

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Outro importante processo do sistema imunológico de crustáceos é a atividade antimicrobiana da hemolinfa, que possui peptídeos antimicrobianos (PAMs). Estas moléculas funcionam como antibióticos naturais produzidos nos hemócitos e secretados para o plasma durante as infecções, e podem apresentar um amplo espectro de atividade contra diferentes micro-organismos, além de possuir baixa especificidade. A concentração destes PAMs pode variar em animais sob condições de estresse. (BARRACCO et al., 2008).

Proteínas chamadas lectinas ou aglutininas são proteínas de reconhecimento de padrões moleculares (PRP) que estão presentes na hemolinfa e são capazes de causar aglutinação celular ao se ligar especificamente a carboidratos da superfície de diferentes células, incluindo microrganismos. Também estão implicadas na opsonizacão aumentando a capacidade fagocítica dos hemócitos, na adesão celular e na formação de nódulos (MARQUES; BARRACO, 2000; LEE; SÖDERHÄLL, 2002).

A dissertação está redigida na forma de artigo científico de acordo com as normas do “Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia”.

2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL

Contribuir para o desenvolvimento de um pacote tecnológico para o uso de probióticos, prebióticos e simbióticos na carcinicultura.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar o efeito de dieta suplementada com o probiótico Lactobacillus plantarum, do prebiótico inulina e da combinação destes dois (simbiótico) em camarões marinhos (Litopenaeus vannamei):

a) Na microbiota bacteriana intestinal (bactérias totais, Vibrio spp. totais; e bactérias ácido lácticas totais)

b) Na taxa de crescimento dos camarões.

c) Nos parâmetros imunológicos (contagem total de hemócitos, atividade da enzima fenoloxidase, e atividade aglutinante e antimicrobiana do soro).

d) Na resistência dos camarões ao desafio experimental por Vibrio alginolytiucus

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3 AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL E RESPOSTA IMUNOLÓGICA DE LITOPENAEUS VANNAMEI ALIMENTADOS COM PREBIÓTICO, PROBIÓTICO E SIMBIÓTICO E DESAFIADOS COM VIBRIO ALGINOLYTICUS

Norha C. Bolívar*, Walter Q. Seiffert, Felipe do N. Vieira, José Luiz P. Mouriño, Gabriel F. A. Jesus , Gabriella Soltes, Edemar R. Andreatta

Laboratório de Camarões Marinhos, Departamento de ymbiotic a, Universidade Federal de Santa Catarina, Brasil. Servidão dos Coroas s/n (fundos), Barra da Lagoa, Florianópolis, SC, Brazil. CEP: 88061-600. Tel: 55 48-32313410 FAX: 55 48-32313434

• E-mail: norhabolivar@yahoo.com (N.C. Bolívar)

*Artigo formatado de acordo com as normas da revista “Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia”

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3.1 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de prebiótico (inulina), probiótico (Lactobacillus plantarum) e simbiótico (Lactobacillus plantarum + inulina) no crescimento, microbiota intestinal, reposta imune e resistência ao desafio experimental com Vibrio alginolyticus em camarões Litopenaeus vannamei. A concentração de Vibrio spp. No trato digestório foi significativamente menor em camarões alimentados com dieta suplementada com prebiótico, probiótico e simbiótico, enquanto que a concentração de bactérias ácido lácticas foi significativamente superior somente nos camarões alimentados com probiótico e simbiótico. O titulo aglutinante do soro frente à Vibrio alginolyticus foi significativamente maior no grupo probiótico e simbiótico antes da infecção, e maior em todos os tratamentos após infecção em relação ao controle. O número de hemócitos, atividade da fenoloxidase e a atividade antibacteriana do soro dos camarões não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos comparados com o controle. Igualmente, não houve diferença no crescimento ou na sobrevivência dos camarões ao desafio por V. alginolyticus. Conclui-se que dietas probióticas, prebióticas e simbióticas, alteram a microbiota intestinal aumentando o título aglutinante do soro contra V. alginolyticus, contudo sem alterar o crescimento dos camarões ou a resistência ao desafio por V. alginolyticus.

Palavras chaves: Camarões marinhos, Lactobacillus plantarum, inulina.

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3.2 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the use of prebiotics (inulin), probiotic (Lactobacillus plantarum) and ymbiotic (Lactobacillus plantarum + inulin) on growth, intestinal microflora, immune response and resistance to experimental challenge with Vibrio alginolyticus in shrimp Litopenaeus vannamei. The concentration of Vibrio spp. In the digestive tract was significantly lower in shrimp fed diets supplemented with prebiotic, probiotic and ymbiotic while the concentration of lactic acid bacteria was significantly higher only in shrimp fed probiotic and symbiotic. The value of serum agglutinating Vibrio alginolyticus front was significantly higher in the probiotic and ymbiotic before infection, and increased in all treatments after infection compared to control. The number of hemocytes, phenoloxidase activity and serum antibacterial activity of the shrimp showed no significant differences of treatments compared with control. Also, no difference in growth or survival of shrimp were found to the challenge by V. alginolyticus. It was concluded that dietary probiotic, prebiotic and ymbiotic alter intestinal microbiota and increase the serum agglutinating title against V. alginolyticus, yet without changing the shrimp growth or resistance to challenge by V. alginolyticus.

Keywords: Marine shrimp, Lactobacillus plantarum, inulin.

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3.3 INTRODUÇÃO As perdas na produção de camarões cultivados pelo efeito das

doenças, principalmente as de origem viral como o WSSV, TSV e YHV (Ligtner e Redman, 1998), são incalculáveis. As doenças causadas por bactérias oportunistas também causam perdas importantes na carcinicultura marinha. Diversas espécies já foram reportadas como patogênicas: Vibrio dansela (Song et al., 1993), Vibrio harveyi (Pasharawipas et al., 2005), Vibrio nigripulchritudo (Goarant et al., 2006), Vibrio orientalis (Abraham e Palaniappan, 2004), V. alginolyticus (Vandenberghe, 1998), Vibrio furnissii e Vibrio parahaemolyticus (Sung et al., 1999), Flexibacter maritimus (Mouriño et al., 2008), sendo as de maior importância as do gênero Vibrio.

Para o controle de Vibrio spp. E outras bactérias patogênicas, a utilização profilática e terapêutica de antibióticos têm sido a estratégia mais utilizada na qüicultura ( qüic-Gil et al., 2000). Porém, estes antibióticos são uma fonte de poluição ambiental (Boyd e Massaut, 1999) e as bactérias patogênicas podem facilmente desenvolver resistência (Karunasagar et al., 1994).

Como alternativa, vem crescendo o interesse da indústria aquícola pel uso de probióticos, prebióticos e simbióticos (Gatesoupe, 2008). Probióticos são definidos como: “microorganismo vivo que coloniza o trato digestivo dos animais com o objetivo de melhorar a saúde destes animais” (Gatesoupe, 1999). Já os prebióticos são ingredientes da dieta não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro ao selecionar e estimular o crescimento de bactérias benéficas no trato intestinal (Gibson e Roberfroid, 1995). Já a combinação de probióticos e prebióticos em um mesmo alimento é chamada de simbiótico (Holzapfel e Schillinger, 2002).

Entre as bactérias probióticas utilizadas na qüicultura, destacam-se as bactérias ácido lácticas, por serem de fácil multiplicação, por produzirem compostos antimicrobianos (bacteriocinas, peróxido de hidrogênio, ácidos orgânicos e láctico) e por estimularem a resposta imune não específica nos hospedeiros (Gatesoupe, 2008). Chiu et al (2007), demonstraram que dietas suplementadas com Lactobacillus plantarum induziram à modulação imune e melhoraram a capacidade imunológica além de incrementar à resistência contra V. alginolyticus. Outros trabalhos também relatam o benefício do uso destas cepas suplementadas à dieta em L. vannamei (Ramírez, 2006; Vieira et al, 2007, 2008, 2010).

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A inclusão na dieta de pequenas quantidades de prebióticos, como o polissacarídeo inulina, pode estimular o crescimento de bactérias benéficas, como as bactérias ácido lácticas (Macfarlane et al., 2006).

Em espécies aquáticas, o uso de inulina na dieta vem sendo estudado em diversas espécies de peixe como tilápias (Tilapia aureus) e carpa capim (Ctenopharyngodon idellus) (Wang e Wang, 1997), linguado europeu (Psetta qüicu) (Mahious et al, 2006) e salmão do atlântico (Salmo salar) (Refstie et al., 2006). Contudo, nenhum estudo foi encontrado com a utilização de inulina em camarões marinhos. Já os simbióticos vêm sendo muito utilizados em mamíferos (Mussato e Mansilha, 2007) porém, pouco se sabe sobre os possíveis benefícios do seu uso na qüicultura.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de prebiótico (inulina), probiótico (Lactobacillus plantarum) e simbiótico (Lactobacillus plantarum + inulina) no crescimento, microbiota intestinal, reposta imune e resistência ao desafio experimental com Vibrio alginolyticus de camarões Litopenaeus vannamei.

3.4 MATERIAL E METODOS

3.4.1 Material biológico e prebiótico

Foram utilizados camarões marinhos da espécie Litopenaeus vannamei com 6±1,3g provenientes do Laboratório de Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina. A cepa de bactéria ácido láctica Lactobacillus plantarum foi utilizada como probiótico. Esta bactéria foi isolada dos camarões cultivados (Vieira et al., 2007) e mantida na coleção de microorganismos do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) sob o número de acesso CPQBA 007-07 DRM01. O prebiótico utilizado foi inulina da marca comercial Orafti® HPX.

3.4.2 Condições experimentais

Foram utilizados 16 tanques de 10.000L povoados com 200 camarões em delineamento totalmente ao acaso, com quatro tratamentos em quadruplicata. Durante seis semanas animais de cada tanque foram alimentado com uma dieta experimental contendo: i) ração comercial suplementada com 0,5% inulina, ii) ração comercial suplementada com 107 UFC/g de Lactobacillus plantarum, iii) ração comercial

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suplementada com 0,5% de inulina + 107 UFC/g de Lactobacillus plantarum, iv) ração controle (sem suplementação). Os probióticos foram incluídos na dieta de acordo com a metodologia descrita por Vieira et al. (2008) inoculando 10% do oncent da bactéria láctica na ração. Na inclusão do prebiótico, a dieta comercial foi previamente moída e adicionada a oncentração de 0,50% de inulina para homogeneização. Depois de homogeneizadas, as misturas passaram por um processo de peletização e secagem por 18h a 450C com circulação de ar. Para a preparação do simbiótico, foi incluído o 10% do probiótico na ração com inulina 0,5%.

A ração foi fornecida quatro vezes ao dia em uma quantidade equivalente a 3% de biomassa, sendo ajustada semanalmente de acordo com as biometrias (15 animais por tanque). A temperatura da água foi mantida em 26 ± 1°C e a salinidade em 30ppm. A água dos tanques foi renovada todos os dias até retirar os restos de alimento, fezes e mudas. O Ph e amônia dos tanques também foram mensurados uma vez por semana para moitorar a qualidade da água.

3.4.3 Análise da microbiota do trato intestinal

Foram amostrados tratos digestivos de 10 camarões por tanque (dois pools de cinco camarões) após 30 e 45 dias. O tratos intestinais foram homogeneizados em um gral e diluídos serialmente (1/10) em solução salina estéril 3% (SSE) e semeados em meio de cultura Agar Marinho, Agar tiossulfato citrato bile sacarose (TCBS) e Agar MRS para contagem de bactérias heterotróficas viáveis, vibrionáceas e bactérias lácticas respectivamente. Os intestinos semeados nas placas de Petri foram incubados em estufa e a temperatura foi mantida em 30°C.

Posteriormente, foram efetuadas contagens totais de unidades formadoras de colônias (UFC) após 24 horas de incubação nos meios de cultura Agar Marine e Agar TCBS. No meio Agar MRS as contagens foram feitas após 48 horas. Das colônias crescidas em MRS, foi feita a coloração de Gram para comparação morfológica da cepa probiótica.

3.4.4 Análises imunológicas

A hemolinfa foi obtida do sinus ventral de dois pools de cinco camarões de cada tanque (cerca de 300 uL por animal). As amostras foram coletadas com seringas estéreis de 1 mL de agulha 21G resfriadas a 4°C.

Da hemolinfa coletada, 10 uL foram fixados em solução anticoagulante Alsever modificado (MAS) (citrato de sódio 27mM,

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EDTA 9mM, glicose 115mM, NaCl 336mM, pH 7,2) com 4% de formaldeído para contagem total de hemócitos (THC). O restante foi deixado coagular a 4°C e posteriormente foi centrifugado repetidamente a 10.000 x g por 10 minutos para obtenção do soro que foi aliquotado e estocado a -20°C.

O número de hemócitos por mililitro de hemolinfa foi estimado por contagem direta em câmara de Neubauer.

A concentração de proteína na hemolinfa foi estimada pelo método de Bradford (1976), utilizando soro-albumina bovina como padrão.

A atividade da PO foi determinada por espectrofotometria (490nm) pela formação do pigmento DOPA-cromo, após a oxidação do substrato L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). As amostras do soro foram diluídas (1:9) em TBS-1 (1mM Tris, 336mM NaCl, 5mM CaCl2, 10mM MgCl2, pH 7.6). Desta solução, 50 uL foram incubados em um volume igual de tripsina (Sigma, 1mg/mL), indutor enzimático em microplacas de 96 poços (fundo chato) por 5 min a 25°C. Após incubação, foi adicionado um volume de 50 µL de L-DOPA (Sigma, 3mg/mL) em cada poço. Nos controles, o soro ou a tripsina foram substituídos por TBS-1. A formação do DOPA-cromo foi monitorada em Leitora de Microplaca (490 nm) após 5, 10, 15 e 20 min. A atividade da PO foi expressa em unidades de atividade da enzima (U) através da variação de 0,001 na absorbância/minuto/miligrama de proteína (Söderhäll & all, 1984) por 15 minutos a 20°C. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Para a atividade aglutinante do soro, se utilizaram o V. alginolyticus e L. plantarum inativados com 0,5% de formalina e ajustados a uma concentração de 0.4nm em um comprimento de onda de 550nm. Amostras de 50uL de soro foram diluídas serialmente em TBS-2 (50mM Tris, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 5mM MgCl2, pH 7.4) em placas de 96 micro-poços com fundo côncavo. A cada amostra de soro foram adicionados 50uL de bactéria inativada para avaliar a capacidade aglutinante frente a cada bactéria (V. alginolyticus e L. plantarum). As amostras foram incubadas durante 18h a 25°C em câmara úmida. O controle foi feito substituindo o soro por TBS-2. O valor aglutinante foi definido como o recíproco da última diluição que teve a capacidade de aglutinar as bactérias inativadas.

Para determinar a atividade antimicrobiana do soro o V. alginolyticus com 24 horas de crescimento teve sua concentração ajustada a 103 UFC/mL em leitor de microplaca (densidade óptica de 630 nm) diluindo em meio PWS (peptone water saline) com 1,5% de peptona e 1,5% de NaCl, pH 7,4. Em placas de 96 micro-poços (fundo

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chato), amostras de 100 µL de meio PWS foram colocados em todos os poços das linhas utilizadas da microplaca. Posteriormente 100 µL de amostra do soro foram adicionados no primeiro poço e diluídos serialmente. A cada poço foram colocados 20 µL da solução diluída de V. alginolyticus. As placas foram incubadas por 24h a 30°C. Para os controles, as amostras de soro foram substituídas por SSE (2%). A DO das amostras foi feita a 630 nm e os resultados foram expressos por miligramas de proteína.

3.4.5 Infecção experimental

Depois de seis semanas de alimentação, 15 camarões de cada tanque foram transferidos para caixas de 40L de água (30ppm). Cada camarão foi injetado no sinus ventral com 25uL de V. alginolyticus diluído em solução salina a uma concentração de 108 UFC/mL e o grupo controle foi injetado com 25 uL de SSE. A sobrevivência foi avaliada 48h após a infecção. Posteriormente, cinco camarões de cada tanque (um pool de cinco camarões) foram retirados para coleta de hemolinfa para análises dos parâmetros imunológicos (THC, atividade da PO, título aglutinante do soro e atividade antimicrobiana do soro).

3.4.6 Análises Estatísticas

Os valores das contagens totais de hemócitos e contagens bacterianas foram transformados para log(x+1) para normalização e homogeneização das variâncias. Os valores da atividade antimicrobiana e atividade aglutinante do soro foram transformados para log2(x) e os de sobrevivência em arcoseno(x). Foi utilizada análise de variância com parcelas subdivididas no tempo (α<0,05) para os dados obtidos durante a engorda experimental. Para os dados obtidos após o desafio experimental foi utilizada análise de variância unifatorial (α<0,05). Em caso de diferenças significativas, foi utilizado o teste Student Newman Keuls (SNK) de separação de médias (Zar, 1984).

3.5 RESULTADOS

Após seis semanas de cultivo, não foram observadas diferenças

no crescimento camarões dos diferentes tratamentos, atingindo uma média de 12,6±0,22g, 12,7±0,45g, 12,5±0,33g e 12,6±0,35 nos tratamentos prebiótico, probiótico, simbiótico e grupo controle respectivamente.

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3.5.1 Análise da microbiota do trato intestinal

Nas duas coletas realizadas, o trato digestório dos camarões apresentaram contagens superiores (p<0,05) de Vibrio spp. No grupo controle em relação aos demais tratamentos. (Figura 2ª). Para bactérias ácido lácticas, a concentração foi superior (p<0,05) no trato digestório dos camarões alimentados com simbiótico e probiótico (Figura 2b) Já para concentração de bactérias heterotróficas viáveis não foi encontrada diferença (p≥0,05).

Figura 2 Concentração de Vibrio spp (a) e bactérias ácido lácticas (b) no trato digestório de L vannamei alimentados com dietas suplementada com probiótico (Lactobacillus plantarum), prebiótico (inulina), simbiótico (L. plantarum + inulina) e controle nos dias 30 e 45. Letras diferentes indicam diferença significativa pela teste SNK de separação de média (p<0,05).

A coloração de Gram realizada das colônias crescidas em Agar MRS, revelou bacilos Gram positivos em pares, morfologia semelhante ao L. plantarum usado como probiótico na alimentação.

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3.5.2 Análises imunológicas

O título aglutinante do soro contra V. alginolyticus foi significativamente superior (p<0,05) no grupo probiótico e simbiótico antes da infecção, e significativamente superior (p<0,05) em todos os tratamentos após infecção (Tabela 1). Já o título aglutinante do soro contra L. plantarum não apresentou diferenças (p≥0,05) entre os tratamentos durante as seis semanas de alimentação nem após infecção.

Houve uma tendência no aumento da THC dos camarões alimentados com prebiótico, probiótico e simbiótico comparado com o grupo controle após infecção. Igualmente, a atividade antibacteriana do soro após infecção foi numericamente superior nos camarões do grupo probiótico e simbiótico. Porém, a THC, a atividade antibacteriana do soro dos camarões contra V. alginolyticus e a atividade da PO não apresentaram diferenças estatísticas significativas (p≥0,05) entre os tratamentos antes ou após o desafio.

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Tabela 1 Contagem total de hemócitos (THC), atividade da enzima fenoloxidase (PO), título aglutinante contra Vibrio alginolyticus e Lactobacillus plantarum e atividade antimicrobiana do soro contra V. alginolyticus de camarões alimentados com dieta suplementada com probiótico (L. plantarum), prebióticos (inulina), simbiótico (L. plantarum + inulina) e grupo controle nos dias 30, 45 e após infecção com V. alginolyticus.

THC (x106/mL) Coleta (dias) Controle Prebiótico Probiótico Simbiótico

30 27,2±7,2ª 32,1±1,9ª 15,4±2,1ª 20,2±5,1ª 45 48,1±8,6ª 28,0±2,8ª 23,8±3,3ª 26,0±3,7ª

Infecção 27,6±5,7ª 23,9±3,7ª 33,6±5,3ª 26,0±1,7ª

Atividade da PO (U/min/mg) Coleta (dias) Controle Prebiótico Probiótico Simbiótico

30 24,2±12,8ª 22,0±8,1ª 16,5±3,4ª 30,3±21,0a 45 27,3±8,8ª 20,3±5,22ª 22,4±7,9ª 26,6±2,4ª

Infecção 43,8±13,3ª 20,6±4,46ª 31,6±10,5ª 43,3±22,5ª Título aglutinante do soro contra Vibrio alginolyticus (Log 2)

Coleta (dias) Controle Prebiótico Probiótico Simbiótico 30 6,6±0,2ª 6,7±0,5ª 8,5±0,7b 8,6±1,2b 45 4,6±0,2ª 5,0±0,5ª 7,6±0,47b 8,0±0,9b

Infecção 0,3±0,6ª 1,7±1,5b 2,2±1,5b 3,2±0,9b Valor aglutinante do soro contra Lactobacillus plantarum (Log 2)

Coleta (dias) Controle Prebiótico Probiótico Simbiótico 30 3,3±0,5ª 3,1±0,2ª 3,1±0,2ª 3,6±0,5ª 45 2,0±0,4ª 3,0±0,4ª 3,3±0,3ª 3,6±0,5ª

Infecção 3,3±0,6ª 2,5±0,6ª 3,5±1,3ª 3,0±0,0a

Atividade antimicrobiana no soro (mg proteína) Coleta (dias) Controle Prebiótico Probiótico Simbiótico

30 59,1±84,8ª 51,4±6,7ª 31,1±8,0a 27,2±8,9ª 45 133,5±72,6ª 153,9±76,7ª 83,3±51,6ª 135,3±90,0a

Infecção 89,9±51,8ª 91,1±77,6ª 29,1±10,0a 67,3±51,8ª Letras diferentes indicam diferença significativa pela teste SNK de separação de média (p<0,05).

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Igualmente, a sobrevivência dos camarões após 48h do desafio com V. alginolyticus não apresentou diferenças (p>0,05) entre os tratamentos (Tabela 2). Não obstante, houve tendência de menor sobrevivência nos camarões do controle comparada com os camarões do tratamento prebiótico, probiótico, e simbiótico.

Tabela 2 Sobrevivência de camarões alimentados com prebiótico (inulina), probiótico (Lactobacillus plantarum), simbiótico (inulina + L. plantarum e grupo controle após 48 horas da infecção com Vibrio alginolyticus

Desafio com V. alginolyticus Tratamento Sobrevivência (%)

Controle 84,4±10,1 Prebiótico 91,6±12,6 Probiótico 93,34±5,4 Simbiótico 95±6,3

3.6 DISCUSSAO A maior concentração de Vibrio spp. Encontrada no trato

digestório dos camarões no grupo controle quando comparada com as concentrações dos outros tratamentos pode estar relacionada com a concentração de bactérias ácido lácticas encontradas no intestino. Bactérias ácido lácticas possuem ações inibitórias, seja por competição, por produção de peróxido de hidrogênio ou por produção de ácidos orgânicos como o ácido láctico ou ácido acético que inibem o crescimento de muitas bactérias patogênicas gram negativos (Lu e Walker 2001).

Algumas cepas de Lactobacillos podem produzir tipos de bacteriocinas como o lactatin, produzido por L acidophilus ou plantaracin produzido por L. plantarum (Raccach et al., 1989; Anderson et al., 1998). Trabalhos prévios realizados por Vieira et al. (2007), demonstraram que L. plantarum tem capacidade inibitória in vitro e in vivo frente a Vibrio spp.

No caso do grupo alimentado com prebiótico, os intestinos apresentaram um escasso crescimento de bactérias lácticas na primeira coleta e a partir da segunda coleta a concentração de bactérias lácticas caiu à zero. Não obstante, como o grupo probiótico, a concentração de Vibrio spp. Também foi inferior comparado com o grupo controle. O

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prebiótico provê nutrientes limitados na mucosa intestinal que pode ter favorecido o crescimento de outro tipo de bactérias capazes de fermentar o prebiótico e atuar contra bactérias patogênicas, reduzindo assim o número de Vibrio spp. (Collins e Gibson, 1999).

A adição de inulina no probiótico (simbiótico) não influenciou na concentração das bactérias ácido lácticas no intestino quando comparada com as concentrações nos tratamentos onde os camarões foram alimentados apenas com o probiótico. Neste caso, a inulina e L. plantarum não mostraram um efeito sinérgico, sugerindo não ser o prebiótico ideal para ser usado conjuntamente com esta bactéria probiótica. Não obstante, alguns autores como De Vrese e Schrezenmeir (2008) recomendam usar inulina junto com cepas de L. plantarum, L. paracasei ou B. bifidum para aumentar a concentração destas bactérias.

Apesar da alteração da microbiota do trato digestório, a suplementação da dieta com prebióticos, probióticos e simbióticos não influenciaram na taxa de crescimento dos camarões, corroborando o encontrado por Vieira et al. (2010) onde camarões alimentados com probiótico (L. plantarum) não apresentaram diferenças significativas no ganho de peso.

Os invertebrados possuem um sistema imunológico inato que usa barreiras físicas e componentes celulares e humorais como armas de defesa (Söderhäll e Cerenius, 1992). A estimulação de mecanismos de defesa não específicos usando compostos biológicos específicos, chamados imunoestimulantes, pode aumentar a resistência do hospedeiro frente a enfermidades (Skjermo et al., 2006). Probióticos e prebióticos podem ser usados como imunoestimulantes desempenhando o papel de moléculas de alarme para ativar o sistema imunológico (López et al., 2003). Compostos microbianos como os peptidoglicanos presentes na parede de bactérias gram positivas são estimulantes das funções celulares atuando diretamente sobre as proteínas do plasma, melhorando a eficiência da resposta imune (Bachère, 2003). A imunoestimulacão pelo uso de cepas probióticas tem sido reportada por vários autores (Rengpipat et al., 2000; Gill, 2003; Gullian et al., 2004).

O maior valor aglutinante do soro contra V. alginolyticus encontrado no grupo probiótico e simbiótico antes da infecção, e em todos os tratamentos após infecção, indica que os tratamentos possivelmente atuaram como imunoestimulantes e os camarões foram capazes de produzir uma maior quantidade de lectinas. As lectinas são proteínas de reconhecimento de padrões moleculares (PRP) que estão presentes na hemolinfa e são capazes de causar aglutinação celular ao se ligar especificamente a carboidratos da superfície de diferentes células,

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incluindo microrganismos (Marques e Barraco, 2000). Consequentemente, as lectinas possuem função de opsoninas facilitando o processo de fagocitose (Lee e Soderhall, 2002).

Apesar dos camarões dos três tratamentos apresentarem uma tendência numérica maior na THC que o grupo controle, tanto este parâmetro como a atividade da PO dos camarões dos três tratamentos não apresentaram diferenças quando comparados com os do grupo controle antes ou após o desafio com V. alginolyticus. Resultados variáveis têm sido reportados para estes dois parâmetros em relação à utilização de prebióticos e/ou probióticos em camarões. Por exemplo, em um estudo realizado por Van Hai e Fotedar (2009) não foram encontradas diferenças na THC de Penaeus latisulcatus alimentados com prebiótico Bio-Mos® e β-1,3-D-glucan e Pseudomonas synxantha e P. aeruginosa como probióticos, embora, o número de hemócitos granulares teve um aumento significativo comparado com as contagens em camarões que não receberam tratamento, resultando em camarões mais saudáveis. Em contraste, Li et al. (2007) reportam que em L. vannamei alimentados com scFOS como prebiótico, além de apresentar um aumento da THC, tiveram uma maior atividade da PO. Já em camarões alimentados com L. plantarum, a atividade da PO aumentou, mas houve uma diminuição no número de hemócitos circulantes (Chiu et al., 2007). Num estudo similar realizado por Vieira et al. (2008), o número de hemócitos foi superior em camarões alimentados com L. plantarum quando comparado com o grupo controle depois de serem infectados com V. harveyi. Contudo, não foram encontradas diferenças na atividade da PO ao igual que neste trabalho.

Apesar de não encontrar diferenças significativas na atividade antibacteriana do soro entre os tratamentos e o grupo controle antes ou após infecção, houve uma forte tendência de aumento neste parâmetro após o desafio com V. alginolyticus em camarões suplementados com probiótico e simbiótico. Resultado similares obtidos por Rodríguez et al., (2007) sugerem que o uso de probiótico teve um resultado positivo aumentando a atividade antibacteriana do soro de camarões L. vannamei.

Estudos já demonstraram que vários peptídeos antimicrobianos (AMPs) presentes na hemolinfa demonstraram atividade antimicrobiana in vitro matando diretamente o patógeno (Yang et al., 2002; Hancock et al., 2006). Peptídeos antimicrobianos (AMPs) como as peneidinas, crustinas e fatores anti-lipopolissacarídeos (AFL’s) já foram identificados e isolados da hemolinfa de camarões peneídeos, exercendo

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atividade contra fungos e bactérias (Destoumieux et al., 1997; Bartlett et al., 2002; Supungul et al., 2004; Jiménez-Vega e Vargas-Albores 2007).

Igualmente, não foram reportadas diferenças estatísticas significativas na sobrevivência dos camarões infectados com V. alginolyticus. Contudo, a menor sobrevivência obtida foi no grupo controle. Chiu et al. (2007), reportam que L. plantarum teve um resultado positivo no camarão branco em termos de resistência frente ao desafio com V. alginolyticus. Igualmente, Vieira et al. (2007) relata que o uso de L. plantarum melhorou a sobrevivência na larvicultura e a resistência das larvas frente à infecção com V harveyi.

Assim , se sugere que novos estudos sejam realizados para que as tendências verificadas neste trabalho sejam estatisticamente confirmadas ou mesmo desconsideradas.

3.7 CONCLUSOES

O uso de dieta suplementada com prebiótico (inulina),

probiótico (L. plantarum) e simbiótico (inulina + L. plantarum): - alteram a microbiota do trato digestório dos camarões - aumentaram o título alglutinante do soro contra V.

alginolyticus Contudo, os tratamentos não alteraram significativamente o

crescimento dos camarões ou a resistência ao desafio por V. alginolyticus.

3.8 REFERENCIAS ABRAHAM, T. J.; PALANIAPPAN, R. Distribution of luminous bacteria in semi-intensive penaeid shrimp hatcheries of Tamil Nadu, India. Aquaculture, v. 232, n. 1-4, p. 81-90, 2004. ANDERSSON, R. E.; DAESCHEL, M. A.; HASSAN, H. M. Antibacterial activity of plantaricin SIK-83, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. Biochimie, v. 70, n. 3, p. 381-390, 1988. BACHÈRE, E. Anti-infectious immune effectors in marine invertebrates: potential tools for disease control in haracteriza. Aquaculture, v. 227, n. 1-4, p. 427-438, 2003. BARTLETT, T. C. et al. Crustins, homologues of an 11.5-kDa antibacterial peptide, from two species of penaeid Shrimp, Litopenaeus

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