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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
CAMPUS CENTRO - OESTE DONA LINDU
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUIMICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Kyvia Ferreira Alves
Alterações morfológicas e bioquímicas em larvas de Culex quinquefasciatus
(Culicidae) submetidas à exposição de extratos de alecrim do campo -
Baccharis dracunculifolia (Asteracea)
Divinópolis/MG
Julho/ 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
CAMPUS CENTRO - OESTE DONA LINDU
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUIMICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Kyvia Ferreira Alves
Alterações morfológicas e bioquímicas em larvas de Culex quinquefasciatus
(Culicidae) submetidas a exposição de extratos de alecrim do campo –
Baccharis dracunculifolia (Asteracea)
Orientador: Prof. Dr. Stênio Nunes Alves
Co-Orientador: Prof. Dra. Aparecida Sadae Tanaka
Divinópolis/MG
Julho/2016
Dissertação apresentada ao Programa de
Multicêntrico de Pós Graduação em
Bioquimica e Biologia molecular, da
Universidade Federal de São João Del
Rei, como requisito para a obtenção do
grau de Mestre.
Dedico este trabalho aqueles
que sempre me apoiaram
acima de tudo: Rejane, Adair,
Kayo, Wanda e Daniel.
Agradecimentos
Agradeço еm primeiro lugar а Deus qυе iluminou о mеυ caminho
durante esta caminhada e a São Judas Tadeu que sempre intercedeu por mim.
À minha família, pоr sua capacidade dе acreditar е investir еm mim.
Mãe, sеυ cuidado е dedicação fоі que deram а esperança pаrа seguir em
frente. Vó Wanda, obrigada por todas as orações.
Ao meu namorado Daniel, por todo amor, apoio, paciência e
compreensão de sempre.
A todos meus amigos por me apoiarem e me ampararem em todos os
momentos em que eu precisei, e por serem compreensivos e tolerantes
Ao Prof. Dr. Stênio Nunes Alves, pela excelente orientação e dedicação
à confecção desse trabalho.
Á Prof.Dra Aparecida Tanaka pela colaboração e co-orientação neste
trabalho.
Ao Prof. João Máximo Siqueira
Aos integrantes do LAINS – Laboratórios de Insetos e vetores por
sempre estar dispostos a ajudar. Vocês são parte fundamental deste trabalho.
A todos os professores e funcionários da UFSJ que foram fundamentais
nessa caminhada.
A todos aqueles qυе dе alguma forma estiveram е estão próximos dе
mim, fazendo esta vida valer cada vеz mais а pena.
“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém
ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”
Arthur Schopenhauer
“A persistência é o menor caminho do êxito”.
Charles Chaplin
“Não confunda derrotas com fracasso nem vitórias com sucesso. Na vida de
um campeão sempre haverá algumas derrotas, assim como na vida de um
perdedor sempre haverá vitórias. A diferença é que, enquanto os campeões
crescem nas derrotas, os perdedores se acomodam nas vitórias.”
Roberto Shinyashi
i
RESUMO
O controle de mosquitos através do uso de inseticidas químicos tem
apresentado problemas devido ao seu modo de ação não específico, além da
possibilidade de rápida seleção de resistência de insetos a estes compostos.
Por estas razões, a procura por agentes mais seletivos aumentou e com isso a
adoção de métodos de inseticidas biológicos cresceu. Neste sentido, o
presente trabalho tem por objetivo verificar a suscetibilidade e as alterações
morfológicas e bioquímicas de larvas de Culex quinquefasciatus após
exposição ao extrato etanólico e óleo essencial de Baccharis dracunculifolia.
Dessa forma, o extrato etanólico foi obtido a partir de 50 g da folha de B.
dracunculifolia seca e triturada, deixada em maceração por três dias com 3000
mL de etanol a 70%. Posteriormente o macerado foi filtrado e o extrato foi seco
em rotaevaporador. O óleo essencial da planta B. dracunculifolia foi obtido
através da técnica de arraste de vapor utilizando aparelho de Clevenger. Para
observação de suas ações larvicidas, foi utilizado um total de 240 larvas para
cada experimento. As larvas foram expostas tanto ao extrato etanólico quanto o
óleo essencial nas concentrações de 200ppm, 100 ppm, 50 ppm e 25 ppm.
Foram colocadas 20 larvas em cada recipiente plástico contendo 100mL de
água deionizada para o grupo controle ou 100mL de solução do extrato para o
grupo tratado, todos os testes foram realizados em triplicata. O extrato
etanólico não foi capaz de causar mortalidade significativa nas larvas, já com o
óleo essencial obteve-se uma CL50 de 50 ppm. Para análises morfológicas as
larvas foram expostas a CL50 do óleo essencial e deixadas sob exposição
durante uma e 24 horas. Posteriormente foram retiradas a cabeça e o sifão
dessas larvas e estas foram preparadas sendo colocadas em contato com
Stefanine e paraformaldeído durante 24 horas e formol durante 24 e 48 horas.
Após o tempo atingido, as larvas foram colocadas em álcool a 70%. Para
análises bioquímicas, após a exposição ao óleo essencial, cerca de 30 larvas
foram separadas e armazenadas em ultra freezer. Cada grupo de larvas foi
colocado separadamente em Tampão Tris HCl 20 mM, pH 7,4, e
homogeneizadas em homogeneizador tipo potter. Após a homogeneização, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. O pellet será
descartado e o sobrenadante recolhido e mantido sob refrigeração para
ii
posteriores análises. A determinação da concentração de glicose e
triglicerídeos nas amostras foram realizadas utilizando kits enzimáticos
colorimétricos comercialmente disponíveis (Doles), sendo todos os ensaios
realizados em triplicata. As dosagens de proteína foram determinadas pelo
método descrito por HARTREE (1972). A análise de pH foi realizada com
grupos de 20 larvas expostas aos olés essencial em uma e 24 horas, utilizando
três corantes: fenoftaleína, azul de brotimol, e vermelho de fenol. poderm
indicar ações deste possível agente larvicida e elucidar melhor as alterações
morfo-funcionais detectáveis pelas técnicas utilizadas. A sua importância
mostra-se como subsídio para auxiliar na redução da população e/ou na
erradicação destes insetos com um mínimo de impacto tóxico ou mesmo
ecotoxicológico lembrando-se na redução dos custos do mesmo.
Palavras chave: Culex quinquefasciatus, inseticidas biológico, Baccharis
iii
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................................................i
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.....................................................iv
LISTA DE FIGURAS..................................................................................v
LISTA DE TABELAS................................................................................vi
I. INTRODUÇÃO.......................................................................................1
I.1 OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS........................................................2
I.1.1 Objetivo Geral ..................................................................................2
I.1.2 Objetivos Específicos .......................................................................3
I.1.3 Justificativa .......................................................................................3
I.2 Levantamento Teórico .........................................................................4
I.2.1 C. quinquefasciatus...........................................................................4
I.2.2 Inseticidas sintéticos .........................................................................8
I.2.3 Compostos naturais ..........................................................................11
I.2.4 Óleos essenciais ...............................................................................12
I.2.5 Baccharis dracunculifolia (Asteraceae)..............................................15
II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL......................................................19
II.1 Recursos Necessários.........................................................................19
II.2 Procedimentos.....................................................................................20
II.2.1 Obtenção da planta B. dracunculifolia..............................................20
II.2.2 Obtenção do óleo essencial de B. dracunculifolia............................20
II.2.3 Obtenção do extrato etanólico de B. dracunculifolia.........................21
II.2.4 Obtenção dos espécimes de C. quinquefasciatus............................21
II.2.5 Bioensaios.........................................................................................22
II.2.6 Análise fitoquímica do óleo essencial ...............................................23
II.2.7 Estudos morfológicos das larvas.......................................................23
II.2.8 Testes bioquímicos ...........................................................................24
II.2.9 Análise de pH do tubo intestinal das larvas.......................................25
II.2.10 Análise estatística .............................................................................28
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................28
IV. CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................
V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................
iv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A. Albopictus – Aedes albopictus
A. subpictus – Aedes subpictus
A. aegypti – Aedes aegypti
A. stephensis - Anopheles stephensi
C. quinquefasciatus – Culex quinquefasciatus
B. dracunculifolia – Baccharis dracunculifolia
B. megapotamica – Baccharis megapotamica
B. incarum – Baccharis incarum
B. trimera – Baccharis trimera
B. trinervis – Baccharis trinervis
B. salicifolia – baccharis salicifolia
B. crispa – Baccharis crispa
B. coridifolia – Baccharis coridifolia
B. uncinella – Baccharis uncinella
B. grisebachii – Baccharis grisebachii
B. tricuneata – Baccharis tricuneata
C. citratus - Cymbopogan citratus
T. minuta - Tagetus minuta
D. sisoo - Dalbergia sisoo
L. sidoides - Lippia sidoides
v
H. martiusii - Hyptis martiusii
T. Erecta - Tagetes erecta
M. piperita - Mentha piperita
C. Libani - Cedrus libani
Z. armatum - Zanthoxylum armatum
L. áspera - Leucas áspera
A. houstonianum - Ageratum houstonianum
P. barbatus - Plectranthus barbatus
W. bancrofti - Wuchereria bancrofti
CL50 – Concentração letal de 50%
DMSO – Dimetilsulfóxido
mg/L- Miligrama por litro
pH – potencial Hidrogeniônico
ppm – Partes por milhão
OE – Óleo essencial
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida Culex quinquefasciatus................................................5
Figura 2: Detalhes da larva de mosquito C. quinquefasciatus..........................6
Figura 3: Wuchereria bancrofti..........................................................................7
Figura 4: Fêmea de C. quinquefasciatus realizando oviposição.......................8
Figura 5: Baccharis dracunculifolia...................................................................17
Figura 6: B. dracunculifolia recém coletada.....................................................20
Figura 7: Esquema utilizado para extração do óleo essencial.........................21
Figura 8: Criadouros de C. quinquefasciatus UFS/CCO.................................22
Figura 9: Determinação de parâmetros de pH entre 6,5 e 8,0 de Vermelho de
Fenol..................................................................................................................26
Figura 10: Determinação de parâmetros de pH entre 8,0 e 9,5 de Azul de
Timol..................................................................................................................27
Figura 11: Determinação de parâmetros de pH entre 9,0 e 10,0 e acima de
10,0 de Fenolftaleína ........................................................................................27
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Referências de pH e suas respectivas colorações...........................26
Tabela 2: Mortalidade de larvas de C. quinquefasciatus após exposição ao óleo
essencial de B. dracunculifolia............................................................................
Tabela 3: Mortalidade de larvas de C. quinquefasciatus após exposição ao
extrato etanólico de B. dracunculifolia...............................................................
1
I) INTRODUÇÃO
Uma das maiores causas de morte no mundo continua sendo as
doenças transmitidas por insetos (Pavela, 2009). Anualmente mais de 700
milhões de pessoas adquirem doenças que são transmitidas por mosquitos,
como malária, encefalite, dengue, chikungunya, vírus do Nilo Ocidental, e febre
amarela. Estas doenças são capazes de causar morbidade significativa e
mortalidade tanto em seres humanos quanto em outros animais (Taubes, 1997;
El-Sheikh, 2012).
O Culex quinquefasciatus (Say, 1823), é transmissor da filariose,
principal vetor da Wuchereria bancrofti no Brasil e causador de considerável
incômodo por suas picadas (Forattini, 2002; Subra, 1980). Mais de 120 milhões
de pessoas estão atualmente infectadas e mais de 1,3 bilhões de pessoas em
72 países em todo o mundo são ameaçadas pela filariose linfática, que causa
sofrimento em longo prazo e morbidade, para o indivíduo (OMS, 2012;
Ramaiah, 2000). O C. quinquefasciatus apresenta ampla distribuição
geográfica povoando particularmente as regiões urbanas (Rahuman, 2009). A
capacidade de transmitirem diversas moléstias tanto para o homem como para
os outros animais deve-se ao hábito hematófago das fêmeas, usualmente
necessários para que se processe a maturação dos ovos e a conclusão do
ciclo gonadotrófico (Clements, 1996).
Atualmente o método mais utilizado para o controle desse vetor é a
utilização de inseticidas sintéticos, mas estes inseticidas vêm enfrentando uma
grande ameaça devido ao surgimento de resistência, e, além disso, sua
utilização resulta em acúmulo de produtos químicos não biodegradáveis nos
ecossistemas causando um efeito tóxico para organismos não-alvos (Pizarro,
1999; Rawani, 2009). Assim é evidente a procura crescente por novos produtos
que sejam eficazes no controle de mosquitos adultos, na exterminação das
larvas e que ao mesmo tempo, não sejam prejudiciais ao meio ambiente e ao
homem.
Óleos essenciais e metabólitos secundários provenientes de plantas,
que são denominadas “plantas inseticidas”, são consideradas alternativas a
inseticidas químicos devido a sua disponibilidade e segurança ambiental, além
2
de serem economicamente viáveis (Pavela, 2005; Senthil, 2005; Rajkumar,
2005; Kostic, 2008; Elango, 2009). Tais metabólitos secundários muitas vezes
atuam em múltiplos e novos locais alvo, (Dias, 2014; Priestley, 2003) o que
reduz o potencial para resistência do mosquito (Perumalsamy, 2010; Wang,
2012) e, por isso, são considerados como fontes potenciais para o
desenvolvimento de inseticidas comerciais. Alguns óleos essenciais como
citronela, limão, e óleos de eucalipto podem ser usados como repelentes de
insetos, como já foi registrado pela Agência de proteção ambiental dos EUA,
sendo adequados para a aplicação na pele (Trongtokit, 2005; Briassoulis, 2001;
Nerio, 2010). Óleos essenciais obtidos a partir de Cymbopogan citratus (C.
citratus), Tagetus minuta (T. minuta), Dalbergia sisoo (D. sisoo), Lippia sidoides
(L. sidoides) (Carvalho, 2003), Hyptis martiusii (H. martiusii) (Araujo, 2003),
Tagetes erecta (T. Erecta) (Nikko, 2011), Mentha piperita (M. piperita) (Kumar,
2011), Cedrus libani (C. Libani) (Cetin, 2009), Zanthoxylum armatum (Z.
armatum) (Tiwary, 2007) e muitas outras plantas demonstraram atividade
larvicida promissora.
Plantas do gênero Baccharis, conhecidas popularmente por carquejas,
vassourinhas ou alecrim-do-campo são arbustos lenhosos de grande
diversidade morfológica, pertencentes à família Asteraceae (Ferronato, 2006).
A espécie B. dracunculifolia é ricas em metabólitos secundários e possuem
folhas pontuadas com tricomas secretores (Sousa, 2010). Além disso, possuem
ductos, que produzem e armazenam compostos fenólicos e óleos essenciais
que possuem atividades biológicas já descritas, tais como antimicrobiana e
antiviral (Cobos, 2001; Búfalo, 2009).
I. 1) OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA
I. 1.1) Objetivo Geral
Verificar a suscetibilidade e as alterações morfológicas e bioquímicas de
larvas de Culex quinquefasciatus após exposição ao extrato etanólico e óleo
essencial (O.E) de Baccharis dracunculifolia.
3
I. 1.2) Objetivos Específicos
II. Obtenção do extrato etanólico e do óleo essencial de Baccharis
dracunculifolia;
III. Verificar a suscetibilidade de larvas 3° e 4° estágio do mosquito C.
quinquefasciatus após exposição ao extrato e ao óleo essencial de B.
dracunculifolia e, por conseguinte a DL50 das substâncias;
IV. Realizar análise fitoquímica do extrato etanólico e do óleo essencial com
conhecimento prévio de suas atividades sobre as larvas de C.
quinquefasciatus;
V. Analisar a histologia das larvas expostas a doses subletais do extrato de
B. dracunculifolia.
VI. Analisar as concentrações de glicose e triglicerídeos e proteínas
presentes nas larvas antes e após exposições a doses subletais do
extrato etanólico e do óleo essencial de B. dracunculifolia.
VII. Analisar alteração de pH do tubo intestinal das larvas expostas a doses
subletais do extrato etanólico e do óleo essencial de B. dracunculifolia.
I. 1.3) Justificativa
A resistência dos mosquitos a inseticidas comuns tem sido
freqüentemente detectada (WHO, 1970; Subra, 1980). Essa resistência faz
com que haja um constante aumento das doses de aplicação dos inseticidas, e
seu uso persistente diretamente nos criadouros, em altas concentrações, faz
com que o combate aos vetores torne-se economicamente inviável
(Abercrombie, Berg, 1978; Lassale, 1993) além de destruir uma importante e
rica fauna associada (Silveira, 1989). Dessa forma é importante a busca de
inseticidas que sejam de origem natural, uma vez que estes não agridem o
ambiente, a população e podem ter um custo mais baixo. Além disso, existe
grande importância em entender as alterações que as larvas sofrem ao
entrarem em contato com substâncias bioativas, a fim de detectar o que se
altera e qual a implicância disso em suas próximas fases do ciclo de vida.
Portanto, as alterações morfológicas e bioquímicas de larvas de C.
quinquefasciatus após exposição ao extrato e ao O.E de Baccharis
4
dracunculifolia, poderão ajudar a evidenciar melhor o processo metabólico
desses insetos durante seu desenvolvimento. Ademais, o conhecimento dessas
substâncias associadas a possíveis alterações no metabolismo energético das
larvas dos mosquitos torna-se interessante e importante como subsídio para
elucidação de mecanismos que poderão minimizar a incidência destes
mosquitos.
I. 2) LEVANTAMENTO TEÓRICO
I. 2.1) Culex quinquefasciatus
Culex quinquefasciatus (Say, 1823) é um mosquito que possui hábitos
antropofílicos e endofílicos, além de apresentar uma ampla distribuição
geográfica, habitando inclusive perímetros urbanos (Subra, 1980). Esses
mosquitos possuem desenvolvimento holometabólico, ou seja, realizam
metamorfose completa com quatro estágios de vida (Figura 1) – ovo, larva,
pupa e adulto (Silva, 1999).
A oviposição ocorre em ambientes aquáticos e de baixa luminosidade,
sendo que as posturas são colocadas de forma agrupada, chamadas
“jangadas” (Figura 1- ovos), os quais flutuam sobre a água. Cada jangada tem
em média 100 ovos e a oviposição pode variar de uma a oito durante toda a
vida da fêmea. O número de posturas é influenciado por diversos fatores como,
por exemplo, a alimentação. Esses ovos inicialmente possuem cor branca,
porém sofrem escurecimento gradativo, tornando-se escuros após algum
tempo (Forattini, 2002).
5
Figura 1: Ciclo de vida Culex quinquefasciatus.
As larvas (Figura 2) possuem o corpo dividido em cabeça, tórax e
abdômen, o qual é composto por nove segmentos similares, mais um décimo
diferenciado em lobo anal (Consoli, 1998). O oitavo segmento do abdômen
apresenta o “sifão”, uma estrutura respiratória em cujas extremidades abrem-se
os espiráculos, onde uma glândula adjacente libera substâncias hidrofóbicas,
que evitam o afluxo de água ao sistema respiratório larval e a morte por
afogamento (Becker, 2010). Além disso, as larvas são capazes de se
desenvolverem em quase todos os tipos de habitats, de esgotos à água limpa,
com preferência para os primeiros (Forattini, 2002). Vários fatores extrínsecos
estão relacionados ao desenvolvimento larval como a temperatura, a
precipitação, a evaporação, o recurso alimentar, a predação, o parasitismo e a
competição (Riback, 2009). A época das chuvas possibilita maior número de
criadouros, no entanto o desenvolvimento das larvas ocorre durante todo o ano
nas áreas meridionais da América do Sul (Almirón & Brewer, 1994).
A pupa é um estágio aquático intermediário entre a forma larval e a adulta,
estas nadam ativamente e freqüentam a superfície do criadouro para
respirarem com as extremidades do par de trompas para fora do líquido. Não
se alimentam e as reservas acumuladas na fase larvária são consumidas no
processo de transformação em adulto. O tempo médio desta fase é
6
aproximadamente de dois dias, dependendo da temperatura e de outros fatores
(Brasil, 2011).
Figura 2: Detalhes da larva de mosquito C. quinquefasciatus.
O mosquito adulto (Figura 4), além de causar um incômodo por suas
picadas (Subra, 1980), é uma das espécies de grande importância na saúde
pública (Deane, 1951; Rachou, 1956; Forattini, 2002) devido ao fato de ser o
principal vetor da Wuchereria bancrofti, causador da filariose bancroftiana, no
Brasil. A W. bancrofti é um nematelminto filariforme (Figura 3) que apresenta
um ciclo heteroxênico, sendo que o homem é considerado o hospedeiro
definitivo e, mosquitos como o C. quinquefasciatus são modelos de
hospedeiros intermediários satisfatórios e que podem transmitir a filariose
humana (Campos, 2001).
7
Figura 3: Wuchereria bancrofti.
O C. quinquefasciatus É importante também por ser considerado vetor
secundário de uma arbovirose, a febre de oropouche (cujo vetor primário é o
Culicoides paraensis), estando, dessa forma, associado à transmissão desta
para aves, equinos e canídeos (Hurlbut, 1950; Meyers, 1960; Harwood, 1979).
O que permite a transmissão das moléstias, tanto para homens quanto para
animais é o hábito hematófago das fêmeas. No ato da picada é liberada no
local a saliva do mosquito, que é constituída de um conteúdo protéico. Esse
conteúdo da saliva do mosquito possui função anestésica e evita a coagulação
do sangue e, além disso, é responsável também pelas reações alérgicas tanto
nos animais quanto nos seres humanos (Feingold, 1968).
8
Figura 4: Fêmea de C. quinquefasciatus realizando oviposição.
I. 2.2) Inseticidas sintéticos
Anteriormente a descoberta dos inseticidas residuais sintéticos na
década de 1940, muitas metodologias para o controle de mosquitos foram
adotadas em diferentes partes do mundo com variados graus de sucesso. A
descoberta desses novos inseticidas revolucionou a metodologia de controle de
mosquitos vetores de doenças, possibilitando a sua maior padronização. Pela
primeira vez na história da saúde pública foi possível, em muitas regiões,
controlar de maneira eficaz e mesmo erradicar algumas das doenças por eles
transmitidas. O uso de inseticidas sintéticos tem aumentado progressivamente
desde então e atualmente continua sendo o principal suporte dos programas de
combate e controle de insetos vetores de doenças (Wright, 1971; WHO, 1976;
Mariconi, 1980).
Inseticidas organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides
têm sido empregados em várias regiões do mundo para o controle de
mosquitos. No Brasil, o DDT (Dicloro-difenil-tri-cloro-etano), da classe dos
organoclorados é ainda o inseticida químico mais largamente empregado para
esse fim. Trata-se de um produto relativamente barato, com elevado poder
residual, moderadamente tóxico e de baixa absorção cutânea; por outro lado
não é biodegradável, sendo acumulativo nas gorduras de animais de sangue
9
quente, podendo interferir no metabolismo do sódio e potássio além de disso,
mostrou-se carcinogênico em camundongos (Aldridge, 1979; Mariconi, 1980).
Posteriormente outras classes de inseticidas químicos foram sintetizadas para
substituição dos organoclorados no controle de insetos (Brogdon & McAllister,
1998).
Os organofosforados foram desenvolvidos a partir de 1940, são
constituintes de uma grande variedade de produtos agrícolas e sanitários,
desde os extremamente tóxicos até aqueles com baixa toxicidade, como o
temefós, que tem seu uso permitido em água potável (Chavasse & Yap, 1997).
São ésteres, amidas ou derivados tiol de ácido fosfórico (ácido tiofosfórico,
ácido ditiofosfórico e outros), contendo várias combinações de carbono,
hidrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre e nitrogênio. Existem três categorias de
inseticidas organofosforados, baseadas em sua natureza química: alifáticos, os
derivados de grupos fenil e os heterociclícos. Estes compostos, após contato
e/ou ingestão pelos mosquitos, agem como inibidores das enzimas
acetilcolinesterases, responsáveis por hidrolisar o neurotransmissor
acetilcolina. A enzima é fosforilada pelo inseticida ficando inativa. Ocorre o
acúmulo de acetilcolina na fenda sináptica, que provoca uma hiperatividade
nervosa e consequentemente ocorre colapso do sistema nervoso. Também
ocorre a dessensibilização do receptor de acetilcolina que cessa o impulso
nervoso levando o inseto a morte (Sucen, 2001; Eldefrawi, 1976; Eldefrawi &
cols, 1982). Devido à sua potência, por não se acumularem em tecidos e por
serem biodegradáveis esses inseticidas têm sido bastante utilizados na área da
saúde. Entretanto, são quimicamente instáveis, logo apresentando persistência
curta no solo necessitando serem repostos periodicamente. (Beaty &
Marquardt, 1996; Sucen, 2001).
Os primeiros carbamatos foram colocados no mercado por volta de 1950
(Casida & Quistad, 1998). São praguicidas orgânicos derivados do ácido
carbâmico, que possuem pequeno espectro de atividade inseticida. Três
classes de carbamatos são conhecidas: carbamatos inseticidas (e
nematicidas), carbamatos herbicidas e carbamatos fungicidas. Os mais
conhecidos são carbaril-metomil, carbofuran, metiocarb, primicarb, indoxacarb,
alanicarb e furatiocarb (Sucen, 2001). Assim como os organofosforados, os
carbamatos também são inibidores das enzimas acetilcolinesterases, embora a
10
ligação deste inseticida à enzima seja mais instável (Beaty & Marquardt, 1996;
Sucen, 2001).
O controle de larvas de mosquitos em todo o mundo depende da aplicação
continuada de organofosforados e reguladores de crescimento de insetos
(Rahuman, 2009). No Brasil, vários registros indicam resistência a esses
inseticidas em populações de C. quinquefasciatus (Bracco, 1999; González,
1999; Campos & Andrade, 2003; Alves, 2011) e A. aegypti (Campos & Andrade,
2001; Luna, 2004; Horta, 2011). O aparecimento de resistência faz com que
haja um constante aumento das doses de aplicação dos inseticidas (WHO,
1970; Subra, 1980). Ocorre também à ruptura dos sistemas naturais e as
substâncias persistem no ambiente por período de tempo imprevisível
(Pushpanathan, 2008; Rajkumar, 2009). Além disso, o uso persistente destes
produtos diretamente nos criadouros, em altas concentrações, faz com que o
combate aos vetores torne-se economicamente dispendioso (Abercrombie &
Berg, 1978; Lassale, 1993), e causam destruição de uma importante e rica
fauna associada que pode, juntamente com fatores climáticos, reduzir a
presença destes vetores (Silveira, 1989).
Compreender os mecanismos de resistência a inseticidas é essencial
para as estratégias de controle do vetor. Sabe-se que os mecanismos de
resistência podem ser divididos em dois grupos principais: a sensibilidade
diminuída das proteínas alvo conhecida, como alvo local e aumento da
insensibilidade metabólica (Hemingway, 2004). O canal axônico de sódio
voltagem-dependentes (VGSC) e as acetilcolinesterases sinápticas (AChE1),
codificadas pelo gene ACE-1, estão nos sítios alvos primários de inseticidas
(Davies, 2007; Soderlund, 2008; Dong, 2014.; Weill, 2003, 2004). Em C.
quinquefasciatus, a insensibilidade local alvo mais comum é a mutação em
L1014F KDR, no gene do canal de sódio voltagem-dependentes (VGSC), que
confere resistência ao DDT e piretróides, seguido pela mutação em G119S
ACE-1, que confere resistência a organofosforados e carbamatos (Xu, 2005;
Sarkar, 2009a; Weill, 2004; Wondji, 2008; Jones, 2012; Low, 2013).
I. 2.3) Compostos Naturais
11
Atualmente, visando uma maior eficácia, um baixo custo e a diminuição do
aparecimento de resistência por parte dos mosquitos, muitos compostos
naturais estão sendo investigados (Guimarães, 2001). Segundo Vasconcelos
(2006), uma alternativa que vem sendo retomada para o controle de pragas é o
uso de metabólitos secundários presentes em plantas, as quais são chamadas
de “plantas inseticidas”. Conhece-se hoje aproximadamente 250.000 espécies
de plantas superiores, sendo que a raça humana se aproveita de uma fração
muito pequena destas com as quais sempre conviveu.
A humanidade ao longo do tempo selecionou cerca de 300 plantas para a
alimentação, e de um pouco mais de uma centena, obteve-se princípios ativos
puros para o tratamento e prevenção de doenças (Pinto, 2002). Inúmeras
substâncias acumulam-se no vegetal para sua defesa, sendo sintetizados e
emitidos vários compostos voláteis (ácidos, aldeídos e terpenos) além de
substâncias como sílica, metabólitos secundários, enzimas e proteínas.
Diversas substâncias são derivadas de produtos intermediários ou finais do
metabolismo secundário das plantas, podendo ser encontradas em todas as
partes dos vegetais. Entre essas substâncias estão rotenóides, piretróides,
alcalóides e terpenóides. (Vasconcelos, 2006). Tais substâncias podem atuar
no metabolismo de outros organismos interferindo em vários aspectos como
repelência, deterrência alimentar e oviposição, esterilização, bloqueio do
metabolismo e interferência no desenvolvimento, sem necessariamente
causarem morte (Lancher, 2000). O controle do mosquito na fase larval do
desenvolvimento com a utilização de fitoquímicos que ocorrem nos óleos,
folhas e raízes de plantas é uma das técnicas que proporciona um ambiente
harmônico, além de ser um método mais barato de controle (Shyamapada
Mandal, 2011).
Estudos nos quais foram testados os extratos aquosos das plantas
Lansium domesticum, Azadirachta indica, Eucaliptus sp. e Codiaeum
variegatum em larvas de 3° e 4° instares do C. quinquefasciatus, apresentaram
doses letais baixas, evidenciando boa atividade (Monzon, 1994). Também,
foram determinadas as CL50 dos extratos brutos de Melia azedarach, Bauhinia
rufa e Coffea arabica sobre larvas de C. quinquefasciatus (Teixeira, 2007;
Ribeiro-Neto, 2008).
12
Elumalai (2015), em seu estudo demonstrou a atividade inseticida de
extrato aquoso, etanólico, metanólico, clorofórmio e de éter de petróleo de
Leucas aspera contra Aedes aegypti, Anopheles stephensi e Culex
quinquefasciatus. Observou-se mortalidade das larvas de quarto instar após 24
e 48 horas de tratamento e concluiu-se que o extrato metanólico de L. áspera
foi o que possuiu maior eficiência quando comparado com os outros extratos,
possuindo uma CL50 de 27, 855 ppm em 24 horas. Echegoyen (2014) em seus
estudos relatou a atividade do extrato de folhas de Ageratum houstonianum
utilizando metanol, acetato de etila e hexano, evidenciando a atividade desses
extratos sobre larvas de terceiro instar de Anopheles stephensi, Aedes aegypti
e Culex quinquefasciatus, foi observado que o extrato no qual se utilizou
acetato de etila foi o mais eficiente em todas as espécies. Tais dados
evidenciam a eficiência que extratos de plantas podem ter no combate ao
mosquito.
I. 2.4) Óleos essenciais
Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos orgânicos
voláteis, produzidos como metabolitos secundários em plantas. Esses óleos
são constituídos por hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos) e compostos
oxigenados (álcoois, ésteres, éteres, aldeídos, cetonas, lactonas, éteres de
fenóis e de fenol) além de serem responsáveis pelo odor característico das
plantas (Guenther, 1972). Aproximadamente 3000 óleos essenciais são
conhecidos, e 10% deles têm importância comercial (FAO, 1995) em indústrias
de cosméticos, alimentos e indústrias farmacêuticas (Zygadlo & Juliani, 2003).
Além disso, já é descrito que óleos essenciais isolados a partir de plantas
possuem propriedades de repelência contra artrópodes hematófagos, sendo
que alguns desses óleos já são base de formulação de repelentes comerciais
(Curtis, 1989).
Ao longo dos últimos 50 anos, milhares de plantas foram rastreadas
como fontes potenciais de repelentes e inseticidas (Sukumar, 1991).
Atualmente, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA)
tem os óleos de citronela, limão e eucalipto registrados como componentes de
repelentes de insetos para aplicação na pele, estes produtos naturais estão
sendo usados com freqüência devido à sua toxicidade relativamente baixa, e
13
grande eficácia (Katz, 2008). Chowdhury (2008) explica que há grande eficácia
de extratos vegetais para o controle de insetos devido a estes serem
ecologicamente seguros, não apresentando risco para saúde pública e meio
ambiente, além de possuir um rico estoque de produtos químicos de diferentes
ações biológicas, ao contrário de inseticidas convencionais, que se baseiam
num único composto ativo. Inseticidas derivados de plantas compreendem em
misturas de compostos químicos que atuam tanto nos processos
comportamentais quanto nos processos fisiológicas. Assim, existe muito pouca
probabilidade de desenvolvimento de resistência de pragas a essas
substâncias (Ghosh, 2012).
Plantas do gênero Cymbopogon têm sido usadas para repelir mosquitos
nas regiões da selva como a Amazônia boliviana (Moore, 2007). Este gênero
produz os repelentes naturais mais utilizados no mundo (Trongtokit, 2005).
Muitos óleos essenciais isolados a partir destas plantas foram testados contra
diferentes tipos de artrópodes. Cymbopogon excavatus apresentou 100% de
repelência durante duas horas, quando avaliada em laboratório contra
Anopheles arabiensis (Govere, 2000). Óleo essencial de Cymbopogon
winterianus misturado com 5% de vanilina, deu 100% de proteção durante 6 h
contra Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e Anopheles dirus, resultados
comparados aos observados com 25% de DEET (N, N-dietil-3-metilbenzamida)
(Tawatsin, 2001).
A família Lamiaceae é um excelente reservatório de agentes larvicidas
(Pavela 2015). O óleo essencial extraído das folhas de Mentha spicata foi
testado contra C. quinquefasciatus, A. aegypti e A. stephensi (Govindarajan,
2012). Mais tarde, a atividade larvicida do óleo essencial de folhas e os
principais constituintes químicos de Ocimum basilicum foi avaliado contra C.
tritaeniorhynchus, A. albopictus e A. subpictus (Govindarajan, 2013). Óleos
essenciais de Rosmarinus officinalis e Lavandula angustifólia (Lamiaceae)
mostraram atividade larvicida moderada (Conti, 2010), mas possuiu um bom
efeito repelente e ovicida contra várias espécies de mosquitos (Prajapati,
2005), possivelmente ligada à presença de α-terpineno, carvacrol e timol (Choi,
2002). Vários estudos mostraram que o óleo Hyptis suaveolens tem
propriedades inseticidas úteis contra mosquitos (Jaenson, 2006; Conti, 2012).
14
Alguns monoterpenos, como α-pineno, cineol, eugenol, limoneno,
terpinoleno, citronelol, citronelal, cânfora e timol são constituintes comuns de
um número de óxido de etileno descrito na literatura, como apresentando
atividade repelente de mosquitos (Zaki, 1998; Jaenson, 2006; Park, 2005;
Yang, 2004). Yogananth (2015) em seu estudo identificou e avaliou a atividade
larvicida do óleo essencial de Rhizophora mucronata contra mosquitos da
espécie Anopheles stephensi e Culex quinquefasciatus revelando um potencial
agente larvicida contra as espécies citadas. A mortalidade para larvas de
quarto instar foi observada após 24 h de tratamento, obtendo-se uma CL50 de
0,051 mg/mL e 0,0514 mg/mL para A. stephensi e C. quinquefasciatus
respectivamente. Também foi avaliada a toxicidade do óleo essencial de
Plectranthus barbatus e seus principais constituintes, contra larvas de
Anopheles subpictus, Aedes albopictus e o Culex tritaeniorhynchus. Os
Principais constituintes do óleo essêncial de P. barbatus foram eugenol
(31,12%), α-pineno (19,38%) e β-cariofileno (18,42%). Este teve um efeito
tóxico significativo para todas as espécies testadas sendo que Anopheles
subpictus teve uma CL50 84,20 µg/mL, Aedes albopictus CL50 87,25 µg/mL e
Culex tritaeniorhynchus 94,34 µg/mL (Govindarajan, 2015).
Foi investigada também a ação larvicida do óleo essencial da folha de
Feronia limonia contra Anopheles stephensi, Aedes aegypti e Culex
quinquefasciatus. Análises do óleo essencial da planta revelaram a presença
de 51 compostos, sendo os principais o Estragol (34,69%) e o β-pineno
(23,59%). O óleo mostrou notável atividade larvicida contra todas as espécies,
sendo que para A. stephensi observou-se uma CL50 de 38,93 ppm , para
Aedes aegypti CL50 de 37,60 ppm e para C. quinquefasciatus CL50 de 52,08
ppm evidenciando assim que o óleo possui boa atividade larvicida
(Senthilkumar, 2013). Anteriormente, em outro trabalho Senthilkumar (2008)
descreveu a atividade do óleo essencial de Blumea mollis sobre larvas de
quarto instar de C. quinquefasciatus. No óleo essencial foram identificados 39
compostos, sendo esses linalol (19,43%), γ-elemeno (12,19%), copaeno
(10,93%), estragol (10,81%), Alo-ocimeno (10,03%), γ-terpineno (8,28%) e
Aloaromadendreno (7,44%). O óleo essencial apresentou efeito tóxico
significativo contra larvas de quarto instar de C. quinquefasciatus com CL50 de
71,71 ppm. Outra espécie que já se tem relatos da atividade inseticida de seu
15
óleo essencial é a Zingiber officinalis, esta teve sua atividade avaliada contra
larvas de terceiro instar de Culex quinquefasciatus (Pushpanathan, 2008). A
mortalidade das larvas foi observada após 24 horas de tratamento, o valor da
CL50 foi 50,78 ppm evidenciando sua eficácia como larvicida. Phasomkusolsil
(2012) relatou em seu estudo efeitos de óleos essenciais sobre a oviposição
dos mosquitos Aedes aegypti, Anopheles dirus e Culex quinquefasciatus,
dessa forma foi constatado que o óleo essêncial de Cananga odorata influencia
a oviposição, diminuindo também a taxa de atividade ovicida desses
mosquitos.
Além de pesquisas relacionadas à ação larvicidas, ovicidas e inseticidas
de óleos essenciais, também há relatos da ação repelente de óleos essenciais
inclusive com formulações de creme, como no trabalho de Reegan (2013).
Neste estudo foram testadas cinco formulações diferentes de cremes
repelentes, os quais foram preparados utilizando combinações de óleos
essenciais, incluindo cânfora, canela, citronela, capim-limão, limão, laranja,
nim, manjericão, Vitex, Lantana, eucalipto e cravo, e sua repelência foi testada
em C. quinquefasciatus e A. aegypti, dessa forma constatou-se que
combinações utilizando óleos essenciais podem ser usadas para formulação de
repelentes comerciais, tendo eficácia tão boa quanto ao dos repelentes
sintéticos.
I. 2.5) Baccharis dracunculifolia (Asteraceae)
A família Asteraceae compreende espécies arbóreas, arbustivas,
herbáceas e lianas que estão amplamente distribuídas em regiões tropicais,
subtropicais e temperadas, particularmente na América do Sul. Expressiva em
número de espécies, Asteraceae é a maior família dentre as Angiospermas,
constituídas por cerca de 1535 gêneros e 23000 espécies. Em sua quase
totalidade, os gêneros são constituídos por plantas de pequeno porte as quais
são encontradas em todos os tipos de habitats, principalmente nas regiões
tropicais montanhosas na América do Sul (Cancelli, 2007). O gênero Baccharis
está representado por mais de 500 espécies distribuídas principalmente no
Brasil, Argentina, Colômbia, Chile e México, ocupando as regiões mais
elevadas (Ferronatto, 2006), e a alta concentração de espécies no Brasil e nos
16
Andes indica que uma dessas áreas é o provável centro de origem desse
gênero (Verdi, 2005). Estimam-se em 100 as espécies na Argentina
(Ferronatto, 2007) e no México (Marchesan, 2006) e cerca de 40 na Colômbia,
constituindo um dos mais importantes grupos de plantas neste país (Ferronatto,
2006), das quais 38% são endêmicas. No Brasil, estão descritas 120 espécies
de Baccharis, com a maior parte delas localizadas na região sudeste do País
(Marchesan, 2006) sendo, Baccharis dracunculifolia D.C e Baccharis uncinella
D.C as espécies mais comumente encontradas.
Plantas do gênero Baccharis, conhecidas popularmente por carquejas,
vassourinhas ou alecrim-do-campo são arbustos lenhosos de grande
diversidade morfológica (Ferronatto, 2006). Essas plantas são extensivamente
estudadas quanto a sua composição química e atividade biológica, sendo que
algumas têm proporcionado o desenvolvimento de novos fármacos, inseticidas
dentre outros, além de apresentarem elevado valor sócio-econômico.
(Ferronatto, 2007). Em geral são consumidas principalmente na forma de chás
com indicações para males do estômago, fígado, anemias, inflamações,
diabetes, doenças na próstata, sendo também descritas para o processo de
desintoxicação do organismo (Trevisan, 2007). Uma visão mais detalhada cita
que no Brasil e Argentina, por exemplo, Baccharis crispa e a Baccharis
notosergila são usadas para curar feridas e inflamações. Em relação à
Baccharis genistelloides, no Brasil, cita-se o seu uso para variadas patologias,
sintomas e sinais, tais como desordens digestivas e do fígado, malária, úlceras,
diabetes, anemia, diarréia, inflamações urinárias, amigdalite, verminoses, mal
de Hansen, entre outras (Verdi, 2005).
Do ponto de vista fitoquímico, apesar de não mais que 15% das
espécies do gênero Baccharis terem sido estudadas quanto à sua composição,
pode-se observar que o gênero é caracterizado pelo acúmulo de
sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos e flavonóides (Trevisan, 2007). É
nitidamente observado maior acúmulo de flavonas, flavonóis, diterpenos,
labdanos e clerodanos (Verdi, 2005), embora também se tenha verificado com
certa freqüência a presença de kauranos, germacreno, ácidos cumáricos,
tricotecenos e fenilpropanóides. Entre as espécies mais pesquisadas quanto à
composição química e/ou atividade biológica, encontra-se B. megapotamica, B.
incarum, B. trimera, B. trinervis, B. salicifolia, B. crispa, B. coridifolia, B.
17
dracunculifolia, B. uncinella, B. grisebachii e B. tricuneata (Ferronatto, 2007;
Ferronatto, 2008; Ferronatto, 2006). Estudos com o gênero Baccharis relatam
propriedades capazes de inibir a ação da hialuronidase por extratos e óleos
essenciais produzidos por espécies desse gênero. A atividade antiinflamatória
de óleos essenciais produzidos por B. uncinella e B. dracunculifolia foram
avaliados por Marchesan (2006). Os resultados obtidos mostraram que a
atividade enzimática foi inibida 77,86% na presença de 50μL do óleo de B.
dracunculifolia e de 74,40% para o óleo de B. uncinella.
A espécie Baccharis dracunculifolia DC (De Candole), é popularmente
conhecida como vassoura ou alecrim-do-campo, é amplamente utilizada na
medicina caseira. Estudos de literatura relatam o uso medicinal e religioso do
“alecrim-do-campo” comercializado em mercados e feiras livres no Rio de
Janeiro (Azevedo & Silva 2006), assim como a utilização das folhas para
feridas (Fenner, 2006) e o uso dos ramos, em decocto, como antifebril
(Rodrigues & Carvalho, 2001). É uma planta dióica com as inflorescências
masculinas e femininas, cujo arbusto cresce em quase todo o Brasil, é a
principal fonte botânica da própolis verde no sudeste do Brasil.
Figura 5: Baccharis dracunculifolia.
A palavra própolis é de origem grega, pró significa defesa e polis cidade.
Este termo genérico é utilizado para denominar o material resinoso e balsâmico
coletado e processado pelas abelhas a partir de várias fontes vegetais, como
18
por exemplo, a B. Dracunculifolia. As abelhas utilizam a própolis para diversas
finalidades: como medida de proteção contra intrusos, para manutenção da
temperatura interna e assepsia na colmeia (Salatino, 2005; Sousa, 2007). As
várias substâncias presentes na própolis provêm de flores, ramos, brotos,
exsudatos e de outras partes do tecido vegetal. Estas substâncias podem ser
modificadas na colmeia pela adição de secreções salivares (Santos, 2003). A
composição química da própolis é complexa e está relacionada com a flora da
região em que foi originada e a época da coleta, conseqüentemente, as
atividades biológicas podem ser distintas (Buriol, 2009), mas, em geral,
consiste em ceras, resinas, água, compostos inorgânicos, compostos fenólicos
e óleos essenciais (Mohammadzadeh, 2007).
Com relação à própolis brasileira, a mais popular e bem estudada é
chamada própolis verde, que tem origem da Baccharis dracunculifolia
(Asteraceae), amplamente distribuída nas Regiões Sudeste e Sul do Brasil
(Park, 2002; Salatino, 2005). Neste tipo prevalecem os compostos
fenilpropanoídes (ácidos cafeícos, ferúlicos, p-cumarínicos e cinâmicos), mas
também é detectada a presença de dehidrocostus lactona, que mostrou
exercer várias atividades, inclusive contra o Trypanosoma cruzi (Teixeira,
2006).
Uma característica dos compostos fenólicos das própolis analisadas e
da espécie vegetal de B. dracunculifolia foi a alta proporção de artepilina C e
outros derivados do ácido cinâmico. Com base nas evidências fitoquímicas, B.
dracunculifolia foi identificada como a principal fonte vegetal das própolis
produzidas nos estados de São Paulo e Minas Gerais (Alencar, 2005). O
extrato de B. dracunculifolia mostrou a presença de germacreno-D,
biciclogermacreno, assim como derivados prenilados do ácido cumarínico.
Germacreno-D e o biciclogermacreno (14%) estão entre os principais
compostos do óleo essencial de B. dracunculifolia em conjunto com o delta-
cadineno (13%) e germacrona (5%) (Loayza, 1995).
Estudos têm provado que o óleo essencial dessa planta possui atividade
antiulcerogênica (Massignani, 2009), antimicrobiana (Ferronato, 2007), ações
antiprotozoários e contra esquistossomose (Parreira, 2010). Lage (2014) em
seu estudo avaliou a composição química do óleo essencial de B.
dracunculifolia e sua atividade acaricida em Rhipicephalus microplus tanto do
19
óleo quanto de seus constituintes nerolidol e limonemo. Os principais
constituintes do óleo essencial foram nerolidol (22,3%), germacreno D (7,2%),
limoneno (6,9%), β-pineno (6,7) e biciclogermacreno (6,5%). A atividade
acaricida foi maior que 90% tanto para o óleo essencial quanto para o nerolidol,
o limonemo não apresentou atividade. Dessa forma, foi constatado que o óleo
essencial e seu principal constituinte, o nerolidol possui forte ação acaricida.
Pereira (2010) relatou em seu trabalho as atividades antiprotozoários,
esquistossomicida e antimicrobiana do óleo essencial de B. dracunculifolia.
Foram identificados 14 compostos oxigenados, sendo os principais o nerolidol
(33,51%) e espatulenol (16,24%). O óleo essencial mostrou atividade contra
formas promastigotas de Leishmania donovani, com valores de IC50 de 42 mg /
mL e também apresentou alta atividade conta Schistosoma mansoni , sendo
que todas as formas foram mortas nas concentrações de 10, 50 e 100 mg/mL.
Apesar de todos esses relatos sobre a atividade de B. dracunculifolia,
não há descrições sobre sua ação contra mosquitos, e principalmente contra C.
quinquefasciatus.
II) METODOLOGIA EXPERIMENTAL
II. 1) Recursos necessários
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Insetos Vetores de
Doenças e no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Federal de São
João Del-Rei/Campus Centro-Oeste Dona Lindu (UFSJ/CCO).
A seguir, encontram-se listados os equipamentos, reagentes e vidrarias
necessários para a execução deste projeto:
Equipamentos: agitador magnético (Nova Ética); freezer (Electrolux);
Liquidificador; micrótomo; destilador de água tipo Pilsen (SOLAB,
modelo SL71), estufa vertical (FANEM); equipamento de água de
Osmose Reversa (Vertex); estereomicroscópio (Zeiss); pHmetro
(AAKER, modelo mPA-210), Manta Aquecedora.
Produtos e reagentes: água destilada, ração para camundongos da
marca Purina, DMSO, azul de timol, vermelho de fenol, fenolftaleína,
álcool 70%, paraformaldeído, stefanine, formol, Entelan, extrato B.
dracunculifolia, OE de B. dracunculifolia.
20
Materiais e vidrarias: pipeta graduada, micropipeta, pipeta pasteur,
proveta graduada, béquer, balão de vidro, funil, erlenmeyer, bastão de
vidro, aparelho de clevender, balão de fundo redondo, pérolas de vidro,
cubas plásticas (50 X 40 X 25cm), copos plásticos (300mL), luvas, filme
de PVC transparente.
II. 2) Procedimentos
II. 2.1) Obtenção da planta B. dracunculifolia
A planta B. dracunculifolia foi coletada no mês de outubro de 2015 no
Instituto técnico de agropecuária e cooperativismo - EPAMIG em Pitangui –
MG. As folhas foram separadas do caule e uma parte do total foi utilizada
imediatamente após a coleta para obtenção do óleo essencial, e outra parte foi
armazenada adequadamente para secagem no laboratório de Química de
Produtos Naturais/Farmacognosia da Universidade Federal de São João del-
Rei no Campus Centro-Oeste Dona Lindu para posterior obtenção do extrato
etanólico.
Figura 6: B. dracunculifolia recém coletada.
II. 2.2) Obtenção do óleo essencial de B. dracunculifolia
Para obtenção do OE foi realizada a técnica de arraste de vapor
utilizando aparelho de clevenger. Pesou-se 200g de plantas fresca a qual foi
levada ao liquidificador para ser triturada juntamente com 800 mL de água. A
21
mistura foi então levada ao balão de vidro contendo pérolas de vidro, onde
ocorreu a extração durante um tempo de 5 horas, da seguinte forma: conteúdo
do balão foi aquecido, os vapores de água entraram em contato como
condensador, e posteriormente passaram pelo tudo de resfriamento, por ser
mais leve o óleo ficou concentrado sob a camada de água. Após a extração o
OE foi coletado e armazenado a -4ºC.
Figura 7: Esquema utilizado para extração do óleo essencial
II. 2.3) Obtenção do extrato etanólico de B. dracunculifolia
Para obtenção do extrato etanólico de B. dracunculifolia, após obtenção
da planta seca, esta foi triturada em liquidificador. Para realizar a maceração foi
pesado 50 g da folha triturada e misturou-se a 300 mL de etanol a 70%, a
mistura foi deixada em contato durante dois dias. Posteriormente, o macerado
foi filtrado e logo após foi realizada a secagem utilizando rotaevaporador.
II. 2.4) Obtenção dos espécimes de C. quinquefasciatus
As formas imaturas de C. quinquefasciatus foram obtidas do criadouro
semi-natural mantido dentro do CCO/UFSJ em Divinópolis, MG. As fêmeas
dos mosquitos fizeram a postura em cubas plásticas (50 X 40 X 25 cm)
contendo cerca de 25 litros de água deionizada e aproximadamente 10 “pelets”
22
(20g cada) de ração rotineiramente utilizada para a alimentação de
camundongos (Labina - Purina®) (Figura 8). As cubas foram preparadas cerca
de 10 dias antes da primeira postura e deixadas em condições naturais de
temperatura e fotoperíodo.
Figura 8: Criadouros de C. quinquefasciatus UFS/CCO
II. 2.5) Bioensaios
Em cada teste foram utilizadas 300 larvas de 3º e 4º instares, as quais
foram divididas por recipientes em grupos de 20 larvas. As larvas foram
expostas ao extrato de B. dracunculifolia nas concentrações de 200, 100, 50 e
25ppm. Em cada recipiente foram colocados 100 mL da solução em suas
devidas concentrações e ração para camundongos para alimentação das
larvas. Para o grupo controle foi utilizado um total de 60 larvas, sendo três
recipientes plásticos com 20 larvas cada um. Em cada recipiente foi colocado
100 mL de água deionizada e ração para camundongos.
As larvas também foram expostas ao OE de B. dracunculifolia nas
concentrações de 200, 100, 50 e 25 ppm. Para a dissolução do óleo foi
necessário a utilização de DMSO a 0,5%. Em cada recipiente foram colocados
100 mL da solução em sua concentração adequada e ração para alimentação
das larvas. Para o grupo controle utilizou-se um total de 60 larvas, sendo
dividas em grupos de 20 por recipiente. Em cada recipiente continha 100 mL de
água deionizada juntamente com DMSO 0,5%, além de ração para alimentação
das larvas.
23
Os experimentos foram realizados em triplicata e seguiram o protocolo
da Organização Mundial da Saúde (WHO, 1970).
II. 2.6) Análise fitoquímica
II. 2.7) Estudos morfológicos das larvas
As Larvas de C. quinquefasciatus de 3o e 4o instares foram expostas a
concentração sub-letal do OE de B. dracunculifolia durante uma e 24 horas.
Utilizou-se um total de 10 larvas para o tratado e 10 larvas para o grupo
controle. Após o tempo de exposição à solução inseticida, foram retiradas a
cabeça e sifão respiratório das larvas para posterior fixação.
A fixação foi realizada utilizando três diferentes fixadores: Stefanini,
formol e paraformaldeído. No fixador Stefanini e em Paraformaldeído as larvas
foram deixadas por 24 horas. Em formol, um grupo de larvas foi deixado
durante 24 horas e outro grupo de larvas foi deixado durante 48 horas. Depois
de completado o tempo de contato das larvas com os fixadores, essas foram
retiradas e armazenadas em álcool 70% para posterior emblocagem, corte e
montagem das lâminas.
Antes de realizar a emblocagem as larvas, sem cabeça e sem sifão,
foram deixadas em tampão fosfato por 24 horas. Após foram deixadas em
álcool 70% durante 15 minutos, álcool 80% durante 15 minutos, álcool 90%
durante 15 minutos e álcool absoluto durante 30 minutos. Posteriormente as
larvas ficaram em solução álcool-resina na proporção 1:1 durante 30 minutos e
após na solução álcool-resina 1:2 durante 30 minutos. Finalmente as larvas
foram deixadas em resina pura over night. Dessa forma, estavam prontas para
serem incluídas. Na emblocagem, ou inclusão, as larvas foram posicionadas no
fundo do recipiente de plástico e colocou-se então a resina juntamente com o
catalisador. Após foram deixadas no vácuo por duras horas e posteriormente o
bloquinho de resina foi retirado e colado no bloquinho de madeira.
Os cortes para montagem das lâminas foram realizados em micrótomo
com espessura de ?????? e posicionados nas lâminas.
Após a montagem das lâminas realizou-se a coloração de Hematoxilina
e Eosina (HE). As lâminas foram deixadas em água destilada por um minuto.
Posteriormente foram mergulhadas em Hematoxilina por cinco minutos, deixou
24
reagir com água da torneira por 4 minutos (água parada) e lavou-se em água
corrente. Após, as laminas foram deixadas em contato com eosina durante 5
minutos e posteriormente lavadas em água corrente. Após a secagem das
lâminas colou-se lamínulas utilizando resina sintética (Entelan®).
II. 2.8) Testes bioquímicos
Os ensaios bioquímicos foram realizados utilizando larvas de C.
quinquefasciatus expostas a dose sub letal do OE de B. dracunculifolia durante
uma e 24 horas. Foram feitas três repetições para cada experimento em dias
distintos. Após a exposição das larvas a dose sub-letal, 30 larvas foram
separadas para cada experimento e armazenadas em ultra freezer para
posteriores análises bioquímicas. As larvas do grupo controle foram expostas a
água deionizada e receberam o mesmo procedimento.
Cada grupo de larvas foi colocado separadamente em Tampão Tris HCl
20 mM, pH 7,4, e homogeneizadas em homogeneizador tipo potter. Após a
homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10
minutos. O pellet foi descartado e o sobrenadante recolhido e mantido sob
refrigeração para posteriores análises bioquímicas.
A determinação das concentrações de glicose e triglicerídeos nas
amostras foram realizadas utilizando kits enzimáticos colorimétricos
comercialmente disponíveis (Doles), sendo todos os ensaios realizados em
triplicata.
O cálculo para glicose foi realizado utilizando a seguinte fórmula:
Já o cálculo para TAG foi realizado da seguinte forma:
As dosagens de proteína foram determinadas pelo método descrito por
HARTREE (1972), usando como padrão BSA na concentração de 0 a
120μg/μL. Foram utilizados 50 μL de amostra misturados a 950 μL de água
deionizada resultando em 1 mL de solução final. A essa solução final foram
25
adicionados 0,900 mL de reagente A (Preparado com a diluição em 1 L de
água deionizada de 2 g de tartarato de sódio e potássio + 100 g de Na2CO3 +
20 g de NaOH), posteriormente homogeneizou-se a mistura e aqueceu-a por
10 min a 50°C. Logo após, deixou-a esfriar a temperatura ambiente e
adicionou-se 0,100 mL de reagente B (preparado com a diluição em 1 L de
água deionizada de 2 g de tartarato de sódio e potássio + 1 g de CuSO4 . 5 H2O
+ 0,4 g de NaOH). A solução foi agitada e incubada por 10 min a temperatura
ambiente e em seguida foi adicionado 3,0 mL de reagente C (Reagente de
FolinCiacalteus® diluído em água deionizada na proporção de 1:14).
Posteriormente, a mistura foi homogeneizada e aquecida por 10 min a 50°C.
Após esfriar a temperatura ambiente, realizou-se a leitura no espectrofotômetro
em comprimento de onda de 650 nm. Os ensaios também foram realizados em
triplicata.
O cálculo para proteínas totais é realizado da seguinte forma:
ABS medida -------- 50 µL de amostra
Y ----------- 1 µL
Y = ABS para cada µL
Y x fator de correção* = concentração de proteínas (µg/µL)
*O fator de correção é obtido através da curva padrão de BSA podendo
variar de acordo com a construção da curva. No caso dos experimentos
realizados neste trabalho o fator de correção utilizado foi de 543,48.
II. 2.9) Análise de pH do tubo intestinal das larvas
Foram utilizados os indicadores Vermelho de Fenol (pKa 7,9), Azul de
Timol (pKa 8,2) e Fenolftaleína (pKa 9), todos em solução a 0,5%. 100 Larvas
de 3º e 4º instares de C. quinquefasciatus foram divididas em grupos de 20 em
cada recipiente e expostas a CL50 do OE de B. dracunculifolia. O grupo controle
continha apenas água deionizada e DMSO. Após o tempo de uma e 24 horas
26
as larvas foram retiradas da substância, separadas em grupos de 10 larvas,
colocadas em um recipiente contendo aproximadamente 10 mL de água
deionizada, onde posteriormente acrescentou-se cada indicador de pH.
Para cada teste foram adicionadas aproximadamente 20 gotas de
Fenolftaleína, dez gotas de Azul de Timol e dez gotas de Vermelho de Fenol
em aproximadamente, 30 mL de água, estavam presentes as larvas. As
mesmas condições foram realizadas com o grupo controle.
Os resultados foram obtidos a partir da visualização do tubo intestinal
das larvas utilizando um estereomicroscópio. Todas as larvas foram
observadas com os três indicadores.
Tabela 1: Referências de pH e suas respectivas colorações.
Indicador de pH pH Coloração
Fenolftalína 8,0 – 10 (incolor - rosa)
Azul de Timol 8,0 – 9,5 (amarelo – azul)
Vermelho de Fenol 6,5 – 8,0 (amarelo – vermelho)
Para a determinação dos parâmetros colorimétricos do pH foi realizado o
procedimento de tubos múltiplos, no qual utilizou-se uma solução de ácido
acético (CH3COOH) e com o auxílio de uma bureta adicionou-se quantidades
necessárias de solução básica (NaOH) para atingir os pHs requeridos. Para
aferir os pHs utilizou-se um pHmetro. Em seguida, adicionou-se os indicadores
de pH nos tubos com os padrões de pH pré-estabelecidos. Foram adicionadas
seis gotas em cada tubo dos seguintes indicadores, Vermelho de Fenol e Azul
de Timol, e 12 gotas para o indicador Fenolftaleína (Figuras 9 – 11).
27
Figura 9: Determinação de parâmetros de pH entre 6,5 e 8,0 de Vermelho de
Fenol.
Figura 10: Determinação de parâmetros de pH entre 8,0 e 9,5 de Azul de
Timol.
28
Figura 11: Determinação de parâmetros de pH entre 9,0 e 10,0 e acima de
10,0 de Fenolftaleína
II. 2.10) Análise estatística
A determinação das doses sub-letais foram submetidas a análise de
Probit através do programada DL50. Conforme a WHO preconiza, os
bioensaios foram feitos em triplicata de experimento, sendo utilizado para cada
experimento um total de 240 larvas por dosagem e por inseticida.
Os dados da mensuração morfológica foram analisados com auxílio do
software BioEstat 5.0. Visando identificar variações entre os resultados,
aplicou-se o teste de normalidade de Shapiro-Wilk e posteriormente os testes
de variância ANOVA/Tukey ou Kruskal-Wallis/Dunn.
III) RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi obtido um total de 4,84 g de extrato etanólico seco, com cor marrom-
esverdeado e odor característico de própolis. Dessa forma, foi calculado o
rendimento através seguinte fórmula:
Assim, o rendimento do extrato etanólico obtido foi de 9,68%.
29
Já o rendimento do óleo essencial foi calculado usando a seguinte
formula:
O volume total de OE obtido através da técnica de arraste de vapor foi
de 1,21 mL, o óleo obtido possuiu uma cor amarelo- claro e um cheiro
marcante e característico desse tipo de óleo. A densidade considerada foi de
932 mg/mL. Dessa forma, obtemos um rendimento de 0,56%. Conforme
amplamente mencionado na literatura há um baixo rendimento na produção
dos OE em geral. Comparando nosso resultado com o resultado de Loyaza
(1995), o qual obteve um rendimento de OE de B. dracunculifolia de 0,32%
utilizando a mesma técnica de arraste de vapor e partindo de um total de 1 kg
de folhas e de Lage (2015) que obteve um rendimento de 0,8% utilizando esta
técnica e partindo do total de 300g de folhas de B. Dracunculifolia podemos
considerar que tivemos um rendimento relativamente bom. Além disso, O
rendimento normalmente é afetado por diversos fatores, como variações
fisiológicas inerentes à planta (fase de desenvolvimento, ciclo de polinização,
variações sazonais, condições de estresse da planta), condições ambientais
(clima, poluição atmosférica, características do solo), variações geográficas,
características genéticas dos cultivares, entre outros (Figueiredo, 2008).
Para verificar a ação do extrato e do óleo essencial de B. dracunculifolia,
foram analisados os índices de mortalidade nos testes de susceptibilidade após
a exposição das larvas ao extrato etanólico e ao óleo essencial. Para cada
teste foram utilizadas 300 larvas e os mesmos foram realizados em triplicata.
Os resultados são mostrados nas tabelas e nos gráficos a seguir:
Tabela 2: Mortalidade de larvas de C. quinquefasciatus após exposição ao óleo
essencial de B. dracunculifolia
Concentração do óleo essencial de B. dracunculifolia Mortalidade
200 ppm 173
100 ppm 133
50 ppm 104
25 ppm
Controle
85
6
30
Tabela 3: Mortalidade de larvas de C. quinquefasciatus após exposição ao
extrato etanólico de B. dracunculifolia
Concentração do óleo essencial de B. dracunculifolia Mortalidade
200 ppm 6
100 ppm 6
50 ppm 5
25 ppm
Controle
4
4
Através da análise dos dados apresentados podemos observar que o
óleo essencial mostrou uma boa atividade sobre as larvas de C.
quinquefasciatus causando muitas mortes. Como já era esperado, o maior
número de larvas mortas foi obtida na maior concentração, sendo a
mortalidade diminuída de acordo coma diminuição da concentração ( gráfico 1).
Dessa forma a CL50 calculada para o óleo essencial foi de 50 ppm, com uma
variância de 43,751 – 55,275.
Gráfico 1 : Mortalidade de larvas após a exposição ao óleo essencial de B.
dracunculifolia.
Já o extrato etanólico não foi capaz de causar um número de mortes
significativo. Como podemos observar (gráfico 2) , apesar da linearidade dos
dados, ou seja, houve maior número de mortes na maior concentração, e
31
menor número de mortes na menor concentração, a quantidade de mortes foi
extremamente pequena para a quantidade de larvas analisadas. Assim, não foi
possível realizar o teste de probit e verificar a CL50 para o extrato etanólico.
Gráfico 2 : Mortalidade das larvas após a exposição ao extrato etanólico de B.
dracunculifolia.
Devido ao fato da impossibilidade de cálculo da CL50 para o extrato
etanólico das folhas de B. dracunculifolia, a continuação dos experimentos só
foi possível utilizando o óleo essencial, o qual obtivemos a CL50 de 50 ppm.
As larvas de C. quinquefasciatus foram expostas a CL50 do óleo
essencial de B. dracunculifolia durante 1 hora e durante 24 horas, após esses
períodos as larvas foram retiradas da solução para realizarmos análises
histológicas e bioquímicas.
IV) CONSIDERAÇÕES FINAIS
V) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABERCROMBIE, J.; BERG, C.O. Malacophagous dipteral of South America:
Biology and immature stages of Dictyodes dictyodes (Sciomyzidae). Revista
Brasileira de Entomologia, v.22, p. 23-32, 1978.
32
ALDRIDGE, W.N. (1979). Insecticids, past, present and future: practice and the
understanding of mechanisms. Ann. occup. Hyg., 22:407-409.
ALENCAR, S. M.; AGUIAR, C. L.; GUZMÁN-PAREDES, J.; PARK, K. Y.
Composição química de Baccharis dracunculifolia, fonte botânica das própolis
dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Ciência Rural, v. 35, p. 909-915,
2005.
ARAUJO, E. C.; SILVEIRA, E. R.; LIMA, M. A.; NETO, M. A.; ANDRADE,
I.;LIMA, M. A. Insecticidal activity and chemical composition of volatile oils from
Hyptismartiusii benth. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51;
p.3760-3762, 2003.
AZEVEDO, S. K.; SILVA, I. M. Plantas medicinais e de uso religioso
comercializadas em mercados e feiras livres no Rio de Janeiro. Acta Botânica
Brasilica, v. 20, p. 185-194, 2006.
BERNAL, J.; HEMINGWAY, G. J.; RANSON, H. Insecticide resistance in insect
vectors of human disease. Annual Review Entomology, v. 45, p. 371–391,
2000.
BRACCO, J, E.; BARATA, J.M.S.; MARINOTTI, O. Evaluation of insecticide
resistance and Biochemical Mechanisms in a population of Culex
quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) from São Paulo, Brazil. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 94, p. 115-20, 1999.
BRASIL. Ministério da Saúde. Guia de vigilância epidemiológica. p.815, 2005.
BROGDON, W. G.; MCALLISTER, J. C. Insecticide resistance and vector
control, Centers for Disease Control and Prevention, Emerging Infectious
Diseases, v. 4, p.605-612, 1998.
BUDEL, J. M.; DUARTE, M. R.; SANTOS, C. A. M. Parâmetros para análise de
carqueja: comparação entre quatro espécies de Baccharis spp.(Asteraceae).
Revista Brasileira de Farmacognosia, v.14, p.41-48, 2004.
33
BÚFALO, M.C.; FIGUEIREDO, A.S.; SOUSA, J.P.; CANDEIAS, J.M.; BASTOS,
J.K.; SFORCIN, J.M. Anti-poliovirus activity of Baccharis dracunculifoliaand
propolis by cell viability determination and real-time PCR Journal of Applied
Microbiology, v. 107, p. 1669-1680, 2009.
CAMPOS, J.; ANDRADE, C. F. S. Susceptibilidade larval de populações de
Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a inseticidas químicos. Revista de
Saúde Pública, v. 37, p. 523-7, 2003.
CANCELLI, R. R.; EVADT, A. C. P.; BAUERMANN, S. G. Contribuição a
Morfologia Polínica da Família Asteraceae Martinov no Rio Grande do SUL-
RS. Pesquisas Botânica, v. 58, p.347-374, 2007.
CARVALHO, A. F.; MELO, V. M.; CRAVEIRO, A. A.; MACHADO, M. I.;
BANTIM, M. B.; RABELO, E. F. Larvicidal activity of the essential oil from Lippia
sidoides Cham. against Aedes aegepti L. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz,
v. 98, p.569-571, 2003.
CETIN, H.; KURT, Y.; ISIK, K.; YANIKOGLU, A. Larvicidal effect of Cedrus
libani seed oils on mosquito Culex pipiens. Pharmaceutical Biology, v. 47, p.
665-668, 2009.
CHAVASSE, D. C.; YAP, H. H.; Chemical methods for the control of vectors
and pests of public health importance. WHO/CTD/WHOPES/ 97.2, 1997.
CHOI, W.; PARK, B.; KU, S.; LEE, S.; Repellent activity of essential oils and
monoterpenes against Culex pipiens pallens. American Mosquito Control
Association, v. 18, p. 348–351, 2002.
34
CHOWDHURY, N.; CHATERJEE, S. K.; LASKAR, S.; CHANDRA, G. Larvicidal
activity of Solanum villosum Mill. leaves to Anopheles subpictus with effect on
non-target Chironomus circumdatus. Journal of Pest Science, v.10, p. 213–214,
2008.
COBOS, M.I.; RODRIGUEZ J.L.; DEMO, M.M.; FAILLACI, S.M.; ZYGADLO,
J.A, Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Baccharis
notosergila. Planta Medica, vol. 67, p. 84–86, 2001.
CONTI, B.; BENELLI, G.; FLAMINI, G.; CIONI, P. L.; PROFETI, R.;
CECCARINI, L.; MACCHIA, M.; CANALE, A. Larvicidal and repellent activity of
Hyptis suaveolens (Lamiaceae) essential oil against the mosquito Aedes
albopictus Skuse (Diptera: Culicidae). Parasitology Research, v. 110, p. 2013–
2021, 2012.
CONTI, B.; CANALE, A.; BERTOLI, A.; GOZZINI, F.; PISTELLI, L.; Essential oil
composition and larvicidal activity of six Mediterranean aromatic plants against
the mosquito Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). Parasitology Research, v.
107, p. 1455–1461, 2010.
CURTIS, C.; LINES, J.; LU, B.; RENZ, A. Natural and synthetic repellents. In:
Curtis, C.F. (Ed.), Appropriate Technology in Vector Control. CRC Press,
Florida. Chapter 4, 1989.
DAVIES, T. G. E.; FIELD, L. M.; USHERWOOD, P. N.; WILLIAMSON, M. S.
DDT, pyrethrins, pyrethroids and insect sodium channels. International Union of
Biochemistry and Molecular Biology Life, v. 59, p. 151–162, 2007.
DIAS, C.; MORAES D, Essential oils and their compounds as Aedes aegypti L.
(Diptera: Culicidae) larvicides: review. Parasitology Research, v.113, p. 565–
592, 2014.
35
DONG, K.; DU, Y.; RINKEVICH, F.; NOMURA, Y.; XU, P.; WANG, L.; Molecular
biology of insect sodium channels and pyrethroid resistance. Insect
Biochemistry and Molecular Biology, v. 50, p. 1–17, 2014.
ECHEGOYEN,C. G.; PACHECO, R. P.; HERNÁNDEZ, M. S.; VEGA, J. R.;
RIVERA, L. L.; HERNANDEZ, N. A; ARMAS, R. G. Inhibition of the growth and
development of mosquito larvae of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)
treated with extract from leaves of Pseudocalymma alliaceum (Bignonaceae).
Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 7, p. 594-601, 2014.
ELANGO, G.; BAGAVAN, A.; KAMARAJ, C.; ZAHIR, A.A.; RAHUMAN, A. A.
Oviposition-deterrent, ovicidal, and repellent activities of indigenous plant
extracts against Anopheles subpictus Grassi (Diptera: Culicidae). Parasitology
Research, v. 105, p. 1567–1576, 2009.
ELDEFRAWI, A.T. The acetylcholine receptor and its interaction with
insecticide. Insect Biochemistry Physiology, p. 297-326, 1976.
EL-SHEIKH, T. M.; AL-FIFI, Z. I.; ALABBOUD, M. A. Larvicidal and repellent
effect of some Tribulus terrestris L., (Zygophyllaceae) extracts against the
dengue fever mosquito, Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Saudi
Chemical Society, 2012.
ELUMALAI, D.; HEMALATHA, P.; KALEENA, P. K. Larvicidal activity and GC–
MS analysis of Leucas aspera against Aedes aegypt, Anopheles stephensi and
Culex quinquefasciatus. Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences,
p. 1-8, 2015.
FAO, 1995. Flavours and Fragrances of Plant Origin. Rome.
FENNER, R.; BETTI, H. A.; MENTZ, L. A.; RATES, S. M. 2006. Plantas
utilizadas na medicina popular brasileira com potencial atividade antifúngica.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, p. 369-392, 2006.
36
FERRONATTO, R.; MARCHESAN, E. D.; BEDNARSKI, F.; ALENCAR, S. M.;
ONOFRE, S. B. Atividade antioxidante dos óleos essenciais produzidos por
Baccharis dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae).
Arquivos de Ciências da Saúde da UNIPAR, v.10, p.67-70, 2006.
FERRONATTO, R.; MARCHESAN, E. D.; BEDNARSKI, F.; ALENCAR, S.M.;
ONOFRE, S. B. Atividade antioxidante dos óleos essenciais, produzidos por
Baccharis dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae).
Arquivos de ciências da saúde da UNIPAR, v.10, p.67-70, 2006.
FERRONATTO, R.; MARCHESAN, E. D.; BEDNARSKI, F.; RIBAS, T. T. Z.;
ONOFRE, S. B. Efeitos do óleo essencial produzido por Baccharis
dracunculifolia D. C. (asteraceae) sobre bactérias cariogênicas. Arquivos de
Ciências da Saúde da UNIPAR, v.11, p.15-18,
FERRONATTO, R.; MARCHESAN, E. D.; PEZENTI, E.; BEDNARSKI, F.;
ONOFRE, S. B. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais produzidos por
Baccharis dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae). Revista
Brasileira de Farmacognosia, v.17, p.76- 84. 2007.
FIGUEIREDO, A. C.; BARROSO, J. G.; PEDRO, L. G.; SCHEFFER, J. J.
Factors affecting secondary metabolite production in plants: volatile
components and essential oils. Flavour and Fragrance Journal, v. 23, p. 213-
226, 2008.
GHOSH, A.; CHOWDHURY, N.; CHANDRA, G.; Plant extracts as potential
mosquito larvicides. Indian Journal of Medical Research, v. 135, p. 581–598,
2012.
GOVINDARAJAN, M. Chemical composition and mosquitocidal potential of
Mentha spicata (Linn.) essential. In: Govil JN, Bhattacharya S (eds) Recent
progress in medicinal plants: essential oil III and phytopharmacology. Studium,
USA, p.153–172, 2013.
37
GOVINDARAJAN, M.; RAJESWARY, M.; HOTI, S. L.; BHATTACHARYYA, A.;
BENELLI,G. Eugenol, α-pinene and β-caryophyllene from Plectranthus
barbatus essential oil as eco-friendly larvicides against malaria, dengue and
Japanese encephalitis mosquito vectors. Parasitoloy Research, v. 115, p. 807-
815, 2015.
GOVINDARAJAN, M.; SIVAKUMAR, R.; RAJESWARI, M.; YOGALAKSHMI, K.;
Chemical composition and larvicidal activity of essential oil from Mentha spicata
(Linn.) against three mosquito species. Parasitology Research, v. 110, p. 2023–
2032, 2012.
GUENTHER, E. 1972. The Essential Oils. Krieger Publishing Company, Florida,
USA, 1972.
GUIMARÃES, V. P.; SILVA, I. G.; SILVA, H. H. G.; ROCHA, C. Atividade
larvicida do extrato bruto etanólico da casca do caule de Magonia pubescens
St. Hil. sobre Aedes albopictus (Skuse, 1894) (Diptera, Culicidae). Revista
Patologia Tropical, v.30, p.243-249, 2001.
HORTA, M. A. P.; CASTRO, F. I.; ROSA, C. S.; DANIEL, M. C.; MELO, A. L.
Resistance of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) to Temephos in Brazil: A
Revision and New Data for Minas Gerais State. BioAssay, v. 6, P. 1-5, 2011.
IBRAHIM, J.; ZAKI, Z. M. Development of environment-friendly insect repellents
from the leaf oils of selected Malaysian plants, ASEAN. Review of Biodiversity
and Environmental , v. 6, p. 1–7, 1998.
JAENSON, T. G.; PALSSON, K.; BORG-KARLSON, A. K. Evaluation of
extracts and oils of mosquito (Diptera: Culicidae) repellent plants from Sweden
and Guinea-Bissau. Journal of Medical Entomology, v. 43, p. 113–119, 2006.
38
JAENSON, T. G.; PALSSON, K.; KARLSON, A. K. Evaluation of extracts and
oils of mosquito (Diptera: Culicidae) repellent plants from Sweden and Guinea-
Bissau. Journal of Medical Entomology, v. 43, p. 113–119, 2006.
JONES, C.M., MACHIN, C., MOHAMMED, K., MAJAMBERE, S., ALI, A.S.,
KHATIB, B.O., Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus from Zanzibar:
implications for vector control programmes. Parasites Vectors, v. 5, p. 78-87,
2012.
KATZ, T.; MILLER, J.; HEBERT, A. Insect repellents: historical perspectives
and new developments. Journal of the American Academy of Dermatology, v.
58, p. 865–871, 2008.
KOSTIC, M.; POPOVIC, Z.; BRKIC, D.; MILANOVIC, S.; SIVCEV, I.;
STANKOVIC, S. Larvicidal and antifeedant activity of some plant-derived
compounds to Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Limantriidae). Bioresource
Technology, v. 99, p. 7897–7901, 2008.
KUMAR, S.; WAHAB, N.; WARIKOO, R. Bioefficacy of Mentha piperita
essential oil against dengue fever mosquito Aedes aegypti L. Asian Pacific
Journal of Tropical Biomedicine, v.1, p. 85-88, 2011.
LAGE, T. C.; MONTANARI,R. M.; FERNANDES, S. A.; MONTEIRO, C. M.;
SENRA, T. O.; ZERINGOTA, V.; MATOS, R. S.; DAEMON, E. Chemical
composition and acaricidal activity of the essential oil of Baccharis
dracunculifolia De Candole (1836) and its constituents nerolidol and limonene
on larvae and engorged females of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae).
Experimental Parasitology, v. 148, p. 24–29, 2015.
LANCHER, W. Ecofisiologia vegetal. São Carlos: Rima. p. 519, 2000.
LASSALE, J.; GAULD, I. Hymenoptera and Biodoversity. Wallinford: CAB. p.
350, 1993.
39
LOAYZA, I.; ABUJDER, D.; ARANDA, R.; JAKUPOVIC, J.; COLLIN, G.;
DESLAURIERS, H.; Essential oils of Baccharis salicifolia, B. latifolia and B.
dracunculifolia. Phytochemistry, v. 38, p. 381-389, 1995.
LOAYZA, I.; ABUJDER, D.; ARANDA, R.; JAKUPOVIC, J.; COLLIN, G.;
Essential oils of Baccharis salicifolia, B. latifolia and B. dracunculifolia.
Phytochemistry, v. 38, p. 381-389, 1995.
LOW, V. L.; CHEN, C. D.; LIM, P. E.; LEE, H. L.; TAN, T. K.; LIM, Y. A.; First
molecular genotyping of voltage gated sodium channel alleles in Culex
quinquefasciatus populations in Malaysia. Pesticide Biochemistry and
Physiology , v. 107, p. 127–131, 2013.
LUNA, J. E.; MARTINS, M. F.; ANJOS, A. F.; KUWABARA, E. F.; SILVA, M. A.;
Susceptibilidade de Aedes aegypti aos inseticidas temephos e cipermetrina,
Brasil. Revista de Saúde Pública, v. 38, p. 842-843, 2004.
MAJUNDAR, D. K.,; GOVIL, J. N.; SINGH, V. K.; SHAILAJA, M. S.; GANGAL,
S. V. Phytochemistry and Pharmacology II, VIII. Studium Press LLC, Texas, p.
273–281, 2003.
MANDAL, S. Effect of Azardirachta india, A. Juss (Meliaceae) seed oil and
extract against Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae) larval
susceptibility of Indian subcontinent Macedonian. Journal of Medical Sciences,
v. 15, p. 5–11. 2011.
MARCHESAN, E.D.; FERRONATTO, R.; BEDNARSKI, F.; ALENCAR, S. M.;
ONOFRE, S. B. Ação dos óleos essenciais produzidos por Baccharis
dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae) sobre a atividade
hialuronidase. Arquivos de Ciências da Saúde da UNIPAR, v.10, p.63-66, 2006.
40
MARICONI, F. A. M. Inseticidas e seu emprego no combate às pragas. v.1, 4a.
edição, 1980, Editora Nobel, SP, 305 pp, 1980.
MONZON R. B.; LUCSON, L. L. C.; MORALES A. S.; MUTUC E. F. C.
Larvicidal potencial of five phiippine plants against Aedes aegypti (Linnaeus)
and Culex quinquefasciatus (Say). Southteast Asian. Journal of Tropical
Medical Public Health, v. 25, p.755-59, 1994.
MOORE, S. J.; HILL, N.; RUIZ, C.; CAMERON, M .M.; Field evaluation of
traditionally used plant-based insect repellents and fumigants against the
malaria vector Anopheles darlingi in Riberalta, Bolivian Amazon. Journal of
Medical Entomology, v. 44, p. 624–630, 2007.
NIKKON, F.; HABIB, M. R.; SAUD, Z. A.; KARIM, M. R.Tagetes erecta Linn.
and its mosquitocidal potency against Culex quinquefasciatus. Asian Pacific
Journal of Tropical Biomedicine, v. 2, p. 186-188, 2011.
PARK, K. Y.; ALENCAR, S. M.; AGUIAR, C. L. Botanical origin and chemical
composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.
50, p. 2502-2506, 2002.
PARREIRA, N.; MAGALHÃES, L.; MORAISA, D.; CAIXETA, S.; SOUSA, J.;
BASTOS, J.; CUNHA, W.; SILVA, M.; NANAYAKKAR, N.; RODRIGUES, V.;
FILHO, A. Antiprotozoal, Schistosomicidal, and Antimicrobial Activities of the
Essential Oil from the Leaves of Baccharis dracunculifolia. Chemistry &
biodiversity, v. 7, p. 993-1001, 2010.
PAVELA, R. Essential oils for the development of eco-friendly mosquito
larvicides: a review. Industrial Crops and Products, v. 76, p. 174–187, 2015.
PAVELA, R. Larvicidal effects of some Euro-Asiatic plants against Culex
quinquefasciatus Say larvae (Diptera: Culicidae). Parasitology Research, v.
105, p. 887, 2009.
41
PAVELA, R.; HARMATHA, J.; BARNET, M.; VOKAC, K. Systemic effects of
phytoecdysteroids on the cabbage aphid Brevicoryne brassicae
(Sternorrhyncha: Aphididae). European Journal of Entomology, v. 102, p. 647–
653, 2005.
PERUMALSAMY, H.; CHANG, K.S.; PARK, C.; AHN, Y.J. Larvicidal activity of
Asarum heterotropoides root constituents against insecticide susceptible and
resistant Culex pipiens pallens and Aedes aegypti and Ochlerotatus togoi.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, p. 10001–10006, 2010.
PHASOMKUSOLSIL, S.; SOONWERA, M. The effects of herbal essential oils
on the oviposition deterrent and ovicidal activities of Aedes aegypti (Linn.),
Anopheles dirus (Peyton and Harrison) and Culex quinquefasciatus (Say)
Tropical Biomedicine, v. 29, p. 138–150, 2012.
PRAJAPATI, V.; TRIPATHI, A. K.; AGGRAWAL, K. K.; KHANUJA, S. P.
Insecticidal, repellent and oviposition-deterrent activity of selected essential oils
against Anopheles stephensi, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus.
Bioresource Technology, v. 96, p. 1749–1757, 2005.
PRIESTLEY, C. M.; WILLIAMSON. E.M.; WAFFORD, K.A.; SATTELLE, D.B.;
Thymol, a constituent of thyme essential oil, is a positive allosteric modulator of
human GABA(A) receptors and a homo-oligomeric GABA receptor from
Drosophila melanogaster. Journal of Pharmacology, V. 140, p. 1363–1372,
2003.
PUSHPANATHAN, T.; MULLAI, K.; JEBANESAN, A. Effect of bioactive
fractions of Citrullus vulgaris Schrad. leaf extract against Anopheles stephensi
and Aedes aegypti. Parasitology Research, v. 102, p. 951-955, 2008.
42
PUSHPANATHAN,T; JEBANESAN, A; GOVINDARAJAN, M. The essential oil
of Zingiber officinalis Linn (Zingiberaceae) as a mosquito larvicidal and repellent
agent against the filarial vector Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae),
Parasitology Research, v. 102, p.1289–1291, 2008.
RAHUMAN, A. A.; BAGAVAN, A.; KAMARAI, C.; SARAVANAN, E.; ZAHIR, A.
A.; ELANGO, G.; Efficacy of the larvicidal botanical extracts against Culex
quinquefasciatus Say (Dipetera; Culicidae). Parasitology Research, v. 104, p.
1365–1372, 2009.
RAHUMAN, A. A.; BAGAVAN, A.; KAMARAJ, C.; SARAVANAN, E.; ZAHIR, A.
A.; ELANGO, G. Efficacy of larvicidal botanical extracts against Culex
quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae). Parasitology Research, v. 104, p.
1365–1372, 2009.
RAJKUMAR, S.; JEBANESAN, A. Oviposition deterrent and skin repellent
activities of Solanum trilobatum leaf extract against the malarial vector
Anopheles stephensi. Journal of Insect Science, v. 5, p. 1–3, 2005.
RANA, S. I.; RANA, S. A. Efficacy of essential oils of aromatic plants as
larvicide for the management of filarial vector Culex quinquefasciatus Say
(Diptera: Culicidae) with special reference to Foeniculum vulgare. Asian Pacific
Journal of Tropical Disease, v.2, p. 184-189, 2012.
REEGAN, A. D.; KANNAN, R. V; PAULRAJ, M. G; IGNACIMUTHU, S.
Synergistic effects of essential oil-based cream formulations against Culex
quinquefasciatus Say and Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae). Journal of
Asia-Pacific Entomology, v. 17, p. 327–331, 2014.
43
RIBEIRO-NETO J. A.; GASPAR-JUNIOR P. G.; ALVES S. N.; TEIXEIRA J. L.
Atividade de diferentes substâncias derivadas de plantas contra larvas de
Culex quinquefasciatus. In: XXVII Congresso Brasileiro de Zoologia, 2008,
Curitiba. XXVII Congresso Brasileiro de Zoologia. Curitiba, 2008.
RODRIGUES, V. E.; CARVALHO, D. A. Levantamento etnobotânico de plantas
medicinais no domínio do cerrado na região do alto Rio Grande –Minas Gerais.
Ciências Agrotecnicas, v. 25, p. 102-123, 2001.
SALATINO, A.; TEIXEIRA, E. W.; NEGRI, G.; MESSAGE, D. Origin and
chemical variation of Brazilian própolis. Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine v. 2, p. 33-38, 2005.
SARKAR, M.; BHATTACHARYYA, I. K.; BORKOTOKI, A.; GOSWAMI, D.;
RABHA, B.; BARUAH, I. Insecticide resistance and detoxifying enzyme activity
in the principal bancroftian filariasis vector, Culex quinquefasciatus, in
northeastern India. Medical and Veterinary Entomology , v. 23, p. 122–131,
2009.
SENTHIL NATHAN, S.; KALAIVANI, K.; CHUNG, G. The effects of Azadirachtin
and Nucleopolyhedrovirus (NPV) on midgut enzymatic profile of Spodoptera
litura Fab. (Lepidoptera: Noctuidae). Biological Control, v. 34, p. 93–98, 2005.
SENTHILKUMAR, A.; JAYARAMAN, M.; VENKATESALU, V. Chemical
constituents and larvicidal potential of Feronia limonia leaf essential oil against
Anopheles stephensi, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus. Parasitology
Research, v. 112, p. 1337–1342, 2013.
SILVEIRA, G. A. R.; MADEIRA, N. G.; DE AZEREDO-ESPIN, A. M. L.; PAVAN,
C. Levantamento de Microhimenópteros parasitoides de dípteros de
importância médico- veterinária no Brasil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz,
v. 84,p. 505-510, 1989.
44
SODERLUND, D. M. Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels.
Pest Manage. v. 64, p. 610–616, 2008.
SUCEN - Superintendência de Controle de Epidemias, 2001. Segurança em
controle químico de vetores; disponível em:
http://www.sucen.sp.gov.br/saude_trabalhador/texto_seguranca_e_controle_qui
mico.ht Acesso em: 20 de jan. de 2006.
SUKUMAR, K.; PERICH, M. J.; BOOBAR, L. R. Botanical derivatives in
mosquito control: a review. Journal of the American Mosquito Control
Association , v. 7, p. 210–237, 1991.
TAWATSIN, A.; WRATTEN, S. D.; SCOTT, R. R.; THAVARA, U.;
TECHANDAMRONGSIN, Y. Repellency of volatile oils from plants against three
mosquito vectors. Journal of Vector Ecology, v. 26, p. 76–82, 2001.
TEIXEIRA, A. R.; NITZ, N.; GUIMARO, M. C.; GOMES, C.; SANTOS-BUCH, C.
A. Chagas disease. Journal of Postgraduate Medicine, v. 82, p. 788-798, 2006.
TEIXEIRA, J. L.; ALVES, S. N.; JESUS, T. P.; OLIVEIRA, M. G.; SILVA, R. C.
Obtenção de extrato bruto de Melia azedarach (Meliacea) para possível
utilização no controle do mosquito Culex quinquefasciatus. In: XXI Encontro
Regional da Sociedade Brasileira de Química, 2007,
TIWARY, M.; NAIK, S. N.; TEWARY, D. K.; MITTAL, P. K.; YADAV, S.
Chemical composition and larvicidal activities of the essential oil of Zanthoxylum
armatum DC (Rutaceae) against three mosquito vectors. Journal of Vector
Borne Diseases, v. 44, p. 198-204, 2007.
45
TOLOZA, A. C.; ZYGADLO, G. J.; DURRHEIM, D. N.; DU, T. N.; HUNT, R. H.;
COETZEE, M. Local plants as repellents against Anopheles arabiensis. Central
African Journal of Medicine v. 46, p. 213–216, 2000.
TRABOULSI, A. F.; EL-HAJ, S.; TUENE, M.; TAOUBI, K.; NADER, N. A.;
MRAD, A. Repellency and toxicity of aromatic plant extracts against the
mosquito Culex pipiens molestus (Diptera: Culicidae). Pest Management
Science, v. 61, p. 597-604, 2005.
TREVISAN, M. M. W.; Abordagem Fitoquímica de Baccharis dracunculifolia
D.C. (Asteraceae). Monografia de Conclusão de Curso. Universidade
Paranaense – UNIPAR - Campus de Francisco Beltrão, 2007.
TRONGTOKIT, Y.; RONGSRIYAM, Y.; KOMALAMISRA, N.;
APIWATHNASORN, C. Comparative repellency of 38 essential oils against
mosquito bites. Phytotherapy Research, v. 19, p. 303–309, 2005.
TRONGTOKIT, Y.; RONGSRIYAM, Y.; KOMALAMISRA, N.;
APIWATHNASORN, C. Comparative repellency of 38 essential oils against
mosquito bites. Phytotherapy Research, v. 19, p. 303–309, 2005.
VERDI, L. G.; BRIGHENTE, I. M. C.; PIZZOLATTI, M. G. O. gênero Baccharis
(Asteraceae): Aspectos químicos, econômicos e biológicos. Quimica Nova,
v.28, p. 85-94, 2005.
WANG, Z.; KIM, J.R.; WANG, M.; SHU, S.; AHN, Y.J. Larvicidal activity of
Cnidium monnieri fruit coumarins and structurally related compounds against
insecticide-susceptible and insecticide-resistant Culex pipiens pallens and
Aedes aegypti. Pest Management Science, v. 68, p. 1041–1047, 2012.
46
WEILL, M.; LUTFALLA, G.; MOGENSEN, K.; CHANDRE, F.; BERTHOMIEU,
A.; BERTICAT, C. Comparative genomics: insecticide resistance in mosquito
vectors. Nature, v. 423, p. 136–137, 2003.
WEILL, M.; MALCOLM, C.; CHANDRE, F.; MOGENSEN, K.; BERTHOMIEU,
A.; MARQUINE, M. The unique mutation in ace-1 giving high insecticide
resistance is easily detectable in mosquito vectors. Insect Biochemistry and
Molecular Biology, v. 13, p. 1–7, 2004.
WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION. Resistance of vectors and
reservoirs of diseases to pesticides. Technical Report Series (TRS), 1976.
WONDJI, C. S.; PRIYANK, W. A.; HEMINGWAY, J.; RANSON, H.;
PARAKRAMA, S. H. Characterization of knockdown resistance in DDT- and
pyrethroid-resistant Culex quinquefasciatus populations from Sri Lanka.
Tropical Medicine & International Health, v. 13, p. 548–555, 2008.
WRIGHT, J. W. The WHO programme for the evaluation and testing of new
insecticides. Bulletin of the World Health Organization, v. 44, p. 11-22, 1971.
XU, Q.; LIU, H.; ZHANG, L.; LIU, N.; Resistance in the mosquito, Culex
quinquefasciatus, and possible mechanisms for resistance. Pest Management
Science, v. 61, p. 1096–1102, 2005.
YANG, P.; MA, Y. Repellent effect of plant essential oils against Aedes
albopictus. Journal of Vector Ecology, v. 30, p. 231–234, 2005.
47
YOGANANTH, N.; ANURADHA, V.; YACOOB SYED ALI, M.; MUTHEZHILAN,
R.; CHANTHURU, A.; PRABU, M. Chemical properties of essential oil from
Rhizophora mucronata mangrove leaf against malarial mosquito Anopheles
stephensi and filarial mosquito Culex quinquefasciatus. Asian Pacific Journal of
Tropical Disease, v. 5, p. 67-72, 2015.