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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS-ICE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUIMICA-PPGQ
Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos
Banny Silva Barbosa
Manaus -Amazonas
Janeiro – 2013
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS-UFAM
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS-ICE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUIMICA-PPGQ
Banny Silva Barbosa
Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Química, Universidade Federal do Amazonas, para obtenção do
título de Mestre em Química, Área de concentração em Química
Orgânica.
Orientador: Dr. Sergio Massayoshi Nunomura
Manaus -Amazonas
Janeiro – 2013
iii
Banny Silva Barbosa
Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes amazônicos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Química, Universidade Federal do Amazonas, para obtenção do
título de Mestre em Química, Área de concentração em Química
Orgânica.
Aprovada em 30 de janeiro de 2013.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Prof. Dr. Sergio Massayoshi Nunomura
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
___________________________________________________
Prof. Dr. Adrian Martin Pohlit
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
___________________________________________________
Prof. Dr. Nilson Luiz de Aguiar Carvalho
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
iv
Dedico à minha família que me proporcionou
educação e confiança, em especial à minha avó materna
Francisca de Melo Ribeiro (in memorian) que me
ensinou a lutar - “O Senhor è o meu pastor e nada me
faltará”.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus pela graça, sabedoria, misericórdia e o seu imenso amor;
A minha mãe, Rosangela Ribeiro, pela confiança, ao meu padrasto, Francisco Pontes,
minha irmãs Bonny Barbosa e Fernanda Pontes, meu irmão André Pontes, minha Tia, Waldecira
Oliveira, meu pai, Waldenei Barbosa e familiares pelo apoio;
Ao Prof. Dr. Sergio Massayoshi Nunomura, pela orientação segura, confiança, paciência,
incentivo, educação e conhecimentos compartilhados para o meu aprendizado, meu
AGRADECIMENTO ESPECIAL;
Á Prof. Dra. Rita Nunomura pelo apoio;
Ao Prof. Msc Roberto Figliuolo que cedeu boa parte dos padrões comerciais de lipídeos e
nos estimulou a iniciar essa linha de pesquisa no grupo;
Aos amigos de turma do mestrado e companheiros do Laboratório de Princípios Ativos da
Amazônia – LAPAAM:, Rita Cynara, Magno Muniz, Andréia Montoia, Tiago Pereira,
Marycleuma Henrique, Suniá, Ellen Cristina, Patrícia Pinto, Kethellin Galeno, Viviane Guedes,
Berna, David, Paulo Senna e Renata, em especial à Andreza Barreto, Paula Suellen e Mauro
Garcia pelo apoio e valorosas discussões;
Às amigas da Nova Igreja Batista – NIB, Aline Bentes, Aline Amaral, Cecília Caetano,
Daniele Araújo, Helenkássya Araújo, Jeanne Costa, Jeane Cristini, Karol Diniz, Auxiliadora
Rodriguez, Milena, Nágila Lima, Patrícia Rocha, Sandrelany Pinho, Talita Oliveira e Vanessa
Brito, pelo apoio e incentivo;
Aos amigos Dione, Ana Pantoja, Alessandra, Amanda e Andréa, pelo apoio;
Ao Programa de Pós-Graduação em Química da UFAM pela oportunidade de realização
do curso de mestrado;
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, onde realizei as atividades
experimentais;
À CAPES pela bolsa concedida;
À FINEP e CNPq por incentivo financeiro ao grupo LAPAAM;
E finalmente um agradecimento a todos os demais que, direta ou indiretamente
contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
Ficha Catalográfica
(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)
B238a
Barbosa, Banny Silva
Análise da composição lipídica de seis espécies de peixes
amazônicos / Banny Silva Barbosa. – Manaus, 2013.
159 f.; il. color.
Dissertação (Mestrado em Química) –– Universidade Federal do
Amazonas.
Orientador: Dr. Sergio Massayoshi Nunomura
1.Ácidos graxos 2. Lipídeos 3.Glicolipídeos 4. Peixes da
Amazônia I. Nunomura, Sergio Massayoshi (Orient.) II. Universidade
Federal do Amazonas III. Título
CDU (2007) 613.281(811.3)(043.3)
vii
RESUMO
Considerando a importância do pescado para o povo amazônico, o seu potencial no mercado, a
sua valorização nutritiva, e à escassez de informações referentes à composição lipídica dos peixes
amazônicos objetivou-se determinar a composição lipídica presente no músculo dorsal de seis
espécies de peixes amazônicos, jaraqui, curimatã, pacu, sardinha, pescada e surubim, através das
análises dos ácidos graxos constituintes de suas diferentes classes de lipídeos e dos esteróides
presentes em seus lipídeos insaponificáveis. O estudo envolveu o desenvolvimento e a aplicação
de metodologias para extração dos lipídeos totais, separação de classes de lipídeos, extração de
lipídeos insaponificáveis, derivatização de ácidos graxos e esteróides, análises por cromatografia
gasosa com detector de ionização de chamas e com espectrometria de massas para avaliação
quanti e qualitativa de esteróides e de ácidos graxos dos lipídeos em classes. E ainda abordou a
determinação da qualidade nutricional dos lipídeos através dos índices de aterogenecidade, de
trombogenecidade e pela quantidade de ácidos graxos hipocolesterolêmicos. Os resultados
indicaram que os peixes em estudo contêm lipídeos interessantes, possuindo maior quantidade de
lipídeos totais os peixes curimatã e pacu, com maior participação dos lipídeos neutros, e
colesterol como esteróide marjoritário para todos os peixes. Os ácidos graxos insaturados,
essenciais para a saúde humana, foi encontrado em maior quantidade nos peixes sardinha e pacu
na classe dos fosfolipídeos e nos peixes peixes curimatã, pescada, jaraqui e surubim na classe dos
lipídeos neutros. Apesar de o peixe pacu ter mostrado maior quantidade de ácidos graxos de
ômega 3 e 6 o peixe pescada se destacou pela qualidade nutricional.
Palavras-chaves: ácidos graxos poliinsaturados, lipídeos neutros, fosfolipídeos, glicolipídeos,
esteróides.
viii
ABSTRACT
Seeing the importance of fish for amazonian people, it potential in the market, it nutritive value,
and information shortages relative to the lipid composition of amazonian fish, it was aimed to
determinate the lipid composition attendant in dorsal muscle of six amazonia fish species, jaraqui,
curimatã, pacu, sardinha, pescada and surubim, through fatty acids analyses constituent of their
diferent classes of lipids and attendant steroids in their unsaponifiable lipids. This study involved
the development and methodology application for extraction of total lipids, separation of lipid
class, extraction of unsaponifiable lipids, derivatization of fatty acids and steroids, analyses of
gas chromotagraphy with detector of flames ionization and with mass spectrometry for
quantitative and qualitative evaluation of steroids and fatty acids of lipids in class. And also
approached the determination of lipids nutritional quality through atherogenicity,
thrombogenicity index and quantity of hypercholesterolemic fatty acids. The results indicated the
fish in study have interesting lipids, having bigger quantity of total lipids the fishes curimatã and
pacu, with bigger participation of neutral lipids, and cholesterol as majority steroid for all fishes.
The unsaturated fatty acids, essentials for human health, it was found in bigger quantity in fishes
sardinha and pacu in phospholipids class and in pescada (whitefish), curimatã, jaraqui and
surubim in neutral lipids class. Besides pacu fish has shown bigger quantity of omega 3 and 6
fatty acids, the fish pescada (whitefish) highlighted for nutritional quality.
Keywords: polyunsaturated fatty acids, neutral lipids, phospholipids, glycolipids, steroids.
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÃO
Página
Figura 1. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Characiformes
exemplificado por um aracu (Leporinus sp.) ..................................................................................... 4
Figura 2. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Peciformes,
exemplificado por um acará (Apistogramma sp.) .............................................................................. 6
Figura 3. Ésteres de glicerol (1- e 2- MAG, 1,2- e 1,3 – DAG e TAG). RCO representa o grupo
acil dos ácidos graxos RCOOH. Todas as outras letras estão relacionadas aos átomos derivados
da molécula de glicerol ...................................................................................................................... 8
Figura 4. Ácido fosfátidico e suas ramificações mais comuns ........................................................ 10
Figura 5. Estrutura básica dos esfingolipídeos ................................................................................ 11
Figura 6. Estrutura dos ácidos graxos poli-insaturados ................................................................... 14
Figura 7. Reação de transesterificação de triacilglicerideo com ácool primário produzindo
glicerol e ésteres alquilicos .............................................................................................................. 14
Figura 8. Prostaglandinas resultantes dos ácidos graxos AA e EPA ............................................... 16
Figura 9. Colesterol e sitosterol ....................................................................................................... 18
Figura 10. Tocoferóis e tocotrienóis. Tocoferóis tem uma cadeia lateral C 16 saturada,
tocotrienóis tem ligações duplas nas três posições indicadas pelas setas. R = H ou CH3; α = 5,7,8-
trimetiltocol; β = 5,8-dimetiltocol; γ = 7,8-dimetiltocol; δ = 8-metiltocol ...................................... 18
Figura 11. Β-caroteno. Outros carotenos variam na natureza nos grupos terminais cíclicos .......... 19
Figura 12. Mecanismo genérico da reação de sililação ................................................................... 20
Figura 13. Peixes jaraqui (Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ..................................... 48
Figura 14. Peixes sardinha (Triportheus elongatus Gunther, 1864) ............................................... 48
Figura 15. Peixe pacu (Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ......................................................... 48
Figura 16. Peixes curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ............................................... 48
Figura 17. Peixe surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766)...................................... 48
Figura 18. Peixe pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ......................................... 48
Figura 19. Perfil cromatográfico por CCD dos lipídeos neutros de sardinha (Triportheus
elongatus Gunther, 1864) extraídos com diferentes solventes ........................................................ 52
x
Figura 20. Perfil cromatográfico de EFS 7,8, 5 e 6.1 representando a fração referente a MTBE,
EFS 7,8, 5 e 6.2 a fração de acetona e EFS 7,8, 5 e 6.3 a última fração ......................................... 53
Figura 21. Perfil cromatográfico, onde 1= material insaponificável, 2= padrão de colesterol e 3=
tocoferol ........................................................................................................................................... 57
Gráfico 1. Curva analítica do fame C 19:0 em 7 concentrações ..................................................... 50
Gráfico 2. Curva analítica do esteróide sitosterol em 4 concentrações .......................................... 56
Gráfico 3. Curva analítica do EMAG C19:0 em 5 concentrações................................................... 78
xi
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Alguns ácidos graxos de ocorrência natural .................................................................... 13
Tabela 2. Informações das espécies em estudo ............................................................................... 22
Tabela 3. Proporção de mistura se solventes para extração de lipídeos totais ................................ 26
Tabela 4. Quantidade em peso de cada espécie de peixe e de padrão interno usado para extração 27
Tabela 5. Condições testadas para desenvolvimento do método de separação de classes de
lipídeos ............................................................................................................................................ 30
Tabela 6. Peso de lipídeos totais de cada peixe utilizado para a separação de classes de lipídeos . 31
Tabela 7. Relação de reagentes, solvente e amostra de lipídeos neutros (L.N.) na reação de
saponificação para os peixes em estudo .......................................................................................... 32
Tabela 8. Otimização do método ..................................................................................................... 35
Tabela 9. As primeiras oito condições testadas para otimização do método de derivatização para
análise de cadeia graxa por CG ....................................................................................................... 38
Tabela 10. As demais condições testadas para otimização do método de derivatização para
análise de cadeia graxa por CG ....................................................................................................... 39
Tabela 11. Quantidade de massa usada por cada amostra para a reação de derivatização para
análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa ........................................................................... 40
Tabela 12. Padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos ........................ 42
Tabela 13. Otimização do método de análise de ácidos graxos ..................................................... 44
Tabela 14. Rendimento percentual dos extratos de lipídeos totais (L.T) ....................................... 49
Tabela 15. Áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do ácido nonandecanóico .. 50
Tabela 16. Concentração e eficiência do método de extração de lipídeos totais............................. 51
Tabela 17. Rendimento das frações obtidas para separação de lipídeos, comparando-se o método
de Johnston e EFS ........................................................................................................................... 51
Tabela 18. Frações da EFS com solventes não-organoclorados ...................................................... 52
Tabela 19. Rendimento em percentual das classes de lipídeos dos métodos diferentes testados .... 53
Tabela 20. Rendimento em percentual dos lipídeos em classes nos peixes em estudo ................... 54
Tabela 21. Rendimentos percentuais dos lipídeos insaponificáveis dos peixes .............................. 55
Tabela 22. Áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol ............................................... 55
xii
Tabela 23. Quantidade em mg/mg de sitosterol nos lipídeos insaponificáveis dos peixes ............. 56
Tabela 24. Observação da resolução dos cromatogramas obtidos durante o desenvolvimento do
método para análise de lipídeos insaponificáveis ............................................................................ 63
Tabela 25. Identificação do tempo de retenção (min) de cada esteróide na mistura usada para
otimização do método de análise de esteroides ............................................................................... 64
Tabela 26. Identificação pelo tempo de retenção (min) de esteróides nos peixes estudados .......... 71
Tabela 27. Quantidade em mg/mg de esteróides nos peixes em estudo .......................................... 72
Tabela 28. Percentual de esteróides nos lipídeos insaponificáveis ................................................. 72
Tabela 29. Rendimento em percentual para a reação de derivatização ........................................... 73
Tabela 30. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados por
fase sólida ........................................................................................................................................ 74
Tabela 31. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados por
fase sólida ........................................................................................................................................ 76
Tabela 32. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados por
fase sólida ........................................................................................................................................ 77
Tabela 33. Áreas resultantes das análises do padrão de EMAG C 19:0 .......................................... 77
Tabela 34. Quantidade em mg/mg de EMAG C 19:0 nos lipídeos neutros dos peixes................... 78
Tabela 35. Tempos de retenção em min da mistura dos padrões comerciais ésteres metílicos de
ácidos graxos disponíveis .............................................................................................................. 91
Tabela 36. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos lipídeos neutros ........................... 97
Tabela 37. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos presentes em lipídeos neutros.............. 98
Tabela 38. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos glicolipídeos ............................. 104
Tabela 39. Relação percentual dos tipos dde ácidos graxos em glicolipídeos .............................. 105
Tabela 40. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos fosfolipídeos ............................. 109
Tabela 41. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos nos fosfolipídeos ............................... 110
Tabela 42. Qualidade nutricional dos lipídeos neutros dos peixes ................................................ 111
Tabela 43. Qualidade nutricional dos glicolipídeos dos peixes..................................................... 111
Tabela 44. Qualidade nutricional dos fosfolipídeos dos peixes .................................................... 112
Tabela 45. Constituintes dos lipídeos totais dos peixes ................................................................ 112
xiii
LISTA DE CROMATOGRAMAS
Página
Cromatograma 1. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição patrícia .............................................................................................................................. 58
Cromatograma 2. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc1 ........................................................................................................................... 59
Cromatograma 3. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc4 ........................................................................................................................... 59
Cromatograma 4. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc 6 .......................................................................................................................... 60
Cromatograma 5. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc11 ......................................................................................................................... 61
Cromatograma 6. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc23 ......................................................................................................................... 61
Cromatograma 7. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados na
condição Col+toc23 no CG-DIC ..................................................................................................... 62
Cromatograma 8. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de esteróides
analisado nas condições do método silil_II ..................................................................................... 63
Cromatograma 9. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de esteróides
analisado nas condições do método col+toc 23 ............................................................................... 64
Cromatograma 10. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ............................................................................ 65
Cromatograma 11. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ..................................................................... 67
Cromatograma 12. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
sardinha (Triportheus elongatus Gunther, 1864) ............................................................................ 68
Cromatograma 13. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
jaraqui (Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) .................................................................. 69
Cromatograma 14. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ................................................................. 70
xiv
Cromatograma 15. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe pacu
(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ............................................................................................. 71
Cromatograma 16. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB1 ............................................... 79
Cromatograma 17. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB2 ............................................... 80
Cromatograma 18. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB3 ............................................... 81
Cromatograma 19. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB4 ............................................... 82
Cromatograma 20. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB5 ............................................... 82
Cromatograma 21. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB8 ............................................... 83
Cromatograma 22. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) no método BB9 ............................................... 84
Cromatograma 23. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB11 ................................................ 85
Cromatograma 24. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB32 ................................................ 86
Cromatograma 25. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX18.............................................. 86
Cromatograma 26. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX39.............................................. 87
Cromatograma 27. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX64.............................................. 87
Cromatograma 28. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 14A .......................................... 88
Cromatograma 29. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 30A .......................................... 88
xv
Cromatograma 30. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 39A .......................................... 89
Cromatograma 31. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43A .......................................... 89
Cromatograma 32. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de ácidos
graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43 A no espectrometro de
massas .............................................................................................................................................. 90
Cromatograma 33. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de curimatã
(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ........................................................................................... 92
Cromatograma 34. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídoes neutros de pescada
(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) .................................................................................. 94
Cromatograma 35. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de sardinha
(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ........................................................................................... 94
Cromatograma 36. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de jaraqui
(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) .............................................................................. 95
Cromatograma 37. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de surubim
(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................... 96
Cromatograma 38. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de pacu
(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ............................................................................................. 96
Cromatograma 39. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de curimatã
(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ........................................................................................... 99
Cromatograma 40. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pescada
(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ................................................................................ 100
Cromatograma 41. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de sardinha
(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ......................................................................................... 100
Cromatograma 42. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de jaraqui
(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ............................................................................ 101
Cromatograma 43. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de surubim
(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................. 102
Cromatograma 44. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pacu
(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ........................................................................................... 103
xvi
Cromatograma 45. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de curimatã
(Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ......................................................................................... 105
Cromatograma 46. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pescada
(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) ................................................................................ 106
Cromatograma 47. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de sardinha
(Triportheus elongatus Gunther, 1864) ......................................................................................... 107
Cromatograma 48. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de jaraqui
(Semaprochilodus insignis Schomburgk, 1841) ............................................................................ 107
Cromatograma 49. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de surubim
(Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766) ............................................................................. 108
Cromatograma 50. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pacu
(Mylossoma duriventre Cuvier, 1817) ........................................................................................... 108
xvii
LISTA DE ESPECTROS
Página
Espectro 1. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de lipídeos
neutros do peixe curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ................................................. 66
Espectro 2. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de lipídeos
neutros do peixe curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz, 1829) ................................................. 93
xviii
LISTA DE EQUAÇÕES
Página
Equação 1. IA ................................................................................................................................. 47
Equação 2. IT .................................................................................................................................. 47
Equação 3. HH ................................................................................................................................. 47
xix
LISTA DE ANEXOS
Página
ANEXO 1. Espectros de massas dos componentes detectados na análise da mistura de padrões
comerciais esteróides disponíveis por CG-EM ............................................................................. 119
ANEXO 2. Espectros de massas dos componentes detectados na análise da mistura de padrões
comerciais de ésteres metílicos de ácidos graxos disponíveis por CG-EM .................................. 121
xx
ABREVIATURAS
AA Ácido araquidônico
AGI Ácidos graxos insaturados
AGL Ácidos graxos livres
AGMI Ácidos graxos monoinsaturados
AGPI Ácidos graxos poliinsaturados
AGS Ácidos graxos saturados
BF3 Trifluoreto de boro
BHT Butil hidróxi tolueno
BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
CCD Cromatografia em camada delgada
CG-DIC Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização de Chama
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
DAG Diglicerídeo
DHA docosahexanoic acid
EFS Extração em fase sólida
EMAG Éster metílico de ácido graxo
EPA Eicosapentanoic acid
EtOH Etanol
FL Fosfolipídeos
GL Glicolipídeos
HH Hipocolesterolêmicos/Hipercolesterolêmicos
HPLC High peformance liquid chromatography
IA Índice de aterogenicidade
IT Índice de trombogenicidade
LAPAAM Laboratório de Princípios Ativos da Amazônia
L.N. Lipídeos Neutros
L.T. Lipídeos Totais
MeOH Metanol
MAG Monoacilglicerídeo
xxi
MTBE Metyl-Tert- Butyl Ether
AP Alta Polaridade
rcf relative centrifugal force
TAG Triacilglicerídeo
TMCS Trimethylchlorosilane
TMS Trimetilsilil
xxii
SUMÁRIO
Página
RESUMO ............................................................................................................................... .....VII
ABSTRACT ............................................................................................................................... VIII
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ......................................................................................................... IX
LISTA DE TABELAS .................................................................................................................. XI
LISTA DE CROMATOGRAMAS ............................................................................................ XIII
LISTA DE ESPECTROS ......................................................................................................... XVII
LISTA DE EQUAÇÕES ......................................................................................................... XVIII
LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................. XIX
ABREVIATURAS ...................................................................................................................... XX
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ ....1
1.1 Contexto e motivação ............................................................................................................... 1
1.2 Considerações gerais sobre os grupos dos peixes amazônicos estudados ................................. 3
1.2.1 Superordem Ostariophysi ...................................................................................................... 3
1.2.2 Superordem Acantopterygii ................................................................................................... 5
1.3 Lipídeos ..................................................................................................................................... 7
1.3.1 Lipídeos Saponificáveis ......................................................................................................... 7
1.3.1.1 Gliceróis .............................................................................................................................. 7
1.3.1.2 Fosfolipídeos ....................................................................................................................... 9
1.3.1.3 Esfingolipídeos ................................................................................................................. 11
1.3.1.4 Ceras .................................................................................................................................. 12
1.3.1.5 Ácidos graxos .................................................................................................................... 12
1.3.3 Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis .......................................................... 14
1.3.4 Ocorrência de ácidos graxos poliinsaturados em peixes e sua importância na saúde humana
....................................................................................................................................................... 15
1.3.5 Lipídeos Insaponificáveis .................................................................................................... 17
1.3.5.1 Esteróides .......................................................................................................................... 17
1.3.5.2 Tocóis ................................................................................................................................ 18
1.3.5.3 Carotenóides ...................................................................................................................... 19
1.3.6 Reações comuns envolvendo lipídeos insaponificáveis ....................................................... 19
xxiii
1.3.7 Ocorrência de lipídeos insaponificáveis e importância na saúde humana ............................ 20
1.4 Informações referentes às espécies de peixes selecionadas para estudo ................................. 21
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 23
2.1 Geral ....................................................................................................................................... 23
2.2 Específicos .............................................................................................................................. 23
3 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 24
3.1 Material .................................................................................................................................... 24
3.1.1 Seleção das espécies e coleta do material biológico............................................................. 24
3.1.2 Reagentes, solventes e instrumentos cromatográficos utilizados ......................................... 24
3.2 Métodos ................................................................................................................................... 25
3.2.1 Extração de lipídeos totais ................................................................................................... 25
3.2.1.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais ...................................... 25
3.2.1.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo .............................................................. 26
3.2.1.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais............................ 27
3.2.2 Separação em classes e de seus componentes ...................................................................... 28
3.2.2.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos ......................... 28
3.2.2.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo .................................................... 31
3.2.3 Extração de lipídeos insaponificáveis .................................................................................. 31
3.2.3.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis ................................................... 31
3.2.3.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo ............................................ 32
3.2.3.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis. ......... 33
3.2.4 Preparação de amostras para análise de esteroides ............................................................... 33
3.2.4.1 Verificação do método de reação de sililação ................................................................... 33
3.2.4.2 Aplicação do método de reação de sililação nos peixes em estudo................................... 33
3.2.5 Análise de esteróides por cromatografia gasosa ................................................................... 34
3.2.5.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-DIC e
CG-EM) ........................................................................................................................................ 34
3.2.5.2 Análise qualitativa de esteroides dos peixes em estudo por CG-EM ................................ 36
3.2.5.3 Análise quantitativa dos esteroides dos peixes em estudo por CG-DIC ........................... 36
3.2.6 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa ............................................................ 36
3.2.6.1 Otimização da metodologia de derivatização de ác. graxos em seus ésteres metílicos..... 36
xxiv
3.2.6.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo ................................. 40
3.2.6.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos neutros .... 41
3.2.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa ...................................... 41
3.2.7.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa (CG-DIC
e CG-EM) ..................................................................................................................................... 41
3.2.7.2 Análise qualitativa da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo por CG-EM ... 46
3.2.7.3 Análise quantitativa da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo por CG-DIC 46
3.8 Determinação da qualidade nutricional dos lipídeos dos peixes ............................................ 46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 48
4.1. Seleção das espécies e coleta do material biológico ............................................................... 48
4.2 Extração de lipídeos totais ...................................................................................................... 49
4.2.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais ......................................... 49
4.2.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo ................................................................. 49
4.2.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais............................... 50
4.3 Separação em classes e de seus componentes ......................................................................... 51
4.3.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos ............................ 51
4.3.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo ....................................................... 53
4.4 Extração de lipídeos insaponificáveis...................................................................................... 54
4.4.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis ...................................................... 54
4.4.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo ............................................... 55
4.4.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis ........... ..55
4.5 Preparação de amostras para análise de esteroides .................................................................. 57
4.5.1 Verificação do método de reação de sililação ...................................................................... 57
4.6 Análise de esteróides por cromatografia gasosa ...................................................................... 57
4.6.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-DIC e
CG-EM) ........................................................................................................................................ 57
4.6.2 Análise qualitativa de esteroides dos peixes em estudo por CG-EM ................................... 65
4.6.3 Análise quantitativa dos esteroides dos peixes em estudo por CG-DIC .............................. 72
4.7 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa ............................................................... 73
4.7.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres metílicos .. 73
4.7.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo .................................... 76
xxv
4.7.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos neutros ....... 77
4.8 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa ......................................... 79
4.8.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa (CG-DIC e
CG-EM) ........................................................................................................................................ 79
4.8.2 Análise da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo ........................................... 92
4.8.2.1 Lipídeos neutros ................................................................................................................ 92
4.8.2.2 Glicolipídeos ..................................................................................................................... 99
4.8.2.3 Fosfolipídeos ................................................................................................................... 105
4.9 Qualidade nutricional dos lipídeos em classe ....................................................................... 110
4.9.1 Lipídeos neutros ................................................................................................................. 110
4.9.2 Glicolipídeos ...................................................................................................................... 111
4.9.3 Fosfolipídeos ...................................................................................................................... 111
4.9.4 Lipideos no total ................................................................................................................. 112
5 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 113
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 114
ANEXOS ..................................................................................................................................... 119
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Contexto e motivação
Um grande potencial da produção de peixes de água doce se situa na Bacia Amazônica
que representa 20% de toda a água doce do mundo contendo mais de 2.000 espécies das mais
variadas ordens de peixes, representando 75% de todas as espécies de água doce do Brasil e 30%
da fauna de peixes do mundo (Roubach et al., 2003).
A capital do Estado do Amazonas, Manaus, com um desembarque que varia entre 22.000
e 35.000 t/ano é o maior centro produtor e consumidor da região (Santos et al., 2009). Sendo o
Estado do Amazonas possuidor de um dos maiores índices de consumo de peixes do mundo,
entre 38,5 e 55,0 Kg/pessoa/ano na capital Manaus e 510 a 600 g/pessoa/dia no interior do
Amazonas, enquanto que no mundo esse índice chega somente à de 16 Kg/pessoa/ano (Batista et
al., 1998, Barthem et al., 2003).
O consumo de pescado no Amazonas se encontra distribuído entre várias espécies,
somente nos mercados de Manaus, são encontradas pelo menos 100 diferentes espécies
biológicas, sendo os peixes mais consumidos: tambaqui, jaraqui, curimatã, matrinxã, tucunaré,
pacus, sardinhas, pescada, pirapitinga e caparari (confundido com surubim) tais, peixes ocorrem
em diferentes rios de águas clara, branca ou preta (Santos et al., 2009). Considerando que a
composição química depende, dentre outros fatores, da espécie, do seu habitat, do período do
ano, do tipo e quantidade de alimento disponível e do estado de maturidade sexual, o teor de
proteínas, lipídeos e minerais em cada uma dessas espécies deve ser significativamente variável
(Arbeláez-Rojas et al., 2002).
O interesse pela composição química de peixe tem crescido, principalmente em relação à
composição lipídica, pelo fato do consumo de ácidos graxos estar diretamente relacionado com a
saúde humana (Blanchet et al., 2005; Almeida et al., 2007, Almeida et al., 2008; Inhamuns et al.,
2009, Inhamuns et al., 2001). Na natureza, os ácidos graxos podem está presentes na sua forma
livre ou principalmente como ésteres em óleos e gorduras (mono-, di- e triacilglicerídeos), como
ésteres com alcóois de cadeia longa em ceras ou então como ésteres com uma ligação fosfatídica
em estruturas de membranas (fosfolipídeos). Os ácidos graxos de ocorrência natural têm
diferentes estruturas variando desde o tamanho da cadeia carbônica, como na presença de
ligações duplas (insaturações), ramificações, outras funções orgânicas ou até mesmo a presença
2
de estruturas cíclicas. Os ácidos graxos considerados essenciais, isto é, imprescindíveis para o
homem e que não podem ser sintetizados pelo mesmo, subdividem-se em duas subclasses: os
ômega 3 (ω-3) e ômega 6 (ω-6). Os ácidos da série ω-3, que são encontrados principalmente em
óleos de peixes (Alexander, 1998), são responsáveis por evitar distúrbios neurológicos e visuais,
porque são importantes no desenvolvimento do cérebro (Kasim-Karakas, 2001; Hanahan, 1997).
E ainda, relata-se que, o consumo do ácido graxo da série ω-3, ácido 5,8,11,14,17-
eicosapentaenóico (EPA), tem sido associado à redução dos riscos de aterosclerose, câncer,
trombose e pressão alta (Simão et al., 2007).
O aumento do consumo de ácidos graxos poliinsaturados na alimentação, bem como a
redução de ácidos graxos saturados é responsável pela redução dos elevados índices dos lipídeos
de baixa densidade LDL (low density lipids) no sangue, que podem conduzir a doenças
coronarianas (Cozza e Costa, 2000). O estudo da absorção sobre diferentes formas químicas de
ácidos graxos poliinsaturados em humanos demonstrou que a estrutura química, na qual o ácido
se encontra ligado, possui influência para a saúde do ser humano (Netleton, 1995).
Poucos estudos sobre a composição de lipídeos em peixes existem no Brasil, sobretudo
em peixes amazônicos, porém aqueles que têm sido publicados mostraram que peixes de água
doce apresentam interessantes valores nutricionais (Almeida et al., 2006; Almeida et al., 2006;
Bentes et al., 2009; Moreira et al., 2003; Inhamuns et al., 2009; Inhamuns et al., 2001).
Assim, considerando a importância do pescado no mercado regional, o seu potencial
nutritivo, e a escassez de informações referentes à composição lipídica dos peixes amazônicos,
este trabalho tem como objetivo determinar o perfil de ácidos graxos, os esteróides presentes,
bem como a qualidade nutricional dos lipídeos de seis espécies de peixes amazônicos: jaraqui
(Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu (Mylossoma duriventre),
sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada (Plagioscion squamosissimus Heckel,
1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766).
3
1.2 Considerações gerais sobre os grupos dos peixes amazônicos estudados
A ictiofauna amazônica está representada principalmente pela superordem Ostariophysi,
que agrupa cerca de 85% das espécies amazônicas (mais de 1700 espécies), das quais 43% estão
incluídos na ordem Characiformes, 39% na ordem Siluriformes (bagres) e 3% na ordem
Gimnotiformes (peixe elétrico). E ainda representando a ictiofauna amazônica há a superordem
dos Acanthopterygii, que apesar de contribuir com apenas cerca de 500 espécies, possui papel
importante no comércio de peixes do Amazonas (Val et al., 1995 e Barthem et al., 2003).
1.2.1 Superordem Ostariophysi
É o grupo mais dominante de peixes de água doce no mundo. A formação do weberian
apparatus, uma modificação de quatro ou mais vértebra anterior que conecta bexiga nadatória ao
ouvido interno para transmissão de som, aparenta ser a única característica que é compartilhada
por todos os membros deste grupo. Todas as subordens de Ostariophysi são representadas no
Amazonas, exceto para a Cypriniformes (peixes tipo carpa). Os Ostariophysans amazônicos
incluem no mínimo 12 famílias da ordem Characiformes, 12 de Siluriformes e 6 de
Gymnotiformes (Val et al., 1995).
A ordem dos Characiformes, conhecidos também como peixes de escama, possui como
maioria, as espécies migradoras de curta distância, movimentando-se entre rios e lagos. Possui
boca em posição variável, geralmente terminal, ou seja, no mesmo nível do eixo longitudinal do
corpo, e possui ainda ausência de espinhos na região ventral e nadadeira adiposa (nadadeira
ímpar localizada entre a caudal e a dorsal) (Santos et al., 2009). São considerados como os que
possuem a morfologia do corpo mais bruta generalizada dos Ostariophysans amazônicos.
Incluem cerca de 1200 espécies distribuídas entre 12 famílias (Val et al., 1995).
4
Figura 1. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Characiformes
exemplificado por um aracu (Leporinus sp.) (Lima, 2005).
Uma das famílias representante pela ordem Characiformes é a Characidae, que em geral
inclui peixes de diferentes modos de reprodução e hábitos alimentares. A disposição dos dentes é
muito variável, caracterizando sua capacidade de explorar uma grande variedade de habitats. Por
causa da grande variedade de formas é difícil caracterizar morfologicamente o grupo como um
todo. Grande parte das espécies possui nadadeira anal longa, maxilar superior fixo, com dentes
firmemente implantados e nadadeira dorsal com cerca de 10-13 raios (Soares et al., 2008).
Outra família representante dos characiformes é a família Prochilodontidae, que se
caracteriza pelo formato fusiforme do corpo (alongado e ligeiramente abaulado no meio),
presença de um espinho na base da nadadeira dorsal, lábios carnosos, boca protrátil (que tem a
capacidade de se estender para frente), em forma de ventosas. Os dentes são numerosos,
diminutos e enfileirados, fracamente implantados sobre os lábios. O intestino é muito longo e o
estômago tem paredes grossas e musculares. Seus representantes apresentam hábito alimentar
detritívoro (que se alimenta de detritos) e iliófago (se alimenta de lodo ou detritos), consumindo
matéria orgânica particulada, algas e perifíton (organismos aquáticos que vivem aderidos ao
substrasto do ambiente). São migradores, formam cardumes e realizam movimentos dentro do
ecossistema aquático com fins de se alimentar e reproduzir. A família é formada por cerca de 40
espécies de 3 gêneros, Prochilodus, Ichthyoelephas e Semaprochilodus, que estão distribuídos
5
amplamente na América do Sul. Na Amazônia, seus representantes são conhecidos como jaraqui
e curimatã (Soares et al., 2008).
Outra ordem, que juntamente com a ordem do Characiformes são as mais importantes na
Amazônia é a dos Siluriformes. Esse último caracteriza-se por conter corpo nu, sem escamas ou
coberto parcialmente com placas ósseas (Barthem et al., 2003 e Santos et al., 2009). A família
Pimelodidae da ordem do Siluriformes compreende formas diversificadas, com exemplares muito
pequenos e grandes. Possui corpo nu, aberturas branquiais amplas, prolongando-se para a frente,
até próximo ao queixo e para trás, além da inserção do primeiro raio da nadadeira peitoral. As
espécies pertencentes a esta família apresentam, em geral, a dorsal e peitoral providas de
espinhos afiados e a nadadeira adiposa sempre presente. Possuem um par de barbilhões maxilares
(na extremidade do maxilar superior) e dois pares mentonianos (no queixo ou mento), dentes
diminutos e frágeis com borda incisiva, mas não cortante, localizados sobre uma placa óssea nas
maxilas e palato. A maioria das espécies apresenta canais da linha lateral cutâneos ramificados ou
anastomosados (em forma de redes) na cabeça e parte anterior do corpo, possuem hábito noturno
e tem órgãos sensitivos para explorar o ambiente na ausência de luz (barbilhões e barbelas
quimioreceptoras). A família inclui 31 gêneros e 90 espécies, denominadas conjuntamente de
bagres ou peixes-lisos, mas com vários nomes populares específicos. Alguns representantes desse
grupo estão entre os maiores peixes de água doce da América do Sul e a maioria apresenta
destacada importância na pesca comercial ou de subsistência. No mercado de Manaus foram
encontradas 22 espécies pertencentes a 16 gêneros (Soares et al., 2008 e Santos et al., 2009).
1.2.2 Superordem Acanthopterygii
Muitas das ordens que a incluem (cyprinodontiformes, symbranchiformes,
pleuronectiformes, tetraodontiformes e perciformes) são extremamente importantes no Amazonas
do ponto de vista comercial (Val et al., 1995 e Barthem et al., 2003).
A ordem dos Perciformes caracteriza-se por serem peixes sedentários, típicos de lagos e
caracterizados por corpo coberto com escamas, nadadeiras dorsal, anal e pélvica com alguns raios
duros, em forma de espinho; nadadeira pélvica situada logo abaixo ou a frente da nadadeira
peitoral (Santos et al., 2009). Essa ordem inclui as famílias Scianidae, Nandidae, e Cichlidae
(Val et al., 1995).
6
Figura 2. Principais características morfológicas externas de um peixe da ordem Peciformes,
exemplificado por um acará (Apistogramma sp.) (Lima, 2005)
Os peixes da família Scianidae são caracterizados por serem peixes acantopterígios, ou
seja, possuem as nadadeiras com espinhos precedidos de raios e apresentam dois espinhos na
nadadeira anal; e ainda por possuírem linha lateral contínua, da cabeça até o final da nadadeira
caudal, sendo que as escamas da linha lateral maiores que aquelas do restante do corpo.
Normalmente a nadadeira dorsal é longa e nadadeira caudal com uma projeção mediana em forma
de lança. As espécies destacam-se pela presença de otólitos (estruturas calcárias) muito grandes
em relação aos outros grupos de peixes. Esse grupo é formado por cerca de 70 gêneros,
principalmente marinhos e estuarinos, amplamente distribuído pelos oceanos, sendo cinco deles
exclusivamente de água doce; quatro ocorrem na Amazônia (Petilipinnis, Plagioscion,
Pachypops e Pachyurus), com cerca de quatorze espécies (Soares et al., 2008 e Santos et al.,
2009).
7
1.3 Lipídeos
Lipídeos caracterizam-se por ser um grupo complexo de substâncias baseadas em ácidos
graxos ou relacionadas a eles, como óleos e gorduras (ésteres formados a partir de ácidos graxos),
fosfolipídeos (diésteres do ácido 3-glicerofosfórico), glicolipídeos (diacilgliceróis ligados a
unidades de carboidratos), ceras (cujos principais componentes são ésteres de ácidos graxos e
alcoóis de cadeia longa), esteróides, terpenos, sabões, detergentes e sais biliares. Aqueles
contendo cadeia graxa são chamados lipídeos saponificáveis e os que não os contém são lipídeos
insaponificáveis (Curi et al., 2002 e Hanahan, 1997, Gunstone, 2008).
1.3.1 Lipídeos saponificáveis
1.3.1.1 Gliceróis
Os gliceróis são compostos por uma molécula de glicerol esterificada com ácidos graxos.
Dependendo do número de grupos hidroxila do glicerol esterificados, os acilgliceróis são
denominados monoacilgliceróis (MAG), diacilgliceróis (DAG) e triacilgliceróis (TAG) (Nelson e
Cox, 2005).
Há dois tipos de monoacilglicerol designado com números ou letras gregas como, por
exemplo, 1-(ou α-) monoestearina e 2-(ou β-) monoestearina. Também há dois isômeros para
diacilgliceróis designados, por exemplo, 1,2-diestearina e 1,3-diestearina, algumas vezes
descritos como isômeros simétrico (1,3-) e assimétrico (1,2-); porém muito frequentemente
ocorrerão grupos acila diferentes e isso aumentará o numero de formas de isômeros, assim como
na molécula de triacilglicerídeo também (Gunstone, 2008). Quando os ácidos graxos presentes
nos gliceróis naturais são iguais, estes são ditos gliceróis simples, quando diferentes são
chamados gliceróis mistos (Gurr, 2002).
8
Figura 3. Ésteres de glicerol (1- e 2- MAG, 1,2- e 1,3 – DAG e TAG). RCO representa o grupo
acil dos ácidos graxos RCOOH. Todas as outras letras estão relacionadas aos átomos derivados
da molécula de glicerol.
Nos triacilgliceróis, como os grupos polares hidroxilas e carboxila dos ácidos graxos
fazem ligações de ésteres, são apolares, moléculas hidrofóbicas, e essencialmente insolúveis em
água. O ponto de fusão dos triacilglicerídeos é determinado, fundamentalmente, pela natureza dos
ácidos graxos na molécula e são extremamente importantes no armazenamento de energia nos
organismos, devido à vantagem de que o átomo de carbono dos ácidos graxos é mais reduzido
que aquele contido no açúcar, sendo o rendimento da oxidação de triacilglicerídeos duas vezes
maior em energia que a oxidação de carbohidrato, e ainda porque triacilgliceróis são hidrofóbicos
e assim desidratados, resultando que o organismo que carrega gordura como fonte de energia não
necessita carregar o peso extra da água de hidratação que é associado com polisacarídeos
estocados (Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).
Triacilglicerídeos são produzidos a partir de duas vias biossintéticas principais
conhecidas, a via sn-glicerol 3-fosfato que predomina no fígado e no tecido adiposo, e uma via de
monoacilglicerol no intestino. Em sementes de plantas de maturação e de alguns tecidos de
origem animal, uma terceira via tem sido reconhecido na qual um diacilglicerol transferase está
envolvido. A principal via de biossíntese de triacilglicerol é a sn-glicerol-3-fosfato, por meio do
qual mais de 90% de triacilgliceróis do fígado são produzidos, no qual esta molécula sofre uma
esterificação com ésteres de ácido graxo coenzima A, sendo o fosfato removido por reação de
MAG
DAG
TAG
1-MAG 2-MAG
1,2-DAG 1,3-DAG
9
hidrólise antes da última esterificação. A molécula de sn-glicerol-3-fosfato, também particpa
como precursor dos fosfolipídeos, aqui classificada como outra classe de lipídeos (Christie, 2011;
Dewick, 2002; Nelson e Cox, 2005).
1.3.1.2 Fosfolipídeos
Os fosfolipídeos são classificados, como os lipídeos que contém grupo fosfato presentes
em suas estruturas moleculares, como os glicerofosfolipídeos e podendo compreender parte dos
esfingolipídeos, mas especificamente as esfingomielinas. São conhecidos por suas propriedades
biológicas e químicas, sendo componentes primários das membranas e essencial para a função
celular, além de atuar como agentes emulsificante (composto que promove a dispersão coloidal
de um líquido em outro) e surfactante (composto que reduz a tensão superficial de uma solução,
como detergentes), devido a sua característica de substância anfifílica (Curi et al., 2002;
Hanahan, 1997; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).
Apesar das diferenças estruturais, todos os glicerofosfolipídeos são constituídos de uma
porção apolar e alifática de dois ácidos graxos conectados por uma ligação de éster no primeiro e
segundo carbono da molécula de glicerol (ou com menos uma ligação éter no primeiro carbono),
conhecida como “cauda”, e de uma porção polar, que contêm normalmente uma unidade de
fosfato ou outros grupos carregados (polares) no terceiro carbono, denominada “cabeça” (Curi et
al., 2002; Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011). Eles são denominados como
derivados do composto ácido fosfatídico, de acordo com o álcool polar do grupo “cabeça”, e os
ácidos graxos em suas estruturas compreende uma grande variedade, contendo, em geral, um
ácido graxo saturado C16 ou C18 no C-1 e um ácido graxo insaturado C18 a C20 no C-2 (Nelson
e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).
10
O-
O
O
O
R1
O
R2
OP
O
O-
O
O-
NH3
+
O
OH
OH
O
NH3
+
O
N+
O
CH3CH3
CH3
OH OH
O
OHOH
OH
Figura 4. Ácido fosfátidico e suas ramificações mais comuns: fosfatidilserina (FS),
fosfatidilglicerol (FG), fosfatidilinositol (FI), fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE).
Sob condições fisiológicas (pH 7,4), as formas mono- e diprotonada do ácido fosfórico
estão em equilíbrio rápido. Assim, o ácido fosfatídico resultante é novamente capaz, através de
sofrer reação de condensação éster com diferentes álcoois, e formar uma grande variedade de
fosfolipídios, isto é, a fosfatidilcolina (FC), fosfatidiletanolamina (FE), bem como a
fosfatidilserina (FS), fosfatidilglicerol, (FG), fosfatidilinositol (PI) e compostos derivados
altamente fosforilados, como fosfolipídios de carga negativa (figura 4).
Os fosfolipídeos constituem uma grande e generalizada classe de biomoléculas, onde,
com excessão das esfingomielinas, todos são fosfoacilgliceróis. Quando em concentrações
apropriadas, os fosfolopídeos suspensos em água se organizam em estruturas ordenadas na forma
de micelas ou bicamadas lipídicas (Motta, 2005, Curi et al., 2002 e Gunstone, 2008). As
esfingomielinas, também contem uma “cabeça” polar e duas “caudas” apolares, mas diferente do
glicerofosfolípideo não tem contem glicerol, ela é composta por uma molécula de esfingosina,
FS
Ácido fosfatídico
FC
FG
FI
FE
11
que é um álcool amina de cadeia longa, uma molécula de ácido graxo de cadeia longa e um grupo
“cabeça” polar que realiza uma ligação fosfodiéster (Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005).
1.3.1.3 Esfingolipídeos
Os esfingolipídeos são o segundo maior componente lipídico das membranas animais e
vegetais, não contem glicerol, mas apresentam como esqueleto básico da molécula, alcoóis amino
de C18, que são a esfingosina e dihidroesfingosina, e seus homólogos C16, C17, C19, e C20. As
moléculas mais simples desse grupo são as ceramidas, derivadas de ácidos graxos ligados ao
grupo amino (−NH2) no C2 da esfingosina, ocorrem apenas em pequenas quantidades em tecidos
de plantas e animais, mas formam os compostos progenitores dos esfingolípidos mais
abundantes:
Esfingomielinas – são ceramidas que contém tanto uma fosfocolina ou uma
fosfoetanolamina em suas estruturas, podendo ser classificada, mais especificamente, como
esfingofosfolipídeos.
Cerebrosídeos – são ceramidas com o grupo “cabeça” consistindo de um resíduo de um
único açúcar, sendo os galactocerebrosídeos possuídores do açúcar β–D-galactose e os
glucocerebrosídeos contendo como açúcar no grupo “cabeça” a β-D-glucose.
Gangliosídeos – são ceramidas oligosacarídeos que incluem entre seus grupos de açúcares
no mínimo um resíduo de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico e seus derivados) (Motta,
2005; Nelson e Cox, 2005; Voet e Voet, 2011).
NH
H3C(H2C)12
H
OH
O
O
(CH2)n
CH3
açúcar açúcar açúcar
Figura 5. Estrutura básica dos esfingolipídeos.
esfingosina
cerebrosídeo ceramida
12
1.3.1.4 Ceras
A maioria das ceras são ésteres de ácidos graxos de cadeia longa (C14 a C36) saturada e
insaturada com alcoóis de cadeia longa (C16 a C30). Seus pontos de fusão geralmente são mais
altos que aqueles dos triacilglicerídeos, e possuem funções variadas, para fitoplânctons, por
exemplo, elas são a principal forma de fonte de energia metabólica, mas também funcionam
como revestimento de proteção em folhas, caules, frutos e na pele de animais, devido a sua
propriedade de impermeável à água (Nelson e Cox, 2005).
1.3.1.5 Ácidos graxos
Os ácidos graxos, assim como estruturas diretamente a eles relacionadas (como álcoois,
aldeídos ou aminas) são, em geral, componentes fundamentais dos lipídeos, que desempenham
um papel vital na sobrevivência dos organismos vivos. Deve ser enfatizado que ácidos graxos na
sua forma livre existem em níveis muitos baixos, e ocorrem principalmente na forma de ésteres
ou amidas (Curi et al., 2002; Hanahan, 1997).
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos, geralmente monocarboxílico, de longas cadeias
de hidrocarbonetos acíclicas, apolares, na maioria das vezes sem ramificações e número par de
átomos de carbono. Podem ser saturados, monoinsaturados (contém uma ligação dupla) ou
poliinsaturados (contêm duas ou mais ligações duplas). Os mais abundantes contêm 16 e 18
átomos de carbono e em geral, as ligações duplas nos ácidos graxos poliinsaturados estão
separadas por um grupo metileno, −CH=CH−CH2−CH=CH−, ou seja, suas duplas ligações estão
dispostas em um arranjo não-conjugado, o que os torna suscetíveis a serem oxidados a
hidroperóxidos (Belitz et al., 2004).
Os ácidos graxos insaturados naturais ocorrem normalmente com configuração cis (Z). Na
tabela 1, são apresentados exemplos dos ácidos graxos mais comuns com suas respectivas cadeias
e nomenclatura oficial da IUPAC (União Internacional Química Pura e Aplicada).
13
Tabela 1. Alguns ácidos graxos de ocorrência natural (Gunstone et al., 2004; Gurr, 1999; Gurr,
2002).
Nome usual Nome oficial (ácido) N° de átomos de
carbono
Ponto de fusão Família
Butírico butanóico 4 -7,9 -
Capróico hexanóico 6 -8,0 -
Caprílico octanóico 8 12,7 -
Cáprico decanóico 10 29,6 -
Láurico dodecanóico 12 42,2 -
Mirístico tetradecanóico 14 52,1 -
Palmítico hexadecanóico 16 60,7 -
Palmitoléico cis-9 -hexadecenóico 16 1,0 -
Esteárico octadecanóico 18 69,6 -
Oleico cis- 9- octadecenóico 18 16,0 -
Petroselenico cis- 6- octadecenóico 18 33,0 -
Linoleico cis- 9,12- octadecadienóico 18 -5,0 -6
α-linolênico cis- 9,12,15-octadecatrienóico 18 -11,0 -3
γ-linolênico cis-6,9,12- octadecatrienóico 18 - -6
Araquidico eicosanóico 20 75,4 -
Gondóico cis-11-eicosenóico 20 24,0 -
- cis –11,14 -eicosenóico 20 - -6
- cis- 8,11,14 -eicosatrienóico 20 - -3
Araquidônico cis-5,8,11,14-eicosatetraenóico 20 -49,5 -3
EPA cis –5,8,11,14,17-eicosapentaenóico 20 - -
Behênico docosanóico 22 80,0 -
Erúcico cis-13-docosenóico 22 24,0 -
- cis 13,16 docosadienoico 22 - -6
- cis-13,16,19- docosatrienóico 22 - -3
- cis- 7,10,13,16 – docosatetraenóico 22 - -6
DHA cis-4,7,10,13,16,19- docosahexaenóico 22 - -3
Nervônico cis -15-tetracoseinóico 24 - -
Os ácidos graxos poliinsaturados possuem outra nomenclatura, além da IUPAC, bastante
utilizada para descrevê-los, que é o sistema ômega, que se refere à posição das ligações duplas,
em relação ao carbono mais afastado do grupo carboxila. Por exemplo, o ácido linoléico que
possui nome da IUPAC como ácido (Z, Z)-9,12-octadecadienóico pertence à série ω-6, enquanto
que o ácido δ-linolênico nomeado de ácido (Z, Z, Z)-9,12-15-octadecatrienóico, pertence à série
ω-3 (Curi et al., 2002).
14
OH
O
O
OH
Figura 6. Estrutura dos ácidos graxos poliinsaturados.
Os pontos de fusão dos ácidos graxos podem ser definidos por suas estruturas, como
podemos ver na tabela 1, podem ser relacionados com o aumento do comprimento da cadeia
hidrocarbonada aumentando o ponto de fusão, e com cadeias ramificadas e ligações duplas cis
abaixando o ponto de fusão das cadeias saturadas equivalentes. E ainda é interessante o fato de o
ponto de fusão depender da cadeia ser par ou ímpar, e determinar o estado físico da matéria, onde
ácidos graxos saturados com dez ou mais átomos de carbono são sólidos em temperatura
ambiente e todos os insaturados são líquidos nesta temperatura (Gurr et al., 2002; Motta, 2005).
1.3.3 Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis
Reações comuns envolvendo lipídeos saponificáveis são a transesterificação e a
esterificação, onde a transesterificação consiste de um éster resultando em outro éster e a
esterificação consiste em ácido graxo produzindo um éster. Ambas as reações se processam da
reação com um álcool de cadeia curta, na presença de um catalisador, podendo ser uma base ou
um ácido para a primeira e somente via ácida para a segunda (Barreto, 2010).
O
O
O
O
R1
R2
O
O
R3
R OH
R1
O
OR
R2
O
OR
R3
O
OR
OH
OH
OH
+ +
Figura 7. Reação de transesterificação de triacilglicerideo com ácool produzindo glicerol e
ésteres alquilícos.
ácido linoléico
(Z, Z)-9,12-octadecadienóico
ω-6
ácido α-linolênico
ácido (Z, Z, Z)-9,12-15-octadecatrienóico
ω-3
Triacilglicerídeo
álcool
Ésteres de ácidos graxos
Glicerol
15
1.3.4 Ocorrência de ácidos graxos poliinsaturados em peixes e sua importância na saúde
humana
As principais funções dos ácidos graxos poliinsaturados, em peixes e nos mamíferos
terrestres superiores, são como reserva de energia na forma de triacilglicerídeos, como
precursores de eicosaenóides (produtos naturais com 20 átomos de carbonos que são divididos
como prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos) e como constituintes essenciais de
fosfolipídios de biomembranas. Os ácidos graxos de peixes diferem dos poliinsaturados
encontrados em plantas, por serem de cadeia mais longa, com a presença de um maior número de
insaturações e pertencerem à série ômega 3 (ω-3), ao invés da ômega 6 (ω-6). Tanto a série ω-3,
quanto a ω-6, possui ácidos graxos essenciais ao homem, ou seja, que o ser humano não consegue
sintetizar, como o ácido linoléico e o ácido linolênico, que são fundamentais para o metabolismo
e obtidos a partir da dieta. Os ácidos graxos essenciais são precursores para a biossíntese de
vários metabólitos importantes (Motta, 2005). Os ácidos da série ω-6 são responsáveis pela
proteção dérmica e pela produção de importantes mediadores farmacológicos lipídicos como os
derivados do ácido araquidônico. Os ácidos da família ω-3 são responsáveis por evitar distúrbios
neurológicos e visuais, porque são importantes no desenvolvimento do cérebro (Kasim-Karakas,
2001; Hanahan, 1997).
Óleos de peixes são ricos em ômega 3, porque peixes naturalmente consomem dietas ricas
em tais ácidos. Os ácidos graxos poliinsaturados são sintetizados por fitoplânctons, que são
consumidos por peixes, moluscos e crustáceos (cadeia alimentar). Normalmente os peixes
possuem fosfolipídios com alto teor dos ácidos docosahexaenóico e eicosapentaenóico, mais
conhecidos por suas siglas em inglês, DHA e EPA, respectivamente. Esses ácidos graxos
constituem mais de 50% do total de ácidos graxos em alguns fosfolipídeos de peixes, geralmente
numa razão de cerca de 2:1. Já o ácido araquidônico, também conhecido por sua sigla em inglês –
AA, normalmente é responsável por somente 1 a 2% do total de ácidos graxos existentes em
fosfoglicerídeos de peixes, com a notável exceção das fosfotadilinositols, onde o ácido
araquidônico pode ser o principal ácido graxo poliinsaturado (Netleton, 1995).
A quantidade de ácido graxo ômega 3 que ocorre em diferentes espécies de peixes varia
muito, com as espécies ricas em gordura tendo as maiores quantidades de ácidos graxos ômega.
O tipo e a quantidade de ácidos graxos nos peixes variam principalmente com o que o peixe
come, mas outros fatores também influenciam na composição de ácidos graxos: tamanho ou
16
idade, estado reprodutivo, localização geográfica e estação do ano influenciam todo o conteúdo
de gordura e composição (Netleton, 1995).
Para o homem, o consumo de uma dieta rica de ácidos graxos da série ω-3 reduz riscos
associados a doenças cardiovasculares, arterosclerose, hipertensão, inflamações em geral, asma,
artrite, psoríase e de vários tipos de câncer (Andrade et al., 2009; Moura et al., 2006). Os
mecanismos pelos quais os ácidos graxos ω-3 e 6 previnem doenças está relacionado ao fato de
que a partir dos ácidos graxos poliinsaturados se derivam substâncias denominadas eicosanóides,
que são hormônios paracrinos, isto é, atuam somente em células próximas ao local onde foram
sintetizados por um curto período de tempo, devido a sua rápida degradação. Estes compostos são
produzidos em quantidades muito pequenas, mas que apresentam funções metabólicas potentes,
como regulação da pressão sanguínea, diurese, agregação plaquetária, sistema imune, secreções
gástricas, reprodução, contração de músculos lisos, etc., porém a ingestão desequilibrada de ω-6,
ou seja, excessiva, está associada ao aumento da produção de eicosanóides que potencializam as
inflamações. Então a ingestão de ω-6 equilibrada com ω-3 ou somente deste último previnem
doenças por estar relacionado à substituição de ω-6, especialmente AA, por ácidos ω-3 como
EPA e DHA, reduzindo a produção de prostaglandina tipo E2, de tromboxano tipo A2, e
contribuindo para a formação de leucotrieno B4, que é indutor da resposta inflamatória, aumento
da concentração de prostaglandina E3 e leucotrieno A5 (Netleton, 1995).
CH3
CO2H
CH3
CO2H
O
OH
CO2H
OH
CH3
O
OH
CO2H
OH
CH3
Figura 8. Prostaglandinas resultantes (PGE2 e PGE3) dos ácidos graxos araquidônico e
eicosapentaenóico.
Ácido araquidônico (n 5,8,11,14) Ácido eicasapentaenóico (n 5,8,11,14,17)
PGE2 PGE3
17
E ainda um importante ácido graxo para o homem é CLA (ácido linoleico conjugado), que
embora possua poucos estudos, há evidência de propriedades anticancerígenas. Tal evidência
vem a partir de estudos de cultura de células (incluindo células humanas) e de estudos com
animais vivos, principalmente ratos e camundongos, (Gurr, 1999).
1.3.5 Lipídeos insaponificaveis
Dentre os compostos insaponificáveis podemos destacar os esteróides, tocóis e
carotenóides, que serão comentados a seguir (Gurr, 1999).
1.3.5.1 Esteróides
Os esteróides são triterpenos modificados contendo o sistema de anel tetracíclico do
lanosterol, mas faltando três grupos metila nos carbonos C-4 e C-14, o qual confere à molécula a
caraterística de ser quase planar e relativamente rígida, por causa do anel fundido não permitir
rotação na ligação C-C. São comuns nas membranas dos organismos eucarióticos, onde eles são
importantes para propocionar a estabilidade. Eles ocorrem em muitos óleos e gorduras,
compartilham algumas das suas propriedades fisicas e estão relacionados intimamente aos óleos e
gorduras em discussões de alimentação e saúde, podendo ser encontrados em suas formas livres e
também esterificadas (Dewick, 2002; Gunstone, 2008; Gurr, 2002; Nelson e Cox, 2005).
O colesterol, o principal esteróide em tecido animal, que exemplifica a estrutura
fundamental dos esteróides, é anfipático com um grupo “cabeça” polar e um corpo de
hidrocarboneto apolar. Tem sido associado com doenças coronárias e muitas recomendações de
ingestão de lipídeos estão relacionados a sua influência no sitema cardiovascular. Esteróides
similares sao encontrados em outros eucariontes: estigmasterol em plantas e ergoesterol em
fungos, por exemplo. Os esteróides, no geral, são um precursor essencial de ácidos biliares,
corticóides, hormônios sexuais e hormônios derivados da vitamina D (Gunstone, 2008, Nelson e
Cox, 2005).
18
CH3CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
Figura 9. Colesterol (esquerda) e sitosterol (direita).
1.3.5.2 Tocóis
Os tocóis são compostos com fenólicos heterocíclicos com cadeia lateral isoprenóide
lipofílica de 16 carbonos. Compreendem os tocoferóis e os tocotrienóis, que possuem duas
qualidades, mas são propriedades idênticas: apresentam atividade da vitamina E e poderosos
antioxidantes naturais lipofílicos, isto porque como são hidrofóbicos, se associam com
membranas celulares, depósitos lipídicos e lipoproteínas no sangue, e ainda porque o anel
aromático reage e destrói formas de oxigênio radicalares, protegendo ácidos graxos insaturados
de oxidação (Gunstone, 2008, Nelson e Cox, 2005).
Os tocóis, em geral, são encontrados em proporções variáveis em plantas, sendo que as
fontes principais são óleos vegetais, germe de trigo, sementes oleaginosas, vegetais folhosos
verde-escuros e alimentos de origem animal, principalmente gema de ovo e fígado. Tanto
tocoferóis como tocotrienóis ocorrem em uma variedade de isômeros que diferem na estrutura de
acordo com o número e a localização de grupos substituintes no anel cromanol. Os isômeros mais
abundantes nos alimentos são γ- e o α- tocoferol (Gurr, 2002).
O
CH3 CH3 CH3
CH3
R
OH
R
R
CH3
Figura 10. Tocoferóis e tocotrienóis. Tocoferóis tem uma cadeia lateral C16 saturada, tocotrienóis
tem ligações duplas nas três posições indicadas pelas setas. R = H ou CH3; α = 5,7,8-
trimetiltocol; β = 5,8-dimetiltocol; γ = 7,8-dimetiltocol; δ = 8-metiltocol.
19
1.3.5.3 Carotenóides
Os carotenóides são um grande grupo de pigmentos presentes na natureza que
desempenham papéis fundamentais na saúde humana, sendo essenciais para a visão. O β-caroteno
e outros carotenóides foram reconhecidos no século XX como as principais fontes de vitamina A,
sendo que a conversão ocorre naturalmente no fígado (Nelson e Cox, 2005).
Quanto à estrutura química, os carotenóides são tetraterpenóides, terpenos de 40 carbonos
unidos por unidades opostas no centro da molécula e a ciclização, hidrogenação, desidrogenação,
migração de duplas ligações, encurtamento ou alongamento da cadeia, rearranjo, isomerização,
introdução de funções com oxigênio ou a combinação destes processos resultam na diversidade
de estruturas dos carotenóides. Quando estes são compostos somente de carbono e hidrogênio são
chamados de carotenos e quando oxidados, carotenóides (Rodrigues-Amaya et al., 1999).
CH3
CH3 CH3CH3 CH3
CH3 CH3
CH3
CH3CH3
Figura 11. β-caroteno. Outros carotenos variam na natureza nos grupos terminais cíclicos.
1.3.6 Reações comuns envolvendo componentes insaponificáveis de óleos
Uma reação comum com lipídeos insaponificáveis, especificamente com esteróides, para
realização de sua análise é a sililação, a qual trata-se de uma reação que busca bloquear os sítios
próticos, havendo uma redução de interações do tipo dipolo-dipolo, elevando a volatilidade dos
compostos, usando-se normalmente compostos trimetilsilil como reagente, além de gerar
produtos com polaridade reduzida. O mecanismo de reação é via substituição nucleofilica de
segunda ordem, conforme mostrado a seguir (Becker, 2012).
20
amostra OH CH3 Si
CH3
X
CH3
amostra O+
H
Si-
CH3
CH3CH3
X O Si
CH3
CH3
CH3
amostra H X+ +
Figura 12. Mecanismo genérico da reação de sililação, onde X varia de acordo com os diferentes
derivatizantes (Becker, 2012).
1.3.7 Ocorrência de componentes insaponificavéis em óleos de peixes e a importância na
saúde humana
Estudos com peixes, mais especificamente estudos com tubarão, apontam para a presença
de lipídeos insaponificáveis em sua composição, sendo tais lipídeos importantes para a saúde
humana (Gunstone, 2004). O colesterol, apesar de atualmente ser visto frequentemente como uma
substância maléfica à saúde humana, possui função importante para o transporte de ácidos graxos
através do sangue na forma de lipoproteínas, as quais são de grande interesse para pesquisas
sobre arterosclerose, apresentando níveis acima de 7000 ppm como componentes em óleo de
peixe (Gunstone, 2008).
Outro lipídeo insaponificavel de grande importancia para o homem são os tocóis, por
desempenhar papel de antioxidante, protegendo ácidos graxos poliinsaturados vulneráveis (ou
ácidos graxos residuais de lipídeos) em membranas celulares e lipoproteínas de processos de
peroxidação (Fulchs et al., 2001), já que os produtos da peroxidação de lipídeos podem causar
danos as células. Os tocotrienóis são encontrados como poderosos inibidores da enzima que
cataliza a etapa limitante na biossíntese do colesterol (Gurr, 1999). Esses compostos se
apresentam como pouca quantidade em óleos de peixe, mas possuem papéis significativos na
saúde. Bem como os carotenoides, que mais recentemente, apresentaram efeitos benéficos contra
cânceres, doenças de coração e degeneração macular e foram estimuladas intensas investigações
sobre o papel desses compostos como anti-oxidantes e como reguladores de resposta do sistema
imune (Almeida et al., 2006; Delgado-Vargas et al., 2000; Orban et al., 2011; Orban et al., 2000;
Prego et al., 2012).
21
1.4 Informações referentes às espécies de peixes selecionadas para estudo
Informações gerais das espécies a serem estudadas se encontram descritas na Tabela 2.
Quanto à estudos existentes sobre lipídeos não foram encontrados para as espécies amazônicas
estudadas neste trabalho.
Tabela 2. Informações sobre as espécies em estudo (Santos et al., 2009; Soares et al., 2008).
Sardinha comprida Curimatã Pacu comum ou pacu
manteiga
Jaraqui-de –escama-
grossa
Pescada branca Surubim
Espécies Triportheus elongatus
Gunther, 1864
Prochilodus nigricans
Agassiz, 1829
Mylossoma duriventre
Cuvier, 1817
Semaprochilodus
insignis Schomburgk,
1841
Plagioscion
squamosissimus
Heckel, 1840
Pseudoplatystoma
fasciatum Linnaeus,
1766
Ordem Characiformes Characiformes Characiformes Characiformes Perciformes Siluriformes
Família Characidae Prochilodontidae Characidae Prochilodontidae Sciaenidae Pimelodidae
Porte médio porte Grande porte Porte médio Grande porte Grande porte Grande porte
Biologia Pelágica bentopelágica pelágica bentopelágica Bentônico
Ocorrência águas brancas, claras e
pretas
Águas claras, pretas e
branca.
águas brancas, claras e
pretas
águas brancas, claras e
pretas
Claras, brancas, pretas e
mixtas
águas brancas, claras e
pretas
Alimentação onívora com tendência
herbívora
Detrívoro Herbívoro, com
tendência onívora
detritívoro carnívoro Piscívoro
Hábito diurno, migradora Diurno, migrador diurno, migradora diurno, migradora Noturno Noturno, migradora
Desova Total em rios de águas
brancas
Total, em águas claras
e brancas
Total em confluências
de rios de águas pretas
e brancas
Total em rios de águas
pretas e brancas
parcelada Total na enchente
Fecundação Externa Externa externa externa Externa Externa
Época sazonal
para
reprodução
Seca inicio da enchente Final da seca inicio da
enchente
Seca e cheia início da enchente Todo o ano com pico na
enchente
Entre a enchente e cheia
Importância
econômica
Insignificante no geral
e destacada no grupo
Moderada, domina o
mercado em épocas do
ano
Insignificante no geral
e destacada no grupo
Destacada no geral e no
grupo
Insignificante no geral e
destacada no grupo
Insignificante, pesca
comercial na Amazônia
internacional
Participação da
produção
pesqueira do
amazonas
9,17% (2003) 9,41% (2003) 15% as duas espécies
(2003)
30,7% as duas especies
(2003)
0,94% (2003) 2,07% (2003)
Destacada: acima de 20%;
Moderada: entre 5 e 20 %;
Insignificante: abaixo de 5%.
23
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Conhecer e quantificar os constituintes lipídicos de óleos de seis espécies de peixes
amazônicos, jaraqui (Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu
(Mylossoma duriventre), sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada
(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum
Linnaeus, 1766), utilizando métodos inéditos de análises.
2.2 Específicos
Obter lipídeos totais de seis espécies de peixes amazônicos;
Separar os óleos extraídos por classe de lipídeos utilizando métodos
cromatográficos;
Otimizar a derivatização dos diferentes lipídeos a ésteres metílicos de ácidos
graxos para análise por cromatografia gasosa- CG;
Otimizar o método de análise de ésteres metílicos de ácidos graxos
poliinsaturados por cromatografia gasosa de alta resolução com detector de ionização por
chama- CG-DIC;
Confirmar a identificação dos ácidos graxos poliinsaturados por cromatografia
gasosa acoplada com detector de espectrometria de massas- CG-EM;
Identificar os ácidos graxos nas classes de lipídeos dos peixes.
Quantificar os diferentes ácidos graxos identificados nas amostras analisadas;
Identificar os esteróides presentes nos lipídeos dos peixes;
Quantificar esteróides presentes nos lipídeos dos peixes.
24
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Material
3.1.1 Seleção das espécies e coleta do material biológico
Foram estudadas seis espécies diferentes de peixes, selecionadas dentre as que
apresentam maior importância econômica para o Estado do Amazonas, segundo levantamento
realizado pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA (Santos et al., 2009),
listadas a seguir: jaraqui (Semaprochilodus insignis), curimatã (Prochilodus nigricans), pacu
(Mylossoma duriventre), sardinha (Triportheus elongatus Gxunther, 1864), pescada
(Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum
Linnaeus, 1766).
Os peixes foram adquiridos no mercado de Manaus, na Feira da Manaus Moderna, na
manhã do dia 05 de abril de 2012, sendo 5 pacus, 8 sardinhas, 6 jaraquis, 2 surubims, 5
curimatãs e 2 pescadas. Todos na fase adulta, a quantidade de cada peixe foi estabelecida
baseada no critério de se obter pelo menos 300 g de músculo dorsal e também uma variedade
mínima de dois indivíduos de cada espécie. Sendo a coleta dos peixes realizada no período de
enchente (janeiro a junho), a qual do ano em questão, 2012, apresentou a maior cheia até o
momento superando a de 2009 um mês antes, com 29,97 m contra 29,77 m de 2009
(http://www.portodemanaus.com.br/?pg=nivelhj.php).
A identificação das espécies foi feita comparando-se com a literatura (Soares et al.,
2008 e Santos et al., 2009).
3.1.2 Reagentes, solventes e instrumentos cromatográficos utilizados
Acetato de etila – Química CREDIE
Acetona – Química CREDIE
Ácido acético (99,8%) – Merck
Ácido fosfomolíbdico P.A – Merck
Água destilada
Alumina 90 – Merck
Anisaldeído (18%) – Vetec
Trifluoreto de Boro em meio metanólico (BF3 12%) – Aldrich
Clorofórmio PA – Química CREDIE
Éter etílico – Labsynth
25
Etanol anidro (99,5%) – Química CREDIE
Fenolftaleína PA – Nuclear
Hexano, grau HPLC (95%) – TEDIA
Hidróxido de potássio (85%) - Merck
Metanol (99,85%) – Química CREDIE
Metilato de sódio (30%) – COGNIS
Metil t-butil éter, grau HPLC – TEDIA
Nitrogênio comprimido –WHITE MARTINS
Silica gel (0,040-0,063 mm) – Merck
Cromatográfo gasoso com detector de ionização de chamas (CG-DIC) - Agilent, modelo HP
6890 Plus, configurado com detectores de ionização por chama, sistema de injeção
automática, Chemstation.
Cromatográfico gasoso acoplado com espectrômetro de massas (CG-EM) – THERMO,
modelo, equipado com injetor automático, detector de espectro de massas com fonte de íons
por impacto eletrônico, analisador do tipo quadrupolo e software XCalibur.
3.2 Métodos
3.2.1 Extração de lipídeos totais
A extração de lipídeos totais dos peixes foi realizada utilizando um método eficiente
que não usa solventes organoclorados e que foi desenvolvido como parte inical deste estudo.
3.2.1.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais
Foi desenvolvida uma metodologia alternativa ao método convencional de Bligh e
Dyer (1959), o qual é normalmente usado para extração de lipídeos totais de material
biológico, avaliando-se solventes não-organoclorados em comparação com o clorofórmio.
Testaram-se os éteres dietílico e metiltertbutílico em diferentes proporções numa mistura com
metanol e água (tabela 3), usando como matriz para extração uma solução com 5 mg de cada
padrão comercial: triestearina, ácido esteárico e DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil.
26
Tabela 3. Proporção de mistura de solventes para extração de lipídeos totais.
Solvente Metanol Água
Clorofórmio 4 4 2
Éter dietílico 4 2 2
MTBE 4 2 2
O experimento acima foi monitorado por cromatografia em camada delgada (CCD)
(sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido
fosfórico 8% aquoso) e seu rendimento foi medido. Os solventes utilizados neste experimento
tiveram seus coeficientes de partição em mistura previamente testados.
Depois de definida a mistura de solventes para a extração de lipídeos totais foi
analisada o procedimento de extração, utilizando uma matriz biológica, 200 g do músculo
dorsal de um indivíduo de tucunaré-comum (Cichla monoculus Spix & Agassiz, 1831). Os
lipídeos foram extraídos com cerca de 1 L de MTBE:metanol:água (4:2:2), usando
multiprocessador de alimentos (Philips walita), sendo a mistura resultante filtrada em funil de
Büchner, separadas suas fases em funil de separação, e a fase de MTBE centrifugada por 10
min à 25°C a 15500 rcf (relative centrifugal force), concentrada em rotaevaporador, e por fim
seca sob nitrogênio gasoso.
3.2.1.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo
Os peixes foram limpos em água corrente e o músculo dorsal de cada um foi retirado
com auxílio de uma faca. Os indivíduos de mesma espécie foram reunidos, pesados conforme
mostra a tabela 4 e extraídos seus lipídeos totais usando multiprocessador de alimentos
conforme metodologia resultante do ítem acima, onde para cada 100 g de peixe uma mistura
de 500 mL dos solventes MTBE:MeOH:água na proporção 4:2:2 e a adição de 32,0 mg do
padrão interno éster metílico do ácido graxo C 19:0 (EMAG) foram realizadas. Depois de
filtrado em funil de Buüchner as fases da mistura foram separadas em funil de separação e a
fase etérea foi centrifugada por 10 min à 25°C a 15500 rcf e concentrada em rotaevaporador,
seca sob nitrogênio gasoso e liofilizadas.
27
Tabela 4. Peso do músculo dorsal de cada espécie de peixe e de padrão interno EMAG C19:0
usado para extração.
Peixe Músculo dorsal (g) Padrão interno (mg)
curimatã 606,01 192,0
pescada 606,40 192,0
sardinha 298,82 95,8
jaraqui 608,06 191,6
surubim 600,93 191,7
pacu 305,86 96,0
3.2.1.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais
Cerca de 50 mg de lipídeos totais liofilizados de cada espécie de peixe em estudo,
além do lipídeo total do peixe tucunaré, que foi usado como teste foram eluídas em cartucho
de Extração em Fase Sólida (EFS) a fim de separar o EMAG dos demais constituintes do
extrato para verificação de recuperação do padrão, durante o processo de extração de lipídeos
totais.
Para o procedimento utilizando EFS, um cartucho de vidro de com diâmetro 0,9 cm,
foi empacotado à seco com cerca de 2 cm de sílica flash, com auxílio de ar comprimido, e 1
cm de sulfato de sódio foi colocado no topo do cartucho. As amostras foram eluídas com 20
mL de uma mistura dos solventes hexano:acetato de etila na proporção 99,7:0,3 (solvente grau
HPLC), coletando-se em balão de fundo redondo de 50 mL. Cada amostra foi concentrada em
rotaevaporador, mantida sob vácuo em dessecador com secante sulfato de sódio e ainda seco
sob nitrogênio para determinação de massa.
Cada amostra resultante obteve seu perfil cromatográfico realizado por CCD (sistema
clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido fosfórico 8%
aquoso) e depois de preparadas, por diluição, solução na concentração de 1 mg/mL em
hexano, foram analisados por CG-DIC. O método do CG-DIC usado, consistia de uso do gás
de arraste hélio com fluxo de 1m L/min, modo de injeção split 2:1 à 250°C, com temperatura
do forno começando em 200°C, mantendo nessa temperatura por 10 min, subindo numa
rampa de 6°C/min até 260°C e mantendo-se nessa última temperatura por 5 min, a fase
estacionária utilizada foi uma coluna HP 5, a temperatura do detector utilizada foi de 270°C.
28
Utilizando o mesmo método no CG-DIC uma curva analítica com o padrão comercial
de EMAG C 19:0 foi feita com 7 concentrações diferentes em dois dias consecutivos, para o
uso do método de quantificação por padrão interno, onde através da regressão linear da
equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em mg/mL) gerada
pela curva da média, calculou-se as concentrações reais das amostras, as quais deveriam ser
na concentração de 1 mg/mL, já que as amostras foram preparadas nessa concentração e
como houve uma filtração somente do analito este deve estar em sua totalidade inicial
equivalente ao peso encontrado de lipídeos totais.
3.2.2 Separação em classes e de seus componentes
Procurando-se um método para separação dos lipídeos em classes, que reduzisse o
tempo do processo, bem como a quantidade de solvente e de amostra utilizados, e seguindo
ainda o conceito da metodologia descrita por Johnston e colaboradores (1983), em que se
obtêm suas diferentes classes (lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos) através do
fracionamento em coluna aberta dos extratos de lipídeos totais, por ordem de polaridade,
desenvolveu-se uma metodologia de extração em fase sólida (EFS).
3.2.2.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos
Inicialmente foi feita uma comparação entre o método descrito por Johnston e
colaboradores (1983) e um sistema utilizando EFS, a partir de lipídeos totais extraídos de
sardinha-comprida (Triportheus elongatus Gxunther, 1864). Separando os lipídeos totais em
neutros e polares pelo método de Johnston (1983), cerca de 20 g de sílica gel (63-200 µm),
previamente ativada por 2 h à 80°C em estufa de circulação de ar, foram empacotadas em
suspensão com clorofórmio em uma coluna cromatográfica de vidro com 1,6 cm de diâmetro,
correspondendo a altura de sílica contida na coluna de 22 cm. Uma fase de 1 cm de altura, da
coluna, do sal secante sulfato de sódio foi colocada no topo da sílica empacotada e cerca de 1
g de amostra de lipídeos totais foi adicionada solubilizada em 1 mL de clorofórmio, com
auxílio de uma pipeta de Pasteur. Logo depois de o sulfato de sódio ter adsorvido a amostra,
400 mL do solvente clorofórmio foi adicionado aos poucos, seguido de 400 mL de acetona, e
este seguido de 400 mL de metanol; sendo cada solvente representante de uma fração, as
quais foram concentradas em rotaevaporador, transferidas para frascos menores e secas sob
nitrogênio gasoso, correspondendo a lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos
respectivas à ordem de eluição dos solventes.
29
Para a extração por fase sólida (EFS) foi empacotado à seco 2 cm do cartucho de
vidro, que mede 0,9 cm de diâmetro, com sílica flash, e adicionando no topo da sílica 1 cm de
sulfato de sódio, adaptadou-se no EFS e cerca de 500 mg dos lipídeos totais de sardinha
solubilizados em 0,5 mL de clorofórmio foram eluídos com 20 mL de cada solvente,
clorofórmio, acetona e metanol, nessa sequência, coletando-se frações de 10 em 10 mL.
Quando secas às frações, foram determinados seus pesos e feito o perfil cromatográfico por
CCD (sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico 10% em ácido
fosfórico 8% aquoso). Ainda usando EFS, outros experimentos foram realizados, em um
verificou-se a substituição do solvente clorofórmio por solventes não-organoclorados: o éter
dietilico e o metiltertbutiléter, em outro foi feita uma comparação do uso do metanol e etanol
com água como último sistema no processode eluição, e em um ultimo testou-se a
modificação da estrutura do cartucho de EFS, usando um com 1,3 cm de diâmetro e
empacotando a seco 1,20 cm de altura a sílica flash.
30
Tabela 5. Condições testadas para desenvolvimento do método de separação de classes de lipídeos.
Método Johnston EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 EFS 7 EFS 8
peixe Sardinha sardinha sardinha sardinha sardinha tucunaré Tucunaré tucunaré sardinha
L.T. (g) 1 0,4993 0,5006 0,4996 0,5015 0,503 0,5008 0,5000 0,5002
1°sistema CHCl3 CHCl3 CHCl3 éter dietílico MTBE MTBE MTBE MTBE MTBE
vol(ml) 400,0 20,0 20,0 20,0 20,0 40,0 40,0 40,0 40,0
2°sistema Acetona acetona acetona - - acetona Acetona acetona acetona
vol(ml) 400,0 20,0 20,0 - - 40,0 40,0 40,0 40,0
3°sistema MeOH MeOH MeOH - - MeOH:H2O
(8:2)
EtOH:H2O
(8:2)
EtOH:H2O
(8:2)
EtOH:H2O
(8:2)
vol(ml) 400,0 20,0 20,0 - - 40,0 40,0 40,0 40,0
h sílica (cm) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,2 1,2
di (cm) 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 1,3 1,3
padrão int
(mg/100g) - - - - - 32,0 32,0 32,0 -
31
3.2.2.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo
De cada espécie de peixe cerca de 500 mg de lipídeos totais lifiolizados, conforme
tabela 6, foram separados, por classe usando sistema de EFS sob vácuo seguindo a
metodologia desenvolvida no item anterior. O método consistiu de usar um cartucho de 1,3
cm de diâmetro, com 1,2 cm de altura de sílica flash, adicionando no topo da sílica 1 cm de
sulfato de sódio, aplicando-se cada amostra solubilizada em 1 mL de MTBE e eluir com 50
mL de cada sistema de eluição, MTBE 100%, acetona 100% e etanol:água 8:2, nessa
sequência, coletando-se frações de 50 em 50 mL, e quando secas foram determinados seus
pesos e perfil por CCD (sistema clorofórmio:metanol:água 75:22:3 e revelador sulfato cúprico
10% em ácido fosfórico 8% aquoso).
Tabela 6. Peso de lipídeos totais de cada peixe utilizado para a separação de classes de
lipídeos.
Peixe L.T.(mg)
curimatã 499,80
pescada 500,20
sardinha 472,60
jaraqui 499,30
surubim 480,50
pacu 500,30
3.2.3 Extração de lipídeos insaponificáveis
A fim de se separar uma fração rica em esteróides e tocoferóis (lipídeos
insaponificáveis) e analisá-los qualitativamente e quantitativamente, os lipídeos neutros foram
submetidos ao procedimento de saponificação segundo método de Azevedo-Meleiro e
colaboradores (2004) em duplicata, extraindo os lipídeos insaponificáveis.
3.2.3.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis
Com o objetivo de se testar inicialmente o procedimento de extração de
insaponificáveis em óleo de peixe, cerca de 200 mg de lipídeos neutros de sardinha foram
submetidas ao procedimento de saponificação.
À amostra de lipídeo neutro de sardinha foi adicionado 4 mL de solução de hexano
com 0,1% butil hidróxi tolueno - BHT e 4 mL de solução de hidróxido de potássio 10 %
(KOH) metanólico em balão de fundo redondo em agitação por 16 h no escuro à temperatura
ambiente, e em ambiente de nitrogênio gasoso. Obtida uma fase hexânica e outra metanólica,
32
estas foram separadas e a fase hexânica foi lavada cerca de 3 vezes com água milli-Q na
proporção 1:1 (v/v), até completa remoção do excesso de KOH, o que foi comprovado com o
indicador fenolftaleína. A seguir, a fração hexânica foi concentrada em rotaevaporador a
40°C, sêca na presença de gás nitrogênio para determinação do peso e monitorada por CCD
(hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído) para verificação da presença de tocoferóis e
esteróides por comparação com padrões comerciais (colesterol e α-tocoferol).
3.2.3.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo
Durante esse procedimento foi feita a adição de 0,1 mg do padrão comercial do
esteróide β-sitosterol em cada amostra de lipídeo neutro de peixe a fim de se determinar a
eficiência da extração de insaponificáveis, procedimento discriminado no próximo item, o
ítem 3.2.3.3.
O procedimento para extração dos lipídeos insaponificáveis a partir da fração dos
lipídeos neutros dos peixes em estudo foi realizado conforme testado no ítem 3.2.3.1, onde a
reação de saponificação considerou a relação 1 g de amostra para 20 mL de reagente e 20 mL
de solvente, descriminado na tabela 7. Depois que a fase hexânica foi separada da metanólica
e lavada com água milli-Q, até completa remoção do excesso de KOH, esta foi concentrada
em rotaevaporador, seca na presença de gás nitrogênio para determinação do peso,
monitorada por CCD (hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído) e reservada para reação
de sililação.
Tabela 7. Relação de reagentes, solvente e amostra de lipídeos neutros (L.N.) na reação de
saponificação para os peixes em estudo.
Saponificação
Peixe L.N.(mg) Reagente (mL) Solvente (mL)
curimatã 295,6 6,0 6,0
pescada 301,0 6,0 6,0
sardinha 250,8 6,0 6,0
jaraqui 298,8 6,0 6,0
surubim 236,8 6,0 6,0
pacu 295,3 6,0 6,0
33
3.2.3.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis
No experimento do ítem 3.2.3.2, usando uma pipeta automática, 100 µL de uma
solução do padrão β-sitosterol em hexano na concentração de 1 mg/mL foi adicionado às
amostras de peixes. Esse padrão foi quantificado para verificar a recuperação total do que foi
adicionado inicialmente, ou seja, a concentração de 0,1 mg/mL, através da análise quantitativa
das amostras sililadas na concentração de 1 mg/mL por CG-DIC (3.2.5.3) em método de
análise desenvolvido no ítem 3.2.5.1. E calculando a eficiência do método em porcentagem
da razão entre a concentração real e a esperada em uma amostra de 1 mg/mL, através da
regressão linear da equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em
mg/mL) resultante de uma curva analítica com o padrão esteróide β-sitosterol em solução.
3.2.4 Preparação de amostras para análise de esteróides
3.2.4.1 Verificação do método de reação de sililação
A fração hexânica extraída do tratamento resultante da reação de saponificação dos
lipídeos neutros de sardinha, bem como padrões comerciais de colesterol (esteróide) e de α-
tocoferol (tocol), foi reagido segundo metodologia descrita por Bowden et al. (2009), onde
em um frasco de 2 mL cerca de 10 mg da fração hexânica foram adicionados 200 µL de
reagente derivatizante, sendo 100 µL de BSTFA+TMCS (99:1) e 100 µL de piridina e
mantido por 30 min na lavadora ultra-sônica à 80°C. Ao término depois de verificado a
conversão por CCD (hexano:acetato 80:20 e revelador anisaldeído), uma solução de 1 mg/mL
a partir da mistura resultante foi realizada para identificação dos esteróides através de análise
no CG-EM.
3.2.4.2 Aplicação do método de reação de sililação nos peixes em estudo
Para todas as amostras de lipídeos insaponificáveis foi realizada a reação de sililação
segundo metodologia descrita por Bowden et al. (2009), conforme descrito acima no ítem
3.2.4.1. E ao término comparou-se a conversão das amostras por CCD (hexano:acetato 80:20
e revelador anisaldeído) com padrões comerciais de esteróides.
34
3.2.5 Análise de esteróides por cromatografia gasosa
3.2.5.1 Otimização da metodologia de análise de lipídeos insaponificáveis por
cromatografia gasosa (CG-DIC e CG-EM)
O processo de otimização foi feito usando tanto o CG-DIC quanto o CG-EM, sendo
inicialmente utilizado o CG-DIC configurado com uma coluna cromatográfica apolar HP-5,
gás de arraste hélio, injetor no modo split 10:1 à 250°C, volume de injeção de 1µL, detector
na temperatura de 300°C com fluxo de H2 30 mL/min, de ar sintético 300 mL/min e de N2 de
25 mL/min. Posteriormente, utilizou-se o CG-EM, a fim de confirmar a possibilidade de
identificação de componentes em regiões mal resolvidas e assim buscar um aprimoramento do
método, com coluna apolar ZB-5 e linha de transferência e fonte de íons na temperatura de
275°C e 250°C, respectivamente.
O desenvolvimento de um método de separação foi feito a partir de uma mistura de
padrões comerciais disponíveis de esteróides e tocoferóis, alterando os parâmetros de
temperatura do forno do aparelho, bem como o fluxo do gás de arraste (tabela 8), a fim se
obter boa separação dos contituintes da mistura. Os padrões usados foram: colesterol,
ergoesterol, estigmasterol, β-sitosterol e α-tocoferol.
A identificação inequívoca de cada esteróide e tocoferol, foi feita pela análise e
comparação dos tempos de retenção dos padrões e dos espectros de massas com as bibliotecas
disponíveis (Wiley e Adams).
35
Tabela 8. Otimização do método de análise de lipídeos insaponificáveis.
Método Coluna Fluxo
(mL/min) Rampas do forno
Tempo total
(min) Detector
1
Hidalgo Zb-5 0,6 120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 5ºC/min até 300ºC
e mantendo por 10 min 30,66 EM
2 ColToc_1
Zb-5 1,0
120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15 ºC/min até 250ºC, subindo 3ºC/min até
300ºC e mantendo por 5 min 32,32 EM
3
ColToc_4
Zb-5 1,0
120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 5ºC/min até
280ºC, mantendo por 5 min, subindo 10ºC/min até 300°C, mantendo por 5 min. 28,66 EM
4 ColToc_6
Zb-5 1,0
120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 3ºC/min até
270ºC, mantendo por 8 min, subindo 10ºC/min até 300°C 28,32 EM
5 ColToc_11
Zb-5 1,0
120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, subindo 2ºC/min até
260ºC, mantendo por 5 min, subindo 10ºC/min até 300°C 24,66 EM
6 ColToc_23
Zb-5 1,0
120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 250ºC, mantendo por 30 min,
subindo 5ºC/min até 300ºC. 50,66 EM
7
Silil_II HP-5 2,1 120ºC, mantendo por 2 min, subindo 15ºC/min até 240ºC, mantendo por 45 min,
subindo 5ºC/min até 300ºC e mantendo por 3 min 70,00 DIC
36
3.2.5.2 Análise qualitativa de esteróides dos peixes em estudo por CG-EM
As amostras de esteróides sililados dos peixes em estudo foram analisadas
qualitativamente por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em método
desenvolvido na seção 3.2.5.1. A identificação inequívoca dos esteróides das amostras de
lipídeos insaponificáveis dos peixes foi feita pela comparação dos seus espectros de massas
com as bibliotecas disponíveis (Wiley e Adams).
3.2.5.3 Análise quantitativa de esteróides dos peixes em estudo por CG-DIC
A quantificação dos esteróides presentes em cada amostra de lipídeos insaponificáveis
de peixes foi realizada por meio da técnica de CG-DIC, empregando o método de
normalização de área, utilizando o padrão interno β-sitosterol para as amostras (3.2.3.2). A
quantificação por padrão interno consiste na construção de uma curva analítica, a partir de
soluções-padrão com concentrações conhecidas de um analito que não contenha na matriz de
análise; que no caso neste trabalho as curvas analíticas foram construídas baseadas em
soluções-padrão de β-sitosterol, nas concentrações na faixa de 0,00625-0,05 mg/mL (4
pontos). E a equação linear (y = ax + b; onde y é a área do pico, x é a concentração em
mg/mL) gerada pela curvas, proporcionou calcular pela regressão linear as concentrações dos
esteróides nas amostras.
3.2.6 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa
Cada amostra obtida foi analisada na descrição dos ácidos graxos residuais pela
conversão das diferentes amostras de lipídeos em seus respectivos ésteres metílicos e
posterior análise por CG-DIC e CG-EM. Para tal foi necessário otimizar a metodologia de
derivatização já desenvolvida por Barbosa e colaboradores (2009), onde se realizou uma
reação de transesterificação/saponificação utilizando como catalisador o metilato de sódio
(anidro) em metanol, em baixa concentração, seguido da esterificação com BF3/MeOH.
3.2.6.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres
metílicos
Foi feito inicialmente dois experimentos, reproduzindo o método de Barbosa et al.
(2009) e testando outro reagente como esterificante o cloreto de amônia em ácido sulfúrico ao
invés de trifluoreto de boro, usando amostras de lipídeos neutros (fração MTBE),
glicolipídeos (fração acetona) e fosfolipídeos (fração EtOH:água) de peixe. Onde o
esterificante a base de cloreto de amônia foi preparado da seguinte forma: pesando-se cerca de
37
10 g de NH4Cl e adicionando 300 mL de MeOH, seguida da adição em pequenas porções de
15 mL de ácido sulfúrico concentrado com eventual agitação.
E depois várias condições foram testadas, dispostas resumidamente na tabela 9 e
tabela 10, partindo do experimento inicial descrito acima, avaliando-se diferentes
concentrações do catalisador na etapa de transesterificação (experimento I-X), bem como a
adição de álcool em etapas (experimento VII -X), a inversão das etapas normalmente usadas
para primeiro a etapa de esterificação e posteriormente a de transesterificação (experimento
XIII – XIV), e ainda a substituição do álcool por um solvente aprótico (experimento XVII –
XVIII). Buscando o procedimento que fosse mais favorável para a conversão dos ácidos
graxos contidos nas amostras em seus respectivos ésteres metílicos.
Uma observação importante deve ser feita em relação ao experimento IV, o catalisador
básico foi neutralizo com 4 mL de ácido acético, controlando o pH da mistura ao valor de 2
com papel indicador universal de pH. E ainda, após cada reação foi empregado um tratamento
para extração da fase orgânica, onde cerca de 3 mL de hexano foi colocado no tubo de ensaio
e agitado vigorosamente, em seguida 3 mL de solução saturada (15%) aquosa de cloreto de
sódio foi adicionado e também agitado. Depois a fase hexânica (orgânica) foi separada da
hidroalcoólica e transferida para um frasco, seca sob nitrogênio gasoso, e monitorada por
CCD (hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4, revelador ácido fosfomolibdico 20%
etílico) usando padrões comerciais de éster metílico do ácido nonandecanóico, triestearina,
ácido esteárico, DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil, monopalmitolglicerídeo e
dipalmitolglicerídeo para verificação do sucesso ou não de conversão após reação, A fase
orgânica foi solubilizada em 0,5 mL de hexano e tratada em extrator por fase sólida (EFS)
usando cartucho de 0,9 cm de diâmetro contendo 2 cm de altura de sílica flash fase normal e
0,5 cm de altura de sulfato de sódio no topo, eluindo-se com 20 mL do sistema de eluição
hexano:acetato de etila 98:2, coletando em balão de fundo redondo de 50 mL, concentrando
em rotaevaporador, transferindo para frasco, seco sob nitrogênio e monitorado por CCD
(hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4, revelador ácido fosfomolibdico 20% etílico); a
fim de se obter somente os ésteres metílicos para a análise no cromatógrafo gasoso e impedir
problemas de impureza em contato com a fase estacionária do CG.
38
Tabela 9. As primeiras oito condições testadas para otimização do método de derivatização para análise de cadeia graxa por CG.
Método Barbosa et al. 2009 Exp. I Exp. II Exp. III Exp. IV Exp. VI Exp. VII Exp. VIII Exp. IX Exp. X
amostra (classe) L.N., Glico., Fosf. L.N., Glico., Fosf. L.N., Glico., Fosfo. L.N. L.N. L.N., Glico.,
Fosf. L.N. L.N. L.N. L.N.
quantidade (mg) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
1ª reação transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest. transest.
catalisador CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+
concentração 0,24 M 0,24 M 5,38 M 0,35 M 0,35 M 0,35 M 0,35 M 0,23 M 0,35 M 0,69 M
via metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica metílica
volume 4 mL 4 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 1mL +1mL 1mL +2mL 1mL +1mL 1mL +1mL
tempo (min) 15 15 30 30 30 30 30 30 30 15
agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom
temperatura (°C) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
2ª reação esterif. esterif. esterif. esterif. neutraliz. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif.
catalisador BF3 NH4Cl- H2SO4 BF3 NH4Cl- H2SO4 ác. Acético BF3 BF3 BF3 NH4Cl-
H2SO4 BF3
concentração 1 M 0,63 M 1 M 0,63 M - 1 M 1 M 1 M 0,63 M 1 M
via metílica metílica metílica metílica - metílica metílica metílica metílica metílica
volume 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL - 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
tempo (min) 15 15 30 30 - 30 30 30 30 15
agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom - ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom
temperatura (°C) 50 50 50 50 - 50 50 50 50 50
39
Tabela 10. As demais condições testadas para otimização do método de derivatização para análise de cadeia graxa por CG.
Método Exp. XI Exp. XIII exp. XIV exp. XV exp. XVI exp. XVII exp. XVIII exp. XIX exp. XX
amostra L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N. L.N.PI L.N., Glico.,
Fosf.
quant. (mg) 50 50 50 50 50 50 50 50 50
1ª reação transest. esterif. esterif. transest. transest. transest. transest. transest. transest.
catalisador CH3O-Na+ BF3 novo BF3 novo CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+ CH3O-Na+
concentração 0,46 M 1 M 1 M 1,19 M 1,04 M 1,04 M 0,69 M 0,69 M 0,69 M
via metílica metílica metílica metílica Metílica DMSO DMSO+MeOH metílica metílica
volume 2mL+1mL 7mL 5mL 1mL+1mL 2mL 2mL 1mL+1mL 2mL 2mL
tempo (min) 25 45 30 40 30 30 30 30 30
agitação ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom Ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom
Temp. (°C) 40 40 50 50 50 50 50 80 50
2ª reação esterif. - transest. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif. esterif.
catalisador BF3 - metoxido BF3 BF3 BF3 BF3 BF3 BF3
concentração 1 M - 0,69 M 1 M 1 M 1 M 1 M 1 M 1 M
via metílica - metílica metílica Metílica metílica metílica metílica metílica
volume 5 mL - 2mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
tempo (min) 15 - 30 30 30 30 30 30 30
agitação ultrassom - ultrassom ultrassom Ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom ultrassom
Temp.(°C) 50 - 50 50 50 50 50 80 50
40
3.2.6.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo
Cerca de 50 mg de cada classe de lipídeo representada pelas frações obtidas de cada
peixe na etapa de separação de lipídeos por polaridade foram colocadas em tubos de ensaio de
capacidade de 15 mL, confome tabela 11, para realizar a derivatização para análise da cadeia
graxa por cromatografia gasosa. À estas amostras foram adicionados 2 mL de solução de
metóxido de sódio metanólica 0,69 M à 50°C no ultrassom por 30 min, depois adicionou-se
ao tubo de ensaio 5 mL de solução de trifluoreto de boro metanólica 14% que equivale à 1 M
e foram mantidas no ultrassom por mais 30 min à 50°C e ao término sofreram tratamento pós-
reacional.
Tabela 11. Quantidade de massa usada por cada amostra para a reação de derivatização para
análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa.
Peixe m para derivatização 1 (mg) m para derivatização 2 (mg)
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip. Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
curimatã 55,1 4,0 10,8 49,5 40,4 17,3
pescada 49,6 3,7 6,8 50,2 0,0 12,5
sardinha 47,1 3,5 50,0 51,6 1,3 50,0
jaraqui 54,5 3,3 13,7 49,9 0,0 21,3
surubim 59,5 9,4 50,0 49,5 0,5 50,0
pacu 53,0 6,1 4,8 50,0 0,0 3,3
No tratamento pós-reacional houve a extração da fase orgânica, onde cerca de 4 mL de
hexano foi colocado no tubo de ensaio e agitado vigorosamente, em seguida 4 mL de solução
saturada (15%) aquosa de cloreto de sódio foi adicionado e também agitado. Depois a fase
hexânica (orgânica) foi separada da hidroalcoólica e transferida para um frasco, seca sob
nitrogênio gasoso, e ainda monitorada por CCD (hexano:éter dietílico: ácido acético 80:15:4,
revelador ácido fosfomolibdico 20% etílico) usando padrões comerciais (éster metílico do
ácido nonandecanóico, triestearina, ácido esteárico, DL-α-fosfatidilcolina dipalmitoil,
monopalmitolglicerídeo e dipalmitolglicerídeo) para verificação do sucesso ou não de
conversão após reação; e ainda esta fase orgânica tratada em EFS conforme ítem 3.2.6.1.
41
3.2.6.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos
neutros
O padrão interno (EMAG C19:0) adicionado em todos os peixes durante o processo de
extração de seus respectivos lipídeos totais, ítem 3.2.1.2, a fim de se verificar a recuperação
total ao término de todas as etapas envolvidas na análise da cadeia graxa, sofreu análise
quantitativa nos lipídeos neutros esterificados dos peixes, ítem 3.2.7.3, após análise por CG-
DIC em método desenvolvido no ítem 3.2.7.1.
3.2.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa
A análise quantitativa e qualitativa da composição da cadeia graxa foi realizada pela
separação dos constituintes de cada amostra e suas respectivas detecções por cromatografia
gasosa e detectores de ionização de chamas e de espectro de massas. Para tal separação
buscou-se fazer a otimização do método de Barbosa e colaboradores (2009).
3.2.7.1 Otimização da metodologia da análise de cadeia graxa por cromatografia gasosa
(CG-DIC e CG-EM)
O processo de otimização foi feito usando tanto o CG-DIC quanto o CG-EM.
Inicialmente utilizou-se o CG-DIC configurado no modo dual, isto é, com duas colunas
cromatográficas em paralelo, uma polar (HP INNOWAX-20) e outra apolar (HP-5) de
idênticas dimensões (30 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e espessura do
filme de 0,25 µm), que permite a análise simultânea de uma mistura em duas fases
estacionária diferentes, permitindo a identificação com maior precisão dos ésteres metílicos. E
posteriormente configurado com uma coluna cromatográfica polar específica para ácidos
graxos (zebron ZB-FFAP), de 60 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e
espessura do filme de 0,25 µm. O gás de arraste usado foi o hélio, o injetor foi usado no modo
split 10:1 e temperatura 250°C, o volume de injeção foi de 1 µL, detector DIC na temperatura
de 270°C com fluxo de H2 30 mL/min, de ar sintético 300 mL/min e de N2 de 25 mL/min. O
CG-EM usado, com linha de transferência e fonte de íons na temperatura de 275°C e 250°C,
respectivamente, foi configurado com coluna polar de 60 m (zebron ZB-FFAP), e seu uso se
deve ao fato de confirmar a possibilidade de identificação dos componentes em regiões mal
resolvidas e assim buscar um aprimoramento do método.
O desenvolvimento de um método de separação foi feita a partir de uma mistura de
padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos (tabela 12), com uma
quantidade maior dos dois últimos componentes da separação para marcação do término da
42
análise, alterando os parâmetros de temperatura do forno do aparelho, bem como o fluxo do
gás de arraste e coluna (diferentes diâmetros, comprimentos e fase estacionária) usando modo
dual ou simples (tabela 13).
Tabela 12. Padrões comerciais disponíveis de ésteres metílicos de ácidos graxos.
Nome usual Nome oficial (ácido) Fórmula Família
1 valérico pentanóico C 5:0 -
2 capróico hexanóico C 6:0 -
3 - heptanóico C 7:0 -
4 - octanóico C 8:0 -
5 - nonanóico C 9:0 -
6 cáprico decanóico C 10:0 -
7 - undecanoico C 11:0 -
8 - cis-10 -undecenóico C 11:1 cis 10
9 laúrico dodecanóico C 12:0 -
10 - tridecanóico C 13:0 -
11 mirístico tetradecanóico C 14:0 -
12 miristoléico cis-9- tetradecenóico C 14:1 cis- 9 ω-5
13 - pentadecanóico C 15:0 -
14 palmítico hexadecanóico C 16:0 -
15 palmitoléico cis-9 -hexadecenóico C 16:1 cis -9 ω -7
16 palmitoléico trans -9 -hexadecenóico C 16:1 trans-9 ω -7
17 - heptadecanóico C 17:0 -
18 esteárico octadecanóico C 18:0 -
19 petroselínico cis-6-octadecenóico C 18:1 cis -6 ω -12
20 cis- vaccênico cis- 11- octadecenóico C 18:1 cis -11 ω -7
21 oléico cis- 9- octadecenóico C 18:1 cis- 9 ω -9
22 trans -
vaccênico trans- 11 -octadecenóico C 18:1 trans-11
ω -7
23 elaídico trans-9-octadecenóico C 18: 1 trans-9 ω -9
24 - cis – 12-octadecenóico C 18: 1 cis-12 ω -6
25 -
C 18:2 conj.
26 linolelaídico trans- 9,12 -octadecadienóico C 18:2 trans –9,12 ω -6
27 linoléico cis- 9,12- octadecadienóico C 18:2 cis- 9,12 ω -6
28 γ-linolênico cis- 9,12,15-octadecatrienóico C 18:3 cis-9,12,15 ω -3
29 α-linolênico cis-6,9,12- octadecatrienóico C 18:3 cis- 6,9,12 ω -6
30 - cis-6,9,12,15-octadecatetraenóico C 18: 4 cis-6,9,12,15 ω -3
31 - nonadecanóico C 19:0 -
32 araquídico eicosanóico C 20:0 -
33 - cis-5-eicosenóico C 20:1 cis -5 ω - 15
34 - cis-11-eicosenóico C 20:1 cis -11 ω - 9
35 - cis – 8- eicosenóico C 20:1 cis -8 ω - 12
36 - cis-13-eicosenóico C 20:1 cis 13 ω - 7
37 - cis –11,14 -eicosenóico C 20:2 cis 11,14
ω - 6
43
38 - cis- 8,11,14 -eicosatrienóico C 20:3 cis- 8,11,14 ω - 6
39 - cis- 11,14,17- eicosatrienóico C 20:3 cis- 11,14,17 ω - 3
40 araquidônico cis-5,8,11,14-eicosatetraenóico C 20:4 cis-5,8,11,14 ω - 6
41 EPA cis –5,8,11,14,17-eicosapentaenóico C 20:5 cis-5,8,11,14,17 ω - 3
42 - uncosanóico C 21:0 -
43 behênico docosanóico C 22:0 -
44 erúcico cis-13-docosenóico C 22:1 cis -13 ω - 9
45 - cis- 13,16 docosadienoico C 22:2 cis –13,16 ω - 6
46 - cis-13,16,19- docosatrienóico C 22: 3 cis-13,16,19 ω - 3
47 - cis- 7,10,13,16 –docosatetraenóico C 22:4 cis-7,10,13,16 ω - 6
48 DHA cis-4,7,10,13,16,19docosahexaenóico
C 22: 6 cis-
4,7,10,13,16,19
ω - 3
49 - tricosanóico C 23:0 -
50 - tetracosanóico C 24:0 -
51 nervônico cis -15-tetracoseinóico C 24:1 cis-15 ω - 9
A identificação inequívoca dos ésteres metílicos de ácidos graxos da mistura foi feita
pela comparação com os tempos de retenção da mitura de padrões e pela comparação dos
espectros de massas com as bibliotecas disponíveis (Wiley e Adams) quando usado o CG-
EM.
Continuação da tabela 12
44
Tabela 13. Otimização do método de ánalise de ácidos graxos.
Método Coluna
Fluxo
(mL/min) Rampas do forno Detector
1 Barbosa et
al., 2009 dual 2,8
107ºC, subindo 7ºC/min até 149ºC e mantendo-se nessa temperatura (isoterma) por 54 min , em seguida subindo
6 ºC/min até 260ºC, e mantendo-se nessa temperatura por 1,50 min DIC
2 BB2 dual 2,8 102ºC, subindo 7ºC/min até 150ºC, mantendo por 30 min, subindo 5ºC/min até 260ºC e mantendo por 15 min DIC
3 BB3 dual 1,6 110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 20 min aumentando 3ºC/min até 260ºC e matendo por 10 min DIC
4 BB4 dual 1,6 110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 8 min aumentando 2ºC/min até 260ºC e matendo por 5 min DIC
5 BB5 dual 2,8 110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 5 min aumentando 1ºC/min até 260ºC e matendo por 1 min DIC
6 BB8 dual 2,8
110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC mantendo por 4,29 min aumentando 5ºC/min até 200ºC e matendo por 10 min,
aumentando 5ºC/ min até 250ºC DIC
7 BB9 dual 2,8
110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC aumentando 6ºC/min até 185ºC e matendo por 5 min, aumentando 5ºC/min até
250ºC DIC
8 BB11 dual 1,4
110ºC subindo 7ºC/min até 150ºC aumentando 6ºC/min até 185ºC e matendo por 10 min, aumentando 6ºC/min
até 250ºC e mantendo por 5 min EM
9 BB32 dual 1,4
50ºC mantendo por 1,5 min, subindo 20 ºC/min até 175ºC, mantendo por 10 min, aumentando 20ºC/min até
190ºC, aumentando 5°C até 250°C e mantendo por 5 min EM
10 MIX 3 ZBFFAP 2,2 200ºC subindo 2ºC/min até 260ºC, mantendo por 10 min DIC
11 MIX 16 ZBFFAP
2,2 150ºC, subindo 7ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC, e mantendo por 5 min DIC
12 MIX 18 ZBFFAP
2,2 150ºC, subindo 8ºC/min até 240ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC, e mantendo por 2 min DIC
13 MIX 20 ZBFFAP
2,2 150ºC, subindo 20ºC/min até 240ºC, mantendo por 8 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC
14 MIX 22 ZBFFAP
2,2 150ºC, subindo 20ºC/min até 230ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC
15 MIX 24 ZBFFAP
2,2 150ºC, subindo 10ºC/min até 220ºC, mantendo por 10 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC
16 MIX 33 ZBFFAP
2,2 140ºC, mantendo por 5 min, subindo 6ºC/min até 260ºC, mantendo por 5 min DIC
17 MIX 39 ZBFFAP
2,2 140ºC, subindo 6ºC/min até 220ºC, aumentando 1ºC/min até 260ºC, mantendo nessa temperatura por 5 min DIC
18 MIX 40 ZBFFAP
2,2 160ºC, subindo 8ºC/min até 220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 2ºC/min até 260ºC DIC
45
Continuação da Tabela 13
19 MIX 44 ZBFFAP
2,2 160ºC, subindo 10ºC/min até 240ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até 260ºC, mantendo nessa
temperatura por 2 min DIC
20 MIX 47 ZBFFAP 2,3 160ºC, subindo 8ºC/min até 220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 2ºC/min até 260ºC DIC
21 MIX 55 ZBFFAP 2,3
140ºC, subindo 7 ºC/min até 190ºC, aumentando 2ºC/min até 240ºC, aumentando 4ºC/min até 260ºC e mantendo
nessa temperatura por 5 min DIC
22 MIX 64 ZBFFAP 2,3 140ºC, subindo 0,5ºC/min até 260ºC, mantendo por 20 min DIC
23
MIX 71 ZBFFAP 1,1
140ºC, subindo 2 ºC/min até 170ºC, aumentando 1ºC/min até 200ºC, aumentando 4ºC/min até 260ºC e mantendo
nessa temperatura por 5 min DIC
24 MIX 82 ZBFFAP 1,1
140ºC, subindo 2ºC/min até 170ºC, mantendo por 5 min, aumentando 1ºC/min até 200ºC, aumentando 4ºC/min
até 260ºC e mantendo nessa temperatura por 5 min DIC
25 MIX 19 - EM ZBFFAP
1,5 140ºC, subindo 6ºC/min até 220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 5ºC/min até 240, aumentando 5ºC/min até
260°C e mantendo nessa temperatura por 5 min EM
26 MIX 35 - EM ZBFFAP
1,5 120ºC, mantendo por 5 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 20 min, aumentando 15ºC/min até 260ºC,
e mantendo nessa temperatura por 10 min EM
27 MIX 77 - EM ZBFFAP
1,5 120ºC, subindo 10ºC/min até 155ºC, mantendo por 15 min, aumentando 5ºC/min até 160ºC, mantendo por 50
min, aumentando 2ºC/min até 260ºC, e mantendo por 10 min nessa temperatura. EM
28
MIX 14A ZBFFAP 1,8
120ºC, subindo 10ºC/min até 165ºC, mantendo por 10 min, aumentando 1ºC/min até 165ºC, mantendo por 40
min, aumentando 4ºC/min até 210ºC, mantendo por 4 min , aumentando 2ºC/min até 260ºC, mantendo por 5
min
DIC
29 MIX 27A ZBFFAP
1,8 165 ºC, mantendo por 60 min, subindo 10 ºC/min até 230ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até
260ºC, mantendo por 5 min DIC
30 MIX 30A ZBFFAP
1,8 165 ºC, mantendo por 60 min, subindo 8ºC/min até 190ºC, mantendo por 10 min, aumentando 2ºC/min até
220ºC, mantendo por 5 min, aumentando 4ºC/min até 260ºC DIC
31 MIX 35A ZBFFAP
1,8 160ºC, mantendo por 60 min, subindo 10 ºC/min até 200ºC, aumentando 0,5ºC/min até 260ºC DIC
32 MIX 39A ZBFFAP
1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 1ºC/min até 260ºC DIC
33 MIX 41A ZBFFAP
1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 10ºC/min até
210ºC, mantendo por 42 min DIC
34 MIX 43A ZBFFAP
1,8 160ºC, mantendo por 62 min, subindo 8ºC/min até 200ºC, mantendo por 10 min, aumentando 10ºC/min até
230ºC, mantendo por 30 min DIC
46
3.2.7.2 Análise qualitativa da composição da cadeia graxa dos peixes por CG-EM
As amostras de ésteres metílicos de lipídeos neutros, glicolipídeos e fosfolipídeos de
peixes foram preparadas na concentração de 1 mg/mL em hexano e analisadas
qualitativamente pela separação dos constituintes de cada amostra por cromatografia gasosa e
detectadas por espectrometria de massas em método desenvolvido na seção 3.2.5.1. A
identificação inequívoca dos ésteres metílicos de ácidos graxos das amostras de lipídeos de
peixes foi feita pela comparação dos seus espectros de massas com as bibliotecas disponíveis
(Wiley e Adams).
3.2.7.3 Análise quantitativa da composição da cadeia graxa dos peixes por CG-DIC
A quantificação dos ácidos graxos presentes em cada amostra de lipídeos de peixes
analisada foi realizada por meio da técnica de CG-DIC, empregando o método de
normalização de área, utilizando padrão interno, que consiste na construção de uma curva
analítica, a partir de soluções-padrão com concentrações conhecidas de um analito que não
contenha na matriz de análise. As curvas analíticas foram construídas baseadas em soluções-
padrão de FAME C19:0, nas concentrações na faixa de 0,0625-0,1 mg/mL (5 pontos), em
análise intradays (tres dias consecutivos). E a equação linear (y = ax + b; onde y é a área do
pico, x é a concentração em mg/mL) gerada pela curvas, possibilitou calcular pela regressão
linear as concentrações.
3.8 Determinação da qualidade nutricional dos lipídeos dos peixes
A qualidade nutricional de cada classe de lipídeos foi determinada através dos dados
obtidos do perfil lipídico de cada amostra de peixe, considerando tanto a razão entre os ácidos
graxos poliisaturados e saturados quanto os índices de aterogenicidade (IA) e
trombogenicidade (IT) (Ulbricht e Southgate, 1991). E ainda a razão entre os ácidos graxos
hipocolesterolêmicos e hipercolesterolêmicos-HH (Santos- Silva et al., 2002).
As equações referentes aos índices de aterogenicidade (IA) e trombogenicidade (IT), e a
razão entre os ácidos graxos hipocolesterolêmicos e hipercolesterolêmicos (HH) se encontram
a seguir:
47
IA= [(C 12:0 + (4 x C 14:0) + C 16:0]/( ΣAGMI + Σω6 + Σω3) (1)
IT = (C 14:0 + C 16:0 + C 18:0)/[(0,5 x ΣAGMI) + (0,5 x Σω6) + (3 x Σω3) + (Σω3/
Σω6)] (2)
HH = (C 18:1n9 + C 18:2n6 + C 20:4n6 + C 18:3n3 + C 20:5n3 + C 22:5n3 + C
22:6n3)/(C 14:0 + C 16:0) (3)
Onde:
ΣAGMI = somatório dos ácidos graxos monoinsaturados;
Σω6 = somatório dos ácidos graxos do tipo ômega 6;
Σω3 = somatório dos ácidos graxos do tipo ômega 3.
48
4. Resultados e Discussão
4.1. Seleção das espécies e coleta do material biológico
A seguir se encontram as fotos referentes aos peixes coletados.
Os peixes foram identificados comparando-se com a literatura Soares e colaboradores
(2007) e Santos e colaboradores (2009) como sendo jaraqui de escama grossa (Semal
Figura 13. Peixe jaraqui. Figura 14. Peixe sardinha.
Figura 15. Peixe pacu. Figura 16. Peixe curimatã.
Figura 17.
Peixe surubim.
Figura 18.
Peixe pescada.
49
prochilodus insignis Jardine & Schomburgk, 1841), curimatã (Prochilodus nigricans Agassiz,
1829), pacu-comum ou pacu manteiga (Mylossoma duriventre Cuvier, 1817), sardinha papuda
(Triportheus angulatuss Spix & Agassiz, 1829), pescada branca (Plagioscion squamosissimus
Heckel, 1840) e surubim (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus, 1766).
4.2 Extração de lipídeos totais
4.2.1 Desenvolvimento de metodologia de extração de lipídeos totais
Observou-se semelhante eficiência para os solventes alternativos quando comparados
com o clorofórmio ao se testar a mistura de padrões comerciais com rendimento de 100% de
extração. Optou-se por definir a mistura de solventes para a extração de lipídeos totais como
sendo MTBE:MeOH:água 4:2:2, pela baixa volatilidade do éter quando comparada com o éter
dietílico e igual eficiência.
Quando analisada o procedimento de extração usando a matriz biológica, observou-se
lipídeos totais de massa 2,3929 g, ou seja, um teor extrativo de 2% maior que o encontrado
para esse peixe na literatura (Inhamuns et al., 2009).
4.2.2 Extração de lipídeos totais dos peixes em estudo
Os valores de teor de lipídeos totais dos peixes em estudo se encontraram na faixa 0,4
– 3%, sendo os maiores valores apresentados para os peixes pacu e curimatã e valores
comuns para os demais peixes quando comparado com a literatura (Arbeláez-Rojas et al.,
2002; Blanchet et al., 2005; Almeida, et al., 2007; Almeida et al., 2008; Inhamuns et al.,
2009; Inhamuns e Franco, 2001).
Tabela 14. Rendimento percentual dos extratos de lipídeos totais (L.T.).
Peixe Extrato L.T.(g) Teor (%)
curimatã 11,062 1,8
pescada 3,370 0,6
sardinha 2,059 0,7
jaraqui 3,848 0,6
surubim 2,417 0,4
pacu 8,364 2,7
50
4.2.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos totais
A seguir se encontra a média das áreas resultantes das análises do padrão de éster
metílico do ácido nonandecanóico disposta em forma de tabela, onde se observa baixo erro
relativo para todas as concentrações.
Tabela 15. Áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do ácido
nonandecanóico.
Concentração (mg/mL) dia 1 dia 2 Media Desvio padrao Erro relativo (%)
0,125 241,5 244,5 243,0 2,16 0,89
0,1875 366,0 370,4 368,2 3,15 0,86
0,25 507,3 511,6 509,4 3,04 0,60
0,375 761,3 764,8 763,1 2,51 0,33
0,5 1035,4 1038 1037 1,94 0,19
0,75 1542,7 1550 1546 5,20 0,34
1 2051,4 2067 2059 10,82 0,52
A curva analítica do padrão interno obteve um bom coeficiente de linearidade, de
0,9999.
Gráfico 1. Curva analítica do fame C 19:0 em 7 concentrações.
Os padrões internos separados de seus respectivos lipídeos totais de peixes
apresentaram concentrações baixas em relação ao esperado de 1 mg/mL, indicando baixa
eficiência do método de extração de lipídeos totais. Porém como o processo de análise da
51
quantidade de padrão interno recuperado leva em consideração uma etapa de purificação,
considerou-se que o erro pode estar não no procedimento de extração de lipídeos totais e sim
no método em que se analisa esse padrão interno, ou seja, nesse processo de purificação, o
que pode não estar levando a uma extração total do cartucho de EFS, gerando um resultado
falso.
Tabela 16. Concentração e eficiência do método de extração de lipídeos totais.
Peixe área Conc (mg/mg) % eficiência
curimatã 327,2 0,164 16,43
pescada 920,3 0,450 44,96
sardinha 541,2 0,267 26,73
jaraqui 554,4 0,273 27,27
surubim 817,6 0,430 42,97
pacu 288,9 0,146 14,59
4.3 Separação em classes e de seus componentes
4.3.1 Desenvolvimento de metodologia para separação de classes de lipídeos
Segundo os dados resultantes da comparação do método Johnston com EFS dispostos
na tabela 17 pode-se afirmar que é possível separar diferentes classes de lipídeos pelo método
EFS com maior praticidade, pois a quantidade de amostra empregada é reduzida pela metade
e o volume de solvente é 20 vezes menor, porém observou-se que era necessário ainda fazer
modificações para resultar em máxima eficiência de extração e separação.
Tabela 17. Rendimento das frações obtidas para separação de lipídeos, comparando-se o
método de Johnston e EFS.
Classe Rendimento (%)
Coluna (Johnston) EFS
Lipídeos neutros 76,62 77,57
Glicolípideos 8,830 1,960
Fosfolípideos 8,850 2,340
Analisando-se a substituição do solvente clorofórmio por um solvente não-halogenado
para extração dos lipídeos neutros observou-se semelhante eficiência para os solventes
alternativos quando comparado com o clorofórmio, com apresentação de substâncias a mais
52
quando feito o uso de MTBE, isso foi possível verificar pelo monitoramento realizado por
CCD (Figura 19), que para tal foram testados vários sistemas de eluição e reveladores,
definindo-se por usar o sistema clorofórmio:metanol:água (75:22:3) e o revelador 10% sulfato
de cúprico em ácido fosfórico 8% aquoso.
Figura 19. Perfil cromatográfico por CCD dos lipídeos neutros de sardinha extraídos com
diferentes solventes: clorofórmio, éter dietílico e MTBE.
E ainda o experimento com MTBE produziu valor de rendimento levemente superior
que os demais solventes testados até mesmo quando comparado com clorofórmio, solvente
usado no método de Johnston, conforme descriminado na tabela 18.
Tabela 18. Frações da EFS comparando-se solventes não-organoclorados e clorofórmio.
Fração Rendimento (%)
Clorofórmio 97,20
Éter dietilico 95,24
MTBE 98,00
Quando comparadas a extração de fosfolípideos usando os solventes metanol ou etanol
em mistura com água, métodos EFS 5 e 6 respectivamente, observou-se semelhantes
resultados de rendimento e de perfil cromatográfico, conforme mostrado na Tabela 19 e
Figura 20.
CHCL3 éter MTBE
dietilíco
53
Tabela 19. Rendimento em percentual das classes de lipídeos dos métodos diferentes
testados.
Método Rendimento (%)
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
EFS 5 86,04 0,340 4,630
EFS 6 87,00 9,200 3,750
EFS 7 74,31 - 12,03
EFS 8 95,62 0,300 -
Os resultados favoreceram a escolha do solvente etanol por conter toxicidade
altamente reduzida quando comparado ao metanol. Já quando analisado o volume do cartucho
de eluição foi apresentado valores distintos, sendo maior rendimento de fosfolípideos usando
um cartucho com diâmetro maior, método EFS 7. E ainda verificando o uso deste método,
com outros óleos de peixes observou-se boa separação das classes de lipídeos com lipídeos
totais de sardinha, método EFS 8.
Figura 20. Perfil cromatográfico de EFS 7, 8, 5 e 6.1 representando a fração referente a
MTBE, EFS 7, 8, 5 e 6.2 a fração de acetona e EFS 7, 8, 5 e 6.3 a última fração.
4.3.2 Separação de classes de lipídeos dos peixes em estudo
Conforme nos mostra a Tabela 21 os lipídeos separados em suas classes apresentaram
diferenças para os lipídeos neutros entre os peixes com variações em seus valores de teores,
revelando a classe de lipídeos neutros como a classe marjoritária dos lipídeos totais,
representando uma faixa 67 – 97%. Esses resultados também nos mostraram que o surubim
quando comparado aos demais peixes em estudo obteve menor rendimento para os lipídeos
neutros que os demais, indicando que outras classes de lipídeos possuem contribuição mais
significativa para os lipídeos totais desse peixe que nos demais peixes.
7.1 8.1 5.1 6.1 7.2 8.2 5.2 6.2 7.3 8.3 5.3 6.3
54
Tabela 20. Rendimento em percentual de cada classe de lipídeos dos peixes em estudo.
Peixe Lipídeos neutros Glicolipídeos Fosfolipídeos
curimatã 92,90 1,68 5,62
pescada 93,24 0,740 3,858
sardinha 76,77 1,016 21,16
jaraqui 93,07 0,661 7,010
surubim 67,03 2,060 25,66
pacu 97,30 1,219 1,619
Já os valores de rendimento que representam a classe dos glicolipídeos foram variáveis
e em geral baixos, a ponto de não ser possível a pesagem para as amostras de dos peixes
pesca, jaraqui e pacu, indicando que a contribuição desta classe para os lipídeos que compõem
os peixes em estudo é pequena. Com relação aos fosfolipídeos também houve variação em
seus teores, com valores baixos em geral, com exceção para o peixe surubim, que apresentou
rendimento médio de 25,66% representando que os lipídeos deste peixe contêm uma
significativa contribuição de fosfolipídeos ou lipídeos de alta polaridade para seus lipídeos
totais.
4.4 Extração de lipídeos insaponificáveis
4.4.1 Verificação do método de extração de insaponificáveis
A fração hexânica extraída do tratamento resultante da reação de saponificação dos
lipídeos neutros de sardinha obteve perfil cromatográfico bom, onde foi possível observar,
comparando-se com o padrão comercial de colesterol (esteróide) e de α-tocoferol (tocol), a
presença somente de esteróides. O teor resultante foi de 6,5% com massa proveitosa para se
processar a reação de sililação (derivatização).
55
4.4.2 Extração de lipídeos insaponificáveis dos peixes em estudo
Os rendimentos das frações dos lipídeos insaponificaveis foram cerca de 4-9%, sendo
o maior valor para o peixe surubim e o menor para o curimatã. Quando comparado com a
literatura encontramos altos valores em relação aos peixes de água doce e valores próximos
aos correspondentes de tubarão (Belitz et al., 2004).
Tabela 21. Rendimentos percentuais dos lipídeos insaponificáveis dos peixes.
Peixe Rendimento (%)
curimatã 3,89
pescada 8,94
sardinha 7,85
jaraqui 4,92
surubim 9,16
pacu 5,55
4.4.3 Monitoramento da eficiência do método de extração de lipídeos insaponificáveis
A seguir se encontra as áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol disposta
em forma de tabela.
Tabela 22. Áreas resultantes das análises do padrão de β-sitosterol.
Concentração (mg/mL) Área
0,05 155,5
0,025 64,70
0,0125 25,90
0,00625 6,600
A curva analítica do padrão interno obteve um coeficiente de linearidade, de 0,9984.
56
Gráfico 2. Curva analítica do esteróide sitosterol em 4 concentrações.
O padrão interno quantificado na análise de esteróides dos peixes em estudo
apresentou uma variação de eficiência de 13 - 79 %.
Tabela 23. Quantidade em mg/mg de β-sitosterol nos lipídeos insaponificáveis dos peixes.
Peixe Real Esperado % eficiência
curimatã 0,001 0,009 12,65
pescada 0,002 0,004 53,8
sardinha 0,004 0,005 78,8
jaraqui 0,009 0,007 100,0
surubim 0,002 0,005 43,4
pacu 0,003 0,006 49,2
57
4.5 Preparação de amostras para análise de esteróides
4.5.1 Verificação do método de reação de sililação
Conforme perfil cromatográfico usando padrão comercial de colesterol e tocoferol
sililados (Figura 21) foi possível observar boa conversão tanto dos padrões quanto da
amostra do peixe sardinha como matriz teste.
Figura 21. Perfil cromatográfico, onde 1= material insaponificável sililado, 2= padrão de
colesterol e 3= tocoferol.
4.6 Análise de esteróides por cromatografia gasosa
4.6.1 Otimização da metodologia de análise de esteróides por cromatografia gasosa (CG-
DIC e CG-EM)
Os cromatogramas referentes ao desenvolvimento do método de análise de esteróides
se encontram descriminados a seguir.
1 2 3
58
RT: 0.00 - 30.67
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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65
70
75
80
85
90
95
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nd
an
ce
17.83
2.63 3.10 5.34 7.10 18.437.43 20.90 21.58 24.819.31 29.0727.0510.99 11.86 17.0115.13
NL:5.14E7
TIC MS tocoferol
Cromatograma 1. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição Hidalgo.
Partindo do primeiro método apresentado na tabela de otimização de métodos para
análise de esteróides observou-se ao se analisar uma mistura de colesterol e alfa-tocoferol que
tais padrões não se separavam entre si, o que poderia comprometer a quantificação de cada
substância se as contivessem nas amostras de peixe em estudo. Optou-se então por fazer a
última rampa de temperatura da programação de forno do equipamento mais lenta.
59
RT: 0.00 - 32.33
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
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lativ
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bu
nd
an
ce
19.34
19.45
19.8518.22 20.752.63 8.706.453.27 9.92 30.1322.94 29.2627.98 31.9226.2811.82 16.8712.944.96 14.26
NL:1.63E9
TIC MS col+toc_1
Cromatograma 2. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição ColToc1.
Foi possível observar uma leve separação nos constituintes da mistura, e buscando a
melhor resolução decidiu-se adicionar uma rampa na temperatura de 280°C.
RT: 12.89 - 21.06
13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
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nd
an
ce
17.94
17.58 18.38 18.9717.00 19.23 19.72 20.10 20.4415.98 16.7315.4514.52 15.1013.63 14.2712.94
NL:1.01E9
TIC MS col+toc_4
Cromatograma 3. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição ColToc4.
60
Porém, houve uma piora na resolução dos componentes. Optando-se por diminuir a
temperatura da rampa adicional em 10°C.
RT: 0.00 - 28.32
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
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65
70
75
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85
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95
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ce
19.68
19.54
19.0120.162.60 3.02 4.07 20.9518.276.31 28.267.08 22.8116.86 23.957.89 26.859.36 10.19 11.88 12.96 14.91
NL:4.24E8
TIC MS col+toc_6_120817150127
Cromatograma 4. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição ColToc 6.
Observou-se novamente uma leve separação dos componentes. Então, uma menor
temperatura na rampa adicional foi testada.
61
RT: 0.00 - 24.67
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
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nd
an
ce
21.53
21.28
20.53 21.922.67 3.07 22.673.96 19.625.51 6.32 7.43 8.43 17.609.36 10.19 11.89 13.03 16.7114.07 15.27
NL:4.90E8
TIC MS col+toc_11
Cromatograma 5. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição ColToc11.
Houve uma melhora na separação dos constituintes da mistura em teste, optando-se
para melhor resolução o retorno das duas rampas iniciais, porém mantendo uma condição
isoterma à 250 C.
RT: 0.00 - 50.70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lativ
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bu
nd
an
ce
25.85
25.12
23.78
22.644.98 28.216.31 50.6410.19 19.6011.96 48.2930.3615.11 46.0432.5817.72 43.7634.86 37.49
NL:4.77E9
TIC MS col+toc_23
Cromatograma 6. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição ColToc23.
62
Com boa separação do esteróide colesterol e do tocol α-tocoferol o método col+toc 23
com programação do forno do equipamento 120 ºC, mantendo por 2 min, subindo 15 ºC/min
até 250 ºC, mantendo por 30 min, subindo 5 ºC/min até 300ºC, analisado em espectrômetro de
massas foi escolhido como o melhor método para as análises de lipídeos insaponificáveis. Ao
ser analisada a mesma mistura no cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chamas
observou-se que a reprodução do método não era possível, visto que as dimensões da coluna
usada eram diferentes, então a otimização do método para o uso desse equipamento foi
necessária.
m i n0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
p A
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
F I D 2 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ E S T E R O ~ 1 \ C O L T O C _ 3 . D )
33.04
2 33
.670
36.62
3 37
.299
38.71
4
Cromatograma 7. Perfil cromatográfico do padrão de colesterol e tocoferol trimetilsililados
na condição Silil_II.
No geral as condições de métodos desenvolvidos revelaram que o melhor método
desenvolvido, com boa resolução de cromatograma, foi o ColToc 23 para o CG-EM e para o
CG- DIC foi o Silil_II.
α-tocoferol TMS
Colesterol TMS
63
Tabela 24. Observação da resolução dos cromatogramas obtidos durante o desenvolvimento
do método para análise de lipídeos insaponificáveis.
Método Tempo de retenção (min) Observação
TMS-colesterol TMS-tocoferol
Hidalgo 17,83 13,83 s/ resolução, 1 pico
col+toc 1 19,45 19,34 2 picos,não resolvidos
col+toc 4 17,94 17,94 s/ resolução, 1 pico
col+toc 6 19,68 19,54 2 picos,não resolvidos
col+toc 11 21,53 21,28 2 picos,não resolvidos
col+toc 23 25,85 25,12 2 picos, resolvidos
silil_ii 37,24 38,71 2 picos, resolvidos
O método escolhido para o CG-DIC consistiu do uso fluxo 2.1 mL/min, injeção no
modo split 2:1 a 280°C, com temperatura do forno iniciando em 120°C e mantendo essa
temperatura por 2 min, aumentando numa rampa de 15°C/min até 240°C, mantendo por 45
min, subindo 5°C/min até 300°C e mantendo por 3 min, usando coluna HP-5.
Foi possível verificar através da análise de uma mistura de padrões de esteróides a boa
separação no método desenvolvido para CG-DIC.
Cromatograma 8. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de
esteróides analisado nas condições do método Silil_II.
m i n0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F I D 2 B , ( B A N N Y \ S T E R O I D S . D )
33.69
1
37.18
3 44.32
8
45.79
9
49.03
4
55.06
6Colesterol TMS
Ergoesterol
TMS
Campesterol
TMS
Estigmaesterol
TMS Sitosterol
TMS
64
E também para o método desenvolvido para CG-EM.
RT: 0.00 - 50.66
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23.74
30.86
34.23
28.62
24.8331.343.60 6.31 34.757.42 50.6249.269.36 13.25 36.54 47.0415.07 44.6917.63 39.1621.31
NL:1.38E8
TIC MS steroids
Cromatograma 9. Perfil cromatográfico dos trimetilsililados padrões comerciais de
esteróides analisado nas condições do método ColToc 23.
E pela análise individual dos esteróides contidos na mistura usada para otimização do
método e através dos seus respectivos espectros de massas, o tempo de retenção desses
esteróides tanto no método desenvolvido para o CG-DIC quanto para o CG-EM (Anexo 1)
foram identificados.
Tabela 25. Identificação do tempo de retenção (min) de cada componente na mistura usada
para otimização do método de análise de esteróides.
Padrões CG-DIC CG-EM
colesterol TMS 37,183 24,83
ergoesterol TMS 44,328 28,62
campesterol tms 45,799 29,73
estigmasterol tms 49,066 30,86
sitosterolTMS 55,066 34,23
Colesterol TMS
Ergoesterol TMS
Campesterol TMS
Estigmaesterol TMS
Sitosterol TMS
65
4.6.1 Análise qualitativa dos esteróides dos peixes em estudo por CG-EM
Observou-se a presença de colesterol, campesterol e do sitosterol, apresentando
identificação por espectrometria de massas coerentes. Como exemplo de como foi possível
obter tais resultados, temos o cromatograma de esteróides do peixe curimatã.
RT: 0.00 - 50.66
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
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8.6724.97
8.43
5.29
9.729.80
10.77
6.663.30
10.95
11.93
13.2715.09
29.4916.33 49.0446.7721.38 34.2126.64 29.80 43.5739.2134.71
NL:8.84E7
TIC MS 1tms_1
Cromatograma 10. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
curimatã por CG-EM.
Cada pico a partir de 23 min, corresponde a um esteróide (derivatizado) e seus
respectivos tempos de retenção foram comparados com o tempo de retenção da mistura de
padrões disponíveis de esteróides resultantes de análises por GC-EM. E também seus
espectros de massas gerados para cada pico foram comparados com a biblioteca de espectros
disponível, bem como a coerência dos fragmentos padrões de esteróides sililados foi
analisada. Exemplicando, temos o pico no tempo de retenção do cromatograma 10, em
24,95 min.
66
1tms_2 #874 RT: 24.95 AV: 1 NL: 3.99E7T: + c Full ms [40.00-800.00]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
m/z
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368.12
128.95
329.55
144.96
159.00 457.82118.9872.99
212.98247.37
254.41173.35 443.48275.53
429.92 550.78503.84 624.69 789.19744.30707.47667.05
Espectro 1. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de
lipídeos neutros do peixe curimatã.
O seu espectro de massas, espectro 1, apresentou os sinais de fragmentos em m/z
368,12 e 129, bem como a presença do fragmento em sinal m/z 73, característico de
esteróides sililados e o íon molecular em sinal de m/z 458, confirmando o tamanho da cadeia,
sendo este referente ao espectro do colesterol.
A seguir se encontram os cromatogramas referentes as amostras sililadas dos peixes
em estudo.
67
RT: 0.00 - 50.70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
0
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5.34
6.77
10.2524.94
9.22 10.413.33 15.28 47.7912.49 19.09 23.66 45.8842.9725.63 29.39 34.2331.61 41.8336.25
NL:5.50E8
TIC MS 2tms_1
Cromatograma 11. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
pescada.
Na amostra do peixe pescada (cromatograma 11) é visível a presença do pico em
24,94 min, referente ao colesterol, se sobresaindo na área do cromatograma relacionada aos
esteróides.
68
RT: 0.00 - 50.68
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
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24.98
8.43
9.55
9.71
5.27
2.9510.31
5.56 10.75 12.4523.6814.91 49.7547.6725.6316.51 19.70 46.6929.54 34.2833.07 43.5736.67 38.74
NL:9.60E7
TIC MS 3tms_1
Cromatograma 12. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
sardinha.
Na amostra do peixe sardinha (cromatograma 12) o pico em 24,98 min, referente ao
colesterol, também se sobresai na área do cromatograma relacionada aos esteróides.
69
RT: 0.00 - 50.67
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
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8.685.28
9.71
8.42 24.98
10.32
10.74
5.0310.92
8.29 16.29 23.6512.46 29.3817.91 34.19 50.3129.0023.41 48.8729.90 47.0134.55 43.5138.10
NL:2.43E8
TIC MS 4tms_2
Cromatograma 13. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
jaraqui.
Já no peixe jaraqui (cromatograma 13), além do colesterol, outro pico se sobresai na
região é 29,38 min, que refere ao campesterol.
70
RT: 0.00 - 50.69
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
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5.32
24.96
10.24
4.95 10.409.19
8.6423.6815.2613.06 16.31 50.3317.93 49.2725.78 29.42 46.1131.02 34.25 36.79 43.8138.82
NL:2.35E8
TIC MS 5tms_1
Cromatograma 14. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
surubim.
O peixe surubim tem como destacado na região de esteróides a presença de colesterol,
pico em 24,96 min (cromatograma 14).
71
RT: 0.00 - 50.70
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Time (min)
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5.28 9.72
9.57
24.938.44
2.76
10.923.32
5.56 12.4513.06 16.31 23.67
50.3649.3125.4417.30 47.0234.2727.58 30.36 44.6935.28 39.04
NL:7.98E7
TIC MS 6tms_1
Cromatograma 15. Perfil cromatográfico dos esteróides trimetilsililados analisados no peixe
pacu.
Assim como o peixe pacu também (cromatograma 15).
O tempo de retenção obtido para os esteróides identificados nas amostras de peixes
por espectrometria de massas foi similar ao disposto na mistura de padrões comerciais no
desenvolvimento do método de análise, o que possibilitou usar o tempo de retenção como
parâmetro de identificação de esteróides (tabela 26) além das análises dos espectros de
massas.
Tabela 26. Identificação pelo tempo de retenção (min) de esteróides nos peixes estudado.
Padrões Peixes
curimatã pescada sardinha jaraqui surubim pacu
Colesterol TMS 24,95 24,94 24,98 24,87 24,91 24,88
Campesterol TMS 29,37 29,39 29,51 29,38 29,42 29,49
Β-sitosterol TMS 34,21 34,23 34,28 34,16 34,25 34,27
72
4.6.2 Análise quantitativa dos esteróides dos peixes em estudo por CG-DIC
A curva analítica usada do padrão interno foi a mesma do ítem 4.4.3. E através dessa
curva foi possível quantificar os esteróides nos peixes em estudo, onde foi observado a
presença de colesterol e campesterol, sendo o colesterol, em quantidade de mg/g (tabela 27),
o componente marjoritário em todos os peixes analisados, com a maior quantidade para a
sardinha e o surubim e a menor para o curimatã.
Tabela 27. Quantidade em mg de esteróides/g de peixe.
Esteróides Peixes
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
colesterol 15,067 171,385 324,923 195,231 282,462 79,846
campesterol 2,133 2,000 2,923 21,231 4,462 2,000
β-sitosterol 1,067 2,154 3,692 8,769 1,846 2,615
total 18,267 175,538 331,538 225,231 288,769 84,462
Esse resultado é melhor observado quando analisamos o teor em percentual de cada
esteróide em relação a massa inicial de peixe utilizada, onde os peixes sardinha e surubim
apresentaram valores de 32 e 28%, respectivamente, e o curimatã de 1,5% (tabela 28).
Tabela 28. Percentual de esteróides por grama de peixe.
Esteróides Peixes
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
colesterol 1,507 17,138 32,492 19,523 28,246 7,985
campesterol 0,213 0,200 0,292 2,123 0,446 0,200
β-sitosterol 0,107 0,215 0,369 0,877 0,185 0,262
total 1,827 17,554 33,154 22,523 28,877 8,446
No geral a relação percentual total dos esteróides nos peixes foram na faixa de 2-33%,
valores esses maiores que aqueles encontrados em plantas (Belitz et al., 2004).
73
4.7 Preparação de amostra para análise da cadeia graxa
4.7.1 Otimização da metodologia de derivatização de ácidos graxos em seus ésteres
metílicos
Para otimização do método de derivatização de ácidos graxos foram obtidos
rendimentos diferenciados para as condições testadas, conforme tabela 29, onde se
observaram valores acima de 85% para os experimentos Barbosa et al. (2009), Exp. II, Exp.
III, Exp. VII, Exp. Exp. VIII, Exp. X e Exp. XIII; o que necessariamente não indicam que
estes experimentos obtiveram melhores resultados, visto que não representam somente o
produto desejado quando analisados por CCD.
Tabela 29. Rendimento em percentual para a reação de derivatização.
Método Rendimento da reação (%)
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
Barbosa et al. 2009 85,0 100,0 9,6
exp. I 83,2 6,7 2,62
exp. II 44,73 100,0 26,13
exp. III 100,0 - -
exp. IV - - -
exp. VI 82,6 18,0 28,0
exp. VII 100,0 - -
exp. VIII 93,03 - -
exp. IX 76,6 - -
exp. X 94,12 - -
exp. XI 72,2 - -
exp. XIII 85,4 - -
exp. XIV 79,2 - -
exp. XV 65,4 - -
exp. XVI 73,4 - -
exp. XVII 69,6 - -
exp. XVIII 76,6 - -
exp. XIX 76,2 - -
exp XX 77,8 0,0 0,0
Analisando os produtos da reação de derivatização em cada condição testada por
CCD, mostrados na tabela 30, foi possível identificar através de comparação com padrões
comerciais de diferentes lipídeos quase todos os resíduos de classe que não estavam obtendo
sucesso em conversão de ácidos graxos em seus respectivos ésteres metílicos, dentro de cada
74
experimento analisando assim qual a etapa da reação deveria ser modificada e qual a melhor
condição de cada etapa.
Tabela 30. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de
filtrados por fase sólida.
Método Componentes por CCD
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
Barbosa et al. 2009 EMAG+TAG MP EMAG
exp. I EMAG+TAG MP EMAG+AP
exp. II EMAG+TAG+DAG+colest. MP AP
exp. III - - -
exp. IV - - -
exp. VI EMAG+MAG+colest. EMAG+AP EMAG+AP
exp. VII EMAG+TAG+AP - -
exp. VIII EMAG+TAG+AP - -
exp. IX EMAG+TAG+colesterol - -
exp. X EMAG+TAG+colest+AP - -
exp. XI EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XIII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XIV EMAG+colest+DAG+AP - -
exp. XV EMAG+FFA+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XVI EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XVII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XVIII EMAG+TAG+colest+DAG+AP - -
exp. XIX EMAG+colest+AP - -
exp. XX EMAG+colest EMAG+AP EMAG+AP
Quando analisamos a tabela 30, observamos que os experimentos onde se testava a
concentração do catalisador na etapa de transesterificação na primeira etapa de reação, que
são os métodos Barbosa et al. 2009 (0,2 M), Exp. VI (0,3 M), Exp. XI (0,5 M), Exp. X (0,7
M), Exp XVI (1 M), e Exp. II (5 M) apresentaram presença de ésteres metílicos de ácidos
graxos, mas também a presença de triacilglicerídeo e diacilglicerídeo, estes dois últimos em
menor concentração, em relação aos ésteres, a medida que se aumentava a concentração do
catalisador até 0,7 M, sendo observado em concentração maior que essa o surgimento
novamente de triacilglicerídeo e diacilglicerídeo. Em todos os experimentos observou-se a
presença de esteróides e componentes de polaridade alta que podem ser componentes que
assim como os esteróides não contenham cadeias graxas e, portanto não reagirão no processo
de transesterificação e esterificação.
75
Comparando a eficiência do trifluoreto de boro com o cloreto de amônia como
reagentes esterificantes nos experimentos Barbosa et al. 2009 (BF3) e Exp. I (NH4Cl),
observou-se resultados semelhantes para todas as classes de lipídeos testadas, não
apresentando ácido graxo livre nas análise por CCD (tabela 30), indicando a conversão
destes em seus respectivos éster metilicos. Testando a via de reação com relação ao solvente
durante os processos, observou-se melhor resultado para aquela com uso abundante do álcool
metanol (exp. XIX), como já conhecido na literatura, onde para haver a reação de
transesterificação ou a de esterificação é necessária a presença de um álcool de preferência de
cadeia curta, pois este age como nucleófilo; as demais com uso de DMSO, um solvente
aprótico a fim de favorecer a reação do tipo SN1 não obteve reação favorável nem quando
adicionado metanol no meio (Exp. XVIII) nem quando somente com o metanol do reagente
de transesterificação (Exp. XVII), que é 30% em metanol, apresentando estes dois últimos
experimentos a presença marjoritária de TG, DG e pouca quantidade em relação a esses
componentes de ésteres metílicos de ácidos graxos.
Concordando que a melhor via é a metílica para a reação de transesterificação testou-
se a adição desse álcool em etapas, distribuído com o catalisador no processo de reação.
Quando feita em duas partes iguais a adição de metanol (Exp. VII) observou-se semelhante
resultado comparando com a adição feita em uma única etapa (Exp. VI), mesmo quando
aumentada a concentração do catalisador na reação (Exp.X e XIX). Quando a adição em duas
partes de álcool com a segunda sendo de maior volume houve semelhança nos resultados
também (Exp. VIII e Exp. I).
Analisando se o tipo de reação convencional, transesterificação seguida de
esterificação, seria a mais apropriada, observou-se através da comparação do experimento IV
com o exp. VI que apenas o uso de uma única reação, a transesterificação, seria inviável e que
a reação de esterificação como primeira etapa poderia ser feita (Exp. XIII), mas esta não
apresentou resultados satisfatórios (Exp. XIV) quando comparada com a reação convencional
(Exp. VI).
Diante do perfil cromatográfico por CCD dos experimentos discutidos acima, obteve-
se melhores resultados para os experimentos XIX e XX, os quais foram oriundos dos
experimentos anteriores à eles testados e entre si comparavam-se a temperatura envolvida nas
etapas de transesterificação e esterificação, sendo o experimento com a temperatura de 50°C o
melhor sucedido e escolhido para aplicação nas amostras de peixes.
76
Tabela 31. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de
filtrados por fase sólida.
Método Rend. Tratamento (%)
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
Barbosa et al. 2009 64,0 sem massa sem massa
Exp. I 76,6 sem massa sem massa
Exp. II - sem massa sem massa
Exp. III 100,0 - -
Exp. IV - - -
Exp. VI 64,4 2,2 4,8
Exp. VII 68,8 - -
Exp. VIII 73,8 - -
Exp. IX 51,8 - -
Exp. X 72,2 - -
Exp. XI 46,6 - -
Exp. XIII 2,63 - -
exp. XIV - - -
exp. XV 48,6 - -
exp. XVI 52,2 - -
exp. XVII 52,8 - -
exp. XVIII 57,4 - -
exp. XIX 69,4 - -
exp. XX 67,8 0,0 0,0
Com relação aos rendimentos reais das reações testadas (tabela 31), isto é depois de
filtrados em extrator por fase sólida obtendo somente os ésteres metílicos, produto da reação,
apresentou valor de 68% para o experimento com melhor resultado verificado por CCD (exp.
XX).
4.7.2 Aplicação do método otimizado nos lipídeos dos peixes em estudo
Os rendimentos (tabela 32) para a derivatização dos peixes em estudos foram
satisfatórios para todas as classes com valores acima de 50%, com exceção para a amostra de
fosfolipídeo de sardinha e surubim.
77
Tabela 32. Rendimento real em percentual para a reação de derivatização depois de filtrados
por fase sólida.
Peixe Rendimento (%) depois de EFS
Lip. Neutros Glicolip. Fosfolip.
curimatã 64,00 100,00 85,18
pescada 71,17 89,19 55,88
sardinha 72,82 100,00 15,60
jaraqui 71,19 100,00 74,45
surubim 58,66 100,00 30,20
pacu 64,53 60,66 97,22
4.7.3 Monitoramento da eficiência das etapas envolvidas para análise dos lipídeos
neutros
A seguir se encontram as áreas resultantes das análises do padrão de éster metílico do
ácido nonandecanóico disposta na tabela 33.
Tabela 33. Áreas resultantes das análises do padrão de EMAG C 19:0.
conc (mg/ml) área
dia 1 dia 2 dia 3 media desvio padrão erro relativo (%)
0,00625 10,0 9,0 9,1 9,367 0,551 5,880
0,0125 20,4 19,9 18,0 19,433 1,266 6,516
0,025 41,0 41,1 38,1 40,067 1,704 4,253
0,05 83,2 87,6 78,9 83,233 4,350 5,226
0,1 170,0 179,0 166,7 171,900 6,366 3,704
1 1685,7 1807,3 1702,2 1731,733 65,961 3,809
A curva analítica do padrão interno obteve um bom coeficiente de linearidade, de
0,9998.
78
Gráfico 3. Curva analítica do EMAG C19:0 em 5 concentrações.
O padrão interno quantificado na análise de ácidos graxos dos lipídeos neutros dos
peixes em estudo apresentou uma variação de eficiência de 38 - 89%.
Tabela 34. Quantidade em mg/mg de EMAG C 19:0 nos lipídeos neutros dos peixes.
Peixe área conc conc esperada % eficiência
curimatã 14,7 0,0099 0,0174 57,126
pescada 45,1 0,0274 0,0570 48,115
sardinha 28,0 0,0176 0,0466 37,705
jaraqui 30,8 0,0192 0,0499 38,465
surubim 120,0 0,0705 0,0793 88,882
pacu 10,4 0,0074 0,0115 64,888
79
4.7 Análise da composição da cadeia graxa por cromatografia gasosa
4.8.1 Otimização da metodologia da análise da cadeia graxa por cromatografia gasosa
(CG-DIC e CG- EM)
Na tentativa de se desenvolver um método o primeiro cromatograma como resultado
apresentou algumas regiões não resolvidas.
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
3
4
5
6
FID1 A, (BANNY\BB1.D)
3.4
91
4.6
16
5.8
32
5.9
37
7.5
94
10.
051
13.
254
13.
851
19.
840
27.
379
29.
406
64.
314
65.
329
65.
871
69.
201
69.
802
70.
422
71.
100
71.
168
71.
357
71.
906
73.
920
74.
167
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
3
4
5
6
FID2 B, (BANNY\BB1.D)
2.4
03
3.0
59
3.9
28
4.9
85
5.5
94
6.1
84
7.7
09
9.8
77
10.
869
13.
039
17.
742
19.
155
24.
797
65.
781
66.
114
66.
848
69.
018
69.
588
71.
970
72.
269
73.
811
Cromatograma 16. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB1.
No decorrer da primeira análise na coluna apolar (cromatograma 16 A), obteve-se em
geral boa separação de picos, com exceção dos picos depois de 60 min. Então na análise
seguinte o objetivo foi aumentar o tempo em que sai os picos mal resolvidos, através da
rampa de temperatura e reduzir o tempo entre 20 e 60 min aproveitando mais o espaço do
cromatograma. O perfil cromatográfico no cromatograma B confirmou o cromatograma A,
onde foi possível observar regiões do cromatograma semelhantes, diferenciando somente pela
ordem de interações entre a amostra e a fase.
A
B
80
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID1 A, (BANNY\BB2.D)
2.8
92
3.8
74
5.1
12
6.4
11 6
.521
8.1
74
10.
569
13.
653
14.
228
19.
960
27.
131
29.
040
40.
799
44.
118 4
4.45
8
44.
781
44.
906
45.
590
46.
115
46.
386
48.
608
49.
185
49.
685
50.
310
50.
479
50.
964 5
2.96
7
53.
270
54.
274
54.
750
56.
384
57.
526
57.
911
59.
890
62.
443
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID2 B, (BANNY\BB2.D)
2.6
19
3.3
70
4.3
40
5.4
89
6.1
38
6.7
58
8.2
64
10.
369
11.
329 1
3.41
7
17.
921
19.
266
24.
645
36.
522
38.
184
40.
497
42.
772
44.
816
45.
179 46.
391
46.
628
47.
060
48.
019
48.
613
48.
969
49.
091
51.
070 5
1.38
5
52.
077
52.
887
54.
295
54.
530
54.
697
54.
837
56.
334
59.
134
60.
253
63.
245
Cromatograma 17. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB2.
Os picos do perfil cromatográfico antes mal resolvidos, foram separados em mais
regiões distintas, depois de 45 min e o espaço de tempo do cromatograma foi melhor
aproveitado, ou seja, os picos foram mais distribuídos ao longo do cromatograma quando
comparado com o cromatograma anterior. E apesar de ter melhorado em relação à primeira
análise, a primeira região mal resolvida continuou demonstrando a necessidade de uma
melhor resolução.
A
B
81
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID1 A, (BANNY\BB3.D)
3.5
32
4.4
95
5.7
04
7.1
24
7.2
61
9.5
21
12.
956
13.
569
17.
494
18.
328
26.
772
32.
462
32.
817
33.
814
38.
748
41.
406
41.
690
41.
977
42.
108
42.
752
43.
346
43.
630
46.
220
47.
061
47.
682
48.
405 4
8.48
9
48.
703
49.
342
52.
221
52.
731
54.
196
54.
909
57.
456
59.
275
59.
890
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID2 B, (BANNY\BB3.D)
2.1
27
3.2
43
3.9
83
4.9
31
6.0
61
6.7
77
7.5
37
9.6
03
12.
594
13.
999
17.
020
23.
632 2
5.62
6
31.
082 3
6.16
1
36.
850
36.
990
37.
214
37.
443
38.
679
38.
965
40.
184
42.
022
42.
404
43.
614
43.
951
44.
416
45.
567 4
6.33
6
46.
672
46.
959
49.
465
49.
954
52.
075
54.
538
54.
846
55.
022
57.
426
60.
604
63.
733
Cromatograma 18. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB3.
Nas condições do método BB3, os perfis cromatográficos, antes mal resolvidos, foram
obtidos na região entre 40 e 60 min., na coluna apolar e entre 35 e 60 min. na coluna polar,
com melhor resolução. Porém ainda insuficiente e foi verificada a necessidade de uma melhor
resolução.
A
B
82
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID1 A, (BANNY\BB4.D)
3.5
32
4.4
95
5.7
04
7.1
25
7.2
61
9.5
23
12.
960
13.
567 1
7.02
5
17.
644
22.
551
26.
335
26.
603
27.
413
32.
121
35.
082
35.
414
35.
731
35.
891
36.
643
37.
371
37.
718
40.
979
42.
063
42.
880
43.
853 4
3.96
5
44.
256
45.
130 4
9.10
7
49.
767
51.
888
52.
931
56.
615
59.
242
60.
167
min0 10 20 30 40 50 60 70
pA
2
4
6
8
10
12
FID2 B, (BANNY\BB4.D)
2.6
67 3
.243
3.9
83
4.9
31
6.0
61
6.7
77
7.5
36
9.6
03
12.
595
13.
997
16.
652
20.
966
22.
016
22.
846
25.
308
29.
575
30.
272
30.
383
30.
613
30.
851
32.
128
32.
403
33.
706
35.
822
36.
264
37.
716
38.
136
38.
699
40.
152 41.
125
41.
563
41.
936
45.
285
45.
936
48.
874
52.
370
52.
712
53.
024
Cromatograma 19. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB4.
Nas condições do método BB4, os picos dos perfis cromatográficos antes mal
resolvidos foram obtidos na região entre 35 e 45 min na coluna apolar e entre 30 e 40 min na
coluna polar, com uma resolução melhorada. Entretanto ainda foi verificada a necessidade de
aumentar a separação, aumentando o tempo de análise na rampa em que se encontra essa
região do decorrer da análise posterior.
min0 20 40 60 80 100
pA
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
FID1 A, (BANNY\BB5.D)
5.6
35
7.2
26
9.5
75
12.
556
13.
079
17.
709
21.
986
22.
337
23.
379
29.
879
34.
268
34.
832 3
5.63
4
36.
929
38.
020
38.
608
44.
259
45.
787
47.
318
49.
423
49.
975
51.
689 5
9.08
3
59.
750
64.
156
66.
344
73.
442
78.
334
min0 20 40 60 80 100
pA
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
20
22.5
FID2 B, (BANNY\BB5.D)
4.7
19
5.2
95
5.8
55
7.3
04
9.3
57
10.
304
12.
308
16.
147
17.
184
17.
985
20.
832
26.
264
27.
160
27.
656 2
7.97
1
29.
747
32.
248
35.
427
36.
127
38.
611
39.
173
40.
142
42.
489 44.
079
45.
183
51.
792
52.
785
58.
400
65.
002
66.
003
Cromatograma 20. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB5.
A
B
83
No método BB5, houve um aumento do tempo total de análise sem uma significante
melhora na resolução mesmo com uma rampa final lenta. Então optou-se por diminuir a
temperatura da ultima rampa seguida por outra rampa rápida final.
min0 5 10 15 20 25 30 35
pA
10
20
30
40
50
60
FID1 A, (BANNY\BB8.D)
2.0
66
2.7
90
3.3
08
3.5
75
3.8
86
4.0
76
4.2
79
4.3
65
4.4
80
4.7
18
5.1
61
5.5
28 5.6
29
5.7
88
6.0
35
6.7
16
7.2
20
7.5
48
7.7
70
8.7
64
9.5
74
9.9
72 1
2.13
3
12.
490
13.
235
15.
084
16.
913
17.
036
17.
408
18.
244
19.
524
20.
891
21.
051
21.
211
21.
292
21.
682
21.
883
22.
100
22.
299
22.
972
23.
258
24.
497
25.
423
26.
117
27.
046
27.
132
27.
428
28.
329
32.
718
33.
016
33.
253
33.
514
34.
565
34.
967
35.
729
36.
587
38.
070
38.
444
39.
548
min0 5 10 15 20 25 30 35
pA
10
20
30
40
50
60
FID2 B, (BANNY\BB8.D)
2.0
28
2.7
56 2
.899
3.2
36
3.7
03
4.0
04
4.4
78
4.7
00
5.1
40
5.2
80
5.4
54
5.8
44
5.9
84
6.3
60
6.8
39
7.2
97
7.9
99
9.3
57
10.
296
11.
950
14.
318
14.
855
15.
273
16.
462
18.
438
18.
789
18.
909
19.
021
19.
595
19.
696
20.
274
21.
322
21.
549
21.
999
22.
359
22.
650
23.
000
23.
996
24.
738
25.
046
25.
403
28.
577 29.
341
32.
525
32.
952
33.
476
33.
808
34.
361
34.
931
35.
312
35.
547
35.
778
36.
171
38.
931
Cromatograma 21. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB8.
Ainda com uma rampa adicional não obteve-se boa resolução, então diminui-se a
temperatura da rampa da região problemática (depois dos 16 min na coluna polar) e uma
isoterma depois dessa rampa, mantendo uma rampa rápida no final, para ser trabalhada
depois.
A
B
84
min0 5 10 15 20 25 30 35
pA
10
20
30
40
50
60
FID1 A, (BANNY\BB9.D)
2.2
13
3.0
74
3.1
49
3.3
09
3.5
73
3.6
90
3.8
15
4.0
78
4.1
82
4.2
79
4.3
67
4.4
90
4.6
33
4.7
23
5.1
87
5.5
30 5.6
31
5.7
93
6.1
08
6.6
40
7.0
49
7.2
99
7.4
59
8.1
09
8.5
77
8.7
98
9.9
62
10.
158
10.
391
10.
612
10.
834
10.
980
11.
361
11.
751
13.
201
13.
308
13.
653
14.
577
16.
266
18.
255
18.
455
18.
642
18.
737
19.
172
19.
608
19.
806
20.
421
20.
672
21.
603
22.
215
22.
628
23.
162
23.
313
23.
729
25.
637
25.
820
25.
984
26.
107
26.
612
26.
692
26.
930
27.
388
29.
018
min0 5 10 15 20 25 30 35
pA
10
20
30
40
50
60
FID2 B, (BANNY\BB9.D)
2.1
80
2.9
04
3.0
06
3.0
45
3.1
21
3.7
06
4.0
88
4.2
67
4.5
28
4.7
01
5.1
57
5.2
83
5.4
58
5.6
35
5.8
45
5.9
82
6.3
30
7.1
08
7.6
29
8.4
61
8.9
67
9.8
61
11.
276
11.
630
11.
951
12.
815
14.
821
15.
282
15.
430
15.
588
16.
424
17.
434
18.
777
19.
037
19.
869
20.
137
20.
448
21.
244 21.
774
21.
970
22.
211 2
3.85
4
24.
191
24.
494
25.
019
25.
578
25.
858
26.
117
26.
323
26.
622
26.
956
27.
171
27.
385
27.
488
28.
971
Cromatograma 22. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna apolar (A) e polar (B) nas condições do método BB9.
Várias tentativas modificando somente rampas de temperaturas foram realizadas e
decidiu-se de a partir do método BB9 continuar a desenvolver o método no cromatográfo
gasoso com espectrometria de massas a fim de se identificar por espectrometria de massas se
todos os padrões da mistura estavam sendo separados, e todos os ácidos graxos da mistura
foram identificados, com dificuldade somente na série de 18 carbonos e 20 carbonos, regiões
problemas do método.
85
RT: 0,00 - 37,42
0 5 10 15 20 25 30 35
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
7,15
8,52
9,935,87 11,73
4,74
15,51
12,95
27,67
15,0431,1329,17
2,93 27,30
24,9622,1615,86
22,70
17,84
37,1221,68 25,31 36,2734,06
24,7220,23
NL:6,82E8
TIC MS data_110305131908
Cromatograma 23. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB11.
No método BB11 observaram-se poucas mudanças no cromatograma quando
comparado com o método BB9, possuindo ainda regiões mal resolvidas, indicando que um
aumento de 5 min na isoterma do método não é o sufiente. Por isso decidiu-se mudar
brucamente o método iniciando com uma temperatura 60°C inferior, com uma rampa rápida
até a temperatura que corresponderiam às regiões problemas e mantendo uma isoterma curta.
86
RT: 0.00 - 35.52
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
7.35
7.66
7.95
8.63
9.47
10.57
22.1612.58
12.09 23.786.732.59 14.23 28.9825.8617.95
18.296.0919.83
17.26
31.602.7435.435.40
15.49
NL:1.96E9
TIC MS bb32
Cromatograma 24. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método BB32.
Ainda assim não observou-se significativa melhora na resolução das séries de ácidos
graxos de 18 carbonos e 20. De volta ao CG-DIC continuou-se o desenvolvimento do método,
com o uso de uma coluna de 60 m especifica para ácidos graxos, com rampas simples e
isotermas de curto tempo no final da análise para garantir que compostos não ficariam retidos
na coluna, prejudicando-a e comprometendo análises posteriores.
m i n5 7 . 5 1 0 1 2 . 5 1 5 1 7 . 5 2 0 2 2 . 5
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
F I D 1 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 1 8 . D )
2.796
2.876
2.969
3.042
3.104
3.210
3.248
3.335
3.555 3.896 4.3
54 4.6
72 4.9
40 5.3
22 5.6
56 5.9
47
6.489
7.412
7.751
7.815
8.397
9.416 9.7
07
10.15
3 10
.446 11.47
4 11
.737
11.78
7 11.87
8
12.28
4 12.58
2
13.35
6 13
.494
13.85
0 14
.128
14.20
1 14
.320
14.96
1 15
.348
15.45
9 15.90
5 17.16
0 17.69
1
19.39
8
21.18
2
22.15
3
22.91
5 23
.171
Cromatograma 25. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX18.
87
Como não observou-se melhora significativa, decidiu-se por realizar rampas lentas a
fim de se aumentar o tempo em que os componentes ficavam retidos na coluna, buscando
melhor separação.
m i n5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0
p A
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
F I D 1 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 3 9 . D )
4.935
5.097
5.280
5.626
7.991
9.037
9.689
10.24
7 10
.723
11.58
1
12.99
2 13
.498 13
.595
14.47
9
16.11
9 16
.619
17.96
0
20.06
3 20
.631
20.73
7 20
.936
21.82
3 22
.487
24.18
0 24
.491
25.28
0 25
.814 25.87
9 26
.026
26.28
3
27.64
0
28.47
8 28
.662 29
.554 32
.088 33.05
8
36.09
2
40.45
7
41.67
8 42
.068
Cromatograma 26. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX39.
Ainda não resolvidas as regiões problemas, optou-se por uma condição de uma única
rampa lenta 0,5°C/min.
m i n6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 1 0 0 1 0 5 1 1 0
p A
1 . 5
2
2 . 5
3
3 . 5
4
4 . 5
5
F I D 1 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 6 4 . D )
69.04
0
150.0
34 15
0.892
Cromatograma 27. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX64.
88
Foi possível observar a separação dos ácidos graxos da série de 18 carbonos
monoinsaturados em quatro picos (em torno de 70 min) e também o desdobramento do que
era antes dos picos em quatro em torno de 80 min (referentes ao ácido conjugado linoléico,
indicado pelo fabricante como uma mistura de dois). Porém, como demanda um tempo de
análise grande e outras regioes precisavam ainda serem melhores resolvidas outras condiçoes
foram testadas. Não obtendo resultados satisfatorios somados a dúvida a respeito da
identidade dos picos maus resolvidos e se os mesmos eram isômeros que não poderiam ser
separados na coluna usada na análise, utilizou-se o CG-EM para identificar os componentes
em condições diferentes, observando a identificação com probabilidade maior a medida que
os picos eram melhores separados.
m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 4 A .D )
3.9
80
8.5
36
9.4
38
12
.00
0
15
.66
9
17
.35
2
20
.43
6
27
.00
3
29
.07
4
31
.58
8
36
.45
3
46
.07
1
50
.13
0
53
.01
3 5
3.5
25
54
.43
0 5
5.4
75
61
.07
2
65
.20
5
67
.22
4 71
.45
9 7
2.0
58
72
.37
1 7
2.8
88
77
.06
2
82
.07
7 8
2.9
65
86
.52
5
90
.60
0 9
1.4
93
m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 5 A .D )
3.9
80
8.3
51
14
.45
4
15
.96
9
18
.88
8
25
.29
0
27
.33
7
29
.85
4
34
.59
8
48
.14
9
50
.74
7 5
1.1
06
51
.70
6 5
2.3
45
55
.14
3
57
.65
8
59
.19
0
63
.33
7 6
4.0
61
64
.40
6 6
4.9
67
69
.14
5
74
.16
3 7
5.0
68
78
.63
3
82
.73
4 8
3.6
35
m in0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 1 6 A .D )
3.9
78
8.5
29
11
.99
2
15
.65
9
17
.34
2 20
.42
5
26
.98
8
29
.05
9
31
.56
7
35
.76
5 3
6.4
37
50
.11
1
52
.98
9 5
3.5
02
54
.41
0 5
5.4
53
61
.05
3
65
.19
6
67
.21
5
71
.76
3 7
2.4
63
72
.83
1 7
3.4
41
78
.12
2
83
.52
6 8
4.4
58
88
.22
0
92
.46
1 9
3.3
74
Cromatograma 28. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 14A.
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 2 8 A .D )
5.7
69 7
.07
9
9.0
15
11
.87
2 1
3.3
19
16
.08
1
22
.26
7
24
.27
1
26
.78
1
31
.34
6
44
.63
7
47
.50
7 4
7.9
89
48
.86
6 4
9.9
05
55
.81
8
62
.33
4
64
.10
6
65
.74
6 67
.12
2 6
7.5
63
68
.16
3
71
.28
5
76
.16
0 7
7.1
51
81
.00
9
85
.41
6 8
6.3
82
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 0 A .D )
5.7
62
6.4
14 7
.07
1
9.0
05
11
.86
1 1
3.3
07
16
.06
9
22
.25
2
24
.25
6
31
.32
9
44
.61
9
47
.48
3 4
7.9
68
48
.84
5 4
9.8
80
55
.78
8
62
.50
7
64
.84
3
72
.22
0 7
3.4
01
73
.99
0 7
4.9
64
81
.46
2
88
.11
2 8
9.1
95
94
.45
4
99
.21
4 1
00
.04
8
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 1 A .D )
5.7
49
6.4
01
7.0
55
8.9
84
11
.82
9 1
3.2
70
16
.02
3
22
.18
9
24
.18
9
31
.24
2
44
.49
9
47
.35
2 4
7.8
36
48
.72
2 4
9.7
61
55
.66
8
62
.44
2
67
.74
6 6
8.1
13
68
.59
2
70
.66
0
72
.97
2 7
3.4
16
75
.17
2
77
.47
9 7
8.0
71
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 2 A .D )
5.7
64
6.4
16
7.0
73
9.0
07
11
.86
1 1
3.3
06
16
.06
6
22
.24
4
24
.24
7
31
.31
2
44
.58
5
47
.44
3 4
7.9
28
48
.80
7 4
9.8
46
55
.77
1
62
.59
1
64
.78
9
69
.91
4 7
0.7
39
71
.17
0 7
1.8
94
77
.21
3
82
.01
8 8
2.9
25
86
.87
1
91
.84
4 9
2.9
63
Cromatograma 29. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 30A.
89
Pensando-se que as regioes que antes eram problemas poderiam melhorar optou-se por
diminuir a temperatura inicial em 5°C.
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F ID 2 B , (B A N N Y \2 4 _ 1 B B .D )
10
5.6
62
m in0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
F ID 2 B , (B A N N Y \M IX_ 3 9 A .D )
7.0
08
7.8
05
10
.16
2
13
.67
6
15
.43
7
18
.91
0
26
.68
5
29
.17
5
38
.22
8
55
.31
4
58
.81
6 5
9.5
07
60
.67
8 6
1.9
59
65
.76
3
68
.18
2
69
.81
2
74
.84
2 7
5.6
58
76
.08
7 7
6.7
99
82
.52
9
90
.00
5 9
1.3
46
97
.20
8
10
4.1
85
10
5.2
60
10
5.6
50
Cromatograma 30. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 39A.
m i n0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
p A
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
F I D 2 B , ( B A N N Y \ M E T C G \ M I X _ B B \ M I X _ 4 3 A . D )
4.09
6 4.
351
4.52
0 5.
314
5.84
9 6.
279 7.
065
7.87
0 9.
149
10.24
4 13.78
5 15
.560
16.33
0
19.05
4
26.87
8
29.37
9
32.39
4
38.46
3
55.62
7
59.12
7 59
.824
60.99
8 62
.278
65.87
0 68.26
3 69
.893
72.35
4 72
.498
74.93
5 75
.770
76.18
0 76
.897 81
.541
88.76
6 90
.302
97.91
4
109.7
68 11
1.620
112.6
77
Cromatograma 31. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43A.
O método escolhido foi o método MIX 43A que consistiu do uso de gás de arraste
hélio, injector no modo split 10:1 a temperature de 250°C, volume de injeção de 1µL, fluxo
90
de 1,8 mL/min, com temperature do forno iniciando em 160°C, mantendo por 62 min,
aumentando numa rampa de 8°C/min até 200°C, mantendo por 10 min, subindo 10°C/min até
210°C e finalmente mantendo por 42 min, coluna ZB-FFAP (zebron), de 60 m comprimento,
0,25 mm de diâmetro interno e espessura de filme de 0,25 µm.
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
82.18100.77
69.35
75.99
98.6489.40
6.01
10.43
14.39
83.3270.88
20.2628.9022.10
41.76101.5790.66 106.8944.38 81.58
24.43 44.9368.5930.38 32.67 60.69
52.47
NL:6.92E6
TIC MS mixpg47+24_1+22_6_III
Cromatograma 32. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos de padrões comerciais de
ácidos graxos analisado em coluna polar nas condições do método MIX 43 A no
espectrometro de massas.
E nessa condição os padrões de ésteres metílicos dos ácidos graxos na mistura foram
identificados por espectrometria de massas (anexo 2) e os seus respectivos tempos de retenção
das análises tanto no CG-DIC quanto no CG-EM estão dispostos na tabela a seguir.
91
Tabela 35. Tempos de retenção em min da mistura dos padrões comerciais de ésteres
metílicos de ácidos graxos disponíveis no método MIX 43A.
Cadeia Tempo EM (min) Tempo dic (min)
C 6:0 - 4,10
C 7:0 - 4,35
C 8:0 - 4,52
C 9:0 - 5,31
C 10:0 - 5,85
C 11:0 - 6,28
C 11:1 - 7,06
C 12:0 6,01 7,87
C 13:0 7,77 10,24
C 14:0 10,43 13,78
C 14:1 11,80 15,56
C 15:0 14,39 19,05
C 16:0 20,26 26,88
C 16:1 c 22,10 29,38
C 16:1 t 24,43 32,39
C 17:0 28,90 38,46
C 18:0 41,76 55,63
C 18:1 c9 44,38 59,13
C 18:1 c6 44,93 59,82
C 18:1 c11 45,78 60,10
C 18:1 c 12 46,81 62,28
C 18:2 c 9,12 52,47 65,87
C 19:0 60,69 68,26
C 18:3 c 6,9,12 63,70 68,82
C 18:3 c 9,12,15 64,72 69,89
C 18:4 66,85 -
C 18:2 conj 1 68,59 72,35
C 18:2 conj 2 68,61 72,50
C 20:0 69,35 74,94
C 20:1 c13 69,93 75,77
C 20:1 c11 70,28 76,18
C 20:1 c8 70,86 76,90
C 20:1 c 5 70,90 76,92
C 20:2 c12,14 73,38 78,04
C 20:3 75,25 78,62
C 21:0 75,99 81,54
C 20:4 76,81 85,28
C 20:5 80,80 86,96
C 22:0 82,18 88,77
C 22:1 c13 83,32 90,30
C 22:2 c13,16 85,00 92,00
C 22:2 c11,14 85,15 92,30
92
Continuação da Tabela 35
C 22:3 87,00 94,24
C 23:0 89,40 97,91
C 22:4 90,81 99,51
C 24:0 98,64 109,77
C 22:6 99,94 111,62
C 24:1 100,77 112,68
4.8.2 Análise da composição da cadeia graxa dos peixes em estudo
4.8.2.1 Lipídeos neutros
Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos lipídeos neutros por
espectrometria de massas e quantificá-los pela relação com os cromatogramas gerados no CG-
DIC. Seus cromatogramas mostraram uma boa aplicação do método desenvolvido para
análise de ácidos graxos. Como exemplo de como foi possível obter tais resultados, temos o
cromatograma de lipídeos neutros do peixe curimatã.
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
20.47
22.28
44.75
10.47 42.02
80.8264.75 70.3845.87
14.444.94 52.7227.34 100.0329.06 75.22 97.0193.32 117.30108.2660.9751.26
NL:8.94E7
TIC MS 1_1fame3III
Cromatograma 33. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de
curimatã por CG-EM.
Cada pico corresponde a um ácido graxo (derivatizado) e seus respectivos tempos de
retenção foram comaparados com o tempo de retenção da mistura de padrões disponíveis de
ácidos graxos resultantes de análises tanto por GC-EM quanto por CG-DIC, bem como com a
comparação dos espectros de massas gerados para cada pico com a biblioteca de espectros
93
disponivel e análise da coerência dos fragmentos padrões de ácidos graxos (Vetter et al.,
2007). Exemplicando temos o pico no tempo de retenção da análise no CG-EM 42,02 min,
que apresentou os sinais de fragmentos em m/z 74 e 87 altos (espectro 2), caracterização de
ácido graxo saturado e o íon molecular em sinal de m/z 298, confirmando o tamanho da
cadeia, sendo este referente ao espectro do éster metilico do ácido esteárico (C18:0), que
nesse caso tem ionização desencadeada em um dos pares de eletrons do oxigenio carbonilico,
e a partir desse ponto o rearranjo de fragmentação bem conhecido de McLafferty leva ao ion
base em m/z 74. Esse íon é caracteristico para todos os ácidos graxos saturados e mono
insaturados, assim como o fragmento em m/z 87, que se refere a quebra entre os carbono C3 e
C4.
1_1fame1III_130107122236 #2376 RT: 41.09 AV: 1 SB: 66 30.05-30.40 , 31.02-31.68 NL: 4.43E5T: + c Full ms [40.00-500.00]
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
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e A
bu
nd
an
ce
74.11
87.12
143.12
43.13
199.21
255.32101.16129.17
157.32 213.27171.17 298.29241.28111.20 267.32
279.64 392.83 435.94328.51 457.48369.73 490.69
Espectro 2. Espectro de massas do pico no tempo de retenção em 42 min da amostra de
lipídeos neutros do peixe curimatã.
A seguir se encontram os cromatogramas dos lipídeos neutros dos demais peixes em
estudo.
94
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
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e A
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nd
an
ce
20.43
44.85
42.0422.26
76.80
52.7910.48 70.38 100.0864.784.99
61.06 90.8129.0714.44 80.80 97.046.00 75.22 100.94 112.9731.34 48.34 53.65
NL:4.37E7
TIC MS 2_1fame3III
Cromatograma 34. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de
pescada.
Para o peixe pescada observou-se uma variedade grande de componentes, já que o
espaço do cromatograma foi bem aproveitado dentro do método, com maior quantidade do
pico em 20,43 min.
RT: 0.00 - 120.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
20.44
22.2544.79
42.09
10.46
45.92
14.41
28.9860.90
70.344.95 17.19 52.56 82.2131.28 98.6173.35 89.40 100.21 116.3135.03 66.66
NL:7.96E7
TIC MS 3_1fame2III
Cromatograma 35. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de
sardinha.
95
Para o peixe sardinha observou-se também uma variedade grande de componentes,
sendo marjoritário o pico em 20,44 min.
RT: 0.00 - 119.99
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
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an
ce
20.38
22.28
44.7242.06
10.41 76.8545.98
64.814.94 14.46
80.8270.4252.8425.16 100.1093.3729.11 90.8761.12 101.96 112.8551.3631.98 58.85
NL:2.96E7
TIC MS 4_1fame3III
Cromatograma 36. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de
jaraqui.
Da mesma forma se processo para o peixe jaraqui, sendo marjoritário o pico em 20,38
min.
96
RT: 0.00 - 120.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
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e A
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ance
20.38
44.65
41.9722.2210.47
60.9614.43 76.79
64.70 100.0170.3745.86 79.464.95
93.3280.7852.6329.0175.19 82.19 101.8831.29 117.04110.5148.2535.47 53.66
NL:4.32E7
TIC MS 5_1fame2III
Cromatograma 37. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de
surubim.
Igualmente para o peixe surubim e pacu, sendo encontrado neste último uma grande
quantidade de outro componente, o referente ao pico em 44,87 min.
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
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bund
ance
20.40
44.87
42.06 52.80
22.224.96 70.3564.70
45.8610.4776.76 99.9382.2110.90 93.26 105.94 116.9890.2060.8722.73 29.05 37.13 47.04
NL:4.21E7
TIC MS 6_1fame2III_130105011422
Cromatograma 38. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos lipídeos neutros de pacu.
Foi identificado e quantificado uma grande variedade de ácidos graxos para os lipídeos
neutros nos peixes em estudo (tabela 36), sendo marjoritário para todos os peixes a presença
de ácido palmítico (C16:0), o que referia ao pico em 20 min, seguido por ácidos da série de 18
carbonos (entre 42 e 45 min), os ácidos oléico (C 18:1 ω 9), esteárico (C 18:0) e cis-12-
97
octadecenóico (C 18:1 ω 6). E ainda foi observada a presence dos ácidos graxos EPA
(eicosapentaenóico) e DHA (docosahexaenóico), importantes ácidos graxos do tipo ômega 3
que são considerados valiosos de um ponto de vista nutricional e fisiológico (Belitz et al.,
2004). Os ácidos graxos cis 6-octadecenóico (C 18:1 ω 12) e nervônico (C 24:1 ω 9)
encontrados nas especies de peixe sardinha, jaraqui, surubim e pacu não foram encontrados
nos lipídeos neutros de outros peixes amazônicos que já foram estudados, como o tucunaré e
matrinxã (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002; Almeida et al., 2007; Almeida et
al., 2008).
Tabela 36. Quantidade em mg de ácido graxo/g de peixe nos lipídeos neutros.
Cadeia Peixe
curimatã pescada sardinha jaraqui surumbi pacu
C 12:0 1,987 2,148 2,493 3,932 2,435 2,896
C 13:0 2,205 - 3,299 3,299 4,162 -
C 14:0 20,909 11,586 25,571 23,614 23,557 6,522
C 14:1 c 9 ω5 1,941 - 2,781 - - -
C 15:0 9,860 6,752 12,046 13,658 19,988 -
C 16:0 261,874 210,596 143,953 196,611 190,281 183,490
C 16:1 c 11ω5 5,313 6,752 17,514 4,507 6,004 4,507
C 16:1 c 9ω7 3,011 - - - - -
C 16:1 t 11 ω5 3,702 9,111 10,895 8,018 7,385 -
C 16:2 c 7,10 ω6 3,817 - - 3,356 - -
C 16:2 t7,11 ω5 3,241 3,471 4,162 2,896 2,953 -
C 17:0 11,644 11,126 12,219 10,780 13,600 3,126
C 16:3 ω1 5,198 - - - - -
C 17:1c10 ω7 5,255 4,910 4,047 4,910 6,234 1,457
C 18:0 64,935 74,028 71,209 60,447 73,280 127,666
C 18:1 c9 ω9 101,768 177,735 117,364 63,554 117,767 331,568
C 18:1 c6 ω12 - - 10,493 - - -
C 18:1 c11 ω7 36,793 29,772 - - - -
C 18:1 c 12 ω6 - - 51,181 38,520 29,081 17,399
C 18:1 t11 ω7 2,608 3,644 8,018 - 4,220 -
C 18:1 t9 ω9 4,392 - 3,874 9,975 - -
C 18:2 c 9,12 ω6 25,341 46,232 20,506 25,743 25,743 136,644
C 18:2 t 9,13 9,226 - - - - 3,471
C 19:0 9,917 27,412 17,571 19,183 70,518 7,442
C 18:3 c 6,9,12 ω6 7,442 - - 2,551 2,551 -
C 18:3 c 9,12,15 ω3 28,448 17,111 20,219 24,477 24,938 16,823
C 18:2 conj 1 ω6 2,953 - - - - -
C 18:2 conj 2 ω6 - - 4,910 3,241 3,414 3,011
C 20:0 3,874 5,140 4,795 4,910 5,198 10,953
98
C 20:1 c13 ω7 3,011 3,874 2,781 3,471 3,759 -
C 20:1 c11 ω9 19,240 10,953 5,198 9,572 15,039 12,680
C 20:1 c8 ω12 2,205 - - 3,644 2,493 -
C 20:2 c12,14 ω6 6,176 - 3,817 - 2,551 2,551
C 20:3 5,11,14 ω6 3,184 - 2,723 2,608 - -
C 20:3 c 11,14,17 ω3 6,349 4,738 2,953 3,989 5,371 6,004
C 21:0 2,090 - - - - -
C 20:4 c5,8,11,14 ω6 7,442 2,666 7,327 5,946 10,723 3,759
C 20:5ω3 19,298 5,716 9,860 8,306 8,363 -
C 22:0 2,378 3,759 3,932 3,069 3,414 -
C 22:1 c13 ω9 2,781 7,903 - 2,608 - -
C 22:4 ω6 4,392 - - 4,392 7,442 -
C 24:0 5,831 5,773 6,522 6,176 12,219 -
C 22:6 ω3 8,709 6,234 6,291 5,831 10,262 -
C 24:1ω9 9,399 13,946 22,463 8,018 22,233 3,471
Total 740,140 713,088 642,986 595,813 737,178 885,439
Foi observada uma maior quantidade de ácido graxo saturado para os lipídeos neutros
que insaturados, com exceção dos peixes sardinha e pacu (tabela 37); resultado coerente,
porque os lipídeos neutros sao formados principalmente por glicerideos, que tem função de
armazenar energia na saúde humana, sendo necessário ácidos graxos saturados (Gurr et al.,
2002). Porém de qualquer forma os ácidos graxos insaturados mostraram participação
significativa para os lipídeos neutros com uma variação para os peixes estudados entre 25-
54%, observando valores percentuais altos, principalmente para o peixe pacu, tanto com
monoinsaturados quanto de poliinsaturados, quando comparados à outros peixes amazônicos
(Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002; Almeida et al., 2007; Almeida et al.,
2008).
Tabela 37. Relação percentual de tipos de ácidos graxos presents nos lipídeos neutros.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
ΣAGS 39,750 35,832 30,361 34,568 41,865 34,209
ΣAGMI 20,142 26,860 25,661 15,680 21,421 37,108
ΣAGPI 14,122 8,617 8,277 9,334 10,431 17,226
Σω6 6,075 4,890 9,046 8,636 8,151 16,336
Σω3 6,280 3,380 3,932 4,260 4,893 2,283
ΣAGI 34,264 35,477 33,938 25,013 31,853 54,334
99
4.8.2.2 Glicolipídeos
Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos glicolipídeos por
espectrometria de massas.
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
5.01 5.396.05
7.01
4.028.23
8.76
9.52 20.46
11.10
12.41
13.21 113.58110.95100.3394.3992.3914.47 87.74
82.49
79.12
22.31 78.02
77.80
77.3923.16 70.42
68.3225.3027.60 66.8744.70
30.89 66.2837.17 46.04 64.8249.46
62.64
NL:1.89E6
TIC MS 1_2fame2
Cromatograma 39. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de curimatã.
Para o peixe curimatã, apesar da baixíssima quantidade de componentes, foi possível
observar assim como nos lipídeos neutros a predominância do pico em 20,46 min.
100
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
20.33
44.57
10.44 41.976.16
112.2722.224.48 100.6294.3111.63 93.37 101.1269.38 113.0670.34 82.1667.12
22.89 29.06 45.81 52.6164.6832.20
46.91 56.41
NL:6.36E6
TIC MS 2_2fame1III
Cromatograma 40. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pescada.
Para o peixe pescada, além do pico mais abundante em torno de 20 min, observou-se
os picos com relativa quantidade em relação ao cromatograma total, em 42 e 44 min.
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
0
5
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4.93
20.25
5.67
6.89
8.019.12 99.81
10.74 111.12105.0912.45 93.1441.75 91.5714.41 87.0980.6922.09
44.3822.52 75.1272.56
25.77 45.5766.7831.07
52.4363.10
NL:2.90E6
TIC MS 3_2fame2III_130103164224
Cromatograma 41. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de sardinha.
101
Já para o peixe sardinha, observou-se a presença em quantidade abundante do pico em
100 min.
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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44.59
41.9422.19
10.46
45.734.93 14.4069.3652.5328.94 76.73 81.644.49 64.6418.07 88.2360.76 94.84 99.93 112.2131.23
NL:5.85E7
TIC MS 4_2fame2III
Cromatograma 42. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de jaraqui.
O jaraqui obteve uma boa quantidade de componentes para uma fração de glicolipídeos,
quando comparado com os demais peixes em estudo.
102
RT: 0.00 - 120.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Time (min)
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5
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5.92 6.19 41.6844.318.23
10.41
11.68109.70 113.61102.76100.1592.7287.1280.2322.09
78.1124.27 70.1845.53 67.0931.21 60.5634.48
46.08
NL:3.57E6
TIC MS 5_2fame1III
Cromatograma 43. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de surubim.
Os peixes surubim e pacu, apesar da baixa concentração das amostras, também foi
possivel observar maior quantidade do pico em torno de 20 min, com um diferencial para o
ultimo peixe, que paresentou uma quantidade quase equivalente ao pico citado de picos em 42
e 44 min.
103
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
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44.34
6.006.33
7.05
7.58
8.238.64
9.854.49
11.60
12.25
12.83 112.21108.24
100.5714.07 93.4041.73 90.2887.20
82.14
81.59
78.3620.84 78.08
22.4570.27
69.3224.7967.0727.04
31.04 52.4536.17 66.55
47.49 53.10 63.41
NL:1.17E6
TIC MS 6_2fame1III
Cromatograma 44. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos glicolipídeos de pacu.
Também foi possivel identificar e quantificar uma variação grande de ácidos graxos
para os glicolipídeos dos peixes em estudo (tabela 38), sendo marjoritária a presence do ácido
palmitico (C16:0) para os peixes jaraqui e surubim e a presença do ácido 12-octadecenoico
(C 18:1 ω 6) para os peixes pacu e pescada, e do ácido esteárico para os demais peixes. E
ainda foi observada a presença do ácido DHA para o peixe sardinha.
104
Tabela 38. Quantidade em mg de ácidos graxos presentes /g de peixe nos glicolipídeos.
Cadeia Peixe
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
C 6:0 - - - - - -
C 10:0 - 2,666 - 1,998 1,636 -
C 14:0 20,506 2,320 2,551 2,320 2,781 -
C 15:0 2,148 3,644 - - 3,356 -
C 16:0 - - - 20,506 40,534 12,392
C 16:1 c 9 ω7 6,349 6,924 - 7,500 3,702 -
C 16:1 t 9 ω7 1,912 - - - - -
C 17:0 2,263 3,529 - - - -
C 18:0 11,528 26,722 14,003 12,162 23,672 12,046
C 18:1 c9 ω 9 12,392 47,555 8,766 14,118 21,542 23,154
C 18:1 c11 ω 7 5,658 7,557 - 5,601 - -
C 18:2 c 9,12 ω 6 3,644 10,147 3,299 3,644 4,450 5,198
C 18:2 t 9,13 ω 5 4,392 2,608 - - - -
C 19:0 4,680 4,795 2,263 3,414 6,176 2,320
C 18:3 c 9,12,15 2,205 3,702 2,608 2,666 - -
C 18:2 conj 1 ω6 4,565 5,255 2,838 4,507 - -
C 20:0 1,797 5,601 - - - -
C 20:1 c11 2,263 2,781 - - 2,493 -
C 20:3 c 11,14,17 ω3 2,263 2,551 - - - -
C 21:0 2,263 - - - - -
C 20:4 c5,8,11,14 ω6 2,148 2,781 - - - -
C 22:0 2,148 2,896 - - - -
C 22:3 c8,11,14 ω8 2,263 - - - - -
C 22:4 ω6 - 3,069 - - - -
C 24:0 2,435 4,680 - - - -
C 22:6 ω3 - - 4,047 - - -
C 24:1ω9 - 4,277 - - - -
Total 99,822 156,060 40,375 78,436 110,341 55,110
Foi observada uma maior quantidade de ácidos graxos insaturados do que saturados
para os glicolipídeos dos peixes em estudo, com exceção para o surubim (tabela 39) e maior
participação de ácidos graxos monoinsaturados que poliinsaturados, com exceção do peixe
sardinha.
105
Tabela 39. Relação percentual dos tipos de ácidos graxos nos glicolipídeos.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
ΣAGS 8,212 9,375 6,297 6,644 13,006 8,749
ΣAGMI 4,715 11,394 2,934 4,476 4,616 7,570
ΣAGPI 3,544 4,966 4,281 1,779 0,740 1,699
Σω6 1,709 3,505 2,054 1,341 0,740 1,699
Σω3 0,373 0,001 0,002 0,000 0,000 0,000
ΣAGI 8,260 16,360 7,214 6,255 5,356 9,269
4.8.2.3 Fosfolipídeos
Foi possível identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos dos fosfolipídeos por
espectrometria de massas.
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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42.30
44.82
18.13
45.99
76.8022.26
70.38
37.04 52.74 75.224.95 29.0614.45 93.3580.79 100.0290.8164.734.04 60.9931.35 111.1748.09
NL:6.25E7
TIC MS 1_3fame2III
Cromatograma 45. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de curimatã.
Para os fosfolipídeos do peixe curimatã observou-se uma varição de componentes, e
assim como nas demais frações de seus lipídeos, a predominância do pico em 20 min.
106
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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100.044.96
6.057.08 93.35
44.609.08 90.8296.9980.8210.94
102.6913.14 41.97 113.7990.07
23.11 75.2252.7423.63 73.5170.1536.9627.54
64.7250.57 53.65
NL:4.33E6
TIC MS 2_3fame3III
Cromatograma 46. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pescada.
Para o peixe pescada observou-se uma quantidade relativamente alta dos picos em
torno de 77 e outro em trono de 100 min.
107
RT: 0.00 - 120.03
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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44.81
76.82
46.0022.25
18.1014.41 29.0310.47 93.35 100.0436.99 75.2252.71 90.7981.706.06 70.3564.72 101.88 112.87
NL:9.40E7
TIC MS 3_3fame2III
Cromatograma 47. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de sardinha.
Para o peixe sardinhaobservou-se como marjoritario o pico em torno de 20 min
também.
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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76.8029.094.96 14.46 52.74 75.2037.02 70.3724.49 93.3077.98 99.9661.03 111.0187.1051.17
NL:6.19E7
TIC MS 4_3fame2III
Cromatograma 48. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de jaraqui.
108
Bem como para os peixes jaraqui, surubim e pacu.
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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44.79
45.9514.46
22.26 29.06 70.3510.47 76.7452.6937.014.95 69.39 93.2790.7180.07 115.0098.61 108.3860.92
NL:1.17E8
TIC MS 5_3fame2III
Cromatograma 49. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de surubim.
RT: 0.00 - 120.01
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Time (min)
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44.32
76.635.76 7.00
14.35 52.33 93.1699.73 112.4087.01 110.6775.0867.04 82.0822.09 45.5628.90 31.32 66.3256.88
NL:9.96E6
TIC MS 6_3fame1III
Cromatograma 50. Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos fosfolipídeos de pacu.
109
Foi identificado como marjoritária a presence do ácido palmitico (C16:0) seguido
pelos ácidos graxos da série de 18 carbonos, os ácidos esteárico (C18:0) e 12-octadecenoico
(C 18:1 ω 6), para a classe de fosfolipídeos dos peixes em estudo (tabela 40). Os ácidos EPA
e DHA, entre outros ácidos graxos foram encontrados para os fosfolipídeos também. Os
fosfolipídeos dos peixes também apresentaram muitos ácidos graxos insaturados da série
ômega 6 (12-octadecenoico, 18:3 e 20:2) que nao foram encontrados em fosfolipídeos de
outros peixes amazonicos já estudados (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002;
Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008).
Tabela 40. Quantidade em mg de ácidos graxos/g de peixe nos fosfolipídeos.
Cadeia Peixe
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
C 9:0 - - - - - 1,820
C 10:0 - - - - - 2,608
C 12:0 2,551 - 1,992 - - -
C 14:0 6,637 - 12,449 4,162 10,205 16,478
C 14:1 9,284 - 4,738 - - -
C 15:0 8,421 - 17,974 7,845 24,650 9,802
C 16:0 321,381 47,613 385,320 190,684 650,283 179,461
C 16:1 c 9 ω7 15,557 - 18,262 8,651 7,212 -
C 16:1 t 9 ω7 7,442 - 12,737 5,083 10,723 -
C 17:0 16,535 - 22,463 13,773 24,823 6,809
C 18:0 327,251 17,744 269,183 192,238 342,848 162,311
C 18:1 c 9 ω 9 150,801 23,959 154,312 56,130 172,900 104,185
C 18:1 c 6 ω 12 - - 9,744 - - -
C 18:1 c 11 ω 7 90,833 4,910 96,128 58,720 63,612 17,744
C 18:1 c 12 ω 6 - - 6,349 - - -
C 18:2 c 9,12 ω 6 35,815 11,586 20,967 17,514 26,952 49,224
C 18:2 t 9,13 ω 5 3,529 - 5,658 - 2,896 -
C 19:0 11,644 - 11,874 9,860 10,493 4,335
C 18:3 c 6,9,12 ω6 3,586 - 2,953 2,608 5,198 -
C 18:3 c 9,12,15 ω3 8,824 2,608 6,119 4,335 4,507 2,263
C 18:2 conj 1 ω6 - - - - - 2,493
C 20:0 4,680 - 4,622 3,702 4,968 3,471
C 20:1 c13 ω7 - - - - 3,471 -
C 20:1 c11 ω9 22,290 - 4,047 4,738 12,967 4,853
C 20:1 c8 ω 12 - - 2,263 2,953 - -
C 20:2 c12,14 ω6 2,378 - 3,299 - - -
C 22:3 c8,11,14 ω8 8,593 - 5,255 3,644 5,486 8,651
C 21:0 13,658 4,162 10,723 5,946 6,349 9,514
C 22:4 ω6 3,126 - 3,299 - - -
110
C 20:5 ω3 5,946 5,198 5,025 - - 2,666
C 22:0 2,953 - 5,313 - - -
C 22:6 ω3 7,327 6,579 6,809 - 3,529 3,586
C 24:1ω9 7,730 28,736 13,658 - - 7,442
Total 1098,774 153,096 1123,535 592,584 1394,071 599,717
Foi observado uma maior quantidade de ácido graxo saturado que insaturado para os
fosfolipídeos, com execeção da pescada (tabela 41), porém mesmo sendo menor o somatorio
dos acidos graxos insaturados, estes foram maiores nos peixes curimatã, sardinha e surubim
que para seus respectivos lipídeos neutros, confirmando que em geral os fosfolipídeos
possuem maior quantidade de insaturados que lipídeos neutros por serem componentes de
membrana (Gurr et al., 2002). Os valores encontrados foram na faixa dos encontrados para
outros peixes amazônicos já estudados (Inhamuns et al., 2009; Arbeláz-Rojas et al., 2002;
Almeida et al., 2007; Almeida et al., 2008).
Tabela 41. Relação percentual dos tipos ácidos graxos nos fosfolipídeos.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
ΣAGS 118,102 11,464 248,281 70,422 178,826 129,670
ΣAGMI 50,154 9,500 107,836 22,411 45,078 43,884
ΣAGPI 13,057 4,283 19,873 4,621 8,082 22,521
Σω6 7,410 1,911 12,337 3,309 5,350 16,909
Σω3 3,646 2,372 6,008 0,713 1,337 2,784
ΣAGI 63,211 13,782 127,710 27,033 53,160 66,405
4.8 Qualidade Nutricional dos lipídeos em classe
4.9.1 Lipídeos neutros
Observou-se que os acidos graxos do tipo ômega 3 e 6 presentes, importantes
mediadores farmacologicos, constitui em 8-18% dos ácidos graxos insaturados, sendo o
somatorio dos ácidos graxos EPA e DHA até 5% para a fração de lipídeos neutros, resultado
esse maior que aqueles encontrados no matrinxã (Almeida et al., 2007). No entanto houve
uma grande contribuição dos ácidos graxos do tipo ômega 6, através dos altos valores da
razão entre eles (ω6/ω3). E a razão entre os ácidos graxos poliinsaturados e saturados mostrou
valor recomendado para consumo para o peixe pacu, maiores que 0,45 (Department of
healthy, 1994). Porém, atualmente a qualidade nutricional é medida pelos indices de
aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos
111
hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, que mostraram valores 1 - 2 para IA, 2-3 para IT e
0,1-0,8 para HH.
Table 42. Qualidade nutricional dos lipídeos neutros dos peixes.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
AGPI/AGS 0,355 0,240 0,273 0,270 0,249 0,504
ω6/ω3 0,967 1,447 2,301 2,027 1,666 7,157
Σω3+Σω6 12,355 8,270 12,979 12,896 13,044 18,619
EPA + DHA 4,621 1,971 5,405 2,325 3,099 0,000
IA 1,765 1,216 2,154 1,698 1,385 1,247
IT 1,740 1,829 2,723 1,815 1,589 3,081
HH 0,111 0,190 0,358 0,100 0,154 0,841
4.9.2 Glicolipídeos
Dos ácidos graxos insaturados, os ácidos do tipo ômega 3 e 6 constituintes da fração
de glicolipídeos para os peixes em estudo foram cerca de 1-3% e a razão de entre eles (ω6/ω3)
indicou uma maior contribuição dos ácidos graxos ômega 6. A razão entre poliinsaturados e
saturados apresentaram valores recomendados para consumo (Department of healthy, 1994).
E os índices de aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos
hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, mostraram valores 0,1–2 para IA, 0,6-4 para IT e
0,1-5 para HH.
Table 43. Qualidade nutricional dos glicolipídeos dos peixes.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
AGPI/AGS 0,432 0,530 0,680 0,268 0,057 0,194
ω6/ω3 4,577 3399,142 922,171 0,000 0,000 0,000
Σω3+Σω6 2,082 3,506 2,056 1,341 0,740 1,699
EPA + DHA 0,000 0,000 1,354 0,000 0,000 0,000
IA 1,991 0,103 0,684 0,842 1,605 0,437
IT 1,162 0,643 2,215 1,977 4,162 1,724
HH 0,164 4,562 2,456 0,147 0,100 0,748
4.9.3 Fosfolipídeos
Quando observamos os ácidos graxos do tipo ômega 3 e 6, que desenvolvem papel
como importantes mediadores farmacológicos, podemos verificar que estes constituem 4-20%
dos ácidos graxos insaturados e a relação entre eles (ω6/ω3) indicou uma maior contribuição
112
dos ácidos graxos ômega 6. A razão entre poliinsaturados e saturados da fração de
fosfolipídeos apresentaram valores levemente menores que o recomendado para consumo
(Department of healthy, 1994). Porém, atualmente a qualidade nutricional é feita pelos
indices de aterogenicidade e trombogenicidade e a razão entre os ácidos
hipocolesterolemico:hipercolesterolemico, que mostraram altos valores para a HH do peixe
pescada e pacu, considerando-o bom para a saúde humana.
Table 44. Qualidade nutricional dos fosfolipídeos dos peixes.
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
AGPI/AGS 0,111 0,374 0,080 0,066 0,045 0,174
ω6/ω3 2,032 0,805 2,053 4,642 4,001 6,074
Σω3+Σω6 11,056 4,283 18,345 4,022 6,687 19,693
EPA + DHA 2,190 1,942 3,960 0,000 0,587 2,044
IA 0,945 0,570 1,159 1,290 2,222 1,262
IT 2,689 0,766 2,840 4,184 5,664 3,010
HH 0,105 0,173 0,163 0,066 0,052 0,270
4.9.4 Lipídeos no total
Quando somamos os valores das classes de lipídeos, levando em consideração suas
respectivas contribuições para os lipídeos totais, encontramos valores entre 1-2 para IA, 2–3
para IT e 0,1-1 para HH. Esses valores foram coerentes com os encontrados na literatura
(Ulbricht et al., 1991 e Bentes et al., 2009). Os peixes sardinha e pacu apresentaram elevados
valores para a razão HH, confirmando a razão entre ácidos graxos poliinsaturados e saturados
e ainda uma boa quantidade de ácidos do tipo ômega 3 e 6 conferindo a estes uma qualidade
nutricional destacada.
Tabela 45. Constituintes dos lipídeos totais dos peixes (% em g de peixe).
Curimatã Pescada Sardinha Jaraqui Surumbi Pacu
AGPI/AGS 0,343 0,243 0,233 0,258 0,180 0,495
ω6/ω3 1,090 26,534 11,570 2,212 2,143 7,062
Σω3+Σω6 12,134 7,902 13,867 12,293 10,475 18,456
EPA + DHA 4,416 1,912 5,001 2,164 2,228 0,033
IA 1,726 1,157 1,906 1,676 1,532 1,239
IT 1,787 1,740 2,714 1,996 2,604 3,068
HH 0,112 0,217 0,335 0,099 0,119 0,832
colesterol 1,400 15,980 24,944 18,170 18,933 7,769
113
5. CONCLUSÃO
Esse trabalho resultou em metodologia desenvolvida para análise quanti- e qualitativa
de ácidos graxos e de esteróides por cromatografia gasosa usando detector de ionização de
chamas e espectrometria de massas; indicou que as espécies de peixes curimatã, pescada,
sardinha, jaraqui, surubim e pacu possuem teores de lipídeos interessantes, sendo que as
maiores quantidade de lipídeos totais estão nos peixes curimatã e pacu.
Verificou-se que os peixes estudados possuem ácidos graxos insaturados essenciais
para a saúde humana (ômega 3 e 6), constituindo a maior quantidade para os peixes curimatã,
pescada, jaraqui e surubim em suas frações de lipídeos neutros e para os peixes sardinha e
pacu em suas frações de fosfolipídeos. E observou-se os melhores índices de aterogenecidade
e de trombogenecidade, bem como elevada quantidade de ácidos graxos
hipocolesterolêmicos, para os glicolipídeos dos peixes, com exceção para o peixe surubim que
foi melhor contemplado nos lipídeos neutros. Quando levado em consideração a contribuição
de cada classe de lipídeos para os lipídeos totais, e avaliados como parâmetros de qualidade
nutricional lipidíca, a relação de ácidos graxos poliinsaturados e saturados, e ainda a soma de
ácidos graxos do tipo ômega 3 e 6, destacou-se o peixe pacu, porém ao se avaliar os índices
de aterogenecidade e trombogenecidade, o peixe em destaque foi a pescada.
114
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alexander, W. Immunonutrition: The role of ù-3 fatty acids. Nutrition. 1998, 14(7-8), 627-
633.
Almeida, N. M.; Moura, J. M. L.; Moreira, R. C. N.; Franco, M. R. B. Tocoferois do músculo
dorsal e cavidade ocular do matrinxã (Brycon cephalus) proveniente da Bacia Amazônica em
diferentes épocas sazonais. Ciência Rural. 2006, 36(2).
Almeida, N. M.; Batista, G. M.; Kodaira, M.; Lessi, E. Alterações post-mortem em tambaqui
(Colossoma macropomum) conservados em gelo. Ciência Rural. 2006, 36(4), 1288-1293.
Almeida, N. M. e Franco, M. R. B. Fatty acid composition of total lipids, neutral lipids and
phospholipids in wild and farmed matrinxã (Brycon cephalus) in the Brazilian amazon area. J
Sci Food Agric. 2007. 87, 2596–2603.
Almeida, N. M.; Visentainer, J. V.; Franco, M. R. B. Composition of total, neutral and
phospholipids in wild and farmed tambaqui (Colossoma macropomum) in the Brazilian
amazon area. J Sci Food Agric. 2008. 88, 1739–1747.
Andrade, G. Q.; Bispo, E. S.; Druzian, J. I.. Avaliação da qualidade nutricional em espécies
de pescado maisproduzidas no Estado da Bahia. Ciênc. Tecnol. Aliment. 2009. 29(4), 721-
726.
Arbeláez-Rojas, G. A.; Fracalossi, D. M.; Fim, J. D. I. Composição corporal de tambaqui,
Colossoma macropomum, e matrinxã, Brycon cephalus, em sistemas de cultivo Intensivo, em
igarapé, e semi-intensivo, em viveiros. R. Bras. Zootec. 2002. 31(3), 1059-1069.
Azevedo-Meleiro, C. H.; Rodriguez-Amaya, D.B. Confirmation of identity of the carotenoids
of tropical fruits by HPLC-DAD and HPLC-MS. 2004. Journal of food composition and
analysis, 17, 385-396.
Barbosa, B. S.; Nunomura, S. M. e Figliuolo, R. Análise de ácidos graxos poliinsaturados por
cromatografia gasosa de alta resolução. Anais XVIII Jornada de Iniciação Científica do
Pibic/CNPq/FAPEAM/INPA- resumos expandidos. 2009. 659-663.
115
Barreto, Andreza Cruz. Dissertação de mestrado: Óleo e biodiesel de uricuri (Scheelea
phalerata Mart. Ex Spreng). Nov-2010. Ufam.
Barthem, R. B., Fabré, N. N. Biologia e diversidade dos recursos pesqueiros da Amazônia.
Em: A pesca e os recursos pesqueiros na Amazônia Brasileira. Ruffino, M. L., ed.;
Provarzea: Manaus, 2003, 11-52 p.
Batista, V.S.; Silva, A.J.I.; Freitas, C.E.C.; Freire-Brasil, D. Characterization of the fishery in
riverine communities in the Low-Solimões/High-Amazon region. Fisheries Management and
Ecology. 1998. 5, 419-435.
Becker, Raquel Wielens. Dissertação de mestrado: Determinação de anti-inflamatórios em
efluente urbano na região de porto alegre-RS por SPE, derivatização e CG-MS.UFRGS 2012.
Belitz, H-D.; Grosch, W.; Schieberle, P. 2004. Food Chemistry, 3rd ed., Springer:EUA, 2004.
Bentes, A. S.; Souza, A. L.; Mendonça, X. M. F. D.; Simões, M. G. Caracterização física e
química e perfil lipídico de três espécies de peixes amazônicos. Revista Brasileira de
tecnologia Agroindustrial, 2009, 03, 97-108 p.
Blanchet, C.; Lucas, M.; Julien, P.; Morin, R.; Gingras, S.; Dewailly, E. Fatty acid
composition of wild and farmed atlantic salmon (salmo salar) and rainbow trout
(oncorhynchus mykiss). Lipids, 2005, 40(5).
Bligh, E. G.; Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian
Journal of Biochemistry and Physiology, 1959, 37(8), 911-917.
Bowden, J. A.; Colosi, D. M.; Mora-Montero, D. C.; Garrett, T. J; Yost, R. A. Enhancement
of chemical derivatization of steroids by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS).
Journal of chromatography B, 2009, (877) 3237-3242.
Christie, W. W. Triacylglycerols. Part 1. Structure and composition. Lipidlibrary.aocs.org,
2011.
Cozza, K. L.; Costa, J. A. V. Lipídios em Spirulina. Vetor, 2000, 10, 69-80.
116
Curi, R.; Pompéia, C.; Miyasaka, C. K.; Procopio, J. Entendendo a gordura - ácidos graxos,
1° ed., Manole: São Paulo, 2002.
Delgado-Vargas, F.; Jiménez, A. R.; Paredes-Lópes, O. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2000, 40,
173.
Department of health. Nutritional Aspects of cardiovascular Disease. Report on health and
Social Subjects. HMSO: London, 1994, n°46.
Dewich, Paul M. Medicional natural products-a biosynthetic approach, 2° ed., John wiley &
Sons, 2002.
Fuchs, B.; Süß, R.; Teuber, K.; Eibisch, M.; Schiller, J. Lipid analysis by thinlayer
chromatography—A review of the current state. Journal of chromatography A, 2001, 1218,
2754-2774.
Gunstone, F. D. Oils and fats in the food industry, 1° ed., Blackwell Publishing: EUA, 2008.
Gunstone, F. D. 2004. The Chemistry of Oils and Fats- Sources, Composition, Properties and
Uses. Blackwell Publishing.
Gurr, Michael I. 1999. Lipids in nutrition and health: a reappraisal. The oil press
Gurr, M. I.; Harwood, J. L.; Frayn, K. N. Lipid Biochemistry-An Introduction, 5 ª ed.,
Blackwell publishing:UEA, 2002.
Hanahan, D.J. A guide to phospholipids chemistry, 1997, New York, Oxford University Press,
214 pp.
http://www.portodemanaus.com.br/?pg=nivelhj.php, acessado em 20 de agosto de 2012.
Inhamuns, A. J.; Franco, M. R. B. Composition of Total, Neutral, and Phospholipids in
Mapará (Hypophthalmus sp.) from the Brazilian Amazonian Area. J. Agric. Food Chem.
2001, 49, 4859-4863.
117
Inhamuns, A.; Franco, M. R. B.; Batista, W. S. Seasonal variations in total fatty acid
composition of muscles and eye sockets of tucunaré (Cichla sp.) from the Brazilian Amazon
area. Food Chemistry , 2009, 117, 272–275.
Johnston, J. J.; Ghanbari, H. A.; Wheeler, W. B.; Kirk, J. R. Characterization of shrimp lipids.
Journal of food science, 1983, 48, 33-35.
Kasim-Karakas, S.E. Omega-3 fish oils and lipoprotein metabolism. Em: Handbook of
Nutraceuticals and Functional Foods. Wildman, R.E.C., ed.; CRC Press: Boca Raton, 2001,
295-305 p.
Lima, F. C. T. Peixe e gente no alto rio tiquié. Conhecimento tukano e tuyuka, ictiologia,
etnologia. São Paulo. Intituto socioambiental, 2005.
Moreira, A. B.; Souza, N. E.; Visentainer, J. V.; Matsushita, M. Composição de ácidos graxos
e teor de lipídeos em cabeças de peixes: matrinxã (B. Cephalus), piraputanga (B. Microlepis)
e piracanjuba (B. Orbignyanus), criados em diferentes ambientes. Cienc. Tecnol. Aliment.,
2003, 23(2), 179-183.
Motta, V.T. Bioquímica. Caxias do Sul: Educs, 2005. 332p.
Moura, J. M. L. N.; Gonçalves, L. A. G.; Grimaldi, R.; Soares, M. S.; Ribeiro, A. P. B.
Otimização das condições de produção de ésteres etílicos a partir de óleo de peixes cm
elevado teor de ácidos graxos ω-3 Quim. Nova, 2006, 29(5), 956-959.
Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger – Principles of biochemistry, 4th edition, W. H.
Freeman and Company/New York. p. 348-354. 2005.
Netleton, J. A. Omega-3 fatty acids and health. 1995. Editor Chapman and Hall.
Orban, E.; Di Lena, G.; Nevigato, T.; Masci, Casini, I.; Caproni, R. Proximate, unsaponifiable
lipid and fatty acid composition of bogue (Boops boops) and horse mackerel (Trachurus
trachurus) from the Italian trawl fishery. Journal of food composition and analysis, 2011, 24,
1110-1116.
118
Orban, E.; Di Lena, G.; Ricelli, A.; Paoletti, F.; Casini, I.;Gambelli, L.; Caproni, R. Quality
characteristics of sharpsnout sea bream (Diplodus puntazzo) from different intensive rearing
systems. Food chemistry, 2000, 70, 27-32.
Prego, R.; Pazos, M.; Medina, I.; Aubourg, S. P. Compartive chemical composition of
different muscle zones in angler (Lophius piscatourius). Journal of food composition and
analysis, 2012, 28, 81-87.
Rodrigues-Amaya, D.; A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research: ILSI
Press: Washington D. C. 1999.
Roubach, R.; Correia, E. S.; Zaiden, S.; Martino, R. C.; Cavalli, R. O. Aquaculture in brazil.
2003. World aquaculture.
Santos, G. M, Ferreira, E. J. G., Zuanon, J. A. S. Peixes comerciais de Manaus, 2ª ed., INPA:
Manaus, 2009.
Simão, A. N. C., Barbosa, D. S., Nunes, L. B., Godeny, P., Lozovoy, M.A B., Dichi, I. Efeitos
e mecanismos de ação dos ácidos graxos poiinsaturados N-3 na prevenção de doenças
cardiovasculares. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, 2007, 11(3), 225-233.
Soares, M. G. M. Peixes de lagos do Médio Rio Solimões, 2ª ed., Instituto I-piatam: Manaus,
2008, 160 p.
Ulbricht, T. L. V.; Southgate, D. A. T. Coronary heart Disease: seven dietary factors. Lancet,
1991, 338(8773), 985-992 p.
Val, A. L.; Almeida-Val, V. M. F. de. Fishes of the amazon and their environment-
physiological and biochemical aspects. 1995. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New york-
Zoophysiology volume 32- INPA.
Vetter, W.; Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected íon
monitoring mode. Lipid technology, 2007, 19(8).
Voet, D.; Voet, J. G. Biochemistry. 4th edition, John Wiley & Sons/EUA . p. 386-393. 2011.
119
ANEXO 1
Espectros de massas dos tempos de retenção do cromatograma obtido da análise da mistura
de padrões comerciais esteróides disponíveis.
Colesterol TMS
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121
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128.98
357.48
74.98
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ANEXO 2
Espectros de massas dos tempos de retenção do cromatograma obtido da análise da mistura de
padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos.
EMAG C12:0
mixpg47+24_1+22_6_III #102 RT: 6.01 AV: 1 SB: 58 5.49-5.81 , 6.18-7.07 NL: 1.64E5T: + c Full ms [40.00-650.00]
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122
EMAG C13:0
mixpg47+24_1+22_6_III #182 RT: 7.77 AV: 1 SB: 42 7.25-7.64 , 7.94-8.45 NL: 1.26E5T: + c Full ms [40.00-650.00]
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EMAG C14:0
mixpg47+24_1+22_6_III #303 RT: 10.43 AV: 1 SB: 39 9.87-10.19 , 10.63-11.11 NL: 2.27E5T: + c Full ms [40.00-650.00]
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143.07
43.07
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123
EMAG C15:0
mixpg47+24_1+22_6_III #482 RT: 14.39 AV: 1 SB: 36 13.76-14.15 , 14.56-14.92 NL: 2.19E5T: + c Full ms [40.00-650.00]
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EMAG C16:0
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143.07
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124
EMAG C16:1 cis
mixpg47+24_1+22_6_III #822 RT: 22.10 AV: 1 SB: 82 21.08-21.87 , 22.38-23.45 NL: 2.56E4T: + c Full ms [40.00-650.00]
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EMAG C16:1 trans
mixpg47+24_1+22_6_III #922 RT: 24.43 AV: 1 SB: 58 23.78-24.20 , 24.55-25.41 NL: 1.38E4T: + c Full ms [40.00-650.00]
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125
EMAG C17:0
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EMAG C18:0
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126
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127
EMAG C18:1 cis 9
mixpg47+24_1+22_6_III #1851 RT: 45.78 AV: 1 SB: 198 43.98-45.32 , 46.24-49.41 NL: 1.44E4T: + c Full ms [40.00-650.00]
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EMAG C18:1 cis 6
mixpg47+24_1+22_6_III #1897 RT: 46.81 AV: 1 SB: 338 41.48-46.18 , 47.25-50.30 NL: 1.26E4T: + c Full ms [40.00-650.00]
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128
EMAG C18:2 cis 9,12
mixpg47+24_1+22_6_III #2138 RT: 52.45 AV: 1 SB: 229 49.48-51.84 , 52.87-55.85 NL: 6.64E3T: + c Full ms [40.00-650.00]
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EMAG C19:0
mixpg47+24_1+22_6_III #2486 RT: 60.62 AV: 1 SB: 229 49.48-51.84 , 52.87-55.85 NL: 2.52E4T: + c Full ms [40.00-650.00]
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129
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