universidade federal do espÍrito santo ... - sapili.org · renato manfredini júnior ao professor,...
TRANSCRIPT
José Robson Venturim
ANÁLISE DA REATIVIDADE SORÓLOGICA E MOLECULAR
PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE DA
REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA – ES
Vitória 2007
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DOENÇAS INFECCIOSAS
JOSÉ ROBSON VENTURIM
ANÁLISE DA REATIVIDADE SORÓLOGICA E MOLECULAR
PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE DA
REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA – ES
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Doenças Infecciosas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre em Ciências – Patologia Geral das Doenças Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues.
Vitória 2007
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Venturim, José Robson, 1975- V469a Análise da reatividade sorológica e molecular para hepatite C em
pacientes de hemodiálise da região metropolitana de Vitória-ES / José Robson Venturim. – 2007.
86 f. : il. Orientador: Rodrigo Ribeiro Rodrigues. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Espírito Santo,
Centro de Ciências da Saúde. 1. Hepatite C. 2. Hemodiálise. 3. Sorologia. 4. Reação em cadeia de
polimerase. I. Rodrigues, Rodrigo Ribeiro. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. III. Título.
CDU: 614
À minha esposa Alessandra e ao meu filho Arthur, pelo
simples motivo da existência. Por tudo o que representam
para mim, por todas as alegrias e por todos os sorrisos.
Dedico a vocês este meu trabalho, com todo amor.
AGRADECIMENTOS
“...e quem um dia irá dizer que existe razão nas coisas feitas pelo coração ... e quem irá dizer quem não existe razão !”
Renato Manfredini Júnior
Ao Professor, Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, orientador desta dissertação, meu
agradecimento e gratidão, pelo compromisso, pelo entusiasmo contagiante, pelas
orientações, apoio, sugestões, esclarecimentos e a confiança em mim depositada.
Muito obrigado.
Ao Dr. Henrique Tommasi e ao Dr. Bruno O. Tommasi, por todo o apoio sob todos os
aspectos possíveis. Espero poder retribuir com minha seriedade e dedicação, por
tudo que me foi oferecido.
Ao Professor, Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, coordenador da Pós-Graduação,
por me ensinar o verdadeiro significado da palavra “professor”, minha mais profunda
admiração.
Ao Dr. Reynaldo Dietze, coordenador do Núcleo de Doenças Infecciosas, pelo apoio
e empenho na estruturação e manutenção deste centro de pesquisas, obrigado.
Ao Fabrício Martins e à Gabriela Nogueira do Instituto Tommasi de Pesquisa e
Desenvolvimento, agradecimentos muito especiais. Muito obrigado por todo apoio e
dedicação.
À Carla Baroni, um agradecimento muito especial, pela ajuda, apoio e dedicação.
Muito obrigado Carlinha. À Valéria pelas palavras e auxílio, sempre prestativo.
À equipe da Clinica Capixaba do Rim, especialmente Lucineide, Muriel e Ieda, pelo
apoio e prestatividade, muito obrigado.
Ao pessoal técnico do serviço de hemodiálise do Hospital Santa Rita de Cássia,
obrigado pela colaboração.
Ao Dr. Michel, do Instituto de Doenças Renais, responsável pelo serviço de
hemodiálise do Hospital da Associação dos Funcionários Públicos, obrigado.
À Kelly e Marcela da Fundação Sorológica Capixaba, obrigado pela ajuda. À Dra.
Regina e Fred do LACEN-ES, muito obrigado pelo apoio.
Ao meu amigo, Juan Mozart e ao pessoal da Roche diagnóstica, muito obrigado pelo
apoio.
Aos amigos Tatiana e Fabrício, pela amizade, pelo apoio, pelas conversas, pelo
incentivo mútuo, muito obrigado aos dois.
Aos meus amigos e colegas do mestrado: Cristina, Christiane, Ketene, João
Marcelo, Bianca, Renata e Marcela.
Aos colegas de trabalho do Laboratório Tommasi, em especial à Vanderléia,
Adryanna, Leonardo e Bianca pelo apoio e segurança em minhas ausências e
demais percalços.
Aos mestres da pós-graduação, por todo conhecimento e ensinamento, obrigado a
todos.
À Fátima, secretária da pós-graduação, pelo apoio e prestatividade.
Aos meus pais, em primeiro lugar pela minha vida e pela dedicação (e eu sei que
não foi pouca) para que eu pudesse chegar até aqui. Por todo o amor que sempre
por mim nutriram. Pela educação que me deram e respeito que me ensinaram a ter.
A vocês todo meu amor e toda minha gratidão, sempre. Nunca poderei agradecer a
contento. Obrigado de todo coração.
Ao meu irmão Cristiano, pelo amor fraternal, presença e lucidez, obrigado.
À minha esposa Alessandra, minha companheira. Obrigado por todo o amor, por
todo o carinho, pela ajuda nos momentos que caio, pela mão que ajuda a levantar e
seguir, pelo abraço nas conquistas.
Ao meu filho Arthur. Objetivo e sentido da minha vida, singela e intensa presença de
Deus em minha existência. Obrigado por iluminar o meu caminho.
"[...] acho que só há um caminho para a ciência — ou
para a filosofia: encontrar um problema, ver a sua beleza
e apaixonarmo-nos por ele; casarmo-nos com ele, até
que a morte nos separe — a não ser que obtenhamos
uma solução. Mas ainda que encontremos uma solução,
poderemos descobrir, para nossa satisfação, a existência
de toda uma família de encantadores, se bem que talvez
difíceis, problemas-filhos, para cujo bem-estar poderemos
trabalhar, com uma finalidade em vista, até ao fim dos
nossos dias".
Popper, K. R.
RESUMO
Este estudo teve por objetivo avaliar a reatividade de diferentes métodos
diagnósticos para hepatite C em amostras de pacientes em hemodiálise. Foi
focalizado, principalmente, na concordância entre os métodos sorológicos utilizados
para finalidade de triagem e métodos moleculares visando à confirmação da
infecção. O intuito fundamental foi avaliar se a amplitude da leitura dos testes
sorológicos atribui a estes, maior ou menor poder discriminatório frente aos métodos
moleculares. Foram analisadas amostras de sangue periférico de 50 pacientes de 5
serviços de hemodiálise, sendo 40 reativas em um método sorológico por
quimioluminescência e 10 negativas, inseridas como grupo controle. Outros dois
métodos sorológicos, ELISA colorimétrico e MEIA fluorimétrico, foram utilizados. Os
três métodos sorológicos foram comparados entre si e com os resultados de
métodos moleculares por PCR em tempo real e pelo método Amplicor®. As
amostras, que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os
métodos moleculares, foram submetidas à análise por “immunobloting”. O método
MEIA apresentou melhor correlação com os métodos moleculares do que ELISA e
CIA. Os resultados das análises demonstraram que valores mais elevados na
relação leitura da amostra / valor do “cut-off” (S/Co) dos testes sorológicos, possuem
melhor correlação com os métodos moleculares e com o “immunoblotting”. Para esta
avaliação este estudo seguiu os critérios do CDC, que classificam os resultados
como de alta reatividade ou baixa reatividade, de acordo com o valor de relação
S/Co que apresentam. A análise estatística pelo teste de Mann-Whitney, apresentou
diferença significativa (p < 0,05) nos valores de relação S/Co das amostras cujos
resultados sorológicos se confirmaram em PCR, daquelas cujos resultados não se
confirmaram. Foram encontrados resultados discrepantes, com resultados
sorológicos considerados altamente reativos nos três métodos, reatividade no
método de “immunoblotting” e resultados negativos em ambos os métodos
moleculares. Estes achados podem estar relacionados com um aspecto descrito em
diversos estudos que atribui à hemodiálise a capacidade da diminuição ou mesmo
eliminação da viremia para o VHC, entretanto, em cerca de 20 % dos casos na
história natural da infecção pelo VHC, pode ocorrer a resolução da infecção e desta
forma a detecção de anticorpos constitui o que se chama de “cicatriz sorológica”.
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the reactivity of different diagnostic methods for
hepatitis C in samples of hemodialysis patients. It focused mainly in agreement
between the serological methods used for purpose of screening and molecular
methods aiming to confirm the infection. The fundamental aim was to assess whether
the magnitude of the reading of serological tests attaches to them, more or less
discriminatory power front of molecular methods. We analyzed samples of peripheral
blood of 50 patients, 5 of hemodialysis services, and 40 in a reactive serologic
method by chemiluminescence and 10 negative, inserted as the control group. Two
other serological methods, colorimetric ELISA and MEIA fluorimetric were used. The
three serological methods were compared with each other and with the results of
molecular methods for real-time PCR method and the Amplicor®. The samples, which
showed disagreement between methods serological and molecular methods, were
subjected to analysis by "immunobloting." The method presented MEIA better
correlation with the molecular methods than ELISA and CIA. The results of the
analysis showed that higher values in the relationship reading of the sample / value
of the "cut-off" (S/Co) of serological tests, have better correlation with the molecular
methods and the "immunoblotting." For this evaluation this study followed the criteria
of the CDC, which classify the results as high reactivity or low reactivity, according to
the value of relationship S/Co presenting. Statistical analysis by the Mann-Whitney
test, showed a significant difference (p <0.05) in the values of respect S/Co of
serological samples whose results were confirmed in PCR, those whose results were
not confirmed. Discrepant results were found with serological results considered
highly reactive in the three methods, reactivity in the method of "immunoblotting” and
negative results in both molecular methods. These findings may be related to an
aspect described in various studies that attaches to the hemodialysis's capacity
reduction or even elimination of viremia for HCV, however, in about 20% of cases in
the natural history of HCV infection, the resolution may occur of the infection and
thus the detection of antibodies is what you call a "scar antibodies".
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. O Vírus da Hepatite C: Modelo estrutural e poliproteína sintetizada pela sua ORF .................................................................................... 19
Figura 2. Ciclo de vida do VHC. O vírus penetra na célula alvo pela interação
com receptores específicos e após o desnudamento, inicia seu processo de replicação ..................................................................... 20
Figura 3. Demonstração do comprometimento hepático que em geral se
observa no curso natural da hepatite C ................................................ 21
Figura 4. Padrões de resposta sorológica com a detecção de anticorpos
específicos na infecção pelo VHC, tanto em casos onde ocorre total recuperação (esquerda), quanto nos casos que evoluem para doença crônica (direita) ..................................................................... 23
Figura 5. O comprometimento do parênquima hepático, que perde o seu
modelo funcional (esquema superior esquerdo), devido ao processo que se instala e que termina por levar ao colapso hepático com extensa fibrose e cirrose macronodular (inferior direito) ............................................................................................... 26
Figura 6. Prevalência Mundial da Hepatite C em 2002, de acordo com a
Organização Mundial de Saúde ........................................................ 27
Figura 7. Prevalência da Hepatite C, em vários grupos populacionais nos Estados Unidos da América, segundo o CDC, em 2003 .................. 28
Figura 8. Proporção de testes de triagem sorológica por ELISA colorimétrico
para anticorpos anti-VHC, confirmados em “immunoblotting”, por faixa de valores expressos em relação amostra / “cut-off”, e grupos estudados .......................................................................................... 32
Figura 9. Proporção de testes de triagem sorológica por
quimioluminescência (VITROS®) para anticorpos anti-VHC, confirmados em “immunoblotting”, por faixa de valores expressos em relação amostra / “cut-off” e grupos estudados ............................. 32
Figura 10. Algoritmo apresentado pelo CDC para diagnóstico da Hepatite C ... 33
Figura 11. Gráfico esquemático representativo do funcionamento e
interpretação da PCR em tempo real ................................................ 46
Figura 12. Distribuição percentual dos resultados obtidos nos métodos de ELISA (A), CIA (B) e MEIA (C), para todas as 50 amostras do estudo, incluindo 10 amostras do grupo controle negativo ............... 57
Figura 13. Análise de concordância entre os métodos sorológicos. Os critérios utilizados para definição de baixa reatividade e alta reatividade foram definidos pelo CDC (USA). Os critérios de definição de amostras reativas, inconclusivas ou não-reativas são fornecidos pelos fabricantes dos reagentes e sistemas analíticos utilizados ..... 58
Figura 14. Análise comparativa dos resultados de cada amostra, expressos
em S/Co, nos três métodos sorológicos estudados, além do respectivo resultado dos dois métodos de biologia molecular utilizados ............................................................................................ 60
Figura 15. Correlação entre os resultados obtidos em ELISA colorimétrico
(MUREX®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 11; amostras reativas, n = 39 ; baixa reatividade, n = 4; alta reatividade, n = 35 ........................................ 61
Figura 16. Correlação entre os resultados obtidos em quimioluminescência
(Vitros ECi®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 10; amostras reativas, n = 40; baixa reatividade, n = 5; alta reatividade, n = 35 ........................................ 61
Figura 17. Correlação entre os resultados obtidos em MEIA (Axsym®) e PCR,
nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 12; amostras reativas, n = 38; baixa reatividade, n = 6; alta reatividade, n = 32 ............................................................................. 61
Figura 18. Representação estatística da associação entre os valores de
relação S/Co obtidos nos dois grupos de amostras reativas e o método de PCR. Para cada método os valores de “p” (probabilidade de significância) foram: ELISA x PCR: p = 0,0244; CIA x PCR: p = 0,0007; MEIA x PCR: p = 0,0001) ........................... 63
Figura 19. Representação estatística da Correlação Linear de Pearson em os
valores de CT no método de PCR em tempo real e os valores em S/Co de cada método sorológico estudado. Em nenhum dos métodos foi encontrada correlação estatisticamente significativa .... 65
Figura 20. Comparação entre os resultados dos métodos sorológicos e o
método de “immunoblotting”, considerando todas as amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os métodos moleculares (A); amostras que apresentaram alta reatividade sorológica (B) e amostras que apresentaram baixa reatividade sorológica e amostras não reativas (C). Foram desconsiderados os resultados considerados “indeterminados” ou “inconclusivos” ................................................................................... 67
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de relação S/Co, na sorologia para anticorpos anti-VHC, obtidos pelos estudos mencionados pelo CDC acima dos quais o VPP apresenta-se superior a 95 %................................................................................. 31
Tabela 2. Dados demográficos dos pacientes do estudo e grupo
controle................................................................................................ 39
Tabela 3. Características dos três ensaios de triagem sorológica para anticorpos anti-VHC utilizados ............................................................ 42
Tabela 4. Interpretação dos resultados da PCR qualitativa para VHC com
detecção de controle interno de amplificação – Amplicor® (Roche Diagnostics) ........................................................................................ 51
Tabela 5. Resultados individuais em cada um dos três métodos sorológicos
estudados (ELISA, MEIA e CIA), expressos em relação S/Co. As amostras 001 a 010 referem-se ao grupo controle; As amostras 013 a 059 referem-se ao grupo de estudo............................................................................. 55
Tabela 6. Estatística descritiva dos resultados obtidos nas análises sorológicas nos
três métodos estudados (ELISA, CIA e MEIA), separados por reatividade sorológica.............................................................................................. 56
Tabela 7. Resultados estatísticos descritivos obtidos para os grupos: (a) Constituído
de amostras cujos resultados sorológicos reativos não se confirmaram em PCR; (b) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos confirmaram-se em PCR. Resultados expressos em relação S/Co............................................................................................................... 62
Tabela 8. Estatística Descritiva – PCR em Tempo Real - TaqMan® Applied
Biosystems. Valores expressos em CT(“Cicle timing”, ponto em número de ciclos de amplificação onde a amostra apresenta fluorescência considerada positiva pelo sistema de detecção......................................... 64
Tabela 9. Comparação entre os resultados de “immunoblotting” e os demais
sorológicos e moleculares, para as amostras que apresentaram resultados discrepantes entre estes. Resultados dos métodos sorológicos expressos em relação S/Co..................................................................................... 66
LISTA DE SIGLAS
ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas
Abs: Absorbância
ALT: Alanina amino-transferase
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CIA: Imunoensaio quimioluminescente (“Chemiluminescent Immune assay”)
CD: Tipo de receptor celular observado em leucocitos (“Cluster of differentiation”)
CDC: Centro de prevenção e controle de doenças infecciosas - USA (“Center of
Disease Control and Prevention”)
CNES: Cadastro Nacional de estabelecimentos de saúde
CNPJ: Cadastro Nacional de Pessoa Jurídica
CT: Número de ciclos de amplificação necessários para a detecção (“Cicle timing”)
C1q: Componente do complemento
C1qR: Receptor de C1q
DNA: Ácido Desoxirribunucléico (“Desoxirribonucleic acid”)
ELISA: Imunoensaio enzimático ligado à enzima (“enzyme linked immuno sorbent
assay”)
HBsAg: Antígeno de superfície do vírus da hepatite B (“Hepatitis B surface antigen”)
HBV: Vírus da hepatite B (“Hepatitis B virus”)
HRP: Peroxidase de rábano
IC: Intervalo de confiança
IFN: Interferon
Ig: Imunoglobulina
IL: Interleucina
IPC: Controle positivo interno de amplificação (“Internal Positive Control”)
Log: Unidade de medição em escala logarítimica
MEIA: Imunoensaio enzimático fluorescente microparticulado (“Microparticle Enzyme
Immunoassay”)
min: Minuto
mL: Mililitro
mM: Milimol � L: Microlitro
� M: Micromol
NAT: Teste de ácido nucléico (“Nucleic Acid Test”)
NHP: Plasma-controle humano normal
NK: “Natural killer”
nm: Nanômetros
ORF: Região de leitura aberta (“Open Reading Frame”)
p: Probabilidade de significância estatística
PCR: Reação da polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction”)
r: Coeficiente de correlação estatística
RDC: Resolução de Diretoria Colegiada
RNA: Ácido ribonucléico (“Ribonucleic acid”)
seg: Segundo
SUS: Sistema Único de Saúde
Th1: T helper
TMB: Tetrametilbenzidina
VHC: Vírus da Hepatite C (HCV, “Hepatitis C Virus”)
WB: Tampão de lavagem (“Wash Buffer”)
SUMÁRIO 1 Introdução …………………………………………………………………….. 18
1.1 A hepatite C e seu agente etiológico ……………………………………...... 18
1.2 História natural da hepatite C …………….................................................. 20
1.3 Aspectos Imunológicos da Infecção pelo VHC e do Diagnóstico
Sorológico …………………….....................................................................
22
1.4 Patogênese da hepatite C ......................................................................... 25
1.5 Epidemiologia da hepatite e sua relação com a hemodiálise ................... 26
2 Objetivos .................................................................................................. 36
3 Materiais e métodos ................................................................................ 38
3.1 Caracterização do estudo ......................................................................... 38
3.2 Caracterização dos indivíduos de estudo ................................................. 38
3.3 Considerações éticas ................................................................................ 39
3.4 Análises estatísticas .................................................................................. 40
3.5 Imunoensaios ............................................................................................ 40
3.6 Métodos de Biologia Molecular ................................................................. 42
3.6.1 PCR em tempo real ................................................................................... 43
3.6.2 PCR Qualitativa – Amplicor® v2.0 ............................................................. 47
3.7 Immunoblotting .......................................................................................... 52
3.8 Formatação e normas técnicas ................................................................. 52
4 Resultados ............................................................................................... 54
4.1 Análises Sorológicas ................................................................................. 54
4.2 Análise dos Métodos de Biologia Molecular ............................................. 59
4.3 Análise estatística da correlação entre os métodos estudados ................ 62
4.4 Immunoblotting .......................................................................................... 65
5 Discussão ................................................................................................ 69
6 Conclusões .............................................................................................. 74
7 Referências .............................................................................................. 77
8 Anexo ....................................................................................................... 85
Introdução
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 A Hepatite C e seu agente etiológico
O vírus causador da hepatite C (VHC) foi identificado e descrito em 1989 por Choo e
col.. Sua estrutura de 50nm e nucleocapsídeo envelopado, é de um vírus RNA de
fita simples que apresenta polaridade positiva (aproximadamente 10.000
nucleotídeos), formando uma longa fase de leitura aberta ou ORF (do inglês “open
reading frame”) a qual codifica uma poliproteína de aproximadamente 3010
aminoácidos (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005). Esta poliproteína contém tanto
proteínas estruturais (Core, E1 e E2) quanto não-estruturais (NS1, NS2, NS3, NS4 e
NS5) responsáveis pela replicação do vírus (STRAUSS, 2001). O VHC é classificado
como membro da família Flaviviridae e gênero Hepacivirus, sendo considerado a
mais freqüente causa de hepatites virais crônicas (PAROLIN et al., 2005). O VHC
apresenta alta taxa de mutação (1 em 1000 bases por ano) (REHERMANN;
NASCIMBENI, 2005), o que pode provocar a um aumento na diversidade viral. A
análise filogenética do vírus levou à definição de 6 genótipos (denotados pelos
números de 1 a 6), com cerca de 20 a 35 % de diferenças na seqüência de
nucleotídeos e mais de 50 subtipos (denotados pelas letras a, b, c,... adicionadas
subsequentemente ao número do genótipo) (STRAUSS, 2001).
Variações encontradas dentro de um mesmo genótipo e subtipo, provavelmente
relacionadas à replicação imperfeita do vírus, levam ao aparecimento de
”quasispecies”. Uma associação entre o aparecimento de “quasispecies” e pressão
imunológica, exercida pelo hospedeiro, tem sido observada. A ocorrência de
“quasispecies” é frequentemente menor nos estágios iniciais da doença quando
comparadas à encontrada na doença avançada crônica (REHERMANN;
NASCIMBENI, 2005).
Considerando-se que o VHC é um patógeno humano, a inexistência de modelos
experimentais, seja através da utilização de animais de experimentação (com
exceção do chimpanzé, modelo este que apresenta custos elevados e aspectos
Introdução
19
éticos cada vez mais controversos) ou através de cultivo celular que possam ser
adaptados, torna muito difícil o estudo da hepatite C (STRAUSS, 2001).
Figura 1 – O Vírus da Hepatite C: Modelo estrutural e poliproteína sintetizada pela sua ORF. Fonte: www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/03006938h.htm (adaptado)
O VHC não se integra ao genoma do hospedeiro e exibe uma meia-vida de cerca de
3 horas, com uma cinética viral da ordem de 1012 vírions por dia. O VHC promove
elevada viremia após uma semana de infecção (REHERMANN; NASCIMBENI,
2005), a qual diminui entre 8 a 12 semanas pós-infecção. Os sintomas relacionados
à icterícia são atribuídos à lesão tecidual hepática promovida pela ação da resposta
imunitária mediada por células T, sendo observados raramente nos casos de
hepatite C, diferentemente do que ocorre na hepatite B. A maioria dos pacientes
desenvolve hepatite crônica e os títulos de RNA viral se estabilizam cerca de 2 – 3
logs abaixo do observado na fase aguda da doença (REHERMANN; NASCIMBENI,
2005). Após a entrada na célula, o nucleocapsídeo do VHC penetra no citoplasma e
o RNA viral assume as funções de RNA mensageiro diretamente, efetuando a
tradução de sua longa poliproteína. A replicação do vírus ocorre no citoplasma, junto
Introdução
20
à membrana perinuclear no chamado complexo de replicação associado à
membrana (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005); Este complexo atua
conjuntamente com o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi, na montagem
final das partículas virais que serão liberadas, conforme demonstrado na figura 2.
Figura 2: Ciclo de vida do VHC. O vírus penetra na célula alvo pela interação com receptores específicos e após o desnudamento, inicia seu processo de replicação. Fonte: http://www.tibotec.com/content/backgrounders/www.tibotec.com/hcv_lifecycle.html (adaptado).
1.2 História Natural da Hepatite C
A hepatite C apresenta um período de incubação bastante variável, tendo em média
de 6 a 12 semanas, podendo até ser superior a 12 meses após a infecção pelo
vírus. Durante esta fase o único marcador confiável é a detecção do RNA viral, uma
vez que a produção de anticorpos específicos não ocorre imediatamente devido à
“janela imunológica”, que pode durar de 4 até 20 semanas, o que dificulta o
diagnóstico sorológico (STRAUSS, 2001). Uma vez detectados, os anticorpos
continuarão a ser encontrados mesmo após a cronificação da doença, o que
geralmente ocorre em mais de 80 % dos casos. Destes, 5 a 30 % evoluem para
Introdução
21
cirrose hepática, após 10 a 20 anos e posteriormente ao hepatocarcinoma (HWANG,
2001), sendo este um dos aspectos mais alarmantes da infecção pelo VHC. De
acordo com estudos retrospectivos, os intervalos entre a infecção pelo VHC e a
detecção de seqüelas variam de 10 a 14 anos para hepatite C crônica, 21 a 25 anos
para cirrose hepática e 28 a 29 anos para hepatocarcinoma (HWANG, 2001).
Figura 3: Demonstração do comprometimento hepático que em geral se observa no curso natural da hepatite C. Fonte:http://hopkins-gi.nts.jhu.edu/pages/latin/templates/ index.cfm?pg=disease1& organ=2&disease=18&lang_id=1(adaptado)
Um aspecto importante na história natural da hepatite C encontra-se associado aos
pacientes em hemodiálise, sendo este grupo um dos mais estudados a partir de
1990. Furusyo e col. (2000) demonstraram que os níveis plasmáticos de RNA viral
do VHC, decresciam em pacientes portadores de hepatite C crônica, submetidos à
hemodiálise. Porém, neste grupo de pacientes estudado não havia indícios de um
“clearence” (depuração) da viremia. Alguns anos antes, Okuda e col. (1996) e
Hayashi e col. (1997), haviam demonstrado, no Japão, que partículas virais podiam
ser adsorvidas pelas membranas de diálise e destruídas pela pressão hidráulica do
sistema. Estes dados foram confirmados por outros estudos subseqüentes, como
Fabrizi e col. (2003) e Ishida e col. (2004), sendo que estes últimos, embora
demonstrem que membranas de polissulfonas exerçam um efeito mais significativo
na diminuição da viremia, salientam que somente um estudo longitudinal poderia
demonstrar, de forma conclusiva, o impacto desta observação na dinâmica da
infecção pelo VHC nestes pacientes.
Introdução
22
Recentemente, um estudo caso-controle publicado por Okuda e Yokosuda (2004),
demonstrou que este impacto pode ser extremamente significativo. Neste estudo,
com seguimento variando entre 4-23 anos, todos os 25 pacientes-casos, positivos
para anticorpos contra o VHC e em processo de hemodiálise, acompanhados por
mais de 15 anos, permaneceram assintomáticos. Além disso, em 15 destes 25 (60
%) a detecção de RNA viral não era mais possível, após determinado período de
tempo. Entretanto, um quarto dos pacientes-controles não dialisados, diagnosticados
como portadores de infecção pelo VHC no mesmo mês dos pacientes-casos com os
quais foram pareados, progrediram para um quadro de cirrose hepática. Desta
maneira, estes autores demonstraram que pacientes com hepatite C crônica
submetidos à hemodiálise apresentam um decréscimo nos níveis de RNA-VHC no
sangue, bem como após um longo período pode ocorrer até mesmo o “clearence”
(depuração) da viremia. Estes dados sugerem que a hemodiálise pode alterar o
curso da infecção pelo VHC nestes pacientes.
1.3 Aspectos Imunológicos da Infecção pelo VHC e do Diagnóstico
Sorológico
Ao contrário da hepatite B, anticorpos neutralizantes não oferecem imunidade
protetora ao VHC e até o presente momento, não existe vacina eficaz disponível
(STRAUSS, 2001). A resposta imune celular adaptativa somente se manifesta após
aproximadamente um mês e a resposta humoral após cerca de dois meses, o que
levou ao aparecimento de várias hipóteses relacionadas à capacidade do VHC em
subverter o aparecimento de uma resposta imune adaptativa (REHERMANN;
NASCIMBENI, 2005). Anticorpos específicos para o VHC são detectáveis,
geralmente, após aproximadamente 12 semanas e eles não indicam a possibilidade
de soroconversão (como ocorre na hepatite B). O diagnóstico da infecção pode ser
feito pela detecção de anticorpos em indivíduos onde estes sabidamente não eram
detectáveis. Para esta finalidade são utilizados os testes de triagem sorológica.
Estes testes devem ser seguidos da realização de ensaios de maior especificidade,
como testes de “immunoblotting” ou testes de ácido nucléico (como a PCR). No
entanto, embora a resposta imune exibida obedeça ao padrão típico, com a resposta
Introdução
23
imune inata se manifestando inicialmente e coordenando a resposta adaptativa, esta
parece não ser eficiente e inicia-se com um atraso significativo.
Figura 4: Padrões de resposta sorológica com a detecção de anticorpos específicos na infecção pelo VHC, tanto em casos onde ocorre total recuperação (esquerda), quanto nos casos que evoluem para doença crônica (direita). Fonte: www.thailabonline.com/ hepatitisc.htm (adaptado)
O VHC induz uma mudança na expressão intra-hepática de genes relacionados à
resposta de interferon (IFN) do tipo I. Mesmo com esta indução da produção de IFN
pela resposta inata, o VHC consegue se estabelecer e dar origem a uma infecção
crônica. Pacientes que se recuperam espontaneamente da hepatite C, tipicamente
conseguem montar uma resposta celular do tipo T CD4+ e CD8+ vigorosas.
Entretanto, pacientes com doença crônica exibem uma resposta do tipo T-
dependente tardia, transitória ou mesmo inexistente (REHERMANN; NASCIMBENI,
2005). Estas observações sugerem a existência de uma associação significativa
entre a resposta imune celular e o curso da infecção pelo VHC. Alguns estudos
indicam que o aparecimento de resposta celular do tipo Th1 e a indução da
expressão de IFN-γ no fígado de chimpanzés infectados, coincidiam com o
decréscimo dos níveis de RNA viral. Utilizando-se ensaios funcionais, células T VHC
- específicas foram detectadas tanto em amostras de sangue de pacientes e
chimpanzés infectados, no período de 5 a 9 semanas após a infecção, quanto em
amostras de biópsias hepáticas em chimpanzés entre 6 a 12 semanas após a
infecção (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).
Introdução
24
Uma das hipóteses mais mencionadas para a incapacidade do sistema imunológico
em eliminar o VHC, se concentraria no desequilíbrio entre as respostas Th1 e Th2,
uma vez que a resposta do tipo Th1 estaria relacionada com uma maior capacidade
de ação anti-viral (STRAUSS, 2001). Entretanto, os mecanismos de escape viral do
VHC dependem, provavelmente, de outros fatores virais e/ou do hospedeiro.. A
formação de “quasispecies” contribui para uma rápida diversificação da população
viral. O aparente atraso na ação da resposta adaptativa, seja celular ou humoral,
facilitaria ainda mais este processo, de forma que mutantes eficientes nos processos
de escape possam se desenvolver (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).
Diversos outros mecanismos foram propostos e apresentados como correlacionados
a esta capacidade do VHC. Um deles está relacionado a uma seqüência específica
na proteína do core do VHC que exibe capacidade de se ligar ao domínio globular
do receptor de C1q (componente do complemento expresso na superfície de
macrófagos e células T). Esta ligação leva a uma hiporegulação na produção de IL-
12 pelos macrófagos e conseqüentemente, uma hipoproliferação e diminuição de
produção de IL-2 e IFN-γ pelas células T (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005). A
ligação do core com o ligante de C1q, C1qR, ocorre de forma mais acentuada nas
células CD8+ do que as células CD4+, devido a uma maior expressão deste
receptor entre as células T citotóxicas. Esse fenômeno leva a uma supressão, mais
acentuada, da proliferação da população de células T CD8+, comprometendo a
resposta celular citotóxica, fato provavelmente responsável pela escassez de
sintomas na hepatite C aguda, uma vez que estes sintomas são geralmente
associados à lesão tecidual provocada pela citotoxicidade da resposta imune (YAO
et al, 2004). Como a proteína do core do VHC é a primeira proteína produzida após
a infecção viral, este mecanismo poderia ajudar a esclarecer a razão pelo atraso na
resposta adaptativa celular e humoral ao VHC (EISEN-VANDERVELDE et al, 2004).
O receptor responsável pela ligação do VHC à célula ainda não é conhecido. Porém,
recentemente, dados obtidos em estudos “in vitro” demonstraram que, em altas
concentrações, a proteína recombinante E2 do VHC, liga-se cruzadamente com a
proteína CD81, presente na superfície de células NK (“Natural Killer”), inibindo sua
citotoxicidade e a produção de citocinas (REHERMANN; NASCIMBENI, 2005).
Introdução
25
1.4 Patogênese da hepatite C
O VHC é, provavelmente, o vírus de maior diversidade antigênica dentre os vírus
que infectam humanos. Entretanto, muitas evidências clínicas sugerem que fatores
do hospedeiro são importantes na persistência viral ou na "cura" da infecção
(THOMAS; SEEFF, 2005).
A magnitude dos dados clínicos disponíveis na avaliação do paciente portador de
hepatite C crônica é, em geral, contrária aos efeitos celular do VHC. Alterações
histológicas mínimas, ou mesmo ausentes, ausência de sinais e sintomas ou mesmo
alterações laboratoriais dignas de nota, além é claro de uma longa evolução da
doença e a carga viral elevada, são características da infecção pelo VHC
(STRAUSS, 2001). Várias evidências têm sugerido que as lesões hepáticas estão
diretamente relacionadas a mecanismos imunológicos. Esperadamente, isto inclui a
modulação da resposta adaptativa para os pólos Th1, com maior ação anti-viral ou
Th2, onde predomina a produção de anticorpos, os quais se mostram ineficazes na
infecção pelo VHC, em detrimento de uma melhor ação celular de ação anti-viral
mais eficiente (STRAUSS, 2001).
A lesão hepática, propriamente dita, ocorre devido a ação de células citotóxicas
sobre a célula infectada. Considerando-se que o processo ocorre de forma crônica,
com intensidade e velocidade variáveis e a resposta inflamatória é incompleta, ou
seja, ineficiente na eliminação do VHC, a resposta imune acaba por ser o principal
responsável pela fibrose hepática, fator preponderante de progressão da doença
(STRAUSS, 2001). Diversos estudos sugerem que a persistência viral ocorre devido
a ineficácia da resposta imune inata a qual pode levar a um retardamento da ação
da resposta imune adaptativa (THOMAS; SEEFF, 2005). Obviamente, outros fatores
podem estar associados à progressão da doença como idade, uso de álcool e
medicamentos hepatotóxicos, infecção concomitante por outros vírus,
imunodeficiências, presença de outras doenças e o genótipo do VHC envolvido na
infecção (STRAUSS, 2001). Apesar de não possuírem uma significância estatística,
dados epidemiológicos sugerem que pacientes infectados pelo VHC do genótipo 1b,
Introdução
26
apresentam um prognóstico pior e uma evolução mais rápida para as formas mais
graves da doença (STRAUSS, 2001).
Figura 5: O comprometimento do parênquima hepático, que perde o seu modelo funcional (esquema superior esquerdo), devido ao processo que se instala e que termina por levar ao colapso hepático com extensa fibrose e cirrose macronodular (inferior direito). Fontes:http://hopkins-gi.nts.jhu.edu/pages/latin/templates/index.cfm?pg=disease1& organ=2&disease=18&lang_id=1 e http://library.med.utah.edu/WebPath/LIVEHTML
1.5 Epidemiologia da Hepatite C e sua relação com hemodiálise
A definição de hepatite crônica, normalmente empregada, implica na persistência da
detecção do RNA viral por um período superior a 6 meses. Na infecção pelo VHC foi
demonstrado que esta persistência é da ordem de 75 a 85 % (THOMAS; SEEFF,
2005). Em 2005 aproximadamente 170 milhões de pessoas em todo o mundo eram
portadores de infecção crônica pelo VHC, sendo esta a causa mais freqüente de
indicação para transplantes de fígado nos Estados Unidos da América e na Europa
(KEEFFE, 2005).
Introdução
27
Figura 6: Prevalência Mundial da Hepatite C em 2002, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Fonte: www.molecular-virology.uni-hd.de/rsr/area_hcv.htm
A hepatite C é uma doença infecciosa de transmissão predominantemente
parenteral (STRAUSS, 2001), apesar da possibilidade de transmissão pelas vias
materno-fetal (vertical), mesmo que com menor eficiência em relação à transmissão
do vírus da hepatite B e sexual (TENGAN et al, 2001). A hepatite C representa um
sério problema de saúde pública, principalmente em instituições onde o uso de
sangue, hemoderivados ou terapias que podem propiciar o contato dos pacientes
com o vírus, como serviços de hemodiálise.
Foi demonstrado, que o VHC é o agente causador da grande maioria das hepatites
virais pós-transfusionais (STRAUSS, 2001). Desta forma, todas as pessoas que
receberam transfusão de sangue ou hemoderivados, antes do início da triagem
sorológica para o VHC, iniciada na década de 1990, devem ser consideradas como
portadoras do vírus em potencial (STRAUSS, 2001). “A maioria das hepatites, que
ocorre entre pacientes em tratamento por hemodiálise [...] é causada pelo vírus da
hepatite do tipo C” (SALOM, apud LAZZARINI et al, 2000).
Os testes para diagnóstico de hepatite C disponíveis, atualmente, incluem testes de
triagem sorológica para anticorpos contra o VHC realizados por imunoensaios
enzimáticos (EIE). Estes testes sorológicos diferenciam-se quanto às diferentes
regiões virais utilizadas como antígeno da fase sólida. Desta forma, existem
Introdução
28
disponíveis os chamados testes de primeira, segunda ou terceira geração que
basicamente incluem um maior número de antígenos diferentes representando as
regiões estrutural e não-estrutural do vírus. Outros testes para diagnóstico da
infecção pelo VHC são os testes sorológicos mais específicos como
“immunobloting”, além de técnicas de biologia molecular como a pesquisa do RNA-
VHC por testes de ácidos nucléicos (NAT) como PCR ("Polimerase Chain Reaction"
ou Reação da polimerase em cadeia).
Dados recentes demonstram que a prevalência do VHC encontra-se elevada entre
pacientes dos serviços de hemodiálise. O MMWR (“Morbidity and Mortality Weekly
Report” – Relatório Semanal de Morbidade e Mortalidade) Vol. 52, 167 RR-3 do
CDC (USA) de 07 de fevereiro de 2003 classifica a população de pacientes de
hemodiálise como uma população de média prevalência indicando uma taxa de
prevalência de 9,5 %, com base em grandes estudos multicêntricos realizados.
Figura 7: Prevalência da Hepatite C, em vários grupos populacionais nos Estados Unidos da América, segundo o CDC, em 2003. Fonte: CDC (adaptado) No Brasil existem poucos dados oficiais sobre a prevalência do VHC em pacientes
de hemodiálise. Foi observada uma prevalência de 23,8 % em Salvador-BA
(SANTANA et al, 2001) e 52,0 % em Fortaleza-CE (MEDEIROS et al, 2004), sendo
que no primeiro estudo foi utilizado método de “immunoblotting” como confirmatório
além da triagem sorológica, enquanto no segundo estudo os dados representam
apenas os resultados da triagem sorológica. Naghettini e col. (1997), em Goiânia-
GO, demonstraram a existência de uma variabilidade na determinação da
Introdução
29
prevalência associada à metodologia utilizada. Estes autores, quando utilizaram
apenas a detecção do anti-VHC por um ELISA de 2ª geração obtiveram prevalência
de 35,3 % na população estudada (n=173), porém, ao utilizar um teste confirmatório
tipo “line immunoassay” (INNO-LIA® VHC Ab, Innogenetics) encontraram uma
prevalência de 25 % para a mesma população. Mesmo assim, apesar da
variabilidade gerada pelos diferentes métodos, os resultados encontrados
apontavam para uma prevalência mais elevada nos serviços de hemodiálise
brasileiros para o VHC.
Estudos mais recentes apontam para uma redução desta prevalência, devido à
adoção de medidas relacionadas ao monitoramento e diminuição do risco de
transmissão do vírus. Albuquerque e col. (2005), em Recife-PE, avaliando um grupo
de 250 pacientes de hemodiálise encontraram prevalência de 8,4 % quando
utilizando um teste de ELISA e 7,6 % quando da pesquisa do RNA do VHC. De
forma semelhante, Carneiro e col. (2005), em Goiânia-GO, demonstraram
diminuição significativa na incidência de casos de VHC, diminuindo de 71 % no
período de 1993 – 2002, para 34,2 % no período de 1996 – 2002 e para 11,7 %
considerando o período de 1999 – 2002.
Os procedimentos visando à diminuição da contaminação nestes serviços incluem,
além das medidas preventivas obrigatórias de biossegurança, o uso de máquinas de
diálise independentes para pacientes contaminados pelo VHC e pacientes cujos
exames sorológicos não apresentam reatividade para o VHC. Estes exames são
realizados periodicamente com o intuito de monitorar a possibilidade de
contaminação dos pacientes usuários dos serviços e assim estabelecer o
fluxograma de hemodiálise dos mesmos. A RDC nº 154, de 15 de junho de 2004 da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que estabelece o regulamento
técnico para o funcionamento de serviços de diálise, descreve em detalhes os
procedimentos e estruturas, necessários à segurança destes procedimentos.
Tanto o algoritmo para diagnóstico do VHC recomendado pelo CDC (figura 10),
quanto o recomendado pelo Ministério da Saúde no Brasil (Brasil, 2002), incluem a
presença de testes confirmatórios para os casos de positividade sorológica. O
Introdução
30
Ministério da Saúde estabelece a necessidade da realização da pesquisa de RNA-
VHC em todos os pacientes cujos testes sorológicos de pesquisa de anticorpos anti-
VHC revelaram-se reagentes. Apesar desta determinação, a realização dos testes
de biologia molecular dificilmente é realizada rotineiramente pelos programas de
hemodiálise para pesquisa do RNA-VHC, devido às dificuldades existentes para o
custeio destes procedimentos. Esta realidade compromete o monitoramento correto
da infecção pelo VHC nestes pacientes, uma vez que boa parcela dos serviços de
hemodiálise no Brasil é realizada por instituições privadas ou filantrópicas,
conveniadas ao Sistema Único de Saúde (SUS). Desta forma, na maioria das vezes,
os testes sorológicos para pesquisa de anticorpos anti-VHC constituem-se no único
critério de classificação de reatividade ou não reatividade. Estes resultados definem
qual o tratamento a ser dado aos pacientes no momento da hemodiálise, embora os
centros de referência em diagnóstico e tratamento da hepatite C, já tenham
incorporado os métodos de biologia molecular no diagnóstico.
A proporção de testes de triagem sorológica reativos, confirmados nos testes
suplementares, aumenta à medida que aumenta a prevalência do VHC na
população estudada. Além disto, nos testes sorológicos em que o resultado final é
expresso na forma de relação entre leitura da amostra / valor do “cut-off” (S/Co), o
valor preditivo positivo (VPP) dos testes de triagem sorológica elevam-se
consideravelmente quando se utilizam valores mais elevados desta relação como
limites de corte para a reatividade (CDC, 2003). Entretanto, foi demonstrado que as
amostras reativas que apresentam baixa relação S/Co demonstram um
comportamento oposto ao observado pelas amostras que apresentam alta relação
S/Co. Enquanto que a proporção de testes de triagem sorológica com alta relação
S/Co que são confirmados em testes mais específicos, aumenta conforme aumenta
a prevalência da população estudada, os resultados com baixa relação S/Co
diminuem sua confirmação de positividade conforme aumenta a prevalência do VHC
na população estudada (CDC, 2003).
Em 2003, o CDC elaborou um relatório estabelecendo uma série de recomendações
acerca dos testes de detecção de anticorpos anti-VHC, que enfocam principalmente
dois aspectos:
Introdução
31
a. Recomendação da realização de testes mais específicos para confirmação,
sejam eles sorológicos (“immunoblotting” como o RIBA®) ou testes de biologia
molecular (PCR), particularmente em populações que apresentam uma baixa
prevalência da doença, com a finalidade de identificar e excluir casos falso-
positivos de triagem sorológica.
b. Recomendação do uso de um algoritmo que utiliza a relação S/Co,
estabelecendo que testes reativos na triagem sorológica, cujos resultados
apresentem valores de relação S/Co iguais ou superiores aos que foram
estabelecidos (tabela 1) como de VPP igual ou superior a 95 %, sejam
reportados com positivos sem a necessidade de realização de testes
suplementares. Esta recomendação é salientada particularmente em
populações de maior prevalência da hepatite C (entre elas pacientes de
serviços de hemodiálise).
Tabela 1: Valores de relação S/Co, na sorologia para anticorpos anti-VHC, obtidos pelos estudos mencionados pelo CDC acima dos quais o VPP apresenta-se superior a 95 %.
Teste de Triagem Sorológica Valor da relação S/Co a partir da qual o teste apresenta VPP acima de 95%
ELISA colorimétrico (Foram avaliados dois kit’s: Ortho
HCV Version 3.0 e Abbott HCV EIA 2.0)
3.8
Quimioluminescência (CIA) Ortho Vitros ECi Anti-HCV
8.0
Imunoensaio Fluorescente Microparticulado (MEIA) Abbott
Axsym HCV
10.0
Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/c/sc_ratios.htm (adaptado).
As figuras 8 e 9 demonstram os resultados encontrados, pelo CDC, para os métodos
sorológicos de ELISA colorimétrico e quimioluminescência, respectivamente, em
diversas populações estudadas.
Introdução
33
Na prática laboratorial não são incomuns valores de relação S/Co para o teste de
anticorpos anti-VHC considerados de baixa reatividade em pacientes
hemodialisados. Resultados como estes não apresentam uma confiabilidade
adequada para permitir que qualquer decisão seja tomada, o que torna necessária à
realização de testes suplementares confirmatórios.
Figura 10: Algoritmo apresentado pelo CDC para diagnóstico da Hepatite C. Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/resource/posters.htm (modificado). Muitos estudos, realizados com a finalidade de avaliar a especificidade dos testes
sorológicos de terceira geração, utilizaram-se de amostras de doadores de sangue.
Porém, diferentemente dos doadores de sangue, pacientes em situações diversas
como portadores de alguma infecção, doenças hepáticas, doenças auto-imunes,
mulheres grávidas e pacientes com limitações fisiológicas, como pacientes de
hemodiálise, estão sujeitos à possibilidade de ocorrência de reações inespecíficas,
interferindo com os testes sorológicos (ZACHARY et al, 2005). Tendo em vista que a
maioria dos testes sorológicos foi desenvolvida, nitidamente, privilegiando a
Introdução
34
sensibilidade na detecção da infecção pelo VHC em detrimento da melhor
especificidade, muitos estudos ao longo dos anos enfocaram a ocorrência de
resultados falso-positivos (BAR-SHANY et al, 1996; COLIN et al, 2001; POLYWKA et
al, 2001; OETHINGER et al, 2005; ZACHARY et al, 2005).
A proposta deste estudo tem por objetivo avaliar a relação S/Co (leitura da amostra /
valor do “cut-off”) dos testes sorológicos e sua correlação com os resultados obtidos
em métodos de pesquisa do RNA viral do VHC (PCR) e métodos sorológicos
suplementares (“immunoblotting”), nos casos discrepantes. A ocorrência de
resultados falso-positivos e a proporção desta ocorrência em diferentes faixas de
resultados obtidos na relação S/Co, para os três métodos de triagem sorológica
estudados. Neste estudo foram utilizados dois métodos diferentes de detecção do
RNA viral, de forma que também analisamos o grau de concordância entre os
mesmos, além da sua correlação com os testes sorológicos. As amostras
discordantes entre sorologia e métodos moleculares, foram avaliadas pelo método
de “immunoblotting”.
O presente estudo também busca avaliar se as recomendações quanto ao critério de
alta reatividade e baixa reatividade, elaboradas pelo CDC em 2003, aplicam-se aos
resultados das amostras de pacientes dos serviços de hemodiálise estudados. REN
e colaboradores (2005) demonstraram a aplicabilidade do algoritmo, proposto pelo
CDC, ao analisarem vários testes de triagem sorológica em amostra de bancos de
sangue chineses. Também demonstraram existir relevância no uso da relação S/Co,
em virtude da correlação entre a elevação desta e o aumento da confirmação da
infecção.
Objetivos
36
2 OBJETIVOS
Avaliar a relevância estatística da relação S/Co (leitura da amostra / valor do “cut-
off”), obtida em diferentes métodos sorológicos e sua correlação com métodos
moleculares como a PCR e, nos casos discrepantes, com métodos sorológicos
suplementares como o “immunoblotting”;
Avaliar a concordância entre os métodos sorológicos para detecção de anticorpos
para o VHC;
Avaliar a aplicabilidade dos critérios estabelecidos pelo CDC em 2003, quanto à
classificação dos resultados em baixa ou alta reatividade sorológica, em pacientes
dos serviços de hemodiálise estudados.
Materiais e Métodos
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização do estudo
O estudo em questão caracteriza-se por ser um estudo do tipo descritivo transversal
do tipo análise comparativa. As metodologias diagnósticas avaliadas neste estudo
foram comparadas sob o ponto de vista paramétrico e não-paramétrico. O estudo
busca ainda atribuir relevância aos valores encontrados, também do ponto de vista
estatístico.
3.2 Caracterização dos indivíduos de estudo
A população alvo deste estudo é formada por pacientes dos serviços de hemodiálise
atendidos pelo laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas Ltda, na região
metropolitana de Vitória - ES, a saber: Serviço de hemodiálise do Hospital da
Associação dos Funcionários Públicos – Vitória - ES; Serviço de hemodiálise do
Hospital Santa Rita de Cássia – Vitória-ES, Clínica Capixaba do Rim – Unidades em
Vitória - ES, Serra - ES e Cariacica - ES.
No universo de pacientes atendidos, foi encontrado um número total de 43
indivíduos, com testes sorológicos reagentes (Vitros ECi® “Anti-HCV assay”), o que
perfaz aproximadamente 10,16 % do universo de pacientes atendidos (423
pacientes), sendo este, portanto o “n” pretendido para este estudo. No entanto,
alguns indivíduos tiveram que ser excluídos do grupo de estudo, por motivo de óbito
(1 indivíduo) e por mudança ou abandono do tratamento (2 indivíduos). Desta forma
foram considerados como grupo de estudo, 40 indivíduos. Sendo considerado como
critério de inclusão a reatividade sorológica para VHC e estar paciente sob
tratamento por hemodiálise.
Um grupo controle foi constituído de 10 indivíduos (correspondente a 25 % do total
de amostras reativas), sorologicamente não reativos para o VHC e escolhidos de
forma aleatória (por sorteio) entre o universo de pacientes. Todos as amostras,
incluindo o grupo controle, foram testadas sorologicamente para anticorpos anti-HIV
Materiais e Métodos
39
1 e 2 e também para o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg),
visando avaliar a possibilidade da presença de co-infecção por estes vírus, em todas
as amostras analisadas os resultados foram não reagentes, indicando a provável
inexistência de co-infecção nas amostras estudadas, para este vírus.
As amostras de soro e plasma obtidas foram aliquotadas e congeladas a - 20° C, as
alíquotas foram destinadas às análises sorológicas e de biologia molecular. As
análises sorológicas antecederam as análises de biologia molecular em cerca de 3
meses. Do total de amostras analisadas no grupo de estudo, 11 amostras
apresentaram resultado negativo para a pesquisa do RNA do VHC, além das 10
amostras do grupo controle. Considerando-se que todas as amostras apresentaram
ao menos um resultado sorológico reagente para anticorpos anti-VHC, todas estas
11 amostras foram coletadas novamente visando à confirmação do resultado da
PCR, tendo em vista a baixa estabilidade do RNA “in vitro”.
Os dados demográficos, dos pacientes dos grupos de estudo e controle, são
apresentados na tabela 2.
Tabela 2: Dados demográficos dos pacientes do estudo e grupo controle.
Sexo
N Feminino Masculino
Idade
(em anos)
Grupo de Estudo 40 16 24 31 - 73
Grupo Controle 10 5 5 16 - 59
3.3 Considerações éticas
O projeto deste estudo foi submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) do Centro de ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Espírito
Santo (UFES). Obteve aprovação com parecer nº CEP-074/06, aprovado na
Reunião Ordinária de 28/09/2006. Todos os indivíduos foram esclarecidos quanto ao
estudo e, aqueles que concordaram em participar, assinaram o Termo de
Materiais e Métodos
40
Consentimento. Todas as amostras foram identificadas numericamente, de forma a
garantir o total anonimato a todos os indivíduos participantes do estudo.
3.4 Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa BioEstat 4.0 para
Windows (Manuel Ayres - Instituto Marimauá – Belém-PA). Os dados foram
analisados quanto à estatística descritiva dos resultados de cada método sorológico
e quanto à correlação com os métodos moleculares. Para avaliar a correlação entre
os resultados dos métodos sorológicos, expressos de forma numérica em S/Co e os
resultados dos métodos moleculares, os mesmos foram separados em dois grupos:
Grupo (a) constituído por amostras sorologicamente reativas cujos resultados não
foram confirmados nos métodos de biologia molecular; Grupo (b) constituído por
amostras cujos resultados sorológicos reativos foram confirmados pelos métodos de
PCR. Foi utilizado para esta finalidade o teste de Mann-Whitney, teste não-
paramétrico utilizado para a comparação de dois grupos independentes sob a
influência de uma variável (SOARES; SIQUEIRA, 2002).
Os valores de número de ciclos de amplificação necessários à detecção (CT),
obtidos para cada amostra positiva em PCR pelo método de PCR em tempo real,
foram pareados com os valores de relação S/Co da respectiva amostra em cada um
dos três métodos sorológicos. O pareamento foi analisado pelo teste de Correlação
Linear de Pearson.
3.5 Imunoensaios
Foram utilizados imunoensaios enzimáticos nos testes sorológicos da amostras:
• “VITROS ECi® Anti-HCV assay” (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey,
USA – Importado e comercializado no Brasil por Johnson e Johnson Produtos
Profissionais Ltda. CNPJ: 54.516.661/0002-84 – Registro ANVISA: 1032590629):
Imunoensaio enzimático por quimioluminescência de terceira geração que utiliza
os antígenos recombinantes do Core Viral e das regiões NS3, NS4 e NS5 do
Materiais e Métodos
41
VHC. Equipamento utilizado: VITROS ECiQ®, sistema automatizado de
imunoensaio quimioluminescente. Realizados no Laboratório Henrique Tommasi
Netto Análises Clínicas Ltda., CNPJ: 28.133.312/0001-92, em Vitória - ES.
• “Abbott Murex® Anti-HCV (versão 4.0)” (Fabricado por Murex Biotech S.A. (PTY)
Ltd., África do Sul – Distribuído por: Abbott Laboratórios do Brasil Ltda. – CNPJ:
56.998.701/0001-16 – Registro no Ministério da Saúde: 10055310825):
Imunoensaio enzimático colorimétrico para detecção de anticorpos contra o vírus
da hepatite C em soro ou plasma humano. Equipamento utilizado: TECAN
Gênesis RPM 2000®, sistema automatizado para processamento de ELISA.
Realizados no laboratório da Fundação de Estudos Sorológicos Capixaba
(FESCA) – CNPJ: 39.617.113/0001-76, em Vitória - ES.
• “Abbott Axsym® Anti-HCV” (Fabricado por Abbott Laboratories – Diagnostic
Division – Illinois – USA – Distribuído por: Abbott Laboratórios do Brasil Ltda. –
CNPJ: 56.998.701/0001-16 – Registro no Ministério da Saúde/ANVISA:
Imunoensaio enzimático microparticulado (MEIA) com revelação por
fluorescência para detecção de anticorpos contra o vírus da hepatite C em soro
ou plasma humano. Equipamento utilizado: Abbott Axsym® – Sistema
automatizado de análises imunológicas. Realizados no laboratório central de
referência (LACEN-ES) do Instituto Estadual de Saúde Pública (IESP) do estado
do Espírito Santo, em Vitória - ES.
Foram utilizados na avaliação de co-infecção dos pacientes do estudo pelo vírus da
hepatite B e pelo vírus HIV, os seguintes imunoensaios:
• Anticorpos anti-HIV: Ensaio imunoenzimático quimioluminescente - Vitros ECiQ
(Ortho Clinical Diagnostics) - Realizado no laboratório Henrique Tommasi Netto
Análises Clínicas Ltda.
• HBsAg: Ensaio imunoenzimático quimioluminescente - Liaison® (Diasorin) -
Realizado no laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas Ltda.
Materiais e Métodos
42
Tabela 3: Características dos três ensaios de triagem sorológica para anticorpos anti-VHC utilizados.
Antígenos
Axsym® anti-HCV 3.0 (Abbott Diagnostics)
Vitros ECi® anti-HCV (Ortho Clinical Diagnostics)
Murex anti-HCV 4.0 – (Murex Biotech)
Core
Proteína recombinante HCr43 (E. coli)
Proteína recombinante c22-3 (levedura)
Proteína recombinante HCr43 (E. coli)
NS3
Proteína recombinante c200 (levedura); Proteína
recombinante c100-3 (levedura)
Proteína recombinante c200 (levedura)
Proteína recombinante c200 (levedura)
NS4
Proteína recombinante c200 (levedura); Proteína
recombinante d 00-3 (levedura)
Proteína recombinante c200 (levedura)
Proteína recombinante c200 (levedura)
NS5
Proteína recombinante NS5 (levedura)
Proteína recombinante NS5 (levedura)
Proteína recombinante NS5 (levedura)
Princípio Imunoensaio enzimático indireto
Imunoensaio enzimático indireto
Imunoensaio enzimático indireto
Sólida Fase Micropartículas (MEIA) Cubetas de reação individuais (“Wells”)
Microplacas de reação
Volume de Reação(µL)
83 20 20
Tempo de reação(min)
30 56 120
Zona cinza (S/Co)
0,80 – 0,99 0,90 – 0,99 0,90 – 0,99
Fonte: http://www.cdc.gov/Ncidod/diseases/hepatitis/c/sc_ratios.htm (adaptado) e instruções de uso fornecidas pelos fabricantes.
3.6 Métodos de Biologia Molecular
Os testes de biologia molecular utilizadas baseiam-se na identificação do RNA viral
do VHC em amostras de soro (PCR em tempo real) e plasma (PCR qualitativa -
Amplicor®). Os métodos de biologia molecular qualitativos são considerados
métodos mais sensíveis e específicos na detecção de infecção por vírus. Uma vez
que seu objetivo é detectar o próprio RNA viral, os mesmos são considerados
métodos de diagnóstico direto, enquanto os métodos sorológicos são considerados
métodos de diagnóstico indireto da presença viral.
Materiais e Métodos
43
3.6.1 PCR em Tempo Real
Pesquisa do RNA viral através da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Qualitativa para VHC por método de tempo real (Real-Time PCR), padronizado pelo
Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento (ITPD), CNPJ: 05.814.244/0001-
21, Vila Velha-ES.
Materiais Utilizados:
• QIAamp MinElute® “Virus Spin Kit” - Cat. N. 57704 - Lote: 127131849 - Val:
11/06/2008 – QIAGEN - Importado por: Uniscience do Brasil
• TaqMan® - “Universal PCR Master Mix” - Applied Biosystems – P/N: 4304437 -
Lote: J00968 - Val.: 31/01/2008
• TaqMan® “RNase P Detection Reagentes (FAM)” - Lote: 0505054
• “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” - Applied Biosystems - Lote:
0703014 - Val: 31/03/2008
• TaqMan® “Exogenous Internal Positive Control Reagents (VIC® Dye)” – PN:
4308323 - Applied Biosystems - Lote: 0703101
• MGB TaqMan® “Probe” – P/N: 4316034 – Lote: 185388386-9 - Applied
Biosystems
• “Primers” HCV - Região 5` UTR (“5`untranslated region”, sorotipo 1a, 1 a 341 pb,
região mais conservada do genoma, com identidade de nucleotídeos de 99,6 %)
- Applied Biosystems – Patenteados.
Procedimentos:
• Isolamento e purificação de ácido nucléico viral:
Material necessário:
• QIAamp MinElute® ”Vírus Spin Kit” – QIAGEN
• Centrífuga Eppendorf® (14000 rpm).
• Bloco térmico (56° C), pré-aquecido.
• Etanol (96 – 100 %).
• Tubos de microcentrífuga com tampa (tipo Eppendorf®).
Materiais e Métodos
44
Etapas prévias e volumes necessários:
Volume de amostra: 200 � L de soro ou plasma.
Preparação do carreador de RNA: Adicionar 310 � L de tampão AVE ao frasco
contendo 310 � g de carreador de RNA liofilizado, obtendo uma solução a 1 � g/ � L.
Adição da solução carreador RNA/Tampão AVE ao Tampão AL: Calcular o volume
necessário de cada tampão utilizando as seguintes fórmulas:
n x 0,22 mL = y mL y mL x 28 � L/mL = z � L
Onde:
n = número de amostras a serem processadas simultaneamente.
y = cálculo do volume ncessário de tampão AL
z = volume da solução carreador RNA/Tampão AVE a ser adicionado ao tampão AL.
Procedimento:
Pipetar 25 � L de protease em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Adicionar 200 � L de amostra neste mesmo tubo.
Adicionar 200 � L de tampão AL contendo 28 � g/mL de carreador de RNA. Fechar o
tubo e homogeinizar em vórtex por 15 segundos.
Incubar em bloco térmico a 56° C por 15 minutos.
Centrifugar rapidamente para remover gotículas formadas por condensação no
interior do tubo.
Adicionar 250 � L de etanol (96 – 100 %), fechar o tubo e homogeinizar em “vórtex”
por 15 segundos. Incubar o homogeinizado por 5 minutos à temperatura ambiente
(15 – 25° C).
Centrifugar rapidamente para remover gotículas formadas por condensação no
interior do tubo.
Aplicar, cuidadosamente, o homogeinizado obtido na etapa anterior em uma coluna
“QIAamp MinElute”® sem encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a
tampa da coluna e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferí-
Materiais e Métodos
45
la para um tubo de coleção de 2 mL novo, fornecido no kit e descartar o tubo
contendo o filtrado.
Cuidadosamente, abrir a tampa da coluna e adicionar 500 � L de tampão AW2 sem
encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a tampa e centrifugar a 8000
rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferi-la para um tubo de coleção de 2 mL
novo, fornecido no kit e descartar o tubo contendo filtrado.
Abrir a tampa da coluna cuidadosamente e adicionar 500 � L de etanol (96 – 100%),
sem encostar a ponteira na membrana da coluna. Fechar a tampa da coluna e
centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Retirar a coluna e transferi-la para um tubo de
coleção de 2 mL novo, fornecido no kit e descartar o tubo contendo o filtrado.
Centrifugar a coluna contida no tubo de coleção de 2 mL novo a 14000 rpm por 3
minutos, para secar a membrana completamente.
Retirar a coluna e transferí-la para um tubo de coleção de 2 mL novo, previamente
aquecido em bloco térmico a 56° C. Mantê-la no bloco térmico com a tampa aberta,
por 3 minutos, visando secar por completo a membrana.
Transferir a coluna para um tubo de microcentrífuga novo de 1,5 mL (não fornecidos
no kit) e descarte o tubo prévio. Cuidadosamente, abrir a tampa da coluna e aplicar
de 20 a 150 � L (60 � L no caso deste estudo) de tampão AVE ou água destilada livre
de RNase no centro da membrana. Fechar a tampa, incubar à temperatura ambiente
por 1 minuto e centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto. Utilizar o filtrado para processo
de formação de cDNA e amplificação.
• Formação de DNA complementar (cDNA):
Materiais necessários:
“High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit”.
Termociclador Perkin Elmer – Modelo: GeneAmp PCR System 2400.
Tubos de reação para PCR.
Procedimento:
Em cada tubo adicionar 50 � L do filtrado proveniente da extração anterior, 10 � L de
10X “Reverser transcription buffer”, 4 � L de 25X dNTPs, 10 � L “random primers”, 5
� L MultiScribe reverse transcriptase 50 U/ � L e 21 � L de água RNAse-free.
Programa: “Hold” (10 min / 25° C), “Hold” (120 min / 37° C)
Materiais e Métodos
46
• Amplificação – Reação da Polimerase em Cadeia, em Tempo Real:
Equipamento: ABI 7300 Real-Time PCR System
Sistema de detecção: TaqMan®
Controle interno de amplificação: VIC®-IPC (“Internal Positive Control”).
Características: Sondas fluorescentes; elaboração de curva de fluorescência e
obtenção de valor CT para cada amostra individualmente. O valor de CT refere-se ao
ponto, em número de ciclos e suas frações, onde a fluorescência do amplificado
ultrapassa o valor estipulado como “threshold” e é inversamente proporcional à
quantidade de material genético, a ser amplificado, presente na amostra. O
“threshold” é um valor calculado pelo software do sistema, baseado na referência
passiva do fluoróforo utilizado, na linha de base de fluorescência inicial e na
magnitude (� Rn) do sinal gerado pelo fluoróforo em cada “corrida” específica de
PCR.
Figura 11: Gráfico esquemático representativo do funcionamento e interpretação da PCR em tempo real. Fonte: Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System Absolute Quantification Getting Started Guide Protocolo:
H2O destilada “DNAse-free”: 1,75 � L
TaqMan Universal Mix (2x): 25 � L
Primer F (10.000 nM): 3 � L
Primer R (10.000 nM): 3 � L
TaqMan Probe (10 � M) 1,25 � L
Materiais e Métodos
47
Exo IPC Mix (10X): 5 � L
Exo IPC DNA (50X): 1 � L
cDNA (1 – 100 ng): 10 � L.
Volume Total de reação: 50 � L.
Programa:
“Hold” (AmpErase® UNG - Ativação): 2 min / 50° C
“Hold” (AmpliTaq Gold® DNA Polimerase): 10 min / 95° C
40 ciclos: Desnaturação (15 seg / 95° C); Anelamento (1 min / 60° C)
3.6.2 PCR Qualitativa – Amplicor® v2.0 Pesquisa do RNA do VHC por reação de polimerase em cadeia, através do método
Amplicor® v2.0 (Roche Diagnostics) não-automatizado. Realizado no laboratório de
Imunologia e Biologia Molecular do Núcleo de Doenças Infecciosas (NDI) da
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).
Reagentes necessários:
• Amplicor® “HCV Specimen Preparation Kit”, v2.0 (HCV PREP) - P/N: 21111086
123 – 96 testes.
• Amplicor® “HCV Controls Kit”, v2.0 (HCV CTL) – P/N: 21111175 123 – 8 sets.
• Amplicor® “HCV Amplification Kit”, v2.0 (HCV AMP) – P/N: 21111094 123 – 96
testes.
• Amplicor® “HCV Detection Kit”, v2.0 (HCV MWP DK) – P/N: 21111108 123 – 96
testes.
• Amplicor® “Internal Control Detection Kit” (IC MWP DK) – P/N: 20763306 – 96
testes.
Procedimentos:
Isolamento e purificação de ácido nucléico viral:
Material necessário:
• Amplicor® HCV Specimen Preparation Kit, v2.0 (HCV PREP), composto de:
Materiais e Métodos
48
HCV LYS, v2.0 (Reagente de lise).
HCV DIL, v2.0 (Diluente de amostras).
HCV IC, v2.0 (Controle Interno contendo RNA recombinante do VHC com
seqüências de ligação do iniciador do VHC).
• Isopropanol de grau reagente.
• Etanol 70 % preparado a fresco em grau reagente.
• Centrífuga a 16000 g.
• Bloco térmico a 60o C.
• Vórtex.
• Pipetas com ponteiras com barreira (filtro) isentas de RNase.
• Tubos de polipropileno com tampas rosqueáveis de 1,5 mL (Sarstedt)
• Luvas descartáveis sem talco.
Procedimento:
Preparo do reagente de lise de trabalho: Adicionar o conteúdo de um frasco de HCV
IC ao frasco de HCV LYS. Estabilidade de 8 horas à temperatura ambiente. O frasco
de HCV LYS quando mantido na temperatura de armazenamento (2 a 8o C), forma
um precipitado. Antes de utilizar deve-se aquecer por até 30 minutos em banho-
maria na temperatura de 37º C e agitar para a dissolução do precipitado.
Adicionar em tubo de tampa rosqueável (Sarstedt):
• 400 � L do reagente de lise de trabalho
• 200 � L de plasma (para as amostras) ou 200 � L de plasma-controle (NHP,
disponível no kit Amplicor® Controls Kit) para os controles (positivo e negativo)
• 20 � L de controle (positivo ou negativo) para os controles.
Procedimento:
Incubação a 600 C por 10 minutos, após adicionar 600 µL isopropanol. Novamente
incubar à temperatura ambiente por 2 minutos.
Centrifugação: 15 minutos a 16000g, desprezar o sobrenadante. Adicionar 1000 µL
de etanol a 70%, agitar em vórtex por 5 segundos. Centrifugação: 5 minutos a
16000g, adicionar HCV DIL: 200 µL. Com auxílio de uma ponteira, soltar o "pellet"
formado, agitar em “vórtex” por 10 segundos.
Estabilidade: 3 horas à temperatura ambiente / 1 mês a -700 C.
Materiais e Métodos
49
• Amplificação e Identificação: Materiais necessários:
• Amplicor® “HCV Amplification Kit”, contendo:
HCV MMX, v2.0 ( Mistura principal ou “master mix”).
HCV Mn2+, v2.0.
• Amplicor® “HCV Detection Kit”, contendo:
HCV MWP, v2.0 (Microplacas revestida e sonda para o VHC).
[1] DN (solução de desnaturação - NaOH)
[2] HCV HYB (Tampão de hibridização).
[3] AV-HRP (Conjugado de avidina-peroxidase).
[4A] SUB A (Substrato A – H2O2).
[4B] SUB B (Substrato B - TMB).
[5] STOP (Reagente de parada da reação – ácido sulfúrico).
10X WB (Solução de lavagem concentrada 10 x).
• Amplicor® “Internal Control Detection Kit”.
• Pipetas com ponteiras com barreira (filtro) e isentas de RNase.
• Tubos de reação MicroAmp® (Tubos de PCR).
Equipamentos:
• Termociclador Perkin Elmer, modelo: GeneAmp PCR System 2400
• Lavador de microplacas – Bio-Rad, modelo PW40
• Leitora óptica de microplacas – Bio-Rad, modelo: A1
Procedimentos:
• Preparação da mistura principal de trabalho (“Master mix”):
Posicionar a quantidade de tubos de reação para amostras e controles na
bandeja que vai ao termociclador. Preparar o “master mix” adicionando 100 µL de
HCV Mn2+ no frasco de HCV MMX e agitar 10 a 15 vezes por inversão
(estabilidade 4 horas 2 - 8º C). Distribuir 50 � L de “master mix” em cada tubo de
reação. Guardar em saco plástico a 2 - 8º C e até o momento de usar.
Adicionar 50 � L de amostra ou controle processados, em cada tubo de reação
devidamente identificado, contendo 50 � L do “master mix”. Tampar os tubos de
reação e encaminhar ao termociclador.
Materiais e Métodos
50
• Programa:
“Hold”: 50º C / 5 min
“Hold”: 62º C / 30 min
“Cycle”: 90º C / 10 seg, 58º C / 25 seg (37 vezes)
“Hold”: 91º C (não exceder 3 horas)
Tempo de reação de aproximadamente 1 hora e 45 minutos. As amostras
deverão ser removidas dentro das 3 horas do “Hold” final e poderão ser retiradas
a qualquer momento desse período final.
Ao término da amplificação adicionar imediatamente 100 � L da solução de
desnaturação ([1] DN) em cada tubo (não deixar abaixar a temperatura da amostra
amplificada). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente (podem ficar até 2
horas em temperatura ambiente para serem detectadas, caso não ocorra a detecção
nesse período manter 2 - 8° C por até 1 semana).
Deixar os kits de detecção de HCV e Controle Interno à temperatura ambiente.
Pipetar 100 � L do tampão de hibridização ([2] HCV HYB) em cada poço das placas
(HCV e Controle Interno). (Obs: Se o “amplicon” desnaturado foi armazenado na
geladeira, incubar 3-4 minutos 37°C para diminuir a viscosidade).
Pipetar 25 � L da amostra desnaturada, usando ponteiras com barreira nas tiras
correspondentes.
Incubar 60 min a 37ºC (± 2°C).
Preparar o tampão de lavagem (10X WB) (diluir 1:10 em água destilada) 40 mL para
cada tira de 8 poços.
Lavar a placa 5 vezes utilizando o lavador de microplacas.
Adicionar 100 � L de conjugado avidina-peroxidase conjugate( [3] AV-HRP).
Incubar 15 minutos a 37ºC ± 2°C.
Preparar a solução de trabalho do substrato (4 partes de solução [4A] SUB A para 1
parte da solução [4B] SUB B) e deixar ao abrigo da luz.
Lavar a placa 5 vezes bater bem a placa para tirar o tampão residual.
Adicionar 100 µL da solução de trabalho do substrato.
Incubar 10 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Adicionar 100 µL do reagente de parada de reação ([5] STOP).
Materiais e Métodos
51
Ler a placa em 450 nm no máximo 30 minutos após a adição do reagente de parada
da reação.
Interpretação dos Resultados:
Após certificar-se que os valores dos controles positivos e negativos validaram a
corrida, proceder a interpretação dos resultados considerando além dos resultados
das amostras, também o resultado obtido pelo controle interno de amplificação,
conforme os critérios estabelecidos na tabela 4.
Tabela 4: Interpretação dos resultados da PCR qualitativa para VHC com detecção de controle interno de amplificação – Amplicor® (Roche Diagnostics).
Resultado da amostra VHC
(Abs. a 450 nm)
Resultado do Controle Interno de
amplificação (Abs. a 450 nm)
Interpretação
< 0,3
� 0,3
VHC RNA não detectado. A amostra é presuntivamente negativa para o VHC.
< 0,3
< 0,3
Inibição na Amostra. O VHC RNA se presente
não pode ser detectado. Processar outra alíquota da amostra original ou coletar nova
amostra.
�
1,0
Qualquer valor
Para uma corrida válida, amostras com HCV
são interpretadas como positivas independente do resultado do controle interno.
�
0,3 e < 1,0
Qualquer valor
Equívoca. Resultados são inconclusivos para o VHC RNA. Repetir todo processo em duplicata usando nova alíquota da amostra do paciente. Amostras onde as duas repetições forem
� 0.3,
serão consideradas positivas para HCV RNA. Quando uma ou as duas repetições forem < 0,3, serão consideradas presuntivas negativas para HCV RNA desde que os resultados do Controle
Interno sejam �0.3 para ambas replicatas.
Fonte: Amplicor® Hepatitis C virus Test, version 2.0 – Instructions for use – Doc. Ver. 4.0 - 06/2006 (adaptado).
Materiais e Métodos
52
3.7 Immunoblotting As amostras que apresentaram resultados discordantes entre os métodos
sorológicos e os métodos moleculares, foram submetidas à análise pelo método de
“immunoblotting”. Esta análise foi realizada no laboratório Balagué Center S.A.
(Barcelona, Espanha), por intermédio do laboratório Lab-Rede (CNES: 3282406) de
Belo Horizonte - MG ao qual o laboratório Henrique Tommasi Netto Análises Clínicas
Ltda é afiliado. Fabricante: Innogenetics, lote: 172185, validade: 31/07/2008.
O método utiliza peptídeos sintéticos de terceira geração, de forma a identificar
anticorpos presentes na amostra contra os peptídeos das regiões E2, NS3, NS4,
NS5 e duas regiões do core viral (C1 e C2). Como critério de interpretação,
considera-se como resultado positivo o aparecimento de pelo menos duas bandas
de fraca reatividade ou mais. Como resultado negativo, considera-se a ausência de
bandas ou o aparecimento de apenas uma banda de fraca reatividade, exceto se
esta banda corresponder à região NS3. O resultado é considerado indeterminado
quando do surgimento de uma banda de reatividade normal ou intensa, ou ainda a
presença de uma única banda de reatividade fraca sendo esta correspondente a
NS3.
3.8 Formatação e Normas Técnicas
Esta dissertação está redigida segundo as normas técnicas da ABNT, exceto as
referências bibliográficas que serão citadas como referenciadas no “Pubmed”
(www.pubmed.com), excluindo o dia e mês da publicação, quando presentes.
Resultados
54
4 RESULTADOS
4.1 Análises Sorológicas
Os resultados obtidos para os três diferentes métodos sorológicos são apresentados
na tabela 5. Os resultados foram expressos em valor numérico correspondente a
razão entre a leitura da amostra e o valor do “cut-off” ou linha de corte (S/Co, do
inglês “Sample/cut-off”), visando a comparação entre os métodos. Os três métodos
sorológicos apresentaram resultados concordantes para a maioria das amostras
testadas, salvo em casos específicos (amostras 044 e 056), onde observou-se
comportamento duvidoso ou inconclusivo.
A interpretação dos resultados foi realizada de acordo com o estabelecido pelos
fabricantes. Um resultado igual a 1,0 representa uma leitura da amostra idêntica ao
valor da linha de corte (“cut-off”). Este parâmetro é utilizado para estabelecer a
reatividade do teste. Portanto, resultados ligeiramente abaixo de 1,0 são
considerados inconclusivos (“zona cinza”; 0,90 a 0,99 para os testes Vitros Eci® e
ELISA Murex® e 0,80 a 0,99 para o teste Axsym®). Resultados inferiores aos da
região de resultados inconclusivos (“zona cinza”) são considerados não reativos.
Com relação à possibilidade de coinfecção pelos vírus HIV ou HBV, os testes
sorológicos realizados para pesquisa de anticorpos anti-HIV (I e II) e para pesquisa
de HBsAg foram não reagentes para todas as amostras.
Resultados
55
Tabela 5: Resultados individuais em cada um dos três métodos sorológicos estudados (ELISA, MEIA e CIA), expressos em relação S/Co. As amostras 001 a 010 referem-se ao grupo controle; As amostras 013 a 059 referem-se ao grupo de estudo.
RESULTADOS
Amostras Vitros
Eci (CIA)
Murex (ELISA)
Axsym (MEIA)
Amostras
Vitros Eci
(CIA)
Murex (ELISA)
Axsym (MEIA)
001 0,05 (NR) 0,15 (NR) 0,41(NR) 031 22,0 (R) 5,13 (R) 95,05 (R)
002 0,26 (NR) 0,35 (NR) 0,52 (NR) 032 25,1 (R) 4,94 (R) 119,14 (R)
003 0,07 (NR) 0,57 (NR) 0,33 (NR) 033 26,5 (R) 5,25 (R) 111,23 (R)
004 0,18 (NR) 0,29 (NR) 0,37 (NR) 034 5,28 (R) 2,85 (R) 2,30 (R)
005 0,03 (NR) 0,31 (NR) 0,54 (NR) 035 24,7 (R) 5,30 (R) 104,13 (R)
006 0,03 (NR) 0,30 (NR) 0,36 (NR) 036 1,82 (R) 1,16 (R) 1,33 (R)
007 0,02 (NR) 0,29 (NR) 0,42 (NR) 037 24,3 (R) 5,40 (R) 95,44 (R)
008 0,03 (NR) 0,37 (NR) 0,47 (NR) 038 26,30 (R) 5,40 (R) 92,27 (R)
009 0,05 (NR) 0,18 (NR) 0,29 (NR) 039 26,2 (R) 5,35 (R) 142,26 (R)
010 0,20 (NR) 0,31 (NR) 0,52 (NR) 040 23,5 (R) 4,94 (R) 141,1 (R)
013 26,1 (R) 4,88 (R) 53,1 (R) 041 21,3 (R) 4,77 (R) 117,82 (R)
014 20,6 (R) 5,13 (R) 100,16 (R) 042 24,7 (R) 5,12 (R) 74,25 (R)
016 24,2 (R) 6,21 (R) 135,57 (R) 044 1,37 (R) 1,28 (R) 0,84 (I)
017 24,9 (R) 5,40 (R) 57,09 (R) 047 26,2 (R) 5,03 (R) 136,64 (R)
018 12,0 (R) 4,70 (R) 5,98 (R) 048 24,9 (R) 5,12 (R) 129,07 (R)
019 23,8 (R) 5,03 (R) 103,95 (R) 049 9,39 (R) 3,9 (R) 11,04 (R)
020 24,0 (R) 5,0 (R) 104,72 (R) 050 26,8 (R) 5,33 (R) 143,29 (R)
021 22,9 (R) 5,4 (R) 140,76 (R) 051 23,4 (R) 5,40 (R) 121,43 (R)
023 26,4 (R) 5,3 (R) 124,39 (R) 052 24,9 (R) 5,08 (R) 93,78 (R)
024 25,9 (R) 5,3 (R) 98,77 (R) 053 28,0 (R) 5,46 (R) 125,56 (R)
025 18,8 (R) 4,94 (R) 3,00 (R) 054 7,63 (R) 1,50 (R) 2,92 (R)
026 26,8 (R) 5,12 (R) 53,73 (R) 055 17,1 (R) 5,30 (R) 3,98 (R)
028 20,9 (R) 5,08 (R) 118,80 (R) 056 2,63 (R) 0,41 (NR) 0,85 (I)
029 22,7 (R) 5,2 (R) 101,83 (R) 057 29,3 (R) 5,21 (R) 125,74 (R)
030 23,0 (R) 5,3 (R) 149,44 (R) 059 29,1 (R) 4,85 (R) 133,06 (R)
O critério de interpretação como (R) Reagente, (I) Inconclusivo ou (NR) Não-Reagente, segue as recomendações dos fabricantes dos reagentes utilizados e seus respectivos sistemas analíticos.
Resultados
56
Os resultados obtidos foram analisados através de estatística descritiva (Tabela 6).
As médias dos resultados das amostras reativas foram 4,8 para o método ELISA,
21,27 para o método quimioluminescente e 91,08 para o método MEIA. Estes valores
demonstram um padrão de diferença na amplitude da leitura de cada método para as
amostras reativas. Amostras reativas apresentaram, em média, uma leitura cerca de
5 vezes superior no método quimioluminescente do que em ELISA e cerca de 4,5
vezes superior no método MEIA do que na quimioluminescência.
No entanto, amostras com baixa reatividade apresentaram valores muito próximos
nos três métodos, como demonstrado no parâmetro “valor mínimo” da tabela 6.
Tabela 6: Estatística descritiva dos resultados obtidos nas análises sorológicas nos três métodos estudados (ELISA, CIA e MEIA), separados por reatividade sorológica.
Método
Parâmetro
Amostras não-reativas e/ou inconclusivas
Amostras Reativas
n 11 39 Média 0,32 4,80
Mediana 0,31 5,12 Mínimo 0,15 1,16 Máximo 0,57 6,21
Desvio Padrão 0,11 1,12 IC (90%) 0,26 a 0,38 4,50 a 5,10 IC (95%) 0,25 a 0,40 4,44 a 5,16
ELISA colorimétrico (MUREX®)
IC (99%) 0,21 a 0,43 4,32 a 5,28
n 10 40 Média 0,09 21,27
Mediana 0,05 24,20 Mínimo 0,02 1,37 Máximo 0,26 29,3
Desvio Padrão 0,09 7,70 IC (90%) 0,04 a 0,14 19,25 a 23,23 IC (95%) 0,03 a 0,15 18,84 a 23,71
Quimioluminescência (Vitros ECi® – Ortho Clinical Diagnostics)
IC (99%) 0,01 a 0,18 18,02 a 24,53
n 12 38 Média 0,493 91,08
Mediana 0,445 103,95 Mínimo 0,29 1,33 Máximo 0,85 149,44
Desvio Padrão 0,18 47,59 IC (90%) 0,40 a 0,59 78,23 a 103,93 IC (95%) 0,38 a 0,61 75,65 a 106,51
MEIA (Axsym® – Abbott)
IC (99%) 0,33 a 0,66 70,42 a 111,74
Os resultados expressos em valores da relação S/Co.
Resultados
57
Como podemos observar na figura 12, a distribuição qualitativa dos resultados em
cada um dos métodos sorológicos estudados, analisados segundo o critério
estabelecido pelo CDC, demonstra que diferenças significativas somente foram
observadas para resultados obtidos pelo o método MEIA. A análise dos resultados
obtidos pelo MEIA, apresentou tanto uma freqüência ligeiramente maior de amostras
com baixa reatividade e ainda amostras com resultados inconclusivos, fatos não
observados para os outros dois métodos sorológicos estudados.
0%
22%
70%
8%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Am os tras (n = 50)
Fre
quên
cia
(%)
Alta reatividade - ELISA ( � 3,8)
Baixa reatividade - ELISA ( � 1,0 a 3,79)
Inconclusivas - ELISA ( � 0,90 a 0,99)
Não reativas - ELISA (< 0,90)
A
0%
20%
72%
8%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Am os tras (n = 50)
Fre
quên
cia
(%)
Alta reatividade - CIA ( � 8,0)
Baixa reatividade - CIA ( � 1,0 a 7,9)
Inconclusivas - CIA ( � 0,90 a 0,99)
Não reativas - CIA (< 0,90)
B
64%
4%
20%12%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Am os tras (n = 50)
Freq
uênc
ia (%
)
Alta reatividade - MEIA ( � 10,0)
Baixa reatividade - MEIA ( � 1,0 a 9,9)
Inconclusivas - MEIA ( � 0,80 a 0,99)
Não reativas - MEIA (< 0,80)
C
Figura 12: Distribuição percentual dos resultados obtidos nos métodos de ELISA (A), CIA (B) e MEIA (C), para todas as 50 amostras do estudo, incluindo 10 amostras do grupo controle negativo.
Resultados
58
A concordância dos resultados obtidos pelos três diferentes métodos sorológicos é
apresentada na figura 13. Os resultados demonstraram uma forte tendência de
correlação entre os métodos de ELISA e CIA, com o método de MEIA demonstrando
ligeira discordância com os outros métodos. Quando comparados método a método,
os percentuais de resultados concordantes salientam esta observação, conforme
demonstrado na figura 13.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Todos os métodos ELISA x CIA ELISA x MEIA CIA x MEIA
Co
nco
rdân
cia
(%)
Amostras Não-reativas ou Inconclusivas Amostras ReativasBaixa Reatividade Alta Reatividade
ANÁLISE DE CONCORDÂNCIA ENTRE OS MÉTODOS SOROLÓGICOS ESTUDADOS
Todos os métodos ELISA x CIA ELISA x MEIA CIA x MEIA Amostras Não-
reativas ou Inconclusivas
83,30%
90,91%
91,67%
83,30%
Amostras Reativas
95,00% 97,50% 97,44% 95,00%
Baixa Reatividade
66,67% 100,00% 66,67% 66,67%
Alta Reatividade
88,89% 97,22% 91,43% 88,89%
Figura 13: Análise de concordância entre os métodos sorológicos. Os critérios utilizados para definição de baixa reatividade e alta reatividade foram definidos pelo CDC (USA). Os critérios de definição de amostras reativas, inconclusivas ou não-reativas são fornecidos pelos fabricantes dos reagentes e sistemas analíticos utilizados.
Resultados
59
4.2 Análise dos Métodos de Biologia Molecular
As amostras analisadas pelos métodos de biologia molecular foram alíquotas das
mesmas amostras utilizadas na análise pelos métodos sorológicos. Todas as
amostras com resultados negativos em qualquer um dos métodos de PCR, foram
recoletadas e reprocessadas.
O padrão observado nos resultados sorológicos, bem como os resultados das
análises de biologia molecular, é apresentado na figura 14. Podemos visualizar a
existência de resultados paradoxais (amostras 018, 025, 034, 036, 054, 055) onde a
leitura do método MEIA é consideravelmente menor do que o padrão demonstrado
para amostras reativas. Nestas amostras a leitura do método MEIA é equivalente ou
inferior aos métodos de CIA e ELISA (Murex®).
Os resultados dos métodos moleculares utilizados são apresentados de forma
qualitativa. Em algumas amostras sorologicamente reativas (017, 018, 024, 025,
034, 036, 037, 044, 049, 054 e 056), os resultados dos métodos moleculares não
foram concordantes com as análises sorológicas. Destas amostras não
concordantes, seis amostras (017, 018, 024, 025, 037 e 049) apresentaram pelo
menos um dos resultados sorológicos (apresentados na tabela 5) acima do limite
que o caracteriza com resultado de alta reatividade pelos critérios do CDC.
Resultados
60
Figura 14: Análise comparativa dos resultados de cada amostra, expressos em S/Co, nos três métodos sorológicos estudados, além do respectivo resultado dos dois métodos de biologia molecular utilizados.
Os dois métodos moleculares utilizados apresentaram uma concordância de 100%
nas amostras estudadas. Dentre as 50 amostras analisadas, 29 foram consideradas
positivas e 21 negativas para a presença de RNA do VHC em ambos os métodos de
biologia molecular.
Os resultados dos métodos sorológicos estudados apresentaram diferenças de
comportamento com relação à concordância com os métodos moleculares, mas
somente no que se refere às amostras consideradas reagentes. Esta discrepância
foi mais acentuada ao considerarmos todas as amostras reativas (S/Co � 1,0) e
menos acentuada, porém ainda relevante, quando consideradas apenas amostras
de alta reatividade sorológica. Os percentuais de concordância entre os métodos
sorológicos e os de biologia molecular obtidos, são apresentados nas figuras 15, 16
e 17.
Resultados
61
100%
74,40%
0%
82,90%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Faixas de valores em relação S/Co
Co
rrel
ação
(%
)
Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, � 1,0)
Baixa reatividade (� 1,0 a 3,79) Alta retividade ( � 3,8)
Figura 15: Correlação entre os resultados obtidos em ELISA colorimétrico (MUREX®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 11; amostras reativas, n = 39; baixa reatividade, n = 4; alta reatividade, n = 35 .
0%
100%
72,50%82,90%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Faixas de v alores em relação S/Co
Co
rrel
ação
(%
)
Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, � 1,0)
Baixa reatividade ( � 1,0 a 7,9) Alta reatividade (� 8,0)
Figura 16: Correlação entre os resultados obtidos em quimioluminescência (Vitros ECi®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 10; amostras reativas, n = 40; baixa reatividade, n = 5; alta reatividade, n = 35.
100%
76,30%
16,70%
87,50%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Faixa de v alores em relação S/Co
Co
rrel
ação
(%)
Não-reativas (< 1,0) Reativas (Todas, 1,0)
Baixa reatividade ( 1,0 a 9,9) Alta reatividade ( 10,0)
Figura 17: Correlação entre os resultados obtidos em MEIA (Axsym®) e PCR, nas respectivas faixas de relação S/Co. Amostras não-reativas, n = 12; amostras reativas, n = 38; baixa reatividade, n = 6; alta reatividade, n = 32.
Resultados
62
4.3 Análise estatística da correlação entre os métodos estudados
Para avaliar a relevância estatística da expressão dos resultados sorológicos em
valores de relação S/Co, as amostras sorologicamente reativas em cada método
foram separadas em dois grupos: Grupo (a) constituído por amostras
sorologicamente reativas cujos resultados não foram confirmados nos métodos de
biologia molecular; e Grupo (b) constituído por amostras, cujos resultados
sorológicos foram confirmados pelos métodos de PCR.
Os valores de relação S/Co de cada grupo, para cada método, foram submetidos à
análise estatística pelo teste de Mann-Whitney. A tabela 7 apresenta os resultados
estatísticos obtidos para os dois grupos em cada um dos métodos sorológicos.
Tabela 7: Resultados estatísticos descritivos obtidos para os grupos: (a) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos não se confirmaram em PCR; (b) Constituído de amostras cujos resultados sorológicos reativos confirmaram-se em PCR. Resultados expressos em relação S/Co.
Método
Parâmetro
Grupo (a)
Grupo (b) n 10 29
Média 3,64 5,19 Mediana 4,30 5,13 Mínimo 1,16 4,77 Máximo 5,40 6,21
Desvio Padrão 1,79 0,27 IC (90%) 2,67 a 4,30 5,12 a 5,26 IC (95%) 2,45 a 4,52 5,10 a 5,27
ELISA colorimétrico (MUREX®)
IC (99%) 2,13 a 4,76 5,03 a 5,33
n 11 29 Média 12,18 24,54
Mediana 9,39 24,70 Mínimo 1,37 17,10 Máximo 25,90 29,30
Desvio Padrão 9,66 2,65 IC (90%) 7,84 a 15,75 23,72 a 25,20 IC (95%) 7,11 a 16,56 23,65 a 25,26
Quimioluminescência (Vitros ECi® – Ortho Clinical Diagnostics)
IC (99%) 5,95 a 17,42 22,97 a 25,67
n 9 29 Média 30,87 110,22
Mediana 5,98 118,80 Mínimo 1,33 3,98 Máximo 98,77 149,44
Desvio Padrão 41,42 32,13 IC (90%) 9,52 a 47,35 99,34 a 118,80 IC (95%) 9,66 a 52,98 96,90 a 119,23
MEIA (Axsym® – Abbott)
IC (99%) 2,82 a 62,66 92,75 a 122,04
Resultados
63
A análise da associação entre os resultados dos dois métodos baseados em PCR e
cada um dos três métodos sorológicos foi estatisticamente significante como pode
ser observado na figura 18.
Figura 18: Representação estatística da associação entre os valores de relação S/Co obtidos nos dois grupos de amostras reativas e o método de PCR. Para cada método os valores de “p” (probabilidade de significância) foram: ELISA x PCR: p = 0,0244; CIA x PCR: p = 0,0007; MEIA x PCR: p = 0,0001).
Os valores de CT obtidos pelo método de PCR em tempo real foram analisados
quanto à estatística descritiva. Os resultados são apresentados na tabela 8.
Resultados
64
Tabela 8: Estatística Descritiva – PCR em Tempo Real - TaqMan® Applied Biosystems. Valores expressos em CT(“Cicle timing”, ponto em número de ciclos de amplificação onde a amostra apresenta fluorescência considerada positiva pelo sistema de detecção.
Parâmetro Amostras Positivas para RNA-VHC (n=29) Média 29,98
Mediana 29,20 Mínimo 24,12 Máximo 39,43
Desvio Padrão 4,45 Intervalo de confiança (90%) 28,57 a 31,38 Intervalo de confiança (95%) 28,28 a 31,67 Intervalo de confiança (99%) 27,69 a 32,26
Os valores de CT, obtidos para cada amostra positiva em PCR em tempo real, foram
pareados com os valores de relação S/Co da respectiva amostra em cada um dos
três métodos sorológicos. O pareamento foi analisado pelo teste de Correlação
Linear de Pearson, utilizando o programa BioEstat 4.0. Coeficientes de correlação (r)
de 0 a 0,25 (ou – 0,25) indicam pouca ou nenhuma correlação, de 0,25 a 0,50 (ou –
0,25 a – 0,50) pequeno grau de correlação, de 0,50 a 0,75 (ou – 0,50 a -0,75)
moderado a bom grau de correlação e de 0,75 a 1 (ou – 0,75 a – 1) muito bom a
excelente grau de correlação (DAWSOM; TRAPP, 2004). Os resultados obtidos são
demonstrados na figura 19.
Resultados
65
Figura 19: Representação estatística da Correlação Linear de Pearson em os valores de CT no método de PCR em tempo real e os valores em S/Co de cada método sorológico estudado. Em nenhum dos métodos foi encontrada correlação estatisticamente significativa.
Os resultados obtidos pelo teste de correlação linear de Pearson, demonstraram não
existir correlação estatística significativa entre os valores apresentados.
Resultados
66
4.4 Immunoblotting
As amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os
métodos moleculares, no total 11 amostras, foram submetidas à análise pelo método
de “immunoblotting”. Os resultados apresentaram boa correlação com os métodos
sorológicos, para as amostras de alta reatividade e pouca correlação com as
amostras de baixa reatividade. Houve discordância entre o método de
“immunoblotting” e os métodos moleculares em várias amostras. A tabela 9
apresenta os resultados obtidos.
Tabela 9: Comparação entre os resultados de “immunoblotting” e os demais sorológicos e moleculares, para as amostras que apresentaram resultados discrepantes entre estes. Resultados dos métodos sorológicos expressos em relação S/Co.
Amostras
CIA
ELISA
MEIA
PCR
Real-Time
PCR
Amplicor®
Immunoblotting
017
24,9 (R)
5,40 (R)
57,09 (R)
Negativo
Negativo Positivo
(Bandas: C1, C2, NS3, NS4 e NS5)
018
12,0 (R)
4,70 (R)
5,98 (R)
Negativo
Negativo
Positivo (Bandas: C1, C2, E2,
NS3)
024
25,9 (R)
5,3 (R)
98,77 (R)
Negativo
Negativo Positivo
(Bandas: C1, C2, E2, NS3, NS4 e NS5)
025
18,8 (R)
4,94 (R)
3,00 (R)
Negativo
Negativo
Positivo (Bandas: C1, C2 e NS5)
034
5,28 (R)
2,85 (R)
2,30 (R)
Negativo
Negativo
Positivo (Bandas: C1, C2 e NS3)
036
1,82 (R)
1,16 (R)
1,33 (R)
Negativo
Negativo
Positivo (Bandas: E2 e NS3)
037
24,3 (R)
5,40 (R)
95,44 (R)
Negativo
Negativo
Positivo (Bandas: C1, C2, E2, NS3
e NS4)
044
1,37 (R)
1,28 (R)
0,84 (I)
Negativo
Negativo
Negativo (Bandas: Muito fraca C1 e
C2)
049
9,39 (R)
3,9 (R)
11,04 (R)
Negativo
Negativo
Indeterminado (Bandas: NS3)
054
7,63 (R)
1,50 (R)
2,92 (R)
Negativo
Negativo
Indeterminado (Bandas: NS3)
056
2,63 (R)
0,41 (NR)
0,85 (I)
Negativo
Negativo
Negativo
Critérios de interpretação: (R) reagente, (NR) não reagente e (I) inconclusivo (conforme os fabricantes dos ensaios sorológicos).
Resultados
67
77.8%
88.9%100.0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Todas as amostras (n = 11)
Con
cord
ânci
a (%
)
CIA ELISA MEIA
A
100.0% 100.0% 100.0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Amostras com alta reatividadesorológica (n = 6)
Con
cord
ânc
ia (%
)
CIA ELISA MEIA
B
50.0%
75.0%
100.0%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Amostras com baixa reatividadesorológica e não reativas (n = 5)
Co
nco
rdân
cia
(%)
CIA ELISA MEIA
C
Figura 20: Comparação entre os resultados dos métodos sorológicos e o método de “immunoblotting”, considerando todas as amostras que apresentaram discordância entre os métodos sorológicos e os métodos moleculares (A); amostras que apresentaram alta reatividade sorológica (B) e amostras que apresentaram baixa reatividade sorológica e amostras não reativas (C). Foram desconsiderados os resultados considerados “indeterminados” ou “inconclusivos”.
A figura 20 apresenta a concordância entre os resultados dos métodos sorológicos e
o método de “immunoblotting” para estas amostras. Os métodos moleculares e o
método de “immunoblotting” somente concordaram em 20% destas amostras,
desconsiderando-se as amostras que obtiveram resultados “indeterminados”.
Discussão
69
5 DISCUSSÃO
Considerando-se que o delineamento deste estudo não buscou estabelecer
parâmetros epidemiológicos para a população estudada, como por exemplo, a
prevalência da infecção pelo VHC, o grupo controle de 25 % do número de amostras
reagentes foi selecionado, de forma aleatória, dentre a população inicial deste
estudo, porém com sorologia não reativa para o VHC. O objetivo da inclusão deste
grupo foi observar o comportamento dos demais métodos sorológicos avaliados
além do método de triagem inicial (Quimioluminescência – Vitros ECi®) e comparar
estes métodos entre si e com metodologias de caráter confirmatório. Sob este
prisma e à luz de outros estudos anteriormente publicados, a expectativa era de que
quanto maiores fossem os valores obtidos nas leituras dos testes reativos, menores
seriam as chances de tratar-se de um resultado falso-positivo.
Os dados apresentados pelo CDC em 2003 foram corroborados em nossas análises.
Para resultados considerados pelo CDC como de baixa reatividade, todos os testes
sorológicos apresentaram pouca ou nenhuma concordância com os métodos
moleculares. Tomando por base a detecção do RNA-VHC por PCR na amostra
como confirmação da infecção, apenas uma amostra no método de MEIA (amostra
055) teve seu resultado sorológico, considerado de baixa reatividade, confirmado.
Nos outros dois métodos sorológicos estudados, nenhuma amostra de baixa
reatividade teve seu resultado confirmado pelos métodos de biologia molecular. Esta
tendência tem sido também demonstrada por outros autores (OETHINGER et al,
2005; MOREIRA et al, 2005; REN et al, 2005). Tendo em vista, que os métodos
sorológicos para detecção de anticorpos contra o VHC surgiram no início da década
de 1990 com a intenção de triagem de doadores de sangue, não é surpresa que os
mesmos privilegiem a sensibilidade. Este aspecto pode levar uma elevação no
número de resultados falso-positivos, no que se refere à presença do vírus e não de
anticorpos residuais, como ficou constatado pela análise em “immunoblotting”, onde
apenas 4 amostras (044, 049, 054 e 056) apresentaram resultados caracterizados
como falso-positivos.
Discussão
70
Amostras com resultados considerados altamente reativos, pelo critério apresentado
pelo CDC em 2003, apresentaram elevada concordância com os métodos
moleculares. Este valor ficou abaixo dos 95% mencionados pelo CDC, entretanto, os
critérios adotados pelo CDC referem-se à detecção de anticorpos anti-VHC e não,
obrigatoriamente, da presença do vírus. Desta forma, os valores obtidos pelos
métodos MEIA (87,5%), CIA e ELISA (82,9% para ambos), ao serem avaliadas no
método de “immunoblotting” apresentaram boa correlação com este, sendo que
amostras com sorologia altamente reativa apresentaram elevada concordância. No
entanto, apenas as amostras discordantes entre sorologia e PCR foram avaliadas no
“immunoblotting”, o que não permite estabelecer com precisão a magnitude desta
correlação. A utilização do método de “immunoblotting” no estudo se justifica,
exatamente, na avaliação da reatividade sorológica de cada método na ausência de
evidenciação molecular do RNA viral. As amostras reativas sorologicamente no
método de “immunoblotting” demonstram especificidade da reatividade dos
anticorpos presentes na amostras, descartando-se assim a possibilidade de
reatividade cruzada com anticorpos produzidos contra outros patógenos.
Para as amostras sorologicamente não reativas, todos os testes apresentaram
excelente concordância entre si e com os métodos moleculares, embora o número
reduzido de amostras não reagentes, inseridas como controle, não nos permita
estabelecer uma inferência mais aprofundada neste sentido. De toda forma, merece
menção o fato de que nenhum teste apresentou resultado falso-negativo para as 50
amostras estudadas.
A análise dos resultados sorológicos aponta para uma melhor correlação do método
MEIA com os métodos moleculares, em detrimento dos outros dois métodos
sorológicos estudados. Particularmente, a análise dos resultados das amostras
discordantes entre os métodos sorológicos e moleculares, revelou que, embora
tenha sido observada relevância estatística no uso da relação S/Co, classificando-os
em alta reatividade e baixa reatividade, resultados com alta reatividade também
apresentaram discordância com métodos moleculares. Este achado pode estar
relacionado com a questão de que a detecção de anticorpos anti-VHC, pode
permanecer elevada mesmo após o “clareamento” da infecção, que pode ocorrer em
Discussão
71
cerca de 20 % dos casos. Esta situação é normalmente definida como “cicatriz
sorológica”. Os testes moleculares estudados apresentaram resultados equivalentes,
tanto o método de PCR em tempo real com detector TaqMan®, quanto a PCR
qualitativa Amplicor®, demonstraram concordância entre si e com a maioria absoluta
dos resultados sorológicos. Entretanto, um pequeno grupo de amostras, com
resultados sorológicos fortemente reativos, apresentou-se negativo para RNA-VHC.
Consideramos relevante, a evidenciação de que os processos de diálise possam
estar relacionados com a diminuição da circulação sangüínea de partículas virais,
conforme descrito anteriormente (FURUSYO et al, 2000; FABRIZI et al, 2003;
OKUDA et al, 2005). Esta constatação demonstra que a não evidenciação de
material genético viral em amostra de sangue periférico, não pode ser utilizada como
critério absoluto para a total exclusão da presença do vírus no organismo. Nos casos
de pacientes de hemodiálise, resta saber se o vírus realmente não está mais
presente, apesar do resultado sorológico ainda fortemente reativo ou se o mesmo
apenas não se encontra circulante no sangue periférico. A constatação de que a
maioria dos resultados sorológicos de alta reatividade (no caso do método MEIA, a
totalidade dos resultados), ter se confirmado no método de “immunoblotting”, reforça
os aspectos mencionados por outros autores. Esta questão pode ser melhor
investigada por meio de biópsia hepática e pesquisa do material genético do VHC
nesta amostra, procedimento invasivo e de difícil realização.
Os resultados de ambos os métodos moleculares foram totalmente concordantes.
No entanto, algumas ressalvas merecem menção, como o fato da possibilidade de
não detecção pela inativação do RNA da amostra, uma vez que o mesmo é muito
mais lábil do que o DNA. Para evitar que esta possibilidade influenciasse no
resultado final, todas as amostras do grupo de estudo com resultado negativos em
qualquer um dos dois métodos, foram recoletadas e reprocessadas, sendo
resguardadas todas as precauções quanto à preservação das amostras. Este
procedimento revelou-se importante em diversos casos onde a primeira análise
apresentou resultado negativo e uma nova análise, com nova amostra, apresentou
reatividade. Nestes casos, foi coletada uma terceira amostra, visando à confirmação
do resultado.
Discussão
72
Oethinger e col. (2005) reportaram que nenhuma amostra reativa no sistema
analítico Vitros ECi® (Ortho), com relação S/Co < 5,0, foi confirmada por PCR (n=83)
ou “immunoblotting” (n=163), em uma população de militares considerada de
prevalência média (8 a 10 %) pelo CDC. Os autores sugerem, inclusive, que testes
sorológicos deste sistema com relação S/Co < 5,0 não sejam seguidos de testes
complementares e sejam reportados como não reagentes, visando a economia de
recursos, uma vez que nesta faixa de resultado o VPP do testes é inferior a 1%. Esta
opinião não é compartilhada neste nosso estudo, tendo em vista que a pesquisa de
anticorpos anti-VHC ainda é o marcador mais utilizado e por vezes o único, para
triagem da infecção pelo VHC em nosso país, mesmo que nossos resultados
estejam em acordo com a proposta apresentada.
A conversão sorológica de não-reagente para reagente ainda é, atualmente, a forma
de identificar a infecção aguda pelo VHC. Valores baixos de relação S/Co, podem
expressar momentos iniciais da infecção, período onde a viremia é notadamente
mais elevada e conseqüentemente, a infectividade. Em serviços de hemodiálise,
assim como em bancos de sangue, a triagem deve permitir a detecção de infecção
pelo VHC o mais precocemente possível. Entretanto, nestes casos, fatalmente os
testes utilizados apresentaram um maior percentual de resultados falso-positivos.
Neste contexto, os testes suplementares de confirmação são fundamentais para o
estabelecimento do diagnóstico.
Conclusões
74
6 CONCLUSÕES
1. Em relação à relevância estatística da utilização do valor da relação S/Co, os
resultados demonstraram ser estatisticamente significante o uso deste valor.
Desta forma, a estratificação da reatividade sorológica, em baixa reatividade e
alta reatividade, demonstra ser uma abordagem relevante. Este aspecto
reforça a recomendação de valorizar este índice como critério auxiliar na
interpretação dos resultados. Portanto, concluímos serem aplicáveis as
recomendações do CDC no que se refere à detecção de anticorpos anti-VHC.
Mesmo amostras com resultados sorológicos de alta reatividade,
apresentaram resultados moleculares negativos, para a pesquisa de RNA do
VHC, portanto, ao serem reportadas como reativas devem ser seguidas de
recomendação para execução de métodos confirmatórios para infecção,
como recomenda o CDC (CDC, 2003).
2. A não ocorrência de resultados falso-negativos nas amostras avaliadas,
mesmo considerando ser o universo de amostras não-reativas reduzido,
salienta uma característica importante dos métodos sorológicos atuais para
diagnóstico de hepatite C, a elevada sensibilidade. Entretanto, quanto às
amostras com resultados reativos, os métodos sorológicos apresentaram
concordância inferior ao esperado, tendo o método MEIA apresentado menor
concordância com os demais métodos sorológicos (CIA e ELISA), porém
apresentado maior correlação com os métodos moleculares e com o método
de “immunoblotting”, entre as amostras discordantes.
3. A demonstração de amostras com resultados sorológicos de alta reatividade
nos três métodos sorológicos estudados e reatividade concomitante no
método de “immunoblotting”, porém com PCR negativa para RNA do VHC, vai
de encontro aos resultados apresentados por diversos autores (FURUSYO et
al, 2000; FABRIZI et al, 2003; OKUDA et al, 2005), quanto à diminuição da
viremia em pacientes em tratamento de hemodiálise. A confirmação desta
hipótese somente poderia ser efetuada com a pesquisa do RNA do VHC
Conclusões
75
em tecido hepático, o que poderia descartar a possibilidade de cura da
infecção e conseqüentemente, tratar-se os anticorpos detectados de uma
“cicatriz sorológica” ou memória imunológica. Não foi evidenciada correlação
significativa entre os valores de CT, obtidos pelo método de PCR em tempo
real e os valores de relação S/Co, obtidos pelos métodos sorológicos. Este
aspecto indica não haver relação direta entre a viremia e a quantidade de
anticorpos circulantes contra o vírus, uma vez que o valor de CT é um
indicador, inversamente proporcional, da viremia.
4. Finalmente, em suma, podemos concluir que a estratégia de estratificação
dos resultados sorológicos, em alta e baixa reatividade, constitui-se de uma
abordagem consistente, inclusive do ponto de vista estatístico. A valorização
dos resultados, desta forma estratificados, permite uma abordagem mais
racional dos mesmos. Testes sorológicos realizados por diferentes métodos,
não devem ser utilizados em um mesmo diagnóstico, pois diferenças
significativas foram encontradas entre os métodos estudados. Os testes
suplementares como “immunobloting” e testes moleculares, continuam, em
nossa interpretação, fundamentais para a conclusão diagnóstica,
especialmente em resultados de baixa reatividade sorológica.
Referências
77
7 REFERÊNCIAS
Albuquerque AC, Coêlho MR, Lopes EP, Lemos MF, Moreira RC. Prevalence and
risk factors of hepatitis C virus infection in hemodialysis patients from one center in
Recife, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(5):467-70.
Amplicor® Hepatitis C Vírus Test, version 2.0 – Instructions for use – Doc. Ver. 4.0 –
USA, 06/2006.
Applied Biosystems 7300/7500/7500 - Fast Real-Time PCR System Absolute
Quantification Getting Started Guide. 2005.
Axsym® System Anti-HCV 3.0 – Instructions for use – List. N° 5C36 – 34.3443/R5 –
USA. Abbott Laboratories, 2004.
Bar-Shany S, Green MS, Shinar E. False positive tests for anti-hepatitis C antibodies
and the problem of notifying blood donors. Int J Epidemiol. 1996;25:674-8
Brasil. Ministério da Saúde. Hepatites Virais: O Brasil está atento / Ministério da
Saúde, Secretaria de Políticas de Saúde, Programa Nacional de Hepatites Virais –
(Série A. Normas e Manuais Técnicos) – Brasília: Ministério da Saúde, 2002. 24p.
Busek S, Oliveira G. Molecular epidemiology of the hepatitis C virus in Brazil. Genet
Mol Res. 2003;2(1):117-23.
Campiotto S, Pinho JR, Carrilho FJ, Da Silva LC, Souto FJ, Spinelli V, Pereira LM,
Coelho HS, Silva AO, Fonseca JC, Rosa H, Lacet CM, Bernardini AP.. Geographic
distribution of hepatitis C virus genotypes in Brazil. Braz J Med Biol Res. 2005;38(1):
41-49.
Referências
78
Carneiro MA, Teles SA, Dias MA, Ferreira RC, Naghettine AV, Silva SA, Lampe E,
Yoshida CF, Martins RM. Decline of hepatitis C infection in hemodialysis patients in
Central Brazil: A ten years of surveillance. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(4):345-
9.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for laboratory testing
and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003;52(Nº RR-3): 16p.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Recommendations for
Preventing Transmission of Infections Among Chronic Hemodialysis Patients.
MMWR 2001;50(Nº RR05):43p.
Chevaliez S, Pawlotsky JM. Use of virologic assays in the diagnosis and
management of hepatitis C virus infection. Clin Liver Dis. 2005;9(3):371-82.
Colin C, Lanoir D, Touzet S, Meyaud-Kraemer L, Bailly F, Trepo C; HEPATITIS
Group. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C antibodies detection
assays: an analysis of the literature. J Viral Hepat. 2001;8:87-95.
Dawson B, Trapp RG. Basic & clinical biostatistics. 4.ed. New York: LANGE, 2004.
438p. p.48-51.
Eisen-Vandervelde AL, Waggoner SN, Yao ZQ, Cale EM, Hahn CS, Hahn YS.
Hepatitis C virus core selectively suppresses interleukin-12 synthesis in human
macrophages by interfering with AP-1 activation. J Biol Chem. 2004;279(42):43479-
86.
Fabrizi F, Bunnapradist S, Lunghi G, Martin P. Kinetics of hepatitis C virus load
during hemodialysis: novel perspectives. J Nephrol. 2003;16(4):467-75.
Fabrizi F, Lunghi G, Ganeshan SV, Martin P, Messa P. Hepatitis C virus infection and
the dialysis patient. Semin Dial. 2007;20(5):416-22.
Referências
79
Ferreira AW, Ávila SLM. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas
e Auto-Imunes. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 443 p.
Furusyo N, Hayashi J, Kanamoto-Tanaka Y, Ariyama I, Etoh Y, Shigematsu M,
Kashiwagi S. Liver damage in hemodialysis patients with hepatitis C virus viremia: a
prospective 10-year study. Dig Dis Sci. 2000;45(11):2221-8.
Gonçalves PL, Cunha CB, Busek SC, Oliveira GC, Ribeiro-Rodrigues R, Pereira FE.
Detection of hepatitis C virus RNA in saliva samples from patients with seric anti-
HCV antibodies. Braz J Infect Dis. 2005;9(1):28-34.
Hayashi H, Okuda K, Yokosuka O, Kobayashi S, Yokozeki K, Ohtake Y, Irie Y.
Adsorption of hepatitis C virus particles onto the dialyzer membrane. Artif Organs.
1997;21(10):1056-9.
Hussein MM, Mooij JM, Hegazy MS, Bamaga MS. The impact of polymerase chain
reaction assays for the detection of hepatitis C virus infection in a hemodialysis unit.
Saudi J Kidney Dis Transpl. 2007;18(1):107-13.
Hwang SJ. Hepatitis C virus infection: an overview. J Microbiol Immunol Infect.
2001;34(4):227-34.
Ishida H, Tanabe K, Tokumoto T, Shimizu T, Shimmura H, Yoshioka T, Toma H.
Hepatitis C virus decreases in patients with maintenance hemofiltration therapy. Artif
Organs. 2004;28(3):316-8.
Jadoul M, Poignet JL, Geddes C, Locatelli F, Medin C, Krajewska M, Barril G,
Scheuermann E, Sonkodi S, Goubau P; HCV Collaborative Group. The changing
epidemiology of hepatitis C virus (HCV) infection in haemodialysis: European
multicentre study. Nephrol Dial Transplant. 2004;19(4):904-9.
Referências
80
Janeway, CA; Travers, P; Walport, M; Shlomchik, M. Imunobiologia: o sistema
imune na saúde e na doença. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. 767 p., p. 639 –
660.
Kalantar-Zadeh K, Miller LG, Daar ES. Diagnostic discordance for hepatitis C virus
infection in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis. 2005;46(2):290-300.
Keeffe EB. Hepatitis C virus. Clin Liver Dis. 2005;9:xi-xiii (preface).
Large MK, Kittlesen DJ, Hahn YS. Suppression of host immune response by the core
protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J
Immunol. 1999;162(2):931-8.
Lazzarini FAS, Andrade D, Rossi LA, Ferraz, AEP. Incidência de soroconversão para
o vírus da hepatite C após a implementação de programa de prevenção e controle
em unidade de hemodiálise. Rev. Latino-Am. Enfermagem. 2000;8(5):7-12.
Medeiros MTG, Lima JMC, Lima JWO. Prevalência e fatores associados à hepatite C
em pacientes de hemodiálise. Rev. Saúde Pública. 2004;38(2):187-193.
Moreira RC, Lemos MF, Longui CA, Granato C. Hepatitis C and hemodialysis: a
review. Braz J Infect Dis. 2005;9(4):269-75.
Murex anti-HCV (versão 4.0) – Instruções de uso – REF: VK47/48 versão 4.0 –
7F51-01/7F51-02 – Pub n° C03VK47SP – UK, 2002.
Naghettini AV, Daher RR, Martin RMB. Soroprevalência do vírus da hepatite C na
população em diálise de Goiânia, GO. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1997;30(2):113-
117.
Oethinger M, Mayo DR, Falcone J, Barua PK, Griffith BP. Efficiency of the ortho
VITROS assay for detection of hepatitis C virus-specific antibodies increased by
elimination of supplemental testing of samples with very low sample-to-cutoff ratios. J
Referências
81
Clin Microbiol. 2005; 43(5): 2477-80.
Okuda K, Hayashi H, Yokozeki K, Irie Y. Destruction of hepatitis C virus particles by
haemodialysis. Lancet. 1996;347(9005):909-10.
Okuda K, Yokosuka O. Natural history of chronic hepatitis C in patients on
hemodialysis: Case control study with 4-23 years of follow-up. World J Gastroenterol.
2004;10(15):2209-2212
Parolin C, Corso AD, Alberghina L, Porro D, Branduardi P. Heterologous production
of five Hepatitis C virus-derived antigens in three Saccharomyces cerevisiae host
strains. J Biotechnol. 2005;120(1):46-58.
Pires-Alves M, Novais CM. PCR em tempo real – Uma inovação tecnológica da
reação em cadeia da polimerase. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento.
2004;33:10-13.
Polywka S, Schröter M, Feucht HH, Zöllner B, Laufs R. Relevance of reactivity in
commercially available hepatitis C virus antibody assays.. J Clin Microbiol.
2001;39(4):1665-8.
QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit– Handbook – 2.ed. – 04/2005.
Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus
infection. Nat Rev Immunol. 2005;5(3):215-29.
Ren FR, Lv QS, Zhuang H, Li JJ, Gong XY, Gao GJ, Liu CL, Wang JX, Yao FZ,
Zheng YR, Zhu FM, Tiemuer MH, Bai XH, Shan H. Significance of the signal-to-cutoff
ratios of anti-hepatitis C virus enzyme immunoassays in screening of Chinese blood
donors. Transfusion. 2005;45(11):1816-22.
Referências
82
Santana GO, Cotrim HP, Mota E. Anticorpo contra o vírus C da hepatite em
pacientes sob programa de hemodiálise em Salvador, BA, Brasil. Arq. Gastroenterol.
2001;38(1):24-31.
Shamshirsaz AA, Kamgar M, Bekheirnia MR, Ayazi F, Hashemi SR, Bouzari N,
Habibzadeh MR, Pourzahedgilani N, Broumand V, Shamshirsaz AH, Moradi M,
Borghei M, Haghighi NN, Broumand B. The role of hemodialysis machines dedication
in reducing Hepatitis C transmission in the dialysis setting in Iran: a multicenter
prospective interventional study. BMC Nephrol. 2004;5(1):13.
Soares JF, Siqueira AL. Introdução à estatística médica. 2.ed. Belo Horizonte:
COOPMED, 2002. 300 p., p.174-219.
Souza KP, Luz JA, Teles SA, Carneiro MA, Oliveira LA, Gomes AS, Dias MA, Gomes
SA, Yoshida CF, Martins RM. Hepatitis B and C in the hemodialysis unit of Tocantins,
Brazil: serological and molecular profiles. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003;98(5):599-
603.
Strauss E. Hepatite C. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2001;34(1):69-82.
Tengan, FM, Eluf-Neto, J, Cavalheiro NP, Barone AA. Sexual transmission of
hepatitis C virus. Rev. Inst. Med. Trop. 2001;43(3):133-137.
Thomas DL, Seeff LB. Natural history of hepatitis C. Clin Liver Dis. 2005;9(3):383-98.
Yao ZQ, Eisen-Vandervelde A, Waggoner SN, Cale EM, Hahn YS. Direct binding of
hepatitis C virus core to gC1qR on CD4+ and CD8+ T cells leads to impaired
activation of Lck and Akt. J Virol. 2004;78(12):6409-19.
Yao ZQ, Nguyen DT, Hiotellis AI, Hahn YS. Hepatitis C virus core protein inhibits
human T lymphocyte responses by a complement-dependent regulatory pathway. J
Immunol. 2001;167(9):5264-72.
Referências
83
Vitros Immunodiagnostic Products Anti-HCV Reagent Pack – Instructions for use,
version 2.0 – Pub n° J03805, USA. Ortho Clinical Diagnostics, 2003
Zachary P, Ullmann M, Djeddi S, Meyer N, Wendling MJ, Schvoerer E, Stoll-Keller F,
Gut JP. Evaluation of three commercially available hepatitis C virus antibody
detection assays under the conditions of a clinical virology laboratory. J Clin Virol.
2005;34(3):207-10.
Anexo
85
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título do Projeto:
PROPOSTA DE PROCEDIMENTO CONFIRMATÓRIO NA TRIAGEM
SOROLÓGICA PARA HEPATITE C EM PACIENTES DE HEMODIÁLISE NA
REGIÃO METROPOLITANA DE VITÓRIA-ES
DIREITOS DO SUJEITO DA PESQUISA (SEUS DIREITOS): Este termo de consentimento tem a função de informar você sobre o projeto de pesquisa que você está sendo convidado(a), neste momento, a participar. Esta pesquisa pretende estudar a possibilidade de ser desenvolvido um teste confirmatório nos exames de sangue sorológicos para a hepatite C, exames estes que você normalmente já realiza periodicamente como parte do seu tratamento. Após você ser devidamente informado(a) dos objetivos deste estudo, suas perguntas terem sido devidamente esclarecidas e se você concordar em participar do estudo, será solicitado a você que assine este termo de consentimento. Você receberá também uma cópia deste termo de consentimento para que possa guardá-la. Neste momento você está sendo informado(a) de que o estudo que você está sendo convidado a participar não implica em nenhum procedimento ou necessidade de coleta de sangue ou outros materiais além das coletas de sangue que já são normalmente realizadas para realização de seus exames periódicos. A sua participação neste estudo é voluntária e, além disso, você poderá solicitar que quer deixar o estudo em qualquer momento, mesmo após ter concordado em participar do mesmo. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
O estudo que você está sendo convidado(a) a participar, visa observar possibilidades de melhorar o diagnóstico sorológico da hepatite C. A hepatite C é uma doença contagiosa e todos os pacientes que realizam hemodiálise, juntamente com pacientes que recebem transfusão de sangue entre outros, são considerados grupos de maior risco em contrair esta doença. Periodicamente você realiza exames para avaliar se existe a presença de anticorpos em seu sangue contra o vírus da hepatite C. Um diagnóstico rápido e seguro da presença do vírus, em um paciente que realiza hemodiálise, diminui a possibilidade de se passar o vírus da hepatite C para outro paciente. Por isso, um estudo como esse que avalia a possibilidade de melhorar o diagnóstico da hepatite C por meio de exames de laboratório é importante. RISCO EM PARTICIPAR DO ESTUDO Você não estará exposto a nenhum risco por participar deste estudo. As amostras de sangue que serão utilizadas neste estudo serão as amostras de sangue normalmente coletadas, em seus exames periódicos. CONFIDENCIALIDADE Suas informações pessoais, seu nome e os resultados de seus exames são absolutamente CONFIDENCIAIS, isto é, não serão divulgados para ninguém e
Anexo
86
apenas o pesquisador responsável pelo projeto, terá acesso aos seus dados. No estudo, sua amostra de sangue será identificada com um número de participação, desta forma seu nome não será utilizado de forma alguma em nenhum relatório ou publicação sobre este estudo. BENEFÍCIOS POR PARTICIPAR DESTE ESTUDO Ao participar deste estudo, dirigido especificamente apenas a pacientes de serviços de hemodiálise, você estará sendo indiretamente beneficiado por quaisquer resultados positivos que possam ser obtidos com esta pesquisa. Bem como estar beneficiando demais pacientes na mesma condição. CUSTOS Nenhum custo existe por participar deste estudo. Você não receberá nenhuma remuneração por participar deste estudo, mesmo por que isto é proibido no Brasil. PERGUNTAS Se, depois de concordar em participar do estudo, você ainda tiver alguma pergunta você poderá fazê-la através do telefone diretamente ao pesquisador responsável pelo estudo, o Dr. Rodrigo Ribeiro Rodrigues, pelos telefones (27) 3335-7210 ou (27) 3337-7206. Se você tiver alguma dúvida ou pergunta sobre os seus direitos como voluntário deste estudo, você poderá contactar o Dr. Fausto Edmundo Lima Pereira, Presidente do Comitê de Ética em Pesquisa do Centro Biomédico da UFES no telefone (27) 3335-7243. CONSENTIMENTO A SUA PARTICIPAÇÃO NESTE ESTUDO É VOLUNTÁRIA. Você tem o direito de recusar ou de se retirar do estudo a qualquer momento sem riscos para o seu tratamento. TERMO DE CONSENTIMENTO: Eu recebi uma cópia deste Termo de Consentimento e sei que uma cópia ficará guardada no meu arquivo do estudo. Eu fui informado e entendi que minha participação no estudo é VOLUNTÁRIA e que posso deixar o estudo a qualquer momento que quiser. Eu entendo que ao assinar ou colocar minha impressão digital no espaço abaixo, estou concordando em participar deste estudo nos termos estabelecidos neste documento. ___________________________ __________________________ ________ Assinatura ou impressão digital do voluntário Nome do Voluntário Data e Hora Eu expliquei os objetivos deste estudo ao voluntário. Tenho plena convicção que ela/ela entendeu os objetivos, riscos e benefícios em potencial da sua participação no estudo. _________________________ RODRIGO RIBEIRO RODRIGUES ______________ Assinatura do Pesquisador Nome do Pesquisador Data e Hora