Profa. Renata Faier Calegario

Marcadores Moleculares

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO

AF 060- Biotecnologia Vegetal

Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes

Marcadores

(BORÉM, 1997).

INTRODUÇÃO

Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares

Marcadores Genéticos

Melhoramento Genética

mendeliana

Genética de

populações

Genética

molecular Organização do

genoma

Sequenciamento

Transferência

gênica

Aplicações: diversas áreas do conhecimento

Constituição genética de um organismo=> o conjunto de genes

Fenótipo

Características visíveis de um indivíduo

Sofre influência:

• Genótipo • Fatores ambientais

Genótipo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

DiplóideHaplóide

Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos

Local ocupado pelo gene no cromossomo

Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo

Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos

Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos

ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS

Gene Recessivo (a)

• Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa)

• Presente em dose dupla (dois alelos iguais)

Gene Dominante (A)

• Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose(AA) e heterozigose (Aa)

DOMINÂNCIA

A1A1 A1A2 A2A2

Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ DOMINANTES”

=> exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto

2 alelos recessivos no mesmo loco: Ausência de banda – só amplifica locus com alelos dominantes

A1= alelo dominantePresença de bandas

A1A1 A1A2 A2A2

Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose

MARCADORES “ CO-DOMINANTES”

=> Expressão de ambos os alelos no heterozigoto

Genes no

mesmo

locus

� Marcadores MorfológicosCaracterísticas fenotípicas do organismoEx. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala

� Marcadores BioquímicosPresença ou ausência de compostosEx. isoenzimas e proteínas

� Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas

TIPOS DE MARCADORES

�Reprodutibilidade

�Amplamente distribuído através do genoma

�Poder de discriminação

�Ausência de influências ambientais

�Barato

�Fácil de mensurar

CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR

� Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA

� Características polimórficas herdáveis que refletemdiferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos

MARCADORES MOLECULARES

Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade

Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA

APLICAÇÕES

� Diversidade genética de organismos

�Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de

qualquer outra variedade da mesma espécie

� Análise da pureza genética de semente

�Mapeamento de genes e características (associação do marcador

com os genes de interesse)

�Seleção de genitores

� Retrocruzamento assistido...

MARCADORES MOLECULARES

• Não sofre influência do ambiente

• Neutros em relação a efeitos fenotípicos

• N° ilimitado de marcadores e de polimorfismo

• Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta

• Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis

Vantagens

• Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos

Desvantagens

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

DNA ligase

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

CAS

COLAR

DNA ligase

TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL

Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares

EletroforesePCR

Enzimas de Restrição

DNA ligase

AFLP

Restrição e Hibridização de sequências DNA

PCR

PCR + restrição...

CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES

RFLP

RAPD, Microssatélites

=> Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo

A partir 1980...

Restriction Fragment Length PolymorphismPolimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição

� Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição

� Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA

� Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção

� Requer conhecimento sequência

RFLP

RFLP

SouthernBlot

Hibridização

Planta, fungo,

organismos...

1 . DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose)

3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda

4. Visualização dos fragmentos na membrana

� sondas marcadas (32P) ou Fluorescência

5. Análise dos resultados

� presença/ausência de bandas

� diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada

RFLP - METODOLOGIA

Southern blot

ANÁLISE DOS RESULTADOS

RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate

Fonte: Mello et al., 2007.

Fragmentos que

hibridizarem com a

sonda

+ + + + + +T T T T T T

+ →→→→ Grupo 16 SrIII

118

194234

271 281

603

872 1078 1353

pb

310

Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4

Eletroforese do DNA cortado com enzima de restrição

Gel revelado com EtBr => UV

Visualização de arraste contínuo de fragmentos de DNA

Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética

=> representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético

� Trabalhoso � Caro� Uso de sondas radioativas

RFLP

� Reprodutibilidade

� Marcadores co-dominantes

� Simples

Vantagens

Desvantagens

Random Amplification of Polymorphic DNAFragmentos de DNA amplificados por PCR

� Método mais rápido para detecção de polimorfismos

� DNA genômico amplificado por PCR

� Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F

� Não requer conhecimento da sequência

� Marcador dominante

RAPD

1 . DNA é amplificado via PCR com primer aleatório => Gera fragmentos pequenos

2. Separação dos fragmentos por eletroforese

5. Análise dos resultados

� presença/ausência de bandas

� diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas

RAPD - METODOLOGIARAPD - METODOLOGIA

A

A B

B

RAPD - METODOLOGIA

DNA

� Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos)

� Quando se anela em direções opostas = Amplificação

� Anelamento em pequenas distâncias

PRIMERS ALEATÓRIOS

Vários Fragmentos

Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum

RAPD - Feijoeiro

marcador ligado à Co-1

Resistentes à raça 65

Fonte: Moura, 2005

550 pb

1000 pb

1200 pb

• Rápido e simples - não envolve hibridização

• Baixo custo

• Sem uso de radioisótopos

• Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA

Fonte: IPGRI

RAPD

Vantagens

Desvantagens

• Marcador dominante

• Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos

• Problemas de interpretação: co-migração

- mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro!

- uma banda: um fragmento? Pode ser dois!

• Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas emtandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto

Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC

Dinucleotídeos TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC

Trinucleotídeos TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC

Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

MICROSSATÉLITES

• Amplificadas por PCR

• Marcador Co-dominante

• Classe de marcador com maior grau de polimorfismo

• Requer conhecimento prévio da sequência

Sinonímias

• SSR (Simple Sequence Repeats);

• STMS (Sequence Tagged Microsatellites);

• SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);

Onde são encontrados ???• Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)• Plantas: (AT)n• Mitocôndrias• Cloroplastos

MICROSSATÉLITES

MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA

1 . Digestão DNA – Enzimas de Restrição

2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor

3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas)

4. Sequenciamento dos clones

5. Desenho dos primers

M

homozigotoheterozigoto

M

homozigotoheterozigoto

Marcador Co-dominante

MICROSSATÉLITES

Gel de poliacrilamida

=> Perceber diferenças de nucleotídeos

CACACACACACACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

CACACACACACACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

(CA)3

(CA)3

Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

DETECÇÃO DE LOCUS SSRSimple Sequence Repeats = Microssatélites

Homozigoto Heterozigoto Homozigoto

MICROSSATÉLITES

cada “ilha” microssatélite constitui um locus,

multialélico

Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus

Marcador multialélico

Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus)

MICROSSATÉLITES

Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo

MICROSSATÉLITES

Vantagens

• Reprodutibilidade

• Requer pequena quantidade de DNA

• Baixo custo

• Grande poder de resolução

• Alto nível polimorfismo – útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade

Desvantagens• Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primersaleatórios)

• Trabalhoso

• Porém: uma vez desenvolvido é fácil

• Caro

Atributos

Isoenzimas

Proteínas de sementes

RFLPs

RAPDs

Microssatélites

AFLPs

Nível de

Polimorfismo

baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto

Estabilidade

ambiental

moderada alta alta alta alta alta

Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto

Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante

Número de alelos por

loco

2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2

Distribuição no

genoma

regiões de cópia

única

regiões de cópia

única

várias ao acaso ao acaso ao acaso

Acessibilidade

tecnológica

muito alta muito alta média muito alta muito baixa média

Aplicabilidade no

melhoramento

rápido,

baixo custo

rápido,

baixo custo

lento,

custo médio

rápido, baixo

custo

lento, custo alto rápido, custo

baixo

Identificação de genótipos

baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta

Avaliação de

germoplasma

média baixa alta alta alta muito alta

Mapeamento

genético

baixa muito baixa alta alta muito alta alta

Mapeamento de

regiões específicas

baixa inadequado média muito alta média muito alta

Mapeamento

comparativo

baixa inadequado muito alta baixa alta baixa

Genética de

Autógamas

baixa baixa média alta muito alta muito alta

Genética de

Alógamas

média baixa média alta muito alta muito alta

Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média

Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

Técnicas sorológicas:

ELISA e Western Blot

Metodologia: baseada em propriedades

Proteicas

Ácido nucleicos

Métodos Sorológicos

Métodos Moleculares

TÉCNICAS DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO

Detecta => proteína

Baseado na reação antígeno-anticorpo de animais de sangue quente

Anticorpos: são proteínas produzidas pelos glóbulos brancos

(linfócitos B)

Vírus: atua como antígeno quando inoculado num animal

Substância formada em reação ao vírus funciona como anticorpo

Antígeno: substâncias estranhas ao organismo

MÉTODOS SOROLÓGICOS

Anticorpo reconhece esta proteína viral

Portanto:

O antígeno é a proteína viral (Capa Proteica)

Conservado a -4ºCSeparação dos glóbulos brancos - soro

Como se produz anticorpo?

IgG

Região constante

Sítio de reconhecimento da proteína viral

Região variável

Anticorpo

Sítio de reconhecimento da proteína viral

1. ELISA

2. Western Blot

MÉTODOS SOROLÓGICOS

Aplicações:

� Ferramentas para diagnósticos de doenças

� Indexação de material vegetal propagativo –

P. ex. plantas livres de vírus

Y O anticorpo 2° ligado a enzima reconhece Ac 1°

O substrato é adicionado

Anticorpo 1° imobilizado pelo vírus

Vírus adsorvido

Indireto

Adaptado de Zerb ini, 2002

Reação Colorimétrica

ELISA: Enzime linked imunosorbent assay

Resultado

+ -

Absorbância Concentração viral

Leitor de Elisa: Mede absorbância (405nm)

Cor Amarela

ELISA: Enzime linked imunosorbent assay

• Sensível (1 ng/ml)

• Rápido

• Baixo custo

• Seguro

• Teste de várias amostras

• Quantitativo

• Muito útil para testes de rotina

Vantagens Desvantagens

• Não mede infectividade

e reação inespecífica

ELISA: Enzime linked imunosorbent assay

“Western blot”

- Enzima: fosfatase alcalina- Quimioluminescente: CSPD ou CDP-star- Colorimétrico: NBT/BCIP

Western blot

Calegario et al., 2013

Western blot

Calegario et al., 2013

Tissue blot

- Não mede a infectividade do vírus

- Apresenta alguns falsos positivos

- Membranas podem ser transportadas

- Pode ser iniciada em campo pelo agricultor

- Custo moderado

- Várias amostras podem ser analisadas concomitantemente

Vantagens:

Desvantagens:

Western blot e Tissue blot

BIBLIOGRAFIA

1. Aluízio Borém e Eveline Teixeira Caixeta - Marcadores MolecularesViçosa, MG, 2006

2. Fábio Gelape Faleiro - Marcadores Genético-Moleculares aplicadosa programas de conservação e uso de recursos genéticos. EMBRAPACerrados, Planaltina , DF, 2007.

3.http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-extras/marcadores-moleculares/