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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LARISSA MURATORI AGUIAR
INVESTIGAÇÃO DO PAPEL MODULADOR DO HALOPERIDOL SOBRE OS NÍVEIS DE PROTEÍNAS RELACIONADAS À PLASTICIDADE E PREFERÊNCIA
POR OBJETOS NOVOS EM CAMUNDONGOS
NATAL 2013
LARISSA MURATORI AGUIAR
INVESTIGAÇÃO DO PAPEL MODULADOR DO HALOPERIDOL SOBRE OS NÍVEIS DE PROTEÍNAS RELACIONADAS À PLASTICIDADE E PREFERÊNCIA
POR OBJETOS NOVOS EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Bruno Lobão Soares Coorientador: Sidarta Ribeiro Coorientador (a): Selma Bezerra
NATAL 2013
RESUMO
A dopamina (DA) regula tanto o sono quanto o processo de formação de
memórias, enquanto o sono desempenha uma função essencial na consolidação de
diferentes tipos de memórias. Acreditamos que a manipulação farmacológica das
vias dopaminérgicas possa afetar o ciclo sono-vigília, acarretando déficits
mnemônicos, os quais podem ser observados tanto em nível comportamental quanto
molecular. Dessa forma, no presente estudo, investigamos o efeito do haloperidol
(halo - 0,3 mg/kg; i.p.), administrado imediatamente após sessões de treino no
período da manhã e da noite, sobre o desempenho de camundongos no teste de
preferência por objetos novos (TPON). Observamos que esse tratamento causou um
prejuízo mnemônico apenas nos camundongos testados pela manhã. Devido à
maior ocorrência de episódios de sono durante a fase clara dos roedores,
acreditamos que esse déficit pode estar associado a uma cascata de plasticidade
hipocampal, a qual envolve a expressão de diferentes moléculas em períodos
distintos após a exposição ao estímulo mnemônico inicial. Para testar tal hipótese,
realizamos imunohistoquímica (IHQ) em tecidos de animais naïve não expostos
(NV), bem como de animais expostos aos objetos com posterior injeção de halo ou
salina (veículo - VH), perfundidos 3, 6 e 12h após o estímulo inicial. Quantificamos a
expressão hipocampal (CA1, CA3 e GD) das proteínas CaMKII-P, Zif-268 e BDNF,
através de densitometria e contagem de células (somente para Zif-268).
Observamos um aumento parcial na expressão de CaMKII-P em animais VH 3h, na
região CA3. Quanto ao grupo halo, houve uma redução dos níveis de CaMKII-P nos
três horários analisados; de Zif-268 em 6h, tanto em CA1 quanto CA3; e de BDNF
em 12h, apenas no GD. Considerando-se o melhor desempenho diurno na
consolidação de memórias, associado à função do halo na regulação do sono,
propomos que a redução de plasticidade sináptica e os déficits no processo
mnemônicoocorreram devido à supressão do sono REM mediada pelo tratamento
com haloperidol.
Palavras-chave: Dopamina, sono, memória, plasticidade sináptica.
ABSTRACT
Dopamine (DA) is known to regulate both sleep and memory formations, while
sleep plays a critical role in the consolidation of different types of memories. We
believe that pharmacological manipulation of dopaminergic pathways might disrupt
the sleep-wake cycle, leading to mnemonic deficits, which can be observed in both
behavioral and molecular levels. Therefore, here we investigated how systemic
injections of haloperidol (0.3 mg/kg), immediately after training in dark and light
periods, affects learning assessed in the novel object preference test (NOPT) in
mice. We also investigated the hippocampal levels of the plasticity-related proteins
Zif-268, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and phosphorylated
Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II (CaMKII-P) in non-exposed (naïve),
vehicle-injected controls and haloperidol-treated mice at 3, 6 and 12 hours after
training in the light period. Haloperidol administration during the light period led to a
subsequent impairment in the NOPT. In contrast, preference was not observed
during the dark period neither in mice injected with haloperidol, nor in vehicle-injected
animals. A partial increase of CaMKII-P in the hippocampal field CA3 of vehicle-
injected mice was detected at 3h. Haloperidol-treated mice showed a significant
decrease in the dentate gyrus of CaMKII-P levels at 3, 6 and 12h; of Zif-268 levels at
6h, and of BDNF levels at 12h after training. Since the mnemonic effects of
haloperidol were only observed in the light period when animals tend to sleep, we
suggest that these effects are related to REM sleep disruption after haloperidol
injection.
Key-words: Dopamine, sleep, memory, synaptic plasticity.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Via dopaminérgica no SNC
FIGURA 2 Sinapse dopaminégica
FIGURA 3 Redução do sono REM após tratamento com haloperidol
FIGURA 4 Cascata bioquímica de plasticidade sináptica
FIGURA 5 Sinapse glutamatérgica e papel do BDNF
FIGURA 6 Aparato destinado à tarefa comportamental
FIGURA 7 Objetos selecionados para a tarefa comportamental
FIGURA 8 Habituação
FIGURA 9 Protocolo de exposição única
FIGURA 10 Protocolo de reexposição
FIGURA 11 Teste de preferência por objetos novos (TPON)
FIGURA 12 Dados comportamentais - TPON
FIGURA 13 Análise qualitativa
FIGURA 14 Comparação intergrupo após densitometria
FIGURA 15 Comparação intertempo após densitometria
FIGURA 16 Comparação intergrupo/intertempo após contagem de células
FIGURA 17 Implante de eletrodos no hipocampo
FIGURA 18 Comparação dos mapas de estado bidimensionais de animais VH e
halo
FIGURA 19 Comparação da duração dos estágios de vigília, SWS e REM
FIGURA 20 Modelo para a cascata de eventos moleculares após a exposição
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Grupos utilizados no protocolo de reexposição
TABELA 2 Grupos utilizados no protocolo de exposição única
TABELA 3 Comparação intergrupo após densitometria
TABELA 4 Comparação intertempo de grupos VH após densitometria
TABELA 5 Comparação intertempo de grupos halo após densitometria
TABELA 6 Comparação intergrupo após contagem de células
TABELA 7 Comparação intertempo dos animais VH e halo após contagem de
células
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
AMPA Alfa-amino- 3 hidróxi-5 metil- isoxazol- propionicacid
AMPc Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico
Arc Activity-regulated cytoskeleton-associated protein
ATP Adenosina trifosfato
α-MT Alfa-metil-tirosina
BDNF Brain-derived neurotrofic factor
CA1/CA3 Corno de Amon 1/3
CaM Calmodulina
CaMKII Proteína quinase II dependentes de Ca2+/calmodulina
CREB cAMP response element binding protein
DA Dopamina
DAB Diaminobenzidina
DAT Transportador de dopamina
DOPAC Ácido dihidroxifenilacético
Egr-1 Early growth response protein1
ElkI Fator de transcrição tipo E 1
GD Giro denteado
GI Genes imediatos
Halo Haloperidol
IHQ Imunohistoquímica
IP3 Inositol 1,4,5-trifosfosfato
Kit ABC Avidina-biotina-peroxidase (Vectastain Standard ABC kit)
LTD Long-term depression
LTP Long-term potentiation
MAOb Monoamina oxidase tipo b
MAPK Mitogen-activated protein kinases
MTC Média dos tons de cinza
NCC Número de células contadas
NMDA N-metil-D-aspartato
NV Naïve
REM Rapid-eye movement
SARA Sistema ativador reticular ascendente
SWS Slow-wave sleep
p75NTR Receptores de neurotrofinas p75
PEPS Potencial excitatório pós-sináptico
PFA Paraformaldeído
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
PIP2 Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PLCγ Fosfolipase Cγ
PP1 Proteína-fosfatase1
PP2A Proteína-fosfatase 2A
PRP Proteína relacionada à plasticidade
proBDNF Proteína precursora do BDNF
TB Tampão bloqueador
TFS Tampão fosfato-salina
THDA Transtorno de hiperatividade e déficit de atenção
t-PA Ativador de plasminogênio tecidual
TPON Teste de preferência por objetos novos
TrkB Tirosina quinase tipo B
VH Veículo
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 10 1.1 Haloperidol ................................................................................................................................ 10
1.2 Função da dopamina na consolidação de memórias .................................................................. 11
1.3 Regulação dopaminérgica do ciclo sono-vigília .......................................................................... 12
1.4 Função do sono na consolidação de memórias .......................................................................... 18
1.5 Função do hipocampo no processamento de memórias ............................................................. 20
1.6 Bases moleculares da consolidação da memória ....................................................................... 22
1.6.1 CaMKII ............................................................................................................................ 25
1.6.2 Zif-268 ............................................................................................................................ 27
1.6.3 BDNF .............................................................................................................................. 29
2 OBJETIVO.......................................................................................................... 33 2.1 Objetivo geral ............................................................................................................................ 33
2.2 Objetivos específicos ................................................................................................................. 33
3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 34 3.1 Animais ..................................................................................................................................... 34
3.2 Aparato experimental ................................................................................................................. 34
3.3 Objetos ...................................................................................................................................... 34
3.4 Grupos experimentais ................................................................................................................ 36
3.5 Procedimentos Pré-teste ........................................................................................................... 37
3.6 Teste de preferência por objetos novos (TPON) ........................................................................ 37
3.7 Coleta e análise de dados ......................................................................................................... 39
3.8 Obtenção das amostras e realização de imunohistoquímica (IHQ) ............................................. 40
3.9 Quantificação da marcação e análise estatística ........................................................................ 41
4 RESULTADOS ................................................................................................... 43 4.1 TPON – protocolo de reexposição ............................................................................................. 43
4.2 Análise imunohistoquímica – protocolo de exposição única........................................................ 44
4.2.1 Quantificação por densitometria .................................................................................... 46
4.2.2 Quantificação por contagem de células .......................................................................... 51
5 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 53 5.1 TPON – Análise comportamental ............................................................................................... 53
5.2 IHQ – ANÁLISE DOS NÍVEIS PROTEICOS ............................................................................... 55
5.2.1 Nível de CaMKII-P no grupo 3h ....................................................................................... 55
5.2.2 Níveis deZif-268 no grupo 3h .......................................................................................... 56
5.2.3 Níveis de CaMKII-P nos grupos6h e 12h .......................................................................... 58
5.2.4 Níveis de Zif-268 nos grupos 6h e 12h ............................................................................. 60
5.2.5 Níveis de BDNF em 3, 6 e12h .......................................................................................... 62
6 CONCLUSÕES .................................................................................................. 67
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 68 APÊNDICE ................................................................................................................ 77
10
1 INTRODUÇÃO
1.1 HALOPERIDOL
Esse fármaco pertence à primeira geração de antipsicóticos, também
conhecidos como típicos. Os mais recentes, considerados atípicos, a exemplo da
clozapina e risperidona, diferenciam-se da classe anterior principalmente pela menor
tendência em causar efeitos adversos motores. O haloperidol possui uma estrutura
química derivada das butirofenonas, a qual permite sua ligação a uma variedade de
receptores, tais como: os dopaminérgicos D1 e D2, sendo sua afinidade maior pelo
D2; os adrenérgicos α, os histaminérgicos H1, os colinérgicos muscarínicos e os
serotoninérgicos 5-HT2. Entretanto, sua principal ação antipsicótica ocorre devido ao
antagonismo de receptores D2, presentes na via mesolímbica e mesocortical;
enquanto o bloqueio desses receptores, presentes na via nigroestriatal, é
responsável pelos efeitos adversos motores. É usado no controle dos seguintes
quadros: esquizofrenia; psicose aguda induzida por drogas, tais como: LSD,
psilocibina, anfetamina, ketamina e fenciclidina; comportamento hiperativo e
agressivo; e Doença de Huntington (RANG & DALE, 2011).
No início do tratamento, os pacientes podem apresentar sonolência e
morosidade, com uma resposta diminuída aos estímulos externos. Contudo, eles
podem ser facilmente despertados, responder questões e manter sua função
cognitiva intacta. Ao longo dos dias, os sintomas de alucinação, delírios, ideias
incoerentes e desorganizadas apresentam uma melhora (RANG & DALE, 2011).
Os principais efeitos adversos causados pelo tratamento com haloperidol são
decorrentes de seu antagonismo aos diferentes receptores supracitados. Dentre os
principais, pode-se citar: sedação, hipotensão ortostática, letargia, boca seca,
tremores, aumento de peso corporal, inibição do peristaltismo, indução da secreção
de prolactina e, consequentemente, da lactação; quadros depressivos
acompanhados de tendência suicida após o uso prolongado; e efeitos
extrapiramidais. Com relação a esse último, ele engloba dois tipos de distúrbios
motores: distonia aguda e discinesia tardia, os quais resultam direta e indiretamente
do bloqueio de receptores D2. Distonias agudas consistem de movimentos
involuntários semelhantes aos observados na doença de Parkinson. Eles costumam
ocorrer nas primeiras semanas de tratamento e podem ser revertidos com a sua
suspensão. O quadro de discinesia tardia surge após meses ou anos em 20-40%
11
dos pacientes tratados com antipsicóticos típicos. Trata-se de uma condição
incapacitante e irreversível, na qual ocorrem movimentos involuntários da língua, da
face, de tronco e membros (GOODMAN & GILMAN, 2003).
Apesar dos seus efeitos sedativos, esse fármaco geralmente não é usado no
tratamento de transtornos de ansiedade e insônia, devido aos seus efeitos adversos
neurológicos e autonômicos citados acima. Dentre tais efeitos, podem-se observar,
paradoxalmente, quadros de ansiedade severa e agitação (RANG & DALE, 2011).
Quanto aos parâmetros farmacocinéticos do haloperidol, seu pico plasmático
ocorre entre 6-8 horas, após uma dose oral, e em 20 minutos, após administração
intramuscular. A biodisponibilidade por via oral é de 60%-70% e o tempo de meia-
vida média é 24 horas (de 12-38 horas), após administração oral, e de 21 horas (de
13 a 36 horas), após administração intramuscular. Esse fármaco apresenta uma taxa
de 92% de ligação às proteínas plasmáticas, podendo ser excretado nas fezes
(60%) e na urina (40%). Com relação a sua metabolização, ela é realizada pelo
sistema enzimático do citocromo P450, particularmente pelo CYP 3A4 ou CYP 2D6.
Os metabólitos não apresentam atividade neuroléptica (GOODMAN & GILMAN,
2003).
1.2 FUNÇÃO DA DOPAMINA NA CONSOLIDAÇÃO DE MEMÓRIAS
As vias dopaminérgicas já foram reconhecidas por desempenhar uma função
crítica na cognição e emoção. Nas últimas décadas, houve um grande aumento no
número de evidências envolvendo esse neurotransmissor com processos de
plasticidade sináptica e consolidação de memória. A clonagem de cinco subtipos de
receptores dopaminérgicos e o desenvolvimento de agonistas e antagonistas
específicos para cada um deles têm contribuído para caracterização da ação da
dopamina na plasticidade sináptica. Concomitantemente, paradigmas
comportamentais sofisticados auxiliaram na elucidação da função dopaminérgica na
cognição (JAY, 2003).
Diversos trabalhos correlacionam o bloqueio da função mnemônica à
atividade em receptores dopaminérgicos específicos. Wilkerson e Levin (1999)
avaliaram os efeitos da administração no hipocampo ventral de agonistas e
antagonistas de receptores D1 e D2 em uma tarefa de memória espacial. Nenhum
efeito significativo foi observado após a manipulação farmacológica de receptores
D1. Por outro lado, o aumento da atividade dopaminérgica de receptores D2
12
hipocampais, mediado pelo agonista quimpirole, pareceu melhorar o desempenho
desses animais, ao contrário do que foi observado após o uso do antagonista
D2raclopride. Esses resultados sugerem que sistemas dopaminérgicos hipocampais
interagem com a memória, contudo, a função mnemônica desse neurotransmissor
identificada na porção ventral ainda permanece inexplorada no hipocampo dorsal.
Ainda através de manipulação farmacológica, diversos trabalhos investigaram
o envolvimento de receptores dopaminérgicos na indução de LTP na região dorsal
de CA1. Frey et al (1990,1991), através da aplicação de antagonistas D1 e D2 em
uma mesma preparação in vitro, evidenciou que além da atuação do glutamato em
receptores NMDA e AMPA, sinais mediados por receptores dopaminérgicos foram
adicionalmente necessários na produção de uma LTP duradoura.
1.3 REGULAÇÃO DOPAMINÉRGICA DO CICLO SONO-VIGÍLIA
Os seres humanos passam, aproximadamente, um terço de suas vidas
dormindo e, apesar de décadas de pesquisa científica, muitos aspectos
concernentes ao sono ainda permanecem um enigma. No que concerne à visão
científica, muitos especialistas acreditavam ate bem recentemente que o sono seria
um processo passivo que ocorria quando o encéfalo fosse privado de aferências
sensoriais. No entanto, o bloqueio dessas aferências em um animal não impede que
o mesmo continue tendo ciclos de vigília e sono. A partir daí, numerosas hipóteses
foram lançadas para explicar as funções do sono, incluindo regulação imune,
conservação de energia, detoxificação cerebral, reparo tecidual e evasão de
predadores (MAQUET, 2001).
Mais recentemente, trabalhos em várias áreas da ciência estão sendo
publicados mostrando a importância do sono em diversos processos e fenômenos
que têm relação com funções integradas do sistema nervoso central, dentre os quais
podemos citar: condicionamento do medo e atenção, aprendizado, formação e
extinção da memória (KALIA, 2006; MCCARLEY, 2007; RIBEIRO et al., 2003, 2004,
2004.)
No ser humano, o sono possui vários estágios, podendo ser dividido em sono
de movimento rápido dos olhos (REM - rapid-eye movement), o qual também é
chamado de sono paradoxal devido aos vários aspectos semelhantes à vigília; e
sono de ondas lentas (SWS – slow-waves leep). Em humanos, esse último é
geralmente subdividido em 4 estágios (1-4), que correspondem, nessa ordem, ao
13
aumento na profundidade do sono e maior dificuldade de despertar. Em adultos
saudáveis, ocorrem durante a noite 4-6 ciclos alternados de sono SWS e REM, cada
um com, aproximadamente, 90 minutos de duração. O sono SWS é caracterizado
por oscilações eletroencefalográficas de elevada amplitude e baixa frequência (<4
hz), as quais expressam uma sincronia entre o tálamo e o córtex cerebral. Por outro
lado, o sono REM caracteriza-se por oscilações dessincronizadas de baixa
amplitude. Nessa fase, estruturas corticais e subcorticais apresentam oscilações na
frequência gama (30-55 hz), a qual é similar àquela encontrada durante a vigília, e o
hipocampo apresenta potencial de campo local na faixa de 4-7 hz (ritmo teta).
Adicionalmente, há uma redução significativa no tônus muscular, quando comparada
a vigília ou ao sono SWS (PAYNE et al., 2008; DZIRASA et al., 2006; WALKER;
STICKGOLD, 2004.)
A organização cíclica do sono é variável entre as espécies e a duração de
cada ciclo aumenta com o tamanho do encéfalo de cada uma delas. Enquanto nos
humanos e primatas adultos a distribuição circadiana do sono tende a ser
monofásica, em espécies como ratos, camundongos e gatos ela ocorre de forma
polifásica. Nesses animais, os ciclos de SWS-REM são muito mais curtos. O sono
REM apresenta algumas características que permitem sua distinção de SWS:
presença de ritmo teta hipocampal, movimentos rítmicos das vibrissas e respiração
irregular (VANDERWOLF, 1969; WINSON, 1974; RIBEIRO et al., 1999). Apesar da
variabilidade no ciclo de sono, as principais modulações homeostáticas, circadianas
e neuroquímicas do sono permanecem essencialmente similares entre as diferentes
espécies (REVEL et al., 2009).
A passagem através desses diferentes estágios funcionais do encéfalo é
acompanhada por alterações neuroquímicas em diversas regiões encefálicas.
Atualmente, o sistema ativador reticular ascendente (SARA), do qual fazem parte o
sistema difuso modulatório noradrenérgico e o sistema modulatório serotonérgico
(Figura 1), é relatado como o principal agente modulador da entrada e saída do sono
(KALIA, 2006; MCCARLEY, 2007; BEAR, CONNORS, PARADISO, 2008). Durante a
vigília, é observada uma maior atividade dos neurônios do locus ceruleus (sistema
noradrenérgico) e dos neurônios dos núcleos da rafe (sistema serotonérgico), os
quais inervam praticamente todo o sistema nervoso central. Essa atividade é
bastante reduzida durante as fases do sono (KALIA, 2006). Além desses
neurotransmissores, a acetilcolina também desempenha uma função marcante
14
nesse processo modulador. No sono SWS, neurônios colinérgicos subcorticais no
tronco encefálico e prosencéfalo se tornam nitidamente menos ativos, enquanto no
sono REM são igualmente ou ainda mais ativos que durante a vigília. Essa
variabilidade nos níveis de diferentes neurotransmissores gera padrões de atividade
muscular e cerebral característicos de cada fase do sono, os quais são enviados
através de projeções desses grupos de neurônios para estruturas corticais e
subcorticais (WALKER; STICKGOLD, 2004).
A influência dos neurotransmissores supracitados está bem estabelecida na
literatura. Apesar disso, no que se refere ao sistema dopaminérgico, sua influência
na modulação do ciclo sono/vigília ainda não foi bem elucidada e poucas foram as
publicações acerca do tema (DATTA; MACLEAN, 2007; KALIA, 2006; MCCARLEY,
2007; RIBEIRO; NICOLELIS, 2004; BEAR; CONNORS; PARADISO, 2008).
A dopamina é um neurotransmissor derivado da L-dopa, que por sua vez é
formada a partir do aminoácido tirosina, pela ação da enzima tirosinahidroxilase.
Esse neurotransmissor é precursor de outros como a noradrenalina e a adrenalina.
Devido à sua similaridade química com a presença de um grupo químico catecol e
outro grupo etil-amina, estas substâncias constituem as catecolaminas.
A dopamina é sintetizada e liberada principalmente em dois núcleos de
neurônios do tronco cerebral: 1) a substância negra, que possui projeções para o
estriado e forma a via nigro-estriatal, ligada a função de planejamento e movimentos
motores finos; 2) a área tegmentar ventral, que projeta seus axônios para o sistema
límbico (via mesolímbica) e para o córtex frontal (via mesocortical), sendo mais
relacionada a processos emocionais e de tomada de decisão (Figura 1). Os
principais receptores envolvidos na via mesolímbica e mesocortical são os D1 e D5,
componentes da subfamília D1. Os receptores da subfamília D2, que incluem os
receptores D2, D3 e D4, são os mais frequentes na via nigro-estriatal (CAVE; BAKER,
2009; MONTI, J. M.; MONTI, D., 2007).
15
Figura 1: Via dopaminérgica no SNC. Disponível em: http://www.cellbiol.net/ste/alpobesity3.php
Acesso em: 12 de novembro de 2010
No que diz respeito às vias dopaminérgicas, pode-se distinguir dois padrões
de liberação da dopamina: um primeiro padrão tônico, no qual as descargas
neuronais ocorrem de forma irregular, lenta e difusa espacialmente; e um segundo
padrão fásico, onde as descargas ocorrem em bursts de quantidade maiores de
dopamina. As evidências disponíveis tendem a indicar que, durante a vigília, ocorre
um aumento do segundo padrão, com maior liberação de dopamina na área
tegmentar ventral, por exemplo (MONTI, J. M.; MONTI, D., 2007). Esse aumento do
neurotransmissor também é observado no sono REM (DZIRASA et al., 2006). Uma
vez liberada na fenda sináptica, a dopamina irá agir em receptores acoplados a
proteína G, chamados de receptores metabotrópicos, localizados em neurônio pós
ou pré-sinápticos (auto-receptores D2 em nível de dendritos ou corpos celulares). Ela
pode ainda ser recapturada pela célula pré-sináptica por transportadores,
principalmente o DAT, e seguir dois caminhos: ser degradada pela monoamina
oxidase tipo b (MAOb), enzima catabólica que converte a dopamina em ácido
dihidroxifenilacético (DOPAC); ou ser novamente estocada em vesículas sinápticas
para serem reutilizadas (Figura 2) (MONTI, J. M.; MONTI, D., 2007, BEAR;
CONNORS; PARADISO, 2008).
16
Figura 2: Sinapse dopaminérgica.
Disponível em: http://www.nibb.ac.jp/en/sections/sasaoka.html Acesso em: 12 de novembro de 2010
A dopamina está implicada em vários processos comportamentais, como a
sensação de recompensa, a avaliação de riscos, a manutenção da atenção, o
acesso a memórias, a regulação fina de movimentos e o controle do ciclo sono-
vigília, visto que o sistema dopaminérgico também faz parte dos sistemas
modulatórios de projeção difusa. Dessa forma, através da substância negra e da
área tegmentar ventral, neurônios dopaminérgicos fazem conexão com a região
dorsal dos núcleos da rafe, com o locus ceruleus, com o hipotálamo e tálamo,
regiões que são envolvidas com o ciclo de sono e vigília (BEAR; CONNORS;
PARADISO, 2008). Estudos de manipulação farmacológica demonstraram que a
aplicação de agonista D1 levou ao aumento da vigília e diminuição do estado de
sono (REM e SWS), enquanto agonistas D2 geraram uma resposta bifásica: em
baixas concentrações, provocaram aumento de sono REM e SWS, enquanto doses
elevadas resultaram em resposta contrária (MONTI, J. M.; MONTI, D., 2007).
Alterações na via de transmissão dopaminérgica têm se mostrado envolvidas
em alguns transtornos neurológicos e psiquiátricos, tais como: esquizofrenia,
Doença de Parkinson e transtorno de hiperatividade e déficit de atenção (THDA),
sendo observadas hiperdopaminergia na via mesolímbica, no primeiro caso, e
hipodopaminergia nos demais. É interessante notar que indivíduos que apresentam
alguns desses quadros patológicos sofrem de distúrbios do sono, dentre os quais
estão: sonolência diurna excessiva, redução na latência do sono REM e alteração na
17
arquitetura do sono. Esses dados sugerem que a dopamina exerce realmente uma
função regulatória no ciclo sono-vigília (DZIRASA et al., 2006).
O trabalho de Dzirasa et al (2006) avançou mais alguns passos em direção à
corroboração dessa hipótese, pois utilizou camundongos transgênicos, que não
expressam o gene que codifica o transportador de dopamina (DAT-nocautes), para
investigar o efeito de variações agudas da disponibilidade desse neurotransmissor
na fenda sináptica, como de fato ocorre mais lentamente nas doenças
neuropsiquiátricas citadas anteriormente. Esses animais são considerados
hiperdopaminérgicos, pois na ausência do transportador, a dopamina não sofre
recaptação e permanece por um período de cerca de 5 vezes mais na fenda
sináptica do que em animais selvagens (DZIRASA et al., 2006, 2009).
Complementarmente, tais animais também constituem um excelente modelo
farmacológico para a depleção aguda de dopamina quando tratados com alfa-metil-
tirosina (α-MT - inibidora da síntese de dopamina), uma vez que todo o
neurotransmissor de suas sinapses provém de síntese e não de recaptação.
Esse grupo realizou cirurgias de implante de multieletrodos para verificação
dos clusters de sono SWS, sono REM e vigília sob a ação de drogas que modulam a
sinapse dopaminérgica. Após a construção de um mapa bidimensional de estados
do ciclo sono-vigília, foi observado que animais DAT-nocautes expostos a ambientes
novos exibiram um padrão eletrofisiológico hipocampal do sono REM semelhante
àquele observado durante a vigília, ao passo que os animais ditos selvagens
apresentaram padrões espectrais nitidamente separados. Isso sugere que padrões
espectrais de sono REM adentram a fase de vigília quando existe um estado
hiperdopaminérgico.
18
Figura 3: Redução do sono REM após tratamento com haloperidol. Observa-se que a administração de haloperidol (0,3mg/Kg) promove a diminuição na sobreposição dos clusters de sono REM e vigília. (The JournalofNeuroscience, Dzirazaet al (2006)).
O tratamento com α-MT acarretou uma depleção aguda de dopamina,
provocando uma redução nos clusters de sono REM em animais do tipo selvagem.
Nos DAT-nocautes, houve também uma modificação do padrão de divisão dos
clusters, levando a formação de apenas um fora da área dos três anteriores. O
tratamento com agonistas dopaminérgicos D2 e não D1 foi capaz de restaurar o sono
REM nesses camundongos. Por outro lado, a administração de haloperidol, um
antagonista de receptores D2 não seletivo (SPIELEWOY et al., 2000), levou a uma
redução na sobreposição dos clusters de sono REM e vigília, chegando a níveis
semelhantes aos de camundongos selvagens (Figura 3). Esses resultados parecem
indicar que a dopamina, e mais especificamente o receptor dopaminérgico D2,
possui um papel importante na manutenção desses padrões eletrofisiológicos do
sono e, consequentemente, em todos os processos que estão envolvidos com o
mesmo, como a formação e extinção de memórias, que veremos a seguir.
1.4 FUNÇÃO DO SONO NA CONSOLIDAÇÃO DE MEMÓRIAS
A partir de 1970, a ciência começou a reconhecer a função do sono nas
diferentes etapas de consolidação da memória, fundamentando-se em algumas
descobertas principais, tais como: o efeito deletério da privação de sono sobre o
aprendizado (BENNETT et al., 1973; FISHBEIN, 1971; FISHBEIN et al., 1974;
19
LANDFIELD et al., 1972; MEDNICK et al., 2003; PEARLMAN; BECKER, 1974;
SMITH et al., 1974; SMITH; BUTLER, 1982; STICKGOLD et al., 2000; WINSON,
1978); a melhora na retenção de memórias em ratos quando o sono REM é
aumentado; o aumento na quantidade de sono após a aquisição de memórias; e a
presença de ritmos teta no sono REM, os quais consistem em oscilações
hipocampais relacionadas à aprendizagem típica de vigília exploratória (BENNETT
et al., 1973; LANDFIELD et al., 1972; WINSON, 1978 apud RIBEIRO; NICOLELIS,
2004; ARNOLDS et al., 1980; GREEN; ARDUINI, 1954; KAHANA et al., 1999).
Uma teoria recente proposta pelo grupo de Ribeiro et al (2004) argumenta
que as memórias são formadas e consolidadas pela contribuição combinada dos
principais estados fisiológicos do encéfalo (vigília - sono de ondas lentas - sono
REM), que atuam de forma cíclica e complementar de modo a reforçar as sinapses
no sentido hipocampo-cortical. Isso possibilita uma propagação progressiva e
ramificada das transformações sinápticas ao longo desse percurso, permitindo o
estoque gradativo de memórias em diversas áreas corticais associadas ao contexto
sensorial, motor e emocional da sua aquisição.
Dois grupos de pesquisadores, na busca por mecanismos que servissem de
base para a função mnemônica do sono, chegaram às seguintes descobertas: 1) a
aquisição de memórias é danificada pelo bloqueio de síntese proteica durante o
sono (GUTWEIN et al., 1980), e 2) nessa fase, os padrões de atividade neuronal
relacionados às experiências da vigília reaparecem no hipocampo (PAVLIDES;
WINSON, 1989). Seguindo essa linha de pesquisa, o grupo de Ribeiro et al (2004)
propôs que, em atuação complementar, e satisfazendo os dois postulados do
neurocientista Donald Hebb, a consolidação de memórias durante o sono envolveria:
A reativação neuronal pós-estímulo, conhecida como reverberação, a qual
depende principalmente de episódios de sono de ondas lentas (SWS);
Alterações estruturais (plasticidade neuronal), que parecem ocorrer
exclusivamente durante o sono REM.
Objetivando avaliar a fixação de memórias, esse grupo utilizou o chamado
“teste de preferência por objetos novos” (novelty preference test). Esse teste se
baseia no comportamento natural de exploração dos roedores, quando expostos a
um novo ambiente, e serve como base de um modelo de aprendizado conhecido
como reconhecimento de novos objetos. Este modelo, bastante útil na avaliação da
memória de reconhecimento, é vantajoso em relação a outros realizados, pois não
20
envolve reforços repetitivos, como alimentação ou choques elétricos e é comparável
a testes de memória realizados em seres humanos (ENNACEUR et al., 1989). O
animal exposto aos objetos desenvolve a habilidade de discriminar os que são novos
daqueles que são familiares. Essa tarefa envolve o hipocampo e é dependente de
síntese proteica (ROSSATO et al., 2007).
A exploração de novos ambientes acarreta o aumento de atividades motoras
e sensoriais, sendo isso, provavelmente, responsável pela expressão de Zif-268na
fase REM, especialmente no córtex frontal. No teste de preferência por objetos
novos, o animal foi submetido a duas exposições: um primeiro contato com quatro
objetos novos, os quais foram explorados pelo animal por certo tempo; e um
segundo contato, horas ou dias depois, no qual foram reapresentados dois dos
mesmos objetos e também dois objetos novos. A razão entre o tempo de exploração
dos objetos não-familiares e familiares (R não-familiar/familiar) foi usada como
parâmetro de comparação da capacidade de consolidação de memórias entre
diferentes grupos de animais.
Dois resultados principais foram obtidos a partir desse estudo. Inicialmente,
foi demonstrado que o fenômeno de reverberação neural preserva relações
temporais da atividade neuronal da vigília (DAVE; MARGOLIASH, 2000),
correlaciona-se com o conteúdo aprendido em tarefas cognitivas (DESTREBECQZ
et al., 2003), pode predizer quantitativamente as taxas de aprendizado antes do
sono (DATTA, 2000), e é mais robusto durante o sono SWS que durante a vigília ou
o sono REM. Além disso, foi observado que, diferencialmente no sono REM, há uma
indução da expressão do gene imediato Zif-268.
1.5 FUNÇÃO DO HIPOCAMPO NO PROCESSAMENTO DE MEMÓRIAS
A formação hipocampal abrange o corno de Amon, o qual se subdivide em
CA1, CA2 e CA3; o giro denteado (GD), o subiculum, pré-subiculum, parasubiculum
e o córtex entorrinal. Existem controvérsias quanto àposição da região CA2separada
das demais, visto que compreende uma área estreita, interposta entre CA1 e CA3, e
que apresenta características semelhantes às duas outras regiões, sendo
considerada por alguns autores como uma região de transição. O fluxo de
informação percorre a formação hipocampal no seguinte sentido: aferências
sensoriais chegam ao córtex entorrinal, o qual emite projeções para o GD. Este, por
sua vez, enviará a informação para CA3, passando por CA2 e finalmente
21
alcançando CA1. Essa ultima região projeta novamente para o córtex entorrinal e
desempenha uma função de saída de informações já processadas, enviando
projeções para o córtex pré-frontal, amígdala, hipotálamo, dente outros (BEAR;
CONNORS; PARADISO, 2008).
Diversas funções já foram atribuídas ao hipocampo, dentre as quais se
destacam: detecção de novidades; processamento de memória episódica de curto e
médio, mas não de longo prazo; separação, associação e retomada de padrões
associados a informações espaciais e temporais. Estudos relacionando lesão
hipocampal à consolidação de memórias em diferentes paradigmas
comportamentais mostraram que o hipocampo desempenha uma função essencial
na retomada de memórias relacionadas ao lugar e contexto do contato com um
objeto, além de fornecer uma grande contribuição no reconhecimento dos mesmos.
O hipocampo também está envolvido na localização espacial, o que explica a
indução de Zif-268 nesta região (RIBEIRO et al., 1999).
As sub-regiões hipocampais (GD, CA3 e CA1), apesar de atuarem de modo
cooperante em muitos casos, desempenham funções distintas no processamento de
diferentes tipos de memórias. O giro denteado é responsável pela criação de uma
representação espacial métrica a partir das informações sensoriais obtidas, atuando
no processo de separação de padrões espaciais em conjunto com CA3. Essa sub-
região, por sua vez, desempenha funções como associação de padrões espaciais,
detecção de novidades e processamento de memória de curto prazo. Por último, a
sub-região de CA1 participa da associação de padrões temporais, assim como do
processamento de memória de médio prazo, sendo uma sub-região chave para a
ocorrência de processos de consolidação celular. Achados a favor dessa teoria
mostram que animais submetidos a alguns paradigmas comportamentais exibem
alteração na expressão de GI relacionados à indução de LTP somente na região de
CA1. Ratos lesionados em CA1 dorsal, submetidos a um paradigma de medo
condicionado, apresentaram déficit na retenção de condicionamento contextual
quando testados 24 horas após a aquisição (KESNER; GILBERT, 2004). Usando o
mesmo paradigma, Hall et al. (2001) demonstrou uma relação entre esse tipo de
memória e a expressão de GI relacionados à LTP (BDNF e Zif-268) em CA1, 30
minutos após a exposição à situação de medo condicionado.
22
1.6 BASES MOLECULARES DA CONSOLIDAÇÃO DA MEMÓRIA
Memória e aprendizado são os mais importantes mecanismos de alteração do
comportamento em função do ambiente. O aprendizado consiste no processo
através do qual se adquire conhecimento a respeito do mundo, enquanto a memória
é o processo que permite a codificação, armazenamento e posterior retomada desse
conhecimento (KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000).
Durante a fase de aquisição e codificação, processos de sinalizações elétricas
e bioquímicas entre neurônios são capazes de converter as informações
provenientes do ambiente em atividades sinápticas, as quais precisam ser
estabilizadas ou consolidadas para se tornarem uma memória duradoura. Dentre
outros neurotransmissores, o glutamato desempenha um importante papel nessa
primeira fase de aquisição, visto que o influxo de cálcio através de receptores
glutamatérgicos é capaz de induzir fosforilações de proteínas pré-existentes nas
sinapses ativas, resultando em alterações de curto-prazo no fortalecimento dessas
sinapses. Tais alterações aumentam a probabilidade de disparo do neurônio pós-
sináptico e permitem que as informações recém-adquiridas sejam transmitidas em
curto prazo. Elas podem ser convertidas em uma forma mais duradoura, através do
processo de consolidação, ou esquecidas, à medida que as conexões sinápticas
enfraquecem (HERNANDEZ; ABEL, 2011).
Assim, o termo consolidação de memórias se refere ao processo de
conversão de uma informação lábil recentemente armazenada em uma forma mais
estável. Tal processo envolve três fases distintas: consolidação sináptica, a qual
ocorre logo após a fase de aquisição; consolidação sistêmica, que ocorre ao longo
de semanas ou anos e possibilita uma reorganização da memória em diferentes
regiões cerebrais; e, por último, a reconsolidação, a qual estabiliza memórias
retomadas recentemente (HERNANDEZ; ABEL, 2011). No presente trabalho,
evidenciaremos o processo de consolidação sináptica, o qual envolve a expressão
de genes e a síntese de novas proteínas, levando a alterações estruturais
responsáveis por esse armazenamento mais duradouro (KANDEL; SCHWARTZ;
JESSEL, 2000).
A consolidação de memórias envolve processos de plasticidade sináptica, tais
como: potenciação de longa duração (LTP, do inglês long-term potentiation), que
consiste na otimização do processo de evocação de um potencial excitatório pós-
sináptico (PEPS); e depressão de longa duração (LTD, do inglês long-term
23
depression), a qual atua de modo inverso para dificultar a geração desse potencial.
O equilíbrio entre potenciação e depressão tem sido descrito como um mecanismo
molecular para a formação de memórias. Além disso, estudos envolvendo LTP têm
contribuído para o entendimento da biologia celular e molecular do aprendizado e
memória, assim como das funções desempenhadas pelo sono durante esse
processo (KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HERNANDEZ; ABEL, 2011).
A ocorrência desses processos no terminal pós-sináptico está associada a
uma intrincada cascata de eventos bioquímicos, os quais envolvem uma série de
fatores transcricionais e proteínas quinases, dentre as quais se destacam: proteína
quinase II dependentes de Ca2+/calmodulina (CaMKII), a proteína quinase C (PKC) e
a proteína quinase A (PKA). Esses eventos acarretam o aumento da eficiência de
transmissão sináptica em uma determinada via. A LTP é geralmente dividida em
duas fases: recente, que dura aproximadamente 1-2 horas e requer a modificação e
transporte de proteínas já existentes nas sinapses; e tardia, a qual se mantém além
de 8 horas ou até mesmo dias, sendo dependente de fenômenos de transcrição
gênica, particularmente mediada pelo fator transcricional CREB (do inglês, cAMP
response element binding protein) (WAYMAN et al., 2008; BEKINSCHTEIN et al.,
2007). Dessa forma, o que difere a fase precoce da tardia é a necessidade da
ocorrência de síntese proteica de novo, associada a alterações estruturais nas
sinapses, observada apenas na fase tardia. A manutenção da LTP tardia requer
ainda a ocorrência de uma transcrição gênica dependente de atividade, a qual
ocorre no núcleo localizado no corpo celular dos neurônios (LU et al., 2007).
As formas precoce e tardia, relativas ao processo de LTP, se correlacionam
às duas formas descritas para o armazenamento de informações recém-adquiridas:
memórias de curto e de longo prazo. Assim como a LTP precoce, a memória de
curto prazo dura entre minutos a alguma horas e não requer a ocorrência de
processos de transcrição e tradução. Por outro lado, a memória de longo prazo tem
duração de algumas horas a dias, semanas ou mais. Além disso, assim como a LTP
tardia, seu armazenamento depende da síntese de RNAm e proteína (DUDAI et al.,
2004 apud LU et al., 2007). Contudo, a ocorrência dos mecanismos moleculares,
relativos ao processo de LTP, nas diferentes formas de memória ainda não foi
inteiramente elucidada. Ainda que essas memórias dependam da mesma estrutura
anatômica, como é o caso do hipocampo (LU et al., 2007).
24
A primeira região onde se identificou o fenômeno de LTP foi o hipocampo
(BLISS; LOMO, 1973). Para que isso ocorra, é necessário que estímulos de alta
frequência, como o tetânico, ativem simultaneamente o neurônio pré e pós-sináptico,
envolvidos em uma via de transmissão. Esse tipo de estímulo é imprescindível para
a ativação de receptores glutamatérgicos do subtipo NMDA (N-metil-D-aspartato) no
neurônio pós-sináptico (MALENKA, 1994), pois a despolarização da membrana é
responsável pela remoção do íon magnésio, que, constitutivamente, bloqueia seu
canal, mesmo com a ligação do glutamato em seu sítio receptor. Dessa forma,
durante uma estimulação de alta frequência, tanto receptores AMPA (do inglês, alfa-
amino- 3 hidróxi-5 metil- isoxazol- propionicacid) quanto NMDA estarão ativados e
contribuindo para a resposta pós-sináptica, enquanto que, em estímulos de baixa
frequência, somente se ativam os receptores AMPA.
A ativação dos receptores NMDA promove a entrada de grandes quantidades
de Ca2+ no interior da célula. Outras fontes também são responsáveis pelo aumento
intracelular desse íon, como os estoques intracelulares e os canais de Ca2+
operados por voltagem. A calmodulina é uma proteína ativada e modulada por íons
Ca2+. O complexo cálcio-calmodulina (Ca2+/CaM) é capaz de regular as funções de
numerosas proteínas alvo, dentre as quais podemos citar a família de
serina/treonina proteína quinases conhecidas como CaM-quinases (CaMKs). Esse
aumento nos níveis de Ca2+ intracelular ativa CaM, formando o complexo Ca2+/CaM,
o qual se liga a CaMKII. Essa ligação induz a autofosforilação da quinase (CaMKII-
P), levando a ativação da mesma. A CaMKII-P modifica a cinética de receptores
AMPA, podendo levar ao aumento da sua condutância ao Na+ ou sua afinidade pelo
L-glutamato. Isso acarreta um aumento na resposta pós-sináptica a estímulos
subsequentes, e consequente LTP (MALENKA, 1994). A fosforilação de receptores
AMPA pela CaMKII-P resulta na fosforilação e ativação de MAPK (do inglês,
mitogen-activated protein kinases), CaMKIV e PKC, cujos alvos são os fatores
transcricionais CREB e ElkI. Ambos estão envolvidos na regulação da expressão de
genes imediatos, como Zif-268e c-Fos (DAVIS et al., 2000; MIYAMOTO, 2006;
SGAMBATO et al., 1998), os quais são responsáveis pela regulação de vários
outros genes relacionados à transcrição de novas proteínas necessárias a
plasticidade neural. (LEMAIRE et al., 1994). O gene BDNF (do inglês, brain-derived
neurotrofic factor) também é induzido pela ativação dessa cascata, sendo importante
no processo de plasticidade sináptica (LU et al., 2007) (figura 4).
25
Figura 4: Cascata bioquímica de plasticidade sináptica. Eventos associados às fases precoce e tardia da LTP. Nota-se o envolvimento inicial da CaMKII-P, bem como a participação tardia dos genes regulatórios e efetores, Zif-268 e BDNF respectivamente (KANDEL et al., 2000).
No presente estudo, investigaremos o envolvimento de três dessas moléculas
na cascata de plasticidade sináptica descrita acima: CaMKII, Zif-268 e BDNF. Por
essa razão, detalharemos alguns dados da literatura, concernentes especificamente
às moléculas supracitadas.
1.6.1 CaMKII
É uma proteína pertencente à família de serina/treonina proteína quinases,
conhecidas como CaM-quinases (CaMKs) e, em mamíferos, apresenta-se em
múltiplas isoformas codificadas por diferentes genes, tais como α, β, γ e δ
(LUCCHESI et al., 2011). O gene α-CaMKII foi um dos primeiros a serem implicados
nos mecanismos de LTP, memória e aprendizado. Sua deleção prejudica a
formação de LTP em CA1 e o aprendizado espacial em camundongos mutantes
(SILVA et al., 1992 apud WAYMAN et al., 2008). A CaMKII, quinase codificada por
esse gene, estruturalmente é composta por um domínio catalítico N-terminal e um
domínio regulatório auto inibitório. Ainda, ela apresenta um domínio de associação
com quatro regiões variáveis, o qual permite a formação de uma holoenzima
composta por 12 subunidades organizadas em dois anéis hexaméricos. Seu domínio
regulatório contém um sítio para a ligação de Ca2+/CaM, um sítio de ligação de um
26
pseudo substrato capaz de inibir a subunidade catalítica e, por último, alguns sítios
de autofosforilação. Especificamente na α-CaMKII, o sítio de autofosforilação no
resíduo treonina 286 (T286) pertence ao domínio inibitório, enquanto os sítios nos
resíduos T305 e T306 localizam-se no domínio de ligação a Ca2+/CaM (COLBRAN,
2004 apud LUCCHESI et al., 2011) .
Quando o complexo Ca2+/CaM se liga a região regulatória da CaMKII, ocorre
uma alteração conformacional capaz de expor o seu domínio catalítico, o qual por
sua vez passa a fosforilar seus substratos (RELLOS et al., 2010). Devido a sua
estrutura complexa, dois mecanismos distintos de fosforilação são realizados por
essa quinase. O primeiro deles ocorre após a ligação do substrato a região
catalítica, na qual há a hidrólise de ATP. Já o segundo, depende da autofosforilação
em T286 dentro da própria holoenzima, o que torna a atividade de CaMKII
independente da ligação ao complexo Ca2+/CaM. Após a dissociação desse
complexo, observa-se uma atividade autônoma da quinase e a ocorrência de uma
segunda onda de autofosforilação em T305 e T306, a qual é considerada inibitória
visto que previne a religação de Ca2+/CaM (MUKHERJI et al., 1994 apud LUCCHESI
et al., 2011). Apesar disso, a atividade autônoma de CaMKII continua ocorrendo de
forma sustentada, possibilitando a ativação de uma variedade de proteínas, como foi
descrito na cascata molecular acima.
Dentre as diferentes funções atribuídas a CaMKII, destacaremos sua
participação na cascata de sinalização associada ao desenvolvimento neuronal,
plasticidade e comportamento (WAYMAN et al., 2008), visto que essa quinase se
mostra uma candidata ideal para a indução de LTP, considerando suas propriedades
estruturais e bioquímicas acima descritas. Assim, um ponto de mutação que previne
essa autofosforilação impede tanto a formação de LTP quanto do aprendizado
espacial, indicando a importância dessa atividade autônoma para a plasticidade
sináptica (GIESE et al., 1998 apud WAYMAN et al., 2008). Além disso, a inibição
farmacológica da atividade ou autofosforilação de CaMKII também bloqueia a
indução de LTP (MALINOW et al., 1989 apud WAYMAN et al., 2008). Além da sua
função essencial na indução de LTP, a CaMKII também atua no processo de
marcações sinápticas explicado anteriormente, o qual independe de síntese proteica
e dura menos de 2 horas. A atividade sináptica, gerada após um estímulo neuronal,
promove a translocação dessa quinase para os terminais pós-sinápticos de
neurônios glutamatérgicos, originando um tipo de marcação nas sinapses que foram
27
previamente ativadas e que deverão se submeter a modificações adicionais para
ocasionar plasticidade sináptica. Assim, as proteínas relacionadas à plasticidade se
difundem para essas sinapses marcadas, onde irão atuar no fortalecimento a longo-
prazo das mesmas (REDONDO et al., 2010 apud LUCCHESI et al., 2011).
Devido ao fato de a CaMKII exibir uma atividade autônoma cálcio-
independente, faz-se necessário um mecanismo de feedback negativo para regular
sua atividade. Isso parece ser alcançado com a participação das proteínas
fosfatases PP1 e PP2A, capazes de remover o grupamento fosfato presente na
T286 da α-CaMKII autofosforilada (COLBRAN et al., 2004). Além disso, um
mecanismo regulatório mais rápido pode ser fornecido por duas proteínas inibitórias
endógenas, CaMKIINα e CaMKIINβ, que se ligam a região catalítica da CaMKII e
bloqueiam tanto sua atividade autônoma quanto aquela dependente de Ca2+,
impedindo estericamente o acesso dos substratos ao sítio catalítico (VEST et al.,
2007).
1.6.2 Zif-268
Os genes imediatos (GI) são aqueles ativados de modo rápido e transitório
frente a uma grande variedade de estímulos, tais como: estimulação de alta
frequência que induz LTP; fatores de diferenciação, liberação de
neurotransmissores, peptídeos e fatores de crescimento; ou ainda por diferentes
paradigmas comportamentais. A exposição a novos ambientes, por exemplo, é
capaz de induzir fortemente a expressão hipocampal de diversos genes imediatos,
dentre os quais podemos citar Zif-268 (DAVIS; BOZON; LAROCHE, 2003 apud
KATCHE et al., 2012).
Tais genes podem ser funcionalmente divididos em duas classes: genes
regulatórios, que controlam a transcrição de outros genes, e genes efetores, que
codificam proteínas que possuem um papel funcional mais direto nas sinapses,
como Arc (do inglês, activity-regulated cytoskeleton-associated protein) e Homer
(LANAHAN; WORLEY, 1998 apud KUBIK et al., 2007). Um exemplo de gene
regulatório é o Egr-1 (do inglês, early growth response protein1), também conhecido
por Zif-268, Krox24, NGFI-A, TZS8 e Zenk. Na região promotora desse gene
localizam-se diferentes sequências regulatórias: dois sítios CRE; seis sítios SRE;
sequências CCAATT; um sítio GSG (GCGGGGGCG), conhecido como elemento de
resposta ao Egr, dentre outros. Diferentes moléculas podem ativar a transcrição de
28
Zif-268 ao se ligar a essas sequências, tais como: fatores transcricionais CREB e
Elk-1, que se ligam às regiões CRE e SRE, respectivamente; a próprias proteínas da
família Egr, que se ligam aos sítios GSG, provavelmente atuando de maneira auto
regulatória (TSAI-MORRIS et al., 1988; HERDEGEN et al., 1998 apud DAVIS et al.,
2003; CAO et al., 1993 apud DAVIS et al., 2003).
A expressão do gene Zif-268 é ativada após uma despolarização prolongada,
com ativação de receptores NMDA e consequente influxo de íons Ca2+, conforme
descrito anteriormente na cascata molecular. Tal gene codifica a proteína Zif-268,
que consiste em um fator transcricional cuja estrutura apresenta três sequências do
tipo “dedos de zinco” (do inglês, zinc finger) no domínio que se liga a elementos
ricos em CG no DNA (DAVIS et al., 2003). Essa ligação ocorre em regiões
promotoras específicas, regulando centenas de genes de expressão tardia
envolvidos no controle do crescimento, sobrevivência e plasticidade neuronal
(LEMAIRE et al., 1994). Dentre esses, podemos citar o gene das sinapsinas I e II,
fosfoproteínas que regulam a disposição das vesículas sinápticas para ancoragem e
fusão, pelo controle de suas ligações com o citoesqueleto no pool vesicular. (THIEL
et al., 1994; PETERSOHN et al., 1995).
No cérebro de ratos ocorre uma expressão constitutiva do RNAm de Zif-268
no neocórtex, córtex entorrinal e olfatório primário, amígdala, estriado, núcleo
accumbens, cerebelo e hipocampo (DAVIS et al., 2003). Tanto o RNAm quanto a
proteína são importantes para os processos de memória e aprendizagem. A
expressão de Zif-268 está associada à indução de LTP, alterações morfológicas
neuronais após exposição a um ambiente enriquecido, e outros fenômenos
relacionados à plasticidade. Foi descrito que a deleção desse gene acarreta uma
redução no processo de LTP hipocampal, levando a um déficit mnemônico em
camundongos submetidos a uma tarefa de reconhecimento de objetos, 24h após a
primeira exposição (JONES et al., 2001 apud KATCHE et al., 2012). Além disso,
esses camundongos mutantes se mostraram incapazes de consolidar informações a
respeito de localizações espaciais ou o aspecto dos objetos, evidenciando o
envolvimento do gene Zif-268 na memória de reconhecimento (BOZON et al, 2003
apud KATCHE et al, 2012). Katche et al (2012) demonstraram a ocorrência de pelo
menos dois picos de expressão hipocampal da proteína Zif-268, em ratos
submetidos a um treinamento na esquiva inibitória. O primeiro pico ocorre
precocemente e está envolvido na formação de memórias de longo prazo. O
29
segundo é tardio, entre 12-24 horas após o treino nessa tarefa comportamental, e
parece estar envolvido no armazenamento dessa memória recém-formada
(KATCHE et al, 2012).
1.6.3 BDNF
O fator neurotrófico derivado do cérebro, conhecido como BDNF, consiste em
uma pequena proteína dimérica, pertencente a uma família de neurotrofinas
envolvidas na regulação da sobrevivência e diferenciação de neurônios centrais e
periféricos durante o desenvolvimento do sistema nervoso (BINDER; SCHARFMAN,
2004). Ele é sintetizado e armazenado em neurônios glutamatérgicos, os quais
secretam uma mistura de proBDNF, proteína precursora, e BDNF, forma madura
gerada após a clivagem proteolítica (GRAY et al., 2012). Essa clivagem pode ocorrer
tanto no meio intracelular quanto no extracelular. No segundo caso, o proBDNF é
clivado pela plasmina, de modo dependente do ativador de plasminogênio tecidual
(t-PA), em resposta a estímulos indutores de LTP (SCHWARTZ et al., 2011). As
vesículas secretoras podem ser encontradas tanto nos terminais axônicos dos
neurônios pré-sinápticos, quanto nos dendritos dos pós-sinápticos. Essa liberação
ocorre de modo dependente de atividade neuronal (PANG et al., 2004 apud
BEKINSCHTEIN et al., 2008), sendo dependente do influxo de íons Ca2+ através de
canais acoplados aos receptores NMDA ou voltagem-dependentes (LU et al., 2007).
Uma vez liberado na fenda sináptica, o BDNF pode se ligar ao receptor
tirosina quinase tipo B (TrkB), também localizado nos neurônios pré e pós-
sinápticos. Essa ligação promove a dimerizaçãodo receptor e autofosforilação
deresíduos de tirosina específicos em seu domínio intracelular, os quais promovem
a ativação de outras enzimas pertencentes a cascatas distintas de sinalização
intracelular. Uma dessas vias ativa a enzima fosfolipase Cγ (PLCγ), a qual hidrolisa
o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) para produzir inositol 1,4,5-trifosfosfato (IP3),
que por sua vez, desencadeia a liberação de íons Ca2+ do retículo endoplasmático.
Os íons Ca2+ livres no citosol se ligam a calmodulina, formando um complexo cálcio-
calmodulina (Ca2+/CaM) capaz de regular as funções de numerosas proteínas alvo,
inclusive a CaMKII conforme já foi exposto acima. Além disso, o BDNF facilita a
liberação de glutamato, aumenta a fosforilação de receptores NMDA, bem como a
expressão e fosforilação de receptores AMPA (TYLER et al., 2002) (figura 5).
30
Figura 5: Sinapse glutamatérgica e papel do BDNF. Cascata de eventos moleculares ativada pela
ligação do BDNF ao seu receptor TrkB nos neurônios pré e pós-sinápticos (TYLER et al., 2002).
Adicionalmente, foi descrito que a liberação precoce de BDNF, a partir de
vesículas secretoras contendo a proteína previamente sintetizada nos neurônios pré-
sinápticos, facilita a indução de LTP precoce. Possivelmente, isso ocorre devido à
função regulatória que o BDNF desempenha nos processos de mobilização e
ancoragem de vesículas sinápticas, através da distribuição e fosforilação de
proteínas (LU, Y. et al., 2007). A liberação tardia, por sua vez, a partir de neurônios
pós-sinápticos, contribui para a manutenção de LTP. No entanto, para que isso
ocorra, faz-se necessário um suprimento sustentado de BDNF através de processos
de transcrição e tradução induzidos por atividade (ALDER et al., 2005 apud
BEKINSCHTEIN et al., 2008). Por outro lado, proBDNF se liga preferencialmente
aos receptores de neurotrofinas p75NTR, ativando uma cascata de sinalização que
leva a LTD no hipocampo, se opondo aos efeitos gerados pela proteína madura
(WOO et al., 2005 apud GRAY et al., 2012).
Conforme descrito acima, a indução de BDNF pode iniciar uma cascata
molecular capaz de gerar transformações estruturais nas sinapses, as quais
parecem ser necessárias para a persistência da memória. Uma série de estudos
fundamenta essa relação entre o BDNF e os processos de memória e aprendizado,
particularmente nas tarefas hipocampo-dependentes, sendo o fator transcricional
CREB o principal mediador das respostas neuronais a essa molécula
(BEKINSHTEIN et al., 2011). Heldt et al (2007), através de uma deleção específica
31
do gene de BDNF em camundongos, demonstraram a importância dessa molécula
para um desempenho adequado na tarefa de reconhecimento de objetos, a qual é
hipocampo-dependente. Falkenberg et al (1992) mostraram que animais expostos a
um ambiente enriquecido exibiram um aumento na expressão hipocampal de RNAm
que codifica a proteína BDNF. Adicionalmente, esses animais apresentaram um
melhor desempenho quando submetidos ao labirinto aquático de Morris, sugerindo
que a expressão de BDNF pode promover alterações neuronais essenciais no
processo de aprendizado e memória. Relacionado a isso, um estudo mais recente
mostrou que animais submetidos ao exercício físico se tornaram mais aptos a
localizar a plataforma escondida em um labirinto aquático. Tal aperfeiçoamento pôde
ser revertido pelo bloqueio da atividade hipocampal de BDNF, sugerindo que a
capacidade que o exercício apresenta de melhorar a função cognitiva é dependente
da função desempenhada pelo BDNF no hipocampo (GOMEZ-PINILLA et al., 2008).
Além disso, alguns achados evidenciam o papel desempenhado pelo BDNF para a
ocorrência de modificações morfológicas relacionadas à plasticidade: BDNF
aumenta o número de espinhas dendríticas nos neurônios piramidais de CA1, bem
como o número de sinapses excitatórias entre CA3 e CA1 em cultura de tecido
hipocampal (TYLER; POZZO-MILLER, 2001).
Assim como descrito para a CaMKII, alguns estudos evidenciam o papel
desempenhado pelo BDNF no processo de marcação sináptica, visto que um
estímulo tetânico intenso aumenta a expressão dessa proteína no corpo celular de
neurônios piramidais em CA1 (CASTREN et al., 1993 apud LU et al., 2007). Além
disso, o acoplamento de um estímulo tetânico fraco, que promove a formação de
uma marcação sináptica sem induzir a expressão de proteínas relacionadas à
plasticidade, com um aumento dos níveis de BDNF é capaz de induzir LTP tardia
(LU et al., 2007).
Dessa forma, tendo como base os principais tópicos abordados acima, o
estudo da cascata de sinalização envolvendo CaMKII-P, Zif-268 e BDNF, incluindo
seu padrão de ativação espaço-temporal, faz-se necessário para uma melhor
compreensão dos mecanismos de integração entre estímulos ambientais e os
eventos moleculares de plasticidade associados aos mesmos. Acreditamos que a
alteração do ciclo sono-vigília, decorrente da manipulação farmacológica com o uso
de haloperidol, possa acarretar déficits mnemônicos, os quais podem ser
observados tanto em nível comportamental quanto molecular. Assim, o presente
32
estudo nos permitiu investigar essas vias moleculares hipocampais, no contexto de
seu possível envolvimento com as modificações comportamentais observadas em
animais tratados com esse fármaco.
33
2 OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente estudo tem como objetivo investigar os efeitos do tratamento com
haloperidol no que se refere aos aspectos comportamentais e moleculares
envolvidos no processo de consolidação de memórias, em camundongos adultos
submetidos ao teste de preferência por objetos novos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Quantificar o tempo de exploração de objetos familiares e não-familiares, em
animais controle e tratados com haloperidol (0,3mg/Kg), submetidos ao teste
de preferência por objetos novos;
Realizar quantificação imunohistoquímica comparativa (IHQ) das proteínas
CaMKII-P, Zif-268 e BDNF, nas áreas CA1, CA3 e GD hipocampais de
animais não expostos (naïve - NV), bem como de animais expostos aos
objetos com posterior injeção de haloperidol (halo) ou salina (veículo - VH),
perfundidos 3, 6 e 12h após o estímulo inicial.
34
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados 87 camundongos adultos machos da espécie Mus musculus
C57BL6 (19-29g, 3-6 meses), os quais foram mantidos no biotério de camundongos
do Instituto Internacional de Neurociências de Natal Edmond e Lily Safra (IINN-ELS
– Natal, RN) em um ciclo claro-escuro de 12 horas, sem restrição alimentar e de
água. A temperatura do biotério foi mantida a 22° C com variação de 1°.
3.2 APARATO EXPERIMENTAL
Um aparato específico foi construído para a realização da etapa de exposição
aos objetos novos. Ele consiste em um cilindro de madeira de 40 centímetros de
diâmetro por 50 centímetros de altura com o fundo de madeira do mesmo diâmetro e
tampa ausente (Figura 6).
Figura 6:Aparato destinado à tarefa comportamental (TPON).
3.3 OBJETOS
No paradigma comportamental adotado, a exposição aos objetos novos,
foramutilizados quatro itens no total, os quais eram completamente desconhecidos
dos animais. Dessa forma, esperávamos que o contato com esses objetos
provocasse forte estimulação sensorial e espacial, evidenciada por alterações
moleculares e eletrofisiológicas (RIBEIRO, S. et al., 2004). Os objetos escolhidos
foram uma esponja de lavar louça colada em forma de V (figura 7A), uma pirâmide
de acrílico azul (figura 7B), um ralo de pia de metal (figura 7C), a parte superior de
uma escova de limpeza (figura 7D), um rolo cilíndrico oco com fios de plástico em
35
sua superfície externa (bob) (figura 7E) e dois pedaços de borracha colados entre si
em com forma de paralelepípedo oco (figura 7F). Todos os objetos apresentaram
comprimento e altura semelhantes, sendo dispostos equidistantes entre si e a 5 cm
das bordas, para possibilitar a livre passagem do animal. Além disso, esses objetos
não foram fixados ao aparato, o que permitiu a movimentação deles pelo contato
com os animais.
. A. B.
Figura 7: Objetos selecionados para exposição aos animais no paradigma comportamental de preferência por novos objetos. Os objetos B, C, D e F foram utilizados na primeira exposição. Os objetos A, B, E e F foram utilizados na reexposição, sendo os objetos A e E os chamados não-familiares e os objetos B e F os chamados familiares.
D. C.
E. F.
36
3.4 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais. O primeiro,
formado por 32 animais, foi utilizado no protocolo de reexposição para análise
comportamental e subdivide-se da seguinte forma: 16 animais, cujos
comportamentos foramavaliados durante o dia, e 16, avaliados durante a noite.
Cada subgrupo está novamente dividido de acordo com o tratamento aplicado após
a exposição aos objetos: animais veículo – injeção intraperitoneal (i.p.) de salina
(0,25 ml); animais tratados – injeção i.p. de haloperidol (0,3 mg/kg). Todos os
animais foram reexpostos aos objetos novos 24 horas após a primeira exposição.
Osegundo grupo de animais (55) foi submetido ao protocolo de exposição
única (entre 8-10 a.m.) para a obtenção de amostras destinadas à análise por IHQ.
Eles foram divididos em sete grupos, de acordo com a tabela 1. A distinção entre os
grupos expostos perfundidos após 3, 6 ou 12 horas é necessária para avaliar a
cinética de expressão das diferentes moléculas e conhecer o papel desempenhado
por elas na cascata bioquímica de plasticidade sináptica. Os animais pertencentes
ao grupo A funcionaram como controle para a aquisição de informações durante a
vigília, isto é, foram isentos de contato com novos objetos. Então, eles
permaneceram em suas caixas de criação e foram retirados individualmente para o
procedimento de perfusão e coleta do cérebro, realizados sempre no período da
manhã. Dessa forma, esperávamos que a expressão basal dos animais naïve (NV)
fosse inferior a dos VH, visto que os primeiros não adquiriram novas informações,
durante a vigília, que necessitassem de processamento durante o sono.
TABELA 1:Grupos de animais destinados ao protocolo de reexposição – TPON
Treino diurno Treino noturno
Veículo Halo (0,3 mg/kg) Veículo Halo (0,3 mg/kg)
8 8 8 8
37
3.5 PROCEDIMENTOS PRÉ-TESTE
Objetivando facilitar a manipulação dos animais e reduzir o estresse
provocado pelos experimentos, os animais foram submetidos a 10 sessões de cinco
minutos, em dias consecutivos, de habituação (figura 8), as quais foram realizadas
em sala fechada, iluminada e com temperatura de 23° Celsius.
Figura 8: Habituação - procedimento de simples manuseio dos animais.
3.6 TESTE DE PREFERÊNCIA POR OBJETOS NOVOS (TPON)
Essa etapa do experimento foi realizada com todos os grupos experimentais,
exceto o A, descrito na tabela 1. Ocorreu em uma sala isolada, iluminada e com
temperatura mantida em 23° Celsius. A captação dos vídeos de exploração dos
TABELA 2:Grupos de animais destinados à coleta de amostras para a realização
deIHQ para Zif-268, CaMKII-P e BDNF.
Grupo Tratamento Número de animais
Protocolo
A - 7 Grupo naïve: sem exposição ou injeção
B Veículo 10 Exposição aos objetos + perfusão após 3h
C Halo 10 Exposição aos objetos + perfusão após 3h
D Veículo 7 Exposição aos objetos + perfusão após 6h
E Halo 7 Exposição aos objetos + perfusão após 6h
F Veículo 7 Exposição aos objetos + perfusão após 12h
G Halo 7 Exposição aos objetos + perfusão após 12h
38
objetos foi feita por uma câmera instalada acima do aparato já descrito, a qual foi
conectada a um computador presente na própria sala.
Os animais foram retirados do biotério e levados individualmente até a sala,
evitando o desvio da atenção do animal testado por som ou cheiro de outros
animais. O teste em si consistiu na exposição do animal, durante dez minutos, a
quatro objetos diferentes, os quais foram colocados na mesma posição e
equidistantes entre si para manter o padrão e evitar variações entre os animais.
Após a exposição, o animal foi contido sem anestesia e submetido a uma injeção i.p.
com conteúdo dependente do grupo ao qual pertencia, haloperidol (0,3 mg/kg)
(DZIRASA, K. et al., 2006) para o grupo tratado ou salina para o grupo veículo. Em
seguida, os animais foram colocados individualmente em gaiolas e levados de volta
ao biotério, possibilitando a continuidade do seu período de sono e consolidação das
memórias recém-adquiridas. Ao término de cada teste, limpamos o aparato com
álcool a 70% para removerodores e vestígios do animal anterior, que pudessem
interferir na livre exploração do novo animal (figura 9).
Figura 9: Protocolo de exposição única.Procedimentos para marcação e quantificação da expressão de CaMKII-P, Zif-268 e BDNF em tecido cerebral de camundongos, após estimulação mnemônica através do contato com objetos novos.
No protocolo de reexposição para a quantificação comportamental, uma
segunda exposição foi realizada 24h após a primeira. Dois dos quatro objetos
previamente expostos foram substituídos por objetos novos e o tempo de exploração
em cada classe de objeto foi quantificado. Após a reexposição, os animais foram
devolvidos ao biotério para posterior eutanásia por inalação de isoflurano (figura 10).
39
Figura 10: Protocolo de reexposição. Grupos separados de animais VH e halo foram treinados e testados nos períodos diurno e noturno. Dois dos quatro objetos foram substituídos por objetos diferentes na reexposição, visando a quantificação e comparação do tempo de exploração dos objetos familiares e não-familiares.
Figura 11: Teste de preferência por objetos novos (TPON). Livre exploração do animal no aparato experimental para o teste de preferência por objetos novos.
3.7 COLETA E ANÁLISE DE DADOS
No protocolo de reexposição, os dados foram coletados através de vídeo
captado por uma webcam tec75 da LG, com o software da própria câmera.
Utilizamos na análise estatística a razão da reexposição, entre os objetos não-
familiares/familiares e o tempo total de exploração (familiares + não-familiares)
durante a reexposição. Consideramos exploração quando o animal manteve contato
com o objeto através de vibrissas e ou com as duas patas dianteiras. Qualquer outra
parte do animal em contato com o objeto não foi considerado no tempo de
exploração (figuras 10 e 11).
A análise estatística foi realizada no software GraphPad Prism 5, sendo a
normalidade dos dados obtida através do teste de Shapiro-Wilk. Em seguida, o
Teste t de student foi aplicado. Os valores considerados foram p e W, para testes de
normalidade, e p e t, para testes paramétricos. Exibimos nos gráficos de barra as
40
médias das razões e dos tempos totais de exploração, bem como seus respectivos
erros padrões da média.
3.8 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS E REALIZAÇÃO DE IMUNOHISTOQUÍMICA
(IHQ)
No protocolo de exposição única, após o período de repouso determinado para
cada grupo (3, 6 ou 12 horas), os animais foram retirados do biotério, um por vez,
anestesiados com isoflurano e perfundidos com tampão fosfato-salina (TFS) e
paraformaldeído (PFA 4%). Seus cérebros foram removidos e permaneceram
imersos por 24h em uma solução de sacarose a 30%, possibilitando uma adequada
crioproteção. Posteriormente, esse material foi congelado e seccionado
coronariamente a 30 µm em um criostato (Zeiss). As secções foram dispostas em
lâminas de vidro, seguindo uma distribuição em série, e armazenadas a temperatura
de -80ºC, até o momento do procedimento de imunohistoquímica (figura 9).
Inicialmente, as secções foram incubadas em tampão bloqueador (TB: 0,5% de
leite desnatado e 0,3% de Triton X-100 em TF 0,1M) por 30 min e, posteriormente,
no anticorpo primário diluído em TB, overnight a 18ºC. Foram utilizados anticorpos
específicos para CaMKII-P (1:200, Millipore), Zif-268 e BDNF (1:200, Santa Cruz
Biotechnology, USA). Em seguida, as secções foram lavadas por 15min em tampão
fosfato (TF) 0,1M pH 7,4, incubadas com anticorpo secundário biotinilado (diluído em
TB, Vector Labs, USA) por 2 horas, lavadas novamente em TF (15 min), e
finalmente incubadas com uma solução de avidina-biotina-peroxidase (Vectastain
Standard ABC kit, Vector Labs, USA) por 2 horas. A etapa de revelação foi realizada
inserindo as lâminas em uma solução contendo 0,03% de diaminobenzidina (DAB) e
0,001% de peróxido de hidrogênio em TF 0,1M. Em seguida, as secções foram
desidratadas e as lâminas montadas com Entellan (Merck, USA). Visando confirmar
a especificidade da marcação, anticorpos primários foram substituídos por TB em
uma lâmina teste.
Com relação à IHQ para BDNF, algumas alterações foram necessárias no
protocolo acima descrito. Primeiramente, realizamos uma etapa de recuperação
antigênica: os cortes foram imersos em tampão borato 0.1M pH 9,0, com posterior
aquecimento em forno microondas por dois períodos de 30s. As secções foram
lavadas durante 15 min em tampão fosfato (TF) 0,1M pH 7,4. Em seguida, visando
bloquear a peroxidase endógena, os cortes foram imersos em H2O2 3% em metanol
41
20 % por 30 min. Realizamos uma nova etapa de lavagem, incubamos em TB por 2h
e, finalmente, as secções foram incubadas em anticorpo primário (BDNF 1:200,
Santa Cruz Biotechnology, USA) diluído em TB, por 72h a 18ºC. Após uma nova
lavagem em TF (15 min), as etapas de incubação no anticorpo secundário, no kit
ABC, revelação e montagem das lâminas ocorreram conforme o protocolo já descrito
para IHQ de CaMKII-P e Zif-268.
3.9 QUANTIFICAÇÃO DA MARCAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Finalizado o procedimento de IHQ, as lâminas foram fotografadas com o
auxílio do programa Axion Vision, sendo obtidas 3 secções por animal para os 7
animais de cada grupo. Visando evitar divergências na região exata a ser
quantificada, todas as secções foram igualmente selecionadas dentro do intervalo de
1,46mm a 2,06mm, posteriores ao bregma (PAXINOS e FRANKLIN, 2001). As
mesmas configurações de brilho e contraste foram usadas, evitando divergências
entre as lâminas. Em seguida, utilizamos o programa ImageJ para obter uma análise
densitométrica da marcação por CaMKII-P, Zif-268 e BDNF (figura 9).
Anteriormente a quantificação, as imagens foram convertidas ao formato 8-bit
e invertidas. Em seguida, uma área padrão contendo substância branca (corpo
caloso) foi selecionada e medida em todas elas e descontada do valor dos tons de
cinza da imagem. Após o desconto, a medida das diferentes áreas hipocampais
(CA1, CA3 e GD) foi efetuada separadamente. Os valores individuais obtidos
correspondem à média dos tons de cinza (MTC). As três MTC obtidas para cada
animal, correspondente a uma única área quantificada nas três secções, foram
submetidas a uma nova média, obtendo-se assim um valor para cada animal (7
valores ao todo, em cada grupo). As MTC individuais foram normalizadas dividindo-
se cada uma delas por uma média geral (MTCg) obtida a partir de todos os grupos
comparados entre si: NV, VH e halo para cada intervalo de tempo analisado (NV x
VH 3h x halo 3h, por exemplo). Essa razão de marcação (R = MTC/MTCg) também
foi obtida nas comparações intertempo para os grupos VH e halo (NV x VH 3h x VH
6h x VH 12h, por exemplo). Os valores de R obtidos para cada grupo foram tratados
estatisticamente no programa GraphPad Prism 5.
A técnica de quantificação baseada na contagem individual de células foi
empregada para a análise da marcação por Zif-268, a qual é nuclear e permite a
detecção por esse método (figura 9). Por outro lado, as marcações de CaMKII-P e
42
BDNFsão citoplasmáticas, sendo bem mais difusas e difícil de serem detectadas por
contagem individual. O programa utilizado para executar essa análise foi o Stereo
Investigator. De acordo com a área selecionada para cada região de interesse (CA1,
CA3 e DG) (3 secções/animal), o programa gerou quadrados de 50x50µm para a
contagem do número de células marcadas em seu interior. Quanto maior a extensão
da área selecionada, maior o número de campos de contagem gerados pelo
programa.
Isso justifica a importância da escolha de secções pertencentes ao intervalo
1.46mm a 2.06mm posterior ao bregma, evitando variações interanimal no número
de células contadas (NCC). Em seguida, o NCC em cada região selecionada foi
dividido pelo número de campos de contagem gerados pelo programa, obtendo-se
uma primeira razão: R1 = células/campo, correspondente ao valor de cada uma das
três secções. Os R1 individualmente obtidos foram normalizados conforme descrito
anteriormente, obtendo-se uma razão de contagem R2 através da divisão de cada R1
pela média dos valores (Rgeral) obtidos a partir de todos os grupos comparados
entre si (R2 = R1/Rgeral). Essa mesma razão de contagem foi obtida nas
comparações intertempo para os grupos VH e halo.
As análises foram realizadas utilizando o teste de normalidade Kolmogorov-
Smirnov para todos os valores de distribuição. ANOVA de uma via com post hoc
Tukey foi usado para os três grupos de mesmo tempo e diferentes tratamentos,
assim como para o mesmo tratamento em diferentes tempos. Adicionalmente, o
teste T de Student foi aplicado para confirmar tendências reveladas na ANOVA.
Contudo, nos casos em que encontramos diferenças significativas no teste T,
consideramos as mesmas como significância marginal, visto que ANOVA é a análise
de referência. As tendências não são ilustradas nos gráficos, são apenas descritas
no texto. Com ANOVA, as comparações foram consideradas significativas quando
P<0,05, enquanto no teste T esse mesmo valor de P foi considerado uma
significância marginal.
43
4 RESULTADOS
4.1 TPON – PROTOCOLO DE REEXPOSIÇÃO
Comparando-se os dados obtidos para o grupo de animais veículo e tratado,
submetidos ao protocolo de reexposição após 24 horas, observamos um
desempenho significativamente melhor nos animais VH, em relação aos tratados
com haloperidol, quando ambos os grupos foram avaliados pela manhã. Os valores
da média e desvio padrão encontrados para as razões de preferência foram: 2,5 ±
0,19 e 1,51 ± 0,11 (N=8), para os grupos veículo e tratado, respectivamente. No
teste t de Student aplicado, foram encontrados valores de P = 0,0007 e t = 4,35
(figura 12A).
Nenhuma diferença entre as razões de preferência foi observada quando os
grupos foram analisados durante a noite. Os valores da média e erro padrão da
média encontrados foram: 1,28 ± 0,22 e 1,1 ± 0,14, para os subgrupos veículo e
tratado, respectivamente. No teste t de Student aplicado, foram encontrados valores
de P = 0,49 e t = 0,69 (Figura 12B).
No grupo treinado pela manhã, que apresentou diferença estatística
significante, foi aplicado teste de normalidade e o teste t de Student no tempo total
de exploração (em segundos) dos objetos familiares + não-familiares (figura 12C).
Não observamos diferença significativa entre os grupos, com relação ao tempo total
de exploração. Os valores da média e desvio padrão encontrados foram: 244,6 ±
18,77 e, 194,4 ± 16,34 para os subgrupos veículo e tratado, respectivamente. No
teste t de Student aplicado, foram encontrados valores de P = 0,06 e t = 2,02.Assim,
concluímos que os animais pertencentes ao grupo halo não apresentaram uma
redução no tempo de exploração, mas exibiram uma modificação da preferência
pelos objetos explorados.
Figura 12: Dados comportamentais – TPON. Razão do tempo de exploração entre objetos não-familiares e familiares (NF/F) nos grupos tratado (halo 0,3mg/Kg) e veículo, treinados pela manhã (A) e pela noite (B). Análise do tempo total de exploração de objetos familiares + não-familiares (F+NF), nos grupos veículo e tratado, pertencentes ao grupo manhã (C). Consideramos * = p < 0,05, ** p < 0,01 *** p < 0,001.
44
4.2 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA – PROTOCOLO DE EXPOSIÇÃO ÚNICA
Conforme exibido na figura 13, encontramos diferenças nos níveis de
expressão das proteínas analisadas na comparação intergrupo, quando testados em
3, 6 e 12h. A análise densitométrica da marcação de CaMKII-P revelou diferenças
significativas entre os grupos NV, VH e halo, nos três tempos testados.
Considerando-se o intervalo de 3h após a injeção, observamos uma diferença entre
os grupos NV e halo, na região CA3. No intervalo de 6h, ocorreram diferenças
significativas tanto entre VH e halo, quanto entre NV e halo, em CA1, CA3 e no GD.
Por último, no intervalo de 12h, constatamos diferenças significativas entre os
grupos VH e halo nas três regiões hipocampais analisadas. Além disso,
especificamente em CA3, houve também uma diferença entre NV e halo. Esses
resultados podem ser visualizados na linha A da figura 13.
Devido a sua expressão intracelular, a marcação da proteína Zif-268 pode ser
quantificada por ambos os métodos, os quais forneceram resultados
aproximadamente similares. A análise densitométrica dos grupos 6h revelou, em
CA1 e CA3, uma expressão reduzida de Zif-268 nos animais halo, quando
comparados com NV e VH. Os resultados provenientes da contagem de células,
nesse mesmo intervalo de tempo, revelaram a mesma redução do grupo halo
apenas na região CA1. Esses resultados são exibidos na linha B da figura 13.
A análise da expressão de BDNF, por densitometria, não apresentou
diferenças significativas quando realizada em 3 ou 6h. Por outro lado, após 12h de
intervalo, observamos no GD diferenças significativas entre os animais VH e halo,
como é possível observar na linha C da figura 13.
Visando uma melhor ilustração das áreas específicas onde observamos
algumas das diferenças significativas descritas acima (halo x VH; halo x NV),
exibimos na linha D da figura 13 uma seleção das regiões CA3, CA1 e GD marcadas
diferencialmente para CaMKII-P, Zif-268 e BDNF, respectivamente.
45
Fig
ura
13:
Anális
e q
ualit
ativa.
Imagens d
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ação im
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rês inte
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6h -
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dução n
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ção a
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; 12h -
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para
ção N
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halo
, enquanto
as v
azia
s, V
H x
halo
.
46
4.2.1 Quantificação por densitometria
Após as análises estatísticas, ANOVA com teste de Tukey revelaram
diferenças significativas entre os grupos NV, VH e halo quando quantificados 3, 6 e
12h após a injeção, dependendo da molécula analisada. Além disso, algumas
tendências verificadas no ANOVA foram confirmadas com a aplicação do teste T de
Student. Tais resultados podem ser visualizados na tabela 2 e figura 14.
Adicionalmente, também avaliamos nossos dados através da comparação
intertempo obtida para os grupos VH e halo, separadamente.As informações
provenientes dessas comparações foram descritas nas tabelas 3 e 4, bem como
ilustrados na figura 15.
47
F Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P
1,18 ± 0,12; N = 7
0,87 ± 0,15; N = 6
F Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P
1,25 ± 0,07; N = 6 1,06 ± 0,18; N = 7
0,63 ± 0,13; N = 6 1,25 ± 0,07; N = 6
1,06 ± 0,18; N = 7
0,63 ± 0,13; N = 6
1,17 ± 0,07; N = 6
0,71 ± 0,14; N = 6
1,05 ± 0,11; N = 7
0,71 ± 0,14; N = 6
1,10 ± 0,15; N = 6
0,77 ± 0,07; N = 6
1,05 ± 0,14; N = 6
0,77 ± 0,07; N = 6
1,18 ± 0,18; N = 6
0,61 ± 0,24; N = 6
1,11 ± 0,17; N = 6
0,61 ± 0,24; N = 6
1,18 ± 0,17; N = 6
0,70 ± 0,16; N = 6
1,07 ± 0,24; N = 6
0,70 ± 0,16; N = 6
F Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P
1,13 ± 0,04; N = 7 0,97 ± 0,15; N = 7
0,87 ± 0,11; N = 7 1,13 ± 0,05; N = 7
1,18 ± 0,06; N = 7 1,04 ± 0,10; N = 7
0,84 ± 0,11; N = 7 1,18 ± 0,06; N = 7
1,03 ± 0,11; N = 7
0,84 ± 0,11; N = 7
1,13 ± 0,06; N = 7 1,01 ± 0,10; N = 6
0,91 ± 0,11; N = 7 1,13 ± 0,06; N = 7
1,11 ± 0,17; N = 7
0,87 ± 0,15; N = 7
1,01 ± 0,22; N = 6
0,81 ± 0,24; N = 7
Grupo 3h
0,0189 VH x halo P < 0,05
Teste de Tukey Teste T de Student
BDNF
NV x VH 0,0147
NV x VH 0,0133
NV x halo P < 0,05
GD 11,12 0,0008 VH x halo P < 0,01
VH x halo 0,0166
GD 5,06
CA3
Grupo 12h
CaMKII-P
CA1 9,231 0,0017 VH x halo P < 0,05 NV x VH 0,0228
CA3 22,48 < 0,0001
VH x halo P < 0,001
Molécula ÁreaANOVA
6,332 0,0101
NV x halo
NV x VH 0,032
P < 0,05
VH x halo P < 0,05
Zif-268
CA1 11,58 0,0009
NV x halo P < 0,001
VH x halo P < 0,05
CA3
Teste T de Student
VH x halo
NV x halo
P < 0,05
P < 0,05
P < 0,001
P < 0,01NV x halo
P < 0,001
NV x halo P < 0,01
VH x halo
Teste de Tukey Teste T de Student
Grupo 6h
Molécula
CaMKII-P NV x halo
VH x halo
ANOVAÁrea
Teste de Tukey
P < 0,05CA3 4,51 0,0308
CaMKII-P CA3 14,24 0,0003
GD 6,45 0,0095
0,000512,94CA1
Molécula ÁreaANOVA
TABELA 3: Comparação intergrupo após densitometria.
48
TABELA 4: Comparação intertempo de grupos VH após densitometria.
F Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P Grupo Média ± DP; N Valor de P
0,77 ± 0,15; N = 6 0,98 ± 0,19; N = 7
1,18 ± 0,08; N = 7 1,18 ± 0,08; N = 7
0,77 ± 0,15; N = 6
1,09 ± 0,06; N = 6
0,82 ± 0,19; N = 6
1,14 ± 0,06; N = 7
0,82 ± 0,19; N = 6
1,04 ± 0,07; N = 6
0,82 ± 0,10; N = 6 1,00 ± 0,13; N = 6
1,06 ± 0,15; N = 6 1,16 ± 0,06; N = 7
0,82 ± 0,10; N = 6
1,16 ± 0,06; N = 7
1,14 ± 0,12; N = 6
0,92 ± 0,14; N = 6
0,92 ± 0,04; N = 6
1,02 ± 0,05; N = 6
0,92 ± 0,04; N = 6
1,07 ± 0,13; N = 7
0,91 ± 0,13; N = 6
1,07 ± 0,09; N = 7
0,96 ± 0,06; N = 6
1,12 ± 0,14; N = 6
ANOVA Teste de Tukey Teste T de Student
Comparação intertempo - Grupos VH
P < 0,05VH 3h x NV VH 6h x VH 12h
VH 3h x 6h P < 0,01
CA1 10,28 0,0002
Molécula Área
0,00098,346GD
P < 0,001
VH 3h x 6h 0,0243
CaMKII-P
Zif-268 CA1
VH 3h x 6h P < 0,05
CA3 9,218 0,0004
VH 3h x 12h P < 0,001
VH 3h x 12h P < 0,001 NV x VH 12h 0,0216
0,0126
VH 3h x 12h
0,0424
VH 3h x 12h 0,0348
BDNF
CA1
VH 3h x 6h
GD VH 3h x 12h
VH 3h x 12h 0,0297
0,0067
CA3
49
TABELA 5: Comparação intertempo de grupos halo após densitometria.
50
Figura 14: Comparação intergrupo após densitometria. Quantificação das marcações para CaMKII-P (A, D e G), Zif-268 (B, E e H) e BDNF (C, F e I), obtidaspara os grupos NV, VH e halo em três intervalos de tempo distintos.Consideramos p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, relativos aos grupos VH; #p<0.05, ##p<0.01, ### p<0.001, relativos aos grupos NV.
Figura 15: Comparação intertempoapós densitometria. As marcações para CaMKII-P (A e D), Zif-268 (B e E) e BDNF (C e F), obtidaspara os animais VH e halo em três intervalos de tempo distintos, foram comparadas separadamente. As diferenças são indicadas pelas linhas conectivas, sendo p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
51
4.2.2 Quantificação por contagem de células
Após a análise estatística da comparação intergrupo, os parâmetros obtidos
para a contagem individual de células marcadas para Zif-268 apresentaram
diferenças entre os grupos NV, VH e halo, quando analisados nos intervalos de 3 e 6
horas pós-injeção. Além disso, avaliamos nossos dados através da comparação
intertempo obtida para os grupos VH e halo, separadamente. Esses resultados
podem ser visualizados na figura 16, bem como nas tabelas 5 e 6.
Figura 16: Quantificação por contagem de células da marcação para Zif-268 em três intervalos de tempo distintos (A, B e C). Na primeira linha, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 relativos aos grupos VH; #p<0.05, ##p<0.01, ### p<0.001 relativos aos grupos NV. Na segunda linha, as
diferenças intertempo (D e E) são indicadas pelas linhas conectivas.
52
TABELA 6: Comparação intergrupo após contagem de células
TABELA 7: Comparação intertempo dos animais VH e halo após contagem de células
F Valor de P Grupos Média ± DP; N Valor de P Grupos Média ± DP; N Valor de P
0,88 ± 0,17; N = 6 1,14 ± 0,12; N = 6
1,14 ± 0,12; N = 6 0,97 ± 0,08; N = 6
0,72 ± 0,24; N = 6
1,16 ± 0,08; N = 6
0,72 ± 0,24; N = 6
1,09 ± 0,04; N = 6
1,06 ± 0,08; N = 6 1,14 ± 0,12; N = 6
0,74 ± 0,12; N = 6 0,97 ± 0,08; N = 6
1,13 ± 0,10; N = 6
0,74 ± 0,12; N = 6
1,13 ± 0,17; N = 6
0,82 ± 0,24; N = 6
CA3
12h
CA1
0,0254
CA3 VH x halo 0,0244
NV x halo P < 0,001
P < 0,01
CA1 5,32 0,0221 NV x VH P < 0,05
6h
CA1 24,97 < 0,0001
VH x halo P < 0,001 VH x halo
Quantificação de Zif-268 por contagem de células
Tempo ÁreaANOVA Teste de Tukey Teste T de Student
3h
CA3 12,59 0,0011
NV x VH P < 0,01
VH x halo 0,0254
NV x halo
F Valor de P Grupos Média ± DP; N Valor de P Grupos Média ± DP; N Valor de P
1,23 ± 0,19; N = 6
0,88 ± 0,11; N = 6
1,23 ± 0,19; N = 6
0,93 ± 0,25; N = 7
0,85 ± 0,21; N = 6
1,21 ± 0,14; N = 6
0,94 ± 0,19; N = 6
1,21 ± 0,14; N = 6
0,65 ± 0,11; N = 6
1,12 ± 0,21; N = 6
0,65 ± 0,11; N = 6
1,22 ± 0,10; N = 6
0,65 ± 0,11; N = 6
1,01 ± 0,31; N = 6
0,67 ± 0,19; N = 6
1,28 ± 0,04; N = 6
0,67 ± 0,19; N = 6
1,12 ± 0,24; N = 7
0,86 ± 0,28; N = 6
1,28 ± 0,04; N = 6
9,181
halo 6h x 12h P < 0,05
7,689 0,0015
0,0006
halo 6h x 3h P < 0,01
P < 0,001
NV x halo 3h P < 0,05
HALO
CA1
halo 6h x NV P < 0,01
CA3
halo 6h x 3h
NV x VH 3h
VH 6h x 3h
0,0121
0,0256
VH
VH 3h x 12h 0,0482
VH 3h x 6h 0,0076
CA1
CA3
Comparação intertempo
Animal ÁreaANOVA Teste de Tukey Teste T de Student
halo 6h x 12h P < 0,01
53
5 DISCUSSÃO
5.1 TPON – ANÁLISE COMPORTAMENTAL
Os resultados obtidos demonstraram um déficit de aprendizado nos animais
tratados com halo, em relação àqueles pertencentes ao grupo VH, apenas quando
testados no período da manhã (figura 12A). Quando avaliados à noite, tanto os
animais tratados quanto os VH não exibiram um desempenho satisfatório no TPON,
visto que exploraram os objetos familiares e não-familiares indistintamente (figura
12B). Devido aoshábitos noturnos dos camundongos e a ocorrência reduzida de
episódios de sono durante a noite, supomos que seria possível diferenciar a
capacidade de consolidação da memória ou de susceptibilidade ao fármaco entre os
períodos diurno e noturno.
Em concordância, os dados obtidos no grupo testado pela manhã revelaram
uma razão de preferência superior (P=0,0007) para os animais VH, quando
comparados aos tratados com haloperidol. Dessa forma, nossos resultados sugerem
que o aprendizado é mais intenso em períodos com maior frequência de sono. Isso
ocorre, possivelmente, devido ao aumento da expressão de proteínas relacionadas à
plasticidade durante essa fase do ciclo sono-vigília (ECKEL-MAHAN, K. L. et al,
2008; RIBEIRO, S. et al, 2007; HERNANDEZ, P. J. e ABEL, T, 2011; RIBEIRO, S. et
al, 1999; 2002)
Referente à relação entre sono e memória, ao longo dos últimos 10 anos, um
número crescente de publicações forneceu embasamento à função do sono no
processamento de memórias (STICKGOLD et al, 2005; RIBEIRO, S. et al, 2004,
2007; SMITH, C., 2011). Diversas teorias foram propostas para explicar os
mecanismos envolvidos nesse processo de consolidação. Uma delas sugere que os
dois principais estados fisiológicos do sono, SWS e REM, desempenham funções
distintas e complementares, com a ocorrência de retomada de memórias
(reverberação neuronal) principalmente em SWS e armazenamento das mesmas,
através da expressão gênica relacionada à plasticidade, durante o sono REM
(RIBEIRO et al. 2004). A ativação de mecanismos de plasticidade ocorre de forma
seletiva em circuitos específicos que foram acionados na vigília precedente
(RIBEIRO, S. & NICOLELIS, M. A. L., 2004). Dessa forma, o sono seria responsável
pelo aumento da força sináptica de circuitos ativados na vigília, promovendo redução
da força sináptica dos circuitos desativados durante esse mesmo período (RIBEIRO
et al., 2009).
54
Como mostrado anteriormente no trabalho de Dzirasa et al (2006), a atuação
da dopamina em seu receptor D2 promove uma manutenção dos padrões
eletrofisiológicos do sono. A atuação em níveis ótimos desse neurotransmissor
parece estar associada à entrada no sono REM. Por outro lado, em animais da cepa
selvagem, o bloqueio de receptores D2 mediado pelo haloperidol, promove uma
diminuição docluster de REM.
Dados ainda não publicados, obtidos a partir de experimentos piloto
realizados pelo nosso grupo de pesquisa, mostraram que camundongos C57BL6,
tratados com haloperidol (0,3 mg/Kg), tiveram uma redução de sono REM nas
primeiras quatro horas após a administração intraperitoneal. Acreditamos que a
diminuição dessa fase de sono acarreta uma diminuição no acionamento de
mecanismos de plasticidade neuronal que ocorreriam durante esse período, levando
a prejuízos na consolidação da memória desse grupo de animais. Esse fato pode ser
comprovado a partir dos dados comportamentais descritos acima, visto que esses
animais exploraram os dois objetos da reexposição como sendo novos.
Dessa forma, baseando-se em nossos dados eletrofisiológicos, bem como
nos resultados negativos provenientes do grupo testado à noite, consideramos que
nossos dadosapoiam os estudos dos grupos de Ribeiro e Dzirasa et al, visto que o
déficit da consolidação de memórias apresentado pelos animais analisados pode
estar associado ao bloqueio da ação dopaminérgica no controle do ciclo sono-vigília,
levando a redução do período de sono REM. Consequentemente, isso acarreta uma
redução dos mecanismos de plasticidade desempenhados durante essa fase, os
quais são de importância fundamental para consolidar memórias recentemente
adquiridas.
Através da comparação do tempo total de exploração (familiares + não-
familiares) entre os grupos haloperidol e veículo, foi possível avaliar os níveis de
influência do haloperidol no desempenho motor dos animais. Apesar da sua
presença no estriado, os receptores do tipo D2não são os principais responsáveis
pela geração de impulsos motores (ZAMAN et al, 2008). Foi descrito que os
receptores D1 e D3 desempenham um papel mais importante no controle motor
(FIORENTINI, C. et al., 2010), enquanto os receptores D2 estão mais relacionados à
memória motora e controle da liberação dopaminérgica. Os dados coletados não
mostraram diferença estatística significativa na comparação de animais veículo e
tratados, indicando que ambos os grupos apresentaram comportamento exploratório
55
durante o mesmo período de tempo (figura 12C). Apesar das evidências acima
expostas, não podemos descartar a possibilidade de que a diferença observada no
aprendizado seja devido à própriaatividade dopaminérgica diferenciada entre os
períodos diurno e noturno.
5.2 IHQ – ANÁLISE DOS NÍVEIS PROTEICOS
5.2.1 Nível de CaMKII-P no grupo 3h
Nesse intervalo de tempo após a injeção, houve uma redução no grupo halo,
quando comparado ao NV, na região CA3 (ver figuras: 13 - linha A; 14A). Apesar de
alguns estudos terem descrito um aumento na atividade de CaMKII-P no período
pós-treino em paradigmas de memória, bem como durante a indução de LTP, o
tempo exato de ativação dessa kinase após o estímulo ainda permanece
controverso. Enquanto um estudo usando registros de LTP in vitro constatou, na
região CA1, um aumento significativo nos níveis de CaMKII-P, 30 minutos após um
estímulo tetânico, (OUYANG et al., 1997), outro revelou que a expressão dessa
kinase permaneceu em um nível elevado de fosforilação durante as fases de
indução, LTP precoce e LTP tardia. Tais níveis de expressão se mantiveram
elevados por 8 horas (AHMED; FREY, 2005). Possivelmente, o uso de diferentes
paradigmas de tetanização nesses estudos resultou em alterações no fluxo de íons
Ca2+, levando a diferentes concentrações do complexo Ca2+-CaM, o que pode ter
afetado outros mecanismos de sinalização de modo dose-dependente.
Adicionalmente, em testes comportamentais com roedores, Cammarota e
colaboradores (1998) analisaram a fosforilação in vitro de CaMKII, após treinamento
em esquiva inibitória. Eles revelaram um aumento na expressão hipocampal dessa
kinase após 30min, mas não em 120min. Considerando-se que CaMKII-P induz
potenciação sináptica através da fosforilação de receptores AMPA, esse mesmo
grupo de pesquisadores também analisou a fosforilação in vitro do receptor AMPA, a
qual se mostrou elevada após 120min, mas não 30min após o treino. Esses
resultados sugerem que, após o estímulo mnemônico, essa kinase é rapidamente
ativada e desencadeia uma cascata de potenciação sináptica através da fosforilação
de seus substratos, como o receptor AMPA. Apesar do intervalo de 30min não ter
sido avaliado no nosso estudo, supomos que o estímulo inicial induziu fosforilação
de CaMKII previamente sintetizada nos neurônios, tanto nos animais VH quanto
56
halo. Provavelmente ocorreu um pico de expressão em torno de 30min após injeção,
seguido de um decréscimo nos níveis dessa kinase.
Baseando-se nos dados da literatura detalhados abaixo, acreditamos que a
reposição de CaMKII-P possivelmente ocorreu nas horas subsequentes, através de
síntese proteica de novo. Conforme descrito por Hernandez e Abel (2011), é
necessário a ocorrência de uma reativação cíclica de proteínas relacionadas à
plasticidade (PRP), durante o período pós-treino, reforçando vias de sinalização que
levam a uma plasticidade hipocampal em longo prazo, a qual é essencial para a
consolidação de memórias (HERNANDEZ; ABEL, 2011).
Alguns estudos fundamentam o papel desempenhado pelo sono nesse
processo de consolidação de memórias. Um deles, por exemplo, sugere que a
persistência de memórias em longo prazo pode depender da reativação hipocampal
da via transcricional AMPc/MAPK/CREB, durante o ciclo circadiano (ECKEL-MAHAN
et al., 2008). Além disso, foi descrito que essa mesma via, por exemplo, está
envolvida na formação de memórias e pode ser modulada pela privação de sono,
ritmos circadianos e neurotransmissores envolvidos na regulação do ciclo sono-
vigília (HERNANDEZ; ABEL, 2011).
Portanto, nós presumimos que após a exposição aos objetos, um intervalo de
3h é suficiente para a ocorrência de episódios de sono, durante os quais o estoque
de CaMKII-P pode ser parcialmente restaurado. Consequentemente, no grupo halo,
os níveis de CaMKII-P não foram reestabelecidos, pois o tratamento farmacológico
pode ter impedido a ocorrência de um ciclo normal de sono/vigília, bem como do
processo de síntese proteica associado ao mesmo. Os animais do grupo VH
exibiram níveis de expressão intermediários entre NV e halo. Provavelmente, os
episódios de sono que ocorreram no intervalo de 3h pós-injeção foram suficientes
para repor, apenas parcialmente, o estoque inicial de kinase, que foi depletado após
a exploração dos objetos. No grupo NV, acreditamos que a expressão representa o
nível basal, visto que não houve estímulo mnemônico para induzir a fosforilação de
CaMKII.
5.2.2 Níveis deZif-268 no grupo 3h
A quantificação por contagem de células revelou, em CA1, um aumento dos
níveis de Zif-268 no grupo VH quando comparado ao NV, enquanto em CA3 os
grupos VH e halo apresentaram níveis elevados em relação ao NV (figura 16A).
57
Além disso, um teste T adicional indicou uma significância marginal de redução nos
níveis do grupo halo em relação ao VH, apenas em CA1. Esses resultados podem
ser explicadosao considerarmos dois aspectos referentes à expressão da proteína
Zif-268. Primeiramente, esperávamos quantificar no grupo NV uma expressão basal,
a qual é mantida pela função sináptica normal ou por atividade neuro-hormonal /
neurotrófica (WORLEY et al. apud KNAPSKA; KACZMAREK, 2004). Esse aspecto é
provavelmente vital para as funções desempenhadas por esse GI, visto que permite
tanto um aumento quanto uma redução no nível de sua expressão. O segundo
aspecto se refere à expressão tempo-dependente observada tanto para o gene
quanto para a proteína Zif-268.
O conhecimento dessas cinéticas de expressão é fundamental para o estudo
das funções desempenhadas por essa molécula (KNAPSKA; KACZMAREK, 2004).
Sabe-se que a expressão de Zif-268 pode ser induzida de forma rápida e transitória
por diferentes estímulos neuronais, tais como: despolarização (SUKHATME et al.,
1988), exposição e privação de estímulos luminosos (ZANGENEHPOUR;
CHAUDHURI, 2002), estimulação farmacológica (LANAUD et al, 1993), e o contato
com diversos paradigmas comportamentais (MALKANI; ROSEN, 2000).
Zangenehpour e colaboradores (2002) avaliaram os níveis de RNAm no córtex
visual de ratos após um estímulo luminoso, descrevendo um pico de expressão
30min após o estímulo inicial, enquanto a proteína só pode ser detectada 120min
depois. Katche e colaboradores (2012) revelaram um aumento dos níveis
hipocampais de Zif-268 em roedores, 3h após o treino em uma esquiva inibitória.
Essa alteração foi observada principalmente em CA1.
De acordo com esses trabalhos, podemos supor que, na região CA3, os
animais NV exibiram uma expressão basal. Nos grupos VH e halo, ocorreu um
estímulo mnemônico através do contato com objetos novos, o qual induziu a
expressão de novas proteínas durante a fase de vigília subsequente a exploração.
Por isso, tanto os grupos VH quanto halo apresentaram níveis aumentados da
proteína Zif-268, quando comparados aos animais NV. Conforme revelado por uma
tendência marginal no ANOVA e teste T complementar, em CA1 apenas os animais
VH exibiram esse nível aumentado. Isso pode ser decorrente de uma inibição da
síntese proteica causada pela injeção de haloperidol em si, nas primeiras horas.
Outra possibilidade seria um efeito imediato desse tratamento na etapa de aquisição
da informação. Estudos futuros seriam necessários para revelar a influência do
58
haloperidol nos eventos precoces relacionados à cascata molecular, ativada após
exposição de novos objetos.
5.2.3 Níveis de CaMKII-P nos grupos6h e 12h
No intervalo de 6h após injeção, observamos uma menor fosforilação dessa
kinase no grupo halo, quando comparado ao VH e NV, nas três regiões do
hipocampo (figuras: 13 - linha A; 14D). Visto que esse nível permaneceu reduzido no
grupo de 12h (figuras: 13- linha A; 14G), iremos discutir ambos os resultados nesta
seção.
Em 6h e 12h após a injeção, CaMKII deve ter sido ressintetizada nos animais
VH, possivelmente no processo de consolidação dependente de sono, conforme
mencionado anteriormente. Em outras palavras, essa kinase parece desempenhar
uma função na cascata de plasticidade sináptica reativada durante o sono, sendo
importante para a consolidação de memórias.
Estudos recentes descreveram a participação da CaMKII no processo de
formação de marcações sinápticas, o que pode explicar a importância da
permanência de níveis elevados por tempo prolongado. A teoria da marcação
sináptica explica como os neurônios registram quais sinapses devem ser fortalecidas
e mantidas no estado ativado. Possivelmente, tal marcação consiste em um
processo que permite que as PRPs, mobilizadas durante o período de vigília e sono
pós-treino, sejam direcionadas para as sinapses apropriadas (HERNANDEZ; ABEL,
2011; LUCCHESI et al., 2011).
Os dados do presente estudo não foram suficientes para esclarecer
completamente se ocorreram dois períodos de reexpressão de CaMKII-P (em 6h e
12h) ou se o nível dessa kinase foi parcialmente restaurado por volta de 3h e
permaneceu aumentando até 12h. Lismane & Zhabotinsky (2001) propuseram um
modelo capaz de explicar uma possível expressão sustentada de CaMKII-P. Eles
descreveram um sistema CaMKII/fosfatase-1que parece funcionar como uma chave
biestável, a qual pode ser ativada durante a indução de LTP e permanecer nesse
estado, apesar da renovação proteica (turn-over). A ação das fosfatases parece
contrabalançar adequadamente a atividade de CaMKII, através da desfosforilação
de αCaMKII no resíduo T286. De acordo com esse modelo, a densidade pós-
sináptica, que apresenta elevada concentração dessa kinase, funciona como um
compartimento bioquímico isolado, no qual pode ocorrer a saturação das fosfatases
59
disponíveis. Consequentemente, após mais de 8 das 12 subunidades serem
fosforiladas em T268 e se tornarem independentes de Ca2+, um estado ativado
prevalece. Quando isso ocorre, as fosfatases já saturadas não podem mais atuar na
desativação dessas kinases. Por outro lado, alguns estudos indicaram outras formas
de desativar CaMKII, de modo independente da participação de fosfatases.
Conforme descrito por LEPICARD et al (2006), as proteínas CaMKIINα e CaMKIINβ
funcionam como inibidores endógenos, capazes de bloquear a atividade de CaMKII-
P mais rapidamente. Eles mostraram que o RNAm, associado a esses inibidores, foi
expresso em roedores 30min após uma tarefa de condicionamento contextual ao
medo. Já no nosso estudo, o aumento dos níveis de CaMKII-P parece ocorrer em
ciclos de ativação, depleção e reposição ou reativação.
Baseando-se nisso, propomos que a recorrência de episódios de sono REM
ao longo do tempo possibilitou o restabelecimento progressivo, através de síntese
proteica, dos estoques de CaMKII-P nos animais VH, os quais voltaram a atingir
níveis basais (grupo NV) por volta das 6h após injeção. Ao analisarmos os grupos
após 12h, já verificamos nos animais VH níveis de CaMKII-P acima dos valores
basais (figura 15A), possivelmente devido a ocorrência de uma reativação da
cascata, de modo dependente do sono. Da mesma forma, a comparação VH
intertempos da marcação de CaMKII-P, em CA1 e CA3, mostrou uma nítida redução
dos níveis em 3h, quando comparado aos demais tempos. No GD, essa redução em
3h foi também observada em relação ao grupo NV (figura 15A).
Com relação à comparação intertempo dos grupos halo (figura 15D), o
principal resultado encontrado foi uma redução da expressão nos grupos halo 3h e
6h, quando comparados com o NV. Em CA1, observamos que o intervalo de 12h
após injeção parece ser suficiente para restaurar os níveis basais nos animais
tratados com haloperidol, visto que tal grupo apresentou um nível de expressão
similar ao NV e, consequentemente, as mesmas diferenças em relação aos grupos
halo 3h e 6h. Além disso, concluímos que esse tratamento inibiu a reativação de
CaMKII-P em 12h, já que os níveis de halo 12h atingiram valores basais (NV), mas
ainda permaneceram abaixo do nível observado no grupo VH 12h. Nas regiões GD e
CA3, pudemos observar um perfil similar de redução nos níveis de expressão em 3h
e 6h, seguidos por um aumento tardio em 12h. Contudo, esse perfil não foi tão
pronunciado quanto em CA1.
60
Resumidamente, acreditamos que a CaMKII participa de eventos recentes
após a exposição, sendo rapidamente ativada pelo estímulo mnemônico. Nas 3
horas subsequentes, o estoque inicial de kinase foi depletado, apresentando níveis
abaixo dos basais. Em torno de 6h após o estímulo inicial, os estoques de CaMKII-P
foram completamente restaurados através de síntese proteica de novo, cuja
ocorrência parece ocorrer de modo sono-dependente. Em 12h, provavelmente
ocorreu uma reativação da cascata bioquímica, resultando em níveis acima da
expressão basal.
5.2.4 Níveis de Zif-268 nos grupos 6h e 12h
Considerando-se o intervalo de 6h após a injeção, observamos uma redução
da expressão hipocampal no grupo halo, ao ser comparado com os animais VH e
NV (figura 14E e 16B). Esse resultado revela a ocorrência de uma reexpressão
dessa proteína, possivelmente dependente de episódios de sono.
Foi descrito na literatura que, durante o sono, especialmente o REM, genes
imediatos podem ser reativados em resposta a experiências que ocorreram na vigília
precedente, induzindo o processo de síntese proteica de novo. Possivelmente, isso
ocorre como um mecanismo de plasticidade sináptica relacionado ao processo de
consolidação de memórias (RIBEIRO et al., 1999; HERNANDEZ; ABEL, 2011).
Alguns estudos contribuíram para confirmar essa hipótese. Foi demonstrado que o
bloqueio da síntese proteica durante o sono impede a retenção de memórias
(GUTWEIN et al., 1980), sugerindo que a função mnemônica do sono é dependente
de síntese proteica de novo, a qual é capaz de promover modificações duradouras
nas sinapses (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993). Ribeiro e colaboradores (1999)
mostraram uma reativação hipocampal de Zif-268, durante o sono REM, em animais
expostos a objetos novos na vigília precedente. Eles relataram que,
aproximadamente 30min após o início do sono REM, esses animais exibiram uma
maior expressão do RNAm Zif-268, no córtex e hipocampo, em comparação aos
animais naïve (não expostos).
Considerando-se a possível reativação da cascata molecular durante o sono
REM, associada ao controle dopaminérgico do sono, propomos que o tratamento
com haloperidol inibiu o sono REM (mostrado no item I do Apêndice) e,
consequentemente, a expressão de Zif-268 durante essa fase, o que prejudicou o
processo de consolidação de memórias. Como resultado, os animais pertencentes
61
ao grupo halo apresentaram um déficit mnemônico nas análises comportamentais,
conforme descrito anteriormente. Associado a isso, esses animais também exibiram
uma expressão reduzida de Zif-268, em relação aos animais VH (figuras 14E e 16B).
Nós consideramos o período de 6h suficiente para a ocorrência de síntese
proteicade novo, pois, logo após a exposição aos objetos, os animais foram levados
de volta ao biotério para que prosseguissem no seu ciclo sono/vigília normal.
A comparação intertempodos grupos VH (figura 15E e 16D) nos permitiu
concluir que em 3h ocorreu um pico de expressão de Zif-268, ativado ainda no
período de vigília e induzido pelo estímulo mnemônico, visto que o nível observado
no grupo VH 3h foi superior ao NV e VH 6h.Em torno de 6h, possivelmente o
estoque de proteína foi restaurado de modo dependente do sono, retornando aos
níveis basais (NV) em CA1 e CA3. Doze horas após a injeção, os níveis de Zif-268
permaneceram similares aos basais. Nós sugerimos que no grupo halo,
provavelmente, o estoque da proteína Zif-268 não pode ser reposto em 6h, devido à
supressão do sono REM e da síntese proteica (figuras 15E e 16E).
Em um intervalo de 12h, ANOVA não revelou diferenças entre os grupos
(figuras 14H e 16C). Nós supomos, nesse caso, que os animais pertencentes ao
grupo halo foram capazes de restaurar o estoque de Zif-268 nos intervalos de sono
que ocorreram entre 6 e 12 horas após injeção, já que a supressão do sono REM
mediada pelo haloperidol só durouem média 4-6 horas (DZIRASA et al., 2006) (ver
item I do Apêndice). Contudo, de acordo com nossos dados, não podemos inferir se
a expressão no grupo VH 12h representou um terceiropico de reexpressão ou se foi
basicamente a quantificação das moléculas já existentes, detectadas no intervalo de
6h (figuras 15B e 16D).
De modo conciso, nós propomos que a exposição aos novos objetos também
induziu a expressão da proteína Zif-268, durante o período de vigília subsequente.
Isso resultou em um pico de expressão 3h após o estímulo inicial. Seis horas depois,
os níveis da proteína retornaram à condição basal, possivelmente dependendo de
eventos que ocorrem durante o sono. Após 12h, o nível de expressão dos animais
VH permaneceusimilar ao NV, enquanto nos animais halo parece ter ocorrido uma
compensação de síntese proteica no intervalo entre 6-12h.
62
5.2.5 Níveis de BDNF em 3, 6 e12h
Visto que a análise em 3 e 6 horas não revelou diferenças significativas entre
os grupos, o foco da discussão será o período de 12h após injeção. Nesse ponto,
ANOVA indicou uma redução no grupo halo, quando comparado com VH, apenas na
região GD (figura 14I). Nossos resultados estão de acordo com os trabalhos
publicados por Bekinschtein et al (2007, 2009), os quais demonstraram que, 12h
após a aquisição de memórias, ocorre uma fase de síntese proteica dependente da
expressão de BDNF, no hipocampo de ratos. Essa fase tardia parece ser crítica para
o armazenamento de memórias de longo prazo, mas não para a etapa de formação
das mesmas. Esse grupo de pesquisadores revelou que a infusão intra-hipocampal
de anisomicina, um inibidor de síntese proteica, 12h após o treino em uma tarefa de
aprendizado associativo, não acarretou prejuízos mnemônicos no segundo dia pós-
treino. Por outro lado, a análise após 7 dias revelou um déficit no aprendizado. Além
disso, eles descreveram um aumento da expressão da proteína BDNF, 12h após a
aquisição de memórias, o qual foi inteiramente revertido pela infusão de anisomicina.
Visando confirmar a função de BDNF no processo de consolidação de memórias em
roedores, eles bloquearam a expressão do gene BDNF com um oligonucleotídeo
antisense, 10h após o treino em esquiva inibitória. Esse tratamento impediu o
aumento da expressão da proteína BDNF, 12h após o treino, bem como prejudicou a
persistência da memória até o sétimo dia após a aquisição, sem causar nenhum
déficit no segundo dia pós-treino. Ainda, a infusão de BDNF humano recombinante
foi capaz de reparar tal déficit, quando administrado 12h após o treino. Como
podemos perceber, a expressão hipocampal de BDNF ocorre em intervalos restritos
após a ativação de uma cascata inicial de memória de longo-prazo, com o objetivo
de garantir um armazenamento eficaz para que a memória persista ao longo dos
dias.
Além da conformidade quanto ao instante temporal, a expressão diferencial
de BDNF no GD, demonstrada no nosso estudo (figura 14I), também está de acordo
com alguns estudos que correlacionam causalmente essa proteína à função de
separação de padrões, desempenhada pelo GD (BEKINSCHTEIN et al., 2010;
O’REILLY; MCCLELLAND, 1994). O cérebro de mamíferos deve ser capaz de criar
representações mnemônicas distintas ou menos confusas a partir de eventos
similares, tornando possível a distinção entre eles. Dessa forma, o processamento
63
computacional responsável por transformar padrões similares em formas mais
distintas entre si é conhecido como separação de padrões (LEUTGEB et al., 2007).
Estudos recentes têm sugerido que o GD é essencial para esse processo.
Bekinschtein et al (2010) injetou anticorpos bloqueadores de BDNF no GD, visando
demonstrar que danos na função de BDNF podem acarretar prejuízos no
aprendizado em um teste de reconhecimento espontâneo de localização. Contudo,
esse déficit foi observado somente quando os animais tiveram que distinguir duas
localizações similares dentro de um campo aberto, e não quando tais localizações já
eram mais distintas entre si. Dessa forma, a consolidação de memórias de
representações espaciais similares requer tanto a atividade quanto a expressão
dessa molécula. Na medida em que as localizações se tornaram mais similares, o
tratamento com BDNF recombinante no GD aumentou a separação de padrões
(BEKINSCHTEIN et al., 2010). Posteriormente, esse mesmo grupo de
pesquisadores expôs ratos a dois objetos, delimitando tanto localizações espaciais
similares quanto distintas, dentro de um campo aberto. Quando os ratos exploraram
duas localizações similares, a expressão de BDNF no GD aumentou até 4 vezes. O
mesmo não foi observado após a exploração de localizações distintas. Dessa forma,
os níveis da proteína BDNF parecem aumentar espontaneamente, a fim de separar
as representações de eventos similares (BEKINSCHTEIN et al., 2011).
Conforme mencionado anteriormente em nossos resultados, também houve
uma tendência no ANOVA, que foi posteriormente confirmada pelo teste T,
revelando que a expressão reduzida de BDNF no grupo halo também foi observada
em CA3 (figura 14I). Alguns estudos descreveram a ocorrência de uma
conectividade entre GD e CA3, sugerindo que essas duas regiões devem atuar
juntas na separação de padrões (LEUTGEB et al., 2007; O’REILLY; MCCLELLAND,
1994).
Outros estudos foram delineados para descrever a correlação entre BDNF e
outras moléculas envolvidas na cascata bioquímica de plasticidade. Foi descrito que
a expressão de BDNF pode depender de uma interação com o receptor NMDA, o
qual, por sua vez, interage com CaMKII. Dessa forma, o bloqueio de NMDA e
CaMKII aboliu completamente o aumento pós-exercício dos níveis de RNAm da
sinapsina I e do receptor TrkB, bem como reduziu os níveis de RNAm de CREB e
BDNF (VAYNMAN et al., 2003).
64
Complementarmente, o bloqueio da expressão de BDNF, 12h após uma
tarefa comportamental, impediu um aumento tardio dos níveis das proteínas c-Fos e
Zif-268, o qual deveria ocorrer 24h após o estímulo inicial. Isso sugere que uma fase
dependente de BDNF é necessária para armazenar memórias de longo prazo.
Considerados conjuntamente, esses estudos indicam que outra reativação da
cascata bioquímica deve ocorrer em 12h, de modo dependente de BDNF (figura
14I), levando ao pico de expressão de CaMKII-P observado no nosso estudo, o qual
é seguido por um aumento tardio dos níveis da proteína Zif-268 (intervalo de tempo
não avaliado no nosso estudo).
Visto que os estudos mencionados estão em conformidade com nossos
resultados, propomos que a ocorrência regular de sono REM possibilitou a
consolidação sináptica nos animais do grupo VH. Por isso, tais animais tiveram um
melhor desempenho em comparação com aqueles pertencentes ao grupo halo, ao
serem avaliados 24h depois no TPON.
As comparações VH intertempo exibiram níveis crescentes de BDNF ao longo
das 12h subsequentes ao estímulo inicial (figura 15C). Por outro lado, o tratamento
com haloperidol parece interromper esse aumento em 12h, como podemos observar
nos níveis reduzidos do grupo halo 12h, quando avaliados na comparação halo
intertempo (figura 15F). Em consonância, nesse mesmo intervalo de tempo,
encontramos diferenças entre os grupos VH e halo (figura 14I). Isso nos permite
concluir que, conforme descrito nos estudos de Bekinschtein, a expressão de BDNF
associada ao estímulo mnemônico ocorre tardiamente, durante um intervalo de
tempo restrito.
Como resultado, considerando a cinética de expressão hipocampal de BDNF,
em 3h após o estímulo inicial seu nível foi levemente reduzido em relação ao basal.
Ao longo do período de 12h, os níveis da proteína foram restaurados, possivelmente
de modo dependente do sono. Em 12h, uma reexpressão de BDNF, associada à
consolidação de memórias, provavelmente acarretou o pico de CaMKII-P encontrado
nas nossas análises.
Por fim, propomos um modelo para a sequência de eventos moleculares
observadosnos animais VH, após a exposição aos objetos (figura 20). Acreditamos
que nos 30min iniciais ocorreu a fase precoce da LTP, conforme descrito na
introdução, na qual ocorreu a fosforilação de CaMKII, levando a níveis superiores
aos basais. Nesse intervalo temporal,os animais veículo exibiram marcações de Zif-
65
268 e BDNF nos mesmos níveis do grupo basal, visto que essas proteínas só são
expressas após um intervalo de tempo mais prolongado.
Desse modo, na fase tardia da LTP, que ocorreu provavelmente entre 30min
e 3h, houve os eventos de transcrição e tradução de Zif-268, numa cascata induzida
pelo estímulo mnemônico, ainda na fase de vigília. Por essa razão, os animais VH
exibiram níveis proteicos acima do basal em 3h. Além disso, nesse mesmo intervalo
provavelmente ocorreu a reposição parcial do estoque de CaMKII-P,o qual havia
sido depletado na fase precoce. Essa reposição parece ter ocorrido de modo
dependente de sono,o que justificaria o fato dos animais VH terem exibido níveis
intermediários, apresentando-se da seguinte forma: superior ao grupo halo, devido à
supressão farmacológica de sono REM induzida nesses animais; e inferior ao basal,
possivelmente porque os episódios de sono não foram suficientes para uma
reposição integral dessa kinase. Ainda em 3h, a expressão de BDNF permaneceu
em um nível basal.
Entre 3 e 6h, provavelmente ocorreu a reposição de Zif-268, depletado devido
ao pico em 3h, atingindo os valores basais em 6h. Quanto à CaMKII-P, nesse
intervalo de tempo parece ter ocorrido a reposição integral, visto que os estoques
dessa kinase atingiram os mesmos valoresbasais nesse intervalo de tempo. Com
relação ao BDNF, sua marcação se apresentou similar ao grupo basal.
Em 12h, observamos um pico de expressão tardia de BDNF, acompanhado
de uma reativação de CaMKII-P. A análise da figura 5, descrita anteriormente na
introdução, nos permite relacionar a expressão das duas moléculas supracitadas,
pois a ligação do BDNF ao seu receptor desencadeia uma cascata intracelular, a
qual culmina na expressão de CaMKII-P, numa fase precoce (ainda em 12h). Nesse
mesmo intervalo, os níveis de Zif-268 permaneceram similares aos basais.
Posteriormente, entre 12-48h, supomos que essa cascata desencadeada pelo BDNF
apresente uma fase tardia, na qual pode haver a expressão de outras PRPs,
inclusive com a ocorrência de um novo pico de Zif-268.
66
Figura 20: Modelo para a cascata de eventos moleculares após a exposição. Está representada acima uma linha temporal descrevendo uma hipótese para os eventos que ocorreram nas 48h iniciais, após o contato dos animais VH com os objetos novos. Logo abaixo, podem ser visualizados os níveis da marcação para as proteínas CaMKII-P, Zif-268 e BDNF, os quais se apresentaram inferiores, iguais ou superiores aos basais (grupo naïve) ao longo do tempo.
67
6 CONCLUSÕES
Os camundongos exibiram habilidades distintas de evocação de memórias,
dependendo do período claro-escuro de ocorrência do estímulo mnemônico. Quando
apresentadas noperíodo diurno, as informações referentes aos objetos são
retomadas, 24h depois, de modo mais eficiente do que aquelas apresentadas à
noite. O tratamento com haloperidol inibiu a preferência por objetos novos apenas
nos animais testados na fase clara, na qual há uma maior ocorrência de sono em
roedores.
Além disso, esse fármaco também inibiu a expressão hipocampal de PRPs
em diferentes pontos temporais: 3h (CaMKII-P); 6h (CaMKII-P e Zif-268); e 12h
(CaMKII-P e BDNF). A ativação de CaMKII parece ocorrer rapidamente após um
estímulo inicial, o que apoia o fato da mesma estar envolvida precocemente na
cascata de plasticidade. Provavelmente, uma fase de reativação ocorre 12h depois,
o que pode estar associado à expressão de BDNF especificamente nesse mesmo
intervalo de tempo.
Estudos futuros precisarão investigar outras proteínas envolvidas nessa
cascata mnemônica, tais como CREB, PKA e PLC, visando esclarecer a sequência
temporal de eventos moleculares ocorridos no hipocampo, em resposta ao estímulo
mnemônico proveniente do contato com objetos novos.
68
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APÊNDICE
I) DADOS ELETROFISIOLÓGICOS:
De forma resumida, os camundongos foram sedados com isoflurano inalatório
e receberam atropina intraperitoneal para controlar o excesso de secreções que
poderia dificultar a respiração. Cada animal recebeu um implante de uma matriz com
16 eletrodos feitos de microfilamentos de tungstênio cobertos por teflon e espaçados
a intervalos de 300µm. A estrutura alvo para o implante foi o hipocampo dorsal
direito, cuja localização foi dada pelo atlas para cirurgia estereotáxica (PAXINOS e
FRANKLIN, 2001).Os animais se recuperaram no pós-cirúrgico por uma semana e,
após esse período, foram colocados individualmente na caixa de registro vazia por
cinco dias consecutivos, para habituação, recebendo, nesse período, água e ração
ad libitum (ciclo claro-escuro 12/12h, luzes apagadas às 18:00h). A classificaçãodos
estágios de sono-vigília do animal foi realizada através de um algoritmo de
discriminação de estados previamente descrito (GERVASONI D. et al, 2004).
Basicamente, esse algoritmo faz uma classificação online, com atraso menor que 1
segundo, dos estados do ciclo sono-vigília. O método permite identificar o estado
global do animal, a cada instante, como a posição de um ponto no plano cuja
coordenada é dada por duas razões distintas de potências espectrais específicas
provenientes dos sinais de PCL do hipocampo. Como mostrado em (GERVASONI
D. et al, 2004), este mapeamento do espectro de potência revela aglomerados
específicos para cada estágio do sono, viabilizando sua classificação automática,
rápida e perfeitamente replicável. Dessa forma, foi possível verificar se a
administração do haloperidol promoveu alterações em alguma fase do ciclo sono-
vigília desses animais. Após a conclusão dos experimentos, a confirmação do
posicionamento das matrizes foi feita através da coloração de Nissl (Cresil-violeta)
(figura 17).
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Figura 17: Implante de eletrodos no hipocampo. Coloração de Nissl evidenciando os sinais deixados
pelos eletrodos na região CA1 do hipocampo de camundongos.
A comparação entre os dados moleculares e os dados eletrofisiológicos
obtidos é importante para avaliar a possível relação existente entre a redução do
sono REM e o prejuízo nas vias moleculares de plasticidade sináptica. Os dados
eletrofisiológicos, obtidos a partir de experimentos piloto, mostraram que
camundongos C57BL-6, tratados com haloperidol (0,3 mg/Kg), tiveram uma redução
de sono REM nas primeiras quatro horas após a administração intraperitoneal
(Figuras 18 e 19).
Figura 18: Comparação dos mapas de estado bidimensionais de animais VH e halo. Obtidos a partir de registros eletrofisiológicos hipocampais em camundongos pertencentes aos grupos VH e halo. A fase REM de sono, selecionada em verde, está reduzida nos animais haloquando comparada aos animais VH, nas primeiras quatro horas de registro neuronal.
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Figura 19:Comparação da duração dos estágios de vigília, SWS e REM. Diferença significativa entre o tempo gasto no sono REM, evidenciando uma supressão dessa fase mediada pelo haloperidol, nas primeiras 4h pós-injeção (*p<0,05).