UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA

MARCELLE SUSANNE SANTOS FRANÇA

RESISTÊNCIA BACTERIANA EM BACILOS GRAM – NEGATIVOS:

A IMPORTÂNCIA DOS TESTES FENOTÍPICOS

Natal - RN

Novembro/2017

RESISTÊNCIA BACTERIANA EM BACILOS GRAM – NEGATIVOS: A IMPORTÂNCIA DOS TESTES FENOTÍPICOS

por

MARCELLE SUSANNE SANTOS FRANÇA

Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto

Natal - RN

Novembro /2017

Monografia Apresentada à Coorde-nação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

CURSO DE BIOMEDICINA

A Monografia Resistência bacteriana em bacilos Gram – negativos: a importância dos testes fenotípicos elaborada por Marcelle Susanne Santos França e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à ob-tenção do título de BACHAREL EM BIOMEDICINA Natal, 30 de novembro de 2017 BANCA EXAMINADORA _________________________________________

Prof. Dr. Renato Motta Neto Departamento de Microbiologia e Parasitologia – CB/UFRN

(Orientador) _________________________________________

Prof. Drª. Cecília Maria de Carvalho Xavier Holanda Departamento de Microbiologia e Parasitologia – CB/UFRN

(1º examinador) _________________________________________

Me. Bárbara Monique de Freitas Vasconcelos Departamento de Bioquímica – CB/UFRN

(2º examinador)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos aqueles que me apoiaram na difícil trajetória que foi completar

esse Trabalho de Conclusão de Curso. Agradeço aos meus pais que me apoiaram

de forma direta e indireta em seu desenvolvimento e também ao meu orientador,

Renato Motta, que acreditou no meu potencial mesmo não tendo experiência na

área.

Agradeço também a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, por me fornecer

diversas ferramentas que me permitiram alcançar esse conhecimento. Além disso,

não conseguiria ter escrito uma só linha deste trabalho sem a ajuda de meus amigos

queridos e colegas de curso, desta forma, agradeço a Lucas, Luiz, Leonardo,

Rayran, Adriane, Isabela e, principalmente, a meu namorado Pedro que me forneceu

todo o apoio emocional que eu precisava, estando sempre ao meu lado e me

ajudando em momentos de desespero.

Por fim, agradeço a todos os integrantes do laboratório do Hospital Universitário Ana

Bezerra por terem me acolhido carinhosamente e me dado apoio na construção

desse trabalho, mesmo de forma indireta. Não teria conseguido realizar o estágio

concomitante com o desenvolvimento do TCC sem vocês.

RESUMO

Os bacilos Gram-negativos costumam ser participantes frequentes em infecções

hospitalares, principalmente de pacientes imunossuprimidos. Dessa forma, são

organismos muito expostos a tentativas de tratamento, sendo os beta-lactâmicos a

classe mais utilizada contra os mesmos. Isso muitas vezes pode levar a casos de

multirresistência, tanto a diversos tipos de beta-lactâmicos como também a outras

classes, pois essas bactérias podem apresentar diversos mecanismos que a tornam

capaz de inibir ou reduzir o efeito de um antimicrobiano. Este trabalho objetivou

realizar uma revisão bibliográfica sobre a resistência bacteriana em bacilos Gram-

negativos, em bases de dados científicas, afim de reunir conhecimento sobre esse

assunto. Os principais testes fenotípicos utilizados para a detecção de resistência

nessas bactérias são as técnicas de disco difusão, disco aproximação para beta –

lactamases de espectro estendido (ESBL), teste de detecção para enzimas

cromossômicas (AmpC), teste do EDTA para metalo-beta-lactamases (MBL) e teste

para carbapenemases. Entretanto, como esse tipo de teste pode ser de difícil

interpretação quando existe a produção de ESBL e metalo-beta-lactamases, por

exemplo, a busca por novos testes fenotípicos que sejam mais sensíveis,

específicos e rápidos se mantém constante. Os principais mecanismos de

resistência são alteração de permeabilidade, alteração do sítio de ação do fármaco,

expressão de bombas de efluxo, alteração nas vias metabólicas e produção de

enzimas que inibem a ação do antibacteriano, sendo essa produção de enzimas o

mecanismo mais frequente e que conta com as ESBL, AmpC, MBL e

carbapenemases, como a KPC. Esse tipo resistência vem se espalhando pelo

mundo e também pelo Brasil, onde conta com grande prevalência de ESBLs do tipo

CTX-M e metalo-beta-lactamases. Dessa forma, a interpretação correta dos testes

fenotípicos pode ajudar, de forma significante, na redução de indução de resistência

e na formação de um banco de dados epidemiológicos, mesmo que os utilizados

ainda não sejam ideais, sua realização na prática clínica ainda apresenta grande

valor.

Palavras – chave: Resistência bacteriana, Bacilos gram negativos, Testes

fenotípicos, ESBL, AmpC, MBL, KPC.

ix

ABSTRACT

Gram-negative bacilli are often frequent participants in hospital infections, mainly

immunosuppressed patients. In this way, they are very exposed to treatment at-

tempts, with beta-lactams being the most used class against them. This can often

lead to cases of multidrug resistance, both to various types of beta-lactams and to

other classes, as these bacteria may have several mechanisms that make it capable

of inhibiting or reducing the effect of an antimicrobial. This work aimed to carry out a

bibliographic review on bacterial resistance in Gram-negative bacilli, in scientific da-

tabases, in order to gather knowledge about this subject. The main phenotypic tests

used for the detection of resistance in these bacteria are disc diffusion techniques,

disk approach for extended spectrum beta-lactamases (ESBL), detection test for

chromosomal enzymes (AmpC), EDTA test for metallo-beta-lactamases (MBL) and

test for carbapenemases. However, since this type of test can be difficult to interpret

when there is production of ESBL and metallo-beta-lactamases, for example, the

search for new phenotypic tests that are more sensitive, specific and fast remains

constant. The main mechanisms of resistance are alteration of permeability, altera-

tion of the site of action of the drug, expression of efflux pumps, alteration in the met-

abolic pathways and production of enzymes that inhibit the action of the antibacterial,

being this enzyme production the most frequent mechanism and that ESBL, AmpC,

MBL and carbapenemases, such as KPC. This type of resistance is spreading

throughout the world and also in Brazil, where it has a high prevalence of ESBLs of

type CTX-M and metallo-beta-lactamases. Thus, the correct interpretation of the

phenotypic tests can significantly contribute to the reduction of resistance induction

and to the formation of an epidemiological database, even if those used are still not

ideal, and its clinical practice still presents great value.

Key words: Bacterial resistance, Gram - negative bacilli, Phenotypic tests, ESBL,

AmpC, MBL, KPC.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. ix

LISTA DE TABELAS ........................................................................................ x

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ xi

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 13

1.2. Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 17

1.3. Antimicrobianos ............................................................................................... 19

1.3.1. Beta - lactâmicos ...................................................................................... 19

1.3.2. Aminoglicosídeos ...................................................................................... 20

1.3.3. Macrolídeos .............................................................................................. 21

1.3.4. Tetraciclinas .............................................................................................. 21

1.3.5. Lincosaminas ............................................................................................ 22

1.3.6. Glicopeptídeos .......................................................................................... 22

1.3.7. Rifamicinas ............................................................................................... 22

1.3.8. Sulfonamidas e trimetoprim ...................................................................... 22

1.3.9. Quinolonas e fluoroquinolonas ................................................................. 23

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 24

2.1. Objetivo geral .................................................................................................. 24

2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 24

3. METODOLOGIA .................................................................................................... 25

3.1. Tipo de estudo ................................................................................................ 25

3.2. Obtenção dos dados ....................................................................................... 25

3.3. Técnica para detecção do perfil de sensibilidade a antimicrobianos (Técnica

de Kirbe bauer) ...................................................................................................... 25

3.4. Técnicas específicas para detecção de resistência ........................................ 29

3.4.1. Técnica para detecção de ESBL............................................................... 29

3.4.2. Técnica para detecção de metalo – beta – lactamase ............................. 30

3.4.3. Teste de Hodge modificado ...................................................................... 31

3.4.4. Técnica para detecção de AmpC induzível ............................................... 32

3.4.5. Técnica modificada para detecção de ESBL ............................................ 33

3.4.6. Técnica para detecção de KPC em disco ................................................. 33

4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 34

4.1. Mecanismos de resistência em bacilos gram-negativos ................................. 34

4.1.1. Alteração da permeabilidade .................................................................... 34

4.1.2. Alteração do sítio de ação ........................................................................ 35

4.1.3. Expressão de bombas de efluxo ............................................................... 35

4.1.4. Alterações nas vias metabólicas ............................................................... 35

4.1.5. Produção de enzimas que inibem a ação ................................................. 36

4.1.5.1. AmpC .................................................................................................. 36 4.1.5.2. ESBLs ................................................................................................. 36 4.1.5.3. Carbapenemases ............................................................................... 38

5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 43

6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 44

ix

LISTA DE ABREVIATURAS ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC American Type Culture Collection

BaSO4 Sulfato de Bário

blaIMP-1 Gene codificante da Imipenemase-1

CDC Center for Disease Control and Prevention

CESP Citrobacter freundii, Enterobacter spp. , Serratia spp. , Providencia spp

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DHA Dhahran Hospital AmpC

DNA Ácido desoxirribonucleico

EARSS European Antimicrobial Resistance Surveillance System

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ESBL Beta – lactamase de espectro estendido

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz-RJ/Brasil

GES Guiana extended spectrum

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

MBL Metalo – beta - lactamase

MFPs Proteínas de fusão de membrana periplasmática

MHT Teste de Hodge Modificado

NHSN National Healthcare Safety Network

NMC/IMI not metalloenzyme carbapenemase/imipenem-hydrolyzing β-lactamase

OMFs Fatores de membrana externa

OXA oxacillin-hydrolyzing

RNA Ácido ribonucleico

SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends

SME Serratia marcescens enzyme

TMP Trimetoprim

UFC Unidades Formadoras de Colônia

UFP Universidade Fernando Pessoa/Portugal

UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul/Brasil

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte/Brasil

USP Universidade de São Paulo/Brasil

UTI Unidade de Terapia Intensiva

xi

LISTA DE QUADROS Quadro 1: Exemplo de leitura dos halos de inibição para alguns antimicrobianos de acordo com o CLSI. ................................................................................................... 28

xii

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fluxograma sobre a descoberta e introdução dos antimicrobianos e o

consequente surgimento de resistência a eles em bactérias. ................................... 15

Figura 2: Exemplos de mecanismos de transferência de genes de resistência. ....... 16

Figura 3: Alvos dos antimicrobianos nas bactérias. ................................................... 21

Figura 4: Suspensão bacteriana 0,5 na Escala McFarland. ...................................... 26

Figura 5: Semeio em ágar Mueller - Hinton para disco difusão. ................................ 26

Figura 6: Organização dos discos de antimicrobianos. ............................................. 27

Figura 7: Visualização da placa com discos de antimicrobianos após o tempo de

incubação. ................................................................................................................. 28

Figura 8: Visualização de zona fantasma (setas) em relação ao disco de amoxacilina

+ ácido clavulânico ao centro. ................................................................................... 30

Figura 9: Visualização de aumento no halo de sensibilidade no teste do EDTA. ...... 31

Figura 10: Visualização de zona de entroncamento (setas) próximo ao disco de

meropenem ao centro. Técnica para detecção de carbapenemases em

enterobactérias. ......................................................................................................... 32

Figura 11: Mecanismos de resistência na célula bacteriana. .................................... 34

13

1. INTRODUÇÃO

Em ambientes hospitalares, infecções bacterianas geralmente estão em destaque.

A busca de tratamento eficaz contra esses organismos é árdua e constante, devido a

um grande mal que vem se espalhando por todo o mundo: a resistência a

antimicrobianos (AZEVEDO, 2014).

Após a segunda metade do século XIX, cientistas como Robert Koch puderam

identificar os germes causadores e seus ciclos de vida em diversas doenças, como a

tuberculose, cólera e febre tifoide. Métodos de vacinação eram estudados e

substâncias com atividade antibiótica efetiva eram buscadas. O pai da quimioterapia,

Paul Ehrlich, foi quem criou o princípio da mesma: um antibiótico deveria interferir

diretamente na proliferação bacteriana em doses toleradas pelo hospedeiro.

Também foi o primeiro a descobrir que o corante vermelho de tripan era capaz de

ajudar a destruir os tripanosomas causadores da doença do sono nas pessoas. A

descoberta de que compostos arsênicos eram capazes desse efeito iniciou a procura

por um composto que pudesse curar a sífilis. Após muito estudo, a arsfenamina (ou

Salvarsan) foi oferecida ao mundo como eficiente no tratamento da doença até a

descoberta da penicilina. A partir disso, a busca por novos compostos

antibacterianos se iniciou (PATRICK, 2013).

Em 1935, Gerhard Domagk descobriu que o corante vermelho prontosil era

efetivo contra infecções estreptocócicas, sendo criada a classe das sulfas, o único

antimicrobiano a ser usado contra infecções generalizadas até a descoberta da

penicilina (PATRICK, 2013). No entanto, as sulfas apresentam espectro de ação

limitado e são pouco usadas atualmente (GUIMARAES, 2010). Em 1928, Alexander

Flemming descobriu, por acaso, a capacidade do Penicillium notatum em inibir o

crescimento de Staphylococcus sp e, assim, deu-se a descoberta da penicilina.

Entretetanto, seu uso só se iniciou após a sua purificação, o que aconteceu em 1940

pelos cientistas Florey e Chain. A demonstração de que um fungo poderia produzir

um composto tóxico para bactérias impulsionou os cientistas na busca por outros

potenciais antimicrobianos (PATRICK, 2013).

Com o passar dos anos, novos compostos naturais foram descobertos e o

14

fabrico de sintéticos aumentou o arsenal de antimicrobianos até a descoberta da

genômica. Entretanto, segundo GUIMARAES (2010), houve uma redução dramática

na identificação de novos protótipos antibióticos, ao mesmo tempo em que ocorreu

um aumento na incidência de resistência bacteriana. A resistência é a capacidade de

um microrganismo se multiplicar mesmo na presença de concentrações de

antimicrobiano superiores aquelas usadas como doses terapêuticas nos humanos.

Isso ocorreu, principalmente, devido a uma prescrição exacerbada de antibióticos

para sintomas não necessariamente causados por bactérias, sendo um fator

importante na evolução da resistência causado por humanos (FAIR, 2014). O

fluxograma extraído do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Center for

Disease Control and Prevention), CDC, ilustra a descoberta dos antimicrobianos e

de suas respectivas resistências que surgiram em bactérias (Figura 1).

15

Figura 1: Fluxograma sobre a descoberta e introdução dos antimicrobianos e o consequente surgimento de resistência a eles em bactérias.

Adaptado de: Center for Disease Control and Prevention. Antibiotic Resistance Threats in the United

States, 2013. Disponível em: http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/pdf/ar-threats-

2013–508.pdf. Acesso em 14/09/2017

Dentro desse âmbito, há dois tipos de resistência a antimicrobianos em bactérias,

denominadas natural ou intrínseca e adquirida ou extrínseca. Resistência intrínseca

significa que cada membro de uma espécie determinada será resistente a um

composto sem que haja qualquer alteração genética adicional, sendo transmitido

verticalmente, ou seja, de uma bactéria para suas descendentes. Muitas espécies

16

bacterianas entéricas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, apresentam uma

sensibilidade muito baixa aos antibióticos hidrofóbicos, como os macrolídeos, pois

os mesmos apresentam dificuldade para penetrar a membrana externa desses

organismos (HENRIQUES NORMARK, 2002; MACEDO, 2016). Já a resistência

extrínseca ou adquirida ocorre por meio de mutações (mutações de ponto, deleções,

inversões, inserções, entre outras alterações genômicas) ou por mecanismos de

transferência horizontal, ou seja, por mecanismos em que uma bactéria transfere

uma resistência para outras bactérias, podendo ser da mesma espécie ou não. Os

mecanismos pelos quais os genes de resistência são adquiridos variam (Figura 2).

Os plasmídeos transferíveis podem ser muito grandes (> 150 kb) e conter uma

variedade de genes de resistência. Podem formar cointegrados com transposons

que incorporam um ou mais genes de resistência. Os elementos cromossômicos

também podem se transferir por conta própria ou ser mobilizados por plasmídeos

transferíveis (RICE, 2012). Além disso, a forma como a bactéria sofre uma mutação,

por exemplo, em bombas de efluxo, pode levar a uma multirresistência a diversos

fármacos (RICE, 2006).

Figura 2: Exemplos de mecanismos de transferência de genes de resistência.

Fonte:http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/modulo3

/mec_animacao.htm Acesso em 25/10/2017.

17

Segundo Magiorakos et al. (2012), uma bactéria é considerada multirresistente

quando não é susceptível a pelo menos um agente em três famílias de

antimicrobianos diferentes. Definição baseada em testes in vitro. É considerada

extremamente resistente quando não é susceptível a um agente de cada família,

exceto por duas ou menos; ou seja, quando é resistente a todos ou quase todos os

antimicrobianos aprovados para uso clínico. E, por fim, é considerada panresistente

quando não é susceptível a qualquer classe de antimicrobiano, incluindo aqueles

disponíveis comercialmente, os estudados na rotina laboratorial e os disponíveis

para tratamento empírico (MAGIORAKOS, 2012).

Dessa forma, além da busca por novos compostos antimicrobianos, a utilização

consciente dos fármacos já existentes e a pesquisa de resistência em cepas

responsáveis por infecções hospitalares, principalmente, se torna eficaz na luta

contra as bactérias. Sendo assim, é preciso conhecer os patógenos, seus

mecanismos de resistência e os testes já existentes e aprovados para a detecção

dessa resistência (KIM, 2017; MACEDO, 2016).

1.2. Bacilos Gram-negativos

O grande grupo das bactérias gram-negativas é composto por organismos que

apresentam o mesmo tipo de parede celular: uma camada fina de peptidioglicano e

uma membrana externa contendo lipopolissacarídeos, fosfolipídeos e proteínas.

Esse grupo se divide, majoritariamente, entre as enterobactérias e bacilos não

fermentadores. As enterobactérias são microrganismos ubiquitários que se

encontram em todo o mundo no solo, na água e na vegetação. Geralmente fazem

parte da microbiota normal da maioria dos animais, mas também são as bactérias

mais comumente associadas a infecções do trato urinário e intestinais. Já o grupo

dos não fermentadores também apresenta representantes ubíquos, porém as

infecções causadas por este grupo são frequentemente de caráter oportunista

(MURRAY, 2014).

As Enterobacteriaceae são bacilos móveis com flagelos peritríqueos, ou não são

móveis e nem formam esporos. São anaeróbios facultativos, catalase positiva,

oxidase negativa, fermentam glicose e reduzem o nitrato a nitrito. A medida da

atividade da enzima citocromo oxidase pode ser usada para diferenciar essas

18

bactérias de outras gram-negativas (MURRAY, 2014).

Os principais representantes dos bacilos gram – negativos não fermentadores são

Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanii. Membros do gênero

Pseudomonas também são ubíquos, mas, infelizmente, são também encontrados no

ambiente hospitalar em coleções úmidas, como alimentos, pias, banheiros,

equipamentos de terapia respiratória e de diálise e em soluções desinfetantes.

Apresentam exigência nutricional simples e versatilidade nutricional, ou seja, são

capazes de sobreviver na forma de biofilme sobre superfícies com poucos

nutrientes; sendo o biofilme uma estrutura que protege uma comunidade bacteriana

da ação de antimicrobianos e dos mecanismos imunológicos do hospedeiro. P.

aeruginosa é uma das bactérias com mais tipos de resistência intrínseca para

antimicrobianos, sendo a alteração de porinas o principal mecanismo. A. baumanii

também é um microrganismo ubíquo que pode sobreviver em campos úmidos, mas,

além disso, é capaz de sobreviver em superfícies secas, como a pele. Faz parte da

microbiota da orofaringe de poucos indivíduos sadios e podem se multiplicar durante

hospitalização (MURRAY, 2014).

Os dois grupos, entretanto, apresentam uma característica em comum que é a

capacidade de adquirir resistência a diversos tipos de antibacterianos, tanto de

forma vertical quanto horizontal e, dessa forma, com frequência utilizam mais de um

mecanismo para evitar a ação desses fármacos (ANVISA, 2007).

De acordo com dados da Rede Nacional de Segurança da Saúde (National

Healthcare Safety Network, NHSN), de 2009 a 2010, Escherichia coli (contando com

12% de participação nas infecções adquiridas em ambiente hospitalar), Klebsiella

pneumoniae e Klebsiella oxytoca (8%), Pseudomonas aeruginosa (8%) e espécies

de Enterobacter (5%) eram as causas mais comuns de infecções nosocomiais

causadas por gram – negativas nos Estados Unidos, em ordem decrescente

(MEHRAD, 2015).

Segundo o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Center for Disease

Control and Prevention, CDC), o impacto anual por infecções causadas por bactérias

resistentes é estimado em 20 bilhões de dólares em tratamento excessivo e 8

milhões de dólares por dias a mais de internação nos Estados Unidos. Enquanto na

19

Europa, segundo a Agência de Medicina Europeia (European Medicines Agency),

são gastos 1,6 bilhões de euros em tratamento e 2,5 milhões em dias adicionais na

União Europeia (FAIR, 2014).

1.3. Antimicrobianos

1.3.1. Beta – lactâmicos

Os antibióticos beta-lactâmicos atuam inibindo a enzima transpeptidase, presente

somente em bactérias. Essa enzima tem a função de catalisar a reação de

transpeptidação entre as cadeias de peptideoglicano da parede celular bacteriana.

Todos os antimicrobianos desse grupo apresentam um anel beta-lactâmico em

comum e, dessa forma, o principal mecanismo de resistência a eles se dá pela

produção de beta-lactamases. As penicilinas foram os primeiros representantes

dessa classe de antibióticos, sendo descoberta em 1928 por Alexander Flemming,

como falado anteriormente. Têm como representantes as penicilinas G e V,

amoxacilina e ampicilina, principalmente. Por mostrarem sensibilidade a beta-

lactamases, podem ter seu espectro de ação estendido quando usadas em conjunto

com inibidores dessas enzimas (GUIMARAES, 2010; GOODMAN, 2012).

Os beta-lactâmicos são mais ativos contra a fase logarítmica de crescimento e

exercem efeito reduzido em microrganismos em fase estacionária, quando não há a

necessidade de produção de componentes da parede celular (GUIMARAES, 2010;

GOODMAN, 2012). Em relação às bactérias gram - negativas, as quais apresentam

uma barreira lipídica, é mais difícil para o antimicrobiano chegar ao seu alvo, pois

deve passar através das porinas e, devido a isso, aqueles que apresentam grupos

ionizáveis em sua estrutura química terão maior atividade frente a essas bactérias

(GUIMARAES, 2010).

As cefalosporinas são os antimicrobianos beta-lactâmicos com maior uso clínico.

Sua classificação é dada por gerações: de primeira à quarta. As cefalosporinas de

primeira geração, cujas representantes são cefazolina e cefalotina, apresentam boa

atividade contra bactérias gram-positivas e moderada contra gram-negativas. As

cefalosporinas de segunda geração apresentam atividade superior contra

microrganismos gram-negativos em relação às de primeira geração, um exemplo é a

cefoxitina. Já as cefalosporinas de terceira geração possuem atividade reduzida

20

contra bactérias gram-positivas, mas maior ação contra as Enterobacteriaceae,

incluindo aquelas produtoras de beta – lactamase; um exemplo é a ceftazidima.

Enquanto as cefalosporinas de quarta geração, como a cefepima, apresentam

atividade superior em comparação com as de terceira e maior estabilidade à

hidrólise pelas beta-lactamases mediadas por plasmídeos e cromossomos

(GUIMARAES, 2010; GOODMAN, 2012).

Os carbapenêmicos exibem espectro de atividade superior em comparação com a

maioria dos outros antimicrobianos beta-lactâmicos. Isso se dá pela presença de um

anel beta-lactâmico fundido e de um sistema de anel de três membros que o

diferencia das penicilinas por ser insaturado e possuir um átomo de carbono no lugar

do de enxofre. Exemplos são o imipenem e o meropenem (GOODMAN, 2012).

Os monobactâmicos têm o aztreonam como principal representante. Ele interage

com proteínas de ligação da penicilina de microrganismos sensíveis, induzindo a

formação de estruturas bacterianas filamentosas. Sua atividade antimicrobiana é

mais semelhante a dos aminoglicosídeos, pois são ineficientes contra gram-positivos

e excelentes contra Enterobacteriaceae. Enquanto os inibidores de beta-lactamases

têm o ácido clavulânico como seu representante principal. O mesmo exibe baixa

atividade antimicrobiana intrínseca, mas atua ligando-se irreversivelmente a beta-

lactamases produzidas por diversos microrganismos, sendo assim utilizado em

conjunto com as penicilinas, por exemplo (GOODMAN, 2012).

1.3.2. Aminoglicosídeos

Os aminoglicosídeos possuem um grupamento amino básico e uma unidade de

açúcar. Apresentam efeito bactericida ao se ligarem à subunidade 30S dos

ribossomos das bactérias, bloqueando a sua movimentação no RNA mensageiro,

levando a erros de leitura e incorporação errônea de aminoácidos. Dessa forma,

impedem a síntese de proteínas bacterianas (Figura 3). Não atravessam a barreira

hematoencefálica de forma eficiente, sendo assim, não podem ser utilizados no

tratamento de meningites, a menos que sejam injetados diretamente. Esses agentes

são efetivos contra bactérias gram – negativas aeróbias e apresentam sinergismo

com beta – lactâmicos (GUIMARAES, 2010; GOODMAN, 2012).

21

Figura 3: Alvos dos antimicrobianos nas bactérias.

Adaptado de: FAIR, R. J.; TOR, Y., 2014.

1.3.3. Macrolídeos

Os macrolídeos são antibióticos que apresentam efeito bacteriostático ao se

ligarem ao RNA ribossomal 23S da subunidade 50S do ribossomo bacteriano,

bloqueando a síntese de proteínas (Figura 3) ao interferir no elongamento da cadeia

peptídica. Dessa forma, são antimicrobianos que inibem a proliferação bacteriana ao

bloquear a síntese de proteínas, deixando a tarefa de destruir as bactérias para o

sistema imunológico. São bastante utilizados contra infecções respiratórias, tendo a

eritromicina como representante principal. Entretanto, a mesma vem sendo

substituída por macrolídeos de segunda geração, pois apresentam espectro de ação

maior, melhor atividade e efeitos colaterais atenuados (GUIMARAES, 2010).

1.3.4. Tetraciclinas

As tetraciclinas são antimicrobianos bacteriostáticos que atuam sobre diversas

espécies bacterianas, aeróbias ou anaeróbias e gram-positivas ou gram-negativas.

Assim como os aminoglicosídeos, se ligam à subunidade 30S dos ribossomos,

impedindo a ligação do RNA transportador. Devido ao aumento de resistência frente

a essa classe, seu uso como primeira escolha vem diminuindo (GUIMARAES, 2010;

GOODMAN, 2012).

22

1.3.5. Lincosaminas

As lincosamidas funcionam pelo mesmo mecanismo de ação dos macrolídeos. A

clindamicina é o representante mais utilizado dessa classe, apresentam melhor

atividade e absorção quando administrado por via oral (GUIMARAES, 2010).

1.3.6. Glicopeptídeos

Os glicopeptídeos atuam na célula bacteriana inibindo a síntese da parede celular

(Figura 3) através da complexação com o resíduo dipeptídico terminal D-Alanil-D-

Alanina das cadeias peptídicas constituintes da parede. Isso impede que o substrato

esteja disponível para a enzima transpeptidase, inibindo a reação de

transpeptidação. São incapazes de atravessar a membrana de gram-negativos e,

por isso, somente são utilizados contra gram-positivos. A vancomicina geralmente é

utilizada como antimicrobiano de última escolha para infecções por gram-positivos

resistentes, mas já há relatos de resistência a ela (GUIMARAES, 2010, GOODMAN,

2012).

1.3.7. Rifamicinas

O mecanismo de ação da rifampicina se baseia na inibição da enzima RNA

polimerase (Figura 3), bloqueando a transcrição bacteriana. É usada clinicamente

como tratamento para a tuberculose, fazendo parte da combinação de fármacos

(GUIMARAES, 2010).

1.3.8. Sulfonamidas e trimetoprim

As sulfonamidas são agentes bacteriostáticos que atuam na inibição da síntese

do folato, cofator essencial para bactérias incapazes de absorvê – lo, pois é utilizado

na síntese de purinas. O sulfometoxazol é utilizado com frequência em associação

com o trimetoprim. O primeiro atua bloqueando a enzima di – hidropteorato

sintetase, impedindo que o ácido p-aminobenzoico seja incorporado a via de síntese

do folato. Já o segundo, inibe a enzima di – hidrofolato redutase, que reduz o folato a

tetraidrofolato para que sua forma reduzida seja utilizada em reações de

transferência de carbono. A utilização em associação dos dois fármacos, dessa

forma, inibe dois passos na via bioquímica desse cofator (GUIMARAES, 2010;

GOODMAN, 2012).

23

1.3.9. Quinolonas e fluoroquinolonas

Quinolonas e fluoroquinolonas são agentes bactericidas que agem inibindo a

enzima topoisomerase IV de bactérias gram – positivas e a topoisomerase II (DNA

girase) em gram – negativas. Dessa forma, inibem as atividades de corte e

selamento da DNA girase e de separação das fitas de DNA da topoisomerase IV

(Figura 3). Apresentam alta seletividade para enzimas bacterianas em relação às

humanas (GUIMARAES, 2010; GOODMAN, 2012).

24

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Fazer uma revisão bibliográfica sobre resistência bacteriana em bacilos Gram-

negativos e a importância dos testes fenotípicos.

2.2. Objetivos específicos

Reunir informações sobre as principais cepas resistentes de bacilos Gram-

negativos com prevalência no Brasil;

Reforçar a importância do uso dos testes fenotípicos para bacilos Gram-

negativos na rotina laboratorial;

Buscar a existência de testes fenotípicos inovadores para detecção de

resistência em bacilos Gram-negativos.

25

3. METODOLOGIA

3.1. Tipo de estudo

Esse estudo foi uma revisão de literatura científica sobre bacilos Gram-negativos.

Os artigos foram coletados das bases de dados PubMed, Scielo e Mendeley, tendo

como resultado trabalhos da Inglaterra, Brasil, Estados Unidos, Coreia do Sul,

Espanha, Grécia, Suécia, França, Portugal e Singapura. Além disso, foram coletadas

monografias, dissertações e teses do Brasil e de Portugal a partir dos repositórios da

USP, UFRGS, UFRN e UFP.

3.2. Obtenção dos dados

Nas bases de dados, foram utilizadas as palavras-chave “gram negative

resistance”, sendo encontrados 4168 artigos nas bases de dados PubMed e Scielo

no período de 2007 a 2017. Sendo utilizados 25 artigos, 3 livros, 2 teses, 1

dissertação e 1 monografia e sites governamentais que abordavam o assunto na

construção desse trabalho.

3.3. Técnica para detecção do perfil de sensibilidade a antimicrobianos (Técnica de Kirbe bauer)

A etapa inicial da técnica de disco difusão é o preparo de uma suspensão

bacteriana: com a alça bacteriológica, uma colônia é pescada e colocada em

solução salina 0,9% e suspendida. Espera-se obter uma turvação equivalente a 0,5

da escala McFarland, ou seja, uma suspensão contendo, aproximadamente, 1,5 x

10 8 unidades formadoras de colônia (UFC) por mL (ANVISA, 2008) (Figura 4).

Segundo a ANVISA (2006), para padronizar a densidade do inóculo, deve-se usar

um controle de turbidez de BaSO4 , equivalente a uma solução padrão 0,5 de

McFarland ou seu equivalente óptico (ex., suspensão de partículas de látex).

26

Figura 4: Suspensão bacteriana 0,5 na Escala McFarland.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Após o preparo do inóculo, o próximo passo é realizar a técnica em si. Em uma

placa de ágar Mueller - Hinton, à temperatura ambiente, semeia- se o inóculo com

um swab estéril em três direções diferentes (Figura 5).

Figura 5: Semeio em ágar Mueller - Hinton para disco difusão.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Após isso, utiliza-se discos de antimicrobianos de acordo com o tipo de bactéria,

no caso, gram-negativas. Dessa forma, podem ser utilizados discos de ceftazidima,

27

cefepime, aztreonam e imipenem, por exemplo. Os discos são colocados na placa

de forma manual com o uso de pinça estéril e respeitando-se a distância necessária

entre eles (Figura 6).

Figura 6: Organização dos discos de antimicrobianos.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Após incubação em estufa bacteriológica à 35ºC de 18 à 24 horas, os halos de

sensibilidade são lidos de acordo com o CLSI (2016) (Figura 7) e a cepa é

classificada como sensível, intermediária ou resistente (Tabela 1).

28

Figura 7: Visualização da placa com discos de antimicrobianos após o tempo de

incubação.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN

Quadro 1: Exemplo de leitura dos halos de inibição para alguns antimicrobianos de acordo com o CLSI.

Zona do diâmetro (em milímetros)

Agente antimicrobiano Conteúdo do disco Sensível Intermediária Resistente

Ceftazidima 30µg ≥ 21 18 - 20 ≤ 17

Cefoxitina 30µg ≥ 18 15 - 17 ≤ 14

Aztreonam 30µg ≥ 21 18 - 20 ≤ 17

Imipenem 10µg ≥ 23 20 - 22 ≤ 19

Adaptado de: CLSI, 2016.

29

3.4. Técnicas específicas para detecção de resistência

Essas técnicas se resumem aos testes fenotípicos utilizados para a detecção de

enzimas que inibem a ação dos antimicrobianos, as beta-lactamases. A quebra de

anéis beta-lactâmicos presentes em antibióticos é o mecanismo de resistência mais

comum em bactérias gram negativas. O grupo 1 de Bush, Jacoby e Medeiros (1995)

(classe C de Ambler (1980)) das beta-lactamases (AmpC) está presente em grande

parte desse tipo de bactéria, sendo um grupo ativo contra cefalosporinas e

aztreonam mas só agindo contra carbapenêmicos em altas concentrações. O grupo

2 (classe A) tem como representantes as ESBLs: beta lactamases de amplo

espectro que geralmente são adquiridas pelas bactérias através de mecanismos de

transmissão horizontal por elementos genéticos móveis. Essa transmissão é rápida e

bastante eficaz tanto em uma população bacteriana quanto entre populações e,

dessa forma, apresenta um caráter preocupante (HAWKEY, 2009). Já o grupo 3 tem

como representantes as carbapenemases (e metalo-beta-lactamases), enzimas

potentes na hidrólise de carbapenêmicos e que não sofrem efeito de inibidores de

beta-lactamase (MEHRAD, 2015). As metalo-beta-lactamases necessitam de dois

íons divalentes, usualmente zinco, para realizar a atividade catalítica, utilizando-os

como cofatores (AMBLER, 1980; BUSH et al., 1995).

3.4.1. Técnica para detecção de ESBL

A avaliação de ESBL em enterobactérias é feita com o teste de disco

aproximação. Em uma placa de ágar Mueller-Hinton, à temperatura ambiente, o

inóculo é semeado da mesma maneira que o teste anterior. Após isso, é colocado

um disco de amoxacilina/ácido clavulânico (30 μg) no centro da placa. Ao seu redor

são colocados discos de ceftriaxona (30 μg), ceftazidima (30 μg), cefepime (30 μg) e

aztreonam (30 μg) a 20mm de distância. A placa é incubada a 35º por 16 a 18 horas.

O teste é considerado positivo quando há distorções nos halos ou zonas fantasma

entre o disco contendo o inibidor de beta - lactamase e os discos contendo substrato

(Figura 8) (CLSI, 2016).

30

Figura 8: Visualização de zona fantasma (setas) em relação ao disco de amoxacilina + ácido clavulânico ao centro.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Isso ocorre pois o ácido clavulânico é capaz de inibir essas enzimas, permitindo

que os outros beta lactâmicos ao seu redor atuem.

3.4.2. Técnica para detecção de metalo – beta – lactamase

Para a avaliação de carbapenemases, inicialmente se realiza o antibiograma do

inóculo com discos de imipenem e meropenem com interpretação de sensibilidade

de acordo com o CLSI 2016. Se alguma bactéria apresentar resistência a um deles,

a mesma é submetida ao teste de triagem de metalo-beta-lactamase (teste do

EDTA). Em uma placa de ágar Mueller-Hinton, à temperatura ambiente, semeia-se a

suspensão bacteriana e coloca-se um disco de imipenem (10 μg) e meropenem (10

μg) de forma paralela a outros dois discos de imipenem e meropenem embebidos

em 10 μg de EDTA. Se houver aumento do halo de sensibilidade no disco com EDTA

em relação ao disco sem a substância, trata-se de uma cepa produtora de metalo-

beta-lactamase (Figura 9) (ANVISA, 2006).

31

Figura 9: Visualização de aumento no halo de sensibilidade no teste do EDTA.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Como essas enzimas necessitam de íons de zinco para a hidrólise do anel beta-

lactâmico, podem ser detectadas ao se utilizar um agente quelante, como o EDTA,

pois o mesmo forma complexos com esses íons, impedindo as enzimas de usá-los

(MENDES, 2006).

3.4.3. Teste de Hodge modificado

Para as enterobactérias, além do teste do EDTA é realizado também o teste de

Hodge modificado (MHT). No MHT, inocula-se a Escherichia coli ATCC 25922 e se

coloca um disco de meropenem no centro da placa. Ao redor dela, se faz estrias

com as amostras que devem ser submetidas ao teste, como recomendado pelo

CLSI (2016). Se houver um alargamento de crescimento bacteriano na área de

inserção (zonas de entroncamento), ou seja, próxima ao disco, a cepa é considerada

produtora de carbapenemase (Figura 10).

32

Figura 10: Visualização de zona de entroncamento (setas) próximo ao disco de meropenem ao centro. Técnica para detecção de carbapenemases em enterobactérias.

Fonte: Laboratório de Ensino de Microbiologia, DMP, UFRN.

Esse resultado é observado pois a cepa E. coli ATCC 25922 é sensível ao

antimicrobiano meropenem, logo, se a estria da amostra ultrapassar seu halo de

sensibilidade, significa que a mesma produziu uma enzima capaz de limitar ou

inativar a ação do fármaco (ANVISA, 2008).

3.4.4. Técnica para detecção de AmpC induzível

Ainda não há teste aprovado pelo CLSI para detecção desse tipo de beta-

lactamase. Entretanto, Rossi e Andreazzi propuseram em 2005 a seguinte

metodologia: em uma placa de ágar Mueller-Hinton, à temperatura ambiente,

semeia-se a suspensão bacteriana e coloca-se um disco de imipenem (10 μg) e

cefoxitina (30 μg), dois poderosos indutores, a 20mm de distância de discos de

ceftazidima (30 μg) e ceftriaxona (30 μg). Após o tempo de incubação, considera-se

resultado positivo quando há formação de uma zona de achatamento nos halos de

cefalosporinas.

33

3.4.5. Técnica modificada para detecção de ESBL

O CLSI recomenda a técnica de disco aproximação para a detecção de produção

de ESBL. Entretanto, sabe-se que um mesmo microrganismo pode ser capaz de

produzir ESBL e outros tipos de beta-lactamase, como metalo-beta-lactamases e

KPC, o que pode interferir na interpretação da técnica fenotípica (MEHRAD, 2015;

POULOU, 2014). Dessa forma, foi mostrado por Poulou et. al. em 2014 uma

modificação na técnica de disco aproximação, em que se utilizava EDTA e ácido

borônico nos discos de antimicrobianos. Essas duas substâncias eram responsáveis

por inativar metalo-beta-lactamases e por inibir reversivelmente AmpC e KPC,

respectivamente. A técnica modificada apresentou 97,5 % de sensibilidade e 100%

de especificidade enquanto a técnica aprovada contava com 65,4% de sensibilidade

e 97,1% de especificidade. Além disso, a técnica proposta foi capaz de detectar

melhor ESBL em microrganismos que também produziam outro tipo de beta-

lactamase (POULOU, 2014).

3.4.6. Técnica para detecção de KPC em disco

O CLSI recomenda para a detecção dessa carbapenemase o teste de Hodge

modificado, como falado anteriormente. Entretanto, é um procedimento que

demanda muito tempo e, devido a isso, Kim et. al. propuseram em 2016 uma nova

técnica na qual se utiliza um disco contendo 0,3 mg de imipenem (Tienam 500) com

azul de bromotimol como indicador de pH. A técnica se baseia na detecção da

formação de ácido após a hidrólise do imipenem, o azul de bromotimol, como

indicador de pH, muda cor amarela (pH neutro) para a cor verde quando o pH fica

ácido. A mesma apresentou 98,6% de sensibilidade e 100% de especificidade para

bacilos gram – negativos produtores de KPC ou metalo – beta – lactamases com

resultados dentro de 60 minutos; entretanto, falhou em detectar a classe GES – 5

(KIM, 2017).

34

4. DISCUSSÃO

4.1. Mecanismos de resistência em bacilos gram-negativos

Os principais mecanismos de resistência em gram negativos são: alteração de

permeabilidade, alteração do sítio de ação do fármaco, expressão de bombas de

efluxo, alteração nas vias metabólicas e produção de enzimas que inibem a ação do

antibacteriano (Figura 11).

Figura 11: Mecanismos de resistência na célula bacteriana.

Fonte: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/rm_controle/opas_web/

modulo3/pop_mecanismo.htm. Acesso em 25/10/2017.

4.1.1. Alteração da permeabilidade

A membrana celular externa das bactérias gram-negativas é composta por

lipopolissacarídeos e proteínas especiais, as porinas. Esse tipo de membrana

permite que haja uma permeabilidade seletiva, pois as substâncias devem passar

por esses canais específicos. Essa permeabilidade limitada é o que garante a

resistência intrínseca de bacilos gram-negativos à penicilina, eritromicina,

clindamicina e vancomicina e pela resistência de Pseudomonas aeruginosa ao

trimetoprim (ANVISA, 2007).

35

4.1.2. Alteração do sítio de ação

A alteração do sítio alvo de determinado antimicrobiano é um dos mecanismos de

resistência mais importantes. Mutações de ponto nos genes da DNA girase e

topoisomerase IV são diretamente relacionadas à resistência à quinolonas em

Enterobacteriaceae por mudanças no sítio de ação, mas no geral esse tipo de

mutação confere somente níveis moderados de resistência. Entretanto, a aquisição

de plasmídeos que codificam enzimas capazes de inativar fluoroquinolonas ou a

expressão aumentada de bombas de efluxo são fatores que facilitam a resistência

clínica a esse tipo de antimicrobiano (PRIBUL, 2017; RICE, 2012).

4.1.3. Expressão de bombas de efluxo

Os transportadores ativos residem na membrana interna e, em bactérias gram-

negativas, eles formam complexos trans-envelope, juntamente com proteínas de

fusão de membrana periplasmática (MFPs) e fatores de membrana externa (OMFs).

São os responsáveis por reconhecer e expelir os antimicrobianos para o meio

externo antes que os mesmos alcancem seus alvos. A maioria dos genes que os

codificam se localizam cromossomicamente, mas já foram encontrados em

plasmídeos. A expressão exagerada desse tipo de resistência frequentemente

produz grandes falhas no tratamento de infecções e pode influenciar genes para

codificarem sítios diferentes para diversos antibióticos (SPENGLER, 2017; VARGIU,

2016).

4.1.4. Alterações nas vias metabólicas

As sulfas podem agir bloqueando a enzima di-hidropteroato sintetase ou a enzima

di-hidrofolato redutase. As duas atuam na síntese do folato, cofator importante na

biossíntese de bases pirimidínicas que constituem os ácidos nucléicos. Desta forma,

bactérias capazes de reduzir a afinidade de di-hidrofolato redutase, por exemplo,

inativam esse tipo de antimicrobiano (GUIMARAES, 2010). Devido a isso,

combinações com trimetoprim (TMP) foram inseridas na rotina clínica, sendo o TMP

o único aprovado para esse tipo de uso. Dessa forma, quando há resistência tanto a

sulfas como ao trimetoprim, dificuldades no tratamento são comuns (GUZZO, 2016).

36

4.1.5. Produção de enzimas que inibem a ação

Essas enzimas são as beta-lactamases, já citadas anteriormente. Serão divididas

em AmpC, beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e carbapenemases

(incluídas as metalo-beta-lactamases).

4.1.5.1. AmpC

As beta – lactamases AmpC são enzimas frequentes nos integrantes do grupo

CESP (Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp.)

devido à localização cromossômica de seu gene nesses microrganismos. Entretanto,

a mesma já foi encontrada em outras bactérias sendo mediada por plasmídeo.

Aquelas que possuem o gene em seu cromossomo produzem AmpC em níveis

basais para atuação no metabolismo da parede celular, entretanto, essas enzimas

garantem diminuição da sensibilidade ou resistência a cefamicinas, penicilinas,

cefalosporinas de 1ª e 2ª geração e a associações com inibidores de beta-

lactamase. Além disso, quando há a hiperprodução desse tipo de enzima, pode

ocorrer resistência a cefalosporinas de 3ª geração. Essa hiperprodução pode ocorrer

na presença de algum tipo de antimicrobiano, como cefoxitina e imipenem, que

agem como agentes indutores, ou devido a mutações em seus genes reguladores,

como o gene AmpR (ANDRADE, 2008; HENRIQUES NORMARK, 2002).

Entre os anos de 2005 e 2006, esse tipo de beta-lactamase mediada por

plasmídeos foi encontrada em 10% das cepas de Klebsiella spp. e 2% das cepas de

E. coli em cinco hospitais infantis na China, sendo o tipo DHA-1 o mais prevalente; o

que reflete a alta propagação das AmpC, visto que o tipo mais frequente no mundo é

o CMY-2 (HAWKEY, 2009).

4.1.5.2. ESBLs

Beta-lactamases de espectro estendido, ESBLs, são enzimas que garantem

resistência a oximino-cefalosporinas, como cefotaxima e ceftazidima, e a

monobactâmicos; entretanto, são sensíveis aos inibidores de beta-lactamase como o

ácido clavulânico. Os plasmídeos que codificam essas enzimas podem carrear

genes de outras beta-lactamases que podem apresentar resistência a outras classes

de antimicrobianos, como quinolonas e aminoglicosídeos, tornando sua

37

antibioticoterapia complicada e, por conseguinte, sua sobrevivência e disseminação

facilitada (MEHRAD, 2015; POULOU,2014).

Algumas ESBLs são mobilizadas por bactérias do meio ambiente, como CTX-M,

enquanto outras derivam de mutações em aminoácidos de plasmídeos carreadores

de beta-lactamases, como TEM e SHV. Em meados dos anos 1980, as ESBLs

surgiram na Europa a partir de mutações nesses grupos TEM e SHV, praticamente

no mesmo período em que as cefalosporinas de terceira geração estavam sendo

inseridas na rotina clínica. Tornaram - se prevalentes nos anos 1990, em que a maior

parte dos casos de ESBLs se referiam a TEM e SHV, com exceção do genótipo

CTX-M-2 que era frequente na América do Sul. Hoje estão difundidas por todo o

mundo, contando com mais de 300 enzimas individuais descritas (HAWKEY, 2009;

MEHRAD, 2015; RUIZ – GARBAJOSA, 2016).

Segundo dados extraídos de um estudo SMART sobre infecções abdominais,

Escherichia coli produtora de ESBL tinha prevalência de 11% na Europa, enquanto

em outras regiões apresentava mais de 30% de prevalência, como no sudeste

asiático. E em relação a cepas de Klebsiella pneumoniae, países como Austrália e

Japão apresentavam níveis menores do que 10% e China e Singapura contavam

com, aproximadamente, 30% de prevalência, enquanto na Europa foi detectada

prevalência de 56% na Itália (HAWKEY, 2009; HAWSER, 2010; MEHRAD, 2015).

Além disso, as ESBL TEM e SHV, as mais comumente descritas, estão sendo

substituídas por CTX-M na maioria dos países. E em regiões como Ásia, América do

Sul e parte da Europa a prevalência endêmica já se alcançou, refletindo-se na

pandemia de CTX-M-15 que ocorreu na China, nessa última década, a qual foi

associada à disseminação de determinados clones de alto risco de E. coli,

destacando-se o ST131. A prevalência desse clone em cepas de E. coli produtoras de

ESBL na Espanha situou-se em 20%, sendo menor do que a porcentagem

encontrada em países como EUA e Canadá, cujo valor encontrado foi de 50%

(MEHRAD, 2015; RUIZ – GARBAJOSA, 2016).

No Brasil, entre os anos de 1998 e 1999, foram estudadas 18 enterobactérias

produtoras de ESBL, estando a família SHV como mais frequente, seguida, na

época, pela família CTX-M. Grande variedade de enzimas CTX-M foi encontrada,

38

sendo os relatos de CTX-M-8 e CTX-M-16 os primeiros no mundo. Entretanto, em

estudos mais recentes nota – se a prevalência de CTX-M-2 (ANDRADE, 2008).

Ademais, E. coli produtoras de enzimas da família CTX-M tem sido fortemente

associadas a infecções comunitárias, refletindo um panorama diferente do comum

em que esse tipo de microrganismo se encontrava, pois era mais frequente em

ambientes hospitalares, principalmente em UTIs (RUIZ-GARBAJOSA, 2016).

4.1.5.3. Carbapenemases

As carbapenemases são beta - lactamases que apresentam resistência aos

carbapenêmicos, além das cefalosporinas e penicilinas. São enzimas que se

diferenciam em duas famílias principais, levando em consideração seu mecanismo

hidrolítico, em que estão presentes íons de zinco ou serina no sítio de ação. Aquelas

que utilizam os íons de zinco foram primeiramente descritas em bacilos gram-

positivos, levando o nome de metalo-beta-lactamases devido a sua sensibilidade ao

EDTA e formando o grupo B (metaloenzimas) (RIBEIRO, 2013; RICE, 2012).

No final dos anos 80, surgiu outro grupo de carbapenemases, mas que não era

sensível ao EDTA, apresentava serina no seu sítio de ação e inibição ao ácido

clavulânico e tazobactam. Esse grupo contempla as famílias A (penicilinases) e D

(oxacilinases) e suas representantes são chamadas de serino-carbapenemases

(RIBEIRO, 2013; RICE, 2012). A resistência aos carbapenêmicos pode ser induzida

pela produção exacerbada de AmpC e de ESBLs associada a uma redução da

síntese de porinas ou aumento no efluxo, caracterizando os microrganismos que a

possuem como multirresistentes de forma frequente (HAWKEY, 2009).

A primeira Enterobacteriaceae produtora de carbapenemase foi descrita no ano

de 1991 no Japão (HAWKEY, 2009). No momento atual, existem quatro famílias

principais de carbapenemases de classe A, sendo SME, NMC / IMI, GES e KPC

suas representantes. O surgimento dessa classe se deu na década de 80 na

Inglaterra com a família SME, antes da comercialização ampla de carbapenêmicos.

São enzimas cromossomais encontradas somente em Serratia marcescens e há

relatos de sua detecção na Argentina e em boa parte dos Estados Unidos. Em

relação à família NMC / IMI, não há muitos relatos além daqueles feitos na sua

descoberta, e o fato de se caracterizarem como enzimas cromossomais talvez seja o

39

responsável pela sua raridade. Diversas enzimas da família GES têm sido descritas

pelo mundo, entretanto a GES-2 foi a primeira com atividade carbapenemase

encontrada apresentando eficiência catalítica inferior às demais enzimas da classe

A. Houve apenas um relato de K. pneumoniae produtora de GES-5 resistente a

todos os beta-lactâmicos no Brasil (RIBEIRO, 2013).

Dessa forma, a família mais comumente descrita pertencente à classe A, é a

Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), sendo a mais associada à resistência

aos carbapenêmicos em enterobactérias. O fato de geralmente estarem associadas

a elementos genéticos móveis facilita sua disseminação e, por garantirem resistência

aos carbapenêmicos, geram sérios problemas na busca por alternativas de

tratamento. Além disso, há uma constante dificuldade em identificar uma

carbapenemase in vitro quando o mesmo microrganismo apresenta ESBL

(HAWKEY, 2009; MEHRAD, 2015; POULOU, 2014; RIBEIRO, 2013).

No momento atual, existem 16 variantes de KPC (KPC-2 até KPC-17), entretanto

a maioria dos estudos é focada nas variantes KPC-2 e KPC-3 (WANG, 2014). É a

carbapenemase mais comum nos Estados Unidos e foi primeiramente isolada na

Carolina do Norte no ano de 1996. Enquanto, em 2004, 19 isolados de Klebsiella

spp. resistentes a carbapenêmicos, apresentando carbapenemase de classe A KPC-

2 foram encontrados em sete hospitais da cidade de New York, com outro genótipo,

KPC-3, também sendo reportado. Em 2007, seis países europeus reportaram 25%

das cepas de P. aeruginosa como resistentes a carbapenêmicos em um estudo da

European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) (HAWKEY, 2009;

MEHRAD, 2015; RIBEIRO, 2013). Já no Brasil, o primeiro relato de detecção de

cepa produtora de KPC ocorreu em 2009, em relação a quatro isolados de K.

pneumoniae produtoras de KPC-2 na cidade de Recife, em 2006. Desde então,

diversas pesquisas de vigilância detectaram isolados produtores de

carbapenemases em Estados como Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina e

Espírito Santo (RIBEIRO, 2013).

No ano de 2010, quando ocorreu uma grande disseminação de isolados

produtores de KPC, foi publicada a primeira nota técnica brasileira pela ANVISA

(Nota Técnica Nº 1 /2010), que direcionava e instruía a detecção e registro de

membros da família Enterobacteriaceae resistentes a carbapenêmicos perante a

40

Agência. Além disso, a nota orientava que uma cultura resistente deveria ser enviada

até a FIOCRUZ para confirmação do mecanismo de resistência e, após sua

publicação, mais de 500 isolados produtores de KPC provenientes de 11 estados

(Santa Catarina, Rio de Janeiro, Ceará, Minas Gerais, Goiás, Espírito Santo,

Alagoas, Pernambuco, Piauí, Maranhão, Amazonas e Distrito Federal) foram

recebidos (RIBEIRO, 2013).

A classe D de carbapenemases é composta por enzimas que apresentam alta

capacidade hidrolítica contra cloxacilina, oxacilina e meticilina, recebendo o nome de

oxacilinases devido a isso. As OXA são frequentemente descritas em Acinetobacter

spp., entretanto relatos em enterobactérias tem se tornado constantes. Neste

gênero, a principal representante é a OXA-23, a qual já foi detectada mundialmente,

sendo responsável por surtos em diversos países, incluindo o Brasil (RIBEIRO,

2013; RICE, 2012). A OXA-48 é a enzima mais frequente na família das

Enterobacteriaceae, tendo sido detectada principalmente em E. coli e K.

pneumoniae. Essa enzima foi detectada primariamente na Turquia, onde agora é

considerada a carbapenemase de maior relevância clínica, encontrando-se ainda na

Ásia, África, Europa, Estados Unidos e Canadá (RIBEIRO, 2013).

As carbapenemases de classe B ou metalo-beta-lactamases (MBL), são enzimas

produzidas intrinsecamente por alguns microrganismos, mas que recentemente tem

sido encontradas em patógenos de risco. Apresentam um espectro grande de ação,

não sendo capazes de hidrolisar somente os monobactâmicos e possuem

sensibilidade a agentes quelantes, como o EDTA. Atualmente são conhecidas 12

famílias: IMP (imipenemase), VIM (Verona imipenemase), SPM (São Paulo metalo-

beta-lactamase), GIM (Germany imipenemase), SIM (Seul imipenemase), DIM

(Dutch imipenemase), AIM (Australian imipenemase), NDM (New Delhi

imipenemase), KHM (Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase), SMB (Serratia

marcescens metalo-beta-lactamase), TMB (Tripoli metalo-beta-lactamase) e FIM

(Florence imipenemase) (HONG et al.,2015; KAYAMA et al., 2014; MENDES, 2006;

RIBEIRO, 2013; WACHINO et al., 2011).

O primeiro relato de cepa produtora de MBL ocorreu no ano de 1994 no Japão,

em que uma Serratia marcescens era fenotipicamente resistente ao imipenem e

cefalosporinas de espectro ampliado, sendo descrita a nova classe de MBL IMP-1.

41

Já o primeiro relato no continente americano foi feito em 2002, em que foi descrita

uma Pseudomonas aeruginosa resistente a ceftazidima e carbapenêmicos (GIBB et

al., 2002). Análises posteriores revelaram a presença de uma nova MBL, a IMP-7.

Em 1999, foi descrita a segunda subclasse de MBL, a VIM-2, que foi encontrada em

Verona, Itália, em uma cepa de P. aeruginosa (MENDES, 2006; RIBEIRO, 2013).

Essa é a metalo-beta-lactamase mais frequente em P. aeruginosa, tendo sido

reportada em trinta e sete países por todos os cinco continentes (HAWKEY, 2009).

No Brasil, a SPM-1 foi relatada em São Paulo a partir de uma P. aeruginosa

coletada do trato urinário de um paciente no Hospital São Paulo na Universidade

Federal de São Paulo (UNIFESP). Desde então, cepas produtoras dessa enzima

foram encontradas em diversos centros no Brasil, como em Brasília, São Paulo,

Fortaleza, Salvador, Santo André, Londrina, Curitiba e Maringá, totalizando cerca de

70% dos isolados de P. aeruginosa, não sendo reportada em outros países.

(HAWKEY, 2009; MENDES, 2006). Posteriormente, foi descrita a GIM-1 em cepas

de P. aeruginosa provenientes de Dusseldorf, Alemanha. As enzimas SPM-1, GIM-1

e AIM-1 são consideradas variantes únicas detectadas apenas em P. aeruginosa em

seus respectivos países: Brasil, Alemanha e Austrália (MENDES, 2006; RIBEIRO,

2013).

A enzima SIM-1 foi isolada na Coreia e a KHM no Japão, não sendo difundida

para outros países. Entretanto, em 2009, houve o relato de uma K. pneumoniae

produtora de NDM-1 na Suécia e, após sua identificação, a mesma se disseminou

para o Reino Unido, Índia, Paquistão e Bangladesh apresentando hoje relatos

frequentes em todos os continentes (MEHRAD, 2015; RIBEIRO, 2013).

Em 2010, surgiu a DIM-1 caracterizada em uma Pseudomonas stutzeri na

Holanda. Seu gene apresentava também produção de resistência contra

aminoglicosídeos e desinfetantes. Enquanto as três últimas enzimas descritas, SBM,

TBM e FIM, foram detectadas em isolados de S. marcescens, Achromobacter

xylosoxidans e P. aeruginosa entre os anos de 2011 e 2012 permanecendo restritas

aos seus locais de origem (RIBEIRO, 2013).

No Brasil, durante os anos de 2002 e 2003, detectou – se o gene blaIMP-1 em

Acinetobacter spp. e P. aeruginosa isoladas de pacientes do Hospital São Paulo. O

42

primeiro relato de uma Enterobacteriaceae produtora de MBL adquirida na América

Latina ocorreu no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU/USP) em

uma Klebsiella pneumoniae que produzia IMP-1. Também ocorreu, entre 2003 e

2004, o primeiro surto hospitalar em uma UTI por um clone de K. pneumoniae

resistente a carbapenêmicos, em que mais tarde foi detectada a presença do gene

blaIMP-1. Além disso, foi constatado que 41% dos isolados de P. aeruginosa,

provenientes de diversos estados brasileiros, que eram resistentes a

carbapenêmicos eram produtoras de MBL (MENDES, 2006).

43

5. CONCLUSÕES

Apesar de os testes discutidos apresentarem sensibilidade aprovada pelo CLSI,

nem sempre os mesmos são realizados na rotina médica. Dessa forma, destaca-se

a importância da realização dessas técnicas de detecção para que haja um maior

controle da resistência bacteriana, principalmente quando se trata das

carbapenemases, pois as mesmas já conferem resistência à classe de

antimicrobiano mais eficaz contra as bactérias Gram-negativas.

Foram encontradas novas propostas de testes fenotípicos que se apresentaram

mais sensíveis, mais específicos e até mais rápidos quando em comparação com os

testes já aprovados pelo CLSI, principalmente quando em relação a microrganismos

que produzem mais de uma das beta-lactamases discutidas. Dessa forma, os

mesmos poderiam ser empregados quando as condições para a realização de testes

moleculares de confirmação genotípica fossem precárias.

No Brasil, as beta-lactamases mais relatadas foram as ESBL, com prevalência da

família CTX-M-2, metalo-beta-lactamases e carbapenemases da família KPC, com

muitos casos de bactérias Gram-negativas multirresistentes. Entretanto, ainda é

necessário um estudo de culturas de vigilância mais abrangente para que seja

formulado um banco de dados epidemiológicos mais confiável.

44

6. REFERÊNCIAS

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