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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
LEANDRO SILVA COSTA
BIOPROSPECÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE
MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO
NORTE: CARACTERIZAÇÃO DE UMA HETEROFUCANA EXTRAÍDA
DA ALGA MARRON Sargassum filipendula QUE INDUZ APOPTOSE
EM CÉLULAS HeLa.
NATAL 2012
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LEANDRO SILVA COSTA
BIOPROSPECÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE
MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO
NORTE: CARACTERIZAÇÃO DE UMA HETEROFUCANA EXTRAÍDA
DA ALGA MARRON Sargassum filipendula QUE INDUZ APOPTOSE
EM CÉLULAS HeLa.
Tese apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em
Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
NATAL 2012
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A minha esposa Janielle, obrigado por tudo, você entrou em minha vida para me fazer um homem realizado. Ter você ao meu lado me dá forças para conquistar sonhos impossíveis. Como eu sempre digo, agradeço a
Deus por me dar a missão de lhe fazer feliz. Eu te amo eternamente. Ao meu filho Lucas, que me ensinou o que é amar incondicionalmente. Cada sorriso seu enche o meu coração de alegria e orgulho. Eu te amo muito, e sempre estarei por perto para estender o braço nos momentos em que
você mais precisar.
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Aos meus pais, Zonilio e Teresa, por todo amor a mim dedicado. Essa conquista começou a ser construída há muitos anos atrás, ainda quando estava dando os meus primeiros passos, e vocês, com todos os ensinamentos
sobre a vida, me transformaram nessa pessoa que hoje sou. Se eu conseguir repassar uma pequena parte desses ensinamentos ao meu filho, tenho a certeza que serei um grande pai. Amo vocês.
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Ao grande amigo/professor/orientador Hugo, que sempre me guiou durante toda a vida acadêmica. Em 2012
completa-se nove anos de convivência, e durante todo esse tempo pude contar com a sua amizade, cumplicidade, paciência e confiança. Dizem que nossa maneira de agir e pensar são semelhantes, não é para
menos, eu procurei sempre aprender cada ensinamento seu, e hoje procuro colocá-los em prática. Obrigado por todos esses anos de ensinamentos, que transformam essa tese em algo maior do que um título acadêmico.
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Ao grande Deus que sempre esteve presente em todos os momentos de minha vida.
À minha esposa Janielle, meu eterno amor, minha amiga e companheira. Eu te amei desde a primeira vez que
a vi, e pode ter certeza que amarei cada vez mais, em toda nossa vida.
Ao meu filho Lucas, que Deus continue lhe abençoando, e lhe dê muita saúde e sabedoria para superar todos
os obstáculos que a vida nos apresenta. Sempre que precisar estarei ao seu lado. Papai te ama muito.
Aos meus pais, por sempre estarem presentes e compartilharem comigo todos os momentos, especialmente os
mais difíceis. Vocês são meus espelhos para a vida.
Ao meu irmão, minha cunhada Carla e meus sobrinhos Cauã e Enzo. Apesar de distantes, sei que estão torcendo e vibrando muito com cada conquista minha. Amo todos vocês, em especial o meu irmão, um
exemplo de pessoa que eu, como irmão mais novo, sempre fiz questão de seguir.
A toda família Freire, em especial à tia Ana e ao Freire, obrigado pelo carinho e principalmente por ter
trazido ao mundo o meu grande amor.
As grandes amizades que construí ao longo da vida, em especial à Jean (Zacarias), Wallace e Ério.
Aos amigos da velha guarda do laboratório, que foram responsáveis pelos meus primeiros e talvez os mais
importantes conhecimentos científicos: Ivan, Cybelle e Eduardo (Duda).
A banca de qualificação do doutorado: Carlos Eduardo (Cadu), Naisandra e Eduardo (Duda), a
contribuição de vocês foi fundamental na conclusão deste documento.
À toda família Biopol: Sara e Mariana (grandes e velhas amigas, que apesar de toda chatice, eu guardo um
carinho muito especial pelas duas), Diego (vulgo Popó, que tem o coração compatível com o tamanho),
Nednaldo (outro velho amigo de laboratório, torço muito pelo seu sucesso), Rafael (e aí? Um grande amigo
que fiz, e esta amizade levo para a vida), Ruth (a minha engenheira, depois da convivência com você, sei que
tenho um lugar garantido no céu), Leonardo (A covinha mais linda de Natal e uma das pessoas mais
divertida que conheci), Cinthia (agora faz parte da familia), Dayanne (Sempre passou a limpo o protocolo de
Nednaldo) Raniere (você me ensinou a ser mais sutil com as pessoas), Gabriel (uma grande pessoa, a qual
tive o prazer em co-orientar, um pouco mais de juízo e você vai longe) Arthur (o único defeito é o time que
torce), Jailma (você é super especial, é o anjo que Hugo trouxe para nos acompanhar e encher os nossos dias
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de paz e alegria). As nutricionistas Joana e Letícia (Coincidência ou não, depois que vocês chegaram todo
mundo engordou), Karol (apesar de ter me excluído do Biopol em sua monografia, eu a incluo nesta família
em minha tese), e a todos os integrantes mais novos do laboratório.
Aos vários amigos de departamento, por todos os momentos compartilhados nos corredores da Bioquímica.
Aos professores do Departamento de Bioquímica pelos conhecimentos passados e por sempre depositarem
enorme confiança em meu trabalho.
A professora Edda, que me recebeu como uma mãe e me ensinou muita coisa valiosa. A senhora faz parte
desta conquista.
À CAPES e CNPq, pelo financiamento que permitiu a conclusão deste trabalho.
Ao meu pai científico Hugo, obrigado pela confiança em mim depositada, e por todos os ensinamentos, a
minha gratidão e carinho são inestimáveis.
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RESUMO O litoral do Rio Grande do Norte apresenta mais de 100 espécies de macroalgas marinhas, a maioria delas ainda não explorada quanto ao seu potencial farmacológico. Os polissacarídeos sulfatados (PS) são de longe os compostos de macroalgas marinhas mais estudados, sendo atribuída a estes uma gama de propriedades biológicas, como: atividade anticoagulante, antiinflamatória, antitumoral e antioxidante. Neste trabalho, obteve-se extratos ricos em polissacarídeos de onze algas do litoral do Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Gracilaria caudata; Caulerpa cupresoides; Caulerpa prolifera; Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum), e estas foram avaliadas quanto ao seu potencial anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo frente à linhagem celular tumoral HeLa. Todos os extratos polissacarídicos apresentaram atividades anticoagulante, antioxidante e/ou antiproliferativa, com destaque para os das algas D. delicatula e S. filipendula, que apresentaram os maiores índices de potencial farmacológico, sendo, portanto, escolhidas para serem submetidos a passos posteriores de purificação de seus polissacarídeos sulfatados. Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula (DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v) e cinco frações da alga S. filipendula (SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v e SF-2,0v). Análises físico-químicas mostraram que estas são ricas em heterofucanas sulfatadas. Apenas as frações da alga D. delicatula apresentaram atividade anticoagulante, com destaque para DD-1,5v que apresentou a atividade mais proeminente com razão de APTT semelhante à clexane®, fármaco anticoagulante comercial. Quando avaliadas com relação ao potencial antioxidante todas as frações apresentaram atividade em todos os testes realizados (Capacidade antioxidante total, sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação férrica e atividade redutora), entretanto, a capacidade de quelação de íons ferro aparece como o principal mecanismo antioxidante dos polissacarídeos sulfatados dessas macroalgas marinhas. No ensaio antiproliferativo, todas as heterofucanas apresentaram atividades dose-dependente para a inibição da proliferação celular de HeLa, entretanto, as frações SF-0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v apresentaram atividade específica para esta linhagem celular, não inibindo a proliferação da linhagem celular normal MC3T3, sendo a heterofucana SF-1,5v escolhida para ter seu mecanismo de ação antiproliferativo determinado. SF-1,5v induz a apoptose em células HeLa principalmente através de uma via independente da ativação das caspases, promovendo a liberação do Fator Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, que por sua vez induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb. Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma heterofucana cujo principal mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais. Palavras-chave: Atividade antiproliferativa, atividade anticoagulante, atividade antioxidante, fator indutor de apoptose.
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ABSTRACT The coast of Rio Grande do Norte has more than 100 species of seaweed, mostly unexplored regarding their pharmacological potential. The sulfated polysaccharides (PS) are by far the more seaweed compounds studied, these present a range of biological properties, such as anticoagulant activity, anti-inflammatory, antitumor and antioxidant properties. In this study, we extract sulfated polysaccharide rich-extracts of eleven algae from the coast of Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Gracilaria caudata; Caulerpa cupresoides; Caulerpa prolifera; Caulerpa sertularioides e Codim isthmocladum), and these were evaluated for the potential anticoagulant, antioxidant and antiproliferative. All polysaccharide extracts showed activity for anticoagulant, antioxidant and/or antiproliferative activity, especially D. delicatula and S. filipendula, which showed the most prominent pharmacological potential, thereby being chosen to have their sulfated polysaccharides extracted. By fractionating method were obtained six fractions rich in sulfated polysaccharides to the algae D. delicatula (DD-0,5V, DD-0, 7V, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v and DD-2,0) and five fractions to the alga S. filipendula (SF-0,5V, SF-0,7V, SF-1,0v, SF-1,5v and SF-2,0v). For the anticoagulant assay only the fractions of D. delicatula showed activity, with emphasis on DD-1, 5v that presented the most prominent activity, with APTT ratio similar to clexane® at 0.1 mg/mL. When evaluated the antioxidant potential, all fractions showed potential in all tests (total antioxidant capacity, hydroxyl and superoxide radicals scavenging, ferrous chelation and reducing power), however, the ability to chelate iron ions appears as the main mechanism antioxidant of sulfated polysaccharides from seaweed. In antiproliferative assay, all heterofucanas showed dose-dependent activity for the inhibition of cell proliferation of HeLa, however, with the exception of SF-0,7V, SF-1,0v and SF-1,5v, all fractions showed antiproliferative activity against MC3T3, a normal cell line. The heterofucana SF-1,5V had its antiproliferative mechanism of action evaluated. This heterofucan induces apoptosis in HeLa cells by a pathway caspase independent, promoting the release of apoptosis Inducing Factor (AIF) in the cytosol, which in turn induces chromatin condensation and DNA fragmentation into 50Kb fragments. These results are significant in that they provide a mechanistic framework for further exploring the use of SF-1.5v as a novel chemotherapeutics against human cervical cancer. Keywords: antiproliferative activity, anticoagulant activity, antioxidant activity, apoptosis inductor factor.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelo clássico da cascata de coagulação. .............................................. 27
Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. .................. 28
Figura 3. Mecanismos de ação anticoagulate dos polissacarideos sulfatados de algas marinhas. ......................................................................................................... 31
Figura 4. Via extrínseca da apoptose ........................................................................ 35
Figura 5. Via intrínseca da apoptose. ........................................................................ 36
Figura 6. Metodologia de extração e caracterização físico-química e farmacológica dos extratos polissacarídicos e das frações polissacarídicas das algas D. delicatula e S. filipendula. ............................................................................................................. 46
Figura 7. Rendimento dos extratos polissacarídicos extraídos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte ................................................................................... 56
Figura 8. Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos obtidos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte .............................................................. 57
Figura 9. Capacidade antioxidante total dos extratos polissacarídicos ..................... 60
Figura 10. Atividade de Quelação férrica dos extratos polissacarídicos.................... 63
Figura 11. Atividade redutora equivalente de extratos polissacarídicos .................... 65
Figura 12. Atividade antiproliferativa dos extratos polissacarídicos frente a linhagem cellular HeLa após 72h de incubação ....................................................................... 66
Figura 13. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula. ........................................ 68
Figura 14. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de D. delicatula ........ 70
Figura 15. Atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula .................. 71
Figura 16. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga D. delicatula. .................................................................................................................. 72
Figura 17. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga D. delicatula .... 74
Figura 18. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga D. delicatula. .. 75
Figura 19. Atividade antiproliferativa de heterofucanas da alga D. delicatula. .......... 77
Figura 20. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula. ........................................ 78
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Figura 21. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula ....... 80
Figura 22. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga S. filipendula. ................................................................................................................. 82
Figura 23. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga S. filipendula. ... 84
Figura 24. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga S. filipendula .. 85
Figura 25. Atividade antiproliferativa das heterofucanas da alga Sargassum filipendula. ................................................................................................................. 87
Figura 26. Proliferação celular de células HeLa incubadas com SF-1,5v.................. 88
Figura 27. Heterofucana SF-1,5v induz apoptose de células HeLa .......................... 89
Figura 28. Apoptose de células hela induzida pelo polissacarídeo sulfatado SF-1,5v não requer ativação de caspases. ............................................................................. 90
Figura 29. Análise da sinalização intracelular da heterofucana SF-1,5v por western blot ............................................................................................................................ 91
Figura 30. Ativação de GSK não é essencial para apoptose induzida pela heterofucana SF-1.5v. ............................................................................................... 92
Figura 31. Análise da expressão de AIF, Bax and Bcl-2 na presença de SF-1.5v .... 93
Figura 32. Mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente a linhagem celular tumoral HeLa. .......................................................................................................... 112
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LISTA DE TABELAS
Tabela I. Principais características das macroalgas .................................................. 18
Tabela II. Algumas das atividades farmacológicas atribuídas as fucanas. ................ 21
Tabela III. Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas verdes .............................................................................................................. 23
Tabela IV. Local de coletas das macroalgas marinhas ............................................ 42
Tabela V. Composição química dos extratos polissacarídicos. ................................. 58
Tabela VI. Atividade anticoagulante dos extratos polissacarídicos. .......................... 59
Tabela VII. Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelos extratos polissacarídicos. ........................................................................................................ 61
Tabela VIII. Índice de potencial farmacológico dos polissacarídeos extraídos das macroalgas marinhas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte. ........................ 67
Tabela IX. Composição química de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Dictyopteris delicatula................................................................................................ 69
Tabela X. Sequestro de radicais hidroxila e superóxido de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula................................................................................................ 73
Tabela XI. Composição química dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula. .............................................................................................. 79
Tabela XII. Tempo de coagulação das frações polissacarídicas da alga S. filipendula .................................................................................................................................. 81
Tabela XIII. Atividade sequestradora de radicais superóxido e hidroxila dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula. ....................... 83
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LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
ÁC. GLU Ácido glucurônico
AIF Fator indutor de apoptose
AKt Proteina quinase B
aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada
AT Antitrombina
CAT Capacidade antioxidante total
DD-0,5v Fração precipitada da alga D. delicatula com 0,5 volumes de acetona
DD-0,7v Fração precipitada da alga D. delicatula com 0,7 volumes de acetona
DD-1,0v Fração precipitada da alga D. delicatula com 1,0 volumes de acetona
DD-1,3v Fração precipitada da alga D. delicatula com 1,3 volumes de acetona
DD-1,5v Fração precipitada da alga D. delicatula com 1,5 volumes de acetona
DD-2,0v Fração precipitada da alga D. delicatula com 2,0 volumes de acetona
DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazil
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
ERK Quinase regulada por sinais extracelulares
FITC Fitocromo C
FUC Fucose
GAL Galactose
GLI Glicose
GSK-3β Glicogênio sintase quinase 3
HCII Cofator II da heparina
HEP Heparina não-fracionada
IC50 Concentração requerida para inibir 50% de uma atividade farmacológica
MAN Manose
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MAPK Proteína quinase ativada por mitógenos
MTT 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-y1)2,5-difenil tetrazolio brometo)
NBT Azul de tetrazolium
NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
PT Tempo de Tromboplastina
RAF Rafinose
RPM Rotações por minuto
SF-0,5v Fração precipitada da alga S. filipendula com 0,5 volumes de acetona
SF-0,7v Fração precipitada da alga S. filipendula com 0,7 volumes de acetona
SF-1,0v Fração precipitada da alga S. filipendula com 1,0 volume de acetona
SF-1,5v Fração precipitada da alga S. filipendula com 1,5 volumes de acetona
SF-2,0v Fração precipitada da alga S. filipendula com 2,0 volumes de acetona
TCA Ácido Tricloroacético
TT Tempo de trombina
v/v Volume/Volume
XIL Xilose
Z-VAD (carbobenzóxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona)
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SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................. 18
1.2- Polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas...................................... 19
1.2.1- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS. ................ 20
1.2.2- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERDES ..................... 22
1.2.3- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERMELHAS .............. 24
1.3- Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 25
1.3.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E CASCATA DA COAGULAÇÃO. ... 25
1.3.2. POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS COM ATIVIDADE ANTICOAGULANTE .............................................................. 28
1.4- Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ............................................................................................................................... 31
1.5- Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 33
1.5.1. MORTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSE) dependente de caspases. ............................................................................................................ 33
1.5.3. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS................................................. 38
2 – OBJETIVOS ........................................................................................................ 41
2.1- Objetivos gerais............................................................................................... 41
2.1- Objetivos específicos ...................................................................................... 41
3 – MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 42
3.1. Material biológico............................................................................................. 42
3.2. Outros materiais .............................................................................................. 43
3.2.1 – KITS E REAGENTES .............................................................................. 43
3.2.2 – PADRÕES ............................................................................................... 44
3.2.3 – APARELHOS ........................................................................................... 44
3.2.4 – PLASMA HUMANO ................................................................................. 45
3.2.5. CÉLULAS .................................................................................................. 45
3.3 – Obtenção dos polissacarídeos sulfatados ..................................................... 45
3.3.1- OBTENÇÃO DO “PÓ CETÔNICO” ........................................................... 47
3.3.2 – Obtenção do extrato polissacarídico (proteólise)..................................... 47
3.3.2 – Fracionamento com concentrações crescentes de acetona .................... 47
3.5 – Análises químicas.......................................................................................... 49
3.5.1 – DOSAGEM DE AÇÚCARES TOTAIS ..................................................... 49
3.5.2 – DOSAGEM DE SULFATO ....................................................................... 49
16
3.5.3 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS ................................................................... 49
3.5.4 – DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA ................ 49
3.6 – Atividade anticoagulante ............................................................................... 50
3.7. Atividade antioxidante ..................................................................................... 50
3.7.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL ........................................................ 50
3.7.2. SEQUESTRO DE RADICAIS HIDROXILAS .............................................. 51
3.7.3. SEQUESTRO DE RADICAIS SUPERÓXIDO ........................................... 51
3.7.4. QUELAÇÃO FÉRRICA .............................................................................. 51
3.7.5. PODER REDUTOR ................................................................................... 52
3.8. Atividade antiproliferativa ................................................................................ 52
3.9. Seleção das algas para extração dos polissacarídeos sulfatados .................. 52
3.10. Determinação dos mecanismos de ação antiproliferativo de SF-1,5v ........... 53
3.10.1. MARCAÇÃO COM ANEXINA V-FITC .................................................... 53
3.10.2. WESTERN BLOTTING ............................................................................ 53
3.10.3. DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE GSK ............................................ 54
3.11. Análise estatística.......................................................................................... 54
4 – RESULTADOS .................................................................................................... 55
4.1. Prospecção de polissacarídeos sulfatados bioativos extraídos de macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte ........................................................... 55
4.1.1. EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DAS MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO NORTE ....... 55
4.1.2. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ......................................................................................... 56
4.1.3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ........ 57
4.1.4. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ............................................................................................................................ 58
4.1.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ... 59
4.1.6. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS. ........................................................................................ 66
4.1.7. SELEÇÃO DAS ALGAS PARA EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS..................................................................................................... 67
4.2. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom D. delicatula. ................................................................. 68
4.2.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 68
4.2.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 69
4.2.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 71
17
4.2.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. ....................................................................................... 72
4.2.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 76
4.3. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom S. filipendula. ................................................................ 78
4.3.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 78
4.3.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 79
4.3.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 81
4.3.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. ...................................................................................... 82
4.3.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 86
4.4. Mecanismo de ação antiproliferativo da heterofucana SF-1,5v ....................... 88
4.4.1. SF-1,5v INDUZ APOPTOSE EM CÉLULAS HELA. .................................. 88
4.4.2.INDUÇÃO DA APOPTOSE PELA HETEROFUCANA SF-1,5v EM CELULAS HeLa É INDEPENDENTE DA ATIVAÇÃO DE CASPASES. .............. 89
4.4.3.DETERMINAÇÃO DO PAPEL DE GSK NA INDUÇÃO DA APOPTOSE POR SF-1,5v. ...................................................................................................... 91
4.4.4. SF-1,5v INDUZ A LIBERAÇÃO DE NÍVEIS ELEVADOS DE FATOR INDUTOR DE APOPTOSE (AIF) NO CITOPLASMA. ......................................... 92
5 – DISCUSSÃO ....................................................................................................... 94
5.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 94
5.2. Extração e caracterização de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S. filipendula. ..................................................................................................... 101
5.3. Determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente à linhagem celular tumoral HeLa. ............................................................................ 108
6 – CONCLUSÕES ................................................................................................. 114
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 115
8 - APÊNDICES ...................................................................................................... 133
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
18
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Macroalgas marinhas
As macroalgas marinhas são organismos fotossintéticos aquáticos, que apesar
de não formarem uma categoria taxonômica monofilética (não apresentam um
ancestral comum) são agrupadas segundo uma característica única: a ausência de
tecido constituído por células estéreis que envolvam os órgãos de reprodução.
(OLIVEIRA FILHO & BERCHEZ, 1978; BICUDO et al. 1998).
Segundo a classificação adotada por Raven et al (2001), as macroalgas
marinhas podem ser divididas de acordo com a presença de pigmentos acessórios à
clorofila a, o principal pigmento fotossintético (Tabela I). As três divisões de algas,
inteira ou parcialmente multicelulares compreendem as algas vermelhas (divisão
Rhodophyta), as algas pardas (divisão Phaeophyta) e as algas verdes (divisão
Chlorophyta).
Tabela I. Principais características das macroalgas
As macroalgas marinhas apresentam um alto valor nutritivo, sendo ricas em
carotenóides, proteínas, fibras dietéticas, ácidos graxos essenciais, vitaminas e
minerais. Existem relatos que as algas já eram utilizadas como fonte alimentícia há
pelo menos dez mil anos no Japão. Nos países asiáticos, as macroalgas marinhas
Ordem Tipo de
clorofila Outros pigmentos
Substâncias
de reservas
Constituição
da parede
celular
Chlorophyta a, b Carotenos Amido Celulose,
pectinas
Phaeophyta a, c Luteina e fucoxantina Laminarina e
manitol
Celulose,
alginato
Rhodophyta a, d
Carotenos, xantofilas,
ficocianina e
ficoeritrina
Amido das
florideas
Celulose,
pectinas
Fonte: Adaptado de Raven et al., 2001
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
19
chegam a constituir cerca de 25% da dieta humana, sendo encontradas em
alimentos como o sushi, sopas, biscoitos, aperitivos e saladas (MCHUGH, 2003).
Além de sua utilização como fonte de alimentos, as macroalgas marinhas são
fontes de um amplo espectro de compostos de interesse comercial e são utilizadas
nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, de cosméticos, e na agricultura. Dentre
esses compostos podemos destacar os alginatos, que são polímeros constituídos de
monossacarídeos ácidos (ácido gulurônico e ácido manurônico), de caráter viscoso,
produzidos por certas espécies de algas pardas. Eles são utilizados na fabricação de
papel e como estabilizadores de creme dental e sorvete (KOBAYASHI, 1986,
MINHAS et al., 2002); agar e carragenanas, que são polissacarídeos sulfatados ricos
em galactose, encontradas em algumas espécies de algas vermelhas e usadas em
diversas finalidades como na fabricação de cosméticos, gelatina e meios de cultura
(TRIUS & SEBRANEK, 1996, RASMUSSEN & MORRISSEY, 2007).
As macroalgas marinhas ainda produzem outros metabólitos com potencial
econômico importante como ácidos graxos, esteróides, carotenóides, lectinas,
aminoácidos tipo-micosporinas, compostos halogenados, policetídeos, toxinas, e
principalmente outros polissacarídeos sulfatados, que fazem destes organismos foco
das mais diversas pesquisas biomédicas ((ROCHA et al., 2005b, ROCHA et al.,
2006, MANDAL et al., 2008, LUO et al., 2009, MAKARENKOVA et al., 2009, POMIN,
2009, CIANCIA et al., 2010, JIN et al., 2010, KIM et al., 2010a, CAMARA et al., 2011,
CARDOZO et al., 2011, COURA et al., 2011, ERMAKOVA et al., 2011, JIAO et al.,
2011, VISHCHUK et al., 2011, YANG et al., 2011)CARDOZO et al., 2007;
O’SULLIVAN et al., 2010)
1.2- Polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas
Dentre os diferentes compostos bioativos extraídos das algas, destacam-se
os polissacarídeos sulfatados. Eles se localizam na matriz mucilagenosa das algas e
sua função biológica parece estar relacionada com a proteção contra desidratação
solar em períodos de baixa maré, além de oferecer uma maior flexibilidade à alga,
permitindo assim, o seu crescimento em ambiente aquático, e uma rigidez suficiente
para permanecer estendida e assim captar a luz e os nutrientes com mais eficácia
(MICHEL et al., 2010)
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
20
Pesquisas realizadas com polissacarídeos sulfatados de algas têm
demonstrado que tanto a composição quanto a estrutura desses compostos variam
de espécies para espécies e, às vezes, em diferentes partes do mesmo espécime
(FARIAS, 1992; DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000; HAROUN-BOUHEDJA et al.,
2000). A complexidade na estrutura desses compostos é devido às muitas
possibilidades de ligações entre os monossacarídeos e a distribuição de
grupamentos sulfato. Portanto, cada polissacarídeo pode possuir conformação
estrutural única, e, conseqüentemente apresentar atividades farmacológicas
diferentes e/ou mais potentes de que outros polissacarídeos ou outros compostos já
descritos (ROCHA et al., 2005b, CIANCIA et al., 2010, ERMAKOVA et al., 2011,
JIAO et al., 2011).
1.2.1- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS
As Phaeophyceas possuem na sua constituição apenas um único grupo de
polissacarídeos sulfatados: As fucanas (QUILLET, 1961). Esses polímeros têm como
característica principal à presença da L-fucose sulfatada na sua estrutura (LEITE et
al., 1998b, ALMEIDA-LIMA et al., 2010).
A nomenclatura dos polissacarídeos sulfatados de algas marrons ainda é
controversa, entretanto a definição da IUPAC é a mais utilizada. Para os
polissacarídeos de algas marrons que apresentam em sua constituição mais de 90%
de L-fucose é recomendado o uso do termo fucana, enquanto que para aqueles com
menos de 90% de fucose utiliza-se a denominação fucoidan (BERTEAU & MULLOY,
2003). Porém, é comum a utilização de outros critérios na nomenclatura destes
polissacarídeos. Utilizando a constituição monossacarídica como principal critério de
classificação, Medeiros (2008) organizou as fucanas em quatro grupos de
polissacarídeos: Fucoidan, polímeros constituídos totalmente ou quase totalmente
por fucose; xilofucoglucuronanas, que possuem uma estrutura central formada por
um poliglucoronideo, a qual esta ligada cadeias laterais formadas por açúcares
neutros (LEITE et al., 1998a); glucuronogalactofucanas ou glucuronofucogalactanas
(GRAUFFEL et al., 1989); e galactofucanas (ROCHA et al., 2005a). O grupo de
pesquisa no qual este trabalho está inserido utiliza preferencialmente a classificação
da IUPAC para definição destes polímeros (ALBUQUERQUE et al., 2004,
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
21
BARROSO et al., 2008, ALMEIDA-LIMA et al., 2010), o que torna conveniente a
adoção desta classificação no decorrer do trabalho.
As fucanas vêm sendo descritas como possuidores das mais diversas
atividades farmacológicas, resumidas na Tabela II.
Tabela II. Algumas das atividades farmacológicas atribuídas as fucanas.
Atividade Alga Referências
Angiogênica Fucus vesiculosus, Sargassum stenophyllum
(SOEDA et al., 2000, DIAS et al., 2005, MATSUBARA et al., 2005)
Anti complemento Laminaria cichorioide, L. japonica, Fucus evanescens Ascophyllum nodosum
(BLONDIN et al., 1994, ZVYAGINTSEVA et al., 2000, BOISSON-VIDAL et al., 2007)
Anti migratória F. vesiculosus, A. nodosum. (GIRAUX et al., 1998, SOEDA et al., 2000)
Antiadesiva A. nodosum, Laminaria brasiliensis, Spatoglossum schröederi, S. stenophyllum
(LIU et al., 2000, ROCHA et al., 2001)
Anticoagulante
Saccharina latíssima, Lessonia vadosa, Dictyota menstruallis, L. cichorioides, Padyna gymnospora
(ALBUQUERQUE et al., 2004, SILVA et al., 2005, CUMASHI et al., 2007, YOON et al., 2007, CHANDIA & MATSUHIRO, 2008, CROCI et al., 2011)
Antiinflamatória
Lobophora variegata, Sargassum hemiphyllum, F. vesiculosus
(HWANG et al., 2011, PAIVA et al., 2011, PARK et al., 2011)
Antilipidêmica
F. vesiculosus (YOKOTA et al., 2009)
Antioxidante
L. japônica, Sargassum palidum, Undaria pinnatifida
(WANG et al., 2008, YE et al., 2008, HU et al., 2010, JIAO et al., 2011)
Antiproliferativa
A. nodosum, Laminaria setchellii, Macrocystis integrifolia, Nereocystis leutkeana, Ecklonia cava
(ELLOUALI et al., 1993, ELLOUALI et al., 1994, ATHUKORALA et al., 2006, YUAN & WALSH, 2006, ALMEIDA-LIMA et al., 2010)
Antitrombótico A. nodosum, S. schröederi (MAURAY et al., 1998, ROCHA et al., 2005c,
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
22
BARROSO et al., 2008, JIAO et al., 2011)
Antitumoral U. Saccharina japônica, Sargassum hornery, E. cava
(CROCI et al., 2011, ERMAKOVA et al., 2011, VISHCHUK et al., 2011)
Anti-úlcera C. okamuranus (NAGAOKA et al., 2000, SHIBATA et al., 2000, SHIBATA et al., 2001)
Antiviral S. horneri, C. indica
(HOSHINO et al., 1998, MANDAL et al., 2007, HAYASHI, 2008, CARDOZO et al., 2011, JIAO et al., 2011)
Bloqueio de ligação espermatozoide-epitélio do oviduto
F. vesiculosus (SUAREZ et al., 1998)
Estímulo de síntese de heparan antitrombótico
S. schröederi (ROCHA et al., 2005a, BARROSO et al., 2008)
Fibrinolítica
E. kurome, F. vesiculosus (DOCTOR et al., 1995, NISHINO et al., 2000)
Hepato-protetora
F. vesiculosus, C. okamuramus
(NAKAZATO et al., 2010, HONG et al., 2011)
Adaptado de ROCHA et al., 2006
1.2.2- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERDES
Os polissacarídeos sulfatados de algas verdes são de longe os menos
estudados quanto as suas atividades biológicas, entretanto, o número de
polissacarídeos que tiveram sua caracterização estrutural definida vem crescendo
consideravelmente nos últimos anos, principalmente para os polissacarídeos
sulfatados das algas dos gêneros Codium (CIANCIA et al., 2007, FARIAS et al.,
2008, ESTEVEZ et al., 2009, OHTA et al., 2009, LEE et al., 2010, SABRY, 2010).
Os trabalhos de elucidação estrutural dos polissacarídeos sulfatados das espécies
do gênero Codium têm mostrado uma grande quantidade de polissacarídeos
compostos de galactose em sua parede celular, juntamente com outros
heteropolissacarídeos (FARIAS, 2006, BILAN et al., 2007, FARIAS et al., 2008,
ESTEVEZ et al., 2009).
Além das galactanas, comumente encontradas nas espécies do gênero
Codium (FARIAS et al, 2008; BILAN et al, 2007), uma variedade de outros
polissacarídeos são sintetizados pelas algas verdes. Já foram descritas arabinanas
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
23
(SIDDHANTA et al., 1999, HAYAKAWA et al., 2000), uma heteroglicomanana da
alga Enteromorpha compressa (RAY, 2006), uma ramnana da alga Monostroma
nitidum (KARNJANAPRATUM & YOU, 2011), bem como diversos outros
polissacarídeos heterogêneos ricos em galactose, manose, xilose, arabinose e/ou
ácidos urônicos (CIANCIA et al., 2010).
Estes dados permitem inferir que os polissacarídeos sulfatados sintetizados
pelas algas verdes apresentam uma maior heterogeneneicidade do que aqueles
encontrados nas outras algas, dificultando o entendimento da relação do
polissacarídeo com sua atividade farmacológica.
A importância farmacológica destes polissacarídeos sulfatados de algas
verdes foi evidenciada ao se verificar uma gama de atividades farmacológicas
(Tabela III). Entretanto, o número de trabalhos realizados com estes polissacarídeos
ainda é pequeno quando comparado com as fucanas. Ultimamente, vários trabalhos
têm relatado a estrutura molecular de polissacarídeos de algas verdes, o que poderá
facilitar a elucidação dos mecanismos de ação destes compostos, bem como a
relação atividade/estrutura (BILAN et al., 2007, LAHAYE & ROBIC, 2007, FARIAS et
al., 2008, CIANCIA et al., 2010).
Tabela III. Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas verdes
Atividade Alga Referências
Anticoagulante Codium fragile; C. vermilara
C. isthmocladum (FARIAS, 2006, CIANCIA
et al., 2007)
Antiviral Caulerpa recemosa; Ulva
lactuta; Codium latum
(GHOSH et al., 2004, LEE et al., 2004, OHTA
et al., 2009)
Antitumoral Ulva lactuta (KAEFFER et al., 1999)
hiperlipidemica. Ulva pertusa (PENGZHAN et al., 2003)
Anti-angiogênica Codium cillindricum (MATSUBARA et al.,
2003)
Anti-hepatotóxica Ulva reticulata (RAO et al., 2004)
Imuno-estimulatória
C. fragile (LEE et al., 2010)
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
24
1.2.3- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERMELHAS
As algas vermelhas apresentam as galactanas sulfatadas como grupo
polissacarídico característico (Souza et al., 2007). No entanto, relatos de uma
xilomanana sulfatada extraída da alga Scinaia hatei (MANDAL et al., 2008) e um
heteropolissacarídeo extraído da alga Gloiopeltis tenax contendo alguns resíduos de
fucose sulfatados (LIM & RYU, 2009) foram recentemente descritos.
Galactanas de algas vermelhas são polissacarídeos ramificadas com
unidades alternantes de (1�3)-�-D-galactopiranose (Unidade A) e (1�4)-3,6-
anidrogalactopiranose ou α-galactopiranose (Unidade B), apresentando diferentes
graus e posições de sulfatação. De acordo com a estereoquímica da unidade B, as
galactanas podem ser classificadas como: agaranas, quando esta unidade pertence
à série L (MARINHO-SORIANO & BOURRET, 2005); e carragenanas quando
pertence à série D (NAIK et al., 1980, ESTEVEZ et al., 2004).
Existem vários relatos na literatura sobre atividades farmacológicas/biológicas
atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas (SILVA et al, 2009).
Uma das mais estudadas é a antivíral. Xilomananas e derivados purificados da alga
Sebdenia polydactyla apresentaram atividade significante contra Herpes Simplex
vírus tipo-1 (HSV-1) (GHOSH et al., 2009). Esta mesma cepa viral foi fortemente
inibida por galactanas de Gigartina skottsbergii e Porphyridium sp. (CARLUCCI et
al., 1999, HUHEIHEL et al., 2002). A atividade anti-HIV também vem sendo relatada
para diversas algas, como por exemplo: Schizymenia pacifica, Eucheuma cottoni
(WITVROUW & DE CLERCQ, 1997) e Nothogenia fastigiata (DAMONTE et al., 1994,
WITVROUW & DE CLERCQ, 1997). Em um estudo mais detalhado foi demonstrado
que a atividade antiviral de galactanas de Chondrus ocellatus estava relacionada
com as suas massas moleculares, aquelas de menor tamanho apresentavam maior
atividade (ZHOU et al., 2004). Contudo, são necessários mais estudos semelhantes
com polissacarídeos de outras algas para que se possa afirmar que a menor massa
molecular é importante para que uma galactana desempenhe essa atividade de
forma considerável.
Recentemente, polissacarídeos sulfatados comerciais extraídos das Outra
atividade biológica atribuída aos polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas é a
atividade antiparasitária, especificamente a inibição da proliferação de Plasmodium
sp., causador da malária. Essa atividade foi relatada para três carragenanas com
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
25
diferentes padrões de sulfatação, que inibiram “in vitro” o crescimento de
Plasmodium falciparum, assim como, a adesão dessas a glicoproteína humana
CD36 (ADAMS et al., 2005).
A medicina veterinária também busca nos polissacarídeos sulfatados um
fármaco potencial e entre estes tem-se carragenanas que mostraram entre 89-100%
de atividade inibitória de ligação entre Escherichia coli e fibras de colágeno de
tecidos bovinos (MEDINA, 2001).
Entre outras atividades relacionadas aos polissacarídeos sulfatados de algas
vermelhas temos: Efeito hipolipidêmico, atribuído a porphyran, um polissacarídeo
sulfatado extraído da alga Porphyra haitensis (INOUE et al., 2009); Atividade de
inibição do sistema complemento por uma λ-carragenana de Chondrus armatus
(ZVYAGINTSEVA et al., 2000); atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de
galactanas extraídas de Gracilaria córnea (COURA et al., 2011) e atividade
antitumoral (LINS et al., 2009).
1.3- Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas.
1.3.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E CASCATA DA COAGULAÇÃO.
O aumento da incidência de doenças cardiovasculares vem impondo uma
maior demanda por fármacos anticoagulantes, o que leva a um aumento na procura
por novos fármacos. A heparina é o único polissacarídeo sulfatado atualmente
utilizado como anticoagulante, entretanto, ela pode apresentar algumas reações
adversas indesejáveis, como o aparecimento de trombocitopenia em alguns
pacientes, decorrente do seu uso prolongado (Fabris et al., 2000), como também, ela
pode apresentar o risco existente de contaminação viral, uma vez que é obtida de
tecidos animais (NADER et al., 2001, NADER et al., 2004). Outro agravante é o
aparecimento de contaminações em lotes de heparinas comerciais. Recentemente,
um condroitin supersulfatado foi isolado de preparações contaminadas de heparina,
e este tem sido associado a uma gama de efeitos adversos (GUERRINI et al., 2008,
LIMA et al., 2011, RUDD et al., 2011). Ainda, um outro contaminante foi identificado,
TBEP (tris(2-n-butoxietil fosfato), e este está associado a eventos de toxicidade no
sistema nervoso e no fígado, entre outros (SASSAKI et al., 2011). Por outro lado,
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
26
problemas tromboembólicos se apresentam em diferentes condições clinicas que
variam para cada paciente, e a tendência atual do mercado farmacológico é buscar
um fármaco especifico para cada terapia.
O processo de coagulação, alvo da maioria dos fármacos utilizados na terapia
anticoagulante, é um mecanismo fisiológico complexo que envolve diversos
elementos: paredes vasculares, plaquetas e proteínas solúveis nas imediações de
lesões traumáticas (VINE, 2009, RAO & MACKMAN, 2010, BAKER & BRASSARD,
2011).
Em meados dos anos 60, numa tentativa de explicar os mecanismos da
coagulação, Macfarlane, Davie e Ratnoff propuseram uma hipótese que continha a
seqüência de eventos responsáveis pela fisiologia da coagulação (Macfarlane, 1964;
Davie and Ratnoff, 1964). Tal hipótese acabou se tornando um modelo clássico da
coagulação sangüínea. Nele a coagulação ocorre por meio da ativação proteolítica
seqüencial de zimógenos, por proteases presentes no plasma, resultando na
formação da trombina que por sua vez converte a molécula de fibrinogênio em
fibrina. Este modelo (figura 04) divide o mecanismo da coagulação em três vias:
extrínseca (que envolve componentes do próprio sangue e outros que usualmente
não o compõe) e intrínseca (contém somente componentes do próprio sangue) e a
via comum (o ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca que leva a
ativação da fibrina).
A via extrínseca é desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual
(CHARGAFF et al, 1936): Fator VIIa (FVIIa) que ativa o fator X (RAO & MACKMAN,
2010, BAKER & BRASSARD, 2011). O fator tecidual é uma molécula
transmembrana de diversas células localizadas fora dos vasos sanguíneos, e é uma
das principais moléculas responsáveis pela fase inicial da coagulação (MANLY et al.,
2011). FT é exposto na coagulação sanguínea logo após uma injuria vascular, e
possui uma alta afinidade com o FVII que favorece a formação do complexo
(Dahlbäch, 2000).
A via intrínseca envolve somente componentes que estão presentes no meio
intravascular, e é iniciada pela ativação do fator XII (FXII) dado pelo seu contato com
o sangue e/ou qualquer superfície contendo cargas negativas, que desencadeia uma
serie de ativação protéica ativando diretamente o fator X (VINE, 2009).
O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecida como
via comum da coagulação, e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
27
pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator
XIIIa. (Franco, 2001). A Figura 1 sumariza a seqüência de ativação proteolítica
existente na cascata de coagulação.
Um novo modelo da cascata de coagulação que envolve complexos pró-
coagulantes de forma semelhantes da que ocorre no modelo clássico foi proposto.
São relacionados três complexos enzimáticos pró-coagulantes que vão culminar na
ativação da trombina: Complexo “tenase” extrínseco (fator tecidual (FT) + VIIa),
complexo “tenase” intrínseco (IXa + VIIIa) e complexo “protrombinase” (Va + Xa).
Nesse modelo o inicio da coagulação se faz mediante ligação do fator VIIa ao fator
tecidual (CHARGAFF et al.), também conhecido como fator III, com subseqüente
ativação dos fatores IX e X. O fator IX ativo irá se associar ao fator VIII, ativá-lo e
juntos formarão o complexo “tenase” intrínseco, esse ativa o fator X com eficiência
ainda maior. O fator Xa forma um complexo com o fator Va (complexo
“protrombinase”) convertendo o fator II (protrombina) em fator IIa (trombina). Esse
mecanismo pode ser visualizado na Figura 02.
Figura 1. Modelo clássico da cascata de coagulação. (Figura adaptada de Franco, 2001)
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
28
Simultaneamente a esses processos de formação do trombo,
independentemente da via utilizada, existe a ação de fatores anticoagulantes
(fisiológicos) que impedem a propagação desse trombo tais como: proteína C e S,
antitrombina (AT) e cofator II da heparina (HCII).
Assim, quando se evidencia um desequilíbrio entre os processos de formação
do coágulo (coagulação) e dissolução do mesmo (fibrinólise), a chance de se
adquirir uma doença cardiovascular torna-se bastante elevada.
1.3.2. POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS COM
ATIVIDADE ANTICOAGULANTE
Os polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas apresentam-se como
um dos principais grupos de compostos com potencial anticoagulante/antitrombótico.
Eles apresentam-se como promissores fármacos para a substituição da heparina,
devido principalmente, a grande diversidade estrutural, o que fornece a possibilidade
Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. (a) O Fator VII encontra-se ativado em concentrações muito baixas no sangue. (b) O Fator VIIa tem alta afinidade pelo FT. O complexo FT/VIIa é capaz de converter uma quantidade significativamente maior de Fator VII, gerando o Fator VIIa. (c) No entanto o principal papel de FT/VIIa é formar um complexo com os Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), levando a formação dos Fatores Xa e IXa. O Fator Xa, por sua vez, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez ativam os cofatores V e VIII. (d) Os Fatores IXa e VIIIa se complexam ao Fator X (Complexo tenase intrínseco) ativando mais moléculas de trombina. (e) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II (Complexo protrombinase) aumentando consideravelmente sua conversão em trombina (a formação de trombina por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). FT: Fator tecidual. (CÂMARA, 2010).
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
29
deles apresentarem mecanismo de ação diferente da heparina (ROCHA et al.,
2006).
Desde quando foi descrita pela primeira vez (CHARGAFF et al., 1936), a
atividade anticoagulante associada com polissacarídeos de algas vermelhas vem
sendo estudada. Esses polissacarídeos têm propensão a formar complexos solúveis
com proteínas plasmáticas, tal como o fibrinogênio e o seu mecanismo de ação se
dá principalmente por via de inibição da trombina (SHANMUGAM et al., 2001).
Três galactanas foram purificadas da alga Botryocladia occidentalis e
denominadas F1, F2 e F3 de acordo com suas eluições em NaCl de uma coluna
troca iônica. Somente as frações F2 e F3 mostraram potente ação anticoagulante
em testes de aPTT. Suas estruturas são formadas por unidades dissacarídicas
repetidas de (1�4)-α-D-Gal-1�3-β-D-Gal com variáveis padrões de sulfatação,
sendo que um terço das α-Gal são 2-3-dissulfatadas e os demais 1/3 são 2-O-
sulfatadas. Nos testes de aPTT, as frações F2 e F3 apresentaram respectivamente
150 unidades internacionais (UI)/mg e 130 UI/mg e ambas potencializaram a inibição
de trombina e fator Xa por AT (Antitrombina) e/ou HCII (Cofator II da heparina)
(FARIAS et al., 2000).
Em trabalho posterior foi purificada uma galactana da alga Gelidium crinale
composta de uma α-Gal e D-Gal ligados na posição 1�3, com 15% das unidades α
sendo 2-3-dissulfatadas e outros 55% sendo 2-sulfatadas. Quando desafiada ao
teste de aPTT, a galactana apresentou 60 UI/mg, sendo sua ação dada pela
potencialização da inibição da trombina pela AT e do fator Xa pelo HCII (PEREIRA et
al., 2005).
Os polissacarídeos de algas marrons são de longe os mais estudados quanto
ao potencial anticoagulante desde 1941, quando foi descoberto tal potencial em
extratos de algas do gênero Laminaria (KIMURA, 1941). Como destaques têm-se as
algas Fucus vesiculosus e Ascophyllum nodosum (NISHINO et al., 1991b,
CHEVOLOT et al., 2000, HAROUN-BOUHEDJA et al., 2000). A ação inibitória
desses compostos sobre a formação do coágulo de fibrina ocorre principalmente
através da potencialização de anticoagulantes naturais: antitrombina e cofator II da
heparina (NISHINO et al., 1991a, MINIX & DOCTOR, 1997). Contudo, inibição do
fator Xa também pode ocorrer em menor escala (DROZD et al., 2006, YOON et al.,
2007)
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
30
Muitas fucanas podem agir também de forma indireta na alteração do
processo de coagulação, como promovendo a liberação do TFPI (inibidor do fator
tecidual) ou de heparan sulfato, um glicosaminoglicano sulfatado produzido pelas
células endoteliais que apresenta ação antitrombótica (GIRAUX et al., 1998, ROCHA
et al., 2005a). Nesse último caso, foram extraídas da alga Spatoglossum schröederi
três fucanas denominadas A, B e C que quando submetidas a testes anticoagulantes
“in vitro” (Tempo de tromboplastina parcialmente ativada- aPTT; Tempo de
protrombina- PT; Tempo de trombina- TT) não apresentaram nenhuma atividade
considerável (LEITE et al., 2008). Contudo, as fucanas A e B apresentaram atividade
antitrombótica “in vivo” e foi atribuído essa atividade ao fato dessas fucanas
estimularem a síntese do heparan sulfato endotelial antitrombótico (ROCHA et al.,
2005a, BARROSO et al., 2008).
Os polissacarídeos de algas verdes são os menos explorados, e dentre essas
o gênero Codium é o que mais vem sendo estudado. O primeiro relato de
polissacarídeos anticoagulantes de Codium foi feito por Deacon-Smith (DEACON-
SMITH et al., 1985a). Esses autores trabalharam com quarenta e cinco espécies de
Codium e verificaram que os polissacarídeos dessas algas, na maioria galactanas,
apresentaram atividade anticoagulante nos testes de aPTT, PT e TT (DEACON-
SMITH et al., 1985b). Posteriormente, foi extraído e purificado da Codium fragile um
anticoagulante composto de xilose, arabinose e galactose que teve sua ação na
potencialização do Cofator II da Heparina (HC II) e Antitrombina (AT) (JURD et al.,
1995). Um homopolissacarídeo sulfatado constituído de arabinose foi extraído de
Codium dwarkense e mostrou potencial anticoagulante para o teste de TT (tempo de
trombina) similar ao da heparina (140,3 UI/mg), além de dobrar o tempo de
coagulação em relação ao tempo controle para os testes de PT e aPTT a partir das
concentrações de 100 µg/mL e 20 µg/mL, respectivamente (SIDDHANTA et al.,
1999).
Os mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados de
macroalgas marinhas relatados na literatura são sumarizados na Figura 3.
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
31
1.4- Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas.
Em anos recentes, estudos com polissacarídeos sulfatados de macroalgas
marinhas têm demonstrado que esses polímeros também apresentam um papel
importante na neutralização de radicais livres. Radicais livres são definidos como
átomos ou moléculas que apresentam elétrons despareados (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997). Estes são responsáveis por uma gama de desordens, como
doenças cardiovasculares, isquemia, mal de Alzheimer, além de estarem
diretamente envolvidos com inflamação, envelhecimento e a formação de câncer (CIOBICA et al., 2011, JOMOVA & VALKO, 2011, WHALEY-CONNELL et al., 2011).
Estudos recentes mostraram que fucanas apresentam um potencial
antioxidante mediado principalmente através da inibição de radicais superóxido e
sequestro de peróxido de hidrogênio (ZHANG et al., 2003b, HEO et al., 2005, WANG
et al., 2008)
Em acordo com este dado, extratos polissacarídicos de sete algas marrons
apresentaram atividade antioxidante, principalmente através do ensaio de sequestro
de radical superóxido, inclusive com resultados superiores aqueles vistos para
Figura 3. Mecanismos de ação anticoagulate dos polissacarideos sulfatados de algas marinhas. PS- polissacarídeo sulfatado; X- fator X inativo; Xa- fator X ativado; Va- fator V ativado; AT-antitrombina; HCII- Cofator II da heparina; TFPI- inibidor da via do fator tecidual. HS-heparan sulfato.
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
32
antioxidantes comerciais (HEO et al., 2005). Já F3, uma fucana purificada da alga
Laminaria japonica, apresentou excelente atividade antioxidante para o ensaio de
sequestro de radical superóxido, e de forma interessante inibiu cerca de 80% dos
radicais hidroxila formados, sendo o primeiro polissacarídeo sulfatado demonstrado
por apresentar atividade antioxidante através deste mecanismo (WANG et al., 2008).
Diferente desses resultados, uma fucana da alga Fucus vesiculosus mostrou
atividade antioxidante através do ensaio de poder antioxidante pela redução do íon
férrico (RUPEREZ et al., 2002).
Recentemente, fucanas tem sido relatadas por apresentar atividade
antioxidante através de uma variedade de mecanismos de ação. Cinco
heterofucanas isoladas da alga Canistrocarpus cervicornis apresentaram atividade
antioxidante através dos seguintes mecanismos: Sequestro de radicais superóxido e
hidroxila, capacidade redutora e principalmente capacidade quelante de íons ferro
(CÂMARA et al., 2011). Em outro estudo, uma fucana extraída da alga Lobophora
variegata, denominada F1, apresentou resultados similares, seqüestrando radicais
hidroxila e superóxido e mostrando excelente atividade redutora (SOUZA et al.,
2007).
Poucos estudos têm sido realizados com atividade antioxidante de
polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas e algas verdes. Contudo, a literatura
mostra que as espécies desses grupos são fontes de potenciais compostos
utilizados em terapias antioxidantes. Três polissacarídeos sulfatados da alga
vermelha Phorphyra haitensis apresentaram atividade antioxidante através da
inibição dos radicais superóxidos, além de inibir de forma significativa a peroxidação
lipídica, e inibir parcialmente a hemólise de eritrócitos de ratos induzidas por
peróxido de hidrogênio (ZHANG et al., 2003b).
Ulvana, um polissacarídeo sulfatado extraído da alga verde Ulva lactuta,
apresentou baixo poder antioxidante, entretanto, quando modificada pela adição de
grupamentos benzoil e acetil passou a mostrar excelente atividade antioxidante,
principalmente para o ensaio de radicais superóxido, que inclusive foi superior
aquela vista para a vitamina C (QI et al., 2006).
A atividade antioxidante mediada através de vários mecanismos não é
exclusividade de polissacarídeos sulfatados de algas marrons. F1 e F2, duas
xilogalactanas isoladas da alga vermelha Corallina officinalis apresentaram
considerável atividade antioxidante quando submetidas aos testes de sequestro de
INTRODUÇÃO
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33
radicais superóxido e hidroxila, atividade redutora e atividade total no ensaio de
radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Ainda, F1 e F2, quando desulfatadas
diminuíram drasticamente o seu potencial antioxidante, confirmando a importância
do sulfato para a atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados (YANG et al.,
2011).
1.5- Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas
1.5.1. MORTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSE) DEPENDENTE DE
CASPASES
Apoptose, ou morte celular programada, é um processo essencial para a
manutenção do desenvolvimento dos seres vivos, sendo descrito como um processo
fisiológico de eliminação celular (WYLLIE et al., 1981). O termo apoptose foi
originalmente usado referindo-se a um padrão de morte celular com características
morfológicas distintas da necrose (DESAGHER & MARTINOU, 2000).
A necrose pode ser definida como uma forma violenta de morte celular
iniciada por estímulos ambientais que resultam em rápida desregulação da
homeostasia (BRAS et al., 2005). Os eventos que ocorrem durante a necrose podem
ser descritos da seguinte forma: condensação da cromatina e aumento do volume
celular, dilatação mitocondrial e desagregação dos ribossomos (UCHIYAMA, 1995),
alteração na permeabilidade da membrana por diminuição nos níveis de ATP, que
tem como conseqüência comprometimento da bomba de Na+/K+ e de outros
fenômenos que são ATP-dependentes (TRUMP et al., 1997), rompimento de
organelas e da membrana plasmática e liberação de componentes intracelulares,
ocasionando uma reação inflamatória local (BOUJRAD et al.,2007, KERR et al.,
1995).
Por sua vez, o processo apoptótico se configura como um processo fisiológico
altamente regulado de morte celular programada e desempenha um papel relevante
na homeostase de diferentes tecidos em resposta a numerosos estímulos. É
caracterizada por alterações no citoesqueleto que induzem contração celular,
fragmentação do DNA, condensação da cromatina levando a aparência de núcleos
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
34
picnóticos, formação de vesículas sem perda de integridade da membrana e sem
resposta inflamatória (LAVIN, 1993; LIAO et. al., 2005; YASUHARA et al., 2003).
Existem múltiplas vias celulares que desencadeiam a apoptose (JEONG ;
SEOL, 2008). Duas vias apoptóticas são bem conhecidas em células de mamíferos:
A via extrínseca e a via intrínseca. A via extrínseca é iniciada pela ativação de
receptores de morte na superfície da membrana plasmática (JEONG ; SEOL, 2008;
BAO ; SHI, 2007). A via intrínseca é desencadeada através de sinais de estresse
celular, como danos no DNA (BAO ; SHI, 2007; CHIPUK et al., 2006), danos ao cito-
esqueleto, estresse ao retículo endoplamático, perda de adesão, ausência de fatores
de crescimento, inibição de síntese de macromoléculas e outros (CHIPUK et al.,
2006).
Ambas as vias são reguladas por caspases “(cysteine-dependent aspartate-
specific proteases)”, moléculas que pertencem à família das cisteínas proteases
(possuem uma cisteína no sítio ativo) que têm a capacidade de reconhecer e clivar
substratos que possuam resíduos de aspartato. As caspases, que estão presentes
constitutivamente na maioria das células de mamíferos, se localizam no citosol como
proenzimas e quando ativadas sofrem clivagem em cisteínas localizadas próximas
aos resíduos de ácido aspártico (GARRIDO e KROEMER, 2004; LAUNA et al., 2005;
HAIL et al., 2006).
A via extrínseca, ilustrada na Figura 4, é iniciada por associação de
monômeros de diferentes receptores de morte na membrana plasmática e, ao se
agruparem, promovem o recrutamento de proteínas adaptadoras (COHEN, 1997;
HAIL et al., 2006).
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
35
Dentre os receptores na membrana plasmática, o receptor fas/CD95 recruta
procaspase 8 e/ou procaspase 10, e a conseqüente elevação de seus níveis nas
proximidades da membrana garantem interação dessas caspases inativas com
proteínas adaptadoras associadas a fas/CD95. A interação desse complexo protéico
promove a autocatálise das procaspases que se tornam nesse momento em
caspases iniciadoras ativadas. A ativação proteolítica seqüencial de outras
caspases, culmina na ativação de caspases efetoras 3, 6 e 7 que estão no
citoplasma (HAJRA e LIU, 2004).
A via intrínseca ou mitocondrial é ativada predominantemente, com
envolvimento de alterações de permeabilidade de membrana mitocondrial e
liberação do Citocromo C para o citoplasma, que se liga ao Apaf-1 e pró-caspase-9,
formando o complexo apoptossomo (Figura 5). A caspase-9 ativa (iniciadora) pode
então clivar as caspases efetoras subsequentes (-2, -3, -6, -7, -8, -9, e -10).
Portanto, a ativação da caspase-9 mediada pelo Citocromo C serve como um
mecanismo de amplificação de sinais durante o processo apoptótico.
Fonte: GRIVICICH, 2007 Figura 4. Via extrínseca da apoptose. FasL- Fas Ligante. O recrutamento de receptores de morte (Fasl/Faz) recruta a pro-caspase 8 e pró-caspase 10. Estas últimas ativam a caspase 3, que induz a apoptose.(Fonte: GRIVICICH, 2007)
INTRODUÇÃO
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36
Membros pró-apoptóticos e antiapoptóticos da família Bcl-2 regulam a
liberação de Citocromo C a partir da membrana mitocondrial interna. A via
mitocondrial é frequentemente, ativada em resposta a danos no DNA, envolvendo a
ativação de um membro pró-apoptótico da família Bcl-2 (Bax, Bid). Por outro lado, os
membros antiapoptóticos da família Bcl-2 inibem a morte celular por apoptose
impedindo a formação de poros na membrana mitocondrial, com consequente
inibição da libertação do Citocromo C para o citoplasma (KO et al., 2011,
PUPYSHEV, 2011).
1.5.2. INDUÇÃO DA MORTE CELULAR INDEPENDENTE DE CASPASES
ATRAVÉS DA LIBERAÇÃO DO FATOR INDUTOR DE APOPTOSE NO CITOSOL.
A mitocôndria também está diretamente envolvida em eventos de morte
celular independentes da ativação das caspases, através da liberação de fatores
solúveis no citoplasma após sinais pró-apoptóticos específicos. O fator indutor de
apoptose (AIF), uma flavoproteína liberada no citosol a partir da mitocôndria, vêm
sendo considerada uma molécula chave na regulação da morte celular (KROEMER,
Figura 5. Via intrínseca da apoptose. Bax e bcl-2 controlam a liberação do citocromo Cque se liga ao Apaf-1 e pró-caspase-9, formando o complexo apoptossomo, ativando a caspase 3 e induzindo a apoptose.
Fonte: GRIVICICH, 2007
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
37
2001, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010). Esta proteína quando no
citosol, migra para o núcleo e induz a condensação da cromatina e fragmentação do
DNA em fragmentos de 50Kb, em um mecanismo independente da ativação das
caspases (SEVRIOUKOVA, 2011).
A primeira descrição de AIF foi no ano de 1996, e o nome da proteína deve-se
ao fato da manutenção da habilidade apoptogênica mesmo na presença de z-VAD,
um inibidor específico de pan-caspase (SUSIN et al., 1999). AIF é codificada como
uma proteína de 67 Kda, e encontra-se ancorada na membrana interna mitocondrial
pela sua região N-terminal, que contêm um sinal de localização celular, bem como
domínios ligantes para FAD (flavina adenina dinucleotídeo) e NADH (nicotinamida
adenina dinucleotídeo reduzida), e sua função fisiológica está associada a regulação
de processos oxidativos (HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010,
SEVRIOUKOVA, 2011).
Após estímulos específicos, como a hiperpolarização da membrana
plasmática e consequente influxo de Ca++ através de canais denominados HCN2, a
peptidase mitocondrial calpaina-1 (uma cisteíno-protease não lisossomal
dependente de cálcio) é ativada, cliva a região N-terminal de AIF, liberando a
proteína solúvel no espaço intermembrana da mitocôndria na sua forma madura, que
contêm um peso molecular de 52 Kda. Posteriormente, AIF maduro migra para o
citosol e transloca-se ao núcleo, contribuindo com o processo de fragmentação e
condensação da cromatina, por mecanismos ainda desconhecidos (NORBERG et
al., 2010). A liberação de AIF no citoplasma é regulada principalmente pelas
proteínas Bcl-2 e Bax. Na ausência de sinalização pró-apoptótica, Bcl-2 inibe a
abertura de poros na membrana interna mitocondrial, controlando o potencial
transmembrana mitocondrial, impedindo desta forma a translocação de AIF para o
citosol (TSUJIMOTO, 1998, SMITH et al., 2008, OZAKI et al., 2009). Por outro lado,
na presença de sinais pró-apoptóticos a proteína Bax interage com VDAC (canal
aniônico voltagem dependente), uma proteína de membrana mitocondrial externa,
promovendo a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial, que
são poros protéicos não seletivos localizados na membrana mitocondrial interna, que
por sua vez aumentam o influxo de cálcio e aceleram a liberação de AIF no citosol
(SHIMIZU et al., 2000, KIM et al., 2005, OZAKI et al., 2009, SCHARSTUHL et al.,
2009).
INTRODUÇÃO
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38
1.5.3. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DE MACROALGAS MARINHAS.
Atualmente o câncer é uma das maiores ameaças para saúde pública tanto
nos países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento. No Brasil, o câncer
é a segunda principal causa de morte por doença, superada apenas pelas doenças
cardiovasculares. Somente para o biênio 2010/2011, as estimativas apontavam para
a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer somente no Brasil (INCA, 2010).
Tendo em vista que a maioria dos tratamentos atualmente disponíveis, como
radioterapia e quimioterapia, utilizadas como primeira escolha para o tratamento do
câncer, apresentam sérios efeitos adversos como inibição da resposta imunológica,
visto que não apresentam toxicidade seletiva, se faz necessário buscar novos
fármacos com efeitos mais específicos e menor toxicidade (ROCHA et al., 2011).
Nesse sentido, diversos trabalhos foram realizados com polissacarídeos
sulfatados de macroalgas marinhas. Os mecanismos pelos quais os polissacarídeos
sulfatados desempenham suas atividades antiproliferativa frente a linhagens
tumorais são os mais diversos:
� Bloqueio do ciclo celular impedindo a proliferação das células tumorais (RIOU et
al., 1996, JI et al., 2004);
� Estimulo do sistema imunológico potencializando a ativação de linfócitos T,
macrófagos, neutrófilos e células NK (natural killers) e aumentando a produção
de óxido nítrico e interleucinas (MARUYAMA et al., 2006);
� Inibição da adesão celular à matriz extracelular (ROCHA et al., 2001);
� Potencialização do efeito antitumoral de quimioterápicos comerciais (ZHOU et al.,
2006).
� Inibição da angiogênese (formação de vasos sanguíneos) (LEE et al., 2008).
Entretanto, a ativação de diferentes vias de morte celular, especialmente a via
da ativação das caspases (AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007) parece ser o
principal mecanismo antitumoral dos polissacarídeos sulfatados de macroalgas
marinhas. Na ultima década, é possível acompanhar a caracterização de uma gama
de polissacarídeos sulfatados com capacidade de induzir apoptose em diferentes
linhagens celulares (AISA et al., 2005, HANEJI et al., 2005, MARUYAMA et al.,
2006, TERUYA et al., 2007, HYUN et al., 2009b, JIN et al., 2010).
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
39
Os polissacarídeos sulfatados mais bem caracterizados quanto à indução de
apoptose são aqueles extraídos de algas marrons. A fucana mais estudada com
relação ao seu mecanismo de ação antiproliferativo é a fucana de F. vesiculosus
conhecida como fucoidan. Este PS promove a ativação de caspase-3, o que
consequentemente induz apoptose de células de linfoma humano (HS-sultan cells).
Contudo, quando estas células foram incubadas com fucoidan e um inibidor de
caspases concomitantemente, observou-se que o efeito do fucoidan foi parcialmente
anulado. Os autores mostraram que o fucoidan não afetava a via da p38 quinase e
da AKT, mas diminuía a fosforilação de ERK (Extracellular Regulated-Kinase) e que
este efeito também levava as células entrarem em apoptose (AISA et al., 2005).
Quando este fucoidan de F. vesiculosus foi avaliado com células de carcinoma de
colo humano (HCT-15), observou-se que também estimulava apoptose nas HCT-15
por ativar caspases. Contudo, nestas células o fucoidan, ao contrario do visto
anteriormente, aumentava a fosforilação de ERK e de p38 quinase e bloqueava a via
da PI3K/AKT. Os dados mostraram que este efeito era responsável pela atividade
antiproliferativa do fucoidan (HYUN et al., 2009a). Já quando o mecanismo
antiproliferativo deste mesmo fucoidan foi avaliado em células pro-mielocíticas
humanas (HL60), verificou-se que além de ativar as caspases e aumentar os níveis
de fosforilação de ERK, o efeito antiproliferativo do fucoidan também era dependente
do aumento da produção de Óxido Nítrico (ON) e da diminuição dos níveis de
glutationa citoplasmáticos (Jin et al., 2010). Por outro lado, em células de câncer de
colo humano (HT-29), o fucoidan não modificou os níveis de fosforilação de ERK,
porém verificou-se que o fucoidan ativava caspases, promovia a liberação de fatores
mitocondriais pró-apoptóticos (citocromo C e Smac/Diablo) para o citoplasma e
aumentava os níveis de “death receptor 5 proteins”. Em suma, o mecanismo
antiproliferativo do fucoidan nas células HT-29 é mediado por duas vias: a via
mitocondrial (intrínseca) e a via ativada por receptores de morte (extrínseca) (KIM et
al., 2010b).
Estes resultados mostram que a via pela qual fucoidan da alga Fucus
vesiculosus promove apoptose varia de acordo com a linhagem celular.
Provavelmente esse achado é característico para todos os polissacarídeos
sulfatados de macroalgas marinhas, entretanto existe uma necessidade de estudos
mais aprofundados, com o objetivo de determinar os mecanismos de ação
INTRODUÇÃO
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
40
antiproliferativo de cada composto e elucidar a sua relação com a estrutura
molecular destes polissacarídeos.
OBJETIVOS
Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
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2 – OBJETIVOS 2.1- Objetivos gerais
Este presente estudo tem como objetivo geral realizar uma bioprospecção de
polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas coletadas no litoral do
Rio Grande do Norte, selecionando aqueles com maiores potenciais anticoagulante,
antioxidante e/ou antiproliferativo, e caracterizá-los físico-quimicamente e
determinando o(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação.
2.1- Objetivos específicos Este trabalho apresenta como objetivos específicos:
� Coletar macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte para extração de
extratos brutos ricos em polissacarídeos sulfatados;
� Determinar a composição química dos extratos polissacarídicos;
� Avaliar os extratos polissacarídicos quanto ao potencial anticoagulante, utilizando
kits comerciais de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de
protrombina (PT);
� Analisar o potencial antioxidante desses extratos através de diferentes ensaios in
vitro;
� Verificar a existência de atividade antiproliferativa dos extratos frente a linhagem
celular tumoral de cólon uterino, HeLa;
� Selecionar aquelas algas com maiores potenciais farmacológicos para posterior
isolamento de seus polissacarídeos sulfatados;
� Determinar o potencial farmacológico (anticoagulante, antioxidante e
antiproliferativo) e caracterizar físico-quimicamente os polissacarídeos sulfatados
isolados das algas selecionadas;
� Selecionar um polissacarídeo sulfatado a fim de determinar o mecanismo de
ação de pelo menos uma atividade biológica.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
42
3 – MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Material biológico
As algas utilizadas neste trabalho foram coletadas nas praias do litoral do Rio
Grande do Norte (Praia de Búzios, Praia de Maracajaú e praia de Macau) em marés
baixas (entre 0,0 e 0,2 metros), em diferentes períodos durante os anos de 2008 a
2010. As algas selecionadas e seus devidos locais de coleta são mostrados abaixo
(Tabela IV).
Tabela IV. Local de coletas das macroalgas marinhas
Divisão Espécie Local de coleta
Phaeophyta
Dyctiota cervicornis Praia de Camapum, Macau/RN
Dyctiopteris delicatula Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN
Dyctiota menstruallis Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN
Dyctiota mertensis Praia de Maracajaú, Maxaranguape/RN
Sargassum filipendula Praia de Maracajaú, Maxaranguape/RN
Spatoglossum schröederi Praia de Pirambúzios, Nízia
Floresta/RN
Rhodophyta Gracilaria caudata Praia de Camapum, Macau/RN
Chlorophyta
Caulerpa cupresoides Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN
Caulerpa prolifera Praia de Pirambúzios, Nízia
Floresta/RN
Caulerpa sertularioides Praia de Camapum, Macau/RN
Codium isthmocladum Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN
Após serem coletadas, as algas foram levadas ao laboratório (BIOPOL –
Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais), onde foram lavadas e retiradas
as epífitas e inclusões calcárias. Em seguida foram secadas em estufa a 45ºC,
trituradas e guardadas em recipientes apropriados..
MATERIAISEMÉTODOS
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43
3.2. Outros materiais
3.2.1 – KITS E REAGENTES
� 1,3 diamino propano, Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwake, WI, EUA). Acetona,
metanol, etanol, da Merck (São Paulo – SP);
� Acetona, metanol, etanol, da Merck (São Paulo – SP);
� Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant blue R 250, fosfato
de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, glicina, hidróxido de sódio,
peróxido de hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado da CRQ (Diadema, SP,
Brasil);
� Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil);
� Ácido clorídrico e metionina da Synth (Diadema, SP, Brasil);
� Ácido gálico da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP, Brasil);
� Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT) e riboflavina da Sigma-
Aldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil);
� Azul de toluidina, vermelho de cresol, coomasie blue R 250, oriundos da Sigma
Chemical Company (St. Louis, MO, EUA).
� Cloreto de ferro e reagente de Folin-Ciocalteau da Merck (Darmstadt, Alemanha);
� Estreptomicina/Penicilina, Gibco Invitrogen (California, Estados Unidos).
� Fenol e molibidato de amônia da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio
de Janeiro, RJ, Brasil);
� Kit de aumento de quimioluminescência (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.)
� Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e Kit de tempo protrombina da
Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil);
� Anticorpos para determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v
foram obtidos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA) e Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA);
� DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e RPMI 1640 da Cultilab, SP;
� Maxatase (protease alcalina P 126), da BIOCON do Brasil industrial Ltda. (Rio de
Janeiro, RJ, Brasil).
� Membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA).
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
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3.2.2 – PADRÕES
� L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose,
ácido D-glucurônico, ácido D-galacturônico, foram adquiridos da Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO, EUA ).
3.2.3 – APARELHOS
� Agitador de tubos mod. AP 56 da Phoenix Ltda. (Araraquara, SP, Brasil);
� Balanças analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
� Banho maria de temperatura constante da FANEM Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
� Bomba de Vácuo da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil)
� Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);
� Citometro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA);
� Coagulômetro da Drake (SãoPaulo,SP, Brasil);
� Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
� Espectrofotômetro da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
� Estufa da Odontobrás Ltda. (Ribeirão Preto, SP, Brasil);
� Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo, SP,
Brasil);
� Medidor de pH da PHS-3B da PHTEK (Japão);
� Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,
USA);
� Para western blot: PowerPacTM Power Supply; MiniPROTEAN®Tetra Caell; Mini
Trans-blot Cell ®, todos da BIO-RAD (SP, Brasil);
� Bancada de Fluxo Laminar – Pachane Pa300, Piracicaba – São Paulo;
� Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110 –
USA;
� Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia médica
hospitalar LTDA. São Paulo – São Paulo – Brasil;
� Centrífuga para tubos – QUIMIS C Lab. Comércio para laboratório LTDA. Natal –
RN – Brasil;
� Banho-Maria TCM144 – Tecnal Equipamentos para Laboratório LTDA – São
Paulo – SP – Brasil.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
45
3.2.4 – PLASMA HUMANO
O sangue humano foi coletado sobre citrato de sódio (concentração final
0,82%), sob agitação leve, em frasco de polietileno esterilizado. O plasma foi
separado por centrifugação e alíquotas de 10 mL foram estocadas a -20°C em
frascos de vidro esterilizados.
3.2.5. CÉLULAS
A linhagem celular HeLa foi gentilmente doada pelo Departamento de
Genética da UFRN. A linhagem celular MC3T3 foi gentilmente doada pelo
Departamento de Bioquímica da UNICAMP. As células foram cultivadas em meio
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) suplementado com 10% de soro fetal
bovino. Ao meio DMEM foram adicionados Estreptomicina (5000 �g/mL)/Penicilina
(5000 UI). As células foram mantidas em ambiente estéril com 5% de CO2.
3.3 – Obtenção dos polissacarídeos sulfatados Os procedimentos aplicados para extração dos polissacarídeos sulfatados e
caracterização farmacológica dos mesmos são sumarizados na Figura 6.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
46
Figura 6. Metodologia de extração e caracterização físico-química e farmacológica dos extratos polissacarídicos e das frações polissacarídicas das algas D. delicatula e S. filipendula. Cada macroalga marinha foi submetida ao processo de delipidação e despigmentação para a obtenção do pó cetônico. O pó cetônico de cada alga foi submetida a extração do extrato polissacarídico, enquanto o pó cetônico obtidos das algas D. delicatula e S. filipendula foram submetidos a extração das frações polissacarídicas. Os extratos polissacarídicos e as frações polissacarídicas foram posteriormente submetidos a caracterização físico-química, química e farmacológica. *metodologia aplicada apenas para as algas D. delicatula e S. filipendula. **Metodologia não utilizada para os extratos polissacarídicos.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
47
3.3.1- OBTENÇÃO DO “PÓ CETÔNICO”
As algas utilizadas neste trabalho foram separadamente submetidas à
despigmentação e delipidação, com a adição de quatro volumes de acetona PA. As
soluções ficaram à temperatura ambiente durante o período de 24 horas.
Posteriormente, todas as soluções passaram por um processo de decantação e
foram colocados para secar. O resíduo resultante deste processo foi denominado de
“Pó Cetônico” e armazenado para posterior utilização na etapa de proteólise.
3.3.2 – PROTEÓLISE E OBTENÇÃO DO EXTRATO POLISSACARÍDICO
Para a realização desta etapa, foram adicionados dois volumes de NaCl 0,25
M ao “Pó cetônico” obtido para cada macroalga, tendo essas soluções seu pH
ajustado para as condições ideais da enzima maxatase (pH 8.0). Cada recipiente
com esse material foi colocado em banho-maria a 60ºC durante um período de 16
horas. Depois, as soluções resultantes foram filtradas e os sobrenadantes
submetidos à centrifugação (10.000 g, durante 10 minutos à 4º C). Após a
centrifugação, foram adicionados a cada sobrenadante dois volumes de metanol
para precipitação dos polissacarídeos existentes neste extrato. As soluções foram
deixadas à temperatura ambiente durante 24 horas. Após esse período, as soluções
foram novamente centrifugadas (10.000 g, durante 10 minutos a 4º C). Os
sobrenadantes resultantes para cada alga marinha foram descartados e os
precipitados foram secos à pressão reduzida, triturados, pesados e devidamente
armazenados. O material obtido para cada alga foi denominado de extrato
polissacarídico.
3.3.2 – OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS DAS MACROALGAS
MARINHAS S. filipendula e D. delicatula
Os polissacarídeos sulfatados das algas Sargassum filipendula e Dictyopteris
delicatula foram submetidos a fracionamento com concentrações crescentes de
acetona. Ao pó cetônico obtido para cada alga foram adicionados dois volumes de
NaCl 0,25 M, tendo, essas soluções, o pH ajustado para as condições ideais da
enzima maxatase (pH 8.0). Cada recipiente com essas soluções foi colocado em
banho-maria a 60ºC durante um período de 16 horas. Depois, as soluções
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
48
resultantes foram filtradas e os sobrenadantes submetidos à centrifugação (10.000
g, durante 10 minutos à 4º C). Aos sobrenadantes foram adicionados volumes
crescentes de acetona, até o aparecimento de turvação. Na presença de turvação,
cada solução foi mantida na temperatura de 4º C por um período de 18 horas.
Posteriormente, as soluções turvadas de cada alga foram centrifugadas (10.000 g,
durante 10 minutos a 4º C) e secas à pressão reduzida. Este processo repetiu-se até
não ser mais verificado o aparecimento de turvação. A partir desta metodologia
foram obtidos as seguintes frações de polissacarídeos sulfatados: SF-0,5v, SF-0,7v,
SF-1,0v, SF-1,5v e SF-2,0v para a alga Sargassum filipendula e DD-0,5v, DD-0,7v,
DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v para a alga Dictyopteris delicatula. Após
secas, as frações polissacarídicas foram pesadas, e posteriormente foi determinada
a contribuição percentual de cada fração com relação à soma do peso seco total das
frações polissacarídicas.
3.4 – Eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose foi preparado na concentração 0,6% no tampão 1,3 diamino
propano acetato (PDA) e colocado sobre lâminas de vidro (7,5 X 7,5 cm X 1,5 mm,
ou 5,0 X 7,5 cm X 1,5 mm). Cinco microlitros de cada extrato polissacarídico e de
cada fração polissacarídica obtida, na concentração de 10 mg/mL, foram aplicadas
em canaletas no gel e submetidos à eletroforese em cuba resfriada a 4�C pelo
período de uma hora e meia. Após a corrida eletroforética (a 100 Volts), cada
composto foi precipitado com CETAVLON 0,1% por no mínimo 2 horas, a
temperatura ambiente. Depois, os géis obtidos foram submetidos a uma corrente
contínua de ar quente para serem secados e corados com azul de toluidina 0,6%. O
excesso de corante foi removido por uma solução de ácido acético 1% em etanol
50% (solução descorante). Após remoção do corante em excesso, as lâminas
reveladas foram secadas à temperatura ambiente e analisadas (DIETRICH &
DIETRICH, 1976).
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
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3.5 – Análises químicas 3.5.1 – DOSAGEM DE AÇÚCARES TOTAIS
Açúcares totais de cada extrato polissacarídico e de cada fração
polissacarídica obtida foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico,
utilizando-se como padrão galactose, sendo as leituras realizadas a 490 nm
(DUBOIS et al., 1956).
3.5.2 – DOSAGEM DE SULFATO
O teor de sulfato total de cada extrato polissacarídico e de cada fração
polissacarídica obtida foi quantificado, após uma hidrólise ácida com 4N de HCl por
6 horas à temperatura de 100°C, por turbidimetria pelo método da gelatina-bário,
tendo-se como padrão o sulfato de sódio (DODGSON & PRICE, 1962).
3.5.3 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS
O teor de proteína correspondente de cada extrato polissacarídico e de cada
fração polissacarídica obtida foi determinado com o reagente de comassie blue R
250 e a leitura realizada a 595 nm (SPECTOR, 1978).
3.5.4 – DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA
A composição monossacarídica dos polissacarídeos sulfatados das algas
Sargassum filipendula e Dyctiopteris delicatula foi determinada através de
cromatografia liquida de alta performance (HPLC) contendo um detector de índice
refrativo modelo L-2490. Utilizou-se uma coluna LichroCART® 250-4 (250 mm × 40
mm) contendo resina Lichrospher® 100 NH2 (5 μm). Os polímeros foram hidrolisados
(2 M HCl, 100 °C, 2 h) e posteriormente os seus monossacarídeos foram analisados.
Como referências, os seguintes açucares foram utilizados como padrões: arabinose,
galactose, glicose, fucose, manose, ramnose, ácido glucurônico, ácido manurônico,
N-acetil glicosamina e xilose. A fase móvel consistiu de uma mistura de 0,1 mol/l de
KH2PO4 (pH 10)-acetonitrila (80:20). O fluxo foi de 1.0 mL/min e a temperatura da
coluna foi de 80 °C.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
50
3.6 – Atividade anticoagulante Os ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de
protrombina (PT) foram realizados para cada extrato polissacarídico e cada fração
polissacarídica obtida seguindo o protocolo fornecido pelos “kits” comerciais
adquiridos (Labtest, Minas Gerais/Brasil). O “pool” de plasma citratado utilizado
nestes ensaios foi obtido após a centrifugação de sangue humano retirado de
indivíduos adultos, sadios e de ambos os sexos. Foi verificada, através desses
ensaios, a massa de cada composto necessária para prolongar em duas vezes o
tempo normal de coagulação. Foram utilizadas como meio de comparação da
atividade anticoagulante, a heparina e clexane (heparina de baixo peso molecular),
polissacarídeos sulfatados de origem animal utilizados comercialmente como
ferramenta anticoagulante. O tempo de coagulação foi determinado utilizando-se um
coagulômetro automático da marca Drake (São Paulo, Brasil).
3.7. Atividade antioxidante
3.7.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL
O ensaio é baseado na redução de Molibdênio+6 para Molibdênio+5 pelo
polissacarídeo sulfatado e subseqüente formação de um complexo esverdeado
Fosfato/Molibdênio+5 em pH ácido (PRIETO et al., 1999). Aos tubos contendo cada
extrato polissacarídico e cada fração polissacarídica foram adicionados os reagentes
(0.6 M ácido sulfurico, 28 mM fosfato de sódio e 4 mM molibdato de amônia), e
posteriormente as soluções foram incubados à 95º C por 90 min. Posteriormente, a
absorbância de cada solução foi medida a 695 nm contra um branco, contendo
apenas reagentes e água Mili Q. Os resultados tomam como base a atividade do
ácido ascórbico, um composto com atividade antioxidante conhecida. A capacidade
antioxidante total é expressa em equivalentes de acido ascórbico, sendo calculado a
partir da massa de ácido ascórbico necessária para apresentar uma atividade
antioxidante equivalente a 1000 mg do extrato polissacarídico ou da fração
polissacarídica analisada.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
51
3.7.2. SEQUESTRO DE RADICAIS HIDROXILAS
A atividade seqüestradora dos radicais hidroxilas de cada extrato
polissacarídico e de cada fração polissacarídica obtida foi investigada usando a
reação de Fenton (Fe2+ + H2O � Fe3+ + OH- + OH.). Esses resultados são
expressos como porcentagem de inibição dos radicais hidroxilas. Radicais hidroxila
foram gerados usando o método de previamente descrito (SMIRNOFF & CUMBES,
1989) com pequenas modificações. Em 3 mL de tampão fostato (150 mM, pH 7,4),
foi adicionado 10 mM FeSO4. 7H2O, 10 mM EDTA, 2 mM salicilato de sódio, 30%
H2O2 (200 µL) e variadas concentrações dos compostos testes (10, 50, 100, 500 e
1000 µg/mL). No controle, tampão fosfato substitui H2O2. As soluções foram
incubadas a 37º C por 1h, e a presença dos radicais hidroxilas foi monitorada a 510
nm.
3.7.3. SEQUESTRO DE RADICAIS SUPERÓXIDO
O ensaio é baseado na capacidade de cada extrato polissacarídico e de cada
fração polissacarídica obtida em inibir a redução fotoquímica do nitroblue tetrazolium
(NBT) no sistema riboflavina-luz-NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971,
DASGUPTAA & DE, 2007). Cada 3 mL da reação contém 50 nM de tampão fosfato
(pH 7.8), 13 mM de metionina, 2 μM riboflavina, 100 μM EDTA, NBT (75 μM), e 1 mL
de solução contendo os compostos testes (1, 5, 10, 25 e 50 µg/mL). A produção do
azul de formazan foi monitorada pelo aumento da absorbância a 560 nm após
iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A reação foi realizada em câmara
dissipadora de luz. Tubos idênticos com os reagentes foram colocados no escuro e
utilizados como branco.
3.7.4. QUELAÇÃO FÉRRICA
A habilidade quelante de íons ferrosos de cada extrato polissacarídico e de
cada fração polissacarídica obtida foi investigada de acordo método descrito
anteriormente (DECKER & WELCH, 1990) e com posteriores modificações (WANG
et al., 2008). A reação contendo FeCl2 (0.05 mL, 2 mM), e ferrozina (0.2 mL, 5 mM) e
os compostos testes em diferentes concentrações, foi agitada e incubada por 10
min à temperatura ambiente. A absorbância da reação é medida a 562 nm contra um
branco.
MATERIAISEMÉTODOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
52
3.7.5. PODER REDUTOR
O poder redutor das amostras foi quantificado de acordo com metodologia
previamente descrita (ATHUKORALA et al., 2006, WANG et al., 2008). 4 mL da
reação contendo diferentes concentrações dos polissacarídeos sulfatados em
tampão fosfato (0.2 M, pH 6.6) e ferricianeto de potássio (1%) foram incubados por
20 min. à 50ºC. A reação foi terminada pela adição da solução de ácido
tricloroacético (TCA) a 10%, e posteriormente misturada com água destilada e
cloreto de ferro (0,1%). A absorbância foi medida a 700 nm.
3.8. Atividade antiproliferativa A viabilidade celular das linhagens celulares HeLa (células tumorais de cólon
uterino humano) e MC3T3 (células pré-osteoblásticas murinas) foram tratadas com
as diferentes concentrações dos extratos polissacaridicos e dos polissacarídeos
sulfatados de S. filipendula e D. delicatula e avaliadas pelo método colorimétrico do
MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN., 1983).
Este método é baseado na redução do MTT a formazan pelas células vivas. 5 X 103
células foram colocadas em placas de Elisa estéril de 96 poços para um volume
final de 100 µL de meio DMEM 10% de soro fetal bovino. Posteriormente, as células
foram incubadas com diferentes concentrações das amostras (0.1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0
mg/mL). Após 24, 48 e/ou 72 horas, MTT (5 mg/mL) foi adicionado ás células, e
incubados por mais 4 horas. Após este período, o meio foi aspirado, e adicionou-se
100 µL de HCl 0,04N em álcool isopropílico para dissolver os cristais de formazan
formados e precipitados. A quantificação da absorbância foi feita em leitor de Elisa
em comprimento de onda de 562 nm. O ensaio foi realizado em quintuplicata. O
cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação com o
controle contendo células não tratadas com os polissacarídeos sulfatados.
3.9. Seleção das algas para extração dos polissacarídeos sulfatados
Para as escolha das macroalgas marinhas que tiveram seus polissacarídeos
sulfatados, após o termino do processo de bioprospecção dos extratos
polissacarídicos, foi desenvolvida uma ferramenta para avaliação dos resultados
encontrados neste trabalho levando-se em consideração os seguintes fatores:
Rendimento dos polissacarídeos, potencial farmacológico apresentado nos ensaios
MATERIAISEMÉTODOS
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53
anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo e a facilidade de obtenção das algas
em todos os períodos do ano no litoral potiguar. Para todos os fatores citados foram
definidos valores que variaram de 1 a 3, sendo: 1, um resultado considerado ruim; 2,
resultado considerado bom; e 3, resultado considerado ótimo. Por fim, a pontuação
geral obtida por cada alga foi calculada. A pontuação final foi denominada índice de
potencial farmacológico.
3.10. Determinação dos mecanismos de ação antiproliferativo de SF-1,5v
3.10.1. MARCAÇÃO COM ANEXINA V-FITC
As células HeLa (2,5 x 105 células/poço) foram cultivadas em placas de 12
poços por 24 horas e tratadas com concentrações pré-estabelecidas da amostra SF-
1,5v, obtida da alga S. filipendula. Após o tratamento e período de recuperação as
células foram tripsinizadas, transferidas para microtubos de centrífuga estéreis e
centrifugadas por 10 minutos à temperatura ambiente na velocidade de 2.400 RPM.
As células foram lavadas com meio DMEM F10 com soro e centrifugadas
novamente. Para o ensaio da anexina V foi utilizado o kit de detecção de apoptose
por Anexina-V marcada com FITC (Alexis, Lausen, Switzerland). A seguir, as células
foram ressuspendidas com 500 μL de tampão de ligação, 5 μl de anexina V
conjugada com FITC, e 5 μl de iodeto de propídio. A reação foi incubada por 5
minutos, a temperatura ambiente, sob abrigo da luz. A intensidade de fluorescência
(FITC e iodeto de propidio) foi avaliada utilizando o equipamento FACSCalibur
(Becton Dickinson, USA). Para cada ensaio, foram incluídos controle positivo (15
μg/mL de doxorrubicina), controle negativo (células não tratadas).
Para o ensaio de bloqueio da apoptose com o inibidor especifico de caspases
Z-vad, as células HeLa tratadas com SF-1,5v foram pré-incubadas com 50 mM de Z-
Vad(O-Me)-FMK por 45 minutos. A medição da apoptose foi feita de através da
análise da citometria de fluxo, de acordo com os procedimentos supracitados.
3.10.2. WESTERN BLOTTING
Células HeLa foram incubadas com SF-1,5v e após 24 h foram lavadas em
PBS e tratadas em 200 mL de tampão de lise [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), Tween 20
MATERIAISEMÉTODOS
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54
1%, desoxicolato de sódio 0,25%, NaCl 150 mM , 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM
NaF, e os inibidores da protease (1 mg / mL de aprotinina, 10 mg / mL e 1 mM
leupeptina 4-.(2-aminoetil) flúor benzenesulfonil] durante 2h no gelo. As
concentrações de proteínas foram determinados utilizando kit de ensaio de proteína
BCA (Pierce, EUA), com albumina de soro bovino como padrão. Aproximadamente
50 mg de proteínas foram misturadas com tampão de amostra 5 vezes concentrado
(Tris-HCl 150 mM, pH 6,8, contendo: β-mercaptoetanol 15%, SDS 6%, azul de
bromofenol 0,3%), fervidas por 5 min e separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 10%. Em seguida, as proteínas presentes no gel foram
eletrotransferidas para membranas de polivinilidenodifluorido (PVDF). Para bloquear
sítios de ligação inespecífica do anticorpo, as membranas foram incubadas
“overnight” em solução de TBS-T, contendo leite desnatado (5%) a 4 °C, lavadas em
tampão TBS-T e então incubadas overnight com os anticorpos primários adequados
à diluição de 1:1000 ou b-actina (controle). A visualização das proteínas foi realizada
utilizando anticorpo secundário específico conjugado a peroxidase e as bandas
imunorreativas foram visualizadas usando-se kit de aumento de
quimioluminescência (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.) e filme radiográfico,
segundo recomendações do fabricante.
3.10.3. DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE GSK
Para este ensaio, células HeLa (2,5 x 105 células/poço) foram cultivadas em
placas de 12 poços por 24 horas e foram previamente tratadas com cloreto de litium
(LiCl) por 1 h, seguida de incubação com 1,5 mg/mL of SF-1,5v por 24 h. Em
seguida, utilizou-se os mesmos procedimentos usados no ensaio de marcação com
anexina V-FITC,mostrado no item 3.10.1.
3.11. Análise estatística Todos os dados dos experimentos realizados são expressos como média ±
desvio padrão. Para testar diferenças entre frações, bem como diferentes
tratamentos da mesma fração, foi utilizado o teste de análise paramétrica de análise
de variância (ANOVA; SPSS 20.0.0 para Windows, 2011; SPSS Inc., Chicago, IL). O
teste de Student–Newman–Keuls (Nível de significância de p<0,01) foi aplicado para
se comprovar algumas similaridades encontradas pela ANOVA.
55
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4 – RESULTADOS 4.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados ativos extraídos de
macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte
4.1.1. EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DAS MACROALGAS
MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO NORTE
As macroalgas marinhas utilizadas neste estudo foram coletadas de acordo
com o descrito em Materiais e métodos. Após o processo de proteólise, os extratos
polissacarídicos foram obtidos através de precipitação com dois volumes de
acetona. Após secos, os extratos foram pesados e o rendimento percentual
individual foi obtido (Figura 7).
Os extratos obtidos das algas C. cupresoides, C. prolifera, C. sertularioides e
D. cervicornis apresentaram um rendimento muito baixo, com destaque para a
massa obtida para o extrato de C. sertularioides com apenas 2,4% de
polissacarídeos em relação ao peso seco da alga. Por outro lado, pode-se
destacar o rendimento obtido para os extratos das algas G. caudata, D. delicatula, D.
mertensiis, S. filipendula e S. schröederi, que variou de 16,7% (S. schröederi) a
24,2% (G. caudata).
56
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.1.2. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DOS EXTRATOS
POLISSACARÍDICOS
Para confirmar a presença de polissacarídeos sulfatados nos extratos obtidos,
estes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose com Tampão PDA. Após
coloração com azul de toluidina, o qual interage com compostos sulfatados e passa
a apresentar coloração violácea, tornou-se possível visualizar o perfil eletroforético
de cada extrato polissacarídico (Figura 8). Todos os extratos apresentaram uma
coloração violácea, indicando a presença de polissacarídeos sulfatados em todas as
amostras. Percebe-se ainda, um perfil eletroforético polidisperso para a maioria dos
extratos, destacando-se uma ou mais banda eletroforética. A exceção é o extrato
polissacarídico obtido da alga vermelha G. caudata, que apresenta apenas uma
única banda eletroforética bem definida.
Figura 7. Rendimento dos extratos polissacarídicos extraídos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte. O rendimento foi calculado a partir da razão da massa do extrato polissacarídico pela massa da alga seca. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3).
57
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.1.3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS
Para se determinar à quantidade de polissacarídeos e sulfato existentes nos
extratos obtidos das algas foram feitas dosagens químicas de açucares totais e
sulfato. A Tabela V sumariza os resultados obtidos. As algas verdes C. prolifera, C.
sertularioides e C. isthmocladum apresentaram o menor percentual de açúcares
totais (15,6%, 17,2% e 19,2%, respectivamente). Por outro lado, a chlorophyta C.
cupresoides apresentou o maior rendimento de açucares dentre todos os extratos
analisados, com 54,7%, seguida de D. menstruallis (42,4). Com relação ao teor de
sulfato, o extrato de G. caudata apresentou apenas 5,3%, enquanto as algas S.
filipendula e C. prolifera mostraram o maior percentual de sulfato com 18,4% e
17,4%, respectivamente. No que diz respeito a contaminação protéica, os extratos
polissacarídicos apresentaram um percentual extremamente baixo, variando entre
0% (C. cupresoides) a 2,7% (D. cervicornis).
Ori
Figura 8. Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos obtidos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte. A- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas D. cervicornis (Dc),D. delicatula (Dd), D. menstruallis (Dms) e D. mertensis (Dmi). B- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas S. filipendula (Sf),S. schröederi (Ss), G. caudata (Gc) e C. cupresoides (Cc). C- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas C. prolifera (Cp), C. sertularioides (Cs) e C. isthmocladum (Ci). Alíquotas de 5�l (50�g) dos extratos foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. Ori - Origem
A B C
58
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Tabela V. Composição química dos extratos polissacarídicos.
Alga Açúcares totais
(%) Sulfato (%) Proteinas (%)
D. cervicornis 21,4 13,2 2,7
D. delicatula 32,5 12,1 0,4
D. menstruallis 42,4 9,8 0,6
D. mertensis 28,7 10,4 1,7
S. filipendula 37,8 18,4 0,3
S. schröederi 35,4 8,1 1,2
G. caudata 27,2 5,3 1,8
C. cupresoides 54,7 17,0 nd
C. prolifera 15,6 17,4 0,5
C. sertularioides 17,2 15,4 1,9
C. isthmocladum 19,2 14,4 0,7
nd- não detectado
4.1.4. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS
Após análises químicas, os extratos polissacarídicos foram submetidos a
testes de atividade anticoagulante como descrito em Materiais e Métodos, utilizando-
se de “kits” comerciais de aPTT (via intrínseca da coagulação) e de PT (via
extrínseca da coagulação) (Tabela VI). Os extratos polissacarídicos das algas G.
caudata e S. filipendula não apresentaram atividade anticoagulante em nenhumas
das condições testadas. No teste de PT, apenas o extrato polissacarídico de C.
cupresoides mostrou atividade, dobrando o tempo de coagulação em relação ao
controle com a massa de 0,2 mg/mL
. No teste de aPTT, sete extratos polissacarídicos apresentaram atividade: D.
cervicornis, D. mertensis, D. delicatula, C. isthmocladum, C. prolifera, C.
sertularioides e C. cupresoides. O extrato polissacarídico da alga D. cervicornis
apresentou a maior atividade anticoagulante para o teste de aPTT, dobrando o
59
RESULTADOS
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tempo de coagulação com a concentração de 0,1 mg/mL, cerca de apenas 1,4 vezes
superior aquela encontrada pela Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular.
Tabela VI. Atividade anticoagulante dos extratos polissacarídicos.
Dados são mostrados como a concentração (mg/mL de plasma sanguíneo) requerida para dobrar o tempo de coagulação comparado ao controle salino (n=3). aPTT = Tempo de tromboplastina parcialmente ativada; PT = Tempo de protrombina; nd = Atividade anticoagulante não detectada nas concentrações testadas; *Atividade anticoagulante não avaliada.
4.1.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS
A atividade antioxidante dos extratos polissacarídicos foi avaliada em cinco
diferentes ensaios: Capacidade antioxidante total (CAT), sequestro de radicais
hidroxila, sequestro de radicais superóxido, quelação férrica e poder redutor.
No ensaio de Capacidade antioxidante total (expresso como equivalentes de
ácido ascórbico) todos os extratos polissacarídicos mostraram atividade antioxidante
(Figura 9).
Alga APTT PT
D.cervicornis 0,10 nd
D.delicatula 0,40 nd
D.menstruallis * *
D.mertensis 0,40 nd
S.filipendula nd nd
S.schröederi * *
G.caudata nd nd
C.cupresoides 0,50 0,20
C.prolifera 0,40 nd
C.sertularioides 1,00 nd
C.isthmocladum 0,40 nd
Heparina 0,01 0,02
Clexane® 0,07 *
60
RESULTADOS
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Os extratos obtidos da alga verde C. isthmocladum e da alga marrom S.
schröederi apresentaram a menor atividade antioxidante com 9,2 e 14,4
equivalentes de ácido ascórbico, respectivamente. Por outro lado, o extrato
polissacarídico da alga vermelha G. caudata e da alga parda S. filipendula
apresentaram as atividades mais consideráveis com 53,9 e 33,9 equivalentes de
acido ascórbico, respectivamente.
A Tabela VII tem-se a sumarização dos resultados encontrados para os
extratos polissacarídicos nos ensaios de sequestro de radicais superóxido e
hidroxila. Apenas os extratos polissacarídicos das algas D. mertensis, D.
menstruallis, G. caudata e C. sertularioides apresentaram capacidade de seqüestrar
radicais hidroxilas nas condições testadas. O extrato polissacarídico da alga C.
sertularioides mostrou atividade de 11,8% na concentração de 0,5 mg/mL, enquanto
os extratos de D. mertensis, D. menstruallis e G. caudata apresentaram atividades
de 8,7%, 7,5% e 8,0%, respectivamente. Ácido gálico, composto comercial utilizado
como controle positivo neste ensaio, na mesma concentração (0,5 mg/mL)
Figura 9. Capacidade antioxidante total dos extratos polissacarídicos. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre os extratos polissacarídicos.
61
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
apresentou atividade muito superior àquela encontrada para os extratos
polissacaridicos (93,7%).
No teste de sequestro de radicais superóxido, o extrato obtido da alga
vermelha G. caudata e das algas marrons S. filipendula e S. schröederi não
apresentaram atividade detectável. Dentre as algas verdes, apenas o extrato obtido
de C. sertularioides apresentou capacidade de sequestro de radicais superóxidos,
com atividade de 23,3% na concentração de 0.5 mg/mL. Destaca-se ainda, os
extratos polissacarídicos das algas marrons D. cervicornis e D. delicatula que
apresentaram a atividade antioxidante apenas 2,6 e 2,9 vezes inferior aquela
encontrada para o ácido gálico, respectivamente, na concentração de 0,5 mg/mL.
Tabela VII. Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelos extratos
polissacarídicos.
Alga Concentração Atividade (%) (mg/mL) OH. O2
- 0.05 0 ± 0 2.2 ± 3.8
D. cervicornis 0.1 0 ± 0 22.1 ± 3.1 0.25 0 ± 0 30.7 ± 2.1 0.5 0 ± 0 29.4 ± 0.8 0.05 0 ± 0 0 ± 0
D. delicatula 0.1 0 ± 0 13.3 ± 3.7 0.25 0 ± 0 23.1 ± 1.8 0.5 0 ± 0 32.5 ± 2.4 0.05 3.6 ± 0.7 0 ± 0
D. menstruallis 0.1 4.3 ± 2.4 0 ± 0 0.25 4.7 ± 1.2 5.2 ± 2.5 0.5 8.7 ± 3.1 16.8 ± 3,1 0.05 2.4 ± 0.8 2.8 ± 0.4
D. mertensis 0.1 2.6 ± 0.7 4.1 ± 0.8 0.25 3.6 ± 0.4 7.7 ± 1.0 0.5 7.5 ± 1.2 9.0 ± 0.7 0.05 0 ± 0 0 ± 0
S. filipendula 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0
S. schröederi 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 1.4 ± 1.1 0 ± 0
G. caudata 0.1 2.4 ± 2.2 0 ± 0
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RESULTADOS
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0.25 3.8 ± 1.3 0 ± 0 0.5 8.0 ± 3.1 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0
C. cupressoides 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0
C. prolifera 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 4.5 ± 2.4 13.8 ± 1.0
C. sertularioides 0.1 8.4 ± 9.0 17.8 ± 0.3 0.25 9.0 ± 1.8 21.0 ± 2.7 0.5 11.8 ± 0.5 23.3 ± 0.5 0.05 0 ± 0 0 ± 0
C. isthmocladum 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 11.6 ± 1,7 28,9 ± 3,8
Ácido gálico 0.1 43.6 ± 2.4 41.8 ± 4.7 0.25 64.3 ± 3.0 72.1 ± 2.9 0.5 93.7 ± 3.7 86.3 ± 3.1
Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)
Os extratos polissacarídicos obtidos das macroalgas marinhas coletadas no
litoral do Rio Grande do Norte foram avaliados quanto à capacidade de quelar íons
ferro (Figura 10). Os resultados revelaram que neste ensaio, apenas os extratos
polissacarídicos das algas S. filipendula, S. schröederi e C. isthmocladum não
apresentaram capacidade quelante significante. Todos os outros extratos
apresentaram atividade de forma dose dependente. O extrato da rodophyta G.
caudata apresentou atividade de 40,2% a 1,5 mg/mL. Dentre as algas marrons
destacam-se os extratos de D. cervicornis e D. mertensis que apresentaram
atividades quelantes de 46,1% e 43,3% (concentração de 2,0 mg/mL). Por fim, os
extratos polissacarídicos das chlorophytas C. prolifera e C. sertularioides
apresentaram as mais significantes atividades (69,9% e 57,8%, respectivamente, na
concentração de 2,0 mg/mL).
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RESULTADOS
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Figura 10. Atividade de Quelação férrica dos extratos polissacarídicos. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). a,b,c,d
Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre variadas concentrações de extrato polissacarídico individual.
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RESULTADOS
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O teste de poder redutor é expresso como atividade redutora equivalente,
calculado a partir da razão da atividade redutora encontrada para os compostos e
aquela encontrada para o ácido ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL (Figura
11). A partir dos resultados podemos classificar a atividade dos extratos
polissacarídicos em três grupos claramente distintos: o primeiro grupo, com maior
potencial antioxidante, que inclui os extratos da alga C. sertularioides e todos os
extratos das algas marrons, com exceção de S. schröederi; o segundo grupo
incluindo extratos das algas S. schröederi, G. caudata e de todas as algas verdes
com moderada atividade redutora; e um terceiro grupo, composto pelo extrato de C.
isthmocladum, que não apresentou atividade significante. O extrato polissacaridico
da alga S. filipendula mostrou a mais potente atividade redutora equivalente, sendo
inclusive superior à atividade da vitamina C.
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RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Figura 11. Atividade redutora equivalente de extratos polissacarídicos. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de um mesmo extrato polissacarídico.
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4.1.6. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS
Outra atividade biológica avaliada dos extratos polissacarídicos foi seu efeito
frente a células tumorais HeLa. Os dados mostraram que todos os extratos
apresentaram atividade antiproliferativa dose-dependente (Figura 12) bem como
apresentaram excelente potencial antiproliferativo, já que a inibição da proliferação
variou de 36,4% (C. sertularioides) a 67,5% (S. filipendula). Quatro extratos
polissacarídicos (D. delicatula, D. menstruallis, S. filipendula e C. prolifera)
apresentaram atividade antiproliferativa superior a 50% nas concentrações testadas,
o que permitiu a determinação do IC50 para estas amostras: Os extratos de S.
filipendula e C. prolifera possuem o menor IC50 com valores de 0,23 e 0,25 mg/mL,
respectivamente. Por outro lado, os extratos de D. delicatula e D. menstruallis
apresentaram IC50 de 1,0 mg/mL
Figura 12. Atividade antiproliferativa dos extratos polissacarídicos frente a linhagem cellular HeLa após 72h de incubação. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de um mesmo extrato polissacarídico.
67
RESULTADOS
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4.1.7. SELEÇÃO DAS ALGAS PARA EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS.
O índice de potencial farmacológico das macroalgas marinhas coletadas no
litoral do Rio Grande do Norte é ilustrado na Tabela VIII. Dentre todas as algas
avaliadas neste trabalho destacam-se duas espécies de Phaeophyta, D. delicatula
(21 pontos) e S. filipendula (19 pontos), sendo estas escolhidas para terem os seus
polissacarídeos sulfatados avaliados nas demais etapas do trabalho.
Tabela VIII. Índice de potencial farmacológico dos polissacarídeos extraídos das macroalgas marinhas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte
Rend- rendimento; Fac. Obtenção – facilidade de obtenção da alga; Antic.-atividade anticoagulante; CAT- capacidade antioxidante total; OH.- sequestro de radicais hidroxila; O-- sequestro de radicais superóxido; Quel. Fer.- quelação férrica; redut.- atividade redutora; antip.- atividade antiproliferativa; *- atividade anticoagulante não determinada. 1= resultado ruim; 2= resultado bom; 3= resultado ótimo.
Espécie Rend Fac.
obtenção Antic. CAT OH. O-
Quel. Fer.
Redut. Antip. TOTAL
D. cervicornis 1 1 3 2 1 2 2 3 2 17
D. delicatula 3 3 2 2 1 2 2 3 3 21
D. menstruallis 2 2 * 2 1 2 2 2 3 16
D. mertensis 3 2 1 2 1 1 2 2 2 16
S.filipendula 3 3 1 3 1 1 1 3 3 19
S. schröederi 3 2 * 1 1 1 1 1 2 12
G. caudata 3 2 1 3 1 1 2 1 2 16
C. cupresoides 1 3 2 2 1 1 2 1 2 15
C. prolifera 1 2 2 2 1 1 3 1 3 16
C. sertularioides 1 1 2 2 1 2 3 2 2 16
C. isthmocladum 2 2 2 1 1 1 1 1 2 13
68
RESULTADOS
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4.2. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom D. delicatula.
4.2.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA D. delicatula.
Utilizando uma metodologia que combina proteólise e fracionamento com
volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos
sulfatados da alga D. delicatula denominados: DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v,
DD-1,5v e DD-2,0v.
Os polissacarídeos sulfatados foram secados e pesados para obtenção do
rendimento percentual individual (Figura 13). DD-0,5v apresentou o maior
rendimento representando 44% do total da soma do peso de todos os extratos
polissacarídicos. A contribuição percentual dos demais polissacarídeos, DD-0,7v,
DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v, representaram 28%, 11%, 7%, 5% e 5%,
respectivamente.
Figura 13. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula.
69
RESULTADOS
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4.2.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DA ALGA D. delicatula.
A determinação dos teores de açúcares totais e sulfato, bem como o grau de
contaminação por proteínas foram determinados por dosagens químicas. Com base
na Tabela IX é possível notar que todas as amostras são constituídas por
polissacarídeos sulfatados, confirmando o resultado obtido através da eletroforese
em gel de agarose. Com relação à dosagem de açúcares totais os polissacarídeos
sulfatados DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram o maior percentual (69,1% e 70,0%,
respectivamente), ao passo que DD-1,5v apresentou somente 61,3% de açúcares
totais. Como já era esperado, todas as frações apresentaram sulfato em sua
composição, sendo DD-1,0v, o polissacarídeo com o maior teor de sulfato (19,0%).
O teor de contaminação protéica foi baixo para todas as frações
polissacarídicas, atingindo o máximo de 0,7% no polissacarídeo DD-2,0v e o mínimo
de 0,1% nos polissacarídeos DD-0.5v, DD-1.3v e DD-1.5v.
Tabela IX. Composição química de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Dictyopteris delicatula
Frações polissacarídicas
Açúcares totais (%)
Sulfato (%)
Proteínas (%)
Razão molar
Fuc Gal Glc Man Xil Ac. glu
DD-0.5v 69,1 14,1 0,1 1,0 2,0 0,3 0,5 0,7 0,9
DD-0.7v 70,0 17,8 0,3 1,0 3,0 0,4 0,6 1,5 2,2
DD-1.0v 65,0 19,0 0,5 1,0 1,9 0,2 0,5 0,8 1,5
DD-1.3v 68,2 14,5 0,1 1,0 2,4 0,3 0,2 0,6 0,5
DD-1.5v 61,3 15,4 0,1 1,0 1,6 0,2 0,4 1,3 1,9
DD-2.0v 64,3 16,0 0,7 1,0 1,8 0,2 0,4 1,6 2,2
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RESULTADOS
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A Tabela IX também mostra a composição monossacarídica dos
polissacarídeos sulfatados de D. delicatula obtidos através de análise em HPLC. Por
se tratar de polissacarídeos sulfatados de algas marrons, a fucose foi utilizada como
referência para a determinação da razão molar. Todos os polissacarídeos são
constituídos por: fucose, galactose, glicose, manose, xilose e ácido glucurônico em
diferentes razões molares, mostrando que os polissacarídeos sulfatados da alga D.
delicatula são heterofucanas.
Os polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose, tampão PDA, visando uma caracterização preliminar
destes compostos (Figura 14). Com base no perfil eletroforético, pode-se observar a
presença de polissacarídeos sulfatados em todos os compostos, porém estes
apresentam uma distribuição não uniforme, com no mínimo três populações bem
definidas: uma de menor mobilidade, uma de mobilidade intermediária e uma de
maior mobilidade (Fucanas A, B e C, respectivamente). DD-0,5v e DD-0,7v são
constituídas por fucanas A, ao passo que DD-1,0v apresenta fucana A e fucana B.
DD-1,3v e DD-1,5v são constituídas por fucanas B e C enquanto DD-2,0v por fucana
C.
Figura 14. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de D. delicatula. Alíquotas de 5�l (50�g) dos polissacarídeos sulfatados foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. EXT- extrato polissacarídico de D. delicatula; 0,5-DD-0,5v; 0,7- DD-0,7v; 1,0- DD-1,0V; 1,3- DD-1,3V; 1,5- DD-1,5V; 2,0- DD-2,0V.
Fuc C
Fuc B
Fuc A
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RESULTADOS
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4.2.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA D. delicatula.
A atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula foram avaliadas
através dos testes de PT e aPTT. Não foi observada inibição da formação de
coagulo no teste de PT para todas as heterofucanas nas condições testadas. Por
outro lado, aPTT foi prolongado por todos os polissacarídeos sulfatados de forma
dose dependente (Figura 15). DD-0,7v e DD-1,0v mostraram baixa atividade
anticoagulante enquanto DD-1,5v apresentou a atividade anticoagulante mais
potente com uma razão de aPTT de 3,8 na concentração de 0,4 mg/mL de plasma
sanguíneo. Quando comparada com a clexane®, nas mesmas condições, DD-1,5v
apresentou atividade anticoagulante similar (p>0,01)
Figura 15. Atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula. Dados são
expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante é mostrada como a razão de aPTT, dada pela razão do tempo de coagulação da amostra teste pelo tempo de coagulação da amostra controle (solução salina). Hep- Heparina; Cle- Clexane® (Enoxaparina). aindica diferença significativa quando comparado com Clexane®; bindica razão de aPTT semelhante quando comparado com Clexane®.
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4.2.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA
ALGA D. delicatula.
As heterofucanas da alga D. delicatula foram avaliadas quanto ao seu
potencial antioxidante nos cinco sistemas utilizados neste trabalho: Capacidade
antioxidante total, sequestro de radicais superóxido, sequestro de radicais hidroxila,
quelação férrica e poder redutor.
No ensaio de capacidade antioxidante total, que avalia a capacidade da
amostra de doar elétrons, todas as heterofucanas apresentaram atividade. Com
exceção de DD-2,0v, todas as outras heterofucanas apresentaram atividade
significativamente semelhantes, entre 30,0 (DD-0,7v) a 37,3 (DD-1,0v) equivalentes
de acido ascórbico (Figura 16).
Os resultados dos ensaios de sequestro de radicais hidroxila e superóxido
para as heterofucanas da alga D. delicatula são mostrados na tabela X. No teste de
sequestro de radicais superóxido, as heterofucanas DD-1,0v, DD-1,3v e DD-2,0v não
apresentaram atividade antioxidante, enquanto DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram
baixa capacidade de sequestro destes radicais com atividade de 5,7% e 4,8%,
Figura 16. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga D. delicatula. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). *Única heterofucana a apresentar atividade significativamente distinta.
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RESULTADOS
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respectivamente, a 0,5 mg/mL. Por outro lado, DD-1,5v foi o único polissacarídeo a
apresentar uma moderada capacidade de sequestrar radicais superóxido (13,4% de
atividade na concentração de 0,5 mg/mL.
Para o ensaio de sequestro de radicais hidroxila, apenas as heterofucanas
DD-0,5v, DD-0,7v e DD-1,0v mostraram atividade antioxidante. Entretanto, estas
heterofucanas apresentaram uma capacidade relativamente baixa de sequestrar
radicais hidroxila, com atividades de 14,4%, 15,6% e 17,0%, respectivamente (0,5
mg/mL). O ácido gálico, nesta mesma concentração, apresentou atividade muito
superior, sequestrando 93,7% dos radicais superóxido.
Tabela X. Sequestro de radicais hidroxila e superóxido de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula.
Frações polissacarídicas
Concentração Atividade (%)
(mg/mL) OH. O2-
0.05 6,1 ± 0.7 2,8 ± 2,1
DD-0.5v 0.1 9,6 ± 0.4 4,9 ± 3,1
0.25 11,0 ± 0.9 5,1 ± 3,4
0.5 14,4 ± 2.1 5,7 ± 4,0
0.05 0,5 ± 0.7 3,9 ± 0,3
DD-0.7v 0.1 12,4 ± 3.5 6,1 ± 0,9
0.25 13,4 ± 4.7 6,7 ± 3,1
0.5 15,6 ± 3.8 4,8 ± 2,4
0.05 6,6 ± 3.1 0 ± 0
DD-1.0v 0.1 12,7 ± 2.9 0 ± 0
0.25 16,9 ± 2.2 0 ± 0
0.5 17,0 ± 3.4 0 ± 0
0.05 0 ± 0 0 ± 0
DD-1.3v 0.1 0 ± 0 0 ± 0
0.25 0 ± 0 0 ± 0
0.5 0 ± 0 0 ± 0
0.05 0 ± 0 3,9 ± 2,1
DD-1.5v 0.1 0 ± 0 4,9 ± 3,1
0.25 0 ± 0 9,6 ± 3,4
0.5 0 ± 0 13,4 ± 2,1
0.05 0 ± 0 0 ± 0
DD-2.0v 0.1 0 ± 0 0 ± 0
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RESULTADOS
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0.25 0 ± 0 0 ± 0
0.5 0 ± 0 0 ± 0
0.05 11,6 ± 1,7 28,9 ± 3,8
Àcido gálico 0.1 43,6 ± 2,4 41,8 ± 4,7
0.25 64,3 ± 3,0 72,1 ± 2,9
0.5 93,7 ± 3,7 86,3 ± 3,1 Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)
As heterofucanas da alga D. delicatula também foram avaliadas quanto a
capacidade de quelar íons ferro (Figura 17). Os resultados mostram que DD-1,3v
não apresentou atividade significativa, enquanto as heterofucanas DD-1,5v e DD-
2,0v apresentaram baixo potencial quelante. A heterofucana mais ativa foi DD-0,5v
com atividade quelante de 45,5% na concentração de 1,5 mg/mL. Esta atividade foi
apenas 1,8 vezes menor que o composto de referência, o EDTA, nas mesmas
condições testadas.
Figura 17. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga D. delicatula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas.
75
RESULTADOS
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O poder redutor das heterofucanas está expresso como atividade redutora
equivalente. Os resultados são mostrados na Figura 18. As heterofucanas DD-0,5v,
DD-0,7v e DD-2,0v mostraram uma atividade antioxidante extremamente baixa. Por
outro lado, DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v apresentaram atividade redutora
considerável, com destaque para a heterofucana DD-1,3v com atividade redutora
equivalente de 0,53 (0,5 mg/mL).
Figura 18. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga D. delicatula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de uma heterofucana individual.
76
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.2.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA D. delicatula
A viabilidade de células HeLa incubadas por 72 h com as heterofucanas de D.
delicatula foi determinada (Figura 19A). A partir dos resultados, podemos dividir as
heterofucanas em três grupos quanto o potencial antiproliferativo frente às células
HeLa: DD-0,5v e DD-2,0v com baixo potencial antiproliferativo (28,4% e 20,3%,
respectivamente); DD-1,0v e DD-1,5v com potencial antiproliferativo moderado
(50,5% e 47,5%, respectivamente); DD-0,7v e DD-1,3v com alto potencial
antiproliferativo. Estas últimas heterofucanas, classificadas dentro do grupo com alto
potencial antiproliferativo, apresentam curvas de atividade distintas. Pode-se
perceber que DD-0,7v apresenta alta inibição da proliferação de células HeLa em
baixas concentrações (0,1 e 0,5 mg/mL) atingindo rapidamente um platô de
atividade. Por outro lado, DD-1,3v apresenta baixa atividade em baixas
concentrações e alta atividade em concentrações maiores, chegando a matar cerca
de 90% das células tumorais na concentração de 2,0 mg/mL.
Entretanto, quando desafiados frente à linhagem celular não tumoral murina
pré-osteoblástica (MC3T3), os polissacarídeos sulfatados de D. delicatula
apresentam alto potencial antiproliferativo, especialmente DD-1,3v e DD-1,5v, que
chegaram a inibir a proliferação de 92,3% e 99,2% das células MC3T3 na
concentração de 2,0 mg/mL (Figura 19B).
77
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Figura 19. Atividade antiproliferativa de heterofucanas da alga D. delicatula. (A) Heterofucanas X HeLa (B) Heterofucanas X MC3T3. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas; *Não apresenta atividade antiproliferativa significante quando comparado com o controle sem tratamento (p<0,01).
78
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.3. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom S. filipendula
4.3.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA S. filipendula
Seguindo a metodologia de extração e fracionamento descrita em Materiais e
métodos, foram obtidas cinco frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga S.
filipendula denominados: SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v, SF-2,0v. A Figura 20
mostra o rendimento percentual de cada polissacarídeo individual com relação a
massa total dos polissacarídeos. Os maiores rendimentos foram obtidos para os
polissacarídeos sulfatados SF-0,5v e SF-1,5v, com 33% e 34% da massa total. Em
seguida podemos destacar que SF-0,7v, SF-1,0v e SF-2,0v apresentaram
rendimentos semelhantes com 15%, 15% e 13%, respectivamente.
Figura 20. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula.
79
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.3.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DA ALGA S. filipendula
A composição química dos polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula é
sumarizada na Tabela XI. O percentual de açucares totais e sulfato aumentou de
acordo com o aumento do volume de acetona utilizado para precipitar os diferentes
polissacarídeos sulfatados. Logo, SF-2,0v apresentou o maior percentual de
açúcares totais (66,0%) e sulfato (17,7%) e SF-0,5v apresentou os menores
percentuais (41,4% de açúcares totais e 10,2% de sulfato) dentre todos os
polissacarídeos obtidos. Ainda, destacamos que o percentual de contaminação
protéica foi baixo, variando de 0,2 (SF-1.5v) a 0,6% (SF-1.5v).
No que diz respeito à composição monossacarídica, os polissacarídeos
sulfatados de S. filipendula apresentaram fucose, galactose, glicose, manose, xilose
e acido glucurônico em diferentes proporções, com exceção de manose e acido
glucurônico que não foram encontrados nos polissacarídeos SF-1,5v e SF-2,0v,
respectivamente. Esses dados mostram que todos os polissacarídeos sulfatados de
S. filipendula são heterofucanas, especificamente galactofucanas, já que estes
monossacarídeos (galactose e fucose) estão presentes em maior quantidade.
Tabela XI. Composição química dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula
Frações polissacarídicas
Açúcares Totais
(%)
Sulfato (%)
Proteína (%)
Razão molar
Fuc Gal Gli Man Xil Ac. gluc
SF-0.5v 41.4 10.2 0.6 1.0 1.5 0.5 0.4 1.0 1.1
SF-0.7v 46.2 10.8 0.5 1.0 1.2 0.7 0.2 0.7 0.7
SF-1.0v 59.1 12.6 0.3 1.0 1.3 0.5 0.1 0.3 0.7
SF-1.5v 64.9 12.3 0.2 1.0 1.1 0.3 - 0.1 0.5
SF-2.0v 66.0 17.7 0.4 1.0 2.2 0.5 0.6 0.2 -
Fuc: fucose; ac. gluc: ácido glucurônico; Gal: galactose; Xil: xilose; Man: manose; Gli: glicose; - traços; n.d - não detectado.
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RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
A caracterização físico-química dos polissacarídeos sulfatados da alga S.
filipendula foi determinada através de eletroforese em gel de agarose (tampão PDA),
dosagens químicas de açúcares totais, sulfato e proteínas e quantificação
monossacarídica.
O perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula é
mostrado na Figura 21. Podemos observar, que com exceção de SF-2,0v, todos os
outros polissacarídeos mostraram-se polidispersos, não foi possível identificar
bandas como observado com D. delicatula, com exceção da banda referente a
fucana C encontrada em SF-2,0v.
Figura 21. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula. Alíquotas de 5�l (50�g) dos polissacarídeos sulfatados foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. EXT- extrato polissacarídico de D. delicatula; 0,5v- SF-0,5v; 0,7v- SF-0,7v; 1,0v- SF-1,0V; 1,5v- SF-1,5V; 2,0v- SF-2,0V.
Fuc C
81
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4.3.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA S. filipendula
Os polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula foram submetidas aos
testes de aPTT e PT. Em todas as concentrações testadas (0,1; 0,5; 2 mg/mL),
nenhum polissacarídeo alterou o tempo de coagulação em comparação ao controle
salino, tanto para o teste de aPTT quanto para o teste de PT (tabela XII). Esse
resultado mostra a ausência de potencial anticoagulante dos polissacarídeos
sulfatados da alga S. filipendula.
Tabela XII. Tempo de coagulação das frações polissacarídicas da alga S. filipendula
Frações polissacarídicas
Concentração
(mg/mL)
Ensaios
aPTT (s) PT (s)
Controle 28,8 ± 3,2 10,9 ± 1,0
SF-0,5v
0,1 mg/mL 29,3 ± 3,2 11,4 ± 0,5
1,0 mg/mL 27,8 ± 0,4 10,8 ± 1,8
2,0 mg/mL 27,4 ± 3,8 10,3 ± 1,9
SF-0,7v
0,1 mg/mL 29,5 ±1,7 11,4 ± 0,4
1,0 mg/mL 27,8 ± 2,5 12,7± 2,1
2,0 mg/mL 28,4 ± 2,1 10,5 ± 2,3
SF-1,0v
0,1 mg/mL 29,5 ±1,7 11,4 ± 0,4
1,0 mg/mL 27,8 ± 2,5 12,7± 2,1
2,0 mg/mL 28,4 ± 2,1 10,5 ± 2,3
SF-1,5v
0,1 mg/mL 26,4 ±1,8 10,8 ± 0,4
1,0 mg/mL 29,8 ± 2,1 11,4± 2,1
2,0 mg/mL 24,4 ± 4,0 11,6 ± 2,3
SF-2,0v
0,1 mg/mL 25,9± 4,1 13,8 ± 3,0
1,0 mg/mL 29,0± 3,5 12,5 ± 4,1
2,0 mg/mL 25,8 ± 2,8 12,4 ± 1,9
Heparina não fracionada 0,1 mg/mL >240 >120
Clexane® 0,1 mg/mL 66,2 ± 2,5 39,9 ± 0,7
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4.3.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA
ALGA S. filipendula
Os polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula foram submetidas aos
ensaios antioxidantes: Capacidade antioxidante total, Sequestro de radicais
superóxido e hidroxila, quelação férrica e poder redutor.
Todas as heterofucanas aqui avaliadas apresentaram atividade para o teste
de capacidade antioxidante total (Figura 22). SF-2,0v mostrou o menor potencial
com 9,6 equivalentes de ácido ascórbico. Entretanto, todas as outras amostras
apresentaram atividades significantes, com destaque para as heterofucanas SF-0,7v
(77,3 equivalentes de ácido ascórbico) e SF-1,0v (90,7 equivalentes de ácido
ascórbico).
Os resultados encontrados para a inibição dos radicais superóxido e hidroxila
pelas heterofucanas de S. filipendula estão sumarizados na Tabela XIII. As
heterofucanas SF-0.7v, SF-1.0v, and SF-1.5v apresentaram atividade no ensaio de
sequestro de radicais hidroxila, com percentual de inibição de 23,0%, 26,7%, e
Figura 22. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga S.filipendula. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). Todos as heterofucanas apresentaram atividades significantemente diferentes entre si (p<0,01).
83
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
12,7%, respectivamente, enquanto o resultado encontrado para o ácido gálico foi de
93,7% para a concentração de 0,5 mg/mL. Já para o sequestro de radicais
superóxido, novamente SF-0,7v apresentou a mais potente atividade antioxidante
(19,3%) seguida apenas por SF-2,0v (16,9%) na concentração de 0,5 mg/mL.
Tabela XIII. Atividade sequestradora de radicais superóxido e hidroxila dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula.
Frações
polissacarídicas Concentração
(mg/mL)
Atividade (%)
OH˙ O2-
SF-0.5v
0,05 0 ± 0 0 ± 0 0,10 0 ± 0 0 ± 0 0,25 0 ± 0 0 ± 0 0,50 0 ± 0 0 ± 0
SF-0.7v
0,05 5,3 ± 3,5a 11,1 ± 0,4a 0,10 15,8 ± 2,9b 14,2 ± 0,4b 0,25 23,0 ± 1,5c 16,3 ± 0,6b 0,50 26,2 ± 1,8c 19,3 ± 0,7b
SF-1.0v
0,05 10,8 ± 2,2a 0 ± 0 0,10 17,1 ± 2,9b 0 ± 0 0,25 22,5 ± 1,5c 0 ± 0 0,50 26,7 ± 1,8c 0 ± 0
SF-1.5v
0,05 4,9 ± 0,9a 0 ± 0 0,10 9,2 ± 0,7b 0 ± 0 0,25 12,4 ± 1,5b 0 ± 0 0,50 12,7 ± 4,8b 0 ± 0
SF-2.0v
0,05 0 ± 0 0 ± 0 0,10 0 ± 0 5,0 ± 0,7a 0,25 0 ± 0 9,0 ± 1,1b 0,50 0 ± 0 12,2 ± 1,2b
Ácido gálico
0,05 11,6 ± 1,7a 28,9 ± 3,8a 0,10 43,6 ± 2,4b 41,8 ± 4,7b 0,25 64,3 ± 3,0c 72,1 ± 2,9c 0,50 93,7 ± 3,7d 86,3 ± 3,1d
a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre cada concentração do mesmo polissacarídeo sulfatado. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)
No ensaio de quelação férrica, todas as heterofucanas apresentaram
atividade antioxidante (Figura 23). Destaque para SF-2,0v, que apresentou o maior
potencial para este ensaio, enquanto todos os demais polissacarídeos sulfatados
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RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
obtiveram atividades significativamente similares (p<0,01). A atividade observada
para SF-2,0v (54,8% à 2,0 mg/mL) é apenas 1,7 vezes menor do que a do controle
positivo, o EDTA, que mostrou atividade de 93,2% em condições semelhantes.
Figura 23. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga S. filipendula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). *Diferença significativa (p < 0.01) quando comparada as mesma concentração de heterofucanas distintas.
85
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
O poder redutor das heterofucanas de S. filipendula é expresso como
atividade redutora equivalente (Figura 24). As heterofucanas mostraram
considerável potencial antioxidante neste ensaio, com atividades variando de 0,55
(SF-0,7v) a 0,93 (SF-2,0v) equivalentes, sendo esta última, significantemente similar
(p<0,01) à atividade encontrada para o ácido ascórbico (0,2 mg/mL).
Figura 24. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga S. filipendula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas.
86
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.3.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
DA ALGA S. filipendula.
As heterofucanas da alga S. filipendula foram avaliadas quanto ao potencial
antiproliferativo frente a linhagem tumoral HeLa (células tumorais de colon uterino
humano) e a linhagem normal pré-osteoblástica (MC3T3). As linhagens celulares
foram incubadas durante um período de 72h com as heterofucanas, e os resultados
são mostrados na Figura 25.
Pode-se observar que as células HeLa, foram foram inibidas de forma dose-
dependente por todas as frações polissacarídicas. SF-0,5v e SF-0,7v apresentaram
baixa atividade antiproliferativa com apenas 22,0% e 26,9% de inibição,
respectivamente. Por outro lado, as demais heterofucanas apresentaram excelente
potencial, com destaque para SF-1,5v, que apresentou a mais potente atividade
(p<0,01) inibindo 53,5% das células HeLa.
É interessante destacar, que apenas SF-0,5v e SF-2,0v inibiram o
crescimento da linhagem celular normal MC-3T3, enquanto os polissacarídeos
sulfatados SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v não apresentaram inibição significativa quando
comparados com o controle sem tratamento.
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RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Figura 25. Atividade antiproliferativa das heterofucanas da alga Sargassum filipendula. (A) Heterofucanas X HeLa. (B) Heterofucanas X MC3T3. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas; *Não apresenta atividade antiproliferativa significante quando comparado com o controle sem tratamento (p<0,01).
88
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.4. Mecanismo de ação antiproliferativo da heterofucana SF-1,5v
4.4.1. SF-1,5v INDUZ APOPTOSE EM CÉLULAS HELA
Para dar continuidade a este estudo, o polissacarídeo sulfatado SF-1,5v foi
selecionado para determinação do(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação
antitumoral frente a linhagem celular tumoral HeLa.
A atividade antiproliferativa da fração polissacarídica SF-1,5v frente à células
HeLa foi avaliada com o tempo de incubação de 24h, 48h e 72h (Figura 26). SF-1,5v
mostrou efeito dose e tempo dependente. A capacidade de SF-1,5v diminuir a
proliferação celular já foi observada no tempo de 24h (47,3% de inibição da
proliferação celular à 2,0 mg/mL), entretanto esta inibição foi potencializada após o
período de incubação de 72h (72,5% de inibição da proliferação celular).
Figura 26. Proliferação celular de células HeLa incubadas com SF-1,5v. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre diferentes tempos de uma concentração individual.
89
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Após incubação de células HeLa com SF-1,5v por um período de 24h, a
presença de células apoptóticas foi quantificada através da técnica de citometria de
fluxo, logo após tratamento com anexina V-FITC (Figura 27). Após análise dos
resultados, podemos observar que o tratamento com SF-1,5v aumenta o percentual
de células Anexina+/PI-, que indica fase inicial de apoptose (19,8%) quando
comparadas ao controle sem tratamento (0,8% de células Anexina+/PI-).
4.4.2.INDUÇÃO DA APOPTOSE PELA HETEROFUCANA SF-1,5v EM CELULAS
HeLa É INDEPENDENTE DA ATIVAÇÃO DE CASPASES
As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) apresentam
um papel chave na indução da apoptose, o que nos levou a avaliar se a indução da
apoptose por SF-1,5v é resultado da ativação de caspases, especificamente
caspase-3 e caspase-9, proteínas iniciadoras da via apoptótica dependente de
caspases. A ativação das caspases foi avaliada através da análise de Western blot
Figura 27. Heterofucana SF-1,5v induz apoptose de células HeLa. Células HeLa foram tratadas com 1,5 mg/mL de SF-1.5v. Anexina-/PI- (IE), células viáveis; Anexina+/PI- (ID), células em apoptose; Anexina+/PI+ (SD), células em estágio final de apoptoose. IE, quadrante inferior esquerdo; ID, Quadrante inferior direito; SD, Quadrante superior direito. Este FACS é representativo de três ensaios independentes.
90
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
(Figura 28A). Em resposta ao tratamento celular com SF-1,5v, não foi possível
observar alterações no conteúdo de pro-caspase-9 e pro-caspase-3, indicando desta
forma, ausência de ativação das pro-caspases analisadas.
Para excluir definitivamente a participação das caspases na indução da
apoptose pela heterofucana SF-1,5v, as células foram incubadas com SF-1,5v na
presença de z-VAD (50 mM), um inibidor específico de caspase. Em todas as
condições testadas, z-VAD+SF1,5v não influenciou na atividade antiproliferativa de
Sf-1,5v, indicando que ativação de caspase não é essencial para SF-1,5v induzir a
apoptose em células HeLa (Figura 28B).
Levando em consideração os resultados anteriores, que ativação de caspase
não é essencial para SF-1,5v induzir a apoptose em células HeLa, decidiu-se avaliar
outras proteínas envolvidas na indução da apoptose em vias independentes de
caspases: ERK, p38, p53, NFkB, pAKT e GSK. A Figura 29 mostra a análise da
sinalização celular induzida por SF-1,5v (24h de incubação) avaliada através de
western blot. Os resultados nos mostram que SF-1,5v não alterou a fosforilação das
proteínas ERK, p38, p53, pAKT e NF�B. Entretanto, podemos observar uma
Figura 28. Apoptose de células hela induzida pelo polissacarídeo sulfatado SF-1,5v não requer ativação de caspases. Western blot representativo de 3 experimentos independentes. (A) Efeito de SF-1.5v na regulação da caspase-9 e caspase-3. (B) Inibidor de Caspase z-VAD (50mM) não inibe a atividade antiproliferativa de SF-1,5v. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7).
91
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
diminuição do conteúdo da proteína GSK fosforilada (glycogen synthase kinase-
beta) mostrando provavelmente que esta foi desfosforilada após tratamento com SF-
1,5v.
4.4.3.DETERMINAÇÃO DO PAPEL DE GSK NA INDUÇÃO DA APOPTOSE POR
SF-1,5v.
Para determinar o papel de GSK na indução da apoptose pela heterofucana
SF-1,5v, células HeLa foram tratadas com cloreto de litium (10mM), um inibidor
especifico de GSK. Em seguida, as células foram incubadas com SF-1,5v por 24h, e
a análise dos resultados foi feita através de citometria de fluxo (Figura 30).
Os resultados mostram que células tratadas com SF-1,5v e cloreto de lítio
apresentaram o percentual de células apoptóticas (24,0%) similar ao das células
tratadas apenas com a heterofucana (22,2%), indicando que o cloreto de litium não
alterou a apoptose induzida por SF-1,5v.
Figura 29. Análise da sinalização intracelular da heterofucana SF-1,5v por western blot.Células HeLa foram tratadas com 1,5 mg/mL de SF-1.5v por 24h. Fosforilação de ERK, p38, p53, NF�B, Akt, and GSK foi analisada através de anticorpos específicos. Western blot representativo de 3 experimentos independentes..
92
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
4.4.4. SF-1,5v INDUZ A LIBERAÇÃO DE NÍVEIS ELEVADOS DE FATOR INDUTOR
DE APOPTOSE (AIF) NO CITOPLASMA
A influência de SF-1,5v na concentração de AIF citosólico avaliada através de
western blot é mostrada na Figura 31. É possível observar que os níveis citosólicos
de AIF são aumentados após o tratamento com a heterofucana, indicando que a
liberação mitocondrial de AIF no citoplasma é o principal mecanismo de morte
celular para o composto estudado.
Como as proteínas Bcl-2 e Bax, apresentam papel chave na liberação de AIF,
estas também foram avaliadas quanto a influencia de SF-1,5v em suas
concentrações. A análise dos resultados mostra, que de forma tempo dependente,
ocorre a supressão da expressão de Bcl-2, ao passo que os níveis de Bax
aumentaram em células tratadas, confirmando a ativação da via mitocondrial de
apoptose pela heterofucana SF-1,5v.
Figura 30. Ativação de GSK não é essencial para apoptose induzida pela heterofucana SF-1.5v. Células HeLa foram previamente tratadas com Cloreto de litium (LiCl) por 1h, seguida de incubação com 1.5 mg/mL of SF-1,5v por 24 hr. Annexin-/PI- (IE), células viáveis; Annexin+/PI- (ID), células em apoptose; Annexin+/PI+ (SD), células em estágio final de apoptose. IE, quadrante inferior esquerdo; ID, Quadrante inferior direito; SD, Quadrante superior direito. Este FACS é representativo de três ensaios independentes.
93
RESULTADOS
Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
Figura 31. Análise da expressão de AIF, Bax and Bcl-2 na presença de SF-1.5v. Células HeLa foram tratadas com 1.5 mg/mL de SF-1.5v por 0, 6, 12, 18 e 24 hr. Níveis de AIF, Bax e Bcl-2 liberados no citosol foi analisado por western blot usando anticorpos anti-AIF, anti-Bax ou anti-Bcl-2 como descrito em materiais e métodos. *tempo de incubação; **razão da massa de proteínas totais em cada tempo de incubação com relação a massa protéica no tempo de incubação de 0h.
*
**
**
**
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
94
5 – DISCUSSÃO 5.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas
marinhas.
Diversos trabalhos vêm relatando a extração e caracterização de
polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas com atividades
anticoagulante, antioxidante e/ou antiproliferativa (HAYAKAWA et al., 2000,
BERTEAU & MULLOY, 2003, ZHANG et al., 2003a, ALBUQUERQUE et al., 2004,
ALEKSEYENKO et al., 2007, CIANCIA et al., 2007, SOUZA et al., 2007, LINS et al.,
2009, CIANCIA et al., 2010, HU et al., 2010). No estado do Rio Grande do Norte há
registro de mais de cem diferentes espécies de macroalgas marinhas, entretanto,
poucas algas tiveram seus polissacarídeos avaliados no que diz respeito à
descoberta de polímeros com atividades biológicas, o que não se justifica, pois cada
alga apresenta pelo menos um polissacarídeo sulfatado inerente a sua espécie, não
encontrado em outras espécies, e, portanto, pode possuis atividades farmacológicas
diferentes e/ou mais potentes do que outros compostos. Então, o isolamento de um
novo polissacarídeo sulfatado de macroalgas marinhas traz sempre novas
perspectivas de descoberta de um novo fármaco, bem como um maior
desenvolvimento econômico para aquelas comunidades que já cultivam algas, por
inserir uma maior diversidade de produtos, e por inserir, possivelmente, um produto
de maior valor agregado.
Diante deste contexto, foram coletadas onze diferentes espécies de
macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte (Tabela IV) entre os anos de
2008 a 2011, tendo como critério de escolha a abundância da alga no local da coleta
e a facilidade de obtenção da mesma. Extratos ricos em polissacarídeos sulfatados
foram extraídos de cada alga e estes foram avaliados quanto ao potencial
anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo.
Após a obtenção dos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados, o
rendimento percentual em relação ao peso seco da alga foi calculado. Verificou-se
que a alga vermelha G. caudata apresentou o maior rendimento dentre todas as
algas. Entretanto, é interessante destacar que, com exceção da alga D. cervicornis,
todas as algas marrons apresentaram um rendimento maior quando comparadas às
algas verdes (Figura 7). A princípio, este resultado (algas marrons rendem mais
polissacarídeos sulfatados do que algas verdes) parece ser representativo para os
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
95
polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas, entretanto são
necessários mais dados que sustentem esta afirmativa, já que a grande maioria dos
trabalhos encontrados na literatura não apresenta os resultados sobre o rendimento
dos polissacarídeos sulfatados com relação ao peso seco da alga. O alto
rendimento de polissacarídeos sulfatados encontrado aqui para G. caudata e para
as algas marrons facilita o desenvolvimento de estudos que requerem uma grande
quantidade de material, como a caracterização química e a análise de atividades
biológicas e/ou futuramente o uso em larga escala nas indústrias.
Para verificar e confirmar a presença de polissacarídeos sulfatados, os
extratos foram submetidos à técnica de eletroforese em gel de agarose em tampão
PDA (Figura 8). Neste sistema, os polissacarídeos interagem com a diamina em
função da conformação e distribuição dos grupamentos sulfatos, sendo que, aqueles
polissacarídeos que mais interagem com a diamina, passam a apresentar uma
menor mobilidade eletroforética, e aqueles que apresentam menor interação
mostram maior mobilidade. (DIETRICH & DIETRICH, 1976).
A partir do perfil eletroforético dos extratos verificou-se a existência de
polissacarídeos sulfatados em todas as algas analisadas. Quanto a distribuição,
esse perfil se mostrou polidisperso para maioria das algas estudadas, destacando-se
uma ou mais banda eletroforética, com exceção do extrato polissacarídico de G.
caudata, que apresenta apenas uma única banda eletroforética. Este perfil
polidisperso pode ser explicado pela presença de mais de uma população de
polissacarídeos sulfatados encontrados nos extratos, o que está de acordo com a
literatura. Estudos que utilizaram a metodologia aplicada nesse trabalho
demonstraram que cada espécie de alga marinha avaliada apresenta em sua
constituição pelo menos duas populações de polissacarídeos sulfatados observadas
através da técnica de eletroforese em gel de agarose (DIETRICH et al., 1995, LEITE
et al., 1998a, ALVES, 2000, ALBUQUERQUE et al., 2004, FARIAS, 2005, FARIAS,
2006, COSTA, 2008).
Depois de confirmada a presença de polissacarídeos sulfatados em todos os
extratos, estes foram avaliados quanto ao potencial farmacológico. A atividade
anticoagulante é a atividade mais bem caracterizada para os polissacarídeos de
macroalgas marinhas (NIKAPITIYA et al., 2007, CHANDIA & MATSUHIRO, 2008,
MEDEIROS et al., 2008, CIANCIA et al., 2010, JIAO et al., 2011). Esta atividade é
mensurada principalmente através da utilização de kits comercias de aPTT e PT que
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
96
avaliam a via intrínseca e extrínseca da coagulação, respectivamente. Os extratos
ricos em polissacarídeos sulfatados das algas S. schröederi e D. menstruallis não
tiveram suas atividades anticoagulantes avaliadas neste trabalho, já que estes já
tinham sido avaliados em trabalhos anteriores do grupo (LEITE et al., 1998,
ALBUQUERQUE et al., 2004, ROCHA et al., 2005c).
O extrato rico em polissacarídeo sulfatado obtido de D. cervicornis foi o mais
potente anticoagulante, seguido por D. delicatula, D. mertensis, C. prolifera e C.
Isthmocladum (Tabela VI). Esta ordem de atividade anticoagulante não apresenta
nenhuma correlação com a razão sulfato/açucares totais (R2= 0,059) mostrada na
tabela V. Corroborando com nossos resultados, diversos trabalhos encontrados na
literatura mostram que a atividade anticoagulante não é meramente uma
consequência de densidade de cargas, mas provavelmente, este efeito depende da
presença de regiões com variáveis padrões de sulfatação nos polissacarídeos
sulfatados (CHEVOLOT et al., 1999, FARIAS et al., 2000, PEREIRA et al., 2002,
PEREIRA et al., 2005, ROCHA et al., 2006). Por sua vez, os extratos de S.
filipendula e G. caudata não apresentaram atividade anticoagulante em nenhuma
das condições testadas. A ausência de atividade anticoagulante pelos
polissacarídeos sulfatados leva a hipótese de que apesar destes apresentarem
sulfato em sua constituição, provavelmente não apresentam uma estrutura favorável
á interação destes com proteínas envolvidas no processo de coagulação e, portanto
não apresentam atividade anticoagulante.
Recentemente, vários polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas
têm sido descritos como possuidores de atividade antioxidante (CHANDINI et al.,
2008, WANG et al., 2008, LIM & RYU, 2009, HU et al., 2010, JIAO et al., 2011).
Neste trabalho, o potencial antioxidante dos polissacarídeos sulfatados de
macroalgas marinhas foi avaliado através de cinco ensaios específicos já bem
estabelecidos pelo grupo de pesquisa em que se insere este trabalho: Capacidade
antioxidante total (CAT), sequestro de radicais superóxido, sequestro de radicais
hidroxila, quelação férrica e poder redutor.
O CAT avalia o potencial antioxidante através da formação do complexo
fosfato-molibidato observado pela mudança de coloração de amarelo para roxo-
azulado (PRIETO et al., 1999). CAT é expressa como o número de equivalentes de
ácido ascórbico (mg por cada grama de polissacarídeo sulfatado). Todos os extratos
ricos em polissacarídeos sulfatados apresentaram atividade antioxidante para o
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
97
ensaio de CAT, que variou de 9,2 (C. isthmocladum) a 53,9 mg/g de acido ascórbico
equivalentes (G. Caudata) (Figura 9). Estudos mostram que moléculas bioativas que
apresentam potencial antioxidante no ensaio de CAT, provavelmente possuem
atividade antioxidante através de uma gama de mecanismos diferentes,
especialmente sequestrando radicais superóxido e hidroxila, espécies reativas do
metabolismo do oxigênio (ZHANG et al., 2004, CAMARA et al., 2011). Ainda, os
resultados apresentados pelos extratos avaliados podem ser considerados
significativos, já que o valor de 9,2 equivalentes de ácido ascórbico encontrado para
o extrato menos potente, é considerado alto por alguns autores. Como exemplo
disso, Kumar et al (2008) obteve extratos das algas Padina tetrastomatica e
Turbinaria conoides com atividade antioxidante alta, apresentando 9,79 e 9,65
equivalentes de ácido ascórbico (KUMAR et al., 2008).
A partir da Tabela VII, pode-se analisar os resultados da capacidade de
sequestro de radicais hidroxila e superóxido pelos extratos ricos em polissacarídeos
sulfatados. Neste estudo, apenas cinco extratos apresentaram atividade antioxidante
através do sequestro de radicais superóxido, com destaque para D. delicatula, com
uma atividade de 32,5% à 0,5 mg/mL. Alguns trabalhos mostram polissacarídeos
sulfatados de macroalgas marinhas agindo através do sequestro de radicais
superóxido. Um extrato obtido de Eklonia kava apresentou alta capacidade de
sequestro de superóxido (65%) na mesma concentração citada para D. delicatula
(ATHUKORALA et al., 2006) e fucoidans extraídas de Laminaria japonica e ulvanas
extraídas da alga verde Ulva pertusa, mostraram potencial sequestrador superior ao
encontrado para a vitamina C, um composto utilizado como referência neste ensaio
(QI et al., 2005, WANG et al., 2008). Fica claro, a partir destes resultados, que os
extratos aqui analisados desempenham atividade antioxidante através de outros
mecanismos diferentes do sequestro de radicais superóxido.
Adicionalmente, alguns trabalhos mostram que o sequestro de radicais
superóxido pelos polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas é dependente
do teor de sulfato, ou seja, quanto mais sulfatado o polissacarídeo maior é a sua
capacidade de sequestro de radicais superóxido (ZHANG et al., 2003b, SOUZA et
al., 2007, WANG et al., 2008). Os resultados encontrados neste trabalho não
mostram nenhuma correlação entre sulfato e sequestro de radicais, indicando que o
potencial antioxidante do polissacarídeo sulfatado é dependente de um padrão de
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
98
distribuição de grupamentos sulfato no polissacarídeo sulfatado, e não apenas um
efeito da densidade de carga.
O radical hidroxila necessita de poucos milissegundos para reagir com
moléculas biológicas, o que torna quase inviável o combate deste após sua
formação pelo organismo (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Portanto, tem sido
dada muito mais atenção a compostos que impedem a formação do radical hidroxila
do que aqueles que promovem o seu sequestro, e dentre estes se destaca o íon
ferro, que reagindo com o peróxido de hidrogênio (H2O2), numa reação conhecida
como reação de Fenton, é responsável pela maior parte do radical hidroxila formado
nos sistemas biológicos (HALLIWELL B & GUTTERIDGE, 1986, AUST & MILLER,
1991). Neste estudo, todos os extratos apresentaram atividade sequestradora de
radicais hidroxila insignificante (Tabela VII), entretanto, oito extratos mostraram
excelente potencial antioxidante no ensaio de quelação férrica (Figura 10). Esse
achado é extremamente interessante, já que alguns trabalhos mostram que, para
compostos que são utilizados na terapia antioxidante, dentre os vários mecanismos
de ação considerados essenciais, destaca-se o mecanismo de quelação de traços
de íons ferro que catalisam a reação de formação de radical hidroxila (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997, CUZZOCREA et al., 2001). Desta forma, estes polissacarídeos
sulfatados, com destaque para G. caudata, aparecem como promissores compostos
na terapia antioxidante, tanto para uso farmacológico, bem como para a utilização
em indústrias de cosméticos e alimentos.
O ensaio de poder redutor é também considerado um teste de avaliação
antioxidante na medida em que avalia a capacidade da amostrar em doar elétrons,
estabilizando os radicais livres formados. O resultado é expresso como atividade
redutora equivalente, calculado como um percentual da atividade redutora
encontrada para os extratos polissacarídicos em relação à atividade do ácido
ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL (Figura 11). Os resultados mostraram que
apenas o extrato de C. isthmocladum não apresentou atividade significante. Por
outro lado, os polissacarídeos sulfatados mais potentes como agentes redutores
concentram-se nas algas marrons, com potencial redutor similar ao composto de
referência utilizado neste ensaio, o ácido ascórbico. Existem poucos relatos de
atividades redutoras de polissacarídeos sulfatados, e, além disso, não existe uma
padronização quanto à forma de expressar os resultados, já que alguns autores
expressam os resultados apenas como valor da absorbância e outros autores como
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
99
percentual da atividade de um composto referência, na maioria das vezes o ácido
ascórbico. Apenas dois trabalhos permitem uma comparação com os resultados
encontrados neste estudo, e nestes, fucanas de L. japônica e ulvanas de U. pertusa
têm mostrado atividade redutora, entretanto estas foram menos potentes do que o
ácido ascórbico (QI et al., 2005; WANG et al., 2008), o que mostra que os resultados
encontrados neste trabalho podem ser considerados bastante significativos,
especialmente aqueles encontrados para os extratos polissacarídicos das algas
marrons.
Os resultados quanto ao papel antioxidante das algas estudadas aqui
relatados foram bastante interessantes, pois indicam que as macroalgas marinhas
sintetizam polissacarídeos sulfatados com diferentes mecanismos antioxidantes.
Apesar de sua potência antioxidante não ter sido tão alta em alguns ensaios, deve
ser a somatória dos efeitos individuais desses polímeros que é utilizada como uma
estratégia de defesa da alga. Esta proporcionaria uma defesa mais eficiente frente
aos radicais livres em detrimento da síntese de polissacarídeos com alta atividade
antioxidante, mas que agiram apenas via um mecanismo.
Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados tem sido
extensivamente reportada nos últimos anos. Ulvanas, polissacarídeos sulfatados
extraídos da alga verde U. lactuta inibe proliferação da linhagem celular CACO-2
(Adenocarcinoma de epitélio colo-retal humano) (KAEFFER et al., 1999). Fucanas
mostraram-se eficientes frente a varias linhagens tumorais, tais como HL60, uma
linhagem leucêmica humana (USUI et al., 1980), CT-26, linhagem tumoral de cólon
murino e células de sarcoma 180, uma linhagem tumoral de tecido conectivo de
camundongos (ATHUKORALA et al., 2006).
Neste trabalho todos os extratos mostraram potencial antiproliferativo frente a
células HeLa, uma linhagem celular tumoral de cólon de útero humano (Figura 12).
Novamente, nenhuma correlação foi encontrada entre a atividade antiproliferativa e
o teor de sulfato das amostras. Entretanto, quando para esta correlação leva-se
apenas em consideração aqueles extratos que apresentaram as maiores atividades
(C. prolifera, S. filipendula, D. delicatula e D. menstruallis) uma forte correlação pôde
ser encontrada (R2= 0.934). Esses dados indicam que o sulfato, por si só, não é o
principal fator responsável pela atividade antiproliferativa dos polissacarídeos
sulfatados, ou seja, nem sempre o polissacarídeo mais sulfatado apresenta a maior
atividade. A literatura mostra que a presença de sulfato é um requisito essencial para
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
100
o polissacarídeo sulfatado apresentar atividade biológica, entretanto outros fatores
também contribuem para uma melhor relação estrutura/atividades biológicas, como o
peso molecular, tipo de açúcar, tipo de ligação e padrão de ramificação do
polissacarídeo (HAROUN-BOUHEDJA et al., 2000, COSTA, 2005, ROCHA et al.,
2006, POMIN, 2009).
Ao fim de todo o processo de obtenção, caracterização química e avaliação
das atividades farmacológicas dos extratos ricos em polissacarídeo sulfatado
extraídos de algas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte foi possível
desenvolver um banco de dados contendo informações relevantes acerca destas
biomoléculas. Essas informações estão resumidas na Tabela VIII. A fim de
classificar as algas quanto ao seu potencial de exploração cientifica foram levados
em consideração o rendimento dos polissacarídeos com relação ao peso seco da
alga, o potencial farmacológico apresentado nos ensaios anticoagulante,
antioxidante e antiproliferativo e a facilidade de obtenção das algas em todos os
períodos do ano no litoral potiguar.
A princípio, este banco de dados permitiu selecionar as duas algas mais bem
classificadas para dar continuidade a este trabalho: D. delicatula (21 pontos) e S.
filipendula (19 pontos). Trabalhos posteriores podem também fazer uso desta
ferramenta para selecionar macroalgas marinhas, inclusive permitindo fazer uma
seleção mais especifica, como por exemplo, a escolha das algas que apresentaram
o melhor potencial anticoagulante ou antiproliferativo, sem levar em consideração
fatores como rendimento e/ou facilidade de obtenção.
Ainda, percebe-se que não existe nenhuma relação entre a divisão da alga e
a eficiência de seus polissacarídeos sulfatados nas atividades biológicas testadas,
mostrando que o potencial farmacológico é independente de características
inererentes a cada grupo de algas, o que justifica o desenvolvimento de trabalhos de
prospecção visando buscar e selecionar espécimes promissoras à indústria
farmacêutica.
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
101
5.2. Extração e caracterização de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S. filipendula.
Para a obtenção de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S.
filipendula utilizou-se uma metodologia de extração já estabelecida pelo grupo de
pesquisa em que está inserido este trabalho. Essa metodologia permite a separação
de diferentes populações de polissacarídeos sulfatados de acordo com a interação
destes com solventes polares. Assim obteve-se seis frações polissacarídicas para a
alga D. delicatula (DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v), e cinco
frações para a alga S. filipendula (SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v, SF-2,0v),
denominadas de acordo com o volume de acetona adicionado no processo de
fracionamento.
Um estudo realizado com três algas marrons da ordem Dictyotales (Padina
gymnospora, Dictyota mertensis e Sargassum vulgare) demonstrou a existência em
cada uma delas de três famílias de polissacarídeos sulfatados que se diferenciavam
pela sua mobilidade eletroforética no gel de agarose em tampão PDA: Banda A
(menor migração), Banda B (migração intermediaria) e Banda C (maior migração)
(DIETRICH et al., 1995). Diversos estudos posteriores confirmaram a presença
destas três populações polissacarídicas em outras espécies de Dictyotales (LEITE et
al., 1998a, ALBUQUERQUE et al., 2004, ROCHA et al., 2005a, SILVA et al., 2005),
e, um estudo realizado com a alga S. schröederi confirmou que as bandas
eletroforéticas A, B e C, eram constituídas de polissacarídeos sulfatados distintos,
que passaram a receber a nomenclatura de fucanas A, B e C.
Neste trabalho, as duas espécies de algas selecionadas para terem seus
polissacarídeos sulfatados estudados pertencem à ordem Dictyotales, o que não
torna surpreendente a visualização destas três populações de polissacarídeos
sulfatados através da eletroforese em gel de agarose (Figuras 15 e 22). Para a alga
D. delicatula, a fucana A pode ser visualizada nas frações DD-0,5v, DD-0,7v e DD-
1,0v, A fucana B nas frações DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v, ao passo que a fucana C
é encontrada em DD-1,5v e DD-2,0v. Por sua vez, os polissacarídeos sulfatados de
S. filipendula apresentam um perfil eletroforético mais polidisperso, o que dificulta o
processo de visualização das bandas eletroforéticas correspondentes a fucana A e
B, porém é possível observar claramente a presença da fucana C na fração SF-2,0v.
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
102
As análises químicas dos polissacarídeos obtidos, resumidas na Tabela IX e
na Tabela IX confirmam a presença de fucose e sulfato na constituição de todos os
polissacarídeos sulfatados das algas D. delicatula e S. filipendula, além de outros
açúcares neutros como componentes destes polímeros, como galactose, glicose,
manose e xilose, indicando que as duas algas marrons estudadas sintetizam um
complexo sistema de heterofucanas.
Os resultados mostram também que o principal monossacarídeo encontrado
em todas as frações da alga S. filipendula, bem como DD-0,5v e DD-1,3v extraídas
de D. delicatula foi a galactose. Algas marrons, em sua maioria, sintetizam
polissacarídeos sulfatados consistindo principalmente de L-fucose sulfatada com o
conteúdo de fucose variando entre 30-45%, seguido de pequenas quantidades de
galactose, manose, glicose, xilose e ácido glucurônico (BILAN et al., 2007).
Entretanto, alguns trabalhos relatam macroalgas marinhas que sintetizam fucanas
contendo galactose como principal componente monossacarídico, denominadas
galactofucanas: Saccharina longicruris (RIOUX et al., 2010), Lobophora variegata
(MEDEIROS et al., 2008), Spatoglossum schröederi (ROCHA et al., 2005c),
Adenocystis utricularis (PONCE et al., 2003) e Sargassum stenophyllum (DUARTE
et al., 2001).
Para os demais polissacarídeos de S. filipendula, encontrou-se grandes
quantidades de ácido glucurônico, e no caso de SF-1,5v e SF-2,0v este açúcar
aparece como o principal constituinte monossacarídico. Em trabalhos anteriores, a
presença de ácido glucurônico com principal constituinte de fucanas foi relatada.
Leite et al. (1998) purificou e caracterizou uma heterofucana com um grande
conteúdo de ácidos glucurônico, alem de fucose e xilose. Após caracterização
estrutural, foi confirmado que esta fucana apresenta uma estrutura central de (1�3)-
D-ácido glucurônico, substituídas por L-fucose e D-xilose sulfatadas. Em outro
estudo, uma fucana da alga C. okamuranus foi descrita como sendo formada por
uma cadeia central linear de fucose, substituídas por ácido glucurônico nas ligações
α(1�2) (NAGAOKA et al., 1999).
São necessários estudos mais aprofundados para a caracterização estrutural
dos polissacarídeos sulfatados aqui analisados, o que ajudaria a compreensão
acerca da relação entre a estrutura química e a atividade biológica desempenhada
por estes polímeros. Estudos estão sendo desenvolvidos a fim de alcançar estes
objetivos, entretanto, heterofucanas ricas em galactose e/ou ácidos glucurônicos não
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
103
são frequentemente descritas, o que levou a priorizar a avaliação do potencial
farmacológico destas onze frações polissacarídicas extraídas das algas D. delicatula
e S. filipendula, com o objetivo de identificar quais destes polissacarídeos são
responsáveis pelas atividades biológicas previamente identificadas através dos
extratos ricos em polissacarídeos sulfatados.
As heterofucanas da alga S. filipendula não apresentaram atividade
anticoagulante para os testes de PT e APTT (Tabela XII). Este resultado já era
esperado, já que quando se avaliou o potencial anticoagulante do extrato rico em
polissacarídeos sulfatados de S. filipendula, também não foi encontrada nenhuma
atividade. A alga S. filipendula sintetiza um complexo sistema de heterofucanas
compostas, além de galactose e fucose, de uma variedade de açúcares neutros que
possivelmente não apresentam sulfatação, e, portanto, provavelmente estes
monossacarídeos impedem a interação destas heterofucanas com fatores da
coagulação. Resultados semelhantes foram encontrados em pesquisas
desenvolvidas com galactanas sulfatadas de invertebrados marinhos e
heterofucanas de algas marrons que mostraram que a inserção de monossacarídeos
não sulfatados em regiões de ramificações destes polissacarídeos pode prevenir a
sua interação com cofatores da coagulação e suas proteases alvo, inibindo desta
forma, a atividade anticoagulante in vitro (BERTEAU & MULLOY, 2003, PEREIRA et
al., 2005, ROCHA et al., 2005a). Por fim, não se pode descartar o uso das
heterofucanas de S. filipendula em terapias anticoagulantes devido somente ao fato
destas não apresentarem atividades para os ensaios de PT e APTT. Estudos
anteriores desenvolvidos pelo grupo de pesquisa em que este trabalho está inserido
identificaram heterofucanas que não apresentam atividade anticoagulante in vitro,
mas possuem uma considerável atividade antitrombótica in vivo, estimulando a
síntese por células endoteliais de um heparam sulfato com característica
antitrombótica (ROCHA et al., 2005a, BARROSO et al., 2008).
Para a alga D. delicatula, todas as heterofucanas prolongaram o tempo de
coagulação quando comparadas ao controle salino no teste de APTT (Figura 15).
Novamente, nenhuma correlação foi encontrada entre a atividade anticoagulante e o
teor de sulfato dos polissacarídeos sulfatados (R2 = 0,190), corroborando com
diversos trabalhos encontrados na literatura que afirmam que a posição do
grupamento sulfato no polissacarídeo e sua devida proporção são essenciais para a
atividade anticoagulante. Vale destacar ainda, que DD-1,5v apresentou a atividade
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
104
mais proeminente, inclusive com razão de APTT semelhante à clexane® quando
comparadas na mesma concentração (0,1 mg/mL). Atualmente, trabalhos estão
sendo desenvolvidos com objetivos de purificar e caracterizar a estrutura
tridimensional de DD-1,5v a fim de identificar os padrões estruturais responsáveis
pela sua elevada atividade anticoagulante.
As algas D. delicatula e S. filipendula tiveram suas heterofucanas avaliadas
com relação ao potencial antioxidante através dos mesmos ensaios a que foram
submetidos os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados: Capacidade
antioxidante total (CAT), sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação
férrica e poder redutor.
Assim como o observado para os extratos, as heterofucanas mostraram alto
potencial no ensaio de CAT (Figura 16 e Figura 22). Para a alga D. delicatula, DD-
1,0v apresentou a maior atividade com 37,3 equivalentes de ácido ascórbico (figura
17). Esta atividade, bem como as de DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,3v e DD-1,5v, foram
superiores àquela encontrada para o extrato de D. delicatula rico em polissacarídeos
sulfatados (23,0 equivalentes de ácido ascórbico). No que diz respeito às
heterofucanas de S. filipendula, a atividade antioxidante permite a classificação em
três grupos: baixo (SF-2,0v), intermediário (SF-0,5v e SF-1,5v) e alto (SF-0,7v e SF-
1,0v) potencial antioxidante. O baixo potencial antioxidante apresentados pelas
frações polissacarídicas SF2,0v e DD-2,0v, revela que possivelmente o potencial
antioxidante das fucanas é referente as fucanas A e B, já que estas frações são
compostas somente por fucanas C, ao passo que as demais frações contêm fucana
A e/ou fucana B.
Dentre as heterofucanas de D. delicatula, apenas DD-0,5v, DD-0,7v e DD-
1,0v mostraram atividade antioxidante para o ensaio de sequestro de radicais
hidroxilas, ainda assim as atividades podem ser consideradas irrisórias, ao passo
que para o sequestro de radicais superóxido, DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram
baixa capacidade de sequestro destes radicais, enquanto DD-1,5v mostrou uma
atividade apenas moderada (13,4%). Quando comparamos esses resultados com
aqueles encontrados para o extrato rico em polissacarídeos sulfatados de D.
delicatula, encontramos um dado interessante: O extrato apresentou uma atividade
sequestradora de radicais superóxido cerca de 2,4 vezes maior do que DD-1,5v.
Possivelmente, o potencial de sequestro encontrado para o extrato é resultado da
somatória de atividades das heterofucanas que parecem agir de forma sinérgica no
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
105
sequestro de radicais superóxido, promovendo uma ação mais eficiente. Logo,
quando do processo de fracionamento e isolamento dos polissacarídeos, estes
perdem parte do potencial antioxidante que apresentavam em conjunto.
No que tange as heterofucanas de S. filipendula, SF-0.7v, SF-1.0v, and SF-
1.5v apresentaram atividade antioxidante para o sequestro de radicais hidroxila,
enquanto SF-0,7v e SF-2,0v mostraram potencial antioxidante no sequestro de
radicais superóxido (Tabela XIII). Esses dados são surpreendentes se levarmos em
consideração que o extrato polissacarídico de S. filipendula não mostrou atividade
antioxidante para os sequestros de hidroxila e superóxido (tabela VI). Esse achado
permite elaborar algumas hipóteses: 1) Os polissacarídeos sulfatados de S.
filipendula provavelmente necessitam de uma quantidade de massa mínima para
apresentar atividade sequestradora de radicais, o que aconteceu apenas quando
estes foram fracionadas; 2) alguns dos polissacarídeos sulfatados podem agir de
forma antagônica, abolindo a atividade antioxidante dos outros polímeros no extrato
polissacarídico; 3) Outros elementos presentes no extrato podem formar agregados
com os polissacarídeos sulfatados, não permitindo a interação destes com os
radicais formados, logo abolindo a atividade antioxidante do extrato polissacarídico.
Para testar essas hipóteses são necessários estudos mais aprofundados com os
polissacarídeos de S. filipendula, porém, independente destas hipóteses, esse
achado nos permite concluir que apenas os ensaios de sequestro de radicais
superóxido e hidroxila não podem ser usados como parâmetros de avaliação do
potencial antioxidante de extratos ricos em polissacarídeos sulfatados, e sim, estes
ensaios devem estar associados a outros testes antioxidantes, como os utilizados
neste trabalho de pesquisa.
Fucanas de macroalgas marinhas geralmente não apresentam atividade
antioxidante através do sequestro de radicais livres, especificamente superóxido e
hidroxila (LEE et al., 2008). Poucos trabalhos mostram fucanas com considerável
potencial de sequestro desses radicais. Para o ensaio de sequestro de radicais
hidroxila, existe apenas um único relato de polissacarídeo sulfatado de alga marinha
com atividade considerável, trata-se de uma fucana extraída da alga L. japonica, que
necessitou de uma concentração extremamente alta (2,5 mg/mL) para inibir cerca de
90% dos radicais formados, concentração esta cinco vezes superior a utilizada no
nosso trabalho (WANG et al., 2008).
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
106
Alguns antioxidantes inibem a interação entre metais de transição e lipídeos
pela sua interação com íons de ferro, por impedimento estérico ou levando a
formação de complexos insolúveis. Além disso, íons de metais de transição também
podem reagir com H2O2 gerando o radical hidroxila (JOMOVA & VALKO, 2011).
Diversos relatos de polissacarídeos sulfatados com capacidade de quelar íons ferro
são encontrados na literatura (QI et al., 2005, WANG et al., 2008, CAMARA et al.,
2011), indicando que este parece ser um dos principais mecanismos de ação
antioxidante destes biopolímeros. Os resultados encontrados neste trabalho
mostraram que apenas três extratos não apresentaram poder quelante, incluindo o
extrato de S. filipendula (Figura 10). Entretanto, todas as heterofucanas extraídas
de S. filipendula mostraram atividade dose-dependente para o ensaio de quelação
férrica (Figura 23), com destaque para SF-2,0v com atividade superior à descrita
para polissacarídeos sulfatados de L. japônica (WANG et al., 2008), U. pertusa (QI et
al., 2005) e de derivados sulfatados quimicamente dos mesmos polissacarídeos de
U. pertusa (QI et al., 2006) e apenas 1,7 vezes inferior ao EDTA. O processo de
fracionamento com volumes crescentes de acetona mostrou-se altamente eficiente
para a extração de polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula, removendo
composto que anulam a atividade antioxidante destas heterofucanas, como pode ser
observado a partir destes resultados e da atividade sequestradora de radicais.
Para o ensaio de poder redutor, os extratos de S. filipendula e D. delicatula
foram classificados dentro do grupo com alta atividade redutora (Figura 11), com
potencial similar ao encontrado para o ácido ascórbico. Os testes realizados com os
polissacarídeos sulfatados destas algas permitiram identificar quais as
heterofucanas responsáveis por esse alto potencial antioxidante. Para D. delicatula,
as heterofucanas DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v apresentam atividades
correspondentes à 50% da atividade apresentada pela vitamina C, um composto de
referência conhecido por apresentar um considerável poder redutor (Figura 18).
Ainda, essas três frações polissacarídicas são ricas em fucana B (Figura 14),
indicando ser esta a principal responsável pelo potencial redutor dos polissacarídeos
sulfatados de algas marrons. Para S. filipendula, apesar de todos os polissacarídeos
apresentarem potencial considerável, SF-1,0v aparece com a melhor atividade,
praticamente similar à vitamina C (Figura 24).
As algas selecionadas para terem seus polissacarídeos analisados neste
trabalho apresentaram atividade antiproliferativa frente à linhagem celular tumoral
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
107
HeLa, após incubação por 72h. Nessas mesmas condições as heterofucanas de D.
delicatula também apresentaram resultados interessantes, merecendo um maior
destaque as atividades encontradas para DD-0,7v e DD-1,3v (64,5% e 93,4%,
respectivamente) (Figura 19A). Fica claro que estas heterofucanas possivelmente
apresentam potencial para o tratamento de linhagens tumorais, como a observada
para HeLa, entretanto, atualmente existe uma busca incessante por novos
compostos que apresentem efeitos colaterais menos agressivos, e dentre estas
condições, a ação especifica contra uma determinada linhagem celular aparece
como prioridade, ou seja, os compostos que afetam apenas células tumorais são
considerados mais eficientes. De forma surpreendente, quando as heterofucanas
foram incubadas com a linhagem celular MC3T3 (pré-osteoblastos de origem
murina), todas apresentaram um alto poder antiproliferativo, chegando a 99,2% de
inibição (DD-1,5v) (Figura 19B).
Quanto aos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula, todos mostraram um
efeito antiproliferativo dose dependente frente às células HeLa (Figura 25A). SF-
1,5v, inibindo cerca de 53,5% das células incubadas, apresentou a atividade mais
significativa. Entretanto, o resultado que merece maior destaque é a ausência de
inibição de células MC3T3 observada para SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v, indicando
que SF-1,5v inibe a proliferação celular de HeLa por um mecanismo celular que não
é afetado quando a fração polissacarídica é incubada com a linhagem normal
MC3T3. Diversos estudos in vivo e in vitro de atividades antitumorais de fucanas têm
sido relatados (LIN et al, 2010; HOLTKAMP et al, 2009). Estes polímeros podem agir
através de diferentes mecanismos, como por exemplo, Inibição da adesão celular à
matriz extracelular (ROCHA et al., 2001); Inibição da angiogênese (LEE et al., 2008),
bloqueio do ciclo celular (RIOU et al., 1996, JI et al., 2004) e ativação da via das
caspases (AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007).
As heterofucanas avaliadas neste trabalho apresentam um excelente
potencial farmacológico: anticoagulante, antioxidante e antitumoral. A partir dos
resultados obtidos fazem-se necessários estudos mais aprofundados, que ajudem
na compreensão acerca dos principais mecanismos de ação que levam estes
polissacarídeos a desempenharem estas atividades biológicas. Para a continuidade
deste trabalho, um polissacarídeo foi selecionado para avaliação de seu mecanismo
de ação. A heterofucana escolhida foi SF-1,5v, que apresentou uma considerável
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
108
atividade antiproliferativa frente a linhagem celular HeLa e não alterou a proliferação
celular de células normais osteoblásticas (MC3T3).
5.3. Determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente à linhagem celular tumoral HeLa.
A heterofucana SF-1,5v, extraída da alga marrom S. filipendula apresentou
atividade antitumoral célula-específica, inibindo a proliferação da linhagem tumoral
HeLa após incubação por 72 h. Para uma melhor dinâmica experimental na
determinação dos mecanismos de ação, as celulas HeLa foram incubadas com SF-
1,5v por períodos de 24 h e 48 h, a fim de verificar se esta apresenta atividade
antiproliferativa em tempos inferiores à 72 h. A inibição tempo-dependente de SF-
1,5v sobre a proliferação celular de células HeLa pode ser visto na Figura 26. SF-
1,5v inibiu a proliferação celular em 47,3% no tempo de incubação de 24 h (2,0
mg/mL). Estes valores são consideravelmente superiores ao encontrado para outros
polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marrons do gênero Sargassum, como
fucanas obtidas de S. kjellmanianum e S. stenophyllum que não inibiram mais que
40% da proliferação das células L-1210 (linhagem linfocitária leucêmica) e HeLa,
respectivamente (YAMAMOTO et al., 1984, STEVAN et al., 2001). Portanto, levando
em consideração que SF-1,5v promove um decréscimo antitumoral significativo
diante das células HeLa em um período de 24h, decidiu-se adotar este tempo de
incubação como padrão para os ensaios posteriores.
Para confirmar se a inibição da proliferação celular mostrada no experimento
anterior se deve a indução da apoptose, as células HeLa foram incubadas com a
heterofucana SF-1,5v, seguido de marcação com anexina V-FITC (proteína anexina
V unida à isotiocianato de fluoresceína) e iodeto de propídeo (PI). A análise dos
resultados foi feita através da citometria de fluxo (Figura 27). A Anexina V-FITC
caracteriza-se por se ligar à fosfatidilserina (FS), um fosfolipídio de membrana
localizado no lado intermembrana de células vivas. Durante os eventos que levam a
apoptose, ocorre a sua externalização ativamente para a camada externa da
membrana plasmática, onde sua presença e requerida para o reconhecimento e
fagocitose da célula morta (CHEN et al., 2011). Por sua vez o PI caracteriza-se por
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
109
atravessar a membrana citoplasmática de células necróticas, permitindo desta forma
a sua rápida identificação. A partir do tratamento com SF-1,5v podemos verificar que
houve um aumento significativo de células em estagio inicial de apoptose (19,8%),
confirmando que o principal mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v é
através da indução da apoptose.
Duas vias celulares, conhecidas como via extrínseca e via intrínseca da
apoptose podem desencadear os mecanismos apoptóticos (CHAUDHARI et al.,
2008, JEONG & SEOL, 2008) Figura 4Figura 4 e Figura 5), e em ambas as vias as
caspases desempenham papel chave: caspase-8 e caspase-9 como iniciadoras das
vias extrínseca e intrínseca, respectivamente, e caspase-3 como efetora das duas
vias. Estas vias, monitoradas principalmente através da ativação da procaspase-9 e
procaspase-3, aparecem como o principal mecanismo antitumoral de diversos
polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas (AISA et al., 2005, TERUYA et
al., 2007).
Portanto, SF-1,5v foi avaliado quanto a capacidade de ativar a via das
caspases através da técnica de western blot (Figura 28A). Nenhuma alteração foi
observada nos conteúdos das duas procaspases aqui analisadas, procaspase-3 e
procaspase-9, indicando que SF-1,5v provavelmente desempenha sua atividade
antiproliferativa através de uma via diferente da ativação das caspases. Este
resultado foi confirmado após incubação das células HeLa com um inibidor
específico de caspase, zVAD, na presença e na ausência de SF-1,5v (Figura 28B).
zVAD não alterou a proliferação celular de HeLa, ratificando que a ativação de
caspase não é essencial para SF-1,5v induzir a apoptose em células HeLa.
Alguns trabalhos mostram que a ativação das caspases não necessariamente
leva à morte celular, o que mostra a importância de outras vias independente de
caspase no processo de apoptose. Uma fucana extraída de F. vesiculosus induz a
expressão de caspase-3 e reduz o potencial elétrico mitocondrial de células HS-
sultan. Entretanto, experimentos com inibidores de caspases mostraram que a
ativação de caspases era responsável por apenas 69% da atividade apoptótica do
polissacarídeo, indicando que outras vias independentes de caspases estão
envolvidas na indução da morte celular, especificamente, a ativação de ERK
(extracellular signal–regulated kinase) (AISA et al., 2005). Em trabalhos posteriores,
esta mesma fucana inibiu a proliferação de células HCT-15 (linhagem tumoral de
cólon) através da ativação de ERK e p38 e do bloqueio de PI3K/AKt (HYUN et al.,
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
110
2009b), bem como através da produção de óxido nítrico induzida pela ativação de
NFkB (NAKAMURA et al., 2006).
Neste trabalho, outras vias indutoras de morte celular independentes de
caspases foram avaliadas quanto ao efeito do tratamento de HeLa com SF-1,5v.
Devido a MAPK, uma família de proteínas quinases ativadas por mitógenos, estar
diretamente envolvida nos processos de proliferação, diferenciação e apoptose
(MIYAKAWA et al., 2001, GALLO & JOHNSON, 2002, KAPUR et al., 2002), foi
estudada a fosforilação de ERK e p38 através de western blot (Figura 29). SF-1,5v
não alterou a fosforilação destas duas proteínas, indicando que a via MAPK não é
afetada pela heterofucana. AKt, outra proteína quinase, tem um papel chave em
múltiplos processos celulares, como o metabolismo de glicose, proliferação, e é
fundamental à sobrevivência celular através da supressão da apoptose
(NICHOLSON & ANDERSON, 2002, SCHEID & WOODGETT, 2003), logo, o
bloqueio de AKt promove a inibição da proliferação e a indução da apoptose.
Novamente, SF-1,5v não alterou o padrão de fosforilação de AKt.
O fator de transcrição NFkB está envolvida na expressão de genes que
participam de processos imunológicos, apoptóticos e tumorigênicos, e pode ser
ativado por estímulos apoptóticos envolvidos em danos no DNA, induzindo a
expressão de uma variedade de genes pró-apoptóticos. Quando incubada com SF-
1,5v por 24h, a fosforização de NFkB também não pôde ser observada (Figura 29).
A proteína quinase GSK-3β tem sido associada a uma diversidade de
processos biológicos, entre eles a apoptose, o que a torna uma excelente candidata
em terapias antitumorais (LUO, 2009). Percebe-se claramente, que o conteúdo de
GSK-3β fosforilado é alterado após incubação com SF-1,5v, indicando que a
heterofucana promove a desfosforilação (ativação) de GSK-3β. Esta proteína
promove a ativação de uma gama de moléculas, entre elas a proteína supressora de
tumor p53 (LUO, 2009), que mantêm a integridade do genoma, prevenindo desta
forma, o aparecimento de tumores (ZHELTUKHIN & CHUMAKOV, 2010), logo a
ativação de p53 foi avaliada. Entretanto, esta proteína não foi afetada por SF-1,5v.
A desfosforilação de GSK-3β está envolvida no processo de apoptose,
indicando que SF-1,5v provavelmente induz morte celular através da ativação desta
proteína. Para determinar o papel de GSK-3β na apoptose induzida pelo
polissacarídeo sulfatado nas celulas HeLa, estas foram incubadas com cloreto de
litium, um inibidor específico de GSK-3β, e o número de células em apoptose foi
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
111
quantificado através de citometria de fluxo (Figura 30). O cloreto de lítio não alterou
a apoptose induzida por SF-1,5v, mostrando que GSK-3β também não é essencial
para a atividade apoptótica deste polissacarídeo sulfatado em células HeLa. Um
resultado semelhante foi relatado para fucana de F. vesiculosus, que promove
desfosforilação de GSK-3β, mas este efeito não está envolvido na morte celular de
células HS-sultans induzida por fucana (AISA et al., 2005).
Foi observado até aqui, que a heterofucana SF-1,5v induz apoptose em
células HeLa por uma via independente da ativação de caspases. Ainda, os
resultados anteriores mostraram que SF-1,5v não altera as vias de sinalização de
NF�B, Akt, GSK-3�, MAPK (ERK and p38) e GSK.
Estudos mostram que a mitocôndria, além da participação na via intrínseca da
apoptose, também libera fatores envolvidos no processo de morte celular
independente de caspases. Mais recentemente, foi descrita a liberação, na via
mitocondrial, de uma flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF)
(SMITH et al., 2008, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010, MCMILLAN &
QUADRILATERO, 2011, SEVRIOUKOVA, 2011).
AIF migra da mitocôndria para o núcleo após um estímulo de apoptose e
induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb,
independente da ativação das caspases (GRIVICICH et al., 2007, AKEMATSU &
ENDOH, 2010, MCMILLAN & QUADRILATERO, 2011). AIF também induz exposição
de fosfatidilserina na superfície celular e pode manter a atividade apoptótica na
presença do inibidor pan-caspase (z-VAD) (HANGEN et al., 2010). Visto que o
tratamento com SF-1,5v induz exposição de fosfatidilserina na superfície celular e a
atividade apoptótica é mantida na presença de z-VAD, nós mensuramos AIF
citosólico através de western blot (Figura 31). Os níveis de AIF no citosol
aumentaram de maneira tempo-dependente após tratamento com SF-1,5v,
indicando que o principal mecanismo de morte celular induzido pela heterofucana é
através da liberação mitocondrial de AIF no citoplasma.
Como as proteínas Bcl-2 e Bax, apresentam papel chave na liberação de AIF
no citoplasma, a primeira inibindo esse processo, e a segunda favorecendo a
permeabilização da membrana, entrada de íons cálcio e consequente liberação do
fator no citoplasma celular, estas também foram avaliadas quanto a influencia de SF-
1,5v em suas concentrações. Fica claro que SF-1,5v promove a supressão da
expressão de Bcl-2, ao mesmo tempo em que induz a expressão de Bax (Figura 31).
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
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A partir desses resultados pode ser proposto um esquema para os eventos
envolvidos na morte celular de HeLa induzidas por SF-1,5v (Figura 32). Inicialmente,
SF-1,5v promove alterações na expressão das proteinas BCL-2 e Bax, suprimindo a
primeira e promovendo a expressão da segunda no citoplasma. Bax, por sua vez,
promove o aumento da permeabilidade da membrana externa mitocondrial, o que
leva a liberação de diversos fatores, entre eles o AIF. Em seguida, AIF induz a celula
à apoptose, possivelmente através de ligacao ao DNA, e consequente recrutamento
e ativação de endonucleases, promovendo a degradação do DNA em fragmentos de
50Kb, bem como a condensação da cromatina e a formação de corpos apoptóticos
(CREGAN et al., 2004, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010).
Por fim, este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal
mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol. Desta
forma, SF-1,5v aparece como um promissor fármaco na terapia antitumoral,
principalmente por oferecer uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais,
afetando uma via de sinalização celular diferenciada. Estudos mais aprofundados
estão sendo desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa com o objetivo de purificar
Figura 32. Mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente a linhagem celular tumoral HeLa.
DISCUSSÃO
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
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SF-1,5v, determinar a sua estrutura química e avaliar os mecanismos de ação
antiproliferativo frente à outras linhagens celulares tumorais.
CONCLUSÕES
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6 – CONCLUSÕES
Os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados extraídos das onze
macroalgas marinhas apresentaram efeito anticoagulante, antioxidante e/ou
antiproliferativo em diferentes níveis de atividades;
As algas marrons apresentaram os melhores potenciais de exploração
farmacológica dentre todas as algas estudadas;
Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas
seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados para a alga D. delicatula e cinco
frações para a alga S. filipendula;
As algas marrons S. filipendula e D. delicatula sintetizam um complexo
sistema de heterofucanas compostas de fucose, galactose, ácido glucurônico,
glicose, manose e/ou xilose;
Apesar de todas as frações estudados serem constituídos por sulfato, apenas
aqueles obtidos da alga D. delicatula apresentaram atividade anticoagulante para o
teste de aPTT;
Todas apresentaram atividade para os diferentes ensaios antioxidantes,
entretanto, a quelação férrica aparece como o principal mecanismo de ação
antioxidante;
Todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados mostraram potencial
antiproliferativo frente a linhagem celular tumoral de cólon uterino (HeLa);
Dentre todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados aqui estudadas,
apenas as frações SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v, não inibiram a proliferação celular de
células pré-osteoblásticas (MC3T3);
SF1,5v induz a apoptose em células HeLa através da liberação do Fator
Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, uma via independente da ativação das
caspases;
Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal
mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que
torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma
alternativa aos quimioterápicos tradicionais.
REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS
Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN
115
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICES
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8 - APÊNDICES
APÊNDICE A
APÊNDICES
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134
APÊNDICE B
APÊNDICES
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135
APÊNDICE C
APÊNDICES
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136
APÊNDICE D
APÊNDICES
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137
APÊNDICE E
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