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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
HANNALY WANA BEZERRA PEREIRA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS CHIKUNGUNYA
CIRCULANTE NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
NATAL/RN
2018
HANNALY WANA BEZERRA PEREIRA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS CHIKUNGUNYA
CIRCULANTE NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção
do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área
de Microbiologia/Virologia.
Orientador: Prof. Dr Josélio Maria Galvão de Araújo
Natal/RN
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson -
Centro de Biociências - CB
Pereira, Hannaly Wana Bezerra.
Caracterização Genética do Vírus Chikungunya Circulante no Estado do
Rio Grande do Norte / Hannaly Wana Bezerra Pereira. - Natal, 2018.
82 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo.
1. Vírus Chikungunya - Dissertação. 2. Genótipo Leste-Centro-Sul
Africano - Dissertação. 3. Rio Grande do Norte - Dissertação. 4.
Caracterização filogenética - Dissertação. I. Araújo, Josélio Maria Galvão
de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 578.42
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
A Dissertação “Caracterização genética do vírus Chikungunya
circulante no Estado do Rio Grande do Norte”, elaborada por Hannaly
Wana Bezerra Pereira e aprovada por todos os membros da Banca
Examinadora, foi aceita pelo Programa de Pós-graduação em Biologia
Parasitária da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e
homologada pelos membros da Banca, como requisito à obtenção do
título de Mestre em Biologia Parasitária, área de
Microbiologia/Virologia.
Natal, 27 de fevereiro de 2018
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Josélio Maria Galvão de Araújo – Orientador
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
______________________________________________________
Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes – 1º Examinador
Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN
______________________________________________________
Prof. Dr. Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes– 2º Examinador
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN
“Se consegui enxergar mais longe é porque procurei ver
acima dos ombros dos gigantes”
Isaac Newton
AGRADECIMENTOS
A Deus por ser essencial em minha vida, guia do meu destino, minha fonte maior de
força e sabedoria, o autor da sinfonia mais bela: a vida.
Aos meus pais, Romildo e Gerusa pelo amor infinito e incondicional, pelas sábias
lições de otimismo e esperança, por me guiarem no caminho do bem e por sempre
acreditarem na minha capacidade. Ao meu irmão, Hazen; minha cunhada, Juliana;
pelos momentos de descontração e de companheirismo. Ao meu sobrinho, Igor, por
proporcionar mais alegria e cor nos meus dias.
A minha família: avós, tios e primos por partilharem e celebrarem todos os momentos
de conquista.
Ao meu orientador, Josélio Araújo, por ser um exemplo de profissional. Sou grata pela
oportunidade, aprendizado, confiança e por lapidar meu desenvolvimento intelectual
durante o mestrado.
Aos amigos da virologia (LADIC): Ingryd Câmara (fofis); Joelma Dantas (Joelminha);
Leandro Gurgel (doido); Marília Farias (Liloca); Pedro Cavalcanti (Pedrinho); Raiza
Nara (boydoida); Yasmin Mesquita (baby) pela amizade, pelos aprendizados –
inclusive nos “aperreios” e pequenos mini infartos -, por todos os momentos bons e
conquistas alcançadas juntos. Em especial, à Anne Aline (bebê), por ser uma amiga
única e especial – Real oficial -, compartilhando absolutamente todos os momentos
ímpares e colecionando histórias de amizade, afinal “a sua loucura parece um pouco
a minha”.
Aos meus amigos do eterno Five® Totally Spies: Felipe Sales; Iara Dantas; Jéssyca
Tamires e Kamila Araújo por se fazerem presentes em absolutamente todos os
momentos. Pelas discussões dos assuntos mais diversos, pelos momentos ímpares
e por tornar todas as manhãs verdadeiros “bons dias”. Vocês são incríveis!
A Gustavo Cavalcanti (Guga/filhote) pelo amplo espectro de momentos, que vai das
brincadeiras até a seriedade, com um bônus de quase sempre ser a pessoa a me
salvar quando tudo parecia sem saída nessa dissertação. Obrigada pelas discussões
mais importantes do universo 7 (com direito a risadas mais épicas de Dragon Ball
Super). Você é inesquecível!
Aos meus amigos do mestrado (PPgBP): Brenda Elen (Mig); Camila Morais; Denis
Dantas; Julliette Medeiros e Márjore Lorena que tornaram a rotina do mestrado mais
cheia de vida. Por serem a melhor turma que esse programa de pós-graduação já
teve! Por se tornarem tão especiais que não é possível descrever, por entenderem
que o que importa é realmente o que interessa. Aos agregados da turma: Fellipe
Albano; Marcel Miranda; Nathalie Sena por sempre agregar valor à turma e serem
ímpares. Vocês são demais!
A Matheus Zatti e Alex Fernandes por serem aqueles bioinformatas que você respeita
e precisa, no lugar certo e na hora certa. Vocês são meninos muito especiais e terão
um futuro brilhante!
As minhas “Friends”, Heloisa Caravina, Larissa Paula, Rachel Salviano, Sarah Josuá,
Shade Dandara e Smyrna Menezes por muitas vezes entender minha ausência, e
terem a habilidade se fazerem presentes em todos os momentos. Por mostrarem que
realmente amizade é o que importa.
Ao meu amigo Jorge Lucas (xoxinho) por tornar os dias verdadeiras aventuras, por
nossas discussões de brincadeirinha/chororôs e pelo carinho imensurável. A Técio
Marlos (in memorian) pelos anos de amizade e reencontros inesperados, além de
sempre acreditar que os experimentos não decepcionariam. A Walter Luan pela
paciência master; preocupação com meu bem-estar e pela torcida constante em todos
os momentos.
Aos professores José Veríssimo Fernandes e Daniel Carlos Ferreira Lanza pela
gentileza em participar da banca da qualificação, contribuindo significativamente com
todas as sugestões. E agradeço pode se fazerem presentes durante a minha
formação profissional. Meus sinceros agradecimentos. Aos professores Paulo
Guedes; Valter Andrade; Ermeton Duarte; Lilian Giotto; Carlos Maia; Hugo Alexandre
e demais professores pelas conversas incentivadoras, discussão de metodologias e
por contribuírem para o meu aprendizado.
A todos que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho.
RESUMO
A febre Chikungunya é uma síndrome febril com grave artralgia debilitante, podendo
evoluir para casos atípicos, como manifestações neurológicas e mucocutâneas.
Geralmente é transmitida por mosquitos do gênero Aedes. O agente etiológico é o
vírus Chikungunya (CHIKV) que pertence à família Togaviridae e ao gênero
Alphavirus. Até pouco tempo essa doença era negligenciada no Brasil, porém com o
surto epidêmico que houve no ano de 2016, essa arbovirose se tornou um desafio
para a saúde pública. O objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização
genética do CHIKV identificado no Estado do Rio Grande do Norte (RN), no biênio
2016-2017. Um total de 10 amostras de soro, líquor ou conteúdo de vesículas-
bolhosas foram analisadas pela metodologia de qRT-PCR para detecção do CHIKV e
todas se apresentaram positivas. Foi realizada a filogenia e a caracterização genética
do vírus, por meio do sequenciamento da região codificadora da poliproteína
estrutural, com posterior análise da estrutura da proteína por meio da modelagem. A
análise filogenética indicou que o genótipo circulante no Estado do Rio Grande do
Norte é o Leste-Centro-Sul Africano II (ECSA II). A comparação entre as sequencias
dos CHIKV deste estudo com aquelas de seu ancestral da linhagem ECSA II
identificado em Uganda em 1982 (GenBank: HM045812) revelou a presença de 21
mutações não sinônimas. O sequenciamento dos CHIKV do soro e do líquor de um
mesmo paciente revelou duas mutações não sinônimas potencialmente associadas a
neurovirulência viral: N606K e P677L. Adicionalmente, a análise da modelagem de
proteínas mostrou que o vírus circulante no Rio Grande do Norte não apresenta a
mutação na posição A226V, que determina uma maior infectividade do vírus para o
Aedes albopictus. Em conclusão, esse estudo revela a origem do CHIKV circulante no
Estado do Rio Grande do Norte e possíveis marcadores de neurovirulência viral,
informações úteis para compreender a evolução viral e a patogênese da doença.
Palavras-chave: vírus chikungunya, Genótipo Leste-Centro-Sul Africano, Rio Grande
do Norte, Caracterização filogenética.
ABSTRACT
Chikungunya fever is a febrile syndrome with severe debilitating arthralgia, which may
progress to atypical cases, such as neurological and mucocutaneous manifestations.
It is usually transmitted by mosquitoes of the genus Aedes. The etiological agent is the
Chikungunya virus (CHIKV) that belongs to the family Togaviridae and to the genus
Alphavirus. Until recently this disease was neglected in Brazil, but with the epidemic
outbreak that occurred in the year 2016, this arbovirose has become a challenge for
public health. The objective of the present study was to perform the genetic
characterization of the CHIKV identified in the State of Rio Grande do Norte (RN), in
the biennium 2016-2017. A total of 10 serum samples, cerebrospinal fluid (CSF) or
blister samples were analyzed by the qRT-PCR methodology for CHIKV detection and
all were positive. Phylogeny and genetic characterization of the virus were performed
by sequencing the coding region of the structural polyprotein, with subsequent analysis
of the protein structure through modeling. Phylogenetic analysis indicated that the
circulating genotype in the State of Rio Grande do Norte is East-Central-South-African
II (ECSA II). The comparison between CHIKV sequenced in this study and its ancestor
from ECSA II lineage identified in Uganda in 1982 (GenBank: HM045812) revealed the
presence of 21 non-synonymous mutations. Sequencing of serum and CSF CHIKV
from the same patient revealed two non-synonymous mutations potentially associated
with viral neurovirulence: N606K and P677L. In addition, the analysis of the protein
model showed the circulating non-RN virus has no mutation at position A226V which
is the major part of virus infection for Aedes albopictus. In conclusion, this study reveals
the origin of CHIKV circulating in the State of Rio Grande do Norte and possible
markers of viral neurovirulence, useful information to understand the viral evolution
and the pathogenesis of the disease.
Keywords: Chikungunya virus, East-Central-South African genotype, Rio Grande do
Norte, Phylogenetic characterization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura física do vírus Chikungunya. Fonte: Adaptado de Weaver et. al.,
2015 .......................................................................................................................... 21
Figura 2 - Organização do genoma do CHIKV e seus produtos gênicos. Fonte:
Adaptado de Thiberville et. al., 2013 ......................................................................... 21
Figura 3 - Ciclo replicativo do vírus Chikungunya. Fonte: Adaptado de ABDELNABI
et.al., 2015................................................................................................................. 25
Figura 4 - Fisiopatologia da infecção pelo CHIKV: disseminação viral. Fonte:
Adaptado de LUM et.al., 2015 ................................................................................... 26
Figura 5 - Critérios diagnósticos da febre Chikungunya. Fonte: Adaptado de BURT et.
al., 2012 .................................................................................................................... 30
Figura 6 - Esquema representativo das mutações já reportadas na literatura. A
numeração em vermelho representa as posições das mutações referentes a região
codificadora do gene da poliproteína estrutural do CHIKV. ....................................... 35
Figura 7 - Localização do Estado do Rio Grande do Norte. ..................................... 40
Figura 8 - Representação ilustrativa da estratégia de primer walking utilizada para
desenho dos primers específicos para o gene da poliproteína estrutural do CHIKV. 56
Figura 9 - Teste de gradiente de primers em gel de agarose a 1%, utilizando os
primers desenhados para as reações de sequenciamento. ...................................... 58
Figura 10 - Árvore radial no programa Mega 6.0 representando os quatro genótipos
do CHIKV.. ................................................................................................................ 61
Figura 11 - Árvore tradicional colapsada no programa Mega 6.0, representando os
genótipos do CHIKV.. ................................................................................................ 62
Figura 12 - Representação ilustrativa da amostra de vírus obtidas de soro (1417S) e
líquor (1417L) como mapeamento de todas as mudanças de aminoácidos de acordo
com as regiões em que se encontram. ..................................................................... 65
Figura 13 - Estrutura das proteínas E3 e E2 do CHIKV na amostra de vírus obtida de
líquor.. ....................................................................................................................... 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Mutações encontradas nos genes codificadores da poliproteína estrutural
do CHIKV reportadas na literatura. ........................................................................... 35
Tabela 2 - Sequência da sonda e dos primers iniciadores utilizados na qRT-PCR para
detecção do vírus Chikungunya ................................................................................ 42
Tabela 3 - Reagentes utilizados na qRT-PCR para detecção do CHIKV .................. 43
Tabela 4 - Condições de termociclagem para reação de RT-PCR em tempo real ... 43
Tabela 5 - Reagentes utilizados para a reação de síntese de cDNA. ....................... 46
Tabela 6 - Padrões de termociclagem para a síntese de cDNA ............................... 46
Tabela 7 - Reagentes utilizados na PCR para sequenciamento ............................... 47
Tabela 8 - Parâmetros de termociclagem da PCR para sequenciamento ................ 47
Tabela 9 - Parâmetros de termociclagem para a reação de sequenciamento (Cycle
Sequencing) .............................................................................................................. 51
Tabela 10 - Achados clínicos importantes dos nove pacientes selecionados para o
presente estudo. ........................................................................................................ 55
Tabela 11 - Oligonucleotídeos iniciadores para sequenciamento do gene da
poliproteína estrutural do CHIKV ............................................................................... 57
Tabela 12 - Relação das amostras selecionadas para o estudo da caracterização
molecular. .................................................................................................................. 59
Tabela 13 - Mutações na sequência de aminoácidos do CHIKV isolados no Rio
Grande do Norte ........................................................................................................ 63
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES Anti-inflamatórios não esteroidais
CB Centro de Biociências
cDNA DNA complementar
CHIKV Vírus Chikungunya
ddH2O Água livre de nucleases
ddNTPs Dideoxinucleotídeos
DMP Departamento de Microbiologia e Parasitologia
DNA Ácido Desoxirribonucleico
dNTPs Desoxirribonucleotídeos
E1 Glicoproteína do Envelope 1
E2 Glicoproteína do Envelope 2
ECSA Leste-Centro-Sul Africano
EUA Estados Unidos da América
GC Guanina e Citosina
IFN Interferon
IOL Linhagem do Oceano Índico
Kb Kilobases
Km² Quilômetros quadrado
LADIC Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer
LBMG Laboratório de Biologia Molecular e Genômica
LCR Líquido cefalorraquidiano ou líquor
mg Miligramas
min Minutos
MTAse Metiltransferase
NCBI - “National Center for Biotechnology Information”
Centro Nacional de Informação Biotecnológica
ng Nanogramas
NsP Proteínas não estruturais
ORFs - “Open Reading Frame” Fase de leitura aberta
Pb Pares de base
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
Proteína C Proteína do capsídeo
qRT-PCR Transcriptase Reversa Seguida de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
RN Rio Grande do Norte
RNA Ácido Ribonucleico
RT-PCR Transcriptase Reversa Seguida de Reação em Cadeia da Polimerase
SNC Sistema nervoso central
SSSS Síndrome da pele escaldada estafilocócica
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Web – “World Wide Web” Rede Mundial de Computadores
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 16
1.1 Breve Histórico ........................................................................................... 16
1.2 Vetores transmissores ............................................................................... 17
1.2.1 Aedes aegypti........................................................................................... 18
1.2.2 Aedes albopictus ..................................................................................... 19
1.3 CHIKV: Agente etiológico .......................................................................... 19
1.3.1 Proteínas não estruturais ........................................................................ 22
1.3.3 Ciclo replicativo do vírus Chikungunya ................................................. 23
1.4 Fisiopatogênese da febre Chikungunya .................................................. 25
1.5 Aspectos Clínicos ...................................................................................... 26
1.5.1 Fase aguda ............................................................................................... 27
1.5.2 Fase subaguda ......................................................................................... 28
1.5.3 Fase crônica ............................................................................................. 28
1.5.4 Formas atípicas........................................................................................ 29
1.7 Tratamento e Perspectivas ........................................................................... 31
1.8 Aspectos Epidemiológicos ........................................................................... 32
1.9 Aspectos filogenéticos e moleculares ......................................................... 33
1.10 Controle ........................................................................................................ 36
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 37
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 38
3.1 Objetivo geral: ............................................................................................ 38
3.2 Objetivos específicos: ............................................................................... 38
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 39
4.1 Tipo de estudo ............................................................................................ 39
4.2 Local de estudo .......................................................................................... 39
4.3 População de estudo, espécimes clínicos e fonte de dados ................. 40
4.4 Diagnóstico molecular do vírus CHIKV .................................................... 41
4.4.1 Extração do RNA total ......................................................................... 41
4.4.2 Transcriptase Reversa Seguida da Reação em Cadeia da
Polimerase em Tempo Real (qRT-PCR) .......................................................... 41
4.5 Caracterização Molecular .......................................................................... 44
4.5.1 Sequenciamento do gene da poliproteína estrutural do CHIKV .......... 44
4.5.1.1 Oligonucleotídeos iniciadores ............................................................. 44
4.5.1.2 Teste de gradiente de temperatura dos primers ................................ 45
4.5.1.3 Reação de síntese de DNA complementar (cDNA) ............................ 45
4.5.1.4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para sequenciamento ...... 46
4.5.1.5 Eletroforese em gel de agarose ........................................................... 48
4.5.1.6 Purificação do Produto de PCR para Sequenciamento por Extração
de Gel de Agarose ............................................................................................ 48
4.5.1.7 Purificação diretamente do produto da PCR ...................................... 49
4.5.1.8 Quantificação de DNA .......................................................................... 50
4.5.1.9 Reação de Sequenciamento ................................................................ 50
4.5.1.10 Purificação e Precipitação de DNA para remoção de Dye
Terminators ....................................................................................................... 51
4.5.1.11 Análise de Sequências ....................................................................... 51
4.6 Modelagem de proteínas ........................................................................... 52
5. RESULTADOS ................................................................................................... 54
5.1 Achados Clínicos ........................................................................................... 54
5.2 Desenho de oligonucleotídeos iniciadores ................................................. 56
5.2 Gradiente de Temperatura ......................................................................... 58
5.3 Análise Filogenética ................................................................................... 59
5.4 Variabilidade genética dos CHIKV e modelagem das proteínas E2 e E3 .. 63
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 66
7. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 72
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 73
16
1. INTRODUÇÃO
O termo “arbovírus” foi estabelecido no ano de 1942 e deriva da sigla em inglês
Arthropod Borne Viruses, e está relacionado à discriminação do grupo de vírus
transmitido por vetores artrópodes. Essa designação não está apenas associada à
sua veiculação, mas também pelo fato de os vírus serem capazes de se replicar nos
vetores transmissores (CASSEB et. al, 2013; LOPES et. al., 2014; MEYER et. al.,
2016). Algumas condições como mudanças climáticas, desmatamentos, migração
populacional, ocupação desordenada de áreas urbanas e precariedade das condições
sanitárias favorecem à proliferação dos vetores, amplificam a transmissão viral
(MEYER et. al., 2016) e dão início a surtos epidêmicos.
No grupo das doenças infecciosas, a febre chikungunya tem como agente
etiológico vírus Chikungunya (CHIVK), um arbovírus do grupo A que se expandiu
rapidamente por todo o país (PATTERSON et. al., 2016). Com a emergência da
doença surgiu mais um importante problema de saúde pública (HONÓRIO et. al.,
2015), devido a extensão e gravidade dos surtos epidêmicos após sua introdução no
Brasil.
1.1 Breve Histórico
Os primeiros relatos de sintomas compatíveis com a febre Chikungunya foram
observados em 1935, por Cheney, em pacientes de São Francisco, Califórnia,
Estados Unidos da América, que apresentavam um quadro febril e dores articulares
com exantema maculopapular (CHENEY; 1935). Essa doença febril-exantemática foi
designada, a priori, como “dengue-like”, pois a sintomatologia referida e observada
nos pacientes era bastante similar a da dengue (CHENEY, 1935; WEAVER, 2014;
DONALISIO et.al., 2015), porém, o sintoma da artralgia é um dos fatores que as
distinguem, visto que ambas as arboviroses compartilham o mesmo vetor, distribuição
geográfica e alguns sintomas (DELLER et. al., 1968; CAREY, 1971).
A clínica descrita com exatidão na literatura, reportada pelos pacientes, infere
que inicialmente a condição apresentava-se muito semelhante a uma gripe.
17
Posteriormente, a maior queixa dos pacientes era sobre o aparecimento de severas
dores de cabeça, frequentemente em região frontal generalizada ou occipital. Outros
sintomas importantes eram as dores nas costas, que eram intensas na região sacro-
ilíaca e parecia muito pior do que é normalmente encontrado em outras doenças
febris. A presença de dores nos membros foi observada, sendo tão fortes em alguns
indivíduos, que as articulações tornaram-se rígidas e bastante dolorosas, chegando a
receber a denominação de “quebra ossos”, conforme descrito por Cheney (1935).
Somente durante os anos de 1952-1953 é que o vírus Chikungunya foi isolado
a partir de uma amostra de soro de um paciente febril proveniente do povoado de
Tanganyika, Tanzânia, África (ROBINSON, 1955; LUMSDEN, 1955). Segundo uma
autoridade local, a palavra Chikungunya deriva de um verbo raíz –Kungunyala- dialeto
Makonde, que significa “contorcido”, referindo-se ao estado dos troncos e galhos de
árvores que, no período de estiagem africana ficam retorcidos (LUMSDEN, 1955;
ROBINSON, 1955). Desta forma, foi atribuída a doença, e consequentemente ao
vírus, a designação Chikungunya em referência a postura encurvada adotada pelos
pacientes, devido a intensidade das dores na coluna e outras articulações que
acometem os pacientes (LUMSDEN, 1955; ROBINSON, 1955; HONÓRIO et al.,
2015).
Inicialmente a febre Chikungunya foi considerada restrita aos continentes
Africano e Asiático, no entanto, com o aparecimento de epidemias em novas áreas
geográficas, esta arbovirose tornou-se relevante também nos continentes Americano
e Europeu (DELATTE et. al., 2008).
1.2 Vetores transmissores
As principais espécies de mosquitos transmissoras do vírus Chikungunya são
o Aedes aegypti e o Aedes albopictus (VEGA-RÚA et. al., 2015), sendo o Aedes
aegypti (Díptera: Culicidae) o principal vetor no meio urbano (SCHAFFNER et. al.,
2014). O primeiro vetor pode ser encontrado em regiões tropicais e subtropicais do
mundo (COSTA et.al., 2005), enquanto que o segundo circula também no continente
europeu e nas Américas (ABRANTES E SILVEIRA, 2009). Presume-se que o
mosquito foi introduzido nas Américas por meio de embarcações que cruzavam o
18
oceano Atlântico durante o comércio de escravos nas primeiras colonizações (BRAGA
et. al., 2007; SCHAFFNER et. al., 2014).
1.2.1 Aedes aegypti
A palavra Aedes aegypti deriva do grego aēdēs, “odioso”, e do latim aegypt “do
Egito” (FERREIRA,1986). Considerada a espécie mais importante responsável pela
transmissão da doença, o mosquito Aedes aegypti também é responsável pela
transmissão de outras arboviroses, tais como os vírus dengue, zika, vírus do Nilo
Ociental e febre amarela (ZARA et. al., 2016).
O mosquito é originário da África, sendo descrito inicialmente no Egito, e sua
forma adulta apresenta coloração escura, com faixas branco-prateadas no tórax
formando um padrão característico de linhas semelhantes a uma “lira” (CONSOLI &
OLIVEIRA, 1994; FORATTINI, 2002; BECKER et. al., 2003).
O desenvolvimento do vetor é holometábolo, ou seja, realiza metamorfose
completa, que compreende as fases de ovo, larva (quatro estádios), pupa e adulto
(MURRAY; QUAM; WILDER, 2013). Machos e fêmeas da espécie, quando na forma
adulta, procuram, inicialmente, por seiva de plantas, para obtenção de carboidratos
essenciais para o metabolismo. No entanto, as fêmeas necessitam de alimentação
sanguínea para maturar e produzir uma quantidade abundante de ovos férteis
(CLEMENTS, 1992). A hematofagia exercida pela fêmea do Aedes aegypti acontece
durante o dia (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994; GUBLER, 1998), e após o repasto
sanguíneo, a fêmea procura no ambiente, intra ou peridomicilar, criadouros ideais para
a postura de seus ovos, tais como àqueles recipientes artificiais/artefatos produzidos
pelo homem ou de uso doméstico com água acumulada (CONSOLI & OLIVEIRA,
1994; NATAL, 2002).
O processo de oviposição é feito nas paredes internas de recipientes, acima da
superfície da água, podendo acontecer em diferentes intervalos de tempo (DUPONT
et. al., 2012). No entanto, devido a capacidade de se adaptar a condições ambientais
adversas, principalmente quando na ausência de água, os ovos são resistentes à
dessecação, entrando em quiecência (dormência) por períodos superiores a um ano
19
(SILVA, 1999; JASEN & BEEBE, 2010). Além disso, o vetor lança mão de estratégias
como ter a capacidade de colonizar uma ampla diversidade de criadouros, ter elevada
fecundidade e curto ciclo de desenvolvimento, tornando as ações de controle e
vigilância mais complicadas (REGIS et.al., 2013).
1.2.2 Aedes albopictus
O Aedes albopictus é considerado o vetor transmissor secundários das
arboviroses. É uma espécie de florestas do Sudeste Asiático (SKUSE, 1984), e foi
introduzida no Brasil no ano de 1986 (MARTINS, 2012). Porém, devido à alta
capacidade de dispersão e adaptação, esse mosquito adequou-se às regiões de
climas temperado, tropical e subtropical (ALENCAR et.al., 2008; MARTINS, 2012).
Os casos associados com a transmissão do CHIKV por essa nova espécie
indicaram que o vírus sofreu mutações nas proteínas do envelope (E1 e E2)
associadas a infecciosidade para o Aedes albopictus, tornando-se mais eficiente para
se replicar no organismo do inseto e reduzindo o período de incubação extrínseca
para dois a três dias (TSERTSARKIM et. al., 2007; TSERTSATKIM et. al., 2011).
A coexistência de ambas as espécies do gênero Aedes pode ocorrer em
diversas áreas, gerando uma competitividade entre esses vetores, resultando em uma
possível diminuição ou deslocamento populacional de espécies já estabelecidas
(PAUPY et. al., 2009; MARTINS et. al., 2010).
1.3 CHIKV: Agente etiológico
O CHIKV é um arbovírus membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus
(PIALOUX, et. al., 2007). O grupo ao qual pertence este gênero compreende 28 vírus,
seis dos quais compartilham alguns determinantes antigênicos (STRAUSS et. al.,
1984) e podem causar doenças articulares em humanos, dentre eles, pode-se
destacar: vírus Chikungunya; vírus O’Nyong-Nyong, vírus Ross River, Barmah Forest,
vírus Sindbis e vírus Mayaro (STRAUSS et. al., 1994).
20
O chikungunya apresenta apenas um sorotipo, porém, as epidemias relatadas
ao longo da história foram causadas por diferentes genótipos, identificados desde a
sua descoberta em 1953, são eles: Asiático; Leste-Centro-Sul Africano; Oeste
Africano e Oceano Índico (PETERSEN et. al., 2016; NUNES et. al., 2015;
QUEYRIAUX et al., 2008).
O vírus Chikungunya possui aproximadamente 70nm de diâmetro, é sensível à
dessecação e a temperaturas acima de 58°C (STRAUSS, 1994; KAHN et. al., 2002).
Apresenta um envelope lipídico, com a mesma composição da bicamada lipídica da
membrana da célula hospedeira, na qual estão ancoradas as glicoproteínas virais E1
e E2 (STRAUSS, 1994). Possui um nucleocapsídeo de simetria icosaédrica
constituído pela proteína do capsídeo (Proteína C), que envolve e protege o genoma
constituído por uma molécula de RNA (KHAN et al., 2002; RUPP et al., 2015;
STRAUSS, 1994) (figura 1).
O genoma consiste em uma molécula de RNA linear, de cadeia simples, com
polaridade positiva, de aproximadamente 11,8kb, incluindo o cap na extremidade 5’ e
uma cauda poli A na extremidade 3’. O genoma viral possui duas janelas de leitura
aberta (ORFs), e na região de junção, existe uma região de 68 nucleotídeos não
traduzidos (ARIAS-GOETA et al., 2014; DE FIGUEIREDO et.al., 2014). A ORF que
ocupa os dois terços da extremidade 5’ do genoma, apresenta aproximadamente
7.425 nucleotídeos, é traduzida em uma poliproteína que após ser clivada por
proteases da célula e do vírus dá origem as proteínas não estruturais multifuncionais
(DE FIGUEIREDO; FIGUEIREDO, 2014; STRAUSS; STRAUSS, 1994). A outra ORF
ocupa aproximadamente o terço da extremidade 3’ do genoma, apresenta
aproximadamente 4.327 nucleotídeos, e codifica uma segunda poliproteína que após
a clivagem vai gerar as proteínas estruturais do capsídeo C, a proteína 6k e as
glicoproteínas E1, E2 e E3 do envelope (KHAN et al., 2002; PAUL, 2013) (figura 2).
21
Figura 2 - Organização do genoma do CHIKV e seus produtos gênicos. Fonte: Adaptado de Thiberville et. al., 2013
Figura 1 - Estrutura física do vírus Chikungunya. Em A mostra a estrutura representativa do vírion. Em B mostra as estruturas com base em reconstruções microscópicas crioeletrônicas de alta resolução do vírus Chikungunya. Em C tem-se uma figura representativa da estrutura molecular do CHIKV. Fonte: Adaptado de Weaver et. al., 2015
A B C
22
1.3.1 Proteínas não estruturais
A ORF 5’ é diretamente traduzida do RNA genômico para uma poliproteína que
dará origem a quatro proteínas não estruturais (nsP), na qual posteriormente é clivada
proteoliticamente em proteínas não estruturais individuais: nsP1; nsP2; nsP3 e nsP4
(RUPP et al., 2015). Essas proteínas são enzimas ou fatores de transcrição que são
codificadas e traduzidas somente durante a replicação viral (SREEJITH et al., 2012).
A nsP1 está envolvida no encapsulamento do RNA viral de cadeia positiva,
funcionando como uma âncora da membrana do complexo de replicação com
atividades de metiltransferase (MTAse) e guaniltransferase (FROS; PIJLMAN, 2016;
SALONEN et al., 2003), importantes para instrução da direção de leitura e para o
nivelamento do RNA viral, respectivamente (RUPP et al., 2015).
A nsP2 está envolvida com o processamento autocatalítico da poliproteína não
estrutural P1234 (MERITS et al., 2001) apresentando três relevantes funções, pois
age como helicase; trifosfatase e protease. Consonante a essas funções, essa
proteína está intimamente envolvida na inativação da síntese macromolecular da
célula hospedeira(FROLOVA et al., 2010; KIIVER et al., 2008; LULLA et al., 2006;
SALONEN et al., 2003).
A função da proteína nsP3 na replicação viral ainda não é bem elucidada. Sabe-
se que é organizada em três domínios: um macro amino-terminal; uma região
específica central e uma sequência hipervariável carboxi-terminal (SHIN et al., 2012),
e compreende-se que é uma proteína altamente fosforilada, essencial no complexo
de replicação (PERANEN et al., 1988; RUPP et al., 2015). Uma análise funcional da
nsP3 revelou a presença de um sinal de degradação na região C-terminal que se
sobrepõe com um elemento de sequência localizado entre nsP3 e nsP4 que é
necessário para o processamento proteolítico (VARJAK; ZUSINAITE; MERITS, 2009).
A nsP4, por sua vez, é uma RNA polimerase RNA-dependente, parte integrante
do complexo de replicação dos Alphavirus (TOMAR et al., 2006) de curta duração que
produz o RNA de sentido negativo complementar que serve de molde para a
replicação do genoma viral (FROS; PIJLMAN, 2016), e se constitui a primeira proteína
23
não estrutural a ser proteoliticamente clivada (FROS; PIJLMAN, 2016; HARDY;
STRAUSS, 1989).
1.3.2 Proteínas estruturais
A ORF 3’ é diretamente traduzida do RNA subgenômico 26S para uma
poliproteína precursora das proteínas estruturais: do capsídeo (C); glicoproteínas do
envelope (E1 e E2) e pequenos peptídeos (E3 e 6k) (BOURAI et al., 2012).
A proteína do capsídeo é liberada da poliproteína por meio de autoproteólise
instantânea(STRAUSS, 1989). A proteína C envolve o RNA sintetizado, reconhecendo
sinais de encapsulamento específicos (LEUNG et. al., 2011).
As glicoproteínas E1 e E2 interagem entre si para formar heterodímeros
(LEUNG et. al., 2011). Funcionalmente a glicoproteína E2 participa do processo de
adsorção tendo em vista que estabelece uma ligação entre a partícula viral e os
receptores da célula hospedeira. Enquanto que a glicoproteína E1 é encarregada de
promover a fusão do envelope viral com a membrana do endossomo a fim de liberar
o nucleocapsídeo no citosol da célula (SOLIGNAT et al., 2009).
O papel da glicoproteína E3 ainda é indefinido, e parece variar entre diferentes
Alphavirus (LEUNG et. al., 2011). O peptídeo 6k é responsável por atuar como uma
sequência sinal para a translocação de E1 (SOLIGNAT et al., 2009), essencial para a
montagem das partículas virais. Além disso, essa proteína foi classificada como uma
viroporina, devido a sua capacidade de formar canais de íons catiônicos e alterar a
permeabilidade da membrana (LEUNG et. al., 2011).
1.3.3 Ciclo replicativo do vírus Chikungunya
Em células de vertebrados, o vírus Chikungunya é capaz de se replicar em
menos de oito horas pós-infecção, em temperatura corporal normal
(37°C)(SOURISSEAU et al., 2007; TENG et al., 2011). Para que o ciclo replicativo do
24
CHIKV se inicie é necessário que haja a ligação das glicoproteínas de superfície com
receptores celulares específicos, os quais ainda não foram muito bem elucidados, no
entanto, baseado em infecções por outros Alphavirus, acredita-se que os prováveis
receptores sejam os glicosaminoglicanos; moléculas de DC-sign ou receptores para
laminina (CHEVILLON et al., 2008).
Após a entrada da partícula viral nas células-alvo por endocitose revestidas
com clatrinas, acontecem mudanças conformacionais das glicoproteínas do
envelope, devido ao pH ácido do endossoma, fazendo com que o heterodímero E1-
E2 se reorganize e exponha o peptídeo de fusão de E1, permitindo a fusão do
envelope com a membrana do endossoma (LUM et. al., 2015; SOLIGNAT et. al.,
2009), liberando o nucleocapsídeo no citoplasma da célula (CHEVILLON et al., 2008).
Por ser um RNA mensageiro típico (apresenta em suas extremidades um cap e uma
cauda poli A), o RNA viral livre no citosol da célula é diretamente traduzido em uma
poliproteína precursora que após sofrer clivagens proteolíticas por proteases virais e
da própria célula, origina quatro proteínas não estruturais. Essas nsPs se associam e
formam um complexo de replicação funcional que promove a transcrição do RNA viral
em uma fita de RNA polaridade negativa, com o tamanho completo do genoma a qual
servirá com molde de replicação para síntese do RNA genômico 49s e o subgenômico
26S (SOLIGNAT et al., 2009; MAHALINGAM; KELLER, 2014; LUM et.al., 2015).
O RNA subgenômico 26S é traduzido para dá origem a poliproteína precursora
das proteínas estruturais (C-Pe2-6K-e1), as quais em etapas replicativas tardias
posteriores, se tornarão proteínas estruturais maduras (CHEVILLON et al., 2008). As
glicoproteínas E1 e E2, são geradas por processamento posterior, se associam no
Golgi e são exportadas para a membrana plasmática, onde E2 é clivado em duas
unidades: E2 que funciona como estrutura de adsoção do vírus aos receptores da
célula e E3 que promove a dobragem de E2 e sua subsequente associação com E1
que possui a função na orientação das proteínas do capsídeo para a montagem dos
vírions. O papel da proteína 6k permanece ambíguo, mas parece estar envolvida nas
etapas de montagem e brotamento do vírions da superfície das células infectadas. A
montagem dos vírions corresponde a incorpopração das cópias do RNA genômico
pela proteína do capsídeo, formando os nucleocapsídeos os quais brotam da
membrana plasmática, da célula hospedeira, na qual estão inseridas as glicoproteínas
25
do envelope, formando vírions completos que são liberados (SCHWARTZ et. al., 2012;
LUM et. al, 2015) (figura 3).
1.4 Fisiopatogênese da febre Chikungunya
O conhecimento acerca da rota de infecção do vírus Chikungunya ainda é
limitado, no entanto, sabe-se que o vírus é transmitido através da picada do mosquito
fêmea do Aedes aegypti (ou Aedes albopictus), infectando o tecido subcutâneo e
células residentes da pele, tais como fibroblastos, células dendríticas e macrófagos
(COUDERC; LECUIT, 2015; SOURISSEAU et al., 2007). As partículas virais são
capturadas por células dendríticas, as quais migram para os gânglios linfáticos, com
o objetivo de apresentar os antígenos para o sistema imunológico, mas também
transfere os vírus para os monócitos e macrófagos presentes nos linfonodos. A
resposta inicial é mediada pela ação do interferon (IFN) (SCHILTE et al., 2010), cujas
Figura 3 - Ciclo replicativo do vírus Chikungunya. Fonte: Adaptado de ABDELNABI et.al., 2015
26
funções são enviar sinais para células vizinhas não infectadas para reduzir a síntese
de proteínas, ativar células imunes ou enviar sinais de apoptose (NAIR et al., 2017;
SOURISSEAU et al., 2007).
Os vírus se replicam no interior de monócitos e macrófagos, e essas células
infectadas entram na corrente sanguínea causando viremia e levando os vírus para
órgãos-alvo específicos, principalmente as articulações, bem como baço, fígado, rins
músculos, cérebro, dentre outros (DE FIGUEIREDO; FIGUEIREDO, 2014). O
resultado dessa migração das células monocíticas para os tecidos sinoviais
contribuem de forma significante para a inflamação persistente nas articulações,
apesar da ausência de vírus no sangue durante a fase crônica da doença
(TSETSARKIN et al., 2007).
Figura 4 - Fisiopatologia da infecção pelo CHIKV: disseminação viral. Fonte: Adaptado de LUM et.al., 2015
1.5 Aspectos Clínicos
A febre Chikungunya é uma infecção, geralmente, autolimitada, não fatal, mas
com elevado grau de morbidade, embora resolução de muitos sintomas ocorra dentro
de alguns dias (SCHUFFENECKER et al., 2006). Os sintomas são semelhantes à
27
dengue clássica, exceto pela intensa artralgia, que é fortemente preditiva e está
relacionada ao fato de que, após a fase aguda, esse sintoma pode persistir por
semanas a meses com comportamento flutuante (recidivas) (QUEYRIAUX et al.,
2008).
O período de incubação é curto, dura cerca de dois a dez dias (BURT et al.,
2012; THIBERVILLE et al., 2013), e são descritos três estágios da doença: fase aguda;
subaguda e crônica (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015; SIMON et al., 2011).
1.5.1 Fase aguda
Pacientes com infecção aguda geralmente tem um início ab-rupto da doença,
pode durar até dez dias, e é caracterizado por febre alta, poliartralgia, edema, dor nas
costas, dor de cabeça, fadiga e um rash maculopapular (THIBERVILLE et al., 2013;
WIN et al., 2010) que pode variar de uma leve erupção cutânea localizada até
comprometimentos mais extensos (BURT et al., 2012). A febre e o rash cutâneo são
autolimitadas e dentro de poucos dias se resolvem (PISTONE et al., 2009).
Manifestações menos comuns também são descritas, tais como conjuntivite; diarreia;
vômitos; fotofobia; dores abdominais; inflamação do ouvido, dentre outras (MINER et
al., 2015; MOHAN et al., 2010; SIMON et al., 2011).
Em contraste, a poliartralgia é o sintoma mais característico da doença,
geralmente é bilateral, simétrica e acomete, principalmente, as articulações periféricas
(pulsos, tornozelos e falanges), bem como as grandes articulações (ombro, cotovelos
e joelhos) (BURT et al., 2012; STAIKOWSKY et al., 2009; THIBERVILLE et al., 2013;
WIN et al., 2010). O alívio das dores articulares começam após a primeira semana,
embora em alguns pacientes, a dor, o inchaço e as rigidez matinal seja persistente
por até 3 anos (MARIMOUTOU et al., 2012; SCHILTE et al., 2013).
Durante a fase aguda da doença causada pelo CHIKV há risco de transmissão
vertical intraútero, mas não através do leite materno. Inicialmente, o neonato é
assintomático, e entre três a sete dias observa-se os sintomas iniciais, que incluem
febre; recusa da mamada; exantemas; descamação; edema e hiperpigmentação
cutânea (GOPAKUMAR; RAMACHANDRAN, 2012).
28
1.5.2 Fase subaguda
A fase subaguda dura até três meses do início da doença. É caracterizada pelo
desaparecimento da febre, associada ou não a persistência/agravamento da artralgia
(PIALOUX et al., 2007). É observado, em alguns pacientes, o desenvolvimento da
Síndrome de Raynaud, uma doença vascular periférica na qual a pele fica gélida e
isquêmica/cianótica em resposta a uma exposição ao frio ou situações de estresse
(DE BRITO et al., 2016;).
Além disso, percebe-se sintomas depressivos, em virtude das dores
incapacitantes; diminuição da força física (astenia); prurido generalizado e o
aparecimento de lesões bolhosas (ROBIN et al., 2010)
1.5.3 Fase crônica
A fase crônica, geralmente, acomete pacientes acima de 40 anos de idade, com
histórico de doença subjacente (doenças reumáticas ou traumáticas) ou acomete
pacientes que apresentaram sintomas de poliartralgia intensa durante a fase aguda
(SISSOKO et al., 2009). Instala-se após três meses do início de doença, podendo
ocorrer uma exacerbação dos sintomas, caracterizada pelas inflamações reincidivas,
pelo reumatismo duradouro e perda da qualidade de vida do paciente (SIMON et al.,
2007).
O acometimento articular nesses pacientes é persistente e nas mesmas
articulações atingidas nas fases anteriores, com ou sem edema e limitação de
movimento (SIMON et al., 2011). Além disso, relata-se outras manifestações durante
a fase crônica, tais como: alopecia, fenômeno de Raynaud; distúrbios do sono;
depressão; alterações de humor; alterações de sensibilidade dos sentidos
(disestesias) e inflamação da bolsa sinovial (tenossinovite) (SOUMAHORO et al.,
2009). Descrevem-se casos de dor, inchaço e rigidez matinal com persistência de até
3 anos (MARIMOUTOU et al., 2012; SCHILTE et al., 2013) nos pacientes que
desenvolveram a forma crônica da doença.
29
1.5.4 Formas atípicas
As manifestações atípicas da febre Chikungunya resultam em morbidade
significativa, muito embora haja relatos de consequente mortalidade (RAJAPAKSE;
RODRIGO; RAJAPAKSE, 2010). As hipóteses mais atribuídas para o aparecimento
desses casos estão associadas aos efeitos diretos do vírus, à resposta imune do
paciente ou até mesmo pela toxicidade causada pelos medicamentos ministrados
durante o tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
As epidemias de Chikungunya podem ser consideradas como causa importante
para o surgimento de transtornos neurológicos, principalmente em crianças.
Descrevem-se uma ampla variedade de manifestações, incluindo meningoencefalite,
convulsões e síndrome de Guillain-Barré (AGARWAL et al., 2017; ROBIN et al., 2008).
O mecanismo patogênico pelo qual há acometimento do sistema nervoso central
(SNC) ainda é desconhecido. No entanto, já foi demonstrado o neurotropismo de
cepas africanas e asiáticas do CHIKV em camundongos, por meio de lesões cerebrais
encontradas (GRIFFIN, 2005). Microevolução genômica; distúrbios imunológicos e as
interações vírus-hospedeiro de uma maneira global podem ser fatores influentes na
neurovirulência do vírus Chikungunya (SCHUFFENECKER et al., 2006).
As manifestações mucocutâneas podem ocorrer em 40-50% dos casos
(SIMON et al., 2007; STAIKOWSKY et al., 2009). Os locais em que as lesões
normalmente aparecem são os membros (superiores e inferiores), seguido do rosto e
tronco (BANDYOPADHYAY; GHOSH, 2010). Em crianças o curso clínico surge dois
a quatro dias após o início da febre, com o aparecimento de lesões vesiculo-bolhosas
semelhantes às da síndrome da pele escaldada estafilocócica (SSSS) ou eritema
multiforme (ROBIN et al., 2010). A patogênese do envolvimento da pele nas infecções
causadas pelo CHIKV gerando bolhas não hemorrágicas e com o conteúdo rico em
partículas virais, ainda permanece desconhecido, contudo presume-se que as
propriedades físicas da pele das crianças/recém-nascidos sejam predispostas ao
aparecimento de bolhas (COUDERC et al., 2008; ROBIN et al., 2010).
30
1.6 Diagnóstico
O diagnóstico da febre Chikungunya é feito com base na clínica, epidemiologia,
dados laboratoriais (figura 5) que visam excluir outras doenças com aspectos clínicos
semelhantes, tais como a dengue ou doenças causadas por outros Alphavirus;
doenças artríticas e endêmicas como a malária, leptospirose, febre reumática e artrite
séptica (BURT et al., 2012).
Para que o diagnóstico laboratorial seja realizado é necessário um
conhecimento prévio da cinética da viremia do CHIKV e o momento certo da coleta da
amostra (BURT et al., 2012). Métodos como isolamento viral; detecção do RNA viral
por Transcriptase Reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase
convencional (RT-PCR) ou em tempo real (qRT-PCR) e sorologia são realizados para
detectar infecção pelo CHIKV (JOHNSON; RUSSELL; GOODMAN, 2017).
Durante a fase aguda o diagnóstico é dado por meio da coleta do soro do
paciente para detecção do ácido nucleico viral pelas técnicas RT-PCR ou de qRT-
PCR ou isolamento viral, visto que corresponde ao período de viremia (LANCIOTTI et
Figura 5 - Critérios diagnósticos da febre Chikungunya. Fonte: Adaptado de BURT et. al., 2012
31
al., 2007). Já a busca por anticorpos no soro só é detectável entre os dias 5-7 após o
início dos sintomas (JOHNSON; RUSSELL; GOODMAN, 2017). Após o sexto dia de
doença, as amostras com resultado negativo para qRT-PCR são submetidas ao
Ensaio de Imunoabsorção Enzimática de Captura de Anticorpo IgM (MAC-ELISA)
(MARTIN et al., 2004, 2000).
Outros achados laboratoriais inespecíficos podem ser encontrados durante a
fase aguda, tais como a leucopenia (diminuição do número de leucócitos) com
linfopenia menor que 1000 células/mm³ e trombocitopenia (diminuição do número de
plaquetas) discreta, inferior a 100.000 células/mm³ em decorrência da supressão
medular discreta e transitória; a velocidade de hemossedimentação (VHS), proteína
C reativa (PCR) e a creatinofosfoquinase (CPK) encontram-se elevadas,
principalmente, porque as duas últimas são marcadores inflamatórios de fase aguda;
além da discreta elevação de enzimas hepáticas e creatinina, podendo indicar
complicações atípicas ou acompanhamento da toxicidade do tratamento de pacientes
submetidos aos fármacos (MARQUES et al., 2017; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
O correto diagnóstico da febre Chikungunya é de suma importância,
principalmente porque em nosso país há circulação simultânea de outros vírus com
manifestações clínicas semelhantes e transmitidas pelo mesmo vetor, tais como os
vírus zika e dengue, tronando difícil o diagnóstico clínico diferencial sendo necessários
exames laboratoriais.
1.7 Tratamento e Perspectivas
Não existe um tratamento específico para infecção do CHIKV, sendo
recomendados os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) para diminuir as dores
nas articulações (BRIOLANT et al., 2004; MOHSIN et al., 2010). A terapia utilizada é
basicamente de suporte sintomático, hidratação e repouso (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2015).
Tratamentos não farmacológicos também devem ser associados aos
medicamentos. Pode-se realizar compressas geladas; fisioterapia em todas as fases
32
da doença; e sessões de acupuntura durante as fases subaguda e crônica (DE BRITO
et al., 2016).
Atualmente não há vacinas disponíveis para CHIKV. Grandes esforços estão
sendo aplicados para o desenvolvimento da vacina para o CHIKV por meio do uso de
tecnologias incluindo vacinas virais inativadas (ECKELS; HARRISON; HETRICK,
1970), vírus atenuados, quimeras(WANG et al., 2008), vacinas virais recombinantes,
vacinas de partículas semelhantes a vírus (VLP) (AKAHATA et al., 2004). No entanto,
ainda são necessários mais estudos para a obtenção de uma vacina.
1.8 Aspectos Epidemiológicos
Mundialmente o vírus Chikungunya está presente onde há circulação dos
vetores responsáveis pela sua transmissão, ou seja, nas regiões tropicais e
subtropicais, cujo o clima é favorável para manutenção dos mosquitos do gênero
Aedes (LOPES; NOZAWA; LINHARES, 2014; YACTAYO et al., 2016). A infecção se
espalhou drasticamente, principalmente, devido a movimentação de viajantes que
visitam áreas endêmicas que “trazem” para aqueles países onde o vírus não é
prevalente (WEAVER, 2014).
A introdução do vírus nas Américas foi relatada em 2013 (OPAS, 2013), e em
2015 já haviam sido descritos casos autóctones na Bolívia, Colômbia, Equador,
Paraguai, Venezuela e Brasil (OPAS, 2015).
No Brasil o primeiro caso de transmissão autóctone foi relatado em setembro
de 2014 no Estado do Amapá, cujo genótipo do vírus isolado foi o Asiático. No mesmo
mês, ocorreu um novo surto em Feira de Santana – Bahia, causado por outro genótipo,
o Leste-Centro-Sul Africano (NUNES et al., 2015; RODRIGUES et. al., 2016).
Até a 35ª semana epidemiológica, do ano de 2017, a região Nordeste
apresentou o maior número de casos prováveis (76,1%) da febre chikungunya (SVS,
2017). De acordo com os dados divulgados no boletim epidemiológico com relação as
arboviroses no Estado do Rio Grande do Norte (RN) foram notificados 1294 casos
33
suspeitos, e confirmados 161 casos de infecção pelo vírus Chikungunya (SESAP-RN,
2017).
1.9 Aspectos filogenéticos e moleculares
O CHIKV possui apena um sorotipo no qual é capaz de conferir imunidade ao
indivíduo que foi acometido. Inicialmente a análise filogenética distinguia o vírus
CHIKV em três genótipos:(LO PRESTI et al., 2016) o Oeste Africano; o Leste-Centro-
Sul Africano (ECSA) e o asiático (POWERS et al., 2000). No entanto, a cepa ECSA
deu origem à linhagem do Oceano índico (IOL), responsáveis por epidemias nas Ilhas
do Oceano Índico, índia Ocidental e Europa nos anos de 2004-2005. A expansão
desse último genótipo foi atribuída a mutações adaptativas nos genes das
glicoproteínas E1 e E2 do envelope do vírus, permitindo a adaptação do vírus no
Aedes albopictus (VOLK et. al., 2010).
Desta forma, atualmente,estudos filogenéticos realizados a partir da análise
das sequencias parciais do gene E1 da glicoproteína do envelope, atribuem quatro
linhagens distintas ao vírus. Pelo fato de se terem utilizado sequencias parciais,
análises mais sólidas sobre as relações entre as cepas ou até mesmo detalhes sobre
a dinâmica evolutiva viral ainda são um desafio (ABUBAKAR; SAM, 2007; PAROLA
et al., 2006; SAHADEO et al., 2015; SCHUFFENECKER et al., 2006).
Algumas mutações no gene da proteína do envelope aumentaram a gravidade
e a rapidez de propagação (SCHUFFENECKER et al., 2006) da epidemia em países,
cujo principal vetor é o Aedes albopictus e o genótipo do Oceano Índico circulante.
Eles estão associadas com a substituição do aminoácido Alanina (E1-226A) na
posição 226 na glicoproteína E1, pela valina (E1-226V) (THIBOUTOT et al., 2010;
VAZEILLE et al., 2007).Interessantemente a mutação na proteína E1-226V nunca foi
detectada na linhagem Asiática. Esse fenômeno pode ser explicado pelo fato dessa
cepa apresentar uma restrição epistática por meio da substituição do aminoácido
Treonina por Alanina na posição 98 (E1-T98A) (WEAVER et.al., 2015).
O sequenciamento parcial da proteína não estrutural nsP2 e das proteínas E1
e E2 do envelope realizados por Niyas et.al. (2010) identificou uma substituição na
posição 210 de uma leucina por uma glutamina (E2-L210Q) na região de codificação
da proteína E2 em cepas do CHIKV causadora do surto de 2009. Essa substituição
34
de cadeias laterais polares, pode afetar a estrutura conformacional da proteína
(NIYAS et al., 2010).
Taraphdar et. al. (2014) em um de seus estudos, observou a presença de uma
mutação no gene da proteína E3 em cepas isoladas da Índia, na qual havia uma
substituição na posição 303 de uma valina por uma isoleucina (E3-V303I). Como essa
mutação não foi relatada na literatura anteriormente, não se pode averiguar qual a
consequência gerada por essa substituição.
A literatura propõe novas mutações como as substituições de: uma leucina por
uma glutamina na posição 210 (E2-L210Q); uma isoleucina por uma treonina na
posição 211 (E2-I211T) e na posição 60 de uma glicina por um aspartato (E2-G60D)
na região que codifica a glicoproteína E2 do envelope do vírus da cepa IOL, nas quais
podem ser sugestivas de vantagens na transmissibilidade pelo Aedes albopictus
(NIYAS et al., 2010; NJENGA et al., 2008; TSETSARKIN et al., 2007); enquanto que
mutações como as que resultam na substituição de uma lisina por um glutamato na
posição 211 (E1-K211E) no gene da glicoproteína E1 do envelope, conservada no
genótipo asiático; e na posição 264 que implica na substituição do aminoácido valina
por uma alanina (E2-V264A) na glicoproteína E2 do envelope, foram relatadas como
importantes na modulação, infectividade e transmissibilidade pelo Aedes aegypti em
um surto epidêmico ocorrido na Índia(AGARWAL et al., 2016; SUMATHY et. al, 2012)
(figura 6).
No Brasil foram realizados alguns estudos filogenéticos, os quais revelaram que
o genótipo ECSA foi a linhagem causadora do surto ocorrido em Alagoas. Esse
mesmo genótipo foi o encontrado circulando na Bahia (Feira de Santana e Salvador)
e no Rio de Janeiro (SARDI et al., 2016; SOUZA et al., 2017). No estudo descrito por
Souza et. al. (2017) realizado no Rio de Janeiro com amostras positivas para CHIKV
identificou duas substituições de aminoácidos: uma na posição 211 de uma lisina (K)
por uma Treonina (T) (K211T); e a outra na posição 156 de uma valina (V) por uma
Alanina (A) (V156A). Curiosamente a mutação E1-A226V não foi detectada nas cepas
circulantes no Brasil (COSTA et al., 2017).
35
Tabela 1 - Mutações encontradas nos genes codificadores da poliproteína estrutural do CHIKV reportadas na literatura. As posições registradas levam em consideração o alinhamento da proteína individual.
Mutação Proteína afetada Efeito da mutação
E1-V226A E1 Aumento da gravidade e da rapidez de
propagação pelo Aedes albopictus
E1-T98A E1 Restrição epistática à adaptação ao
Aedes albopictus em cepas asiáticas
E1-K211T E1 Desconhecido
E1-V156A E1 Desconhecido
E1-K211E E1 Modulação, infectividade e
transmissibilidade pelo Aedes aegypti E2-V264A E2
E2-I211T E2 Vantagem na transmissibilidade pelo
Aedes albopictus em cepas IOL E2-G60D E2
E3-V303I E3 Desconhecido
Figura 6 - Esquema representativo das mutações já reportadas na literatura. A numeração em vermelho representa as posições das mutações referentes a região codificadora do gene da poliproteína estrutural do CHIKV. Fonte: Autoria própria.
36
1.10 Controle
A forma mais eficiente consiste no controle vetorial, isso acontece, pois, ainda
não existem vacinas eficazes disponíveis (LOPES; NOZAWA; LINHARES, 2014).
Muito embora existam abordagens tradicionais para combate ao vetor(GÓMEZ-
DANTÉS; WILLOQUET, 2009), a forma de prevenção mais eficiente ainda consiste
na eliminação dos criadouros, como por exemplo na vedação de depósitos para
armazenamento de água; armazenamento correto de pneus e outros resíduos sólidos;
limpeza dos vasos de plantas, dentre outras medidas (COELHO, 2012).
Infelizmente, o combate ao vetor é muito difícil, uma vez que trata-se de um
problema multifatorial, cuja solução depende de ações conjuntas de diferentes esferas
da sociedade (TAUIL, 2002). Desta forma, são necessárias ações de educação e
conscientização da população; além da criação de programas governamentais para
vencermos essa luta contra os mosquitos transmissores das arboviroses (GÓMEZ-
DANTÉS; WILLOQUET, 2009).
37
2. JUSTIFICATIVA
Na última década a febre Chikungunya recebeu atenção particular devido à
extensão e gravidade dos surtos epidêmicos, em decorrência de sua introdução nas
Américas (YACTAYO et al., 2016). Com a introdução do vírus no Brasil, onde a doença
tem se apresentado com característica clínica diferenciada, como maior gravidade,
com vários casos de óbitos, especialmente a região Nordeste, incluindo Estado do Rio
Grande do Norte, onde foi observado o segundo maior número de óbitos.
A entrada do vírus no país a partir de casos importados gerou uma
disseminação do vírus causando um surto epidêmico que se espalhou rapidamente
por todas as regiões do país, devido as condições ambientais favoráveis; a presença
de vetores competentes e virtualmente toda a população susceptível a doença (OPS
& CDC, 2010). Durante esse surto foram relatados casos típicos e atípicos da doença.
Diante disso se faz necessário a realização de estudos para uma melhor compreensão
da doença no nosso meio, afim de contribuir para a definição de políticas públicas
votadas para a sua prevenção.
Neste sentido o presente estudo visa caracterização genética do vírus
chikungunya, identificando as variações significativas da sequência do vírus, como
uma forma acrescentar conhecimentos sobre esse patógeno que possam contribuir
para tentar explicar possíveis motivos para os casos atípicos detectados nos
pacientes da nossa região; além de realizar uma avaliação correta sobre o impacto da
epidemia no estado do Rio Grande do Norte.
38
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
Caracterizar geneticamente o vírus Chikungunya circulante no Estado do Rio
Grande do Norte no período de 2016-2017.
3.2 Objetivos específicos:
Realizar a análise filogenética dos CHIKV identificados no Rio Grande
do Norte;
Identificar o genótipo do CHIKV circulante no Rio Grande do Norte;
Propor uma nova classificação para as diferentes linhagens de CHIKV;
Investigar a variabilidade genética do CHIKV no RN e comparar com
CHIKV ancestral e outras linhagens circulantes no Brasil;
Investigar possíveis marcadores genéticos de neurovirulência;
Investigar possíveis consequências conformacionais nas proteínas E2 e
E3 (peptídeo) provocadas pelas mutações encontradas nos vírus isolado por meio da
modelagem proteica.
39
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Tipo de estudo
O presente estudo é do tipo observacional transversal, predominantemente
descritivo, de dados primários.
4.2 Local de estudo
Este estudo foi realizado no Estado do Rio Grande do Norte, localizado na
região Nordeste do Brasil, limitando-se com o Estado do Ceará ao Norte e Oeste e ao
Sul com o Estado da Paraíba e ao Leste com o Oceano Atlântico, situando-se em uma
posição geográfica estratégica, pois é o Estado brasileiro que está mais próximo dos
continentes africano e europeu, possuindo área estimada de 52.811,047
km²(SEPLAN, 2014).
Por estar situado próximo à linha do Equador, as características climáticas
são bem específicas, como o verão seco e a presença de sol a maior parte do ano
(SEPLAN, 2014). O Estado apresenta 167 municípios, agrupados em quatro
mesorregiões: Oeste Potiguar; Central Potiguar; Agreste Potiguar e Leste Potiguar,
que foram divididas de acordo com suas semelhanças com relação aos aspectos
físicos e humanos (RIO GRANDE DO NORTE, 2013).
Embora houvessem amostras provenientes de parte do Estado, foram os
municípios de Ceará-Mirim; Florânia; Natal; Pureza e Senador Elói de Souza (figura
6) que tiveram amostras selecionadas, durante os anos de 2016-2017, para serem
submetidas ao sequenciamento.
40
Figura 7 - Localização do Estado do Rio Grande do Norte. Em destaque os municípios que tiveram as amostras selecionadas para o sequenciamento. Fonte: Autoria própria
4.3 População de estudo, espécimes clínicos e fonte de dados
Foram incluídas no estudo amostras de soro, líquor (LCR) e conteúdo de
lesões vesiculo-bolhosas (n=10) de nove casos suspeitos de Chikungunya, coletadas
com até sete dias após o início dos sintomas, visto que os pacientes ainda estavam
em fase aguda da doença. As amostras foram provenientes de pacientes residentes
de diversos municípios atendidos de diferentes centros de saúde e hospitais da rede
pública ou privada do RN, com suspeita de casos típicos ou atípicos de febre
Chikungunya. Alíquotas dessas amostras, juntamente com a ficha de notificação
compulsória (na qual contém a identificação do paciente, bem como informações
sobre o início da doença) foram enviadas para o Laboratório de Biologia Molecular de
Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC – DMP – CB – UFRN). Os espécimes
clínicos foram armazenados em freezer -70°C até o momento do processamento para
análise molecular. Todos os procedimentos realizados neste estudo passaram pela
aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte – CAAE: 51057015.5.0000.5537.
41
4.4 Diagnóstico molecular do vírus CHIKV
4.4.1 Extração do RNA total
Foram incluídas neste estudo amostras de materiais diversos (soro, líquor e líquido
de vesículas bolhosas) obtidos de 9 pacientes de diferentes regiões do Estado do RN,
com suspeita clínica de febre chikungunya em fase aguda da infecção. Todos esses
foram processados para extração e purificação de RNA, utilizado o kit comercial
QIAMP Viral Mini Kit (QIAGEN, Inc., Valencia, EUA), de acordo com as
recomendações do fabricante, para posterior realização da Transcriptase Reversa
seguida de Reação em Cadeira da Polimerase em tempo real (qRT-PCR).
O procedimento consiste em quatro etapas: lise celular, ligação do RNA a uma
coluna de sílica, lavagem e eluição do RNA. Resumidamente, na primeira etapa 140µL
das amostras foram incubados com o tampão de lise AVL e 5,6µL de RNA
transportador (carrier), durante 10 minutos, a fim de proporcionar o rompimento celular
para a liberação dos ácidos nucleicos. Foi adicionado etanol absoluto P.A e,
posteriormente, as amostras foram aplicadas em uma coluna contendo uma
membrana de sílica, na qual favorecereu a ligação seletiva do ácido nucleico viral à
essa membrana. A terceira etapa consiste em centrifugações e lavagens com
tampões AW1 e AW2, cuja finalidade é retirar impurezas residuais, tais como resíduos
de proteínas e sais, respectivamente. Por fim, a última etapa consiste na eluição, ou
seja, na liberação do RNA viral da membrana de sílica, por meio da adição de 60µL
do tampão AVE, com posterior centrifugação. Após extração os RNAs foram
estocados em freezer -70°C para posterior utilização.
4.4.2 Transcriptase Reversa Seguida da Reação em Cadeia da Polimerase
em Tempo Real (qRT-PCR)
Para o diagnóstico molecular do CHIKV foi utilizado o protocolo descrito por
Lanciotti et. al. (2007). Para a técnica é necessária uma sonda VCHIK 6919P (Applied
42
Biosystems™) marcada com fluorescência, um primer iniciador direto VCHIKV 6856F
e um inverso VCHIK6981R (Invitrogen) e a sequência-alvo (tabela 1)
Tabela 2 - Sequência da sonda e dos primers iniciadores utilizados na qRT-PCR para detecção do vírus Chikungunya
Oligonucleotídeo
iniciador
Sentido da sequência
(5’→3’)
Posição no
genoma
Sonda VCHIK 6919P AGGTACGCGCTTCAAGTTCGGCG 6919–6941
Primer VCHIK 6856F TCACTCCCTGTTGGACTTGATAGA 6856–6879
Primer VCHIK 6981R TTGACGAACAGAGTTAGGAACATACC 6981–6956
Fonte: Lanciotti et. al., 2007
Além dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) faz-se necessário o uso do
sistema TaqMan FAST Vírus 1 Step Master Mix (Applied Biosystems), para hibridizar
em sequências específicas do material genético que será amplificado na PCR. O
volume final é obtido com água livre de nucleases (ddH2O) (IDT, lowa, USA) (tabela
3).
43
Tabela 3 - Reagentes utilizados na qRT-PCR para detecção do CHIKV
Reagentes Mistura para qRT-PCR
(volume para uma reação)
TaqMan FAST Vírus 1 Step Master Mix 2,5 µL
Sonda VCHIK 6919P 0,4 µL
Primer VCHIK 6856F 0,4 µL
Primer VCHIK 6981R 0,4 µL
ddH2O 11,3 µL
RNA 5 µL
Fonte: Adaptado Lanciotti et. al., 2007
Em síntese, os reagentes citados acima são distribuídos em uma placa de 96
poços, resultando em um volume final de 15 µL da mistura, com posterior acréscimo
de 5 µL do RNA extraído previamente no poço. Para a realização do experimento foi
utilizado o equipamento ABI Prism 7500 Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA).
As condições de termociclagem estão apresentadas na tabela 4.
Tabela 4 - Condições de termociclagem para reação de RT-PCR em tempo real
Condição Temperatura Tempo Ciclos
Ativação da enzima 95°C 20 seg 1 ciclo
RT
95°C 3 seg
40 ciclos Desnaturação
Anelamento/extensão 60°C 30 seg
Fonte: Adaptado de Lanciotti et. al., 2007
44
4.5 Caracterização Molecular
4.5.1 Sequenciamento do gene da poliproteína estrutural do CHIKV
Para realizar a caracterização molecular do vírus Chikungunya sequenciou-se
80% do gene da poliproteína estrutural, região informativa para o estudo de filogenia,
visto que nela há a existência da proteína do envelope. Pela impossibilidade de o
fragmento ser sequenciado em uma única reação, os iniciadores foram desenhados a
partir da estratégia de primer walking, nos quais foram capazes de amplificar cerca de
700pb por região, sendo 300pb de sobreposição entre as regiões. O sequenciador
utilizado foi o Applied Biosystems ABI 3500 - Hitachi (Applied Biosystems, Foster City,
CA) disponível no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG), localizado
no Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – RN.
4.5.1.1 Oligonucleotídeos iniciadores
Os oligonucleotídeos iniciadores para CHIKV foram desenhados a partir da
estratégia de primer walking. Para isso, foram coletadas no GenBank a sequência
referência para o CHIKV (acesso: KP164569.1) e sequências de diferentes locais,
para que fossem alinhadas utilizando o software Mega versão 7.0
(http://www.megasoftware.net/).
Após alinhamento, os iniciadores foram desenhados manualmente seguindo
critérios que levavam em consideração o número de nucleotídeos (entre 18 e 22
nucleotídeos); a quantidade de Guanina (G) e citosina (C) entre 45-50%; temperatura
de melting (Tm) entre 55-65°C; verificação para a formação de hairpins (grampos),
por meio do servidor da web RNAfold; e averiguação da formação de dímeros, através
do software autodimer (National Institute of Standards and Technology, USA).
45
4.5.1.2 Teste de gradiente de temperatura dos primers
A fim de testar a melhor temperatura de anelamento dos primers, na prática, foi
necessário realizar o teste de gradiente de temperatura. Para isso, foram realizadas
oito reações utilizando os iniciadores anteriormente desenhados.
Para amplificar as reações o equipamento utilizado foi o Eppendorf®
Mastercycle modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER), cujos parâmetros foram
ajustados nas configurações do próprio termociclador, para que houvesse uma
temperatura de hibridização de 55°C e um gradiente de oito temperaturas distintas.
Foram testadas as temperaturas no gradiente de 51,3 °C; 53,4 °C; 55,6 °C; 57,8 °C;
59,8 °C; 61,6 °C; 62,8 °C e 63,5 °C.A fim de visualizar o resultado da melhor
temperatura, foi feita uma eletroforese em gel de agarose a 1%.
4.5.1.3 Reação de síntese de DNA complementar (cDNA)
A fim de promover uma maior estabilidade e economia das amostras, foi
realizada a síntese de cDNA a partir do RNA viral extraído, a partir de uma reação
enzimática pela transcriptase reversa, utilizando o High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kits (Applied Biosystems), seguindo as recomendações do fabricante.
Na reação de síntese de cDNA foram utilizados 10µL de RNA viral extraído
previamente. Cada tubo da reação continha 2,0µL de 10X RT Buffer; 0,8µL de 25X
dNTPs; 2,0µL de 10X RT Randon Primers; 1,0µL da enzima MultiScribe Reverse
Transcriptase; 4,2µL de água livre de nucleases. O volume final da reação foi de 20
µL (tabela 4), seguindo os padrões de termociclagem descritos na tabela 5.
46
Tabela 5 - Reagentes utilizados para a reação de síntese de cDNA.
Reagentes Mistura para síntese de cDNA
(volume para uma reação)
10X RT Buffer 2,0 µL
25X dNTPs Mix (100Mn) 0,8 µL
10X RT Randon Primers 2,0 µL
MultiScribe™ Reverse Transcriptase 1,0 µL
Água livre de nucleases 4,2 µL
RNA 10 µL
Fonte: Applied Biosystems
Tabela 6 - Padrões de termociclagem para a síntese de cDNA
Configurações Step 1 Step 2 Step 3 Step 4
Temperatura 25°C 37°C 85°C 22°C
Tempo 10 min 120 min 5 min ∞
Fonte: Applied Biosystems
Após sintetizado, o cDNA foi estocado a -20°C para uso nas próximas reações.
4.5.1.4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para sequenciamento
Para sequenciar a região de interesse, foi necessário realizar uma PCR para
sequenciamento. Para isso utilizou-se 5µL do cDNA sintetizado; 5µL dos primers
específicos (foward e reverse) na concentração de 10µM; 25µL de PCR Master Mix
2X (Promega Co., Madison, WI); e 10µL de água livre de nucleases (tabela 6). Foi
realizada em tubos separados a reação referente às regiões individuais.
47
Tabela 7 - Reagentes utilizados na PCR para sequenciamento
Reagentes Concentração 1X Temperatura
PCR Master Mix 1X 25µL
61,6°C
Primer foward 10uM 5µL
Primer reverse 10uM 5µL
Água livre de nucleases - 5µL
cDNA - 10µL
A amplificação foi realizada utilizando o termociclador Eppendorf® Mastercycle
modelo 22331 (Eppendorf AG, Hamburg, GER), seguindo os parâmetros de
termociclagem já padronizados no LADIC (tabela 8).
Tabela 8 - Parâmetros de termociclagem da PCR para sequenciamento
Condição Temperatura Tempo Ciclos
Desnaturação 94°C 35 seg
30 ciclos Hibridização 61,6 °C 1 min
Extensão 72°C 2 min
Extensão final 72°C 10 min 1 ciclo
Temperatura Final 22°C ∞ -
Finalizada a PCR, os produtos amplificados foram analisados por meio de uma
eletroforese em gel de agarose (BioAmerica Inc., Miami, USA) a 1% em TBE 0,5X.
48
4.5.1.5 Eletroforese em gel de agarose
Finalizada a PCR foi realizada a eletroforese em cuba horizontal a 100V
durante 60 minutos, para visualização e análise dos produtos amplificados. Para essa
etapa, foi utilizado 5µL do produto amplificado durante a PCR; misturados a 2,5 µL de
azul de bromofenol (Promega, Madison, WI, USA) e 2,5 µL de Gel Red® (Biotium).
Essa mistura foi aplicada em gel de agarose a 1% (BioAmerica, Inc., Miami, USA) em
TRIS-Ácido Bórico-EDTA 0,5X (Promega, Madison, USA), e por fim, revelado em luz
ultravioleta.
Havendo a presença de bandas inespecíficas nos amplicons, o produto foi
isolado e purificado utilizando o kit comercial Gel Extraction (Qiagen, Inc., Valencia,
CA), realizadas no LADIC, nas quais após purificação, foram enviadas para o
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (LBMG)/UFRN. Já quando observados
amplicons únicos na eletroforese em gel de agarose foi realizada a purificação
diretamente do produto da PCR usando o kit comercial Exosap (Applied Biosystems),
realizadas no LBMG/UFRN. Ambos foram realizados seguindo as recomendações do
fabricante.
4.5.1.6 Purificação do Produto de PCR para Sequenciamento por Extração
de Gel de Agarose
Aquelas amostras que apresentaram amplicons múltiplos, ou seja, constatou-
se o aparecimento de bandas inespecíficas, foram submetidas ao processo de
purificaçãodo produto de PCR por extração de gel de agarose, por meio do kit
comercial Gel Extraction (Qiagen, Inc., Valencia, CA), seguindo as instruções
recomendadas pelo fabricante.
Para esse procedimento foi feita uma eletroforese em gel de agarose a 0,7%,
utilizando todo o produto amplificado durante a PCR, misturados a 5µL de Gel Red®
e 5µL de azul de bromofenol (BioAmerica, Inc., Miami, USA). Após análise em
ultravioleta, os amplicons de interesse foram cortados diretamente do gel, com o
auxílio de lâminas de bisturi estéreis; e transferidos para tubos de 1,5 mL de fundo
cônico para seguir o procedimento de purificação com o kit comercial.
49
Em cada tubo, para cada 100mg do fragmento foram adicionados 300µL de
Buffer QG, a fim de solubilizar o gel de agarose que foi cortado. Posteriormente, os
tubos foram incubados no termobloco (50ºC) por 10 minutos, sendo homogeneizados
no decorrer do tempo. Com o gel completamente dissolvido, foram adicionados 100µL
de isopropanol à amostra, na qual foi seguidamente transferida para uma coluna
fornecida pelo kit. Após centrifugação, o filtrado foi desprezado e forma adicionados
500µL do Buffer QG à coluna, com posterior centrifugação (13.000rpm por 1 minuto).
Em seguida, o filtrado foi desprezado e foram adicionados 750µL de Buffer PE, com
o objetivo de retirar impurezas indesejadas, tais como sais, corantes, dentre outros
resíduos;logo em seguida foi feita uma nova centrifugação. O filtrado foi desprezado
e a amostra foi incubada, à temperatura ambiente, por três minutos. Findo o tempo,
foram feitas mais duas centrifugações. Por fim, a coluna foi encaixada em um tubo de
1,5mL de fundo cônico (eppendorf ®), com posterior adição de 30µL de água livre de
nucleases, seguida de uma centrifugação. O DNA foi estocado a -20°C para posterior
utilização.
4.5.1.7 Purificação diretamente do produto da PCR
Quando foram detectados amplicons únicos, ou seja, o aparecimento de
bandas específicas desejadas, as amostras foram enviadas diretamente para o
LBMG/UFRN, nas quais foram purificadas pelo kit comercial ExoSAP-IT™ PCR
Product Cleanup(Applied Biosystems), seguindo as orientações discriminadas pelo
fabricante.
Para este protocolo foram misturados 5µL do produto de PCR com 2µL do
reagente ExoSAP-IT™. Essa amostra foi incubada por 37°C durante 30 minutos, a fim
de que houvessem a degradação dos primers e nucleotídeos excedentes.
Posteriormente, foi feita outra incubação a 80°C por 15 minutos, a fim de inativar a
enzima ExoSAP-IT. Desta forma as amostras foram submetidas à quantificação de
DNA.
50
4.5.1.8 Quantificação de DNA
Com o objetivo de quantificar o DNA presente em cada amostra, foi utilizando
o aparelho Qubit ® na versão 2.0Fluorometer Quantitation (Invitrogen, Eugene, EUA),
no qual o equipamento detecta a fluorescência gerada por um fluoróforo específico
para DNA, que se liga à dupla fita, que é convertido em quantificação de DNA.
O ensaio tem um volume final de 200µL, provenientes da mistura entre o
tampão, o fluoróforo e a amostra. Posteriormente, os tubos são incubados à
temperatura ambiente durante dois minutos, com consecutivo padrão de leitura no
equipamento Qubit® 2.0 (Invitrogen).
Logo em seguida as amostras quantificadas foram submetidas à nova
purificação utilizando o kit ExoSAP-IT™ descrito anteriormente.
4.5.1.9 Reação de Sequenciamento
Os fragmentos anteriormente quantificados e purificados foram submetidos à
reação de sequenciamento (cycle sequencing), que tem como fundamento o uso de
dideoxinucleotídeos (ddNTPs), que se incorporou à cadeira do material genético,
bloqueando a síntese da cadeia pela DNA polimerase. Os fragmentos foram
sequenciados em ambos os sentidos utilizando o kit Big Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Foster City, CA), versão 3.1.
Nesse ensaio foi feita uma mistura entre 2µL de primer específico (sense ou
antisense); 2µL de Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready;1,5µL de 5X
Sequencing Buffer; quantidade de DNA deliberada pela quantificação (em µL); e para
completar o volume final de 10µL, foi adicionado água livre de nucleases. Os
parâmetros de termociclagem estão estimados na tabela 9.
51
Tabela 9 - Parâmetros de termociclagem para a reação de sequenciamento (Cycle Sequencing)
Condição Temperatura Tempo Ciclos
Ativação da enzima 96°C 1 min 1 ciclo
Desnaturação 96°C 15 min
35 ciclos Hibridização 50 °C 15 min
Extensão 60°C 4 min
Temperatura Final 4°C ∞ -
4.5.1.10 Purificação e Precipitação de DNA para remoção de Dye Terminators
O produto da reação de sequenciamento foi purificado com o Big Dye®
XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems) seguindo o protocolo sugerido
pelo fabricante, mantendo as amostras na ausência de luminosidade.
Inicialmente é feito um mix contendo as soluções SAM Solution e Big Dye
XTerminators Solution, os quais foram aplicados em uma placa de 96 poços
juntamente com a amostra proveniente da reação de sequenciamento. A placa foi
incubada, à temperatura ambiente, por 30 minutos sob agitação; e por fim, colocada
no sequenciador automático Applied Biosystems ABI-3500 (Applied
Biosystems/Hitachi, Foster City, CA).
4.5.1.11 Análise de Sequências
Os resultados do sequenciamento foram analisados no programa Chromas
versão 2.6.4 (Technelysium Pty Ltd.) e editadas manualmente por meio de
alinhamentos múltiplos feitos no software Jalview (Waterhouse et. al., 2009); MEGA
versão 7.0 (http://www.megasoftware.net/) e Clustal W2 (Thompson et.al., 1997) com
sequências referências coletadas no NCBI. As sequências referentes as amostras
desse estudo serão submetidas ao Genbank antes da submissão do artigo.
52
Foram coletadas do GenBank sequências completas do gene da poliproteína
estrutural do CHIKV, com o objetivo de estabelecer relações filogenéticas entre os
vírus circulante no RN com aqueles de diferentes localidades. Cada sequência foi
nomeada de forma padrão, nas quais continham o local de isolamento (utilizando a
sigla internacional de duas letras dos países, e nos casos de sequências brasileiras,
foram adicionadas as siglas referentes aos Estados); número de acesso no GenBank
e ano de isolamento. Amostras que não apresentavam os critérios de inclusão citados
anteriormente; que eram sequenciadas parcialmente ou que eram clones foram
excluídas da coleta.
As árvores filogenéticas foram construídas utilizando o método de Neighbor-
Joining e de máxima verossimilhança (likelihood), modelo Tamura-Nei + Gama, com
auxílio do software MEGA versão 6.0 (http://www.megasoftware.net/).
4.6 Modelagem de proteínas
Primeiramente, para fazer a modelagem proteica foi feito um blastp com a
sequência de estrutura desconhecida (1417L e 1417S) em conjunto com a base de
dados do Protein Data Bank Proteins (PDB), com a finalidade de identificar os moldes
(templates) para a modelagem da proteína-alvo. Os templates selecionados foram
aquelas que possuíram melhor score e identidade (aproximadamente 40% de
cobertura e >95% de identidade). Os únicos moldes encontrados foram para as
proteínas E2 e E3 do CHIKV.
Foi realizado um alinhamento entre a sequência-alvo (1417) e a sequência-
molde no ClustalW (THOMPSON et.al., 1997), no qual foi observado um padrão de
identidade/similaridade. Posteriormente, o alinhamento foi importado para o software
Chimera 1.12 (PETTERSEN et.al., 2004) para que fosse feita a modelagem por
homologia (Modeller), utilizando os templates 3N40 e 3N41, por apresentarem os
maiores números de aminoácidos. Dentre os cinco modelos gerados, àqueles de
menor score foram os escolhidos, ou seja, os que possuíam a Discrete Optimized
Protein Energy (zDOPE) menor, uma vez que seriam os modelos mais estáveis,
havendo pouca estabilidade conformacional.
53
Em seguida os domínios E2 e E3 foram definidos, através da atribuição de
cores: azul para E2 e magenta para E3. Enquanto que as posições com substituição
de aminoácidos encontradas nessas regiões foram identificadas em vermelho. As
regiões que não puderam ser modeladas (Capsídeo; proteínas 6k e E1) foram
representadas em um modelo ilustrativo de sequências biológicas (IBS) (LIU et.al.,
2015).
Para a análise da variabilidade e polimorfismos foram feitas e analisadas pelos
softwares Geneious (DRUMMOND et.al., 2010) e DNA Sequence Polymorphism
(DNASP) 6.1 (ROZAS et.al., 2003), respectivamente.
54
5. RESULTADOS
5.1 Achados Clínicos
Dentre as manifestações clínicas relatadas pelos pacientes em fase aguda da
infecção, foi possível observar a presença de sintomas típicos e atípicos em pacientes
de idades distintas. A obtenção desses dados foi mediante a análise das fichas de
notificação, mas infelizmente algumas das fichas não estavam devidamente
preenchidas, prejudicando a descrição dos sintomas.
Todos pacientes selecionados para o presente estudo apresentaram início
repentino da doença, e a maioria deles apresentou sintomas típicos de fase aguda,
tais como febre (7/9 dos casos) e rash cutâneo maculopapular (5/9 casos). Alguns
apresentaram manifestações como dores de cabeça (2/9 casos); rigidez nas
articulações (2/9 casos); aumento de glânglios linfáticos (1/9 casos); conjuntivite (1/9
casos) e prostração (1/9 casos) (tabela 10).
Alguns pacientes desenvolveram formas atípicas da infecção pelo CHIKV,
havendo um paciente, dos nove casos estudados, que apresentou convulsões como
manifestação neurológica. Enquanto que dois pacientes, ambos recém-nascidos,
embora assintomáticos apresentaram lesões vesículo-bolhosas na pele (tabela 10).
Em todos os pacientes foram avaliados outros sintomas que geralmente são
descritos na literatura para a fase aguda da infecção, tais como dor retro-orbital; dor
nas costas; fotofobia; digeusia; vômitos; dores abdominais; aumento do baço; coceira;
leucopenia; icterícia; náusea e astenia. No entanto, nenhum dos casos apresentou
positividade para tais sintomas.
55
Tabela 10 - Achados clínicos importantes dos nove pacientes selecionados para o presente estudo. (+) indica presença do sintoma; (-) ausência do sintoma; e (NI) Não informado
Achados Clínicos Amostras
71 187 199 259 260 332 353 1417 1617
Início repentino + + + + + + + + +
Cefaleia + - - NI NI - - - +
Rigidez nas articulações + - - NI NI - - - +
Aumento das glândulas linfáticas
+ - - NI NI - - - -
Rash cutâneo + - - NI NI + + + -
Erupção terminal - - - NI NI - - - +
Febre + - + + NI + + + -
Comprometimento do SNC - - - NI NI - - + -
Edema + - - NI NI - - - -
Conjuntivite + - - NI NI - - - -
Lesões vesículo-bolhosas - - - + + - - - -
Anorexia + - - NI NI - - - -
Prostração - - - - - - - - +
56
5.2 Desenho de oligonucleotídeos iniciadores
Os primers utilizados para amplificação da região codificadora da poliproteína
estrutural do CHIKV (3746 pb) foram desenhados a partir da estratégia de primer
walking (figura 8) e totalizaram em oito regiões, as quais foram capazes de amplificar
aproximadamente 700 pb por região, sendo 300 pb de sobreposição entre as regiões
(tabela 11).
Figura 8 - Representação ilustrativa da estratégia de primer walking utilizada para desenho dos primers específicos para o gene da poliproteína estrutural do CHIKV. FWD indica os primers sense e os RVS os primers anti-sense.
57
Tabela 11 - Oligonucleotídeos iniciadores para sequenciamento do gene da poliproteína estrutural do CHIKV
Região
Primer sense F Posição do
genoma
(KP164569.1)
Produto
(pb)
Sobreposição
(pb)
Tm
(°C) Primer anti-sense R
1 TTGTGGAGGGTTTATACTGC 7181-7200
686 295 58° GCCCGGCTTCTTTTTCTTTT 7848-7867
2 AGTACATCCCAACCCAAACT 7572-7591
738 353 58°
TCTTTATTCCAGGTCACCAC 8291-8310
3 GGGGGACAAAGTAATGAAAC 7957-7976
689 333 58° TCTAATGCTACGGGACTATG 8627-8646
4 TTGTCACTAAAATCACCCCC 8313-8332
741 269 58°
ATGTGTACCTCTATCTCCTC 9035-9054
5 GGGGCTATTTGTAAGAACAT 8785-8804
618 272 58°
CAGTAGCATGATGACTTGGT 9384-9403
6 GTGCGGTACAAGTGTAATTG 9131-9150
730 300 58°
AAAGGTTGCTGCTCATTCCA 9842-9861
7 CGCAGTTATCTACAAACGGT 9561-9580
669 276 58°
AGTCAGGTAGGTTTTTGTCC 10201-10230
8
TTTTAGCCGTAATGAGCGTC
TTGTCGAAAGGTGTCCAGGC
9954-9973
10500-10518
564 - 58°
58
5.2 Gradiente de Temperatura
Inicialmente foi realizado um teste de gradiente de temperatura para avaliar
qual era a temperatura ótima de anelamento dos primers desenhados para as reações
de sequenciamento. Levou-se em consideração o melhor padrão de amplificação
(intensidade das bandas), analisadas por meio da revelação do gel de eletroforese
(figura 9).
Figura 9 - Teste de gradiente de primers em gel de agarose a 1%, utilizando os primers desenhados para as reações de sequenciamento. PM: Peso molecular 100pb (Promega) e gel contendo teste para a temperatura ótima de 61,6 °C.
Seguindo as instruções para desenho dos primers foi fixada a temperatura de
anelamento (Tm) em 58°C, no entanto, após realização do teste de gradiente, foi
verificado e determinado que a temperatura que melhor favoreceu a amplificação foi
a de 61,6°C.
59
5.3 Análise Filogenética
Com o objetivo de obter a análise filogenética, foram utilizadas dez amostras
consideradas positivas para infecção pelo CHIKV, identificadas durante os anos de
2016 e 2017 no Estado do Rio Grande do Norte (tabela 11), para o sequenciamento
da região do gene que codifica a poliproteína estrutural do vírus.
Tabela 12 - Relação das amostras selecionadas para o estudo da caracterização molecular. A
tabela discrimina o tipo de amostra, origem e ano de coleta.
Amostra
(Identificação - LADIC)
Tipo de amostra Origem Ano
71 Soro Pureza 2016
187R Líquor Natal 2016
199 Soro Natal 2016
259 Líquido de bolha - 2016
260 Líquido de bolha - 2016
332 Soro Florânia 2016
353 Soro Senador Eloi de Souza 2016
1417L Líquor Ceará-Mirim 2017
1417S Soro Ceará-Mirim 2017
1617 Soro - 2017
Foram analisadas um total de 621 sequências, incluindo as amostras
selecionadas para o sequenciamento acrescidas daquelas provenientes do GenBank,
por meio do software Mega 6.0, usando o método de inferência filogenética Neighbor-
Joining, modelo de substituição de nucleotídeo Tamura-Nei + Gama (melhor modelo
60
para a análise de dados, segundo o software Mega 6.0) e bootstrap de 1000
replicações. O método identificou a existência de quatro genótipos: Asiático /
Caribenho; Leste-Centro-Sul Africano (ECSA); Oceano Índico (IOL) e Oeste Africano
(figura 9).
O genótipo Asiático / Caribenho foi identificado em amostras oriundas da
Nicarágua; Brasil (Amapá, Pará e Pernambuco); Estados Unidos; Trinidade e Tobago;
Suriname; Honduras; El Salvador; Haiti; República Dominicana; Panamá; Ilhas Turks
e Caicos; Guadalupe; Bahamas; México; Mont Serrat; Antígua e Barbuda; Jamaica;
Santa Lúcia; Saint Martín; Polinésia Francesa; Ilhas Cayman; Martinica; Ilhas Virgens
(Britânicas); São Vicente e Granadinas; Porto Rico; Colômbia; São Cristóvão e Nevis;
Barbados; Guiana; Venezuela; Granada; Anguilla; Micronésia; Filipinas; China;
Indonésia; Singapura; Federação Russa; Nova Caledônia; Malásia; Tailândia e Índia.
O genótipo Leste-Centro-Sul Africano abrange cepas provenientes da
República Unida da Tanzânia; África do Sul; Senegal; Índia; Congo; Brasil (Rio Grande
do Norte; Pernambuco; Paraíba; Rio de Janeiro; Bahia e Alagoas); Angola; Uganda;
República Centro Africana; Estados Unidos; Camarões e Gabão. O genótipo do
Oceano Índico tive amostras representantes de Comores; Madagascar; França;
Estados Unidos; Maurício; Tailândia; Índia; Bangladesh; Sri Lanka; China; Paquistão;
Hong Kong; Itália; Japão; Singapura; Iêmen; Malásia; Myanmar; Camboja e Laos. Por
fim, o genótipo Oeste Africano englobou cepas do Senegal; Costa do Marfim e Nigéria.
Seguindo o fundamento das análises filogenéticas, além dos quatro clados já
existentes, propomos que o genótipo ECSA seja subdividido em três: ECSA I; ECSA
II e ECSA II, visto que as amostras não são provenientes de uma mesma linhagem
monofilética, quando classificadas de acordo com o ano de descoberta. Isso é
interessante, pois, a divergência de cada linhagem refletiu, de certa forma, na
transmissão e surtos globais. Todas as amostras de origem brasileira, provenientes
do Estado do Rio Grande do Norte, que foram selecionadas para sequenciamento
nesse estudo, tiveram o genótipo circulante classificado em ECSA II (figura 10).
61
Figura 10 - Árvore radial no programa Mega 6.0 representando os quatro genótipos do CHIKV. O genótipo ECSA II, marcado em verde, é o grupo no qual se encontram a maior parte das
amostras brasileiras, incluindo as selecionadas no presente estudo.
62
Figura 11 - Árvore tradicional colapsada no programa Mega 6.0, representando os genótipos do CHIKV. Destacado em verde, tem-se o genótipo ECSA (I, II e III), onde estão representadas a maioria das amostras brasileiras, inclusive aquelas selecionadas para o presente estudo. Em destaque (“zoom”) tem-se o genótipo ECSA II, cujas amostras do RN estão classificadas (sinalizadas com um
losango vermelho).
63
5.4 Variabilidade genética dos CHIKV e modelagem das proteínas E2 e E3
A comparação entre as sequencias dos CHIKV deste estudo e o seu ancestral
da linhagem ECSA II identificado em Uganda em 1982 (GenBank: HM045812) revelou
a presença de 21 mutações não sinônimas (tabela 12). O sequenciamento do CHIKV
detectado no soro e no líquor de um mesmo paciente revelou duas mutações não
sinônimas potencialmente associadas a neurovirulência viral: N606K e P677L.
Também foram utilizadas uma segunda amostra de soro (1617) e outra de líquor
(187R), mas de pacientes distintos do primeiro, e diferentes entre si. Nesse sentido,
foi possível mapear as mutações presentes em ambos os espécimes (soro e líquor) a
fim de tentar descobrir possíveis marcadores e estabelecer alguma relação com a
neurovirulência do CHIKV.
Alanina (A); Arginina (R); Asparagina (N); Aspartato (D); Fenilalanina (F); Glicina (G); Glutamina (Q); Histidina (H); Isoleucina (I); Lisina (K); Metionina (M); Prolina (P); Serina (S); Tirosina (Y); Treonina (T); Valina (V); Não avaliado (NA).
Posteriormente as sequências foram alinhadas com os templates obtidos no
PDB e foram avaliadas apenas as regiões da poliproteína estrutural do CHIKV, que
abrange o capsídeo, proteínas E3, E2, 6k e E1. Todas as mutações foram
representadas em uma ilustração (figuras 11). No entanto, com o alinhamento foi
possível detectar as regiões/domínios das glicoproteínas E3 e E2 do envelope viral e
modelá-las.
As mutações detectadas na amostra de vírus obtida a partir do líquor ocorreram
principalmente na região da proteína E2 do envelope, quando comparadas à amostra
de vírus obtido do soro do mesmo paciente (figura 12). A partir da modelagem
Tabela 13 - Mutações na sequência de aminoácidos do CHIKV isolados no Rio Grande do Norte
64
observou-se uma das mutações detectadas no vírus obtido do líquor encontrava-se
em uma região de “loop” na glicoproteína E2 do envelope (E2-N606K). Enquanto que
as alterações reportadas para o vírus obtido do soro não apresentaram templates
disponíveis no PDB para modelagem, mas de acordo com a análise da posição no
genoma, as possíveis mutações ocorreram nas proteínas E2 e E3.
Ao verificar a variabilidade genética dos CHIKV dos isolados obtidos, vimos que
não houve variabilidade significativa na sequência de aminoácidos da proteína das
amostras de vírus obtidas a partir de soro e líquor quando comparadas com a
referência (~99,60%). E quando analisadas as identidades das sequências em nível
de proteínas individuais, também não houve variabilidade significativa (capsídeo:
100% (LCR) e 99,62% (soro); E3: 100% (LCR e soro); E2: 99,50 % (LCR) e 99,52%
(soro); E1: 100% (LCR e soro) e 6k: 100% (soro e líquor)).
Ao verificar a variabilidade à nível da sequência nucleotídica, na qual vimos que
existe um maior número de mutações na sequência nucleotídica das amostras de
vírus (~96,58% obtidas do líquor; ~96,45% obtidas do soro) quando comparadas com
a sequência referência. Desta forma, foi feita uma comparação da identidade das
sequências de nucleotídeos para cada proteína que o gene da poliproteína estrutural
codifica, considerando todas as sequências disponíveis no GenBank, e com isso
verificamos que a proteína E3 é a que mais sofre variabilidade (~38,5%), enquanto
que o capsídeo é o que mesmo sofre (~31,3%). Assim como na primeira análise, a
variabilidade da sequência de aminoácidos não foi significativa quando comparadas
todas as 550 sequências disponíveis no GenBank. Confirmando a observação
anterior, foi visto que a maior parte das mutações que ocorreram na sequência
nucleotídica foram na terceira posição do códon (mais comum) sugerindo a maior
proporção de mutações silenciosas.
65
Figura 12 - Representação ilustrativa da amostra de vírus obtidas de soro (1417S) e líquor (1417L) como
mapeamento de todas as mudanças de aminoácidos de acordo com as regiões em que se encontram.
Figura 13 - Estrutura das proteínas E3 e E2 do CHIKV na amostra de vírus obtida de líquor. Os resíduos que sofreram substituição estão destacados em vermelho, com a respectiva posição discriminada. Em
verde tem-se a proteína E2 e em rosa a proteína E3.
66
6. DISCUSSÃO
Os surtos de arbovírus podem tornar-se uma epidemia devido a mudanças
genéticas nos vírus; composição ou dinâmica da população do hospedeiro ou do
vetor; ou até mesmo por mudanças ambientais. O Brasil é considerado um ambiente
favorável para disseminação viral, uma vez que possui uma ampla extensão territorial
e altos índices de vetores competentes para transmitir o CHIKV. Além disso, possui
uma condição climática de temperatura e umidade que beneficia a dinâmica
populacional dos mosquitos do gênero Aedes (WEAVER; REISEN, 2010). Apesar do
impacto na saúde pública que a febre Chikungunya causa no Rio Grande do Norte,
pouco se conhece sobre a dinâmica da doença no Estado. Isso pode ser comprovado
pela inexistência de trabalhos disponíveis acerca do tema.
Analisando os achados clínicos desse estudo observa-se que alguns pacientes
apresentaram manifestações típicas da fase aguda como: cefaleia; dor retro-orbital;
dores/rigidez nas articulações; aumento das glândulas linfáticas; rash cutâneo; febre;
edema; diarreia; prostração e anorexia. Esses dados estão em consonância com os
primeiros relatos da doença por Cheney (1935) e Robinson (1955) ao caracterizarem
surtos epidêmicos “dengue-like”, com uma descrição completa da sintomatologia
clínica e do curso da doença. Não obstante, os sintomas apresentados também estão
de acordo com o descrito pelo Ministério da Saúde e em diversos trabalhos da
literatura para a fase aguda (GALATE et al., 2016; HOCHEDEZ et al., 2006;
HORCADA; DÍAZ-CALDERÓN; GARRIDO, 2014; SAÚDE, 2015; TAUBITZ et al.,
2007).
Nesses pacientes a febre alta e o rash cutâneo estão associados à produção
de fatores imunes pró-inflamatórios tais como IL-1, IL-6 e TNF-α, que normalmente
são detectados nos pacientes que estão em fase aguda da doença (WAUQUIER et
al., 2011) e o comprometimento endotelial (MIMS, 1966), respectivamente. Por outro
lado, o principal sintoma que acomete os pacientes são as dores/rigidez nas
articulações. Acredita-se que esse sintoma se deve à produção das citocinas pro-
inflamatórias, IL-7 e IL-15 (BORGHERINI et al., 2007; CHOW et al., 2011). Nos
estágios agudos da doença, os linfócitos TCD4+ são essenciais no processo
67
inflamatório (CHEN et al., 2015), bem como intensa ativação de células dendríticas,
Natural Killer e linfócitos T CD8+ (GOUPIL; MORES, 2016).
É importante salientar também que os Alphavirus são capazes de infectar
osteoblastos e induzir a produção de fatores pró-inflamatórios, incluindo IL-6 e IL-17,
favorecendo ao desenvolvimento de artrite severa (CHEN et al., 2015; GASQUE et
al., 2015). A ação o de IL-17 pode gerar inflamação crônica da matriz extracelular e
destruição óssea através da estimulação de IL-6, TNF-α, IL-1, metaloproteinases de
matriz e RANKL (MIOSSEC et. al., 2009); enquanto que a IL-6 parece ser
fundamental para a persistência da artrite causada por CHIKV por meio da regulação
de RANKL e osteoclastogênese (NG et al., 2009). No estudo descrito por Phuklia et.al.
(2013) consta que os fibrobastos sinoviais infectados por CHIKV secretam mediadores
imunes, incluindo IL-6 que induz ostoclastogênese, um vez que, recrutam e induzem
a diferenciação de monócitos CD14+ em osteoclastos, que promovem a reabsorção
óssea. Os osteoclastos infectados por CHIKV secretam altos níveis de IL-6
promovendo um feedback positivo que além favorecer a progressão na
artralgia/artrite, também medeia a dor em múltiplas articulações devido às suas
propriedades migratórias.
Além das manifestações típicas, alguns pacientes do presente estudo
apresentaram manifestações atípicas da infecção pelo vírus Chikungunya, tais como
manifestações neurológicas, em adultos, e manifestações mucocutâneas, em
crianças menores de um ano idade. A manifestação cutânea observada nos pacientes
recém-nascidos foi o aparecimento de lesões vesiculo-bolhosas confluentes, flácidas
ou não, acometendo principalmente tronco e membros inferiores, também relatados
nos estudos de Inamadar (2008) e Hochedez (2006). Sabe-se que o conteúdo das
lesões vesiculo-bolhosas possuem uma alta carga viral, cerca de 20-70 vezes maior
que a do soro (ROBIN et al., 2010). No entanto, o mecanismo como se formam ainda
não é bem elucidado(VALAMPARAMPIL et al., 2009). É proposto que as propriedades
físicas da pele de crianças menores de um ano são mais propensas ao aparecimento
de bolhas, inclusive demonstrado em modelos de camundongos infectados com o
vírus Chikungunya (COUDERC et al., 2008). Outra hipótese é que o aparecimento
das lesões vesiculo-bolhosas são ocasionadas por uma ação direta do vírus, em
consequência da replicação viral na epiderme, cujas análises histopatológicas
68
mostram necrose focal e degeneração, seguida de resposta imune com infiltração de
leucócitos (RIYAZ et al., 2010; SEETHARAM et. al., 2012).
A outra forma atípica da febre Chikungunya relatada foi a ocorrência de
convulsões como manifestação neurológica. A fisiopatogenia ainda é investigada, mas
estudos em modelos animais mostraram que as cepas ECSA e Asiática/Caribenha
foram capazes de infectar astrócitos e oligodendrócitos de ratos infectados pelo
CHIKV (BRIZZI, 2017), aliados a expressão aumentada de genes apoptóticos.
Acredita-se que a ativação do sistema imunológico também contribua para lesões
neuronais (BRIZZI, 2017; CHIAM et al., 2015), visto que os astrócitos são capazes de
produzir IFN e fatores pró-apoptóticos, podendo estar envolvido no dano à barreira
hematoencefálica(INGLIS et al., 2016). As manifestações neurológicas geralmente
incluem encefalites, encefalopatias e neuropatias periféricas, incluindo a Síndrome de
Guillain-Barré (CERNY et al., 2017).
Para compreensão da origem e evolução do CHIKV é necessário entender o
quanto esse patógeno foi influenciado pela interação histórica com os fatores
ambientais e com os ambientes imunológicos dos hospedeiros (LO PRESTI et al.,
2016). Para isso, diversos estudos filogenéticos estão sendo feitos. Desta forma, o
presente estudo identificou, através das análises das sequências obtidas a presença
de quatro genótipos distintos: Asiático/Caribenho; ECSA; Oceano Índico e Oeste
Africano. De acordo com a inferência filogenética, as cepas brasileiras estavam
presentes em dois genótipos, o Asiático/Caribenho contendo amostras provenientes
do Amapá e Pará, por exemplo; e o genótipo ECSA englobando as amostras
provenientes dos estados do Rio Grande do Norte, Bahia; Paraíba; Pernambuco; Rio
de Janeiro e Alagoas, incluídas nesse estudo. Esses resultados são semelhantes aos
encontrados por Nunes et. al. (2015) e Souza et. al. (2016).
Por meio da análise dos clados gerados na árvore filogenética, nosso trabalho
propõe ainda que o genótipo ECSA, onde se encontram a maior parte das amostras
brasileiras, seja subdividido em três linhagens: ECSA I, ECSA II e ECSA III,
classificadas por ordem do ano de descoberta. Essa proposta de subdividir o genótipo
em três linhagens se justifica pelo fato que as amostras pertencentes a esse clado
não são provenientes de uma mesma linhagem monofilética. Desta forma, as
69
amostras do Rio Grande do Norte estariam inseridas no genótipo ECSA II, cujo
ancestral mais antigo é relatado de Uganda (1982).
A literatura sugere que o genótipo ECSA é originário de Angola e foi introduzido
no Brasil, em 2014, em Feira de Santana / Bahia (AZEVEDO; OLIVEIRA;
VASCONCELOS, 2015) e está presente, principalmente, no Nordeste do país;
enquanto que o genótipo Asiático/Caribenho, foi originário do Caribe, sendo
introduzido no país pelo Estado do Amapá (NUNES et al., 2015). Tanto o presente
estudo como o realizado por Cunha e colaboradores (2017), destacam a importância
do genótipo ECSA para os casos emergentes e persistentes da febre Chikungunya na
região Nordeste do Brasil, uma vez que esse é um dos genótipos que, além de
desencadear quadros clínicos típicos, está associado a quadros neurológicos em
virtude do seu neurotropismo, como já discutido anteriormente.
As amostras de vírus obtidas do soro e líquor de uma paciente que desenvolveu
manifestações neurológicas foi selecionada para ter a estrutura proteica modelada.
Como não havia a estrutura 3D das amostras do presente estudo, optou-se por
realizar uma modelagem por homologia a fim de utilizar o template de uma estrutura
já conhecida para predizer a estrutura da proteína-alvo, uma vez que o arcabouço
estrutural é similar (WORTH et. al., 2009). Esse tipo de modelagem foi realizada com
base em dados obtidos por cristalografia para determinar a estrutura da proteína da
amostra 1417 (soro e líquor).
A modelagem das proteínas E2 e E3 do CHIKV permitiu avaliar as mutações e
os possíveis impactos que elas gerariam. A proteína E3 apresenta uma porção N-
terminal organizada em três hélices, em “forma de ferradura”, enquanto que E2 está
inserida na superfamília das imunoglobulinas, com três domínios (A, B e C) na porção
amino-terminal. Propõem-se que as mutações que estão relacionadas com o tropismo
tecidual e o espectro de hospedeiros dos vírus estão correlacionados com o domínio
A e B da E2 (VOSS et al., 2010). Na variante presente na amostra de soro não haviam
templates disponíveis para modelagem, no entanto, de acordo com a posição no
genoma, detectamos que as mutações ocorreram na glicoproteína E2 e E3 do
envelope. Na amostra do líquor foram encontradas duas mutações: substituição de
uma asparagina por uma lisina na posição 606 (E2-N606K) e outra substituição de
70
uma prolina por uma leucina na posição 677 (E2-P677L), ambas localizadas na
glicoproteína E2 do envelope.
Partindo da informação que existem duas substituições E2-N606K e E2-P677L
realizamos a comparação dessas substituições de aminoácidos na tabela Blosum62.O
score dessa matriz é dado com base na frequência do aminoácido observada no
alinhamento, ou seja, pontuações positivas indicam substituições mais prováveis,
enquanto que as negativas indicam as menos prováveis. Nela vimos que o score
obtido para cada substituição encontrada para a amostra de vírus obtida do líquor
analisada foi de 0 e -3, respectivamente. Isso indica que a mutação E2-N606K é mais
provável de ter acontecido quando comparada a mutação E2-P677L.
Ao obter o modelo preditivo da estrutura proteica, só foi possível identificar a
mutação E2-N606K, cuja substituição ocorreu em um loop/alça da glicoproteína E2 do
envelope. Essas regiões são estruturalmente variáveis e com menor estabilidade,
provavelmente por serem as regiões mais expostas, as mudanças de aminoácidos
são mais reportadas, inclusive com troca de natureza entre os aminoácidos hidrofílicos
e hidrofóbicos (SANTOS FILHO et.al., 2003).
Ambas as mutações envolvidas na evolução do vírus detectado no líquor (E2-
N606K e E2-P677L) são novas e não haviam sido reportadas na literatura
anteriormente, no entanto é de suma importância investigar alterações nesses sítios,
visto que essa proteína (E2) está implicada com a adsorção do vírus à célula
hospedeira, e mutações nela podem modificar a relação estrutura-função afetando o
tropismo e afinidade do vírus Chikungunya (DEEBA et al., 2017). Diante disso, faz-se
necessário mais estudos em busca dessas mutações para saber se elas representam
marcadores de neurovirulência.
Mutações reportadas na literatura, tais como as das posições 226 e 98,
envolvidas com a adaptação e infectividade ao Aedes albopictus, como visto nos
estudos de Tsetsarkin et. al. (2007), Kumar (2008) e Kuo et. al. (2012) não foram
encontradas em nossas amostras, corroborando com os estudos do Rio de Janeiro
realizado por Souza et. al. (2016).
Com a análise de variabilidade percebemos que alterações em poucos
aminoácidos podem determinar a neurovirulência, pois quando se confronta a
71
variabilidade da sequência referência com as do soro e líquor não houve diferença
significativa. A maioria das mutações pontuais ocorreram na terceira posição do códon
da sequência nucleotídica, gerando assim mutações fenotipicamente silenciosas e
sinônimas, visto que o aminoácido traduzido é o mesmo. No entanto, devido a
inexistência de trabalhos investigando possíveis marcadores de neurovirulência a
partir de amostras de líquor, faz-se necessário estudos mais robustos para
aprimoramento do conhecimento nessa temática.
Os resultados obtidos a partir desse estudo relacionados à possíveis
marcadores de neurovirulência são de suma importância, visto que a febre
chikungunya era uma doença negligenciada no Brasil, mas com o crescimento
exponencial do número de casos da doença no Estado do Rio Grande do Norte. Assim
como em quase todo país, passou a representar um alerta à saúde pública,
principalmente devido a co-circulação de outros arbovírus, como dengue e zika. Desta
forma, ressalta-se a importância de estudos mais robusto sobre filogeografia do vírus,
permitindo o entendimento da origem e distribuição, além de um monitoramento e uma
caracterização molecular de um número maior de amostras, a fim de buscar possíveis
mutações relevantes e outros possíveis marcadores.
72
7. CONCLUSÃO
Com base nos resultados discutidos acima, conclui-se que o genótipo circulante
dos isolados de CHIKV no Estado do Rio Grande do Norte, de acordo com a nova
proposta de classificação, foi o Leste-Centro-Sul Africano II (ECSA II), e que ao
analisar a sequência de aminoácidos de amostras de diferentes tipos (soro e líquor)
percebe-se a presença de algumas substituições que podem ter importância no
tropismo do vírus pelo sistema nervoso de pacientes infectados.
No entanto, torna-se clara a necessidade da análise de um número maior de
sequências para uma compreensão mais detalhada do genótipo circulante por meio
de métodos filogenéticos e outras análises mais robustas de bioinformática, como por
exemplo a análise da dinâmica molecular; além disso é necessário um número maior
de amostras para avaliação da estrutura 3D das proteínas do vírus Chikungunya, bem
como uma análise mais detalhada das substituições de aminoácidos para se tentar
estabelecer um paralelo com os casos atípicos da doença.
73
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRANTES, P; SILVEIRA, H. Alterações climáticas na Europa: efeito nas doenças
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