universidade federal do vale do sÃo ......semiárido da universidade federal do vale do são...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

MICHELLE PEREIRA DA CRUZ

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA DE Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f.

(BROMELIACEAE)

PETROLINA-PE

2017




(BROMELIACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do

Semiárido da Universidade Federal do Vale do

São Francisco, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Recursos

Naturais do Semiárido.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes

da Silva Almeida

Linha de Pesquisa: Química e atividade

biológica

PETROLINA-PE

2017

Cruz, Michelle Pereira da

C957e Estudo fitoquímico e avaliação da atividade antimicrobiana de Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f. (Bromeliaceae) / Michelle Pereira da Cruz. -- Petrolina, 2017.

xvi, 151 f. : il. ; 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –

Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2017.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

Referências. 1. Plantas medicinais. 2. Química vegetal. 3. Microbiologia. 4.

Bromeliaceae. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 581.634

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

FOLHA DE APROVAÇÃO




(BROMELIACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Recursos Naturais do

Semiárido da Universidade Federal do Vale do

São Francisco, como parte dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Recursos

Naturais do Semiárido.

Aprovada em: 07 de março de 2017.

Banca examinadora

______________________________________________

Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida - UNIVASF

(Orientador)

______________________________________________

Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho - URCA

(Examinador externo)

_____________________________________________

Prof. Dr. Wagner Pereira Felix - UNIVASF

(Examinador interno)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, o meu guia que está sempre ao meu lado me fazendo

lembrar que tudo é possível.

À minha família que mesmo longe sempre esteve presente com palavras de

apoio, em especial à minha avó Antônia Brito Ferreira e meu pai Miguel Ferreira da

Cruz que são minha base e meu maior exemplo e se eu cheguei até aqui, foi fruto do

esforço e sacrifício deles.

Ao meu orientador querido, Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, pelo

exemplo de profissionalismo e comprometimento pelo conhecimento científico, por

compartilhar seus saberes, por toda a paciência ao me ensinar a pesquisar e por

apostar e confiar em mim.

Ao meu esposo Rômulo Augusto de Souza Pontes, por nunca ter dito não a

qualquer que fosse meu pedido, pela disposição em ajudar mesmo quando cansado,

pelo incentivo, por entender minhas ausências, minhas noites de estudo, pelos

jantares, almoços e cafés da manhã prontinhos nos dias mais árduos. Obrigada pelo

companheirismo e amor.

Aos meus queridos colegas de laboratório, em especial à Ana Paula pela

ajuda constante, pelas dúvidas sanadas e por toda generosidade em compartilhar

seu conhecimento. À Noelly Cavalcante pelo grande apoio, amizade e parceria, à

Mariana Gama por sempre esta pronta a ajudar, à querida Ana Ediléia por todos os

telefonemas e apoio nas horas de dificuldade, à Celuane, Juliana, Raira, Amanda,

Camila, Juninho, Cristiane, Andressa e a todos que fazem parte do Núcleo de

Estudos e Pesquisa de Plantas Medicinais (NEPLAME), obrigada pelo

companheirismo e ajuda, pelo conhecimento e também pelos momentos de

descontração, foi muito bom conhecer todos vocês.

Às minhas amigas colegas de Turma, Jessica Fernanda, Anita Ribeiro,

Heloisa Ramos, Joana D’arc, Geisiane, e Juliana. As aulas foram bem mais

divertidas com vocês e as dificuldades bem mais fáceis de serem superadas.

Obrigada por hoje fazerem parte de minha vida.

Agradeço ao professor Norberto Peporine Lopes, Gibson Gomes de Oliveira,

Fausto Carnevale Neto e José Carlos Tomaz da Universidade de São Paulo -

Ribeirão Preto pelas análises de LC-MS e Networking Molecular.

À Izabel Cristina Casanova Turatti da Universidade de São Paulo - Ribeirão

Preto, pelas análises de CG-EM.

À Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) que

disponibilizou toda a infraestrutura necessária para o desenvolvimento deste

trabalho.

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco

(FACEPE) pela bolsa de mestrado concedida.

LISTA DE ABREVISTURAS E SÍMBOLOS AcOEt Acetato de etila

ATCC “American type cell colletion”

Bl-1 Substância 1

Bl-2 Substância 2

Bl-3 Substância 3

CBM Concentração bactericida mínima

CCD Cromatografia em camada delgada

CCDA Cromatografia em camada delgada analítica

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CG Cromatografia gasosa

CG-EM Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

CHCl3 Clorofórmio

CIM Concentração inibitória mínima

CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de

arranjo de diodos

CTT Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio

d Dubleto

dd Duplo dubleto

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

ESI Ionização por eletrospray

eV Eletrovolt

HPLC “High-performance liquid chromatography”

HVASF Herbário Vale do São Francisco

J Constante de acoplamento

LC-MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas

m Multipleto

MeOH Metanol

MS Espectrometria de massas

OMS Organização Mundial da Saúde

Rf “Retenction factor" (Fator de retenção)

RMN Ressonância magnética nuclear

UFC Unidade formadora de colônia

UV Ultravioleta

δ Deslocamento químico

μL Microlitro

RESUMO Bromelia laciniosa Mart. ex Shult. é uma espécie pertencente à família Bromeliaceae, que pouco se tem referência, entretanto é usada na medicina popular para o tratamento de cólica infantil, diarreia, febre, icterícia, caspa e hepatite. O objetivo desse trabalho foi realizar o estudo fitoquímico e investigar a atividade antimicrobiana a partir das folhas de B. laciniosa. O material vegetal foi coletado na localidade de Lagoa dos Cavalos no município de Petrolina-PE e após o processo de secagem e maceração foi obtido o extrato etanólico bruto (Bl-EEB). Em seguida este extrato foi particionado utilizando o método de cromatografia líquido-líquido com solventes em ordem crescente de polaridade, obtendo-se as fases éter de petróleo (Bl-EP), clorofórmica (Bl-CHCl3) e acetato de etila (Bl-AcOEt). A fração Bl-EP foi submetida à análise por CG-EM para a identificação dos seus constituintes químicos. Bl-EEB e as frações Bl-EP, Bl-CHCl3, Bl-AcOEt e fase líquida foram analisados por LC-DAD-IT-MS/MS com posterior aplicação do networking molecular. A fase Bl-AcOEt foi submetida ao fracionamento por cromatografia líquida em coluna utilizando os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Além disso, Bl-EEB e as frações foram submetidos ao teste biológico de atividade antimicrobiana, por meio da determinação da CIM e CBM. A análise por CG-EM revelou a presença de 47 picos, sendo os constituintes β-sitosterol e o estigmasterol os mais representativos. Além disso, foram identificados outros constituintes, como campesterol, ácido palmítico, ácido oleico e α-tocoferol. A análise por LC-DAD-IT-MS/MS de BL-EEB levou à identificação de 22 constituintes pertencentes às classes dos fenilpropanoides, flavonoides e ácidos graxos. Além disso, a aplicação do networking molecular auxiliou na identificação desses compostos por meio de uma rede integrando os dados MS/MS de acordo com a similaridade entre os constituintes. O fracionamento cromatográfico da fase Bl-AcOEt, resultou na identificação das substâncias isoladas codificadas como Bl-1 e Bl-2/Bl-3, as quais foram identificadas por meio de técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais. As substâncias identificadas foram: o flavonoide quercetina 3,3’,4’-trimetil éter e a mistura de esteroides β-sitosterol e estigmasterol. Nos testes de atividade antimicrobiana com o extrato e fases de B. laciniosa, foi observada uma forte atividade das amostras testadas contra a cepa bacteriana Staphylococcus aureus. Os valores de CIM e CBM demostraram forte inibição do crescimento microbiano na menor concentração testada. Diante disso, esses resultados demonstraram que B. laciniosa é uma espécie muito interessante do ponto de vista fitoquímico e biológico, se mostrando como um potente inibidor microbiano, podendo se tornar uma promissora candidata à droga contra infecções por S. aureus.

Palavras-chave: Bromeliaceae. Bromelia laciniosa. Fitoquímica. Networking

molecular. Atividade antimicrobiana.

ABSTRACT Bromelia laciniosa Mart. ex Shult. is a species belonging to the family Bromeliaceae, which has few reference, however, it is used in folk medicine for the treatment of childhood colic, diarrhea, fever, jaundice, dandruff and hepatitis. The objective of this research was to carry out the phytochemical study and investigate the antibacterial activity from the leaves of B. laciniosa. The vegetal material was collected in the locality of Lagoa dos Cavalos in the municipality of Petrolina-PE and after the drying and maceration process the crude ethanolic extract (Bl-EEB) was obtained. Then, this extract was partitioned using the method of liquid-liquid chromatography with solvents in order of increasing polarity, yielding phases petroleum ether (BL-EP), chloroform (Bl-CHCl3) and ethyl acetate (Bl-EtOAc). The fraction Bl-EP was submitted to GC-MS analysis for the identification of its chemical constituents. Bl-EEB and the fractions Bl-EP, Bl-CHCl3, Bl-AcOEt and liquid phase were analyzed by LC-DAD-IT-MS/MS with subsequent application of molecular networking. The Bl-AcOEt phase was subjected to fractionation by liquid column chromatography using the solvents hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol. In addition, the Bl-EEB and the fractions were submitted to the biological test of antimicrobial activity, through the determination of MIC and MBC. The GC-MS analysis revealed the presence of 47 peaks, with the β-sitosterol and stigmasterol constituents being the most representative. Moreover, other constituents also have been identified as campesterol, palmitic acid, oleic acid and α-tocopherol. The analysis by LC-DAD-IT-MS/MS Bl-EEB led to the identification of 22 constituents belonging to the classes of phenylpropanoids, flavonoid and fatty acids. In addition, the application of molecular networking aided the identification of these compounds by means of a network integrating the MS/MS data according to the similarity between the constituents. Chromatographic fractionation BL-AcOEt phase resulted in the identification of the isolated compounds coded as Bl-1 and Bl-2 / Bl-3, which were identified by spectroscopic 1H and 13C NMR one and two-dimensional. The substances identified were: the flavonoid quercetin 3,3',4'-trimethyl ether and the mixture of steroids β-sitosterol and stigmasterol. In the antimicrobial activity test with the extract and phase B. laciniosa it was observed a strong activity of the samples tested against bacterial strain Staphylococcus aureus. MIC and MBC values showed strong inhibition of microbial growth at the lowest concentration tested. Therefore, these results demonstrated that B. laciniosa is a very interesting species from a phytochemical and biological point of view, showing itself to be a potent microbial inhibitor and could become a promising candidate for the drug against S. aureus infections. Keywords: Bromeliaceae. Bromelia laciniosa. Phytochemistry. Molecular networking. Antimicrobian activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Distribuição fitogeográfica de B. laciniosa. ................................................. 39

Figura 2 - Estrutura básica dos flavonoides, com anéis nomeados e posições

numeradas. ............................................................................................................... 47

Figura 3 - Representação estrutural das principais subclasses de flavonoides. ....... 49

Figura 4 - Estrutura básica dos esteroides. ............................................................... 51

Figura 5 - Formação de triterpenos e esteroides em plantas. ................................... 52

Figura 6 - Etapas para a implementação do networking molecular. .......................... 55

Figura 7 - Exsicata da espécie B. laciniosa depositada no Herbário da Universidade

Federal do Vale do São Francisco. ........................................................................... 57

Figura 8 - Fluxograma demonstrando a obtenção do Bl-EEB e seu fracionamento a

partir das folhas de B. laciniosa. ................................................................................ 59

Figura 9 - Fluxograma demonstrando a obtenção de Bl-1 e Bl-2/Bl-3. ...................... 65

Figura 10 - Cromatograma de íons totais da fase éter de petróleo (Bl-EP) de B.

laciniosa. ................................................................................................................... 70

Figura 11 - Estrutura dos compostos majoritários obtidos em Bl-EP. ....................... 76

Figura 12 - Representação da aplicação do networking molecular baseada em LC-

DAD-IT-MS/MS no modo de ionização por electrospray negativo em diferentes fases

do extrato de B. laciniosa. ......................................................................................... 79

Figura 13 - Cromatograma representativo de HPLC-DAD-MS do EEB de B. laciniosa

(A) em 320 nm, modos negativo e positivo, (B) ESI negativo e (C) ESI positivo....... 80

Figura 14 - Estrutura química da vicenina-2. ............................................................. 81

Figura 15 - Estrutura química da vitexina. ................................................................. 82

Figura 16 - Espectro de RMN de 13C de Bl-1 (CDCl3,100 MHz). ............................... 92

Figura 17 - Espectro de RMN de 13C DEPT 135° de Bl-1 (CDCl3,100 MHz). ............ 93

Figura 18 - Espectro de RMN de 1H de Bl-1 (CDCl3 400 MHz). ................................ 95

Figura 19 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Bl-1 (CDCl3 400 MHz). ........... 96

Figura 20 - Espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de Bl-1 (CDCl3, 400 MHz e 100

MHz). ......................................................................................................................... 97

Figura 21 - Espectro de correlação heteronuclear RMN de 1H x 13C – HMBC de Bl-1

(CDCl3, 400 e 100 MHz). ........................................................................................... 98

Figura 22 - Expansão do espectro de correlação heteronuclear RMN de 1H x 13C –

HMBC de Bl-1 (CDCl3, 400 e 100 MHz). ................................................................... 99

Figura 23 - Estrutura química do flavonoide 5,7-di-hidroxi-3,3',4'-trimetoxiflavona

(quercetina 3,3’,4’-trimetil éter). ............................................................................... 100

Figura 24 - LC-MS do flavonoide isolado com tempo de retenção e fragmentações.

................................................................................................................................ 103

Figura 25 - Estruturas químicas de Bl-1/Bl-2. .......................................................... 104

Figura 26 - Espectro de RMN de 13C de Bl-2/Bl-3 (CDCl3,100 MHz). ...................... 105

Figura 27 - Expansão do espectro de RMN de 13C DEPT 135° de Bl-2/Bl-3

(CDCl3,100 MHz). .................................................................................................... 106

Figura 28 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Bl-2/Bl-3 (CDCl3 400 MHz). . 107

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Eluentes e reveladores utilizados na identificação do perfil fitoquímico

cromatográfico do extrato e fases de B. laciniosa. .................................................... 61

Tabela 2 - Dados do fracionamento cromatográfico de Bl-AcOEt. ............................ 64

Tabela 3 - Identificação das principais classes de constituintes presentes em

extratos e fases de B. laciniosa. ................................................................................ 69

Tabela 4 - Constituintes químicos da fase éter de petróleo das folhas de B. laciniosa.

.................................................................................................................................. 71

Tabela 5 - Metabolitos detectados por HPLC-DAD-MS/MS (modos ESI positivo e

negativo) do EEB de B. laciniosa. ............................................................................. 85

Tabela 6 - Dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) para Bl-1 em CDCl3,

incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1,

HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura. ....................................................... 101

Tabela 7 - Comparação dos dados espectrais de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) da

mistura de Bl-2/Bl-3 em CDCl3 com os da mistura de β-sitosterol e estigmasterol

encontrados na literatura (125 MHz, CDCl3). .......................................................... 108

Tabela 8 - Atividade antibacteriana do extrato etanólico bruto e fases das folhas de

B. laciniosa. ............................................................................................................. 113

LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Resumo da atividade farmacológica dos extratos de espécies de

Bromeliaceae. ........................................................................................................... 27

Quadro 2 - Atividade farmacológica de moléculas quimicamente definidas. ............. 32

Quadro 3 - Metabólitos secundários isolados do gênero Bromelia. .......................... 37

Quadro 4 - Aplicações de técnicas hifenadas na área de plantas medicinais. .......... 44

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 21

2.1. Geral ............................................................................................................... 21

2.2. Específicos .................................................................................................... 21

3. REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................... 23

3.1. Considerações sobre a família Bromeliaceae ............................................ 23

3.2. Considerações sobre o gênero Bromelia ................................................... 35

3.3. Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa .................................. 39

3.4. Considerações sobre atividade antimicrobiana ......................................... 40

3.5. Considerações sobre técnicas hifenadas ................................................... 43

3.6. Considerações sobre flavonoides ............................................................... 47

3.7. Considerações sobre esteroides ................................................................. 50

3.8. Considerações sobre desreplicação por Networking Molecular .............. 53

4. PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................... 57

4.1. Coleta e identificação botânica .................................................................... 57

4.2. Processamento do material botânico ......................................................... 58

4.3. Preparação e fracionamento do extrato etanólico bruto ........................... 58

4.4. Métodos de análise ....................................................................................... 59

4.4.1. Métodos cromatográficos .......................................................................... 59

4.4.2. Métodos espectrométricos ........................................................................ 60

4.5. Triagem fitoquímica preliminar .................................................................... 60

4.6. Investigações dos constituintes químicos por técnicas cromatográficas

hifenadas .............................................................................................................. 61

4.6.1. Análises por cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas

(CG-EM) ............................................................................................................. 61

4.6.2. HPLC-IT-MS/MS ....................................................................................... 62

4.7. Networking molecular ................................................................................... 63

4.8. Fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila (Bl-AcOEt) ........ 64

4.9. Avaliação da atividade antimicrobiana ....................................................... 65

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 68

5.1. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos.............................................. 68

5.2. Composição química da fase éter de petróleo de B. laciniosa ................. 70

5.3. Networking Molecular ................................................................................... 77

5.5. Caracterização estrutural de Bl-1 ................................................................ 91

5.6. Caracterização estrutural da mistura Bl-2/Bl-3......................................... 104

5.7. Atividade antimicrobiana ........................................................................... 109

6. CONCLUSÕES ................................................................................................... 115

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 117

APÊNDICE .............................................................................................................. 130

16

1. INTRODUÇÃO

17

1. INTRODUÇÃO

Ao longo dos tempos, os seres humanos têm destinado aos recursos naturais

o atendimento às suas necessidades básicas, como a busca de medicamentos para

o tratamento de doenças. As plantas apresentam os registros mais antigos, datados

de cerca de 2.600 a.C. documentando os usos de aproximadamente 1000

substâncias derivadas de plantas na Mesopotâmia. Há registros históricos de sua

utilização nos mais diversos tipos de civilizações, como os gregos e romanos que

contribuíram substancialmente para o desenvolvimento racional do uso de drogas à

base de plantas no antigo mundo ocidental (CRAGG; NEWMAN, 2013).

Atualmente, apesar do desenvolvimento da medicina, progresso tecnológico e

da criação de novos compostos e substâncias sintéticas com propriedades

medicinais, o uso de produtos naturais cresce gradativamente principalmente nos

países desenvolvidos, apresentando-se como uma alternativa nos cuidados com a

saúde (CZELUSNIAK, 2012; LEITE; SHOR, 2002).

Organismos como plantas, fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias

são fontes relevantes de substâncias ativas. Entretanto, o uso de plantas medicinais

é a principal prática utilizada pelo homem para o tratamento de um amplo espectro

de doenças. Além disso, oferecem as melhores possibilidades de encontrar

substâncias de interesse terapêutico. Dessa forma, as plantas medicinais podem ser

classificadas como a principal fonte de compostos biologicamente ativos, fornecendo

a matéria-prima para fabricação de fitoterápicos e outros medicamentos

(BARREIRO; BOLZANI, 2009; COSTA-LOTUFO et al., 2010; CRAGG; NEWMAN,

2013).

Além do metabolismo primário, responsável pela síntese de celulose, lignina,

proteínas, lipídeos, açúcares e outras substâncias importantes para a realização das

funções vitais, as plantas superiores são também capazes de sintetizar uma grande

variedade de compostos de baixa massa molecular - os metabólitos secundários.

Esses por sua vez, podem ser definidos como compostos que não apresentam papel

nos processos fundamentais da manutenção da vida nas plantas que os sintetizam,

mas eles têm um papel importante na interação da planta com o seu ambiente. A

produção destes compostos é geralmente baixa (menos de 1% de peso seco) e

depende em grande parte do estado fisiológico e do desenvolvimento da planta

18

(CHAMPE; HARVEY; FERRIER et al., 2008; PEREIRA; CARDOSO, 2012;

VAISHNAV; DEMAIN, 2010).

A síntese dos metabólitos secundários é frequentemente afetada por

condições ambientais. Sua presença e concentração em uma dada planta são

influenciadas pela genética e uma série de fatores ambientais bióticos e abióticos.

Dentre estes, podem-se ressaltar as interações planta/microrganismos,

planta/insetos e planta/planta; idade e estágio de desenvolvimento, luminosidade,

temperatura, pluviosidade, nutrição, época e horário de coleta, bem como técnicas

de colheita e pós-colheita (ESTELL; FREDRICKSON; JAMES, 2016; GOBBO-NETO;

LOPES, 2007).

Os metabólitos secundários são responsáveis por diversas atividades

biológicas, como: atividade antibacteriana, antifúngica, anticancerígena,

hipocolesterolêmica, imunossupressora, antiparasitária, entre outros. Alguns deles

têm desempenhado um papel crucial no tratamento ou prevenção de doenças, que

não apresentavam cura até a descoberta desses compostos. Em decorrência disso,

os metabólitos secundários são atualmente utilizados como matéria-prima para a

produção de medicamentos, cosméticos e química fina (FUMAGALI et al., 2008;

VAISHNAV; DEMAIN, 2010).

O território brasileiro abriga quase um terço da flora mundial representada em

dez biomas com uma biodiversidade exuberante (BÔAS; GADELHA, 2007). A

Caatinga é o principal ecossistema da região Nordeste brasileira, apresentando-se

como um mosaico de arbustos espinhosos e florestas sazonalmente secas que

cobre a maior parte dos Estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba,

Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e a parte nordeste de Minas Gerais, no vale

do Jequitinhonha (LEAL et al., 2005). Caracterizada como floresta arbórea ou

arbustiva, a Caatinga é composta de árvores e arbustos baixos com características

xerofíticas. É o único bioma exclusivamente brasileiro, o qual ocupa 11% do território

nacional e abriga uma fauna e uma flora únicas, com muitas espécies não

encontradas em nenhum outro lugar do planeta (PRADO, 2003). Essa região é

considerada como um dos ecossistemas mais explorados e degradado do mundo

pelo uso intensivo da terra. Porém, estudos já constataram que sua vegetação

apresenta grande potencial botânico, ainda pouco explorado quanto ao

conhecimento da sua constituição química e potencial terapêutico (BEZERRA et al.,

2011; MOREIRA; LIRA; SANTOS, 2006).

19

O interesse em se investigar novas moléculas inclui o potencial microbicida de

compostos extraídos de plantas (ALBERNAZ, 2010). O consumo desenfreado e

irresponsável de antibióticos tem resultado na seleção de cepas multirresistentes,

causando assim um sério problema de saúde pública. A resistência bacteriana

conferida pelo uso indiscriminado dos fármacos atrelados à diminuição de novas

substâncias antimicrobianas sintéticas são fatores que contribuem para o aumento

da utilização de extratos vegetais (SILVA et al., 2009; VAN BOECKEL et al., 2014).

Estima-se que aproximadamente 80% dos antibióticos utilizados na clínica são

diretamente (ou indiretamente) derivadas de produtos naturais (ROEMER et al.,

2011).

Tendo em vista os aspectos envolvidos na descoberta de novas substâncias

ativas a partir de produtos naturais e considerando o potencial farmacológico

pobremente explorado das espécies vegetais encontradas na Caatinga, este

trabalho tem como objetivo a caracterização fitoquímica da espécie Bromelia

laciniosa, assim como a investigação de sua atividade antimicrobiana in vitro. Esta é

uma planta endêmica da Caatinga, com ampla distribuição nesse bioma e que

apresenta escassez de estudos dessa natureza.

20

2. OBJETIVOS

21

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Realizar o estudo fitoquímico e avaliar a atividade antimicrobiana da espécie

Bromelia laciniosa.

2.2. Específicos

- Obter extratos e fases por partição das folhas de B. lainiosa para posterior análise

fitoquímica e avaliação da atividade antimicrobiana.

- Realizar triagem fitoquímica para a identificação das principais classes de

constituintes químicos.

- Obter substâncias isoladas dos extratos de B. laciniosa através de métodos

cromatográficos.

- Identificar os compostos isolados através de técnicas espectroscópicas de

ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C utilizando métodos uni e

bidimensionais, assim como pela cromatografia líquida acoplada à espectrometria de

massas (LC-MS) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

(CG-EM).

- Realizar ensaios de atividade antimicrobiana in vitro.

- Analisar o perfil químico dos metabólitos secundários através de métodos

cromatográficos como CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM, CLAE-DAD-EM/EM e networking

molecular.

22

3. REFERENCIAL TEÓRICO

23

3. REFERENCIAL TEÓRICO

3.1. Considerações sobre a família Bromeliaceae

A família Bromeliaceae é constituída por cerca de 56 gêneros (GRANT;

ZIJLSTRA, 1998) e aproximadamente 3.270 espécies, dividida em três subfamílias:

Pitcairnioideae, Tillandsioideae e Bromelioideae (LUTHER, 2000; REITZ, 1983).

Essa é considerada a maior família de fanerógamas de distribuição neotropical

(GILMARTIN, 1973). É amplamente distribuída no continente Americano, nos

Estados da Virgínia e Texas no sul dos Estados Unidos para o centro da Argentina e

Chile, com exceção de uma única espécie da África Ocidental tropical (VERSIEUX;

WENDT, 2007). Cerca de 50% das espécies conhecidas são encontradas no Brasil,

ocorrendo principalmente na Mata Atlântica costeira, mas também podem ser vistas

na região amazônica, na Caatinga, Cerrado, Restinga, Campos Rupestres e regiões

semiáridas (CEITA et al., 2008).

A família Bromeliaceae é constituída por plantas terrestres, rupícolas e

epífitas, geralmente herbáceas, variando de plantas delicadas e de pequeno porte,

até plantas de grande porte. Os representantes da família apresentam em geral

inflorescência vistosa e folhas distribuídas em roseta, usualmente com bainha

alargada na base, propiciando a formação de um reservatório de água e nutrientes.

Esse reservatório apresenta um importante papel ecológico e fisiológico, tanto no

que diz respeito à nutrição das bromélias, como no fato de se apresentar como um

micro ambiente onde habitam animais diversos, como formigas, sapos, aracnídeos e

serpentes (REITZ, 1983).

Quanto à importância econômica, a família Bromeliaceae é bastante utilizada

como plantas ornamentais. Bromélias são tradicionalmente usadas em decorações

de interior e projetos paisagísticos, sendo muito cultivadas. Devido à grande

exploração das bromélias de valor ornamental, o extrativismo de seus ambientes

naturais tem ganhado força e isso acaba por colocar algumas espécies em risco

(MOREIRA; LIRA; SANTOS, 2006).

Embora apresente um grande número de espécies, a família Bromeliaceae

não tem sido bem investigada no que diz respeito a seus constituintes químicos. No

entanto, há uma quantidade considerável de compostos químicos identificados, que

na sua maioria pertencem à classe de triterpenoides e flavonoides. Outras classes

24

de compostos, tais como esteróis, diterpenos, derivados do ácido cinâmico, gliceróis

substituídos, lignanas e compostos contendo nitrogênio, entre outros, têm também

sido identificados nesta família, mas em menor grau (MANETTI; DELAPORTE;

LAVERDE-JÚNIOR, 2009; OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2014).

Uma grande variedade de cicloartanos foi encontrada na família

Bromeliaceae, estes estão concentrados principalmente dentro da subfamília

Tillandsioidae (MANETTI; DELAPORTE; LAVERDE-JÚNIOR, 2009; ETTI et al.,

2009). Em um estudo realizado por Cabrera e Selds (1996) foram isolados

cicloartanos de cadeias laterais curtas, são eles: 27-nor-cicloartano-3,25diol,

24,25,26,27-tetranor-3-oxo-cicloartano-23-al e 25,26,27-trisnor-3-oxo-cicloartano-24-

al. Estes constituintes foram isolados a partir da espécie Tillandsia usneoides que foi

coletada em Buenos Aires na Argentina e foram identificados por métodos químicos

e espectroscópicos. Em outro estudo realizado com as folhas de Tillandsia

brachycaulos, foi possível a identificação de dois novos triterpenos: (24S)-24-

isopropenil-29-nor-5α-lanosta-7-en-3-ol e (24S)-24-isopropenil-29-nor-5α-lanosta-7-

en-3-ona, além dos compostos já anteriormente conhecidos, o ácido isopimárico e o

ácido clorogênico (CANTILLO-CIAU et al., 2003).

Os flavonoides também são constituintes presentes dentro da família

Bromeliaceae. Estes constituintes são caracterizados por apresentarem atividades

farmacológicas e apresentarem potencial quimiotaxonômico (MANETTI;

DELAPORTE; LAVERDE-JÚNIOR, 2009). A maioria das principais classes de

flavonoides está representada dentro da família Bromeliaceae, porém, os

componentes mais relevantes são, sem dúvida, a presença de flavonoides com

hidroxilação ou metoxilação na posição C-6, sendo esta uma característica única

dentro das monocotiledôneas (WILLIAMS, 1978). Esse padrão particular de

substituição é bastante utilizado como um indicador filogenético, sendo, dessa

forma, considerados caracteres apomórficos na escala evolutiva, resultantes de uma

etapa biossintética extra para sua formação (MANETTI; DELAPORTE; LAVERDE-

JÚNIOR, 2009). Em um estudo realizado por Bringmann et al. (1999), dentre os

constituinte desse tipo, foi possível o isolamento do flavonoide glicosilado 6-

hidroxiluteolina-7-O-(1''-α-ramnosídeo). Esse constituinte foi isolado por meio do

extrato metanólico das folhas de Vriesea sanguinolenta e pertence à classe das

flavonas (BRINGMANN et al., 1999).

25

Derivados do ácido cinâmico são constituintes químicos extensamente

distribuídos no reino vegetal, entre eles os mais representativos são o ácido p-

cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico e ácido sináptico. Praticamente todos os

tecidos vegetais possuem ao menos um dentre esses ácidos (CARVALHO,

GOSMANN; SCHENKEL, 2003). Esses compostos já foram isolados em espécies da

família Bromeliaceae. Em um estudo realizado por Cantillo-Ciau et al. (2003), com a

fração acetato de etila da extração metanólica de partes aéreas de Tillandsia

brachycaulos, foi possível o isolamento de um éster do ácido quínico, o ácido

clorogênico.

Do ponto de vista farmacológico, também há poucos estudos na literatura

com espécies de Bromeliaceae. No entanto, um número de estudos demonstraram

propriedades farmacológicas importantes, tais como: atividade antimicrobiana

(ALONSO-PAZ et al., 1995), anti-helmíntica (DOMINGUES et al., 2013; HÖRDEGEN

et al., 2003; ISLAM et al., 2015), antinociceptiva (AMENDOEIRA et al., 2005; LIMA-

SARAIVA et al., 2012), antitumoral (LOWE et al., 2014), antioxidante (UPADHYAY et

al., 2012), antiúlcera (CARVALHO et al., 2010) e gastroprotetora (SILVA et al.,

2008).

Domingues et al. (2013) avaliaram a atividade anti-helmíntica de Ananas

comosus contra o parasita Haemonchus contortus em ovinos Santa Inês. O extrato

aquoso da pele do abacaxi foi avaliado em testes in vitro e in vivo. O teste de

incubação de ovos (EHT) e teste de desenvolvimento larval (LDT) foi realizado e os

resultados obtidos no estudo in vitro mostraram que o extrato aquoso foi muito

eficaz. Um estudo com a análise in vitro foi realizado para avaliar o efeito anti-

helmíntico de extratos hidroalcoólicos das folhas de Ananas sativus contra adultos

de Paramphistomum cervi (Trematódeos) e Haemonchus contortus (nematódeo). Os

resultados mostraram que a folha A. sativus exibiu atividade anti-helmíntica in vitro,

mostrando uma maior atividade sobre a sobrevivência de parasitas adultos nas

concentrações testadas (ISLAM et al., 2015).

O extrato etanólico das folhas de Encholirium spectabile foi investigado em

relação à atividade antinociceptiva. A avaliação foi efetuada em ratos usando os

modelos de nocicepções térmico e químico. Os resultados mostraram que o extrato

etanólico apresenta atividade antinociceptiva com a redução do número de

contorções em 68,59, 79,33 e 65,28%, respectivamente. Além disso, o extrato

26

mostrou diminuição do tempo da lambida da pata na primeira fase, bem como na

segunda fase do teste da formalina (LIMA-SARAIVA et al., 2012).

Foi publicado na revista Journal of Plant Sciences um artigo de revisão sobre

a fitoquímica e a atividade biológica e farmacológica de espécies da família

Bromeliaceae encontradas no Brasil. Nesta revisão sistemática, foram relatados os

estudos da literatura sobre as atividades biológicas e a composição química das

espécies de Bromeliaceae brasileira. As palavras "Bromeliaceae", "fitoquímica" e

"farmacologia" foram utilizadas para realizar a busca por artigos nas bases de dados

LILACS, PubMed, SciELO, Science Direct e SCOPUS, publicados até janeiro de

2016. De um total de 652 estudos encontrados, 14 artigos foram selecionados para

a pesquisa após serem utilizados os critérios de inclusão e exclusão. Neste estudo

observou-se que uma grande variedade de espécies dentro da família Bromeliaceae

apresentou potencial farmacológico. Além disso, esta revisão identificou 10

constituintes quimicamente definidos relatados na literatura que foram obtidos a

partir de espécies da família Bromeliaceae brasileira, os quais pertencem às classes

dos flavonoides derivados do ácido cumárico e esteroides. Os dados aqui analisados

sugerem que há um grande potencial químico e farmacológico nas espécies da

família Bromeliaceae, o que justifica o interesse em estudar essas plantas. Os dados

sobre esse artigo podem ser visualizados no quadro 1, pág. 27 e quadro 2, pág. 32.

27

Quadro 1 - Resumo da atividade farmacológica dos extratos de espécies de Bromeliaceae.

Nome botânico Origem Parte usada Preparação Atividade biológica

Modelo Referência

Tillandsia usneoides

Brasil ___ Extrato

etanólico

Atividade analgésica

Teste de contorção,

teste da retirada da

cauda

Costa et al. (1989)

Tillandsia

streptocarpa

Brasil Partes aéreas Extrato

metanólico

bruto

Toxicidade aguda e

antiedematogênica,

atividades

antioxidante e

antimicrobiana

Edema de orelha

induzido por óleo de

croton, redução do

radical DPPH livre,

método de microdiluição

Delaporte et al.

(2005)

Tillandsia

streptocarpa

Brasil Partes aéreas Fração

hexânica

Atividade

antiedematogênica

Edema de orelha

induzido por óleo de

croton

Delaporte et al.

(2004)

Nidularium

procerum

Brasil Folhas Extrato aquoso Atividade

antialérgica

Pleurisia alérgica em

ratos ativamente

sensibilizados

Vieira-de-Abreu

et al. (2005)

Nidularium

procerum

Brasil Folhas Extrato aquoso

bruto

Atividade anti-

inflamatória

pleurisia induzida em

ratos

Amendoeira et

al. (2005)

(Continua)

28

(Continuação)

Nidularium

procerum

Brasil Folhas e raízes Extrato

metanólico

Atividade

antinociceptiva

Teste de contorção,

ensaio de placa

quente, hiperalgesia

induzida por

bradicinina, pleurisia

induzida por

lipopolissacarídeo,

ensaio de inibição da

ciclooxigenase e

ensaio toxicológico

Amendoeira et

al. (2005)

Ananas

ananassoides

Brasil Folhas Extrato

metanólico e

diclorometano

Atividade

gastroprotetiva

Úlcera gástrica

induzida por etanol

Silva et al.

(2008)

Bromelia

antiacantha

Brasil Frutos Extrato

metanólico e

aquosos

Atividade

antioxidante

Redução do radical

DPPH

Santos et al.

(2009)

Ananas bracteatus Brasil Folhas e frutos Extrato

metanólico e

extrato

hexânico

Atividade antirradical Redução do radical

DPPH

Rocha et al.

(2010)

(Continua)

29

(Continuação)

Bromelia

antiacantha


metanólico e

extrato

hexânico


DPPH

Rocha et al.

(2010)

Alcantarea

brasiliana

Brasil Folhas e

rizomas

Extrato

metanólico e

extrato

hexânico


DPPH

Rocha et al.

(2010)

Neoregelia

cruenta

Brasil Folhas e

rizomas

Extrato

metanólico e

extrato

hexânico


DPPH

Rocha et al.

(2010)

Pitcairnia flammea Brasil Folhas e

rizomas

Extrato

metanólico e

extrato

hexânico


DPPH

Rocha et al.

(2010)

Vriesea procera Brasil Folhas e

rizomas

Extrato

metanólico e

extrato

hexânico


DPPH

Rocha et al.

(2010)

(Continua)

30

(Continuação)

Encholirium

spectabile

Brasil Partes aéreas Extrato

etanólico

Atividade anti-úlcera Úlcera gástrica

induzida em

camundongos e

ratos

Carvalho et al.

(2010)

Bromelia balansae Brasil Raízes, folhas e

frutas

Extrato

metanólico

Atividade

antimicobacteriana

Ensaio de

microtitulação

resazurina

Coelho et al.

(2010)

Bromelia

antiacantha

Brasil Folhas e frutas Extrato

alcóolico,

hexânico,

clorofórmico e

acetato de etila

Atividade

antimicrobiana,

citotóxica, moluscicida

e antioxidante

Concentração

inibitória mínima

(CIM), bioensaio da

toxicidade, ensaio da

atividade moluscicida

Manetti et al.

(2010)

Encholirium

spectabile


etanólico bruto

Atividade

antinociceptiva

Toxicidade aguda,

contorção induzida

por ácido acético em

ratos, teste de

formalina, teste da

placa quente e teste

de coordenação

motora

Lima-Saraiva et

al. (2014)

(Continua)

31

(Continuação)

Ananas comosus Brasil Pele Extrato aquoso Atividade anti-

helmíntica

Teste de eclosão dos

ovos (EHT), teste de

desenvolvimento

larval (LDT).

Domingues et al.

(2013)

Neoglaziovia

variegata

Brasil Folhas e partes

aéreas

Extrato

etanólico

Atividade acaricida Teste de imersão de

Adultos (AIT).

Dantas et al.

(2015)

Fonte: Autoria própria.

32

Quadro 2 - Atividade farmacológica de moléculas quimicamente definidas.

Nome Botânico

Origem Parte usada Substância química

Classe Atividade biológica

Modelo/Isolamento Referência

Tillandsia streptocarpa

Brasil Partes aéreas Cicloartenol Esterol ___ Teste de toxicidade

aguda, ensaios

antibacterianos e

antifúngicos e edema

da orelha induzido pelo

óleo de croton

Delaporte et al.

(2004)


Brasil Partes aéreas 4,5-Di-hidroxi-3’,7-

dimetoxiflavanona

Flavonoide ___ Teste de toxicidade

aguda, ensaios

antibacterianos e

antifúngicos e edema

da orelha induzido pelo

óleo de croton

Delaporte et al.

(2004)

Ananas bracteatus

Brasil Folhas e

frutos

2-O-Feruloil

glicerídio

Derivado do ácido

felúrico

___ Redução do

radical DPPH,

cromatografia em

coluna com Sephadex

LH-20 e sílica gel 60,

RMN

Rocha et al. (2010)

(Continua)

33

(Continuação) Ananas

bracteatus Brasil Folhas e

frutos

2-O-p-Cumaroil

glicerídeo

Derivado do ácido

cumárico

___ Redução do

radical DPPH,

cromatografia em

coluna com Sephadex

LH-20 e sílica gel 60,

RMN

Rocha et al. (2010)

Ananas bracteatus

Brasil Folhas e

frutos

5,7,4’-Tri-hidroxi-

3,3’,5’-

trimetoxiflavona

Flavonoide ___ Redução do radical

DPPH, cromatografia

em coluna com

Sephadex LH-20 e

sílica gel 60, RMN

Rocha et al. (2010)

Ananas

bracteatus

Brasil Folhas e

frutos

3-O-β-D-

Glicopiranosil

sitosterol

Derivado do ácido

cumárico

___ Redução do radical

DPPH, cromatografia

em coluna com

Sephadex LH-20 e

sílica gel 60, RMN

Rocha et al. (2010)

Bromelia balansae

Brasil Raízes, folhas

e frutos

Campferol-3-O-α-

L-

ramnopiranosídeo

Flavonoide ___ Cromatografia em

coluna com Sephadex

LH-20, HPLC, RMN

Coelho et al. (2010)

(Continua)

34

(Continuação) Bromelia balansae


e frutos

Campferol 3-O-α-

L-ramnopiranosil-

(1 → 6) -β-D-

glucopiranosídeo


coluna com Sephadex

LH-20, HPLC, RMN.


Bromelia balansae


e frutos

Quercetina-3-O-α-

L-ramnopiranosil-

(1 → 6) -β-D-

glicopiranosídeo


coluna com Sephadex

LH-20, HPLC, RMN.


Bromelia balansae


e frutos

Campferol-3,7-di-

O-α-L-

ramnopiranosídeo


coluna com Sephadex

LH-20, HPLC, RMN.



35

3.2. Considerações sobre o gênero Bromelia

O gênero Bromelia, pertencente à família Bromeliaceae, é representado por

46 espécies (REFLORA, 2014) agrupadas em três subgêneros: Distiacanthus,

Karatas e Bromelia (Mez 1891), sendo um dos mais comuns presentes na Caatinga

(INARA et al., 2005). Algumas espécies desse gênero são usadas na medicina

tradicional como vermífugo, anti-helmíntico, diurético, em casos de problemas

respiratórios e renais, desordens intestinais, diabetes, entre outros (FILHO, 2007).

Dois centros de diversidade podem ser reconhecidos para o gênero Bromelia,

o primeiro na América Central, estendendo-se aos Andes; e o segundo no Escudo

Brasileiro, principalmente no Domínio do Cerrado, onde a maioria é encontrada

(BENZING, 2000).

As espécies pertencentes ao gênero Bromelia podem ser reconhecidas por

suas folhas com espinhos curvos ao longo das margens, bainhas cobertas com

escalas lineares finas, pétalas carnudas unidas dentro de um tubo por filamentos,

falta de apêndices nas pétalas que apresentam coloração de róseas a vermelhas ou

de lilases a roxas e sementes nuas achatadas (SMITH; DOWNS, 1979).

Várias espécies do gênero Bromelia vêm sendo estudadas no que diz

respeito aos seus constituintes químicos e a sua atividade farmacológica. Em um

estudo realizado por Camacho-Hernandez et al. (2002) foi avaliada a atividade

antifúngica de extratos metanólicos de polpa de Bromelia pinguin contra várias

linhagens de fungos. Os resultados dessa pesquisa demonstrou atividade

significativa contra estirpes de Trichophyton spp. e Paecillomyces variotii. Com

relação à atividade biológica, o extrato metanólico dos frutos maduros de Bromelia

balansae mostraram uma atividade moderada em um ensaio in vitro de microplaca

com resazurina contra Mycobacterium tuberculosis com uma concentração inibitória

mínima de 128 µg/mL (COELHO et al., 2010). Estudos realizados com espécies do

gênero revelaram atividade citotóxica e antioxidante (GERAN et al., 1972; MANETTI

et al., 2010), atividade espasmódica, antiparasitária e atividade citotóxica (GERAN et

al., 1972; PAYROL e MARTINEZ, 2000; RAFFAUF et al., 1981).

Com relação aos constituintes químicos, o gênero Bromelia ainda não foi bem

investigado, porém alguns estudos relataram a presença de flavonoides, diterpenos,

compostos fenólicos e nitrogenados. Em um estudo fitoquímico realizado por Parada

et al. (1995) com frutos da espécie Bromelia plumieri, foi possível o isolamento do

36

composto nitrogenado antranilato de 1-O-β-D-glucopiranosila. O composto fenólico

3,4-dimetoxifenil-β-D-glucopiranosídeo foi também isolado dessa mesma espécie em

um estudo conduzido por Herraiz e Galisteo (2003).

Flavonoides também são constituintes que já foram identificados em

espécies desse gênero. Em um estudo realizado por Raffauf et al. (1981) com as

raízes e o caule basal de Bromelia pinguin, os flavonoides penduletina e cirsimaritina

foram isolados a partir da fração solúvel em carbonato de sódio do extrato

metanólico. Nesse mesmo estudo o flavonoide casticina foi isolado a partir da fração

não ácida. No primeiro estudo químico relatado na literatura com a espécie Bromelia

balansae foram isolados os seguintes flavonoides: campferol-3-O-α-L-

ramnopiranosídeo, campferol-3-O-α-L-ramnopiranosil-(1->6)-β-D-glucopiranosídeo,

quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosil-(1->6)-β-D-glucopiranosídeo e o campferol-3,7-di-

O-α-L-ramnopiranosídeo a partir do extrato metanólico dos frutos maduros (COELHO

et al., 2010).

Poucos diterpenos já foram descritos na família Bromeliaceae, porém esses

compostos foram isolados em espécies do gênero Bromelia. Dois filocladanos

oxigenados (Quadro 3 pág. 37) foram isolados de Bromelia pinguin que são

constituintes descritos como raros na natureza (RAFFAUF et al., 1981).

37

Quadro 3 - Metabólitos secundários isolados do gênero Bromelia.

CLASSE DE

METABÓLITO

COMPOSTOS/

REFERÊNCIA

ESTRUTURAS

Composto

nitrogenado

Antranilato de 1-O-β-D-

glucopiranosila

(PARADA et al., 1995).

O

NH2

O

O

OH

OHOH

HO

Flavonoide

Penduletina (RAFFAUF

et al., 1981). OH3CO

H3CO

OH O

OCH3

OH

Cirsimaritina (RAFFAUF

et al., 1981). OH3CO

H3CO

OH O

H

OH

Casticina (RAFFAUF et

al., 1981).

OH3CO

H3CO

OH O

OCH3

OCH3

OH

Campferol-3-O-α-L-

ramnopiranosil

(COELHO et al., 2010). OHO

OH O

ORha

OH

H

38

CLASSE DE

METABÓLITO

COMPOSTOS/

REFERÊNCIA

ESTRUTURAS

Flavonoide

Campferol-3-O-α-L-

ramnopiranosil-(1->6)-β-

D-glucopiranosídeo

(COELHO et al., 2010).

OHO

OH O

OGlc-Rha

OH

H

Quercetina-3-O-α-L-

ramnopiranosil-(1-> 6)-β-

D-glucopiranosídeo

(COELHO et al., 2010).

OHO

OH O

OGlc-Rha

OH

OH

Campferol-3,7-di-O-α-L-

ramnopiranosídeo

(COELHO et al., 2010). ORha

OH O

ORha

OH

H

Diterpeno

3-oxopimar-15-ene-

7β,8β-diol (RAFFAUF et

al.,1981).

OH

OH

O

H

H

3-oxofilocladan-16-α -ol

(RAFFAUF et al.,1981).

O

H

OH

Filocladano-16α,19-diol

(RAFFAUF et al.,1981).

HOH

OH


39

3.3. Considerações sobre a espécie Bromelia laciniosa

Bromelia laciniosa Mart. ex Shult. é uma espécie pertencente à família

Bromeliaceae, conhecida popularmente como “macambira”, “macambira de porco” e

“macambira de cachorro”, que está presente nas áreas secas do Nordeste, desde a

Bahia até o Piauí. Essa planta é rica em amido (63,10%) e é utilizada na

alimentação do homem e animais nos longos períodos de seca, na região do

Semiárido nordestino (ANGELIM et al., 2007; BESSA, 1982).

Figura 1- Distribuição fitogeográfica de B. laciniosa.

Fonte: Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/reflora/listaBrasil.

Essa é uma espécie representante do gênero Bromelia nativa da Caatinga

brasileira. As suas características principais são a presença de um caule com um

formato cilíndrico, folhas com presença de espinhos, formada por duas partes

distintas (dilatada e base da lâmina distribuída em torno do caule), sendo dispostos

sob a forma de rosetas, que se acumula água e finas raízes do tipo fasciculadas.

Devido a esta característica presente em suas raízes, B. laciniosa pode ser usado

para combater a erosão (ANGELIM et al., 2007; DUTRA; TEÓFILO; FILHO, 2010).

40

B. laciniosa é uma espécie que pouco se tem referências, entretanto, suas

principais indicações terapêuticas são para o tratamento da cólica infantil, diarreia,

febre, icterícia, caspa e hepatite (ALBUQUERQUE et al., 2007).

Com relação à atividade farmacológica da espécie B. laciniosa, o único

estudo relatado na literatura constatou a sua propriedade antinociceptiva. Esse

estudo foi realizado com o extrato etanólico (Bl-EtOH) dessa espécie utilizando

modelos térmicos (placa quente) e químicos (contorção e formalina). Neste mesmo

trabalho também foi investigada a toxicidade aguda do extrato, que não apresentou

efeitos tóxicos quando administrado em dose única (LIMA-SARAIVA et al., 2014).

No que se refere à composição química da espécie, a única investigação

química relatada na literatura revelou o isolamento de um flavonoide derivado da

quercetina. Nessa pesquisa, foi realizado um estudo fitoquímico utilizando

cromatografia em coluna (CC) com sílica gel, com a fração clorofórmica do extrato

das folhas de B. laciniosa. Esse estudo levou à elucidação da estrutura do primeiro

flavonoide isolado nesta espécie, denominado 5,7-di-hidroxi-3,3',4'-trimetoxiflavona

(OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2014), cuja fórmula estrutural está representada na figura

23 pág. 100.

3.4. Considerações sobre atividade antimicrobiana

Antibióticos são substâncias químicas naturais ou sintéticas capazes de inibir

o crescimento ou causar a morte de bactérias ou fungos. Essas substâncias podem

ser classificadas como bactericidas, quando causam a morte da bactéria, ou

bacteriostáticas, quando promovem a inibição do crescimento microbiano

(GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010).

Com a invenção do microscópio, as bactérias foram identificadas pela

primeira vez por Van Leeuwenhoek em meados de 1670, microbiologista holandês

que provocou uma verdadeira revolução na concepção do microscópio. Entretanto, a

caracterização desses organismos como possíveis causadores de processos

infecciosos começou a fazer sentido após os experimentos de Louis Pasteur, que

revelou que algumas linhagens de bactérias eram essenciais no processo de

fermentação e que esses microrganismos eram abundantes no meio ambiente

(GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010).

41

Com o passar dos anos, após o entendimento de que as bactérias eram

causadoras de doenças, naturalmente a pesquisa conduzida na busca de agentes

químicos que apresentassem atividade antibiótica se intensificou. Esses estudos

começaram desde muito cedo, em 1910, Ehrlich desenvolveu o primeiro antibiótico

de origem sintética, conhecido como salvarsan que era usado contra sífilis.

Entretanto, o grande marco no tratamento das infecções bacterianas veio com a

descoberta da penicilina, pelo médico inglês Alexander Fleming, em 1928, depois de

constatar que fungos eram capazes de produzir substâncias capazes de causar a

morte bacteriana. Apesar da descoberta, a penicilina só foi introduzida como agente

terapêutico nos anos 1940, época em que houve um acelerado crescimento no

desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos. Nesse período também houve

o surgimento de vários antibióticos que foram desenvolvidos por meio da triagem de

produtos naturais, tais como: β-lactâmicos, aminoglicosídeos, tetraciclinas,

macrolídeos, peptídeos, entre outros (GUIMARÃES, MOMESSO; PUPO, 2010).

A administração de antibióticos tem como objetivo a eliminação ou

impedimento do crescimento do agente infeccioso sem danos ao hospedeiro. Essa

ação pode ocorrer através de vários mecanismos, tais como: a) interferência na

síntese da parede celular do microrganismo, comprometendo os peptidoglicanos

estruturais, por exemplo, penicilinas, cefalosporinas, a vancomicina e a bacitracina,

b) comprometimento na síntese de proteínas bacterianas: os aminoglicosídeos, as

tetraciclinas, a eritromicina, entre outros e c) inibição da síntese de ácidos nucléicos:

o metronidazol, as quinolonas, a rifampicina, as sulfonamidas e trimetoprima

(NICOLLINI et al., 2008).

O uso desenfreado de antibióticos sem uma cuidadosa avaliação das suas

indicações apropriadas pode levar a mutação seletiva dos microrganismos levando

ao desenvolvimento de cepas resistentes. A perda de eficiência em relação a

patógenos comuns não só levou a uma mudança para medicamentos antibióticos

mais caros em países de alta renda, mas também a um aumento da morbidade e

mortalidade em países de baixa renda e de renda média, onde se restringe ao uso

de medicamentos de segunda linha. Os microrganismos resistentes a

antimicrobianos estão causando Infecções com uma frequência cada vez maior,

dessa forma, esses fármacos estão se mostrando cada vez menos eficazes em

tratamentos contra um amplo spectro de infecções bacterianas até então comuns

(NICOLLINI et al., 2008; VAN BOECKEL et al., 2014). Em um estudo realizado por

42

Thomas Van Boeckel et al. (2014), foi examinado as vendas de 16 classes de

antibióticos entre 2000 e 2010 em 71 países com o uso dos dados obtidos na base

de dados IMS Health MIDAS (IMS Health, Danbury, CT, EUA). Nesse estudo, foi

constatado que as vendas de antibióticos aumentaram em cerca de 36%, com os

maiores aumentos ocorrendo em países de baixa renda, onde os antibióticos podem

ser acessados sem receita médica. Esse é o principal fato que vem resultando na

grande resistência de populações bacterianas.

Plantas, fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias são fontes

importantes de substâncias biologicamente ativas (BARREIRO, 2009). Entretanto, o

uso de plantas medicinais é a principal prática utilizada pelo homem para o

tratamento de uma ampla variedade de doenças, oferecendo as melhores

possibilidades de encontrar substâncias de interesse terapêutico (CRAGG;

NEWMAN, 2013). Os produtos naturais, no geral, têm sido uma fonte

particularmente rica de agentes anti-infecciosos, tendo como exemplo histórico as

penicilinas em 1940, as tetraciclinas em 1948 e os glicopeptídeos em 1955

(NICOLLINI et al., 2008). Estima-se que aproximadamente 80% dos antibióticos

utilizados na clínica são diretamente (ou indiretamente) derivadas de produtos

naturais (ROEMER et al., 2011).

A resistência bacteriana conferida pelo uso indiscriminado dos fármacos

atrelados à diminuição de novas substâncias antimicrobianas sintéticas são

situações que tem estimulado os cientistas à busca de novas drogas (MAREGESI et

al., 2008; SILVA et al., 2009). Esse fato vem contribuindo para o aumento da

utilização de produtos naturais, principalmente os extratos vegetais.

Os vegetais são uma excelente fonte de busca de novas drogas

antimicrobianas estando assim em destaque como produto natural mais investigado,

principalmente devido ao conhecimento popular e pelas suas propriedades. Além

disso, a diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela

derivada dos processos de síntese química (COSTA et al., 2003).

Estudos sobre as atividades antimicrobianas de extratos vegetais de plantas

nativas são bastante relatados em países como o Brasil que possuem uma flora

diversificada e uma rica tradição na utilização de plantas medicinais para uso como

antibacterianos ou antifúngicos. A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é

avaliada através da determinação de uma pequena quantidade da substância

necessária para inibir o crescimento do microrganismo teste; esse valor é conhecido

43

como Concentração Inibitória Mínima (CIM). Um aspecto bastante relevante na

determinação da CIM de extratos vegetais é a preocupação em relação aos

aspectos toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais

ou suas combinações. Esses testes são realizados com óleos essenciais, extratos

etanólicos brutos, frações e também com compostos isolados (DUARTE, 2006;

SANTOS, 2015).

3.5. Considerações sobre técnicas hifenadas

O acoplamento de um sistema de separação cromatográfica a um detector

espectroscópico ou espectrométrico a fim de se obter informações estruturais de

metabólitos o qual se tem interesse a partir de misturas, é certamente bastante útil e

vantajoso. Ao acoplamento entre essas técnicas, utiliza-se o termo “técnica

hifenada”. Esse acoplamento combina as vantagens da cromatografia (produção de

frações puras ou quase puras de componentes químicos numa mistura) com as

vantagens da espectrometria de massas (informações seletivas para identificação

estrutural usando padrões ou espectros de bibliotecas), podendo, dessa forma,

explorar as vantagens de ambos (DIAS; URBAN; ROESSNER, 2012; CHIARADIA;

COLLINS; JARDIM, 2008; CROTI et al., 2006; PATEL et al., 2010).

As técnicas hifenizadas têm recebido uma atenção cada vez maior como

principal meio de resolver problemas analíticos complexos. O poder de combinar

tecnologias de separação com técnicas espectroscópicas têm sido demonstrado ao

longo dos anos tanto para a análise quantitativa como qualitativa de compostos

desconhecidos em extratos ou frações de produtos naturais complexos. Geralmente

se combinam um método de separação como a cromatografia em fase gasosa (GC)

e cromatografia líquida (LC), com uma técnica de identificação estrutural como a

espectrometria de massas (MS), espectroscopia ultravioleta-visível ou ressonância

magnética nuclear (RMN). A cromatografia e a espectroscopia são as técnicas

analíticas químicas mais utilizadas na análise de plantas medicinais (DIAS; URBAN;

ROESSNER, 2012; DIAS-JR et al., 2012; MARTSON; HOSTETTMANN, 2009;

PATEL et al., 2010).

Quando comparadas com as técnicas espectroscópicas sem hifenação, as

técnicas hifenadas apresentam vantagens que estão diretamente ligadas ao fato de

não necessitar de uma grande quantidade do analito na sua forma purificada, o que

44

acontece com as técnicas sem hifenação (RODRIGUES et al., 2006). No Quadro 4 é

possível observar a lista das principais técnicas hifenadas adotadas, assim como

suas características e aplicações.

Quadro 4 - Aplicações de técnicas hifenadas na área de plantas medicinais.

Técnicas

hifenadas

Características Exemplos de aplicação na

área de

plantas medicinais

GC-MS Identificação de compostos.

Fornece informação estrutural da

molécula.

Permite comparação com bibliotecas

espectrais.

Estudo da sazonalidade de

algumas classes de metabólitos

secundários, caracterização de

aromas, identificação de

terpenóides.

Análise de flavonoides.

GC-MS-MS Confirmação estrutural de moléculas. Análise de fragrâncias.

LC-DAD Identificação de compostos conhecidos,

através da comparação do tempo de

retenção e espectro UV com o padrão

analítico. Não fornece informação

estrutural.

Análise de flavonoides.

Controle de qualidade de

plantas medicinais, busca de

metabólitos ativos, estudos de

ecologia química e

quimiossistemáticos.

LC-MS Raramente resulta na identificação

definitiva. Muitas vezes acoplado com

LC-DAD para fornecer informações

estruturais complementares.

Análise de antocianinas.

LC-MS-MS Determinação de novos compostos, com

a incrível vantagem da simplicidade no

preparo da amostra e rapidez na

obtenção dos resultados.

Determinação de flavonoides e

Saponinas.

LC-NMR Fornece informações estruturais

(espectro 1H-NMR). Constitui-se a

técnica mais poderosa na determinação

estrutural de substâncias inéditas com

novos esqueletos e em misturas

biologicamente ativas.

Determinação de alcaloides e

flavonoides.

Fonte: (RODRIGUES et al., 2006)

45

A cromatografia gasosa foi a primeira técnica a ser acoplada com o detector

de massas, por causa da facilidade do manuseio do efluente gasoso do

cromatógrafo. Além disso, foi a primeira de seu tipo a se tornar útil para fins de

pesquisa e desenvolvimento. As características de funcionamento do cromatógrafo a

gás são compatíveis com a necessidade de alto vácuo do espectrômetro de massas,

pois ao se utilizar colunas capilares em CG é possível conectar a saída da coluna

diretamente à fonte do espectrômetro, de modo que, em condições normais de

funcionamento, o sistema de bombeamento do espectrômetro de massas seja capaz

de captar todo o eluente da coluna. Dessa forma, os compostos que são voláteis,

pequenos e estáveis à altas temperaturas podem ser facilmente analisados por CG-

EM. Os espectros de massas obtidos por esta técnica hifenada oferecem

informações estruturais baseadas na interpretação das fragmentações. Os íons

fragmentos podem então ser comparados com os espectros da biblioteca

(CHIARADIA; COLLINS; JARDIM, 2008; PATEL et al., 2010; RODRIGUES et al.,

2006).

Os métodos de ionização mais aplicados em CG-EM são os métodos por

ionização por impacto de elétrons - IE e ionização química - IQ. No entanto, em

sistemas modernos de CG-EM, podem ser utilizados outros tipos que permitem a

identificação de íons moleculares. Por exemplo, a espectrometria de massas

ortogonal TOF acoplada com GC é utilizada para confirmação da pureza e

identidade dos componentes medindo a massa exata e calculando a composição

elementar. O CG-EM geralmente é integrado com várias bases de dados MS on-line

para vários compostos de referência que podem ser úteis para a comparação de

espectros para a identificação de componentes (CHIARADIA; COLLINS; JARDIM,

2008; PATEL et al., 2010).

Uma outra técnica comumente acoplada à espectrometria de massas é a

cromatografia líquida de alta eficiência - “high performance liquid chromatography” -

HPLC. Porém, no acoplamento de LC-MS, existem três problemas gerais: a

quantidade de efluente da coluna que tem que ser introduzido no sistema de vácuo

do MS, pois geralmente em HPLC as vazões são consideradas grandes para o

espectrômetro de massas, a composição dos eluentes e os tipos de compostos a

serem analisados que são relativamente pouco voláteis, não sendo possível ionizá-

46

los utilizando as técnicas de ionização que são aplicadas na espectrometria de

massas. Então, para a resolução dos problemas envolvendo o acoplamento das

duas técnicas foram desenvolvidas novas fontes de ionização, as quais são capazes

de combinar duas características em um mesmo sistema além de facilitar a

transferência da amostra que sai da coluna para a fase gasosa, como: a ionização

por electrospray (ESI), a ionização química à pressão atmosférica (IQPA) e a

Ionização por fótons à pressão atmosférica. Todas elas operam à pressão

atmosférica e a mais empregada é a ionização por eletronebulização ou electrospray

(LANÇAS, 2009; MARTSON; HOSTETTMANN, 2009).

Em espectrometria de massas em tandem (MS/MS) são utilizados estágios de

espectrometria de massas. Dessa forma, um íon do primeiro estágio de MS é

selecionado e ativado para produzir íons fragmentos, que são então analisados na

segunda fase de MS, estabelecendo uma relação entre ele e outros íons gerados

pela fragmentação. Nesse processo, o método de ativação iônica mais empregada é

a dissociação induzida pela colisão (CID), que promove a colisão controlada por

energia de um gás quimicamente inerte (Ar, He, N2 ou CO2) com o íon precursor. A

energia de colisão tem por função aperfeiçoar o espectro MS/MS, sendo que baixos

valores de energia de colisão induz à fragmentação suave produzindo poucos

fragmentos, enquanto a alta energia de colisão promove fragmentação extensa.

Desse modo, os íons de fragmentos produzidos podem ser usados para obter

informações estruturais. Porém, ao se utilizar valores moderados de energia de

colisão podem ser obtidas informações estruturais importantes e comparações com

bibliotecas espectrais podem ser feitas (DIAS-JÚNIOR; MELO; CROTTI, 2012).

Após o processo de ionização, íons do analito são direcionados para o

analisador de massas que os separam de acordo com a relação existente entre suas

massas e cargas, ou seja, a razão m/z. Existem diferentes tipos de analisadores de

massas, porém, os mais utilizados são os analisadores de massas do tipo

Quadrupolo, “Time-of-Flight” (Tempo de Vôo) e “Ion Trap”, os quais diferem entre si

apresentando seus benefícios e limitações dependendo da aplicação (LANÇAS,

2009).

Sendo assim, a cromatografia combinada a diferentes sistemas de detecção,

trata-se ainda de uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor

desempenho no estudo da química de produtos naturais.

47

3.6. Considerações sobre flavonoides

Flavonoides são compostos polifenólicos biossintetizados a partir da via dos

fenilpropanoides e do acetato, precursores de vários grupos de substâncias como

aminoácidos alifáticos, terpenóides, ácidos graxos, dentre outros (DORNAS et al.,

2008). Eles podem apresentar múltiplos efeitos biológicos como propriedades

antioxidantes, antiviral, antibacteriano e anti-inflamatório (PROCHÁZKOVÁ;

WILHELMOVÁ, 2011).

A característica estrutural básica dos compostos flavonoides é o núcleo 2-

fenil-benzo[α]pirano ou flavano, o qual consiste em dois anéis benzeno (A e B)

combinados com um anel de pirano (C) contendo oxigênio, conforme mostrado na

figura 2 (CUSHINE; LAMB, 2005).

Figura 2 - Estrutura básica dos flavonoides, com anéis nomeados e posições numeradas.

O

O

2

3

45

6

7

8

2'

3'

4'

5'

6'

Fonte: (CUSHINE; LAMB, 2005).

Os flavonoides podem ser divididos em seis classes principais (flavonóis,

flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavonóis e antocianidinas) com base nas

diferenças na sua estrutura molecular. A diversidade estrutural em cada família de

flavonoides resulta dos vários padrões de hidroxilação, metoxilação e glicosilação da

substituição do anel, proporcionando a formação de mais de 8.000 compostos

flavonoides, que são agrupados nas classes (Figura 3 pág. 49) (AMIC et al., 2007;

GONZALES et al., 2015; PATEL, 2008; SILVA et al., 2015).

Os flavonoides são constituintes fundamentais para o equilíbrio e

sobrevivência das plantas. Eles estão envolvidos em sua sobrevivência fisiológica,

protegendo-a de agentes externos bióticos e abióticos, como por exemplo,

48

patógenos fúngicos e radiação UV-B. Além disso, eles também agem na

fotossensibilização, como também em funções como transferência de energia, ações

de hormônios de crescimento e reguladores de crescimento, controle da respiração

e fotossíntese, morfogênese e determinação do sexo. Os flavonoides também foram

associados a funções protetoras durante o estresse de seca, assim como a

sobrevivência em solos ricos em metais tóxicos como o alumínio (CUSHINE; LAMB,

2005; TREUTTER, 2006).

49

Figura 3 - Representação estrutural das principais subclasses de flavonoides.

Fonte: (AMIC et al., 2007).

50

Os flavonoides são constituintes bastante reportados por possuir atividade

antimicrobiana contra uma vasta gama de agentes patogênicos. Um exemplo

clássico é o própolis que apresenta potentes propriedades antimicrobianas, as quais,

têm sido atribuídas ao seu alto teor de flavonoides, particularmente os flavonoides

galangina e pinocembrina (CUSHNE et al., 2006; GRANGE; DAVEY, 1990).

Em uma pesquisa realizada por Koo et al. (2002), compostos fenólicos como

flavonoides e derivados do ácido cinâmico foram testados com relação à atividade

antibacteriana. Neste estudo foi demostrado que flavonas e flavonóis foram

inibidores potentes da atividade de glucosiltransferases produzidas por Steptococcus

mutans, resultando em efeito antibacteriano contra essa espécie. Além disso, vários

outros estudos relatados na literatura já associaram a sua atividade antimicrobiana

aos flavonoides (CUSHNE et al., 2006; MORI et al., 1987; PROESTOS et al., 2005).

Dentre eles, estão incluídos flavonoides pertencentes à classe das flavonas (ZENG

et al., 1995). Em um estudo realizado por Rauha et al. (2000), flavonoides como

flavonas foram testado contra 9 cepas microbianas. O resultado mostrou que a

flavona apresentou atividade contra a maioria dos organismos testados. Ela foi ativa

contra as cepas de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Bacillus

subtilis, Microccocus luteus e Escherichia coli, além de forte atividade contra o fungo

Saccharomyces cerevisiae mostrando que esses constituintes podem vir a ser

bastante eficazes para o tratamento de infecções.

3.7. Considerações sobre esteroides

Os esteróis são uma subclasse dos terpenoides que apresenta uma estrutura

básica formada por quatro anéis ligados entre si, compostos por átomos de carbono.

Esses anéis caracterizam o núcleo tetracíclico esteroidal C-27 típico desses

constituintes, como pode ser visualizado na figura 4 pág. 51. São moléculas

hidrofóbicas e apresentam estrutura química similar ao do colesterol, entretanto

esses constituintes são sintetizados por plantas em vez de mamíferos. O anel de

esterol é comum a todos os esteróis, as diferenças estão nas cadeias laterais

(SIMÕES et al., 2010).

51

Figura 4 - Estrutura básica dos esteroides.

Fonte: (SIMÕES et al., 2010).

Os esteroides vegetais são componentes essenciais da membrana celular de

plantas, sendo encontrados em óleos vegetais, sementes e frutas. Em sua forma

livre apresentam funções na estabilização da bicamada lipídica de fosfolipídios, além

disso, apresentam ação como reguladores de crescimento ou seus precussores.

Vários desses compostos já foram identificados em plantas, entretanto, o beta-

sitosterol (especialmente), campesterol e estigmasterol são os mais abundantes

(LAW, 2000; YANKAH, 2006).

Bioenergeticamente, os esteroides podem ser considerados metabólitos de

triterpenos, uma vez que se originam do cicloartenol, com a perda de três grupos

metoxilas. Formam-se via pirofosfato de isopentenila originando o óxido de

esqualeno que cicliza numa conformação cadeira-barco-cadeira-barco formando o

cicloartenol em algas e plantas verdes, ou o lanosterol em fungos e organismos não

fotossintéticos (Figura 5, pág. 52) (SIMÕES et al., 2010).

52

Figura 5 - Formação de triterpenos e esteroides em plantas.

Fonte: (SIMÕES et al., 2010).

53

Os fitosteróis são bastante conhecidos por apesentarem a habilidade de

reduzir os níveis de colesterol. Eles podem trabalhar de diversas formas, como por

exemplo, podemos citar a ação do campesterol, sitosterol e estigmasterol que são

os principais fitosteóis encontrado em plantas, que agem na diminuição da absorção

de colesterol no intestino delgado por um mecanismo de competição, com

consequente aumento na excreção (RODRIGUES et al., 2004). Esses constituintes

também podem apresentar atividade anticâncer (WOYENGO; RAMPRASATH;

JONES, 2009), antimicrobiana (SEN et al., 2012), anti-diabética e antioxidante

(GUPTA et al., 2011; KAREN et al., 2012), anti-inflamatória (PANIAGUA-PÉREZ et

al., 2008), entre outros.

3.8. Considerações sobre desreplicação por Networking Molecular

O processo de desreplicação fornece uma rápida identificação de metabólitos

conhecidos em misturas biológicas complexas usando pequenas quantidades de

material, agilizando assim a descoberta de novos produtos naturais e evitando

longos procedimentos de isolamento. Os processos de desreplicação combinam

tipicamente os métodos cromatográficos como LC-UV, LC-MS, LC-MS/MS e CG-EM

e espectroscópicos, com a pesquisa em bases de dados, tais como: o dicionário de

Produtos Naturais de Chapman & Hall e a base de dados de metabólitos METLIN e

PubChem (DE OLIVEIRA et al., 2016; NIELSEN et al., 2011).

A desreplicação utiliza características físico-químicas ortogonais, por

exemplo, perfis UV-Vis, tempos de retenção cromatográficos, peso molecular e

mudanças químicas de RMN ou propriedades biológicas, para confirmar a

identificação metabólica. Porém, apesar desses métodos terem sido bastante

eficientes para a identificação rápida de compostos em misturas, eles apresentam

limitações analíticas que estão relacionadas principalmente com os limites de

detecção e falta de resolução cromatográfica ou a necessidade de dados

confirmatórios adicionais, tais como MS/MS e RMN, além de ter que lidar com a

análise manual de uma grande quantidade de dados (DE OLIVEIRA et al., 2016;

NETO et al., 2016).

No entanto, recentemente abordagens bioinformáticas foram desenvolvidas

para organizar e interpretar dados de MS/MS, como por exemplo, as eficientes redes

54

moleculares ou “networking molecular (NM)”, os quais podem proporcionar um

método rápido e sensível para visualizar simultaneamente a composição química de

extratos de plantas, sem a trabalhosa extração de dados (DE OLIVEIRA et al., 2016;

NETO et al., 2016).

As redes moleculares são particularmente eficazes em organizar grandes

conjuntos de dados de espectrometria de massas em tandem, com base na

similaridade entre os padrões de fragmentação de íons precursores relacionados e

comparação dos espectros MS/MS agrupados com as bases de dados. Elas

comparam os espectros MS/MS de um extrato ou conjunto de extratos e os agrupa

de acordo com a sua similaridade. Uma vez que o espectro de MS/MS está

relacionado à estrutura química dos metabólitos fragmentados, o networking

molecular é capaz de agrupar moléculas dentro de uma rede de acordo com as suas

semelhanças estruturais. As redes formadas permitem a visualização simultânea de

moléculas idênticas e análogas, agilizando a localização de metabólitos conhecidos

por comparação com uma base de dados de produtos naturais e também a

identificação de análogos baseado em estudos de fragmentação (ALARD et al.,

2016; DE OLIVEIRA et al., 2016; YANG et al., 2013).

A implementação de redes moleculares obedece à aplicação de três etapas

fundamentais: primeiro obtém-se os espectros MS/MS de amostras que podem ter

diferentes graus de complexidade e posteriormente gera-se uma rede molecular

utilizando esses espectros por meio de “similaridade de cosseno”, o qual mede a

relação dos espectros de MS/MS. Essas relações podem então ser visualizadas

utilizando uma ferramenta chamada Cytoscape que se trata de um software que

permite a visualização de correlações de grandes conjuntos de dados (SHANNON et

al., 2013; YANG et al., 2013). Cada “nó” representa um espectro de consenso

MS/MS, o qual é uma fusão de espectros MS/MS que apresentam o padrão de

massa e pico do precussor praticamente idêntico. Cada nó é marcado com a massa

do precussor (YANG et al., 2013). Na figura 6, pág. 55, é possível observar as

etapas de implementação do networking molecular.

55

Figura 6 - Etapas para a implementação do networking molecular.

Fonte: (YANG et al., 2013).

Dessa forma, redes moleculares proporcionaram uma forma inovadora de

navegar no metaboloma de amostras biológicas, apresentando uma incrível

capacidade de classificar dados de espectrometria de massas em tadem (ALARD et

al., 2016).

56

4. PARTE EXPERIMENTAL

57

4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Coleta e identificação botânica

As folhas de Bromelia laciniosa Mart. ex Schult. f. (Bromeliaceae) foram

coletadas na localidade de Lagoa dos Cavalos, coordenadas [08° 59' 16.90" S e 40°

35' 20.60" W], no município de Petrolina-PE em maio de 2015. A identificação

botânica se deu por comparação da amostra coletada com uma exsicata da espécie

depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na Universidade Federal do

Vale do São Francisco, com número de tombo 9568 (Figura 7).

Figura 7 - Exsicata da espécie B. laciniosa depositada no Herbário da Universidade Federal do Vale do São Francisco.

Fonte: J.A. SIQUEIRA FILHO, 2012.

58

4.2. Processamento do material botânico

As folhas foram submetidas à secagem em estufa com ar circulante à

temperatura média de 40 ºC durante 15 dias. Em seguida o material foi pulverizado

em moinho de facas, obtendo-se uma amostra de droga vegetal seca e pulverizada

cujo peso foi de 909 g.

4.3. Preparação e fracionamento do extrato etanólico bruto

O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva

utilizando etanol 95% em um recipiente de aço inoxidável. Foram realizadas quatro

extrações, substituindo o solvente a cada 72 h até completo esgotamento da droga.

A solução extrativa obtida passou por um processo de destilação do solvente em

evaporador rotativo à pressão reduzida a uma temperatura média de 50 ºC. Após a

finalização do processo de evaporação do solvente obteve-se o extrato etanólico

bruto (EEB) cujo peso foi 57,53 g. Uma pequena porção do EEB foi separada para

realização da atividade biológica (7,55 g) e a outra para a avaliação fitoquímica

preliminar. O restante foi particionado através de cromatografia líquido-líquido

utilizando solventes em gradiente crescente de polaridade (éter de petróleo,

clorofórmio e acetato de etila).

O EEB foi solubilizado com uma mistura de MeOH:H2O (3:7) e em seguida,

fracionado com os solventes éter de petróleo, clorofórmio e acetato de etila, em

ordem crescente de polaridade, obtendo-se após evaporação do solvente três fases:

éter de petróleo (Bl-EP), clorofórmica (Bl-CHCl3) e acetato de etila (Bl-AcOEt). A

figura 8 pág 59 detalha este procedimento.

59

Figura 8 - Fluxograma demonstrando a obtenção do Bl-EEB e seu fracionamento a partir das folhas de B. laciniosa.

Fonte: Autoria própria. 4.4. Métodos de análise

4.4.1. Métodos cromatográficos

Para cromatografia de adsorção em coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60 (70-

230 mesh, ASTM) de partículas com dimensões entre 0,063-0,200 mm (MERCK). O

comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as quantidades das

amostras e as quantidades de sílica a serem utilizadas. Para cromatografia em

camada delgada (CCD), foi usada sílica gel 60 PF254 (MERCK). As frações foram

monitoradas por Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) da Silicycle

TLC – Aluminum F254, sugerindo dessa forma a pureza da amostra quando

observada uma única mancha após revelação em câmara de irradiação ultravioleta

(254 e 366 nm), em placas eluídas em pelo menos três sistemas de solventes

60

distintos. Como fase móvel, foram utilizados isoladamente ou em misturas binárias

os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, em gradiente crescente

de polaridade.

4.4.2. Métodos espectrométricos

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H (RMN de 1H) e

Ressonância Magnética Nuclear de 13C (RMN de 13C) uni e bidimensionais foram

obtidos em espectrômetro Bruker NMR (DRX 500), operando na frequência do

hidrogênio a 100 MHz e na do carbono-13 a 400 MHz.

As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se uma pequena

quantidade das mesmas em solventes deuterados da CIL (Cambridge Isotopes

Laboratories) (CDCl3). Os deslocamentos químicos (δ) foram referenciados para

RMN de 1H pelos picos característicos dos hidrogênios pertencentes às frações não

deuteradas destes solventes em relação ao TMS: clorofórmio (δH = 7,24) e MeOD

(δH = 4,84 e 3,30). Para os espectros de RMN de 13C, em relação ao TMS foram

utilizados: clorofórmio (δC = 77,0) e MeOD (δC = 49,0). As multiplicidades das

bandas de RMN 1H foram indicadas segundo as convenções: s (singleto), d

(dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).

4.5. Triagem fitoquímica preliminar

A triagem fitoquímica preliminar teve por objetivo a identificação das classes

de metabólitos secundários presentes nos extratos vegetais. Este é um

procedimento rápido, realizado através de reagentes de coloração ou precipitação

que irão revelar ou não a presença de determinada classe de metabólitos

secundários em um extrato (WAGNER; BLADT, 1996). Este processo foi realizado

utilizando a técnica de cromatografia em camada delgada analítica (CCDA), no qual

foram utilizadas placas de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) com suporte

de alumínio com sílica gel como fase estacionária da Silicycle TLC – Aluminum F254.

Uma pequena amostra de cada extrato e fases solubilizados em solventes

ideais foi aplicada com o auxílio de um capilar de vidro em placas de CCD. Uma

mistura de solventes com uma proporção adequada para a análise de cada classe

investigada foi usada como fases móveis. Após a eluição, as placas foram reveladas

61

com reagentes específicos ou então analisadas em câmara UV nos comprimentos

de onda de 254 nm e 365 nm (BRAZ et al., 2012). Os sistemas de solventes

utilizados para cada classe de metabólitos investigadas e os seus reveladores estão

listados na tabela 1.

Tabela 1 - Eluentes e reveladores utilizados na identificação do perfil fitoquímico cromatográfico do extrato e fases de B. laciniosa.

Classe química Eluente Revelador

Alcaloides Tolueno:acetato de etila:dietilamina

(70:20:10)

Dragendorff

Cumarinas Tolueno:éter etílico

(1:1, saturado com ácido acético 10%)

KOH etanólico 10%

Derivados antracênicos Acetato de etila:metanol:água

(100:13,5:10)

KOH etanólico 10%

Flavonoides e taninos Acetato de etila:ácido fórmico:ácido

acético glacial:água

(100:11:11:26

NP-PEG

Lignanas Clorofórmio:metanol:água

(70:30:4)

Vanilina sulfúrica

Mono e diterpenos Tolueno:acetato de etila

(93:7)

Vanilina sulfúrica

Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico

(99:1)

KOH etanólico 10%

Triterpenos e

esteroides

Tolueno:clorofórmio:etanol

(40:40:10)

Lieberman-Burchard

Fonte: (WAGNER; BLADT, 1996).

4.6. Investigações dos constituintes químicos por técnicas cromatográficas

hifenadas

4.6.1. Análises por cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas

(CG-EM)

A fração éter de petróleo (Bl-EP) foi analisada através da técnica de

cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas (CG-EM). As

substâncias presentes na fração de éter de petróleo obtido a partir do extrato

62

etanólico bruto de B. laciniosa foram investigadas num aparelho Shimadzu QP-2010

CG-EM. Foram utilizadas as seguintes condições cromatográficas: coluna

Phenomenex ZB-5MS Zebron (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm); hélio (99,999%) como

gás transportador com uma taxa de fluxo constante de 1,1 mL/min; volume de

injeção de 1 mL; razão de separação do injetor de 1:40; temperatura do injetor de

240 °C; modo de impacto de elétrons a 70 eV; temperatura da fonte de íons de 280

°C. A temperatura do forno foi programada para 100 °C (isotérmica durante 5 min),

com um aumento de 10 °C/min até 250 °C (isotérmica durante 5 min) e 10 °C/min

até 280 °C (isotérmica durante 15 min). Uma mistura de hidrocarbonetos lineares

(C9H20-C40H82) foi injetado sob as mesmas condições experimentais que as

amostras e a identificação dos componentes foi efetuada por comparação dos

espectros de massa obtidos com aqueles de bancos de dados do equipamento

Wiley 7 lib e NIST 08 lib.

4.6.2. HPLC-IT-MS/MS

2,0 mg de cada amostra (Bl-EP), (Bl-CHCl3) e (Bl- AcOEt) foram dissolvidos

em 1,0 mL de ACN/H2O (1:1, v/v, 0,1% de ácido acético). Para a remoção de

moléculas não polares, cada solução foi purificada por extração em fase sólida

(SPE), utilizando cartuchos C18, previamente ativados com 5,0 mL de ACN e

equilibrados com 5,0 mL de ACN/H2O (1:1, v/v). As amostras resultantes foram

secas em atmosfera de N2 e dissolvidas a uma concentração final de 2 mg/mL,

filtradas através de um filtro GHP de 0,45 μm e injetadas no HPLC.

A análise de HPLC-IT-MS/MS foi realizada utilizando um UFLC (Shimadzu)

contendo duas bombas de solvente LC20AD, um auto amostrador SIL20AHT, um

forno de coluna CTO20A e um controlador de sistema CBM20A, acoplado com um

espectrômetro de massas “Ion Trap” (AmaZon SL). Os experimentos de LC foram

realizados utilizando uma coluna C18 (Phenomenex - 250 mm x 4,6 mm x 5 um) e o

seguinte gradiente de eluição: solvente A = H2O e ácido acético (0,1% v/v); Solvente

B = ACN e ácido acético (0,1% v/v); Perfil de eluição = 0,0 - 30,0 min (10 - 100% de

B); 30,0 - 40,0 min (100% de B); 40,0 - 45,0 min (100 - 10% de B); 45,0 - 60,0 min

(10% de B), forno de coluna à 35 °C, volume de injeção de 20 μL e taxa de fluxo de

1,0 mL/min. Os parâmetros de captação do Ion Trap foram os seguintes: capilar 3,5

63

kV, ESI nos modos positivo e negativo, offset da placa final 500 V, nebulizador 40

psi, gás seco (N2) com fluxo de 8 mL/min e temperatura de 300 ºC. A fragmentação

de CID foi conseguida no modo autoMS/MS utilizando o modo de resolução

avançada para o modo MS e UltraScan para aquisição de MS/MS. As possíveis

estruturas putativas foram propostas com base no padrão de fragmentação MS/MS.

Os espectros (m/z 50-1000) foram registados a cada 2 s.

4.7. Networking molecular

Os dados de HPLC-IT-MS/MS foram convertidos para o formato mzXML

diretamente a partir da Bruker DataAnalysis 4.2. Os arquivos de HPLC-IT foram

sujeitos a Spectral Networks, que inclui MS-Cluster, seguido de visualização em

Cytoscape 2.8.3 (SHANNON et al., 2003; WATROUS et al., 2012).

Resumidamente, os espectros de MS/MS foram convertidos em vetores

unitários e comparados por similaridade de cosseno. O algoritmo MS-Cluster foi

aplicado para combinar espectros da mesma molécula com massas parentais

semelhantes (0,5 Da) e pontuação de cosseno superior a 0,95. A rede de espectros

comparou todos os possíveis pares de vetores dos espectros de MS/MS,

considerando tolerância de massa para picos de fragmentos (0,5 Da), tolerância de

massa parental (1,0 Da), o número mínimo de picos correspondentes por

alinhamento espectral (3) e um escore de cosseno mínimo de 0,5. Quanto maior o

escore de cosseno entre dois espectros, mais semelhantes são os espectros de

MS/MS e mais semelhantes são as moléculas.

Após organizar os espectros com base na similaridade de fragmentações, os

dados foram importados para o Cytoscape e exibidos como uma rede de nós e

bordas. Para evitar interpretações errôneas de contaminantes ou ruído de HPLC, as

injeções em branco (fase móvel) foram introduzidas na rede de espectros como um

grupo de amostras distintas identificadas no Cytoscape e removidas da rede. A rede

foi organizada com o “layout” orgânico, as cores do nó foram mapeadas com base

nos arquivos de origem do MS/MS e o atributo de espessura da borda foi definido

para refletir as pontuações de similaridade de cosseno, com linhas mais espessas

indicando maior similaridade (SHANNON et al., 2003; WATROUS et al., 2012; YANG

et al., 2013).

64

4.8. Fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila (Bl-AcOEt)

A fase Bl-AcOEt (3,0 g) foi cromatografada em coluna utilizando sílica gel 60

como fase estacionária e como eluentes, hexano, clorofórmio, acetato de etila e

metanol, individualmente ou em misturas binárias, seguindo-se um gradiente

crescente de polaridade, conforme especificado na Tabela 2. Ao todo, foram

coletadas 181 frações de 100 mL cada e em seguida foram evaporadas em

evaporador rotativo a fim de reduzir o volume de solvente.

Tabela 2 - Dados do fracionamento cromatográfico de Bl-AcOEt.

Fração Sistema de solvente Proporção (%)

1-7 Hexano 100

8-18 Hexano:CHCl3 (90:10)

19-31 Hexano:CHCl3 (70:30)

32-46 Hexano:CHCl3 (50:50)

47-57 Hexano:CHCl3 (30:70)

58-74 CHCl3 100

75-90 CHCl3:AcOEt (90:10)

91-113 CHCl3:AcOEt (70:30)

114-125 CHCl3:AcOEt (50:50)

125-139 CHCl3:AcOEt (30:70)

140-161 AcOEt (100)

162-178 AcOEt:MeOH (5:95)

179-181 MeOH (100)


Durante a coleta das frações foi possível observar a formação de um

precipitado nas frações 87 e 94. Esses precipitados foram separados e lavados

sucessivas vezes com metanol. A fração 87 resultou em um sólido amorfo amarelo

(10 mg) e a fração 94 em um sólido amorfo branco (13 mg). Ambas as amostras

foram monitorada por CCDA, o qual acusou a pureza das amostras. As placas de

CCDA foram então reveladas por meio do borrifamento com o reagente PEG e a

formação de uma mancha amarela na fração 87 sugeriu que o composto pertencia à

classe dos flavonoides. As amostras foram então codificadas como Bl-1 (fração 87)

65

e Bl-2/Bl-3 (fração 94) e enviadas para análises espectroscópicas de RMN de 1H e

13C uni e bidimensionais (Figura 9).

As outras frações coletadas foram monitoradas por CCDA e de acordo com a

semelhança entre os fatores de retenção (Rf), e colorações das manchas

observadas em câmara de luz nos comprimentos de onda de 254 e 365 nm, ou após

revelação pelo borrifamento seguido de aquecimento a 105 °C por 5 min da solução

de vanilina sulfúrica 1%, as frações foram reunidas em 28 grupos.

Figura 9 - Fluxograma demonstrando a obtenção de Bl-1 e Bl-2/Bl-3.


4.9. Avaliação da atividade antimicrobiana

Para avaliação da atividade antimicrobiana, as cepas bacterianas de

referência utilizadas foram obtidas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade

em Saúde (INCQS/FIOCRUZ – Brasil). Os microrganismos utilizados foram:

Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella

pneumoniae (ATCC 13883), Salmonella enterica (ATCC 10708), Serratia

marcescens (ATCC 13880), Shigella flexneri (ATCC 12022) e Staphylococcus

66

aureus (ATCC 25923). O bioensaio antimicrobiano foi realizado utilizando as

seguintes amostras: Bl-EEB, Bl-EP, BL-CHCl3 e Bl-AcOEt.

Para avaliar a atividade antibacteriana, foi determinada a Concentração

Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM). O efeito

antibacteriano foi avaliado pelo método de microdiluição (SANTOS et al., 2012),

como recomendado pelo The National Committee for Clinical Laboratory Standards

(CLSI, 2003). Inicialmente uma solução mãe de 25 mg.mL-1 dos extratos foi

preparada utilizando uma solução aquosa de DMSO a 20% (v/v). Foram transferidos

100 μL desta diluição para a microplaca contendo 100 μL de caldo Muller-Hinton. Em

seguida, diluições seriadas foram realizadas, resultando em concentrações de 12,5;

6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,195 e 0,0975 mg.mL-1. O inóculo contendo 5 x 105

UFC.mL-1 o qual corresponde a 0,5 na escala de McFarland foi padronizado por

espectrofotometria com os valores de absorbância entre 0,08 e 0,1. Posteriormente,

10 μL desse inóculo foram adicionados a cada poço. Vale salientar que foram

reservados poços nas microplacas para controle de esterilidade do caldo, de

crescimento bacteriano e da ação do antimicrobiano de referência (Gentamicina).

Para a gentamicina foi usada uma concentração inicial de 1,6 mg.mL-1, a qual foi

diluída para concentrações de 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg.mL-1. As

microplacas foram incubadas sob condições de aerobiose durante 18-24 h a 37 °C,

quando 10 μL de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (CTT) a 2% foram adicionados a

cada poço para a detecção da mudança de cor do CTT (incolor) para vermelho, que

reflete o metabolismo bacteriano ativo. A CIM foi definida como a concentração mais

baixa do extrato que visivelmente inibiu o crescimento bacteriano.

Para determinar a CBM, alíquotas de 10 μL foram retiradas de cada um dos

poços do ensaio anterior contendo os extratos e transferidas para placas de Petri

contendo ágar Muller-Hinton. As placas foram incubadas durante 24 h a 37 °C. O

surgimento de colônia de bactéria para uma dada concentração indica que essa não

foi capaz de matar 99,9% ou mais do inóculo bacteriano utilizado. Os ensaios foram

realizados em triplicata. Sendo este último utilizado para expressar a CIM e CBM.

67

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

68

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Triagem fitoquímica preliminar dos extratos

Os resultados da caracterização fitoquímica preliminar dos extratos e fases de

B. laciniosa revelou ausência de lignanas e presença dos demais constituintes,

sendo que as classes de alcaloides, cumarinas, flavonoides, triterpenos, esteroides

e mono e diterpenos apresentaram presença moderada ou intensa. Os compostos

derivados antracênicos, derivados cinâmicos, naftoquinonas e

fenilpropanoglicosídeos também se mostraram presentes. Segundo a metodologia

proposta por Wagner e Bladt (1996) permitiu-se a investigação de dez classes de

metabólitos secundários. Os resultados da triagem estão listados na tabela 3, pág.

69.

69

Tabela 3 - Identificação das principais classes de constituintes presentes em extratos e fases de B. laciniosa.

Classe química EEB EP CHCl3 AcOEt

Alcaloides

++ ++ ++ +

Cumarinas

+++ + +++ +++

Derivados antracênicos - - - +

Derivados cinâmicos + - + -

Fenilpropanoglicosídeos - - - ++

Flavonoides +++ +++ + -

Lignanas

- - - -

Mono e diterpenos +++ +++ ++ +

Naftoquinonas

+ + - -

Triterpenos e esteroides + +++ +++ +++

EEB: extrato etanólico bruto; EP: fase éter de petróleo; CHCl3 = Fase clorofórmio; AcEOt= fase acetato de etila (-): ausência do constituinte, (+) leve presença do constituinte, (++):

moderada presença do constituinte, (+++): intensa presença do constituinte. Fonte: Autoria própria.

Os resultados da análise fitoquímica relatados acima corroboram os dados

presentes na literatura, no que diz respeito à presença de diterpenos. Dentro da

família Bromeliaceae poucos diterpenos já foram descritos, sendo que até o

momento apenas quatro representantes dessa classe (Quadro 3 pág. 37) foram

isolados em uma espécie pertencente ao gênero Bromelia, a espécie B. pinguin.

Dois desses constituintes são filocladanos oxigenados descritos como raros na

natureza (RAFFAUF et al.,1981).

É importante destacar também a presença de flavonoides, que são

constituintes abundantes dentro da família Bromeliaceae, principalmente flavonas e

flavonóis. A literatura destaca a presença desses constituintes em espécies do

gênero Bromelia, a citar: B. pinguin (RAFFAUF et al.,1981) e B. balansae (COELHO

et al., 2010). Além disso, o primeiro estudo fitoquímico realizado com a espécie B.

70

laciniosa resultou no isolamento do primeiro flavonoide na espécie, denominado 5,7-

di-hidroxi-3,3',4'-trimetoxiflavona (OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2014).

5.2. Composição química da fase éter de petróleo de B. laciniosa

A análise da composição química da fase éter de petróleo (Bl-EP) das folhas

de B. laciniosa foi realizada utilizando a cromatografia gasosa acoplada ao

espectrômetro de massas (CG-EM). O ensaio de aproximadamente 92 minutos

revelou a presença de 47 picos, como pode ser observado no cromatograma de íons

totais (TIC = “Total Ion Chromatogram”) representado na figura 10. Desses 47 picos,

um total de 25 constituintes foram identificados como mostra a tabela 4 pág. 71, o

qual apresenta a lista dos compostos, o tempo de retenção e a sua quantificação, no

extrato éter de petróleo. A identificação se deu com base nos espectros de massas

dos constituintes, que foram comparados com bancos de dados presentes no

aparelho.

Figura 10 - Cromatograma de íons totais da fase éter de petróleo (Bl-EP) de B. laciniosa.


71

Tabela 4 - Constituintes químicos da fase éter de petróleo das folhas de B. laciniosa.

Pico TR (min) Composto (%) IR

1 6.808 NI 0.04 1045

2 25.051 NI 0.03 1516

3 26.846 Ácido dodecanóico (ácido láurico) 0.13 1562

4 34.132 Ácido tetradecanóico (ácido mirístico) 0.21 1760

5 36.769 Neofitadieno 1.34 1837

6 37.578 NI 0.48 1861

7 38.186 3,7,11,15-Tetrametil-2-hexadeceno-1-

ol

0.44 1879

8 39.590 Ácido hexadecanóico metil éster

(ácido palmítico metil éster)

1.63 1921

9 40.995 Ácido hexadecanóico (ácido

palmítico)

5.94 1965

10 41.773 Ácido hexadecanóico etil éster (etil

palmitato)

0.52 1989

11 43.966 Ácido heptadecanóico (ácido

margárico)

0.27 2060

12 44.758 9,12- Ácido octadecadienóico metil

éster

1.05 2086

13 44.923 NI 1.02 2092

14 44.990 10- Ácido octadecenóico metil éster 0.98 2094

15 45.394 Fitol 2.49 2107

16 45.842 Ácido octadecanóico metil éster 0.41 2122

17 46.127 NI 2.40 2132

18 46.356 9-Ácido octadecenóico (Z) (ácido

oleico)

5.87 2140

19 46.760 NI 0.36 2154

20 47.044 Ácido octadecanóico (ácido esteárico) 1.20 2163

21 51.577 NI 0.58 2324

22 51.809 NI 0.48 2332

(Continua)

72

(Continuação)

23 56.248 Ácido hexadecanóico 2-hidroxi-1-

(hidroximetil) etil éster (palmitina 2-

mono)

2.33 2501

24 56.914 Octadecanal (stearaldeido) 0.76 2527

25 60.577 9,12-Ácido octadecadienóico (Z,Z)-,

2-hidroxi-1-(hidroximetil)etil éster

(linoleina)

1.92 2676

26 60.744 NI 5.38 2683

27 61.780 Ácido tetracosanóico, metil éster

(metil lignocerato)

0.38 2727

28 66.353 NI 0.30 2929

29 68.804 γ-Tocoferol 0.31 3043

30 69.254 NI 0.59 3065

31 70.471 Vitamina E (α-tocoferol) 4.30 3123

32 72.490 Campesterol 5.89 3223

33 73.089 Estigmasterol 11.33 3254

34 73.935 NI 0.54 3297

35 74.359 β-Sitosterol 24.48 3319

36 74.525 Estigmastanol 1.15 3327

37 74.605 NI 0.89 3331

38 75.774 Cicloartenol acetato 2.87 3392

39 76.029 NI 0.57 3400

40 76.909 NI 1.22 3450

41 78.913 NI 1.75 3545

42 80.264 NI 0.32 3604

43 80.789 NI 0.50 3623

44 81.041 NI 0.31 3632

45 84.299 NI 1.10 3745

46 84.693 NI 0.74 3757

47 91.952 NI 2.22 3944

Total 78.20

RT = Tempo de retenção; IR = Índice de retenção; NI = não identificado. Fonte: Autoria

própria.

73

Os compostos majoritários foram β-sitosterol (24,48%) e o estigmasterol

(11,3%) (Figura 11, pág. 76). Outros componentes, incluindo o campesterol, ácido

palmítico, ácido oleico e α-tocoferol foram encontrados em concentrações que

variaram entre 6 e 4 % (Figura 11, pág. 76). Os constituintes remanescentes foram

encontrados em quantidades menores, abaixo de 3 %.

β-sitosterol é o principal composto presente na fase de éter de petróleo. Este

é um dos fitosteróis mais representativos em vegetais para consumo humano, além

disso, tem sido utilizado há muito tempo na indústria farmacêutica sem apresentar

efeitos colaterais significativos (SAEDNIA et al., 2014).

Na família Bromeliaceae o β-sitosterol foi identificado em várias espécies, tais

como Ananas comosus (PAKRASHI; ACHARI; MAJUMDAR, 1975; WANG; DING et

al., 2006), Ananas erectifolius (MARQUES; GUTIERREZ; RIO, 2007), Hechtia rosea

(MARKER et al., 1943), Hechtia scariosa (MARKER et al., 1943), Tillandsia

fasciculata (CANTILLO-CIAU; BRITO-LOEZA; QUIJANO, 2001), Tillandsia pohliana

(MANETTI; DELAPORTE; LAVERDE-JÚNIOR, 2009), Tillandsia streptocarpa

(DELAPORTE et al., 2004) e Tillandsia usneoides (CANTILLO-CIAU; BRITO-

LOEZA; QUIJANO, 2001; MARKER et al., 1943). Estudos realizados com este

composto já demonstraram a presença de atividades farmacológicas, tais como,

atividade hipocolesterolêmica (KATAN, 2003; SUGANO; MORIOKA; IKEDA, 1977),

atividades anti-helmínticas e anti-mutagênicas (VILLASENOR et al., 2002), atividade

antioxidante (BASKAR et al., 2012) e efeito antidiabético (GUPTA et al., 2011).

Entre outros compostos identificados pode-se destacar a presença do

estigmasterol (11,33%) e campesterol (5,89%), que são caracterizados por um grupo

etil adicionail (estigmasterol) ou grupo metil (campesterol) na cadeia lateral.

Estigmasterol é um dos principais esteroides insaturados presentes em várias

plantas medicinais e age como um precursor na síntese de progesterona, além de

agir como um intermediário na biossíntese de andrógenos, estrógenos, corticoides e

síntese de vitamina D3 (CHAUDHARY; KISHORE, 2011; KAMETANI; FURUYAMA,

1987; SUNDARARAMAN; DJERASSI, 1977). Na família Bromeliaceae, ele foi

isolado principalmente de espécies da subfamília Tillandsioideae, como Tillandsia

fasciculata (CANTILLO-CIAU; BRITO-LOEZA; QUIJANO, 2001), Tillandsia

streptocarpa (DELAPORTE et al., 2004) e Tillandsia usneoides (DJERASSI;

MCCRINDLE, 1962). O campesterol também já foi isolado em espécies da família

Bromeliaceae, são elas: Ananas comosus (PAKRASHI; ACHARI; MAJUMDAR,

74

1975), Ananas erectofolius (MARQUES; GUTIERREZ; RIO, 2007), Tillandsia

fasciculata (CANTILLO-CIAU; BRITO-LOEZA; QUIJANO, 2001), Tillandsia pohliana

(MANETTI; DELAPORTE; LAVERDE-JÚNIOR, 2009), Tillandsia streptocarpa

(DELAPORTE et al., 2004) e Tillandsia usneoides (CABRERA, GALLO, SELDES,

1996). Em um estudo conduzido por Antonio et al. (2001) umas frações de Sideritis

foetens contendo os esteroides estigmasterol, β-sitosterol e campesterol foram

avaliados quanto à sua atividade anti-inflamatória. Foi constatada após a aplicação

tópica dessa amostra, que houve a redução do edema da pata induzido pela

carragenina e também a inibição de edema de orelha induzido por acetato de 12-O-

tetradecanoilforbol (TPA). Em outros estudos realizados com frações contendo estes

compostos também foi possível observar atividade anti-inflamatória (AKIHISA et al.,

1996; GARCIA, 1999; NAVARRO; HERAS; VILLAR, 2001).

Em Bl-EP também foi detectada a presença de ácido palmítico (5,95%), ácido

oleico (5,87%), α-tocoferol (vitamina E - 4,30%) e Fitol (2,49%). Os ácidos graxos,

ácido palmítico e ácido oleico são componentes largamente encontrados em plantas

que são utilizadas para fins nutricionais, tais como a B. laciniosa. Os tocoferóis como

o α-tocoferol encontrado nessa fração são uma classe de fenóis metilados,

cromanóis metil substituído com uma unidade de três isoprenos na cadeia lateral

(PSOMIADOU; TSIMIDOU; BOSKOU, 2000). Eles são todos de origem vegetal, são

amplamente distribuídas na natureza e entre estes, o α-tocoferol é o mais conhecido

(FRYER, 1992; NUNES et al., 2012). Além de ter sido detectado na espécie

estudada (B. laciniosa) a presença do α-tocoferol também tem sido relatada em

outras espécies de Bromeliaceae, tal como em Ananas erectifolius (MARQUES;

GUTIERREZ; RIO, 2007). A presença de α-tocoferol destaca o potencial nutritivo

dessas espécies vegetais como alimento para seres humanos e animais. Além

disso, estudos conduzidos com este composto também demonstrou a presença de

atividades farmacológicas, podendo-se destacar àqueles relacionados à

investigação de suas propriedades antioxidantes, que são os mais documentados na

literatura (BARTOSINSKA; BUSZEWSKA-FORAJTA; SILUK, 2016; FRYER, 1992;

KIM et al., 2016, NUNES et al., 2012).

Em um estudo conduzido por Aytac e Uyar (2016), foi avaliada a atividade

antioxidante e a fotoestabilidade do complexo de inclusão α-tocoferol/ β-ciclodextrina

encapsulada com nanofibras de policaprolactona por eletrofiação, sugerindo uma

nova via de administração deste composto, melhorando o seu efeito. Com a análise

75

dos resultados, os autores observaram aumento da atividade antioxidante,

solubilidade e fotoestabilidade do complexo. Dessa forma, eles concluíram que a

incorporação dos complexos de inclusão de ciclodextrina de drogas com nanofibras

por eletrofiação, pode ser uma boa alternativa para os sistemas veiculares de

fármacos e pode ser um material alternativo para a entrega tópica de fármacos

pouco solúveis.

O Fitol (3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-en-1-ol) é caracterizado por ser um

álcool acíclico diterpeno e constituinte de cadeia longa da molécula de clorofila

ramificada (BAXTER, 1968; BAXTER et al., 1967). Estudos com este composto

demonstrou que ele também tem atividades farmacológicas importantes, tais como:

atividade ansiolítica (COSTA et al., 2014), anticonvulsivante (COSTA et al., 2012) e

a leishimanicida (SILVA et al., 2015).

Diante desses resultados, pôde-se observar que os compostos identificados

na fase éter de petróleo de B. laciniosa são fitoquímicamente relevantes. No entanto,

mais estudos fitoquímicos ainda precisam ser realizados com esta espécie, bem

como, o potencial de seus produtos precisam ser avaliados em testes de atividade

biológica.

76

Figura 11 - Estrutura dos compostos majoritários obtidos em Bl-EP.


77

5.3. Networking Molecular

Foi realizada a análise do extrato etanólico bruto (Bl-EEB) e das fases éter de

petróleo, acetato de étila (Bl-AcOEt), clorofórmica (Bl-CHCl3) e líquida das folhas de

B. laciniosa por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro

de massas em tandem com analisador de massas do tipo íon trap (LC-DAD-IT-

MS/MS), a fim de se obter a identificação de sua composição química. Além disso,

foi aplicado o networking molecular, o qual auxiliou na identificação e classificação

dos constituintes.

Nesta análise, a identificação dos metabólitos secundários se deu por LC-

DAD-IT-MS/MS usando o modo de aquisição de dados dependente do fluxo

(autoMSMS) em modos alternados de ionização por electrospray positivos e

negativos (BROECKER et al., 2011; DE OLIVEIRA et al., 2016; OLIVEIRA et al.,

2016). O procedimento de extração foi conduzido utilizando diferentes solventes que

foram escolhidos de acordo com as propriedades de polaridade e seletividade (DE

OLIVEIRA et al., 2016; PILON et al., 2016). O uso de solventes com características

físico-químicas distintas tem impacto nas interações intermoleculares soluto-solvente

e solvente-solvente, o qual afeta a capacidade extrativa, permitindo dessa forma a

detecção de uma gama mais ampla de compostos (PILON et al., 2016).

Após análise e aquisição dos dados, os espectros de MS/MS foram

referenciados em relação aos bancos de dados (DPN, Metlin, Massbank), levando

em consideração todos os dados relatados na literatura para a família Bromeliaceae

(CARNEVALE NETO et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2016). As detecções moleculares

putativas foram justificadas com base na fragmentação medida por m/z, UVmax e

MS/MS. A fim de aprimorar a análise dos dados devido ao grande número de

espectros MS e MS/MS resultante, foi aplicado o networking molecular workflow. O

método auxiliou a identificação in situ por agrupamento dos espectros de MS/MS

usando similaridade de cosseno (OLIVEIRA et al., 2016; WANG et al., 2016).

A abordagem integrada de LC-DAD-MS/MS, mostrada na figura 13, pág. 80,

levou à detecção de 40 metabólitos como pode ser visualizado na tabela 5, pág. 85,

os quais foram classificados em fenilpropanoides gliceróis e glicosídeos e ácidos

graxos, os quais já foram previamente descritos na família Bromeliaceae (MA et al.,

2007; STEINGASS et al., 2015). A rede molecular auxiliou na identificação dos

78

fenilpropanóides gliceróis e glicosídeos utilizando os dados adquiridos no ESI em

modo negativo, como mostrado na figura 12, pág. 79.

Na figura 12, pág. 79 é possível observar a representação da aplicação do

networking molecular baseado no modo de ionização por electrospray negativo de

LC-DAD-IT-MS/MS após a remoção do branco. A figura 12, pág. 79 mostra os

agrupamentos dos fenilpropanóides gliceróis e glicosídeos e ácidos graxos no

extrato EEB e em diferentes fases da espécie B. laciniosa. O texto presente no “nó”

indica a massa do íon pai, o gráfico de cores do “nó” reflete o extrato de origem do

constituinte e a largura da borda mostra a similaridade de cosseno entre eles

(quanto maior o grau de similaridade, maior a largura da borda).

79

Figura 12 - Representação da aplicação do networking molecular baseada em LC-DAD-IT-MS/MS no modo de ionização por electrospray negativo em diferentes fases do extrato de B. laciniosa.


Por meio das análises por LC-MS foi possível realizar a triagem fitoquímica do

EEB de B. laciniosa. O ensaio de aproximadamente 30 minutos levou à detecção de

40 constituintes químicos (Figura 13, pág. 80), dos quais 22 foram identificados por

meio de comparação com o banco de dados do aparelho (Tabela 5, pág. 85). Dentre

estes componentes foi verificada a presença de compostos pertencentes às classes

dos fenilpropanóides gliceróis e glicosídeos, ácidos graxos e flavonoides.

80

Figura 13 - Cromatograma representativo de HPLC-DAD-MS do EEB de B. laciniosa (A) em 320 nm, modos negativo e positivo, (B) ESI negativo e (C) ESI positivo.


Entre os flavonoides identificados destaca-se a presença do flavonoide

vicenina-2 (apigenina-6,8-di-C-β-D-glucopiranosídeo) (composto 10). Ele apresentou

íon molecular em modo positivo [M + H]+ de m/z = 593.1 Daltons e em modo

negativo [M - H]+ m/z = 595.2 Daltons (Tabela 5 pág 85). Sua estrutura esta

representada na figura 14, pág. 81.

81

Figura 14 - Estrutura química da vicenina-2.

O

OOH

OHO

O

HO

HO

HO

OH

OH

HO

OH

HO

OH


Esse constituinte é um flavonoide C-glicosilado que apresenta algumas

atividades farmacológicas, como atividade anti-inflamatória, atividade antioxidante e

atividade anticâncer (FERNANDES et al., 2011; GOBBO-NETO et al., 2005;

MARRASSINI et al., 2011). Em um estudo realizado por Nagaprashantha et al.

(2011) foi avaliada a atividade anticâncer da vicenina-2 sobre câncer de próstata.

Nesta pesquisa a atividade desse flavonoide foi constatada quando este foi

administrado oralmente no período de 8 semanas, resultando na inibição do

crescimento de tumores da próstata in vivo . Além disso, a vicenina-2 pode estar

associada à proteção UV em espécies vegetais sob luz solar intensa, como proposto

por Silva et al. (2014). De acordo com Steingass et al. (2015) flavonoides como a

vicenina-2 que apresentam máximos de absorção a 270 e 330 nm podem contribuir

para a fotoproteção nas espécies encontradas.

Dentro da família Bromeliaceae a vicenina-2 foi constatada apenas na

espécie Ananas comosus. A identificação se deu por meio de análises dos extratos

metanólicos da casca e da coroa da infrutescência por meio de cromatografia líquida

de alta eficiência (STEINGASS et al., 2015).

O flavonoide vitexina (8-D-glucopiranosil-apigenina) (composto 13), também

foi identificado na análise por LC-MS. Ele apresentou o íon molecular em modo

positivo [M + H]+ de m/z = 345 Daltons e em modo negativo [M - H]+ m/z = 343

Daltons (Tabela 5, pág. 85). A vitexina é um flavonoide C-glicosilado caracterizado

82

pela presença de uma molécula de glicose ligada ao núcleo aromático do anel A na

posição 8 por meio de uma ligação carbono-carbono, como representado na Figura

15 (LOPES et al., 2013).

Figura 15 - Estrutura química da vitexina.

O

OOH

OHOHO

HO

OH

H

HO

OH


Este flavonoide é pertencente à classe das flavonas. De acordo com Manetti,

Delaporte e Laverde-Júnior (2009) o flavonoide isovitexina, o qual também é um

derivado C-glicosilado, também foi encontrado em espécies da família

Bromeliaceae, porém este é um flavonoide pouco comum nessa família, sendo

restrito a pouquíssimas espécies (MANETTI; DELAPORTE; LAVERDE-JÚNIOR,

2009). A vitexina juntamente com a isovitexina é derivada da apigenina e luteolina, e

dentre outros flavonoides são considerados atualmente as melhores opções de

marcadores de espécies do gênero Passiflora (MULLER et al., 2005). Dentre as

atividades farmacológicas da vitexina, destaca-se seu potente efeito hipotensivo,

anti-inflamatório e propriedade anti-espasmódica (PRABHAKAR et al., 1981).

Dentre os fenilpropanoides glicosídeos, o composto 21, o qual foi atribuído ao

vanilloil di-hexosídeo, apresentou íon molecular no modo positivo [M + H]+ de m/z =

493.1 Daltons e em modo negativo [M - H]- m/z = 491.2 Daltons (Tabela 5, pág. 85),

corroborando os dados presentes na literatura (STEINGASS et al., 2015).

O composto 23 apresentou íon molecular no modo positivo [M + H]+ de m/z =

567.2 Daltons e em modo negativo [M - H]- m/z = 523.2 (Tabela 5, pág. 85). Este

constituinte foi atribuído ao siringoil di-hexosídeo devido ao íon percussor

provavelmente corresponder a um aduto de ácido fórmico [M-H+46]−. Além disso,

83

outros íons de fragmento MS2 (m/z= 521, m/z = 559, m/z = 359) corroboram os

dados presentes na literatura, concluindo assim a identificação (STEINGASS et al.,

2015).

Vanilloil di-hexosídeo (21) e siringoil di-hexosídeo (23 e 25) já foram

identificados na família Bromeliaceae, nos extratos metanólicos de diferentes tecidos

de infrutescência de abacaxi (Ananas comosus) (STEINGASS et al., 2015).

No que diz respeito aos fenilpropanóides glicerídeos, os compostos 26 e 29

apresentaram íon molecular em modo negativo [M - H]- m/z = 415 Daltons, como

pode ser observado na tabela 5, pág. 85. Além disso, os dois produziram íons

pseudomoleculares [M - H]- de m/z = 253, 235, 179, 161 e 153, indicando dessa

forma que são isômeros do dicafeoilglicerol (composto 8) (MA et al., 2007;

STEINGASS et al., 2015). Da mesma forma o composto 30 foi atribuído a p-

cumaroil-cafeoilglicerol. Nesse caso, os valores do íon molecular positivo e negativo

foram de [M + H]+ m/z = 401.1 e [M - H]- m/z = 399.1, além disso, essa substância

produziu íons pseudomoleculares quase idênticos aos atribuídos ao p-cumaroil-

cafeoilglicerol na literatura ([M - H]- = 253, 235, 163, 199), concluindo assim a

identificação (STEINGASS et al., 2015). Dessa mesma maneira os compostos 32, e

35 foram também identificados.

No que diz respeito ao constituinte 34, este possivelmente trata-se de um

aduto de ácido fórmico [M-H+46]−. Ele apresentou íon molecular no modo negativo

[M - H]- de m/z = 445.1 e íon pseudomolecular [M - H]- de m/z = 399 (Tabela 5, pág

85), corroborando o valor do composto 30. Diante disso, pôde-se concluir que o

composto 34 corresponde também a p-cumaroil-cafeoilglicerol (STEINGASS et al.,

2015).

Os constituintes dicafeoilglicerideo (26), di-O-cafeoilglicerol (29), p-cumaroil-

cafeoilglicerol (30) e feruloil-cafeoilglicerol (32), já foram anteriormente identificados

por meio de análises por HPLC-DAD-MS no extrato etanólico de folhas de Ananas

comosus (Bromeliaceae) (MA et al., 2007). Esses constituintes também foram

detectados nos extratos metanólicos de diferentes tecidos de infrutescências de

abacaxi (Ananas comosus) (STEINGASS et al., 2015).

O composto 36 foi atribuído a smilasídeo C. Esse constituinte apresentou íon

molecular no modo negativo de [M - H]- m/z = 819.3, além disso, produziu íons

pseudomoleculares ([M - H]- m/z = 777, 643) iguais aos encontrados na literatura

84

(CHEN; LU; ZHAO, 2007). Já o constituinte 38 foi atribuído ao flavonoide quercetina

3,3’,4’-trimetil éter, o qual foi isolado e identificado neste trabalho por meio de dados

de RMN. Essa conclusão se deu devido ao fato da substância apresentar o íon

molecular em modo positivo [M + H]+ equivalente a m/z = 345 Daltons e em modo

negativo [M - H]+ m/z = 343 Daltons, corroborando os dados presente na literatura.

Além disso, esse constituinte foi isolado anteriormente da espécie B. laciniosa

(OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2014).

Os ácidos graxos hidroxi-C18:3 e hidroxi-C18:2, (composto 39 e 40)

apresentaram valores do íon molecular negativo de [M - H]- m/z = 293.2 [M - H]- m/z

= 243.2 respectivamente. Seus padrões de fragmentações corroboraram os dados

presentes na literatura (TYURIM et al., 2009).

De acordo com os resultados da análise de LC-MS, foi possível a

identificação de 22 constutuintes químicos, sendo 4 pertencentes à classe dos

flavonoides (10, 12, 13 e 38), 15 pertencentes à classe dos fenilpropanóides (8, 17,

21, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 37), 2 ácidos gáxos (39 e 40) mais o

ácido chiquímico (composto 3). Esses resultados mostraram que os fenilpropanoides

foram os constituintes mais identificados no EEB de B. laciniosa. Sendo assim,

pode-se afirmar que uma parte considerável da composição do extrato de B.

laciniosa é representada por fenilpropanoides. Esses compostos fenólicos são

bastante relevantes quimicamente e biologicamente, apresentando diversas

atividades biológicas e farmacológicas, tais como: atividade antimicrobiana (DIDRY

et al., 1999; LIMA et al., 2003; LOAUER et al., 2009), antioxidante (KORKINA, 2007;

LEE et al 2004), anti-inflamatória (DIAZ et al., 2004; KORKORINA, 2011; SÁ et al.,

2014), antitumoral (CARVALHO et al., 2015) e antiviral (ASTANI; REICHLING;

SCHNITZLER, 2009).

Diante disso, é importante destacar que a análise por LC-MS é o primeiro

estudo dessa natureza com a espécie B. laciniosa. Todos os constituintes aqui

identificados, são inéditos para essa espécie, exceto o flavonoide quercetina 3,3’,4’-

trimetil éter que já foi isolado anteriormente dessa planta (OLIVEIRA-JÚNIOR et al.,

2014). O estudo mostrou que o extrato de B. laciniosa, apresenta uma constituição

química muito relevante com a presença de compostos fenólicos bastante

interessantes biologicamente, mostrando, dessa forma, que essa espécie apresenta

um grande potencial biológico a ser explorado.

85

Tabela 5 - Metabolitos detectados por HPLC-DAD-MS/MS (modos ESI positivo e negativo) do EEB de B. laciniosa.

n° Rt

(min)

UV max

(nm)

Identificação* [M-H]- Fragmentação [M+H]+ Fragmentação Referências

1 3.9-4.1 267 - 294.1 MS2[294] 276; 258; 241;

144

585.5 MS2[585] 292; 244; 202 -

2 4.4-4.8 268 - 326.2 MS2[326] 308; 278; 266;

236; 206; 164

328.1 MS2[328] 310; 292; 282; 178

MS2[328→310] 292; 282;

276; 264; 246; 227; 216;

178; 166

-

3 5.1-5.2 284 Ácido chiquímico 173.0 MS2[173] 155; 129; 111 - - (Chen et al.,

2014)

4 5.4-5.5 280 - 451.3 MS2[451] 405; 373; 359;

179; 161; 143

- - -

5 6.4-6.7 301 - - - 602.1 MS2[602] 470; 308; 205

MS2[602→470] 453; 405;

373; 308; 287; 208; 197; 135

-

6 6.4-6.7 300 - 484.3 MS2[484] 448; 395; 320;

272; 178

486.2 MS2[486] 468; 324; 306;

274; 260

-

(Continua)

86

(Continuação)

7 6.6-6.9 280 - 512.3 MS2[512] 467; 425; 367;

144

MS2[512→367] 321; 281;

235; 143

- - -

8 6.6-6.9 280, 307(sh) Dicafeoilglicerol 415.2 MS2[415] 367; 253; 179;

161; 135

- - -

9 7.4-7.6 274, 330 - - - 496.2 MS2[496] 479; 425; 353; 313 -

10 7.6-7.7 273, 330 Vicenina-2 593.1 MS2[593] 503; 473; 383;

353; 311

595.2 MS2[595] 577; 559; 511;

439; 379

-

11 8.1-8.2 277, 330 - 519.2 MS2[519] 487; 429; 387;

242

-

12 9.8-10.0 266, 325 Quercetina-O-di-

hexosídeo

609.3 MS2[609] 301 611.2 MS2[611] 465; 449; 303 -

- - -

13 10.2-

10.3

266, 325 Vitexina 431.1 MS2[431] 341; 311; 241;

197

433.1 MS2[433] 415; 397; 379;

367; 337; 313; 283

-

14 10.9-

11.1

290, 320 - 623.2 MS2[623] 577, 561, 315;

300; 255

625.2 MS2[625] 318; 317, 303 -

15 10.9-

11.1

290, 320 - 507.2 MS2[507] 493; 460; 415;

387; 345

509.1 MS2[509] 464; 347 -

(Continua)

87

(Continuação)

16 11.5-

11.8

300, 330 - 539.3 MS2[539] 503; 357

MS2[539→503] 371; 354;

227; 161

- - -

17 12.1-

12.2

286, 320 Di-O-tri-hidroxi-

cinamoilglicerol

433.2 MS2[433] 415; 253; 227; 179;

161

- - -

18 12.1-

12.2

286, 320 - 417.3 MS2[417] 371; 179 419.2 MS2 [419] 400; 383; 373;

355; 335; 329; 271; 225

-

19 12.4-

12.5

274, 335 - 643.2 MS2[643] 601; 583; 559; 427

MS2[643→427] 383; 365;

325; 295; 221; 161; 143

- - -

20 12.4-

12.5

274, 335 - 521.2 MS2[521] 506; 359 523.2 MS2[523] 361 -

21 12.4-

12.5

274, 335 Vanilloil di-

hexosídeo

491.2 MS2[491] 477; 401; 371; 329 493.1 MS2[493] 331 (Steingass et

al., 2015)

22 12.4-

12.5

274, 335 - 463.2 MS2[509] 464; 347

(Continua)

88

(Continuação)

23 13.4-

13.8

280, 320 Siringoil di-

hexosídeo (Aduto

do ácido fórmico)

567.2 MS2[567] 521; 359; 298;

197

MS2[567→521] 489; 399;

359

523.2 MS2[523] 403; 361; 346; 265 (Steingass et

al., 2015)

24 14.1-

14.2

275, 333 - 491.2 MS2[491] 329 493.2 MS2[493] 331 -

25 14.1-

14.2

275, 333 Siringoil di-

hexosídeo

521.2 MS2[521] 506; 359; 313 523.2 MS2[523] 505; 463; 379;

369; 359; 252

(Steingass et

al., 2015)

26 14.1-

14.2

275, 333 Dicafeoilglicerídeo 415.1 MS2[415] 253; 235; 179;

161; 135

- - (Ma et al.,

2007)

27 14.6-

14.7

276, 333 - 551.1 MS2[551] 343

MS2[551→343] 233

- - -

28 14.8-

15.0

290, 325 - 581.1 MS2[581] 535; 373

MS2[551→343] 233

- - -

29 14.8-

15.0

276, 333 Di-O-cafeoilglicerol 415.0 MS2[415] 253; 235; 179;

161; 135

- - (Ma et al.,

2007)

30 16.1-

16.3

320 p-Cumaroil-

cafeoilglicerol

399.1 MS2[399] 253; 235; 163;

119

401.1 MS2[401] 383; 249; 237; 221 (Steingass et

al., 2015)

31 16.1-

16.3

320 Di-O-feruloil-di-O-

acetil-hexose

777.2 MS2[777] 753; 717; 601;

583; 513

- - (Chen et al.,

2014)

(Continua)

89

(Continuação)

32 16.5-

16.7

317 Feruloil-

cafeoilglicerol

429.1 MS2[429] 253; 235; 193;

179; 161

431.1 MS2[431] 413; 321; 251; 237 (Steingass et

al., 2015)

33 17.2-

17.3

325 Di-O-feruloil-di-O-

acetil-hexose

777.2 MS2[777] 735; 717; 601;

583; 559

- - (Chen et al.,

2014)

34 17.2-

17.3

325 p-Cumaroil-

cafeoilglicerol

(Aduto do ácido

fórmico)

445.1 MS2[445] 399 - - (Steingass et

al., 2015)

35 19.1-

19.3

296, 320 Di-O-

feruloilglicerol

443.2 MS2[443] 249; 235; 207;

193; 175; 161; 135

445.1 MS2[445] 427; 321; 251

MS2[445→427] 251; 177;

145

(Steingass et

al., 2015)

36 19.5-

20.0

317 smilasídeo C 819.3 MS2[819] 777; 759; 735;

643; 559

- - (Chen et al.,

2014)

37 20.6-

20.8

294, 326 Derivado de

smilasideo

863.2 MS2[863] 819; 801; 685;

643; 559

- - (Chen et al.,

2014)

38 21.9-

22.1

274, 341 Quercetina

3,3’,4’-trimetil éter

343.2 MS2[343] 328 345.2 MS2[345] 327 (Oliveira-

Júnior et al.,

2014)

39 28.9-

29.1

- Hidroxi-C18: 3 293.2 MS2[293] 275; 249; 209;

171;

- - (Tyurin et al.,

2009)

(Continua)

90

(Continuação)

40 31.2-

31.6

- Hidroxi-C18: 2 343.2 MS2[295] 277; 227; 195;

171

- - (Tyurin et al.,

2009)


91

5.5. Caracterização estrutural de Bl-1

O composto codificado como Bl-1 (10,2 mg) foi obtido da fase acetato de etila

na forma de um precipitado amarelo claro da fração 87, solúvel em clorofórmio,

apresentando-se fluorescente no comprimento de onda 254 nm e 366 nm. Este

composto apresentou coloração amarela quando revelado com o reagente PEG

(polietilenoglicol), podendo-se sugerir que pertence à classe dos flavonoides.

O espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) mostrou a presença de 18

sinais correspondentes a amostra (Figura 16, pág. 92) dentre os quais, os sinais em

δC 90,57, 104,30, 108,27, 114,99, 120,71, 123,37, 146,86, 149,23, 153,06, 132,30,

132,60, 158,74, 163,83 e 164,08 estão na região de compostos aromáticos. Os

sinais em δC 163,83 e em 132,30 não foram registrados no espectro de carbono,

porém foram detectados no bidimensional HMBC, o qual é mais sensível.

Por meio do experimento 13C DEPT 135° foi possível registrar a presença de

nove sinais de carbono, dos quais três correspondem a carbonos metílicos (δC

56,18, 56,34, 60,89) e cinco a carbonos metínicos e aromáticos (δC 90.57, 104,30,

108.27, 114.99, 120.71). Os carbonos não registrados nesse experimento foram

caracterizados como carbonos não hidrogenados (δC 123.37, 132.30, 132,60,

146,86, 149,23, 153,06 158,74, 163.83, 164,08 e 182,65).

Por meio do espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) foi possível observar

sinais característicos da estrutura flavonoídica, como a presença dos 14 sinais na

região de compostos aromáticos, a presença do sinal em δC 182, 65 que aponta

para a presença de um carbono carbonílico e três sinais (δC 60,89, 56,18 e 56,34)

que se encontram na região de carbonos ligados a átomos eletronegativos, que

caracterizam a presença de três grupos metoxilas, duas metoxilas livres (δC 56,18,

56,34) e uma metoxila estericamente impedida (δC 60,89).

92

Figura 16 - Espectro de RMN de 13C de Bl-1 (CDCl3,100 MHz).


93

Figura 17 - Espectro de RMN de 13C DEPT 135° de Bl-1 (CDCl3,100 MHz).


94

O espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) de Bl-3 (Figura 19, pág. 96)

apresentou sinais característicos do núcleo de flavonoide, como o sinal em δH 12,76,

atribuído ao hidrogênio do grupo hidroxila ligado ao carbono C5, o qual caracteriza a

presença de uma hidroxila quelatogênica. Foram também observados o dubleto em

δH 7,34 (d, J = 2 Hz) e o duplo dubleto em δH 7,50 (dd, J = 8.4 e 2.0 Hz) que foram

atribuídos aos hidrogênios H2’ e H6’ do anel B e dois singletos com sinais em δH

6,56 (1H, s) e δH 6,60 (1H, s), os quais são referentes aos hidrogênios da posição H8

e H6 do Anel A e são típicos de hidrogênios aromáticos (Figura 18 pág. 95). Os

sinais em δH 3,93 (3H, s) e δH 3,98 (3H, s) e δH 4,02 (3H, s), indicaram a presença de

três grupos metoxilas.

A análise dos deslocamentos químicos de 1H e 13C e o experimento de 13C

DEPT 135° sugeriu que possivelmente o composto trata-se de uma flavona com três

substituintes metoxilas.

95

Figura 18 - Espectro de RMN de 1H de Bl-1 (CDCl3 400 MHz).


96

Figura 19 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Bl-1 (CDCl3 400 MHz).


97

Por meio do espectro HSQC foi possível observar as correlações diretas entre

δH 3,93 e δC 60,89, δH 3,98 e δC 56,34, δH 4,02 e δC 56,18, δH 7,50 e δC 120,71, δH

7.05 e δC 114,99, δH 7,34 e δC 108,27, δH 6,56 e δC 90,57 e δH 6,60 e δC 104,3 (Figura

20).

Figura 20 - Espectro de correlação 1H x 13C - HSQC de Bl-1 (CDCl3, 400 MHz e 100 MHz).


Por meio da observação do mapa de correlação de HMBC (Figuras 21, pág.

98 e 22, pág. 99) foi possível a localização dos grupos substituintes metoxila. Nesse

espectro foi observado os acoplamentos a longa distância entre δH 3.98 (3'-OMe)/δC

158.74 (C-3', J3 ), δH 4.02 (4'-OMe)/δC 146.86 (C-4', J3) confirmando a localização

das metoxilas no anel B e 3,93 (3-OMe)/ δC 132,3 (C-3, J3) no anel C, comprovando

a estrutura do esqueleto da flavona. Outros acoplamentos observados no espectro

de correlação a longa distância (HMBC) foram mostrados na tabela 6, pág. 101.

98

Figura 21 - Espectro de correlação heteronuclear RMN de 1H x 13C – HMBC de Bl-1 (CDCl3, 400 e 100 MHz).


99

Figura 22 - Expansão do espectro de correlação heteronuclear RMN de 1H x 13C – HMBC de Bl-1 (CDCl3, 400 e 100 MHz).


100

Após análise dos deslocamentos químicos de todos os espectros de RMN 1H

e 13C e a comparação com compostos semelhantes presentes na literatura, foi

possível a identificação do composto como sendo o flavonoide 5,7-di-hidroxi-3,3',4'-

trimetoxiflavona (quercetina 3,3’,4’-trimetil éter) cuja estrutura esta demostrada na

figura 23.

Figura 23 - Estrutura química do flavonoide 5,7-di-hidroxi-3,3',4'-trimetoxiflavona (quercetina 3,3’,4’-trimetil éter).

O

O

HO

OH

OMe

OMe

OMe


A maioria das principais classes de flavonoides esta representada dentro da

família Bromeliaceae, sendo constituintes bastantes difundidos. Porém os

flavonoides de maior relevância dentro da família Bromeliaceae são os que

apresentam hidroxilação ou metoxilação na posição C-6 ou C-8, sendo esta uma

característica única dessa família dentro das monocotiledôneas (WILLIAMS, 1978).

Em um estudo realizado por Bringmann et al. (1999), foi possível o isolamento do

flavonoide glicosídico 6-hidroxiluteolina-7-O-(1''-α-ramnosídeo), o qual apresenta

essas características. Ele foi isolado por meio da extração metanólica das folhas de

Vriesea sanguinolenta, e pertence à classe das flavonas (BRINGMANN et al., 1999).

O flavonoide quercetina 3,3',4'-trimetil éter não é um composto exclusivo para

a família Bromeliaceae, este flavonoide já foi relatado em várias outras espécies

vegetais tais como: Inula japonica (QIN et al., 2010), Artemisia rupestris (SONG et

al., 2006), Pulicaria canariensis (TRIANA et al., 2005), Artemisia monosperma

(ISMAIL et al., 1989) entre outras. Porém este composto não foi anteriormente

identificado em nenhuma outra espécie dentro da família Bromeliaceae, apenas na

espécie B. laciniosa. Ele foi isolado por Oliveira-Júnior et al. (2014) de uma planta

101

coletada em uma localidade diferente da coletada nesse estudo, devido a isso este

flavonoide pode então ser considerado um marcador quimiotaxonômico da espécie

B. laciniosa, pois foi isolado de plantas coletadas sob condições ambientais distintas.

Tabela 6 - Dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) para Bl-1 em CDCl3, incluindo os resultados dos experimentos 2D heteronucleares 1H x 13C - nJCH (n=1, HSQC, n= 2 e 3, HMBC) e dados da literatura.

Carbono HSQC HMBC

δC δH 2JCH 3JCH

C

2 149,23 - H-2’; H-6’

3 132,30 - MeO-3

4 182,65 -

5 164,08 - H-6

7 163,83 - H-6

9 153,06 - H-6

10 132,60 - H-8

1’ 123,37 - H-5’

3’ 158,74 - MeO-3’

4’ 146,86 - MeO-4’

CH

6 104,30 6,60 (s)

8 90,57 6,56 (s)

2’ 108,27 7,34 (d, 2,0)

5’ 114,99 7,05 (d, 8,4)

6’ 120,71 7,50 (dd, 8,4 e 2,0)

MeO

3 60,89 3,93 (s)

3’ 56,34 3,98 (s)

4’ 56,18 4,02 (s)


102

Por meio de análises por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de

massas LC-MS em modo positivo e negativo do extrato etanólico bruto de B.

laciniosa foi possível observar o tempo de retenção em coluna e a fragmentação do

composto isolado, a quercetina 3,3’,4’-trimetil éter. Esta análise demostrou o pico

majoritário em torno de 22 minutos, cujo íon molecular equivale a m/z = 344

consistente com a fórmula molecular C18H16O7 do composto (Figura 24, pág. 103)

(OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2014). É possível observar na figura 24 o íon molecular

da substância em modo positivo [M + H]+ o qual equivale a m/z = 345 Daltons e em

modo negativo [M - H]+ m/z = 343 Daltons. Esses resultados confirmaram a

elucidação do composto obtido por meio dos dados de RMN.

103

Figura 24 - LC-MS do flavonoide isolado com tempo de retenção e fragmentações.


104

5.6. Caracterização estrutural da mistura Bl-2/Bl-3

A Análise fitoquímica da fase acetato de etila resultou também no isolamento

da mistura Bl-2/Bl-3 (13 mg), o qual foi obtida na forma de um sólido amorfo branco

a partir da fração 94 após sucessivas lavagens com o solvente metanol,

considerando que estes não são solúveis neste solvente. Após a realização das

análises dos espectros e comparação com dados da literatura (FERREIRA, 2011)

pôde-se concluir que esta amostra se tratava de uma mistura dos esteroides β-

sitosterol e estigmasterol.

Figura 25 - Estruturas químicas de Bl-1/Bl-2.

HO

H H

1

2

3

4 6

7

8

9

1113

12

18

17

16

15

14

20

21

22

23

25

26

27

28

29

H19

10

24

5

HO

H H

1

2

3

4 6

7

8

9

1113

12

18

17

16

15

14

20

21

22

23

25

26

27

28

29

H19

10

24

5


A partir da análise dos espectros de RMN 13C e de RMN 13C – DEPT (Figura

26, pág. 105 e figura 27, pág. 106) foi possível observar os deslocamentos químicos

referentes aos átomos de carbono olefínicos em δC 140,73 e 121,74 os quais são

atribuídos a C-5 e C-6. Além disso, foi constatada a presença de outros dois sinais

olefínicos em δC 138,34 e 129,23 que são referentes à C22 e C23, os carbonos da

dupla ligação da cadeia lateral do estigmasterol e a presença de um carbono

oximetínico em δC 71,8 atribuído a C-3.

105

Figura 26 - Espectro de RMN de 13C de Bl-2/Bl-3 (CDCl3,100 MHz).


106

Figura 27 - Expansão do espectro de RMN de 13C DEPT 135° de Bl-2/Bl-3 (CDCl3,100 MHz).


107

No espectro de RMN de 1H (Figura 28), foi possível observar o multipleto na

faixa de δH 3,4 - 3,6 ppm característico de hidrogênio ligado a carbono carbonílico, o

qual é atribuído ao átomo de hidrogênio H3 dos esteroides. Além disso, o espectro

apresentou sinais na faixa de 0,6 e 2,0 ppm que são referentes a átomos de

hidrogênios metílicos (CH3), metilênicos (CH2) e metínicos (CH) de esteroides.

Foram observados também os sinais entre 5,3 e 5,5 ppm típicos de hidrogênios

olefínicos atribuído ao H6, e o multipleto entre 5,0 e 5,3 ppm o qual é referente aos

átomos de hidrogênio H22 e H23 do estigmasterol.

Por meio das análises dos espectros de RMN 13C de 1H e DEPT e

comparação com valores referenciados na literatura (FERREIRA, 2011) permitiu-se

identificar Bl-2 e Bl-3 como uma mistura dos esteroides β-sitosterol e estigmasterol.

A comparação dos valores espectrais obtidos e os dados da literatura estão listados

na tabela 7, pág. 108.

Figura 28 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Bl-2/Bl-3 (CDCl3 400 MHz).


108

Tabela 7 - Comparação dos dados espectrais de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) da mistura de Bl-2/Bl-3 em CDCl3 com os da mistura de β-sitosterol e estigmasterol encontrados na literatura (125 MHz, CDCl3).

Posição δC δC

C Bl-2 β-sitosterol Bl-3 Estigmasterol

5 140,7 140,8 140,73 140,8

10 36,4 36,5 36,4 36,5

13 42,2 42,2 42,2 42,2

CH

3 71,8 71,8 71,8 71,8

6 121,7 121,7 121,7 121,7

8 31,9 31,9 31,9 31,9

9 50,1 50,2 50,1 50,2

14 56,7 56,8 56,7 56,9

17 56,0 56,1 56,0 56,0

20 36,1 36,2 40,5 40,5

22 - 138,3 138,3

23 - 129,2 129,3

24 45,7 45,9 51,2 51,3

25 28,9 28,9 29,7 29,7

CH2

1 37,2 37,3 37,23 37,3

2 31,6 31,7 31,6 31,7

4 42,3 42,3 42,30 42,3

7 31,9 31,9 31,9 31,9

11 21,1 21,1 21,1 21,1

12 39,7 39,8 39,6 39,7

15 24,3 24,3 24,3 24,4

16 29,0 29,2 29,01 29,2

22 34,0 34,0 - -

23 26,0 26,1 - -

28 23,0 23,1 25,4 25,4

CH3

18 11,9 11,9 12,0 12,0

19 19,4 19,4 19,4 19,4

(Continua)

109

(Continuação)

21 18,8 18,8 21,2 21,2

26 19,8 19,8 19,8 19,8

27 19,0 19,1 19,0 19,0

29 12,0 12,1 12,2 12,3

Fonte: (FERREIRA, 2011). 5.7. Atividade antimicrobiana

Com relação à atividade antimicrobiana não existe uma concordância comum

sobre o nível de inibição considerado aceitável para produtos naturais quando

comparados com antibióticos padrões (DUARTE, 2006). Porém, no presente

trabalho utilizou-se o parâmetro proposto por Aligianis et al. (2001) que classifica os

extratos vegetais com base nos resultados de CIM. É considerado como forte

inibição - CIM até 500 μg.mL-1, inibição moderada - CIM de 600 a 1500 μg.mL-1 e

fraca inibição - CIM para resultados acima de 1500 μg.mL-1

Os resultados para a avaliação do efeito antibacteriano do extrato e fases de

B. laciniosa são apresentados na Tabela 8, pág. 113 e são expressas como

concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). Foi

possível observar que dentre os resultados que foram obtidos para a concentração

inibitória mínima (CIM), pôde-se considerar como forte a ação dos extratos Bl-EEB,

Bl-EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt, frente à cepa bacteriana Shigella flexneri, apresentando

valores de 0,19 mg/mL. Os extratos Bl-EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt, também inibiram

fortemente o crescimento do microrganismo Staphylococcus aureus com valores de

0,19 mg/mL (Tabela 8, pág. 113). Todos os extratos apresentaram fraca ou

nenhuma atividade frente aos demais microrganismos testados (Tabela 8, pág. 113).

No que diz respeito à concentração bactericida mínima (CBM), os extratos Bl-

EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt também se mostraram bastantes efetivos contra S. aureus,

apresentando forte inibição com valores de 0,19 mg/mL mostrando, dessa forma, a

efetividade das fases do extrato mesmo na menor concentração testada. O extrato

Bl-EEB apresentou atividade em uma concentração maior de 3,125 mg/ml. Com

relação à cepa bacteriana S. flexneri, as amostras foram fracamente ativas, com

valores de CBM de 12,5 mg/ml para todas as amostras testadas. Entretanto, por

meio da relação entre os valores de CIM e CBM, pode-se ter uma melhor avaliação

110

do efeito antibacteriano de compostos bioativos. De acordo com Biyiti et al. (2004),

uma substância é considerada bactericida quando a razão CIM/CBM é ≤ 2, e

bacteriostática se a razão CBM/CIM > 2. Sendo assim, baseado nestes dados foi

possível classificar o extrato e as fases como tendo efeito bactericida contra S.

aureus e bacteriostático contra S. flexneri.

A capacidade de inibir o crescimento microbiano é uma característica

conhecida para a família Bromeliaceae. No que se referem à atividade

antimicrobiana, várias espécies dessa família já foram relatadas na literatura, tais

como: Tillandsia streptocarpa (DELAPORTE et al., 2004), Ananas comosus (DUTTA;

BHATTACHARYYA, 2014), Encholirium spectabile (SANTANA et al., 2012),

Neoglaziovia variegata (OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2012), e Bromelia antiacantha

(MANETTI et al., 2010). Este é o primeiro estudo que mostra atividade antibacteriana

das fases de B. laciniosa.

Na tabela 8, pág. 113, dentre os resultados obtidos destacamos a ação das

fases do extrato Bl-EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt sobre a cepa de S. aureus na menor

concentração, as quais obtiveram efeito bactericida na relação CIM/CBM. Os

estudos voltados a essa bactéria são de grande relevância, pois as infecções

atribuídas ao S. aureus são umas das principais ameaças atestadas em ambiente

hospitalar. Além disso, essas bactérias apresentam capacidade crescente em

adquirir resistência aos antimicrobianos e capacidade de se manter viável por um

grande período de tempo, o que reforça ainda mais a importância da continuidade

desse estudo (RODRIGUES et al., 2012; SANTOS et al., 2007).

Por meio das análises cromatográficas de HPLC-IT-DAD-MS/MS foi possível

observar que o extrato e as fases analisadas apresentam em suas composições

diferentes compostos fenólicos, como fenilpropanoides e flavonoides (Tabela 7 pág

108). Através da observação do perfil fitoquímico preliminar também foi possível

perceber que as análises cromatográficas dos extratos mostram em sua composição

a presença desses mesmos constituintes, além da notável presença de derivados do

ácido cinâmico e terpenos no extrato bruto e fases analisadas. Esse fato corrobora

para um estudo realizado por Raffauf, Menachery e Quesne (1981) com uma

espécie pertencente ao gênero Bromelia: B. pinguin, no qual flavonoides e terpenos

foram também encontrados.

Em um estudo realizado por Koo et al. (2002), compostos fenólicos como

flavonoides e derivados do ácido cinâmico foram testados com relação à atividade

111

antibacteriana. Neste estudo foi demostrado que flavonas e flavonóis foram

inibidores potentes da atividade de glucosiltransferases produzidas por Steptococcus

mutans. Em outro trabalho realizado por Loauer et al. (2009) um fenilpropanoide

majoritário do óleo essencial da espécie Carum montanum foi isolado e testado

contra cepas bacterianas e fúngicas. Esse composto se mostrou ativo contra várias

cepas do gênero Staphylococcus, inclusive contra S. aureus. Além desses, vários

outros estudos relatados na literatura já associaram a sua atividade antimicrobiana

aos compostos fenólicos, como flavonoides (CUSHNE et al., 2006; MORI et al.,

1987; PROESTOS et al., 2005), derivados do ácido cinâmico (HERALD; DAVIDSO,

1983; TROUGH et al., 2010), fenilpropanoides (DIRY et al., 1999; LIMA et al., 2003)

e taninos (SCALBERT, 1991), mostrando dessa forma, que esses constituintes

apresentam um grande potencial para o tratamento de infecções.

Os compostos fenólicos podem estar associados à atividade antimicrobiana

apresentada por B. laciniosa, pois apresentam capacidade de inibir o crescimento

microbiano. Esses constituintes são conhecidos por serem sintetizados por plantas

em resposta a uma infecção microbiana, podendo agir como uma substância

antimicrobiana eficaz contra uma grande variedade de micro-organismos, tais como:

vírus, bactérias e fungos (VIJAYAKUMAR et al., 2012). O mecanismo de ação

responsável pela sua atividade é provavelmente devido à sua capacidade para

complexar com proteínas extracelulares e solúveis e com a parede das células

bacterianas, formando um complexo irreversível com aminoácidos nucleofílicos,

muitas vezes levando a inativação da proteína e consequente perda de função. Os

alvos prováveis na célula microbiana são adesinas expostos à superfície,

polipeptideos de parede celular e enzimas ligadas à membrana (COWAN, 1999).

Por meio da observação dos resultados foi possível perceber que as fases do

extrato se apresentaram de forma semelhante em relação à resposta biológica

contra a cepa S. aureus, porém, do ponto de vista químico a fase acetato de etila

exibiu uma maior concentração de fenilpropanoides em sua composição, fato

observado pela coloração mais intensa na CCD, que não pôde ser observado nos

outros. Esses resultados merecem destaque, tendo em vista que existem cepas de

S. aureus multirresistente a diversos agentes antimicrobianos devido à seleção

natural resultante do uso indiscriminado de antimicrobióticos. É necessária a

continuidade da pesquisa para que se possa investigar por meio de concentrações

menores, qual fase apresenta melhor atividade bactericida.

112

Nesse estudo, pôde-se notar que B. laciniosa agiu como um inibidor efetivo

contra cepas de S. aureus. Isso provavelmente se deve ao fato de seu extrato e

fases apresentarem em sua constituição compostos fenólicos como flavonoides,

fenilpropanoides além da presença de terpenóides. Todas essas substâncias

apresentam um grande potencial antimicrobiano, sendo já bastante referenciadas na

literatura com relação a essa atividade biológica.

Diante disso, pode-se reconhecer que a espécie B. laciniosa apresenta uma

constituição química bastante rica do ponto de vista químico e biológico, além disso,

ela se mostrou um potente inibidor microbiano, podendo vir a ser por meio da

continuação dos estudos dessa natureza, uma promissora candidata à droga contra

infecções por S. aureus.

113

Tabela 8 - Atividade antibacteriana do extrato etanólico bruto e fases das folhas de B. laciniosa.

Extrato Bl-EEB Bl-EP Bl-CHCl3 Bl-AcOEt GEN

Microrganismo CIM

CBM CIM

CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Enterococcus faecalis - - - - 6,25 - 6,25 - 0,4 0,4

Escherichia coli - - - - 12,5 - - - * 0,4

Klebsiella pneumoniae - - - - - - - - 0,05 0,05

Salmonela choleraesuis - - - - 12,5 - 12,5 - 0,05 0,05

Serratia marcescens 12,5 - 6,25 - 6,25 - 6,25 - * 0,025

Shigella flexneri 0,195 12,5 0,195 12,5 0,195 12,5 0,195 12,5 * 0,025

Staphylococcus aureus 3,125 3,125 0,195 0,195 0,195 0,195 0,195 0,195 0,025 0,025

CIM = concentração inibitória mínima; CBM = concentração bactericida mínima; Bl-EEB = extrato etanólico bruto; Bl-EP = Fase éter de petróleo;

Bl-CHCl3 = Fase clorofórmio; Bl-AcOEt = fase acetato de etila. Valores expressos como mg.mL-1; (-) ausência de atividade em todas as

concentrações testadas; (*) ausência de crescimento em todas as concentrações testadas. Fonte: Autoria própria.

114

6. CONCLUSÕES

115

6. CONCLUSÕES

A análise da fase éter de petróleo por CG-MS identificou um total de vinte e

cinco constituintes, obtendo-se como compostos majoritários o β-sitosterol (24,48%)

e o estigmasterol (11,3%).

A análise BL-EEB e suas frações Bl-EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt por HPLC-IT-

MS/MS com a aplicação da técnica de networking molecular levou a identificação de

fenilpropanoides gliceróis e glicosídeos e ácidos graxos em uma rede integrada com

os dados MS/MS agrupados pela similaridade entre os fragmentos. Além disso, esse

experimento levou a identificação de 22 contituintes pertencentes às classes de

fenilpropanoides, flavonoide e ácidos graxos da fase BL-EEB. Esse estudo foi

realizado pela primeira vez com a espécie B. laciniosa e 21 dos constituintes

detectados nunca tinham sido relatados anteriormente para essa planta.

O estudo fitoquímico dos extratos de B. laciniosa por meio de análises por

cromatografia líquida clássica e de ressonância magnética nuclear de RMN de 1H e

13C levou ao isolamento das substâncias Bl-1 e Bl-2/Bl-3, as quais foram

identificadas como o flavonoide quercetina 3,3’,4’-trimetil éter e a mistura de

esteróides β-sitosterol e estigmasterol.

Nos testes de atividade antimicrobiana com o extrato e fases de B. laciniosa

as fases Bl-EP, Bl-CHCl3 e Bl-AcOEt obtiveram forte atividade contra a cepa

bacteriana S. aureus. Os valores de CIM e CBM demostraram forte inibição do

crescimento bacteriano, com a efetividade das fases na menor concentração

testada. Além disso, por meio da relação CIM/CBM foi possível classificar o extrato e

as fases como bactericida contra S. aureus e bacteriostático contra S. flexneri.

De maneira geral a efetividade do extrato e fases contra essa cepa bacteriana

provavelmente esta relacionados aos compostos fenólicos presentes nos extratos,

tais como: fenilpropanoides, derivados do ácido cinâmico e flavonoides, além da

considerável presença de terpenos. Pois, estudos na literatura relacionam sua

atividade antimicrobiana a vários desses constituintes. Além disso, os compostos

fenólicos são conhecidos por serem sintetizados por plantas em resposta a uma

infecção microbiana, podendo agir como uma substância antibiótica muito eficaz.

Em resumo, a espécie B. laciniosa apresentou uma constituição química

bastante rica do ponto de vista químico e biológico com a presença de compostos

fenólicos muito interessantes biologicamente, mostrando, que essa espécie

116

apresenta um grande potencial biológico a ser explorado. Além disso, B. laciniosa se

mostrou um potente inibidor microbiano, podendo vir a ser por meio da continuação

dos estudos dessa natureza, uma promissora candidata à droga contra infecções

por S. aureus.

117

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGRA, M. F. et al. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 17, p. 114-140, 2007. AKIHISA, T. et al. Triterpene alcohols from the flowers of Compositae and their anti-inflammatory effects. Phytochemistry, v. 43, p. 1255–1260, 1996. ALBERNAZ, L. C. et al. Investigation of plants extracts in tradicional medicine of the Brazilian Cerrado against protozoans and yeasts. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 131, n. 1, p. 116-121, 2010. ALBUQUERQUE, U. P. et al. Medicinal plants of the caatinga (semi-arid) vegetation of NE Brazil: a quantitative approach. Journal of Ethnopharmacology, v. 114, p. 325-354, 2007. ALBUQUERQUE, U. P; ANDRADE, L. H. C. Uso de recursos vegetais da caatinga: o caso do agreste do Estado de Pernambuco (Nordeste do Brasil). Interciência, v. 27 n. 7 p. 336-45, 2002. ALIGIANIS, N. et al. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of two Origanum species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 49, n. 9, p. 4168-4170, 2001. ALLARD, P. M. et al. Integration of Molecular Networking and In-Silico MS/MS Fragmentation for Natural Products Dereplication. Analytical Chemistry, 2016. ALONSO-PAZ, E. A. et al. Screening of Uruguayan medicinal plants for antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 45 p. 67-70, 1995. AMENDOEIRA, F. C. et al. Antinociceptive effect of Nidularium procerum: A Bromeliaceae from the Brazilian coastal rain forest. Phytomedicine, v.12, p. 78-87, 2005. AMIC, D. et al. SAR and QSAR of the antioxidant activity of flavonoids. Current Medicinal Chemistry, v. 14, p. 827–845, 2007. ANGELIM, A. E. S. et al. Germinação e aspectos morfológicos de plantas de Macambira (Bromelia laciniosa), encontradas na região do Vale do São Francisco. Revista Brasileira de Biociências, v. 5, p. 1065-1067, 2007. ANTONIO, N.; BEATRIZ, D. L. H.; ANGEL, V. Anti-Inflammatory and Immunomodulating Properties of a Sterol Fraction from Sideritis foetens CLEM. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 24, n. 5, p. 470-473, 2001. ASTANI, A.; REICHLING, J.; SCHNITZLER, P. The inhibitory effect of monoterpene, phenylpropanoid and sesquiterpene components of essential oils against herpes simplex vírus. Planta Medica, v. 75, 2009.

118

AYTAC, Z.; UYAR, T. Antioxidant activity and photostability of α-tocopherol/β-cyclodextrin inclusion complex encapsulated electrospun polycaprolactone nanofibers. European Polymer Journal, v. 79, p. 140-149, 2016. BARREIRO, J. E.; BOLZANI, S. V. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009. BARTOSINSKA, E.; BUSZEWSKA-FORAJTA, M.; SILUK, D. GC–MS and LC–MS approaches for determination of tocopherols and tocotrienols in biological and food matrices. Journal of Pharmaceutical and Biomedical, Anal. n. 127, p. 156-169, 2016. BASKAR, A. A. M. β-Sitosterol prevents lipid peroxidation and improves antioxidant status and histoarchitecture in rats with 1,2-dimethylhydrazine-induced colon cancer. Journal of Medicinal Food, v. 15, p. 335-43, 2012. BENZING, D. H. Bromeliaceae: profile of an adaptive radiation. Cambrigde: University Press, 2000. 590p. BESSA, M. N. A macambira - bromelia forrageira. 2. Ed. Natal: EMPARN, 1982. 135 p. BEZERRA, D. A C. Abordagem fitoquímica, composição bromatológica e atividade

antibacteriana de Mimosa tenuiflora (Wild) Poiret E Piptadenia stipulacea (Benth)

Ducke. Acta Scientiarum. Biological Sciences, Maringá, v. 33, n. 1, p. 99-106,

2011.

BIYITI, L. F et al. Recherchede l’activité antibactérienne de quatre plantes médicinales Camerounaises. Pharmacologie et Medecine Traditionelle en Afrique, v. 13, p. 11-20, 2004. BÔAS, V. K. G.; GADELHA, G. A. C. Oportunidades na indústria de medicamentos e a lógica do desenvolvimento local baseado nos biomas brasileiros: bases para a discussão de uma política nacional. Caderno de Saúde Pública, v. 23, n. 6, p.1463-1471, 2007. BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Biodiversidade da caatinga: áreas e ações prioritárias para aconservação. Brasília: Ministério do Meio Ambiente e Universidade Federal de Pernambuco, 2002. 36p. BRAZ, R. et al. Quality control and TLC profile data selected plant species commonly found in the Brazilian Market. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 22, n. 5, p. 1111-1118, 2012. BRINGMANN, G. J. et al. 6-Hydroxyluteolin-7-O-(1”-α-rhamnoside) from Vriesea sanguinolenta Cogn. and Marchal (Bromeliaceae). Phytochemistry, v. 53, p. 965-969, 2000. BROECKER, S. et al. Development and practical application of a library of CID accurate mass spectra of more than 2,500 toxic compounds for systematic

119

toxicological analysis by LC–QTOF-MS with data-dependent acquisition. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 400, p. 101-117, 2011. CABRERA, G. M.; GALLO, M.; SELDES A. M. Cycloartane derivatives from Tillandsia usneoides. The Journal of Natural Products, v. 59, n. 4, p. 343-347, 1996. CABRERA, G. M.; GALLO, M.; SELDES, A. M. 1995. A 3,4-seco-cycloartane derivative from Tillandsia usneoides. Phytochemistry, v. 39, n. 3, p. 665-666, 1995. CAMACHO-HERNÁNDEZ, I. L. et al. Antifungal activity of fruit pulp extract from Bromelia pinguin. Fitoterapia, v. 73, n. 5, p. 411-413, 2002. CANTILLO-CIAU, Z. et al. Two new 24-Isopropenyl-lanostanoids from Tillandsia brachycaulos. Verlag der Zeitschrift für Naturforschung, v. 58, p. 649-654, 2003. CANTILLO-CIAU, Z.; BRITO-LOEZA, W.; QUIJANO, L. Triterpenoids from Tillandsia fasciculata. Journal of Natural Products, v. 64, n. 7, p. 953-5, 2001. CARVALHO, J. C. T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E. P. Compostos fenólicos simples e heterosídicos. In: SIMÕES M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5 ed. UFSC, 2003. p. 519-550. CARVALHO, A. A et al. Antitumor Phenylpropanoids Found in Essential Oils. BioMed Research International, 2015. CARVALHO, K. I. M. et al. Antiulcer activity of ethanolic extract of Encholirium spectabile Mart.ex Schult & Schult f. (Bromeliaceae) in rodents. Biological Research, v. 43, p. 459-465, 2010. CEITA, G. O. et al. Cytogenetics of Brazilian species of Bromeliaceae. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 158, p. 189-193, 2008. CHAMPE, P. C.; HARVEY, R. A.; FERRIER, D. R. Bioquímica Ilustrada. 4. Ed. Porto Alegre: Artmed, 2008. 533p. CHAUDHARY; KISHORE. Stigmasterol: a comprehensive review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, v. 2, n. 9 p. 2259-2265, 2011. CHEDIER, L. M.; KAPLAN, M. A. C. Chemical ecology of three species of

Bromeliaceae. Bromelia, v. 3, n. 25-31, 1996.

CHIARADIA, M.C.; COLLINS, C.H.; JARDIM, I.C.S.F. O estado da arte da cromatografia associada à espectrometria de massas na análise de compostos tóxicos em alimentos. Química Nova, v. 31, n. 3, p. 623-636, 2008. COAST, J.; SMITH, R. D.; MILLAR, M. R. An economic perspective on policy to reduce antimicrobial resistance Social Science & Medicine, v. 46, n. 1, p. 29-38, 1998.

120

COELHO, R. G. et al. Chemical composition and antioxidant and antimycobacterial activities of Bromelia balansae (Bromeliaceae). Journal of Medicinal Food, v. 13, p. 1277-1280, 2010. COSTA, M. et al. Screening in mice of some medicinal plants used for analgesic purposes in the state of Sao Paulo part II. Journal of Ethnopharmacology, v. 27, p. 25-33, 1989. COSTA, N.T.S. et al. Atividade antibacteriana em alguns extratos vegetais do semi-árido brasileiro. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 13, supl 2, p. 5-8, 2003. COSTA-LOTUFO, L. V. et al. The cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated from Copaifera langsdorffii oleo-resin. Toxicon, v. 40, n. 8, p. 1231-1234, 2002. COWAN, M. M. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, p. 564-582, 1999. CRAGG, G. M; NEWMAN, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta, p. 3670-3695, 2013. CROTTI, A. E. M. et al. Espectrometria de massas com ionização por “eletrospray”: processos químicos envolvidos na formação de íons de substâncias orgânicas de baixo peso molecular. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 287-292, 2006. CUSHINE, T. P; LAMB, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents, v. 26, p. 343–56, 2005. CZELUSNIAK, K. E. et al. Farmacobotânica, fitoquímica e farmacologia do Guaco: revisão considerando Mikania glomerata Sprengel e Mikania laevigata Schulyz Bip. ex Baker. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 2, p. 400-409, 2012. DANTAS, A. C. S. et al. Acaricidal activity of extracts from the leaves and aerial parts of Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Research in Veterinary Science, v. 100, p. 165-168, 2015. DELAPORTE, R. H. et al. Evaluation of the antioedematogenic, free radical scavenging and antimicrobial activities of aerial parts of Tillandsia streptocarpa Baker - Bromeliaceae. The Journal of Ethnopharmacology, v. 95, v. 2/3 p. 229-233, 2004. DE OLIVEIRA, G.G. et al. Dereplication of flavonoid glycoconjugates from Adenocalymma imperatoris-maximilianii by untargeted tandem mass spectrometry-based molecular networking. Planta Medica, 2016. DIAS-JÚNIOR, H.; MELO, N. I.; CROTTI, E. M. Eletrospray ionization tandem mass spectrometry as tool for the structural elucidation and dereplication of natural products: An overview. In: Tandem mass spectrometry - Applications and principles. Intechopen, 2012. Cap. 25, p. 595-618.

121

DIAS, D. A.; URBAN, S.; ROESSNER, U. A Historical Overview of Natural Products in Drug Discovery. Metabolites, v. 2, p. 303-336, 2012. DIÁZ, A. M. et al. Phenylpropanoid glycosides from Scrophularia scorodonia: In vitro anti-inflammatory activity. Life Sciences, v. 74, p. 2515–2526, 2004. DIDRY, N. et al. Isolation and antibacterial activity of phenylpropanoid derivatives from Ballota nigra. Journal of Ethnopharmacology, v. 67, n. 2, p. 197-202, 1999. DJERASSI; MCCRINDLE. 789. Terpenoids. Part LI. The isolation of some new cyclopropane-containing triterpenes from Spanish moss (Tillandsia usneoides, L.) Journal of the Chemical Society, p. 4034-4039, 1962. DOMINGUES, L. F. et al. In vitro and in vivo evaluation of the activity of pineapple (Ananas comosus) on Haemonchus contortus in Santa Ines sheep. Veterinary Parasitology, v. 97, p. 263-270, 2013. DUARTE, M. C. T. Atividade Antimicrobiana de Plantas Medicinais e Aromáticas Utilizadas no Brasil. Revista Multiciência, Campinas, v. 7, 2006. DUTRA, A. S.; TEÓFILO E. M.; FILHO SM. Germinação de sementes de macambira (Bromelia laciniosa Mart. ex Schult). Revista Caatinga, v. 23, n. 2, p. 12-17, 2010. DUTTA, S.; BHATTACHARYYA, D. Enzymatic, antimicrobial and toxicity studies of the aqueous extract of Ananas comosus (pineapple) crown leaf. Journal of Ethnopharmacology, v. 150, p. 451-457, 2013. ESTEL, R. E.; FREDRICKSON, E. L.; JAMES, D. K. Effect of light intensity and wavelength on concentration of plant secondary metabolites in the leaves of Flourensia cernua. Biochemical Systematics and Ecology, v. 65, p. 108-114, 2016. FERNANDES, C. R. et al. The protective role of Lychnophora ericoides Mart. (Brazilian arnica) in 1,2-dimethylhydrazine-induced experimental colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, v. 63, p. 593-599, 2011. FERREIRA, R. O. Contribuição ao estudo químico e avaliação da atividade antioxidante dos frutos verdes de Clusia paralicola (Clusiaceae). 2011. 118f. Dissertação (Mestrado em química) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife-PE, 2011. FUMAGALI, E. et al. Produção de metabólitos secundários em cultura de células e tecidos e plantas: o exemplo dos gêneros Tabernaemontana e Aspidosperma. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, p. 627-641, 2008. GARCIA, M. D. et al. Topical anti-inflammatory activity of phytosterols isolated from Eryngium foetidum on chronic and acute inflammation models. Phytotherapy Research, v. 13, p. 78-80, 1999

122

GERAN, R. I. et al. Protocols For screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemotherapy Reports, n. 3, p. 1-103, 1972. GILMARTIN, A. J. Transandean distributions of Bromeliaceae in Ecuador. Ecology, v. 54, p. 1389-1393, 1973. GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, n. 2, p. 374-381, 2007. GOBBO-NETO, L. et al. Evaluation ofthe anti-inflammatory and antioxidant activities of di-C-glucoflavones from Lychnophora ericoides (Asteraceae). Planta Medica, v. 71, p. 3-6, 2005. GONZALES, G. B. et al. Flavonoid-gastrointestinal mucus interaction and its potential role in regulating flavonoid bioavailability and mucosal biophysical properties. Food Research International, v. 88, p. 342-347, 2016. GRANGE, J. M.; DAVEY R. W. Antibacterial properties of propolis (beeglue). Journal of the Royal Society of Medicine, v. 83, p. 159-60, 1990. GRANT, J. R.; ZIJLSTRA, G. Ananotated catalogue of the generic names of the Bromeliaceae. Selbyana, v. 19, n. 1, p. 91-121, 1998. GUIMARÃES, D. O.; MOMESSO, L. S.; PUPO, M. T. Antibióticos: importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Química Nova, v. 33, n. 3, p. 667-679, 2010. GUPTA, A. et al. Antidiabetic and antioxidant potential of β-sitosterol in treptozotocin-induced experimental hyperglycemia. Journal of Diabetes, v. 3 p. 29-37, 2011. HERRAIZ, T.; GALISTEO, J. Tetrahydro-β-carboline Alkaloids Occur in Fruits and Fruit Juices. Activity as Antioxidants and Radical Scavengers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 51, p. 7156-7161, 2003. HÖRDEGEN, P. et al. The anthelmintic efficacy of five plant products against gastrointestinal trichostrongylids in artificially infected lambs. Veterinary Parasitology, v. 117, p. 51-60, 2003. HÖRDEGEN, P. et al. In vitro screening of six anthelmintic plant products against larval Haemonchus contortus with a modified methyl-thiazolyl-tetrazolium reduction assay. Journal of Ethnopharmacology, v. 108, p.85-89, 2006. ISLAM, M. K. et al. In vitro anthelmintic activity of three Bangladeshi plants against Paramphistomum cervi and Haemonchus contortus. Journal of Complementary and Integrative Medicine, v. 12, n. 2, p. 171-174, 2015. KARAN, S. K. et al. Isolation of β- sitosterol and evaluation of antidiabetic activity of Aristolochia indica in alloxan induced diabetic mice with reference to in-vitro

123

antioxidant activity. Journal of Medicinal Plants Research, v. 6, n. 7, p. 1219-1223, 2012. KIM, S. K. et al. The effects of the antioxidant α-tocopherol succinate on cisplatin induced totoxicity in HEI-OC1 auditory cells. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, v. 86, p. 9-14, 2016. KOO, H. et al. Effects of compounds found in propolis on Streptococcus mutans growth and on glucosyltransferase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 46, p. 1302-1309, 2002. KORKINA, L. et al. Plant Phenylpropanoids as Emerging Anti-Inflammatory Agents.

Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, v. 11, p. 823-835, 2011. LANÇAS, F. M. A Cromatografia Líquida Moderna e a Espectrometria de Massas: finalmente “compatíveis”?. Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, 2009. LAOUER, H. et al. An antibacterial and antifungal phenylpropanoid from Carum montanum (Coss. et Dur.) Benth. et Hook. Phytotherapy Research, v. 23, n. 12, p. 1726-1730, 2009. LAW, M. Plant Sterol and Stanol Margarines in Health. Britsh Medical Journal, v. 320, p. 861-864, 2000. LEAL, I. R. et al. Mudando o curso da conservação da biodiversidade na Caatinga do Nordeste do Brasil. Megadiversidade, v. 1, n. 1, p. 139-146, 2005. LEITE, S. N.; SCHOR, N. Fitoterapia no Serviço de Saúde: significados para clientes e profissionais de saúde. Saúde Debate, v. 29, n. 69, p. 78-85, 2005. LIMA, S. S. R. G. et al. Antinociceptive properties and acute toxicity of ethanolic extract of Bromelia laciniosa. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, v. 13, p. 1659-1666, 2014. LIMA-SARAIVA, S. R. et al. Antinociceptive effect of Encholirium spectabile: A Bromeliaceae from the Brazilian caatinga biome. Pharmacognosy Magazine, v. 10 p. 655-60, 2012. LIMA, C. S. A. et al. Antimicrobial activity of a mixture of two isomeric phenylpropanoid glycosides from Arrabidaea harleyi A.H. Gentry (Bignoniaceae). Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 39, n. 1, 2003. LOPES, A. C. W. C. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica para extrato de Passiflora incarnata Linneaus. 2013. 76f. Dissertação (Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal do Rio Grande so Sul, Porto Alegre, 2013. LAOUER, H. K. et al. An antibacterial and antifungal phenylpropanoid from Carum montanum (Coss. et Dur.) Benth. et Hook. Phytotherapy Research, v. 23, n. 12, p. 1726-1730, 2009.

124

LOWE, H. I. C. et al. Antileukemic activity of Tillandsia recurvata and some of its cycloartanes. Anticancer research, v. 34, n. 7, p. 3505-3509, 2014. LUTHER, E. H. Analphabecal list of bromeliad binomies.7 ed. Sarasota:The Marie Selby Botanical Gardens, 2000. 143p. LUTHER, H. E. An Alphabetical list of bromeliad binomes. Oregon: The Bromeliad Society Inc., 2000. 98p. MA, C. et al. Characterization of active phenolic components in the ethanolic extract of Ananas comosus L. leaves using high-performance liquid chromatography with diode array detection and tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography, v.1165, p. 39-44, 2007. MANETTI, L. M. DELAPORTE, R. H. LAVERDE-JÚNIOR, A. Metabólitos secundários da família Bromeliaceae. Química Nova, v. 32, n.7, p. 1885-1897, 2009. MANETTI, L. M. et al. Avaliação das atividades antimicrobiana, citotóxica, moluscicida e antioxidante de Bromelia antiacantha Bertol. (Bromeliaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 12, n. 4, p. 406-413, 2010. MAREGESI, S. M. et al. Screening os some tanzanian medicinal plants from bunda district for antibacterial, antifungical and antiviral activities. Journal of Ethnopharmacology, v. 119, p. 58-66, 2008. MARKER, R. E. et al. Sterols CLVII. Sapogenins. LXIX. Isolation and structures of thirteen new steroidal sapogenins. New sources for known sapogenins. Journal of the American Chemical Society, v. 65 n. p. 1199-1209, 1943. MARQUES, G.; GUTIERREZ, A.; DEL RIO, J. C. Chemical characterization of lignin and lipophilic fractions from leaf fibers of curaua (Ananas erectifolius). Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 55, n. 4, p. 1327-1336, 2007. MARRASSINI, C. et al. Vicenin-2, a potential anti-inflammatory constituent of Urtica circularis. Journal of Natural Products, v. 74, p. 1503-7, 2011. MARTSON, A.; HOSTETTMANN, K. Natural Product Analysis over the Last Decades. Planta Medica, v. 75, p. 672–682, 2009. MONTANARI, C. A.; BOLZANI, V. S. Planejamento racional de fármacos baseado em produtos naturais. Química Nova, v. 24, p.105-111, 2001. MORAES, M. E. A.; SANTANA, G. S. M. Aroeira-do-sertão: um canditado promissor para o tratamento de úlceras gástricas. Funcap, v. 3, p. 5-6, 2001. MOREIRA, J. N.; LIRA, M. A.; SANTOS, M. V. F. Caracterização da vegetação de caatinga e da dieta de novilhos no sertão de Pernambuco. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 41, n. 11, p.1643-1651, 2006.

125

MORI, A. et al. Antibacterial Activity and mode of action of plant flavonoids against Proteus Vulgaris. Phytochemistry, v. 26, n. 8, p. 2231-2234, 1987. MÜLLER, S. D. et al. LC and UV determination of flavonoids from Passiflora alata medicinal extracts and leaves. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 37, p. 399-403, 2005. NAGAPRASHANTHA, L. D. et al. Anti-cancer effects of novel flavonoid vicenin-2 as a single agent and in synergistic combination with docetaxel in prostate cancer. Biochemical Pharmacology, v. 82, p. 1100-9, 2011. NAVARRO, A.; DE LAS HERAS, B.; VILLAR A. Anti-inflammatory and immunomodulating properties of a sterol fraction from Siderites foetens Clem. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 24, p. 470-473, 2001. NEMADEO, A. G. Plant Cell Elicitation for Production of Secondary Metabolites: A Review. Pharmacognosy Reviews, v. 1, p. 69-79, 2007. NETO, F. C. et al. Dereplication of Natural Products Using GC-TOF Mass Spectrometry: Improved Metabolite Identification by Spectral Deconvolution Ratio Analysis. Frontiers in Molecular Biosciences, v. 3, 2013. NICOLINI, P. et al. Fatores relacionados à prescrição médica de antibióticos em farmácia pública da região Oeste da cidade de São Paulo. Ciência & saúde coletiva, v. 13, p. 689-696, 2008. NIELSEN, K. F. et al. Dereplication of microbial natural products by LC-DAD-TOFMS. Journal of Natural Products, v. 74, p. 2338–2348, 2011. OLIVEIRA-JÚNIOR. R. G. et al. Phytochemical screening, antioxidant and antibacterial activity of extracts from the flowers of Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae). Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, v. 4, p. 4489-4494, 2012. OLIVEIRA-JÚNIOR, R. G. et al. The first flavonoid isolated from Bromelia laciniosa (Bromeliaceae). Journal of Medicinal Plant Research, v. 8 p. 558-563, 2014. OLIVEIRA, A. et al. Anti-inflammatory activity of Vismia guianensis (Aubl.) Pers. extracts and antifungal activity against Sporothrix schenckii. Journal of Ethnopharmacology, v. 195, p. 266-274, 2016. PAKRASHI, S. C.; ACHARI, B.; MAJUMDAR, P. C. Studies on Indian medicinal-plants: Part XXXII - constituents of Ananas comosus (Linn) Merr leaves. Journal of Chemistry, v. 13, n. 7, p.755-756, 1975. PARADA, F. P.et al. 1-O-fl-D-Glucopyranosyl anthranilate from pilquela (Bromelia plumieri) fruit. Phytochemistry, v. 42, n. 3, p. 871-873, 1995. PATEL, K. N. et al. Introduction to hyphenated techniques and their applications in pharmacy. Pharmaceutical Methods, v. 1, 2010.

126

PATEL, J. M. Review of Potential Health Benefits of Flavonoids. Lethbridge Undergraduate Research Journal, v. 3, n. 2, 2008. PAYROL, J. A.; MARTINEZ, M. M. Estudio farmacognóstico de Bromelia pinguin L. (Piña de Ratón). Revista Cubana de Farmacia, v. 34, n. 3, 181-186, 2000. PEREIRA, R. J.; CARDOSO, M. G. Metabólitos secundários vegetais e benefícios antioxidantes. Journal of Biotechnology and Biodiversity, v. 3, n. 4, p. 146-152, 2012. PANIAGUA-PÉREZ, R. et al. Cell protection induced by beta-sitosterol: inhibition of genotoxic damage, stimulation of lymphocyte production, and determination of its antioxidant capacity. Archives of Toxicology, v. 82, n. 9, p. 615-622, 2008. PILON, A. C. et al. Partial least squares model and design of experiments towards the analysis of the metabolome of Jatropha gossypifolia leaves: Extraction and chromatographic fingerprint optimization. Journal of Separation Science, v. 39, p. 1023-1030, 2016. PINTO, A. C. et al. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v. 25, p.45-61, 2002. PRABHAKAR, M. C. Pharmacological Investigations on Vitexin. Planta Medica, v. 43, p. 396-403, 1981. PRADO, D. As caatingas da América do Sul. In: I.R. LEAL, M. TABARELLI & J.M.C. Silva (eds.). Ecologia e conservação da Caatinga. Recife: Editora Universitária, UFPE, 2003. p. 3-73. PROESTOS, C. et al. Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants: investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity. Food Chemistry, v. 95, n. 664-67, 2006. RAFFAUF, R. F. et al. Antitumor Plants. 1 1 . Diterpenoid and Flavonoid Constituents of Bromelia pinguin L. Journal of Organic Chemistry, 46, p. 1094, 1981. RAUHA, J. P. et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds. International Journal of Food Microbiology, v. 56, p. 3-12, 2000. REFLORA. Lista de Espécies da Flora do Brasil. Rio de Janeiro, 2014. Disponível em: <http://www.floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/listaBrasil> Acesso em: 5. ago. 2016. REITZ, R.1983. Bromeliaceas e a malária-bromélia endêmica. Flora Ilustrada Catarinense, Itajaí, SC. ROEMER, T. Confronting the Challenges of Natural Product-Based Antifungal Discovery. Chemistry & Biology Perspective, v. 18, p 148-164, 2011. ROCHA, C. F. D. et al. Bromélias: ampliadoras da biodiversidade. Bromelia, v.4, n. 4, p. 7-10, 1997.

http://www.floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/listaBrasil

127

ROCHA, F. D. et al. Brazilian Bromeliaceae species: isolation of arylpropanoid acid derivatives and antiradical potential. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, p. 240-245, 2010. RODRIGUES, M. V. N. et al. O emprego de técnicas hifenadas no estudo de plantas medicinais. Multiciência, v. 7, p. 1-14, 2006. RODRIGUES, et al. Caracterização físicoquímica de creme vegetal enriquecido com ésteres de fitosteróis. Revista Brasileira de Ciências, v. 40, n. 4, 2004. SÁ, R. D. C. S. et al. A review on anti-inflammatory activity of phenylpropanoids found in essential oils, Molecules, v. 19, n. 2, p. 1459-1480, 2014. SAEIDNIA, S. et al. The Story of Beta-sitosterol - A Review. European Journal of Medicinal Plants, v. 4, n. 5, p. 590-609, 2014. SANTANA, C. R. R. et al. Phytochemical Screening, Antioxidant and Antibacterial Activity of Encholirium spectabile (Bromeliaceae). International Journal of Sciences, v. 1, p. 1-19, 2012. SANTOS, P. H. F. et al. Bioprospecção antimicrobiana a partir de jarrinha (Aristolochia melastoma manso) e carrapicho-beiço-de-boi (Desmodium incanum DC). Revista Bionorte, v. 4, n. 1, 2015. SANTOS, V. N. C. et al. Ripe fruits of Bromelia antiacantha: investigations on the chemical and bioactivity profile. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 2, p. 358-65, 2009. SEN, A. et al. Analysis of IR, NMR and Antimicrobial Activity of β-Sitosterol Isolated from Momordica charantia. Science Secure Journal of Biotechnology, v. 1, n. 1, p. 9-13, 2012. SHANNON, P. et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research, v. 13, p. 2498-2504, 2003. SILVA, J. I. F. et al. Antimicrobial screening of some medicinal plants from Mato Grosso Cerrado. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 19, n. 1b, p. 242-248, 2009. SILVA, J. S. et al. Differences in Gastroprotective and Mutagenic Actions Between Polar and Apolar Extracts of Ananas ananassoides. Journal of Medicinal Food, v. 11, n. 1, p. 160-168, 2008. SILVA, T. S.; FREIRE, E. M. S. Abordagem etnobotânica sobre plantas medicinais citadas por populações do entorno de uma unidade de conservação da caatinga Rio Grande Norte, Brasil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 12, n. 4, p. 427-435, 2010. SILVA, D. B. et al. Mass Spectrometry of Flavonoid Vicenin-2, Based Sunlight Barriers in Lychnophora species. Scientific Reports, v. 4, n. 1, 2014,

128

SILVA, R. et al. Flavonoides: constituição química, ações medicinais e potencial tóxico. Acta Toxicológica Argentinais, v. 23, n. 1, p. 36-43, 2015. SILVERSTEIN, R. M.; WEBSTER, F. X.; KIEMLE, D. J. Espectrometria de ressonância magnética de hidrogênio. p. 123-197. In: Silverstein, R. M.; Webster, F. X.; Kiemle, D. J. Identificação espectrométrica de compostos orgânicos. 7. ed. Rio de Janeiro: LTC - Livros Técnicos e Científicos Editora S.A., 2007. 490p. SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6. ed. Florianópolis: Ed. da UFSC, 2010. SMITH, L. B; DOWNS, J. R. Bromelioideae (Bromeliaceae). Flora Neotropica Monograph 14. New York: Hafner Press, 1979. STEINGASS, C. B. et al. Studies into the phenolic patterns of different tissues of pineapple (Ananas comosus [L.] Merr.) infructescence by HPLC-DAD-ESI-MS n and GC-MS analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 407, p. 6463-6479, 2015. SUGANO, M.; MORIOKA, H.; IKEDA, I. A. comparison of hypocholesterolemic activity of betasitosterol and beta-sitostanol in rats. Journal of Nutrition, v. 107, p. 2011-9, 1977. SUNDARARAMAN, P.; DJERASSI, C. A. convenient synthesis of progesterone from stigmasterol. Journal of Organic Chemistry, v. 42, n. 22, p. 3633-3634, 1977. TREUTTER, D. Significance of flavonoids in plant resistance and enhancement of their biosynthesis. Plant Biology, v. 7, p. 581-591, 2006. UPADHYAY, A. et al. Antioxidant, antimicrobial, 15-LOX, and AGEs inhibitions by pineapple stem waste. Journal of Food Science, v. 71, 2011. VAISHNAV, P.; DEMAIN, A. Unexpected applications of secondary metabolites. Biotechnology Advances, v. 29, p. 223-229, 2010. VAN BOECKEL, T. P. et al. Global antibiotic consumption 2000 to 2010: an analysis of national pharmaceutical sales data. The Lancet Infectious Diseases, v. 14, p. 742-750, 2014. VEIGA-JUNIOR, V. F.; MELLO, J. C. P. As monografias sobre plantas medicinais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.18, n. 3, p. 464-71, 2008. VERSIEUX, L.M. WENDT, T. Bromeliaceae diversity and conservation in Minas Gerais state, Brazil. Biodiversity and Conservation, v. 16 p. 2989-3009, 2007. VIEGAS-JÚNIOR, C.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a Química Medicinal Moderna. Química Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006.

129

VIEIRA-DE-ABREU, A. et al. Anti-allergic properties of the Bromeliaceae Nidularium procerum: Inhibition of eosinophil activation and influx. International Immunopharmacology, v. 5, p. 1966-74, 2005. VIJAYAKUMAR, A. et al. Phytochemical analysis and in vitro antimicrobial activity of Illicium griffithii Hook. f. & Thoms extracts. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, p. 190-199, 2012. VILLASENOR, I. M. et al. Bioactivity studies on betasitosterol and its glucoside. Phytotherapy Research, v. 16, p. 417-21, 2002. WANG, M. et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology, v. 34, p. 828-837, 2016. WANG, W. et al. Studies on phenolic constituents from leaves of pineapple (Ananas comosus). Journal of Chinese Materia Medica, v. 31, n. 15, p. 1242-1244, 2006. WATROUS, J. et al. Mass spectral molecular networking of living microbial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 109, p. 1743-1752, 2012. WOYENGO, T. A.; RAMPRASATH V. R; JONES, P. J. H. Anticancer effects of phytosterols. European Journal of Clinical Nutrition, v. 63, p. 813-820, 2009. WHO global strategy for containment of antimicrobial resistance. Anti-infective drug resistance surveillance and containment. Disponível em: http://www.who.int/emc/amr.html WILLIAMS, C. A. The systematic implications of the complexity of leaf flavonoids in the Bromeliaceae. Phytochemistry, v. 17, p. 729, 1978. YANG, J. Y. et al. Molecular networking as a dereplication strategy. Journal of Natural Products, v. 76, p. 1686-1699, 2013. YANKAH, V. V. Lipids phytosterols and human health. In AKOH, CASIMIR C. Handbook of Functional Lipids. New York: CRC, 2006. p. 403-418. YUNES, R. A.; PEDROSA, R. C.; VALDIR, C. F. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova, v. 24, n. 1, p. 147-152, 2001.

http://www.who.int/emc/amr.html

130

APÊNDICE

136

Biological activities and chemical composition of Brazilian

Bromeliaceae species – a systematic review

1Michelle Pereira da Cruz, 1Noelly Bastos Cavalcante, 1Mariana Gama e Silva, 1Larissa

Araújo Rolim, 1Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida

1Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of San Francisco Valley,

56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil

Email address:

[email protected] (M. P. Cruz); [email protected] (N. B. Cavalcante);

[email protected] (M. G. Silva); [email protected] (L. A. Rolim);

[email protected] (J. R. G. S. Almeida)

Abstract: Studies of Bromeliaceae species have demonstrated the presence of a large

variety of chemical constituents that have important biological activities such as:

antimicrobial, antihelmintic, antinociceptive, antitumor, antiulcer and gastroprotective. Thus,

this systematic review reports the studies in the literature about the biological activities and

chemical composition of Brazilian Bromeliaceae species. The terms “Bromeliaceae”,

“phytochemistry” and “pharmacology” were used to search articles in the databases LILACS,

PUBMED, SCIELO, SCIENCE DIRECT and SCOPUS published until January 2016. From a

total of 652 studies found, 14 met the inclusion and exclusion criteria and were selected for

the research. Moreover, the present review identified 10 chemically defined natural molecules

reported in the literature obtained from Brazilian Bromeliaceae species, belonging to the

classes of flavonoids, coumaric acid derivatives and sterols. The data reviewed here suggest

that there is a large chemical and pharmacological potential in species of Bromeliaceae, which

justifies the interest in studying these plants.

Keywords: Bromeliaceae, Phytochemistry, Biological activities.

1. Introduction

The Bromeliaceae family is predominantly neotropical and comprises 58 genera and

approximately 3172 species divided into three subfamilies: Pitcairnioideae, Bromeliads

Tillandsioideae [1, 2]. It is widely distributed on the American continent, from the states of

Virginia and Texas in the southern United States, to central Argentina and Chile, except for a

single species of west tropical Africa [3]. About 50% of the known species found in Brazil,

that mainly occur in the Atlantic Coastal forest, but they can also be seen in the Amazon

region, at Caatinga, Cerrado, Restinga, Campos Rupestres and semiarid regions [4]. Although with this large number of species, the Bromeliaceae family has not been well

screened for its chemical constituents. However, there is a considerable amount of identified

137

chemical compounds, which mostly belong to the class of triterpenoids and flavonoids. Other

classes of compounds such as sterols, diterpenoids, cinnamic acid derivatives, substituted

glycerols, lignans and nitrogen-containing compounds, among others, have also been

identified in this family but to a lesser extent [5, 6]. From a pharmacological point of view

also there are few studies in the literature with species of Bromeliaceae. However, a number

of studies have shown significant pharmacological properties, such as: antimicrobial [7] and

antihelmintic [8, 9, 10], antinociceptive [11, 12], antitumoral [13], antioxidant [14], antiulcer

[15], and gastroprotective activities [16].

Despite their importance, there are no systematic reviews on the pharmacological

activity of Bromeliaceae family. Accordingly, we conducted for the first time a systematic

review of the literature to examine and synthesize the literature on chemical composition and

pharmacological activity of Brazilian Bromeliaceae species, and then identify those species

that assess pharmacological activity.

2. Materials and Methods

This work was carried out according to the guidelines for Transparent Reporting of

Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA statement) [17]. The search was conducted

in five specialized databases (LILACS, PUBMED, SCIELO, SCIENCE DIRECT and

SCOPUS), using different combinations of the following keywords: Bromeliaceae,

phytochemistry and pharmacology. The databases were searched for studies conducted in the

period up to and including January 2016. All electronic search titles, selected abstracts, and

full-text articles were independently reviewed by a minimum of two reviewers (M.P.C. and

M.G.S). To resolve disagreements on the inclusion/exclusion of certain studies was agreed

consensus among the reviewers. In this systematic review were included studies that

investigated the phytochemical and/or pharmacological activities of Brazilian Bromeliaceae

species. Studies were excluded according to the following exclusion criteria: review articles,

meta-analyses, abstracts, conference proceedings, editorials/letters and case reports. One of

the reviewers was responsible for extracting the data, which were checked by the second

reviewer. The information derived from studies were related to the name of Bromeliaceae

species investigated, the origin of the species investigated, part of the plant used, the type of

preparation, the isolated chemical substance (if any), the tested biological activity and the

model used.

3. Results and Discussion

A total of 652 studies were identified for preliminary electronic review. The primary

search identified 01 from LILACS, 175 from PUBMED, 05 from SCIELO, 448 from

SCIENCE DIRECT and 23 from SCOPUS. After the removal of duplicates and review

articles, meta-analyses, abstracts, conference proceedings, editorials/letters and case reports a

total of 298 articles was screening for relevant titles and abstracts. Eighty-eight articles were

submitted for a full-text review. Fourteen articles met the inclusion and exclusion criteria

138

established. A flow chart illustrating the progress of study selection and number of articles at

each stage were performed (Figure 1).

Figure 1: Flowchart of search and selection of studies.

3.1 Pharmacological activity and chemical composition of crude plant extracts and

fractions

In accordance with what can be observed in Table 1, a wide variety of species within

the Bromeliaceae family present pharmacological potential, especially the species Ananas

comosus and Tillandsia species genus. The first study found related to this genus was

conducted by Costa et al. [18]. In this study, the seventeen medicinal plants used popularly in

Brazil for their reputed analgesic properties were collected in the state of São Paulo and their

ethanolic extract was tested in mice by the writhing and tail flick methods. Among the

Tillandsia usneoides, belonging to Bromeliaceae family, presented a very pronounced effect

in the tail flick test.

In a study conducted by Delaporte et al. [19], the crude methanolic extract of the aerial

parts of Tillandsia streptocarpa was investigated for their acute toxicity using an oral

administration in mice and tested for antiedematogenic, antioxidant and antimicrobial

activities, through the methods of Croton oil-induced ear edema test, 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging and microdilution method, respectively. The

methanolic extract and the hexane fraction showed significant (P < 0.05) inhibition of ear

edema, observed at 2 mg/ear in the Croton oil-induced mice ear edema test. In the DPPH free

139

radical scavenging test was observed for the methanolic extract a strong antioxidant effect

(IC50 = 0.0056%, w/v). The antimicrobial activity assay showed that the crude methanolic

extract was inactive against the strains analyzed. However, the methanolic extract of ripe

fruits of Bromelia balansae was used through the resazurin microtiter assay to measure the

biological activity in vitro against Mycobacterium tuberculosis. The results showed that the

extract showed antibacterial activity with moderate effect, displaying a minimal inhibitory

concentration of 128 mg/mL [19].

Domingues et al. [9] evaluated the antihelmintic activity of Ananas comosus against

Haemonchus contortus in Santa Inês sheep. The aqueous extract of pineapple skin (AEPS),

bromelain from pineapple stems (B4882) and residue from pineapple processing was

evaluated in vitro and in vivo tests. The egg hatch test (EHT) and larval development test

(LDT) were performed and the results obtained in the in vitro study showed that the aqueous

extract was very effective with a dose-dependent inhibitory effect. In the egg hatch test, the

LC50 and LC90 were, respectively, 31 and 81 mg/mL for the aqueous extract, and 0.50 and 2

mg/mL for bromelain. In the larval development test, the LC50 and LC90 were, respectively,

1.7 and 7.3 mg/mL for the aqueous extract, and 0.019 and 0.086 mg/mL for bromelain.

Six Brazilian Bromeliaceae species was screened for antioxidant activity by

assessment of their capacity to scavenge the DPPH radical utilizing a total of twenty different

extracts encompassing fruit leaves and rhizomes. According to what was observed in the

study, it can be stated that polar rhizome extracts from Bromeliaceae representatives assayed

here show better antioxidant results than those from leaves (ANOVA, P < 0.05). The best

results were found to rhizome methanolic extracts of the species Vriesea procera (EBMRVP)

and Neoregelia cruenta (EBMRNC). Leaf extracts showed weak to moderate activities. The

EBMRVP and EBMRNC are good DPPH radical-scavengers with about 90% of DPPH

scavenged under the experimental conditions [20].

Ethanolic extract from the leaves from Encholirium spectabile was used for evaluate

their antinociceptive effects. The evaluation was carried in mice using chemical and thermal

models of nociception. The results showed that ethanolic extract has antinociceptive activity

with reduction the number of writhings by 68.59, 79.33 and 65.28%, respectively.

Additionally the extract decreased the paw licking time in the first phase, as well in the

second phase of the formalin test [11].

In a study conducted by Silva et al. [16], the extracts (methanol [MeOH] and

dichloromethane [DCM]) obtained from the leaves of Ananas ananassoides were evaluated

for their ability to protect the gastric mucosa against injuries caused by necrotizing agents (0.3

M HCl/60% ethanol, absolute ethanol, non-steroidal anti-inflammatory drugs, and pylorus

ligation) in mice and rats. The obtained results demonstrated the gastric anti-ulcer activity of

the DCM extract. In contrast, the MeOH extract did not show any significant antiulcerogenic

activity but presented mutagenic action. Similarly, a study conducted by Carvalho et al. [15]

evaluated the antiulcer activity of an ethanolic extract of Encholirium spectabile (ES-EtOH)

using four experimental models of induced acute gastric ulceration: absolute ethanol-induced

gastric ulcer, HCl/ethanol-induced gastric ulcer, ibuprofen-induced gastric ulcer, ischemia and

reperfusion-induced gastric ulcer. ES-EtOH (100 mg/kg p.o) protected the gastric mucosa

against ulceration that was induced by absolute ethanol (53%), ethanol/HCl (75%), ibuprofen

(52%) and ischemia/reperfusion (43%).

140

These results show the importance of the investigation Bromeliaceae plants with

pharmacologic potential. A total of 14 articles in the literature were selected for the

investigation of pharmacological activity of various plants of this family. The plants are listed

in Table 1 in chronological order of publication years. The botanical name, origin, part used,

preparation, biological activity, model and reference are also listed

141

Table 1. Plant extracts summary showing Pharmacological activity

Botanical name Origin Part used Preparation Biological activity Model Reference

Tillandsia usneoides Brazil ___ Ethanolic extract Analgesic activity Writhing test, tail flick test

Costa et al. [18]


Brazil Aerial parts Crude methanolic

extract

Acute toxicity and antiedematogenic,

antioxidant and antimicrobial activities

Croton oil-induced ear edema, DPPH

free radical scavenging,

microdilution method

Delaporte et al. [19]

Tillandsia streptocarpa Brazil Aerial parts Hexane fraction Antiedematogenic activity

Croton oil-induced ear edema


Nidularium procerum Brazil Leaves Aqueous extract Anti-allergic activity Allergic pleurisy in actively sensitized

mice

Vieira-de-Abreu et al. [21]

Nidularium procerum Brazil Leaves Aqueous crude extract

Anti-inflammatory activity

Induced pleurisy in mice

Amendoeira et al. [22]

Nidularium procerum Brazil Leaves and rhizomes/roots

Methanolic extract

Antinociceptive activity

Writhing test, hyperalgesia, hot

plate assay, bradykinin-induced

edema, pleurisy induced by

lipopolysaccharide, cyclooxygenase

inhibition assay and toxicological assay

Amendoeira et al. [12]

Ananas ananassoides Brazil Leaves Methanol and dichloromethane

extracts

Gastroprotective Gastric ulcer induced by ethanol

Silva et al. [16]

Bromelia antiacantha

Brazil Fruits Aqueous and methanol

Antioxidant activity, Reduction in DPPH, formation

Santos et al. [23]

142

extracts of the

Ananas bracteatus Brazil Leaves and fruits

Hexane extract, methanolic

extract

Antiradical activity DPPH UV spectrophotometric

assay

Rocha et al [20]

Bromelia antiacantha Brazil Leaves Hexane extract, methanolic

extract


assay

Rocha et al. [20]

Alcantarea brasiliana Brazil Leaves and rhizomes


extract


assay

Rocha et al.[20]

Neoregelia cruenta Brazil Leaves and rhizomes


extract


assay

Rocha et al. [20]

Pitcairnia flammea Brazil Leaves and rhizomes


extract


assay

Rocha et al. [20]

Vriesea procera Brazil Leaves and rhizomes


extract


assay

Rocha et al. [20]

Encholirium spectabile Brazil Aerial parts Ethanolic extract Antiulcer activity Induced gastric ulcer in mices and rats

Carvalho et al. [15]

Bromelia balansae Brazil Roots, leaves and fruits

Methanolic extract

Antimycobacterial activity

Biological activity in vitro

against Mycobacterium tuberculosis by

resazurin microtiter assay

Coelho et al. [24]

Bromelia antiacantha

Brazil Leaves and fruits

Alcoholic extract, hexane,

chloroform and ethyl acetate

Antimicrobial, cytotoxic,

molluscicidal and antioxidant activities

Minimum inhibitory concentrations (MIC), toxicity

bioassay,

Manetti et al. [25]

143

extract molluscicidal activity assay

Encholirium spectabile Brazil Leaves Crude ethanol extract

Antinociceptive activity

Acute toxicity, acetic acid-induced

writhing in mice, formalin test, hot

plate test and motor coordination test

Lima-Saraiva et al. [11]

Ananas comosus Brazil Skins Aqueous extract Antihelmintic activity Egg hatch test (EHT), Larval development

test (LDT)

Domingues et al. [9]

Neoglaziovia variegata Brazil Leaves and aerial parts

Ethanolic extract Acaricidal activity Adult immersion test (AIT)

Dantas et al. [26]

144

3.2 Isolation and pharmacological activity of chemically defined molecules

According to the data shown in the Table 2, it was observed that the Bromeliaceae

family is promising for the presence of biomolecules with biological activities, considering

the few studies in the literature that are related to Brazilian species. Only three articles were

found in the literature addressing Brazilian species of the Bromeliaceae. In this sense, it is

necessary to invest more in research using Brazilian species, in order to know the chemical

composition of these and isolate bioactive molecules, and investigate their biological and

pharmacological potential. The studies with Brazilian Bromeliaceae species show important

activities related to these molecules, such as antibacterial activity, antioxidant activity and

acute toxicity activity.

Coelho et al. [24] evaluated the chemical composition of Bromelia balansae species, a

medicinal plant commonly used in the central region of Brazil as a cough syrup and also eaten

roasted. The authors developed a method based on comparative high performance liquid

chromatography with diode array detection and ultraviolet analysis to check for the presence

of flavonols in the crude methanol extract of fruits, leaves, and roots of B. balansae. The

chromatography profiles of the methanolic extracts of fruits, leaves, and roots could be

established by comparing the retention times and ultraviolet spectra of the peaks with those of

isolated compounds from fruit extract. Four flavonols were isolated: kaempferol-3-O-α-L-

rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside,

quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside and kaempferol 3,7-di-O-

α-L-rhamnopyranoside. The identification of all compounds was achieved by the

experimental data (infrared, nuclear magnetic resonance, and mass spectrometry). Their

structures were also confirmed by comparing with literature data. The flavonoids, such as

flavonols, are widely present in the plant kingdom, being found in almost all fruits and

vegetables. However, according to the authors, the occurrence of glycoside flavonols in fruits

from B. balansae is reported for the first time here in this species and in the genus Bromelia.

For isolation and identification of B. balansae molecules, the authors developed a method

based on comparative high performance liquid chromatography with diode array detection

and ultraviolet analysis to check for the presence of flavonols in the crude methanol extract of

fruits, leaves, and roots of B. balansae. The chromatography profiles of the methanolic

extracts of fruits, leaves, and roots could be established by comparing the retention times and

ultraviolet spectra of the peaks with those of isolated compounds from fruit extract.

Rocha et al. [20] evaluated the chemical composition of Ananas bracteatus. The crude

methanolic extract of A. bracteatus (denominated EMFA) was suspended in H2O:MeOH

solution (6:4) and partitioned with hexane, CH2Cl2, EtOAc and BuOH, affording

dichloromethane fraction (PDFA), ethyl acetate fraction (PAFA) and buthanol fraction

(PBFA). The PAFA was concentrated under reduced pressure affording 3 g of a residue,

which was re-dissolved in a CHCl3:MeOH solution (6:1) and submitted to a liquid-liquid

extraction procedure successively with 5% sodium bicarbonate. The purification of the crude

methanol extract of the leaves of A. bracteatus afforded four metabolites: 2-O-feruloyl

glyceride, 2-O-p-coumaroyl glyceride, 5,7,4’-trihydroxy-3,3’,5’-trimethoxyflavone and 3-O-

β-D-glucopyranosyl sitosterol. To confirm the identity of the substances, the 1H and 13C NMR

techniques and UV spectroscopy were used.

145

Delaporte et al. [19] investigated the antiedematogenic, antioxidant and antimicrobial

activities of the crude methanolic extract of the aerial parts of Tillandsia streptocarpa. Also,

the antiedematogenic activity of the hexane fraction resulting from the partition of the crude

methanolic extract was evaluated. For the isolation of substances, the hexane fraction of the

methanolic extract was submitted to a chromatographic column on silica gel, eluting with a

mixture of hexane:dichloromethane and dichloromethane:ethyl acetate in increasing polarity,

yielding 221 fractions of 7 mL each. After thin layer chromatography (TLC) comparison,

fractions with a similar TLC pattern were grouped into 13 sub-fractions. The chemical

investigation on the hexane fraction resulted in the isolation of cycloartenol 1,4’,5-dihydroxy-

3’,7-dimethoxyflavanone and a mixture of stigmasterol, β-sitosterol and campesterol. To

confirm the identity of the substances, the 1H and 13C NMR techniques were used.

The present review encountered 10 chemically defined natural molecules reported in

the literature obtained from Brazilian Bromeliaceae family plants. The active compounds,

which have been isolated and identified, belong to the classes of flavonoids (6), coumaric acid

derivatives (3) and sterols (1). The compounds are listed in Table 2 in chronological order of

publication years. Each entry gives the following informations in sequence: botanical name,

origin, part used, chemical substance, class, biological activity, model and reference.

146

Table 2. Chemically defined molecules and Pharmacological activity

Botanical name Origin Part used Chemical substance Class Biological activity

Model Reference


Brazil Aerial parts Cycloartenol Sterol ___ Acute toxicity test, antibacterial and antifungal assays and Croton oil-

induced ear edema



Brazil Aerial parts 4,5-dihydroxy-3’,7-dimethoxyflavanone

Flavonoid ___ Acute toxicity test, antibacterial and antifungal assays and Croton oil-

induced ear edema


Ananas bracteatus


2-O-feruloyl glyceride Ferulic acid derivative

___ Chromatography on Sephadex® LH-20 gel, silica gel 60

and Amberlite XAD-2, RMN

Rocha et al. [20]

Ananas bracteatus


2-O-p-coumaroyl glyceride

Coumaric acid

derivative



Rocha et al. [20]

Ananas bracteatus


5,7,4’-trihydroxy-3,3’,5’-

trimethoxyflavone

Flavonoid ___ Chromatography on Sephadex® LH-20 gel, silica gel 60


Rocha et al. [20]

Ananas bracteatus


3-O-β-D-glucopyranosyl

sitosterol.

Coumaric acid

derivative


Rocha et al. [20]

147



Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside

Flavonoid ___ Column chromatography

by Sephadex, infrared, nuclear

magnetic resonance, and

mass spectrometry,

HPLC.

Coelho et al. [24]


Kaempferol-3 O-α-L-rhamnopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranoside




mass spectrometry,

HPLC.

Coelho et al. [24]


Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-

(1→6)-β-D- glucopyranoside




mass spectrometry,

HPLC.

Coelho et al. [24]


Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside



Coelho et al. [24]

148


mass spectrometry,

HPLC.

149

4. Conclusions

The present study shows the potential of Bromeliaceae family, where several species

have been studied for decades with respect to its chemical components and pharmacological

activity. As a result, many compounds have been isolated and identified, representing an

advance in the chemistry of natural products. In general, the diversity of biological

activities and metabolites observed in Bromeliaceae justify the interest in the study of species

of this family, since it has good prospects for research with interesting chemical and

pharmacological potential yet to be discovered.

References

[1] Benzing, D. H. Bromeliaceae: Profile of an adaptive radiation. Cambridge University

Press, 2000. 675 p.

[2] Luther H. E. An alphabetical list of bromeliad binomials. 6. ed. Sarasota: The Bromeliad

Society International, 2008. 110p.

[3] Versieux, L. M. Wendt, T. 2007. Bromeliaceae diversity and conservation in Minas

Gerais state, Brazil. Biodiversity and Conservation, 16:2989-3009.

[4] Ceita, G. O. Assis, J. G. A. Guedes, M. L. S. and Oliveira, A. N. P. C. 2008. Cytogenetics

of Brazilian species of Bromeliaceae. Botanical Journal of the Linnean Society 158:189-193.

[5] Manetti, L. M. Delaporte, R. H. Laverde-Júnior, A. 2009. Metabólitos secundários da

família Bromeliaceae. Química Nova, 32(7): 1885-1897.

[6] Oliveira Junior, R. G. Oliveira, A. P. Guimaraes, A. L. Araujo, E. C. C. Braz, F. R.

Vestedal, D. O. Fossen, T. Almeida, J. R. G. S. 2014. The first flavonoid isolated from

Bromelia laciniosa (Bromeliaceae). Journal of Medicinal Plant Research, 8: 558-563.

[7] Alonso-Paz, E. A. Cerdeiras, M. P. Fernandez, J. Ferreira, F. Moyna, P. Soubes, M.

Vázquez, A. Vero, S. Zunino, L. 1995. Screening of Uruguayan medicinal plants for

antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology, 45: 67-70.

[8] Hördegen, P. Hertzberg, H. Heilmann, J. Langhans, W. Maurer, V. 2003. The anthelmintic

efficacy of five plant products against gastrointestinal trichostrongylids in artificially infected

lambs. Veterinary Parasitology, 117: 51-60.

[9] Domingues, L. F. Giglioti, R. Feitosa, K. A. Fantatto, R. R. Rabelo, M. D. De Sena

Oliveira, M. C. Bechara, G. H. De Oliveira, G. P. Barioni Junior, W. Chagas, A. C. S. 2013.

In vitro and in vivo evaluation of the activity of pineapple (Ananas comosus) on Haemonchus

contortus in Santa Ines sheep. Veterinary Parasitology, 97:263-270.

150

[10] Islam, M. K. Siraj, M. A., Sarker, A. B. S, Saha, S. Mahmud, I. and Rahman, M. M.,

2015. In vitro anthelmintic activity of three Bangladeshi plants against Paramphistomum

cervi and Haemonchus contortus. Journal of Complementary and Integrative Medicine,

12(2):171-174.

[11] Lima-Saraiva S. R. Silva J. C. Branco C. R. Branco A. Cavalcanti, A. E. L. da Silva

Almeida J. R., 2012. Antinociceptive effect of Encholirium spectabile: A Bromeliaceae from

the Brazilian Caatinga biome. Pharmacognosy Magazine, 10: 655-60.

[12] Amendoeira, F. C. Frutuoso, V. S. Chedier, L. M. Pearman, A. T. Figueiredo, M. R.

Kaplan, M. A. C. Prescott, S. M. Bozza, P. T. & Castro-Faria-Neto, H. C., 2005.

Antinociceptive effect of Nidularium procerum: A Bromeliaceae from the Brazilian coastal

rain forest. Phytomedicine, 12 (1-2): 78-87.

[13] Lowe, H. I. C. Toyang, N. J., Watson, C. T. Ayeah, K. N., Bryant, J. 2014. Antileukemic

activity of Tillandsia recurvata and some of its cycloartanes. Anticancer Research, 34(7):

3505-3509.

[14] Upadhyay, A. Chompoo, J. Araki, N. Tawata, S, 2011. Antioxidant, antimicrobial, 15-

LOX, and AGEs inhibitions by pineapple stem waste. Journal of Food Science, 71:9-15.

[15] Carvalho, K. I. M. Fernandes, H. B. Machado, F. D. F. Oliveira, I. S. Oliveira, F. A.,

Nunes, P. H. M. Lima, J. T. Almeida, J. R. G. S. Oliveira, R. C. M. 2010. Antiulcer activity of

ethanolic extract of Encholirium spectabile Mart.ex Schult & Schult f. (Bromeliaceae) in

rodents. Biological Research 43: 459-465.

[16] Silva, J. S. Andreo, M. A. Tubaldini, F. R. Varanda, E. A. Rocha, L. R. M. Brito, A. R.

M. S. Vilegas, W. Hiruma-Lima, C. A. 2008. Differences in Gastroprotective and Mutagenic

Actions Between Polar and Apolar Extracts of Ananas ananassoides. Journal of Medicinal

Food, 11(1): 160-168.

[17] Liberati, A. Altman, D.G. Tetzlaff, J. Mulrow, C. Gøtzsche, P.C. Ioannidis, J.P.A.

Clarke, M. Devereaux, P.J. Kleijnen, J. Moher, D. The PRISMA statement for reporting

systematic reviews and meta-analyses of studies that evaluate health care interventions:

Explanation and elaboration. BMJ 2009, 339, b2700.

[18] Costa, M. Stasi, L. C. D. M. Kirizawa, M.S. L.J. Mendacollip, S. L.J. C. Gomes, and

Trolin, G. 1989. Screening in mice of some medicinal plants used for analgesic purposes in

the state of Sao Paulo part II. Journal of Ethnopharmacology, 27: 25-33.

151

[19] Delaporte, R. H. Sarragiotto, M. H. Takemura, O. S. Sanchez, G. M. Filho, B. P. D.

Nakamura, C. V. 2004. Evaluation of the antioedematogenic, free radical scavenging and

antimicrobial activities of aerial parts of Tillandsia streptocarpa Baker - Bromeliaceae.

Journal of Ethnopharmacology, 95(2/3): 229-233.

[20] Rocha, F. D. Yano, M. da Cunha, M. R. Gabriel, F. T. Cordeiro, R. S. Menezes, F. S.

Kaplan, M. A. 2010. Brazilian Bromeliaceae species: isolation of arylpropanoid acid

derivatives and antiradical potential. Revista Brasileira de Farmacognosia, 20: 240-245.

[21] Vieira-de-Abreu A, Amendoeira FC, Gomes GS, Zanon C, Chedier LM, Figueiredo MR,

Kaplan, M. A. C. Frutuoso, V. S. Castro-Faria-Neto, H. C. Weller, P. F. Bandeira-Melo, C

Bozza P. T., 2005. Anti-allergic properties of the Bromeliaceae nidularium procerum:

Inhibition of eosinophil activation and influx. International Immunopharmacology, 5: 1966-

74.

[22] Amendoeira, F. C. Frutuoso, V. S. Zanon, C. Chedier, L. M. Figueiredo, M. R. Kaplan,

M. A. C. Bandeira-Melo, C. Bozza, P. T. Castro-Faria-Neto, H. C. 2005. Anti-inflammatory

activity in the aqueous crude extract of the leaves of Nidularium procerum: A Bromeliaceae

from the Brazilian coastal rain forest. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 28 (6): 1010-

1015.

[23] Santos V. N. C. Freitas, R. A. Deschamps, F. C. Biavatti M. W., 2009. Ripe fruits of

Bromelia antiacantha: investigations on the chemical and bioactivity profile. Revista

Brasileira de Farmacognosia, 19(2): 358-65.

[24] Coelho, R. G. Honda, N. K. Vieira, M. C. Brum, R. L. Pavan, F. R. Leite, C. Q. F.

Cardoso, C. A. L. 2010. Chemical composition and antioxidant and antimycobacterial

activities of Bromelia balansae (Bromeliaceae). Journal of Medicinal Food, 13:1277-1280.

[25] Manetti, L. M. Turra, A. F. Takemura, O. S. Svidzinski, T. I. E. Laverde Junior, A.,

2010. Avaliação das atividades antimicrobiana, citotóxica, moluscicida e antioxidante de

Bromelia antiacantha Bertol. (Bromeliaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 12(4):

406-413.

[26] Dantas, A. C. S. Machado, D. Araujo, A. Oliveira Junior, R. G. Lima-Saraiva, S. R. G.

Ribeiro, L. A. A. Almeida, J. R. G. S. Horta, M. C. 2015. Acaricidal activity of extracts from

the leaves and aerial parts of Neoglaziovia variegata (Bromeliaceae) on the cattle tick

Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Research in Veterinary Science, 100: 165-168.

universidade federal do vale do sÃo ......semiárido da universidade federal do vale do são...

Documents