universidade federal fluminense centro de estudos
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE ESTUDOS GERAIS INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
LEONARDO SILVEIRA VILLAR OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE
METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
DE OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA
APLICAÇÃO EM ESTUDOS AMBIENTAIS
Niterói Abril/ 2006
LEONARDO SILVEIRA VILLAR
OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE
METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE
OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA APLICAÇÃO EM
ESTUDOS AMBIENTAIS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal Fluminense como requisito parcial
para a obtenção de Grau de Mestre em
Química. Área de Concentração: Química
Analítica
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli
Co-orientador: Prof.Dr. Mauro de Freitas Rebelo
Niterói Abril/ 2006
ii
B 862
Villar, Leonardo Silveira Otimização de metodologia para extração e determinação de metalotioneínas por eletroforese em gel de poliacrilamida de ostras Crasostrea rhizophorae (Guiling, 1828) para aplicação em estudos ambientais/ Leonardo Silveira Villar. Niterói, RJ: [s.n], 2006. 50f.: il. Dissertação (Mestrado em Química) Universidade Federal Fluminense, 2006.
1. Ostras ( Crassostrea rhizophorae). 2. Proteínas – Metalotioneínas.3. Eletroforese (SDS-PAGE). 4. Contaminação ambiental. I. Título.
CDD 574.5222
iii
LEONARDO SILVEIRA VILLAR
OTIMIZAÇÃO DE METODOLOGIA PARA EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO DE
METALOTIONEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE
OSTRAS CRASSOSTREA RHIZOPHORAE (GUILDING, 1828) PARA APLICAÇÃO EM
ESTUDOS AMBIENTAIS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal Fluminense como requisito parcial
para a obtenção de Grau de Mestre em
Química. Área de Concentração: Química
Analítica
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli - Orientador
GEO /IQ/ UFF
________________________________________________ Prof.Dr. Mauro de Freitas Rebelo – Co- orientador
IBCCF – UFRJ
________________________________________________ Prof.Dr. Richard Hemmi Valente
FIOCRUZ
________________________________________________ Profa. Dra. Silvia Maria Sella
IQ - UFF
iv
Niterói Abril/ 2006
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais pelo apoio, incentivo e motivação.
Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli pela orientação, apoio,
incentivo e paciência durante todo o curso.
Ao meu Co-orientador Prof. Dr. Mauro de Freitas Rebelo pelos
ensinamentos, apoio e críticas, fundamentais para o aprendizado e
desenvolvimento deste trabalho.
À CAPES pela bolsa concedida.
Ao Prof. Dr. Marcelo Einicker Lamas (UFRJ) pelo apoio e suporte durante
parte de meus experimentos e também ao Thiago pelo apoio e ajuda em
experimentos realizados.
Ao Dr. Richard Hemmi Valente (FIOCRUZ), pelos ensinamentos nos
experimentos envolvendo eletroforese e sugestões metodológicas.
Aos colegas de laboratório da UFF, UFRJ por todos os momentos em que
dividimos, amizade e colaboração.
Ao Dr. Francesco Dondero pela doação dos kits para dosagem por
derivatização com bromobimano e pelas preciosas sugestões na extração
das metalotioneínas.
À todas as pessoas, que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
v
SUMÁRIO LISTA DE TABELAS v
LISTA DE FIGURAS vi
LISTA DE ACRÔNIMOS vi
RESUMO vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUÇÃO 01
1.1 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 08
2. OBJETIVO 11
3. Materiais e Métodos 12
3.1 Reagentes e soluções 12
3.2 Procedimento de limpeza 12
3.3 Coleta de ostras Crassostrea rhizophorae 12
3.4 Protocolos de extração 14
3.4.1 Extração por precipitação com etanol (Viarengo et al., 1997) 14
3.4.2 Extração através de tratamento térmico 15
3.5 Separação de MTs por Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 16
3.6 Estimativa da massa molecular das proteínas 20
3.7 Quantificação de Metalotioneínas (derivatização com mBBr) 20
3.8 Detecção imunológica das bandas contendo metalotioneínas 21
3.8.1 Obtenção da diluição adequada de anticorpos (DOT BLOTTING) 21
3.8.2 Imunodetecção 23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
4.1 Extração e separação de proteínas 25
4.2 Identificação e quantificação de MTs por Derivatização com mBBr 33
4.3 Preservação de amostras 38
4.4 Detecção imunológica das bandas contendo MTs 40
5. CONCLUSÕES 43
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
vi
I – LISTA DE TABELAS TABELA 1 Preparo do gel de empilhamento e fracionador 17
II – LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Sítios para ligação com metais na metalotioneína 06
FIGURA 2 Indução e síntese da metalotioneína 07
FIGURA 3 Bromobimano (fórmula estrutural) 09
FIGURA 4 Ostra Crassostrea Rhizophorae 14
FIGURA 5 Representação esquemática do gel SDS-PAGE Tris-tricina 18
FIGURA 6 Dot Blotting 23
FIGURA 7 Gel SDS-PAGE 15%T, 2,67%C Tris-Glicina (Laemmli) 28
FIGURA 8 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C Tris – tricina 30
FIGURA 9 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Ostras expostas à Cd2+) 31
FIGURA 10 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Ostras expostas à Cd2+) 32
FIGURA 11 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Bromobimano) 34
FIGURA 12 Curva analítica (mBBr) para gel demonstrado na Fig.11 35
FIGURA 13 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Bromobimano) 37
FIGURA 14 Curva analítica (mBBr) para gel demonstrado na Fig.13 37
FIGURA 15 Gel (Fig.14) visualizado em Coomassie Blue 38
FIGURA 16 Gel SDS-PAGE 16,5%T, 3%C (Amostras degradadas) 40
FIGURA 17 Membrana de nitrocelulose para imunodetecção 41
FIGURA 18 Membrana revelada após incubação de anticorpo 42
III – LISTA DE ABREVIATURAS
LCMM Laboratório de Cultivo de Moluscos Marinhos
MBBr Bromobimano
MTs Metalotioneínas
TBS “Tris Buffer Saline”
SDS-PAGE Eletroforese em gel de Poliacrilamida
vii
IV – RESUMO
Neste trabalho de dissertação foram identificadas as melhores condições
para a extração, isolamento e quantificação de metalotioneínas de ostras
Crassostrea Rhizophorae (Guilding, 1828). Após a identificação do protocolo de
extração mais adequado, as bandas protéicas referentes a estes extratos foram
separadas utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de
sódio. Foram estudadas as melhores condições para a corrida eletroforética e
revelação do gel. Foi testado o modelo proposto por Laemmli, que utiliza tampão
contendo Tris e glicina, porém este não se mostrou adequado para resolver
polipeptídeos de massas moleculares menores que 10 kDa e desta forma não foi
possível fazer a estimativa de suas massas moleculares. Então se testou o
modelo proposto por Schagger e Von Jagow que utiliza tampão contendo tris e
tricina, o qual se mostrou adequado para resolver polipeptídeos de massas
moleculares menores que 10 kDa, permitindo a visualização de bandas de até 2
kDa.
Para a quantificação de metalotioneínas foi utilizada a técnica de
derivatização com bromobimano e, em paralelo, a transferência do gel obtido para
membrana de nitrocelulose e imunodetecção. Os resultados obtidos mostraram
que ambas as técnicas se mostraram bastantes específicas, podendo ser
utilizadas em trabalhos de rotina. A derivatização com bromobimano possibilitou a
quantificação da banda correspondente aos padrões de MTs e extratos contendo
a metalotioneína. A técnica de imunodetecção confirmou, através da visualização
das bandas contendo padrões e extratos, que estes aparecem na faixa de 7 kDa e
bandas menos nítidas devido a presença de uma forma dimerizada desta proteína.
Foram utilizados padrões contendo bandas com massas moleculares conhecidas
possibilitando assim uma estimativa da massa molecular das MTs.
viii
V - ABSTRACT
In this work, it was identified the best conditions to extract, isolate and
identify metallothioneins in oysters Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828). After
the extraction protocol identification, the bands containing proteins obtaind from
extracts were separated using sodium dodecil sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE). It was studied the best work conditions for
electrophoresis and staining. It was tested the Laemmli model with Tris and
glycine, but this model was not reliable for the separation of proteins with low
molecular weight, below 10 kDa. Those proteins are only partly or even not
separated from the bulk of SDS. Then it was tested Shagger and Von Jagow
model with tris and tricine buffer system. This model was enough to separate and
to identify low molecular weight proteins, making possible the identification of
protein with 2 kDa molecular weight.
For the quantification of metallothioneins it was used bromobimane that
reacts with the cystein groups of MTs, making possible its identification and
quantification. The fluorescence of the protein bands in the gel was evidenced with
an transilluminator and a picture was taken using a camera. At the same time we
made a western blotting to be shure about the localization of MTs bands. Western
Blotting showed us that MTs bands appeared near 7kDa. The others bands
observed (around 14kDa) are probably due to MTs oxidation and formation of
intermolecular dissulfide bonds.
ix
1
1 – INTRODUÇÃO
A Biota, em zonas costeiras, se encontra exposta a ameaças decorrentes de
diversas atividades antropogênicas. Em particular destacam-se aquelas relacionadas
ao despejo de efluentes ou poluentes tóxicos como, por exemplo, metais traço. As mais
altas concentrações de contaminantes metálicos ocorrem em regiões costeiras de
baixa profundidade, situadas próximas a centros urbanos industrializados. Estes
ecossistemas se tornam vulneráveis a estes poluentes, que podem afetar diretamente
as populações ou se acumular através da cadeia alimentar, com conseqüências para o
homem (Baudrimont et al., 2005).
Dentre esses contaminantes, destacam-se os metais pesados, pela sua
abundância na crosta terrestre e alto potencial de toxicidade. Os metais pesados se
encontram presentes sob diferentes formas no ambiente, especialmente como óxidos e
hidróxidos. Ao alcançarem as zonas costeiras, eles podem reagir com os compostos da
água do mar e alterar suas espécies químicas (formando sulfitos e sulfetos). Os íons
metálicos podem reagir com o material orgânico dissolvido formando colóides metálicos
que podem se adsorver ao material particulado em suspensão e argila, o que influencia
sua disponibilidade para o meio (Carvalho et al.,1991).
A concentração de metais totais em água do mar, sua biodisponibilidade e
também sua concentração em organismos marinhos será uma função do metal traço
envolvido (essencial ou não essencial), da origem do contaminante (urbana ou
industrial) e do organismo em estudo. Todos estes fatores determinam em conjunto
diferentes formas do padrão de distribuição destes metais em diferentes áreas
(Carvalho et al.,1991).
2
As primeiras avaliações da qualidade do meio ambiente foram feitas por análises
químicas dos compartimentos abióticos: alterações de pH, temperatura e oxigênio
dissolvido, concentrações de diferentes metais na água e no sedimento. No entanto a
determinação de metais pesados nesses compartimentos pode não refletir a
biodisponibilidade desses compostos e menos ainda, a sua toxicidade.
De acordo com Rainbow e Phillips (1993) a biodisponibilidade só pode ser
apropriadamente medida pelo que é encontrado no tecido de organismos alvo. Por
isso, o estudo da concentração total de metais em organismos fornece uma informação
mais precisa do potencial dano desses contaminantes ao seu metabolismo e ao
ambiente em geral (Bryan et al., 1980; Carvalho et al., 1991).
Durante mais de 30 anos, a determinação de contaminantes nos tecidos dos
organismos ditos sentinelas, tem sido a principal forma de avaliação da contaminação
de ecossistemas costeiros. Programas de monitoramento com essa filosofia, como o
“Mussel Watch” iniciaram nos anos 70 nos Estados Unidos e se espalharam por todo
mundo, estando em vigor em muitas localidades até hoje (Cossa, 1989; O’ Connor,
1992 e 1998; GoldBouchot et al., 1995; Hunter et al., 1995; Amiard e Berthet, 1996;
Hayes et al., 1998; Cantillo, 1998).
Esses estudos levaram a noção de que também a toxicidade de um elemento só
poderia ser corretamente avaliada utilizando organismos vivos (Cairns e Mount, 1992).
Organismos indicadores do efeito da contaminação ambiental refletem o estado de
saúde, respondendo prontamente, a um estresse de grande relevância toxicológica, e
por isso podem ser utilizados como uma advertência indicadora da presença de
contaminantes, antes que ocorram danos irreversíveis ao meio ambiente (Barea et al.,
1994).
3
Moluscos bivalves são utilizados como organismos sentinelas da contaminação
ambiental, através do monitoramento da concentração de metais considerados tóxicos
nos seus tecidos (Cosson, 2000; Cajaraville et al., 2000). O sedentarismo e o hábito
alimentar filtrador, fazem com que esses organismos estejam expostos a
contaminantes em diversos compartimentos abióticos do ecossistema, favorecendo a
concentração de poluentes em seus tecidos. Especialmente ostras do gênero
Crassostrea têm sido amplamente utilizadas para avaliar contaminação em diferentes
ecossistemas. Estes organismos destacam-se pela capacidade de acumulação de
metais nos tecidos sem apresentar efeito tóxico, e a ampla distribuição ao longo do
litoral brasileiro, indo do Paraná ao Rio Grande do Norte, tornando-se especialmente
importante para estudos de avaliação de impacto ambiental (Ignácio et al., 2000;
Rebelo et al., 2003).
No Brasil, existem vários relatos de contaminação da água e organismos
aquáticos por metais. Em alguns deles tem-se a ocorrência de bioacumulação em
moluscos, devido à contaminação de sedimentos da Baía de Todos os Santos – BA por
Cd, Hg, Pb e Zn. Destaca-se também o despejo de esgoto urbano e rejeitos das
industrias petroquímica e metalúrgica que contribuíram para a contaminação de
sedimentos da Baía de Guanabara – RJ por Cr, Cu, Mn e Zn. Finalizando, a Baía de
Sepetiba – RJ, destaca-se pela contaminação por Cd, Cu e Zn provocada por rejeitos
de indústria metalúrgica (Eysink et al.,1987; Pfeifer et al.,1985; Jose, 1997).
A região da Baía de Sepetiba apresenta um histórico de contaminação por Zn e
Cd. Ostras coletadas na região estão presentes na alimentação da população local e
também para a população da região metropolitana do Rio de Janeiro, e via cadeia
alimentar, este alimento pode representar um potencial risco de saúde para o homem.
4
A organização mundial de saúde estabelece que a dose ingerida tolerada de
cádmio não deva ser superior a 500mg de Cádmio por semana (“WHO” – Organização
Mundial da Saúde). Moluscos e crustáceos apresentam níveis elevados de cádmio
(acima de 1,0 mg. kg-1), mesmo quando procedentes de água consideradas não
poluídas por metais traço. Apesar da concentração de metais nos tecidos revelarem
sobre a biodisponibilidade, o processo de metabolização dessas substâncias até que
elas apareçam incorporadas nos tecidos é lento. Alem disso, muitos trabalhos (Wallner
- Kersanach et al., 2000; Rebelo et al., 2003; Amaral et al., 2005) mostraram que as
ostras são ótimos bioacumuladores, mas não são bons depuradores. Com isso, iniciou-
se uma busca por mecanismos biológicos que pudessem dar uma reposta mais rápida
e mais específica a exposição do organismo aos metais do meio. O termo biomarcador
foi originalmente definido como “alterações bioquímicas, fisiológicas ou manifestações
celulares, promovidas por um estresse ambiental” (Gutiérrez et al., 2003). Neste
contexto, o conceito de biomarcador, utilizado numa forma mais restritiva, de acordo
com estudo realizado por Gadd e colaboradores (1992), está relacionado a uma
alteração bioquímica subletal resultando de uma exposição do indivíduo a um poluente
tóxico. Por esta razão, qualquer sistema celular que sofre uma alteração fisiológica
detectável sob a influência de um estresse ambiental específico ou poluente pode ser
considerado um biomarcador celular. Moléculas envolvidas nesta alteração ou
mudança fisiológica podem ser consideradas como um biomarcador molecular.
Uma das respostas bioquímicas mais estudadas em células animais quando
expostas a metais é a indução de metalotioneínas (MTs – Vallee,1991; Engel e
Brouwer, 1989). Em muitas espécies, por exemplo, moluscos, peixes e crustáceos, a
indução à síntese das MTs por íons metálicos foi demonstrada, sugerindo o potencial
uso de concentrações de MTs em organismos como biomarcadores de exposição a
metais (Amiard et al., 2005).
5
As metalotioneínas são proteínas que apresentam massa molecular entre 6 e 7
kDa, contendo aproximadamente 60 aminoácidos dos quais cerca de 30%
correspondem a cisteínas (que contém grupos sulfidrila) que são sítios para ligações
com metais (Stillman et al.1995). As MTs possuem alta afinidade por metais formando
quelatos com íons de metais essenciais (Zn2+, Cu2+, etc) ou não essenciais (Cd2+ ,Hg2+,
Ag+, etc) (Viarengo,1989). Apresentam diferentes afinidades por cátions metálicos
(Hg2+ > Cu2+ > Cd2+ > Zn2+) .Outra importante propriedade é que possuem estabilidade
frente ao calor e ausência de aminoácidos com grupos aromáticos.
As MTs foram descobertas em córtex renal de eqüinos (Margoshes e Vallee,
1957) como uma proteína com característica de se ligar ao cádmio. Esta propriedade
foi posteriormente investigada e estas foram denominadas metalotioneínas (Kagi e
Vallee, 1960). As MTs foram encontradas em muitos grupos de organismos como
eucariotos e procariotos, vertebrados e invertebrados (Roesijadi, 1996).
As MTs se ligam a 7 equivalentes de íons metálicos divalentes, com grande
afinidade, através da formação de “clusters” (domínios) metal-sulfidrila (Kagi e Schaffer,
1988; Chang et al., 2006; Vergani et al., 2003), de acordo como representado na figura
1.
6
Figura 1 – Sítios para ligação com metais presentes na metalotioneína. Os círculos
denotam íons metálicos divalentes (ex. Zn2+, Cd2+, Mn2+, Cu2+).
Acredita-se que as metalotioneínas possuem um significante papel no controle
homeostásico de metais essenciais do grupo I-B e II-B (Zn2+, Cu2+) e o seqüestro de
metais tóxicos (Cd2+, Hg2+). Estas são capazes de proteger a estrutura celular de
interações não específicas com metais traço e promover a detoxificação de metais
essenciais em excesso no interior da célula (Hamer, 1986; Viarengo e Canesi, 1991;
Roesijadi, 1992; Viarengo e Nott, 1993). Estes metais aumentam a taxa de síntese da
metalotioneína (Tessier et al., 1996). A figura 2 mostra um esquema da indução de
metalotioneínas por metais pesados (Revisão em Roesijadi, 1996), através da indução
e síntese da metalotioneína.
Devido a esta ser uma proteína que é induzida quando ocorre exposição a
metais traço, as MTs são consideradas um importante e específico biomarcador ,
detectando a resposta do organismo frente a poluentes inorgânicos presentes no
ambiente marinho.
7
Quando metais não essenciais (Cd, Hg, Ag) entram na célula, ocorre uma
inevitável competição entre estes e metais essenciais (Cu, Zn) por ligantes
intracelulares como metaloproteínas e as MTs atuam na detoxificação como
representado na figura 2.
A afinidade in vitro da proteína decresce segundo uma sequencia hierarquica
Hg2+ > Cu+, Ag+ , Bi3+ >>Cd2+ > Pb2+ > Zn2+ > Co2+ o que mostra que o Zn é
espontaneamente substituído por outros metais geralmente considerados mais tóxicos.
Figura 2 – Modelo da indução da Metalotioneína e recuperação de ligantes
comprometidos através de uma ligação não apropriada com Cd neste exemplo
(Roesijadi, 1996).
Embora as metalotioneínas tenham sido amplamente utilizadas para identificar
respostas devido à poluição por metais traço, existe evidencia de que em vertebrados
(mamíferos e peixes) a síntese das metalotioneínas é estimulada por diferentes
agentes que podem ser endógenos ou exógenos (Kagi, 1993), ou quando o organismo
é submetido a estresses como frio ou calor e também atividade física em excesso
(Viarengo et al., 1999).
8
A identificação, quantificação e caracterização estrutural das metalotioneínas
constituem uma importante contribuição para o entendimento dos papéis específicos
que a essa proteína desempenha nos organismos. Diferentes metodologias foram
desenvolvidas para a determinação e quantificação de metalotioneínas através de
técnicas eletroanalíticas, espectrofotométricas (U.V - visível), cromatográficas, ensaios
de saturação por metal e métodos imunológicos. (Honda et al., 2005; Viarengo et
al.,1997; Gharahdaghi et al., 1999)
1.1 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
As técnicas de eletroforese em gel de acrilamida são amplamente utilizadas para
a separação de proteínas de um extrato. Os protocolos de extração das proteínas do
organismo e as condições da separação por eletroforese devem estar de acordo com
as características da proteína que se deseja visualizar.
No caso das metalotioneínas muitos procedimentos distintos têm sido aplicados
para extrair, identificar e quantificar essas proteínas oriundas da glândula digestiva de
ostras. Primeiramente testou-se o tratamento térmico, que consiste no aquecimento do
sobrenadante obtido após a homogeneização do tecido, precipitando proteínas de
maior massa molecular (Erk et al. 2002). Outro protocolo utilizado foi o proposto por
Viarengo e colaboradores (1997) que consiste na obtenção de uma fração contendo a
metalotioneína parcialmente purificada através do tratamento das amostras com etanol
e clorofórmio seguido pela precipitação utilizando etanol e HCl.
Nos dias atuais, dois sistemas desnaturantes são mais empregados na
avaliação das massas moleculares de polipeptídios, ou cadeias polipeptídicas
presentes nas proteínas. Um deles é o sistema consagrado na literatura, Laemmli
(1970), e o outro mais recente de Schagger e Von Jagow (1987). O segundo método
9
permite a resolução de pequenas proteínas utilizando menor concentração de
acrilamida, uma vez que, quando se adota a utilização da glicina é necessário que o gel
apresente um maior percentual de acrilamida. Além disso, o sistema Laemmli se
mostra adequado para a resolução de proteínas de 100kDa até 20 kDa. Porém
proteínas abaixo de 20 kDa não se separam adequadamente. Desta forma o modelo de
Schagger se mostrou o mais adequado para este estudo.
Independentemente do método de separação, a identificação das
metalotioneínas não pode se basear apenas na massa molecular da proteína. Algumas
técnicas são utilizadas para fixar as cisteínas dessas proteínas com um reagente
fluorescente (Bromobimano – figura 3). Associada a uma extração que privilegie o
isolamento das proteínas de baixo peso molecular e a separação em gel de
eletroforese, essa técnica pode confirmar o conteúdo de cisteína da proteína separada,
caracterizando as MTs.
Figura 3 – Estrutura química do Mono-bromobimano.
Uma outra possibilidade é a utilização de anticorpos contra a MT que podem
revelar a proteína através de imunodetecção.
O termo blotting se refere a técnicas de transferência de proteínas presentes em
um gel de SDS-PAGE para uma matriz como uma membrana de nitrocelulose ou
10
PVDF. Obtêm-se então, após a transferência, as proteínas ligadas e imobilizadas nesta
membrana. Ao mesmo tempo em que ocorre um aumento do tempo e complexidade
devido a adição desta etapa após a separação eletroforética, tem-se como vantagem a
alta sensibilidade e especificidade. Destaca-se também, maior acessibilidade às
macromoléculas ligadas à superfície da membrana, quando comparada a estas dentro
da matriz do gel.
Dentre outras vantagens explicadas por Gershoni e Palade (1983), destaca-se
que quando as macromoléculas estão imobilizadas em uma fina membrana, podem ser
muito mais rápidas as reações de coloração e descoloração, incubações, lavagens, etc.
A membrana contendo a metalotioneína permite a sua visualização através da
imunodetecção de suas bandas. Este método apresenta as seguintes vantagens: (i)
permite a ligação da MTs a anticorpos altamente específicos e reprodutíveis; (ii) é
bastante sensível, possibilitando a identificação de até 30 ng de proteínas; (iii) não se
utiliza componentes que oferecem risco à saúde do analista.
11
2 – OBJETIVOS
Geral: Este trabalho visa determinar um protocolo apropriado para extração, separação
e identificação de metalotioneínas para estabelecer como rotina em laboratório.
Específicos:
1. Adaptar e otimizar a metodologia para a separação e identificação de
metalotioneína utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE),
através de um gel que proporcione uma boa resolução para proteínas de
baixa massa molecular (região abaixo de 10 kDa).
2. Identificar e quantificar as MTs pela alquilação de resíduos de cisteína das
MTs utilizando o bromobimano.
3. Identificar e quantificar as MTs pela através de técnicas de imunodetecção
como “Imunoblotting” com anticorpo policlonal anti-MT.
12
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Reagentes e soluções
Todas as soluções utilizadas foram preparadas com reagentes de grau analítico
e água de alta pureza (18,2MΩ.cm), purificada com sistema de filtração Milli-Q
(Millipore).
Os reagentes utilizados para a extração de proteínas, eletroforese e ensaios de
imunodetecção foram provenientes da Sigma e Merck. Os padrões de massa molecular
e de MTs utilizados nos experimentos foram adquiridos através da Sigma.
3.2 – Procedimento de limpeza
Para evitar contaminação a vidraria utilizada ficou de molho em Extran 5% e
submetido a HNO3 10% (v/v) por uma noite sendo posteriormente rinsados com água
de alta pureza. O material utilizado na eletroforese, tais como cuba, espaçadores e
vidros foram lavados com água destilada. Vidros, espaçadores e pentes foram
submetidos à limpeza com etanol antes de sua utilização.
3.3 – Coleta de Ostras Crassostrea rhizophorae.
Foram utilizadas ostras de diferentes procedências para os diversos
experimentos desse estudo. Ostras cultivadas na fazenda marinha da Universidade
Federal de Santa Catarina foram gentilmente cedidas pelo LCMM. Ostras Crassostrea
rhizophorae com aproximadamente 8 cm foram expostas a 2 concentrações de Cádmio
(100 e 200 mg.L-1) por 48 e 96h. Após esse período os animais foram dissecados e
seus órgãos internos fixados para posterior análise. Amostras de glândula digestiva
foram processadas para extração de RNA com o reagente TRIZOL (Invitrogen). Após a
remoção do sobrenadante contendo os ácidos nucléicos, o pellet remanescente foi
13
processado de acordo com as instruções do fabricante para extração das proteínas. Os
extratos foram aplicados para comparação da expressão de MT em diferentes tempos
e concentrações de Cd, além de testar a metodologia de extração proposta pelo
fabricante, que permitiria dosagens de ácidos nucléicos e proteínas na mesma
amostra.
Ostras (Crassostrea rhizophorae) coletadas no mangue do Sapateiro - Guaratiba
(Rio de Janeiro) foram utilizadas em extrações pelos diferentes protocolos propostos a
seguir. Esses animais também foram utilizados para um experimento de exposição de
5 ostras em laboratório a 200 mg.L-1 por 48h.
Ostras (Crassostrea rhizophorae), expostas à solução contendo Cd2+, e
coletadas na Ilha do Martins (Baía de Sepetiba) foram utilizadas em extrações pelos
diferentes protocolos propostos a seguir, com a finalidade de testar a metodologia em
amostras de animais expostos ambientalmente (nesse caso a Cd e Zn).
No ambiente, as amostras de ostras foram coletadas utilizando espátula para
removê-las das pedras. Foram coletadas cerca de 30 ostras com tamanho de concha
variando de 5,1 a 7,0 cm. Após a coleta estas foram acondicionadas em sacos de
malha plástica vazada e transportadas até o laboratório, aonde chegaram vivas e com
as valvas firmemente fechadas.
No laboratório, as ostras foram lavadas com água corrente, abertas e os tecidos
moles foram cuidadosamente separados da concha utilizando uma pequena faca. A
glândula digestiva foi isolada e a metalotioneína extraída imediatamente após a
abertura da ostra (Figura 4).
14
Figura 4 – Ostra Crassostrea rhizophorae ilustrando sua glândula digestiva, órgão
utilizado na extração de Metalotioneínas.
3.4 – Protocolos de extração
Para a extração de proteínas foi utilizado glândula digestiva em virtude de este
órgão apresentar mais alta concentração de MTs (Viarengo et al., 1989). Os protocolos
utilizados para extração de proteínas se encontram detalhados abaixo, sendo o
primeiro baseado em estudo realizado por Viarengo e colaboradores (1997). O
segundo protocolo utilizado foi o proposto por Erk e colaboradores (2002).
Metalotioneínas são propensas à oxidação, durante seu isolamento, devido ao
seu alto teor de cisteína. Ocorre formação de pontes de sulfeto e as metalotioneínas
podem sofrer dimerização ou, com outras proteínas, ser transformada em frações de
maior massa molecular. Por isso, recomenda-se que durante todo o processo deve-se
utilizar tampão desaerado ou na presença de um agente redutor. A etapa de
homogeneização é seguida de centrifugação. O uso de uma centrífuga refrigerada é
altamente recomendado.
15
3.4.1 – Extração por precipitação com etanol (Viarengo et al., 1997).
O tecido da glândula digestiva foi homogeneizado na proporção de 1 para 3
volumes de tampão 500 mmol.L-1 de sacarose, 20 mmol.L-1 do tampão Tris-HCl pH 8,6
e adição de 0,006 mmol.L-1 de leupeptina, 0,5 mmol.L-1 de PMFS (agente
antiproteolítico) e 0,01% de beta mercaptoetanol (agente redutor). Deixou-se o material
em repouso por 10 min e em seguida foi centrifugado a 20000 x g por 30 min. Ao
sobrenadante contendo as metalotioneínas foi adicionado, para alíquotas de 1 mL, 1,05
mL de etanol absoluto gelado (-20ºC) e 80µL de clorofórmio.
Deixou-se em repouso por 5 min e após este tempo de repouso as amostras
foram centrifugadas a 6000 x g por 10 min a 4ºC. O sobrenadante, em alíquotas de 500
µL foi reunido e combinado com 40 µL de HCl (37%) e subseqüentemente com 3
volumes (1500 µL) de etanol absoluto gelado. A amostra foi mantida a -20ºC por 1 h e
centrifugada a 6000 x g por 10 min a 4ºC. O “pellet” contendo as metalotioneínas foi
então lavado com 870 µL de etanol absoluto gelado, 10 µL clorofórmio e 120 µL
tampão de extração.O material obtido foi centrifugado a 6000 x g por 10 min e seco à
temperatura ambiente. O pellet foi então solubilizado em SDS 1%(m/v).
Dentre os reagentes utilizados no protocolo de extração de MTs, o β-
mercaptoetanol garante um ambiente redutor (agente anti-oxidante) evitando a
formação de dímeros devido a formação de pontes de sulfeto entre as MTs. Os
agentes antiproteolíticos são utilizados devido à presença, de células digestivas que
secretam enzimas proteolíticas (Viarengo et al., 1997). RNA também pode ser utilizado
na extração como co-precipitante, melhorando a recuperação das metalotioneínas.
Outra possibilidade é acidificar o meio facilitando a precipitação e proporcionando uma
recuperação de aproximadamente 90% (Viarengo et al., 1997).
16
3.4.2 – Extração através de tratamento térmico
As amostras de glândula digestiva extraídas das ostras foram homogeneizadas
em solução contendo sacarose 0,5 M, Tris-HCl 20 mM pH 8,6, leupeptina 0,006 mM,
PMFS 0,5 mM (agente anti-proteolítico) e β-mercaptoetanol 0,01%. A solução foi então
centrifugada a 20.000 x g por 1 h a 4ºC. O sobrenadante contendo as metalotioneínas
foi cuidadosamente separado do “pellet” com auxílio de uma pipeta e aquecido a 70ºC
por 10 min. As amostras foram então centrifugadas a 20.000 x g por 30 min e o
sobrenadante contendo as MTs recolhido.
3.5 – Separação de MTs por Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Os géis de SDS-PAGE foram preparados usando as proporções mostradas na
Tabela 1. Utilizou-se um kitassato para o preparo dos géis, possibilitando assim fazer a
sua desaeração por um período de 15 min, e posterior adição de persulfato de amônio
e N,N,N’,N’ tetrametil etileno diamino (TEMED).
É importante explicitar que no preparo dos géis, após a montagem das placas
(Mini Protean II), aplicou-se 3,2 mL do gel fracionador e 200 µL de H2O ultra pura
impedindo assim o contato do gel com o ar durante a polimerização, cujo tempo é de
aproximadamente 30 min. Depois de decorrido o tempo de polimerização, a água
adicionada foi eliminada e foi adicionado o gel de empilhamento preparado como
mostrado na Tabela 1. Para o preparo do gel foi utilizado uma solução estoque
contendo acrilamida e bis-acrilamida 49,5%T, 3%C, e também o tampão do gel que
contém Tris 3,0 M em SDS 0,3% e pH ajustado para 8,45.
17
Tabela 1 – Preparo dos géis: Concentrador (4%); fracionador (16,5%), utilizando a
solução estoque de acrilamida.
Solução Função Gel fracionador (16,5%)
Volume (mL)
Gel concentrador (4%)
Volume (mL)
Acrilamida + Bis-acrilamida (49,5%T; 3%C)
Acrilamida é o monômero e a Bis-acrilamida é o agente de ligação cruzada
3,33 0,50
Tampão do gel Eletrólitos do meio
Tris +, Cl-
3,33 1,55
Glicerol 1,10 -
Persulfato de amônio Gerador de radicais livres 0,033 0,050
TEMED Catalisador 0,0033 0,005
H2O Milli-Q 2,24 4,17
Durante a corrida eletroforética foi utilizada uma solução tampão para o anodo,
contendo Tris 0,2 M, com pH ajustado para 8,9. E outro tampão para o catodo
contendo Tris 0,1 M, Tricina 0,1 M em SDS 0,1% com pH ajustado para 8,25.
O pente de Teflon foi colocado imediatamente após a aplicação do gel de
empilhamento, e aguardou-se 30 min para a sua completa polimerização. Após
decorrido o tempo necessário, o pente foi cuidadosamente retirado, e formaram-se
pequenas cavidades para a aplicação das alíquotas da solução contendo as proteínas
extraídas (Figura 5).
18
Figura 5 – Representação esquemática do gel SDS-PAGE Tris-tricina (16.5% T, 3%
C).
As frações contendo as metalotioneínas obtidas através da extração foram
tratadas com tampão de amostra (0,4 mL de β-mercaptoetanol, 2,4 mL de glicerol, 8
mL de solução de dodecil sulfato de sódio 10% (m/v), 1 mL de tampão Tris-HCl 1mol.l-1
pH 6,8 , glicerol, 5 mg Coomassie Blue G 250) e então aquecidas por 30 min a uma
temperatura de 40ºC. As amostras foram então centrifugadas a 14.000 x g por 5 min
para posterior aplicação no gel.
A eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS e utilizando tricina como
“trailing” íon foi feita de acordo com Schagger e Von Jagow (1987) com algumas
modificações. Utilizou-se uma concentração de acrilamida 16.5% T; 3%C para o gel
fracionador e uma concentração de 4%T, 3%C para o gel concentrador. Trabalhou-se
com dois tampões de corrida, sendo um tampão do catodo e o outro para o anodo.
19
O tampão de anodo é colocado na base da cuba, ou seja, no anodo o que pode
ser denominado “tampão de fora”. O tampão do catodo deve ser colocado no interior da
cuba e pode ser denominado “tampão de dentro”.
A corrida foi realizada em temperatura ambiente em um sistema Mini Protean II
Biorad, durante aproximadamente 2 h e 45 min, utilizando uma corrente de 10 mA para
cada gel individualmente até a “linha de frente” atingir o gel fracionador, quando
aumentou-se a corrente para 20mA. A corrida eletroforética foi acompanhada com
migração de Coomassie G presente no tampão de amostra. Foram utilizados padrões
de MT Sigma purificadas de fígado de coelho e rim de cavalo (Sigma).
Os géis, após a corrida, foram lavados com água por 15 min (2 vezes) e
mantidas em solução fixadora contendo metanol, acido acético, água (40:10:50%) v/v
por 30 min. Esta solução foi então descartada e adicionou-se solução contendo
Coomassie Brillant Blue R 250 0,25 % por 1 h sob leve agitação. Os géis foram então
descorados com solução de ácido acético 10% (v/v) trocando esta solução a cada
intervalo de 30 min até se atingir a visualização das bandas protéicas.
Para cada amostra, as corridas eletroforéticas foram realizadas em duplicata
verificando assim a reprodutibilidade das corridas. Os géis, após sua revelação, foram
digitalizados utilizando um scanner e então descartados.
Para algumas amostras contendo baixas concentrações de metalotioneínas
(banda pouco nítida) foi utilizada a impregnação por prata por ser um modo de
revelação mais sensível (aproximadamente 100 vezes quando comparado com
Coomassie Blue R 250).
Na Impregnação por prata, conforme recomendado pela Amersham, o gel foi
fixado por uma noite em solução contendo metanol, acido acético, água (40; 10; 50%)
20
sob agitação moderada. A solução foi trocada e o gel foi submetido à agitação por 30
min. A solução anterior foi então desprezada e o gel sensibilizado por 30 min, sob
agitação moderada, com etanol 30%, glutaraldeído 0,5%(v/v), tiossulfato de sódio 0.2%
(m/v), acetato de sódio anidro 7% (m/v) em água. O gel foi então lavado 3 vezes (15
min) com água. Adicionou-se nitrato de prata 0,25% (m/v), formaldeído 0,04% (v/v) e
deixou-se por 20 min, sob agitação moderada. Lavou-se duas vezes por 1 min com
água e revelou-se com carbonato de sódio 2,5%(p/v), formaldeído 0,02% (v/v),
tiossulfato de sódio 0,001% (m/v) em água por 2 a 5 min agitando com auxilio das
mãos. A solução anterior foi descartada e foi adicionado solução de EDTA- Na2 . 2H2O
1,5% (m/v) em água, mantendo-se por 10 min, sob agitação moderada. Lavou-se com
água três vezes por 5 min e após esta etapa o gel foi estocado em solução de ácido
acético 1%.
3.6 – Estimativa da massa molecular das proteínas
Para se estimar a massa molecular de proteínas extraídas de ostras e
separadas por SDS-PAGE, as bandas obtidas foram comparadas com as de um
padrão de proteínas de massas moleculares conhecidas (5µg µL-1). Foram utilizados
também padrões de metalotioneína purificada, extraídos de cavalo e coelho (Sigma).
Estes padrões foram aquecidos durante 30 min a uma temperatura de 40ºC e
posteriormente centrifugados a 12.000 x g por 5 min antes da aplicação no gel.
3.7 – Quantificação de Metalotioneínas (derivatização com mBBr)
O “pellet” obtido no processo de extração de proteínas (Viarengo et al., 1997),
após a etapa de precipitação com etanol absoluto, foi solubilizado em 50 µL do tampão
de extração (Viarengo et al., 1997). Preparou-se a solução padrão de metalotioneínas
contendo 1µg. µL-1. Foi retirado uma alíquota de 2µL e adicionou-se 48 µL do tampão
21
utilizado na extração. Amostras e padrões foram submetidos a uma rápida
centrifugação a 12.000 x g durante 30 segundos sob temperatura de 4ºC. As amostras
foram posteriormente aquecidas a 65ºC durante 15 min, e com estas ainda aquecidas,
foram adicionados 5 µL de bromobimano em cada uma, mantendo estas protegidas da
luz. Por último foram adicionados 55 µL de uma solução contendo 1 µL de β-
mercaptoetanol e 1 mL do tampão de amostra. As amostras ficaram em repouso por 5
min em temperatura ambiente e foram submetidas à centrifugação a 1.000 x g por 1
min em temperatura de 4ºC. A partir desta etapa as amostras foram submetidas à
corrida eletroforética (SDS-PAGE).
Após a realização da corrida, o gel foi lavado com água durante 15 min
trocando-se a água 2 vezes. Após a última lavagem foi adicionado ao gel uma solução
fixadora contendo (metanol 50%; ácido acético 10%; água 40%). O gel permaneceu
então sob leve agitação por 30 min. Desta forma, elimina-se também o excesso de
mBBr que não tinha reagido. Caso seja necessário guardar o gel para ser utilizado no
dia seguinte, esta etapa é fundamental.
Após a obtenção da imagem digitalizada do gel, esta foi tratada com o programa
ImageJ. Então foi obtida a curva de calibração e a quantificação das amostras.
3.8 – DETECÇÃO IMUNOLÓGICA DAS BANDAS CONTENDO METALOTIONEÍNAS
Os anticorpos (anti-metalotioneína) utilizados para o desenvolvimento deste
trabalho foram produzidos por Sá (1999). De acordo com este estudo, os anticorpos
foram obtidos utilizando uma bola implantada subcutaneamente em coelhos, e o autor
explica detalhadamente esta técnica.
22
3.8.1 – Obtenção da diluição adequada de anticorpos (DOT BLOTTING)
Quadrados de nitrocelulose (NC) 0,22 µm, de 1,0 cm2 foram colocados
individualmente em poços de placas de cultura. Aplicou-se 20 µL de amostra contendo
metalotioneínas extraídas de ostra Crassostrea rhizophorae sobre cada pedaço de
nitrocelulose.
Após sua aplicação na membrana, as amostras permaneceram em repouso em
temperatura ambiente por 15 min para a completa secagem. Em seguida, foram
bloqueadas com 500 µL da solução de leite desnatado 5% (m/v) e então
permaneceram por um período de 1h em agitação. Foram preparadas as seguintes
diluições do anticorpo primário: (1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:1000). Incubou-se 200 µL
do anticorpo primário em concentrações crescentes por 1 h, em agitação no escuro. As
membranas de nitrocelulose foram então lavadas com a solução estoque de TBS
diluída em uma proporção 1:5 em agitação. A primeira lavagem com duração de 15 min
e as duas seguintes com duração de 5 min. O anticorpo secundário, marcado com
peroxidase, foi diluído em solução de leite desnatado 2,5% (m/v) preparada em TBS e
Tween 20 0.01%(v/v) obtendo assim uma diluição de 1:4000. As membranas de
nitrocelulose foram então incubadas com 200 µL de anticorpo secundário anti-coelho
por 1 h em agitação, ausência de luz e lavadas com a solução estoque de TBS diluída
na proporção 1:5 em agitação. Para a primeira lavagem, foi utilizado um intervalo de
tempo de 15 min e as duas seguintes 5 min.
Os complexos formados (antígeno - anticorpo) foram revelados através do
método de intensificação da quimiluminescência pelo luminol utilizando Kit
luminescente ECL (Amersham Enhanced Chemiluminescence Western Blotting). Os
filmes foram revelados com HC-110 (Kodak) e fixados (fixador para raios-X dental/
Kodak) em câmara escura (Figura 6). Os reagentes 1 e 2 do Kit foram misturados na
23
relação 1:1. As membranas foram então incubadas durante 1 min nesta solução onde
utilizou-se um volume aproximado de 2,2 ml. Removeu-se então o excesso destes
reagentes. A membrana foi colocada em uma placa de vidro limpa e coberta com filme
de PVC evitando a formação de bolhas. Em total ausência de luz, cortou-se um pedaço
de filme um pouco maior que a membrana e fez-se a exposição durante 15 min. A
revelação foi feita passando o filme pelo revelador até o aparecimento das bandas. O
filme foi inserido em solução de ácido acético 2% e finalmente na solução fixadora até
que o filme se mostre transparente. Posteriormente este foi lavado em água corrente e
seco.
Figura 6 – Dot Blotting para a definição da diluição ideal do anticorpo primário.
3.8.2 – Imunodetecção
Padrões de Metalotioneína purificado de rim de cavalo e extratos foram
submetidas a SDS-PAGE 16,5% como descrito nesta dissertação. Após a eletroforese,
as proteínas contidas nos géis foram transferidas para membranas de nitrocelulose
utilizando tampão de transferência contendo 25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol
pH 8,3 (tampão de transferência) em um sistema vertical apropriado da Biorad Mini
Protean II de acordo com o procedimento explicitado a seguir:
24
Após a eletroforese, o gel foi submetido à lavagem com o tampão de
transferência para retirar sais e detergente por um período de 5 min. Cortou-se então a
membrana de nitrocelulose em um tamanho semelhante ao do gel, sempre
manipulando a membrana com o auxílio de luvas e pinça. Os papéis de filtro e
esponjas foram saturados com tampão de transferência, e em um recipiente plástico foi
montado o cassete de Blotting com o lado preto voltado para o pólo negativo e o lado
transparente para o pólo positivo (a transferência ocorre do lado negativo para o
positivo). Acima do lado preto foram colocadas na ordem a seguir: esponja, papel de
filtro, gel, membrana, papel de filtro, esponja. As bolhas foram evitadas para garantir
uma transferência uniforme. O cassete foi então fechado, colocado no suporte. Todo o
conjunto foi transferido para o tanque de transferência e enchido com o tampão de
transferência. Um recipiente contendo gelo também foi inserido dentro do tanque. A
fonte foi então ligada a 100 volts constantes por 1 h.
Após a transferência das proteínas, monitoradas através da utilização de um
padrão de MT purificado, as membranas foram coradas com solução de vermelho de
Ponceau 0,2%(m/v) e ácido tricloroacético 3% (v/v) com o objetivo de se verificar a
eficiência da transferência (Figura 19). Esta foi então lavada com água e foi iniciada a
fase de bloqueio.
Incubou-se a membrana de nitrocelulose utilizando leite desnatado em uma
solução 5% (m/v) em TBS (diluição 1:5 a partir da solução estoque) à temperatura
ambiente, agitando delicadamente durante 1h. 100µL do anticorpo primário foi diluído
em 5 mL de solução de leite desnatado 2,5% preparado em solução TBS contendo
0,01% de Tween 20 . Obteve-se assim a diluição 1:50, considerada a mais adequada
(Figura 6).
25
Incubou-se a membrana de nitrocelulose com o anticorpo primário por uma noite
a 4ºC com o recipiente mantido protegido da luz. Após este período, esta foi submetida
à lavagem com solução estoque de TBS (diluída na proporção 1:5), fazendo 5
lavagens. Cada uma teve a duração de 3 min e foi feita sob lenta agitação e
temperatura ambiente.
O anticorpo secundário foi então diluído em solução de TBS obtendo a diluição
de 1:4000. A membrana permaneceu então 1 h incubada com o anticorpo secundário
sob leve agitação à temperatura ambiente. Após o período de incubação a membrana
foi submetida à lavagem 3 vezes com a solução diluída de TBS. Cada lavagem teve a
duração de 3 min sob lenta agitação e à temperatura ambiente. A partir desta etapa, a
membrana foi utilizada para revelação, seguindo o mesmo procedimento explicitado
para o Dot Blotting.
26
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Extração e separação de proteínas
Nos experimentos iniciais realizados para o desenvolvimento desta dissertação,
foram testados diferentes protocolos de extração com o objetivo de realizar a
identificação do mais adequado para a utilização futura em trabalhos de rotina.
O protocolo de precipitação por etanol (Viarengo et al., 1997) para a avaliação
da concentração de metalotioneínas em glândula digestiva de ostras foi obtido a partir
do método de Dieter e colaboradores (1987), utilizado para tecidos de mamíferos.
Para este trabalho, as amostras foram rigorosamente preparadas sob condições
redutoras utilizando β-mercaptoetanol 0,01%, evitando a formação de produtos de
maior massa molecular (>20 kDa). Isto pode ocorrer devido à oxidação da
metalotioneína através da formação de pontes de sulfeto durante a etapa de
purificação.
Este método consiste no fracionamento utilizando etanol e clorofórmio obtendo
uma fração parcialmente purificada da metalotioneína seguido de uma precipitação
utilizando etanol e HCl. Esta acidificação, provavelmente, leva à desestabilização dos
“clusters” formados entre o metal e a metalotioneína. E finalizando, em uma última
etapa, foi realizada uma lavagem final da metalotioneína utilizando uma solução
contendo etanol e clorofórmio (87:1%) com o objetivo de eliminar possíveis
contaminações residuais.
O protocolo foi seguido com e sem a adição de HCl, e os resultados obtidos,
mostrados na corrida eletroforética (Figura 8), revelam que a extração se mostrou
eficiente. Foi possível a visualização de bandas suficientemente nítidas na região de 7
27
kDa nos poços 3 e 6 da Figura 8. Em todos os poços foram aplicados iguais volumes
dos extratos obtidos.
O segundo protocolo utilizado (Erk et al., 2002), através do aquecimento (70ºC),
ocorre à desnaturação e precipitação de proteínas de alta massa molecular obtendo
um sobrenadante contendo as MTs, que são termoestáveis.
O extrato, obtido de acordo com este protocolo, se apresenta no poço 7 (Figura
8) apresentando banda suficientemente nítida na faixa de 7 kDa, onde se espera a
visualização da banda referente as metalotioneínas. Ao se comparar o extrato 7 com os
extratos 5 e 8 (Viarengo et al., 1997) foi possível à verificação de que ambas as
extrações apresentaram resultados comparáveis (Figura 8).
A figura 7 mostra um gel de eletroforese (Laemmli) para os extratos das
amostras de ostras coletadas em Barra de Guaratiba. No primeiro gel, foi utilizado β-
mercaptoetanol 0,01% (v/v) com o objetivo de testar a influência deste reagente sobre
os extratos aplicados. Têm-se 5 colunas, sendo que numeradas de 1 a 3
correspondentes às replicatas de uma mesma amostra. No primeiro e último poço,
foram plicados padrões de proteínas de massas moleculares conhecidas (de 14,40 a
94,00 kDa). Para o segundo gel, onde não foi utilizado β-mercaptoetanol no tampão de
corida, tem-se 4 colunas, sendo que numeradas de 1 a 3 que correspondem às
replicatas de uma mesma amostra. No primeiro poço, foi aplicado padrão de proteínas
de massas moleculares conhecidas (de 14,40 a 94,00 kDa). Ao se atingir o término da
corrida, os géis foram revelados com Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v), Etanol 40%,
Ácido acético 10% em água.
28
Figura 7 – Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE 15%T, 2,67%C para amostras de
ostras coletadas em Barra de Guaratiba.
As condições sugeridas por Laemmli não se mostraram eficientes para a
visualização de bandas abaixo de 10 kDa, mesmo utilizando o método de impregnação
por prata para a revelação do gel. Então se testou a separação eletroforética como
proposto por Schaggger e Von Jagow (1987), utilizando tampão contendo tris e tricina,
onde foi possível a visualização de bandas de até 2 kDa como mostrado na Figura 8.
Este sistema se mostrou adequado para a identificação de proteínas na faixa de
2 a 10 kDa, e sua superioridade se deve à introdução de tricina como “trailing íon”. O
empilhamento de pequenas proteínas na presença de SDS é difícil porque pequenos
peptídeos formam complexos proteína–detergente (micelas) de tamanhos e cargas
muito próximas (Andrews, 1986).
A glicina (pkA 9,60) e a tricina (pkA 8,15) se comportam diferentemente no
empilhamento de proteínas. A glicina, utilizada no sistema Laemmli, favorece o
empilhamento de proteínas de maior massa molecular, porque sua migração é muito
lenta no gel de empilhamento que apresenta pH ácido (Schagger et al., 1987).
29
Para uma faixa de pH usual de 6,8 a 8,8, utilizados no gel de empilhamento, a
tricina apresenta maior velocidade de migração quando comparada com a glicina,
mesmo tendo maior massa molecular. Isto ocorre porque, na migração, uma maior
quantidade de tricina se encontra na forma aniônica favorecendo o deslocamento do
limite de empilhamento para uma faixa de menor massa molecular (Schagger et
al.,1987).
A Figura 8 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras
de ostras coletadas em Barra de Guaratiba – RJ. Este gel apresenta 9 colunas,
numeradas de 1 a 9. No poço 1 temos as bandas referentes ao padrão que contém
proteínas de massa molecular conhecida (de 14,40 a 94,00 kDa). No poço 2, temos as
bandas referentes ao padrão de peptídeos que contém proteínas de massa molecular
conhecida (de 2,51 a 16,95 kDa). Nos poços 3 e 4, temos respectivamente as bandas
do padrão de MTs de coelho e cavalo. Nos poços de número 5 até o nove foram
aplicados os extratos obtidos, sendo que no extrato 5 e 8 foram aplicados iguais
volumes dos extratos (20µL) submetidos ao protocolo de extração proposto por
Viarengo e colaboradores (1997) sem a utilização de HCl para a precipitação das MTs.
No poço 7 foi aplicado o extrato submetido ao protocolo térmico. Nos poços 6 e 9 foram
aplicados extratos submetidos ao protocolo de extração proposto por Viarengo e
colaboradores (1997) utilizando HCl para a precipitação das MTs.
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 8 – Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE 16,5%T; 3%C obtido para
amostras de ostras expostas a Cd2+ por 48h.
Outro grupo de ostras foi exposto à Cd2+ em laboratório, em diferentes intervalos
de tempo e concentração de Cd2+. Os extratos obtidos através destas amostras foram
submetidos a corridas eletroforéticas, e os géis obtidos, revelados utilizando
Coomassie Blue R 250 para a verificação da possibilidade da visualização de bandas
na região de 7 kDa (Figuras 9 e 10).
A figura 9 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras de
ostras induzidas em laboratório. Foram utilizadas ostras provenientes do Laboratório de
Cultivo de Moluscos Marinhos (LCMM) que foram expostas à solução contendo
Cádmio. Na obtenção dos extratos representados nos géis das figuras 9 e 10 foi
utilizado o protocolo de extração fornecido com o reagente Trizol (Invitrogen). Este
estudo não teve como objetivo estudar ou utilizar tal metodologia para extração de
proteínas, uma vez que foi adotado o procedimento proposto por Viarengo (1997). Este
31
gel apresenta 8 colunas, e no primeiro poço, tem-se as bandas do padrão que contém
peptídeos de massa moleculares conhecidas (de 2,51 a 16,95 kDa). No poço 2. tem-se
a banda do padrão de MTs de cavalo. Nos poços 3 e 4 foram aplicados extratos
obtidos de indivíduos expostos por um período de 2 dias a 100 µg L-1 de Cd2+, nos
poços 5 ao 7 tem-se extratos obtidos de indivíduos expostos por um período de 7 dias
a 100 µg L-1 de Cd2+, o poço 8 tem-se extrato obtido de indivíduo exposto por um
período de 7 dias a 200 µg L-1 de Cd2+, e no poço 9 tem-se exposto por um período de
2 dias a 200 µg L-1 de Cd2+. Este foi revelado com Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v),
Etanol 40%, Ácido acético 10% em água.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 9 – Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE 16,5%T; 3%C contendo extratos
obtidos de amostras de ostras expostas à solução contendo Cd2+ em laboratório
(LCMM).
32
A figura 10 também mostra um gel de eletroforese obtido para replicatas dos
extratos das amostras de ostras induzidas em laboratório. Este gel apresenta 8
colunas, e no primeiro poço, tem-se as bandas referente ao padrão que contém
peptídeos de massa moleculares conhecidas (de 2,51 a 16,95 kDa). No poço 2, tem-se
a banda referente ao padrão de metalotioneína de cavalo. Nos poços 3 e 4 foram
aplicados extratos obtidos de ostras expostas por um período de 2 dias a 100 µg L-1 de
Cd2+ . Os poços 5, 6 e 7 tem-se extratos obtidos de indivíduos expostos por um
período de 7 dias a 100 µg L-1 de Cd2+, e o último poço tem-se extrato de um indivíduo
exposto um período de 7 dias a 200 µg L-1 de Cd2+. Este gel foi revelado com
Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v), Etanol 40%, Ácido acético 10% em água.
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 10 – Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE 16,5%T; 3%C contendo extratos
obtidos de amostras de ostras expostas à solução contendo Cd2+ em laboratório.
33
Os géis presentes nas figuras 9 e 10 demonstram que a utilização do Coomassie
Blue para a revelação do gel apresenta sensibilidade adequada para a visualização das
bandas presentes nos extratos, evitando assim o emprego da técnica de impregnação
por prata, o que aumenta o tempo de análise, o que não é desejável para uma análise
de rotina. Além disso, pode-se verificar que estes géis mostram a possibilidade de
separar e identificar proteínas de baixa massa molecular (< 10 kDa).
Schagger e Von Jagow (1987) propõem em seu estudo a utilização de 3
porosidades de gel (16,5%,10%,4%) quando se tem o objetivo de visualizar bandas
abaixo de 2kDa. Como as MTs se apresentam na faixa de 7kDa, optou-se pela não
utilização desta camada intermediária (10%) no preparo do gel. Assim pode se verificar
através dos géis mostrados nas figuras 8 e 9 que foi possível a visualização de bandas
até 6,21kDa. Por isso estes géis se mostraram adequados para a realização de
estudos quando se deseja a visualização de bandas contendo MTs.
4.2 – Identificação e quantificação de MTs por Derivatização com mBBr
Para os experimentos aqui representados, foram selecionados 2 extratos, sendo
que o primeiro foi obtido através do protocolo de extração proposto por Erk (2002) e o
segundo através do protocolo proposto por Viarengo (1997). Ambos os extratos foram
tratados com bromobimano, e aplicados no gel mostrado na figura 11. Esta técnica se
mostrou adequada possibilitando o isolamento e a quantificação das MTs. As bandas
localizadas na mesma região que o padrão aplicado, na faixa de 7 kDa, são bandas
referentes às MTs, visto que o bromobimano é um reagente altamente específico, se
ligando aos grupos sulfidrilas característicos às cisteínas das MTs.
A figura 11 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras
de ostras coletadas em Barra de Guaratiba – RJ e expostas à solução contendo 100
34
mg. L-1 de Cd2+ em laboratório por um intervalo de tempo de 48 h. Este gel apresenta 8
colunas. No primeiro poço, temos as bandas do padrão que contém metalotioneínas.
Nos poços de 1 a 4 temos a banda do padrão purificado de MTs extraído de peixe em
ordem crescente de concentração formando uma curva analítica. No poço 6, temos as
bandas protéicas do extrato de ostras induzidas em laboratório obtidos através do
tratamento térmico. No poço 8, tem-se a banda protéica referente ao mesmo extrato
aplicado no poço 6, porém submetido ao protocolo proposto por Viarengo e
colaboradores (1997). O gel foi visualizado e fotografado em transiluminador U.V.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 11 – Imagem de um gel obtido por SDS-PAGE contendo curva com padrões e
extratos de ostras expostas a Cd2+ tratados com bromobimano.
35
Quantificação de MT (Bromobimano)
y = 84,524x + 37R2 = 0,9841
20304050607080
0 0,2 0,4
Massa de MT (µg)
Nº d
e pi
xels
/ ban
da
0,6
Figura 12 – Curva analítica para padrões aplicados no gel da Figura 11 (mBBr).
A figura 12 ilustra uma curva analítica obtida através do gel da figura 11. O eixo
das abscissas representa a massa de MTs presente nos padrões aplicados, e o eixo
das ordenadas o sinal (número de pixels) referente às bandas contendo MTs. As
bandas representadas nas posições 6 e 8 são referentes aos extratos obtidos através
dos dois protocolos de extração diferentes utilizados neste estudo. Pode-se verificar,
através da contagem dos números de pixels através do programa ImageJ versão 1.0,
que a intensidade do sinal se apresentaram semelhantes para os dois extratos
aplicados. A equação obtida através da curva analítica (Figura 12) permitiu fazer a
estimativa das concentrações.
Para o extrato submetido ao tratamento térmico, obteve-se uma massa
equivalente a 0,984 µg para 20 µL do extrato aplicado. O segundo extrato, utilizando o
protocolo proposto por Viarengo et al (1998), obteve-se uma massa equivalente a
0,994 µg, para o mesmo volume de amostra aplicada.
36
Estes resultados mostram que não houve diferença significativa para os
resultados encontrados para a concentração de MTs para o extrato purificado após
tratamento térmico (70ºC) e precipitação com solvente. Em estudo realizado por Geret
e colaboradores (1998), estes também não encontraram diferenças significativas ao se
comparar os resultados obtidos através destes protocolos.
A figura 13 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras
de ostras expostas à solução contendo 100 mg. L-1 de Cd2+ por 48h em laboratório.
Este gel apresenta 8 colunas. Nos poços 1 a 3, foi possível apenas a visualização das
bandas do padrão que contém MTs de peixe em ordem crescente de concentração
formando uma curva analítica. Nos poços 4 a 9, não foi possível a visualização das
bandas protéicas para os extratos aplicados. Este foi visualizado em transiluminador
U.V. Obteve-se uma curva analítica para os padrões (Figura 14), mas nas amostras
analisadas as concentrações de MTs se encontraram abaixo do limite de detecção, não
apresentando bandas na região de 7 kDa.
37
Figura 13 – Imagem de gel 16,5% T, 3% C obtido por SDS-PAGE contendo curva com
padrões e extratos de ostras coletadas na Baía de Sepetiba. Gel visualizado em
transiluminador u.v.
Quantificação de MT (Bromobimano) y = 52,495x + 17,16
R2 = 0,9935
0
2040
60
80
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
massa de MT (ug)
Nº p
ixel
s/ b
anda
Figura 14 – Curva analítica para padrões aplicados no gel da Figura 13 (mBBr).
Em paralelo a derivatização com mBBr, o gel da figura 13 foi revelado com
Coomassie Blue (Figura 15). Neste gel foi possível a visualização da banda do padrão
de metalotioneína de peixe aplicadas nos poços de 1 a 3 em ordem crescente de
concentração. No poços 5 a 9, temos as bandas protéicas dos extratos de ostras
induzidas em laboratório.
38
Figura 15 – Imagem do gel mostrado na Figura 13 revelado com Coomassie Blue.
A corrida eletroforética funcionou corretamente, permitindo a visualização de
diversas bandas protéicas para os diferentes extratos. Embora o primeiro extrato de
ostras induzidas tenha apresentado bandas na faixa de 7 kDa (Figura 15), não foi
possível a identificação das MTs porque as bandas não apareceram para estes
extratos, no gel mostrado na Figura 13 (bromobimano).
4.3 – Preservação de amostras
Quando se trata de preservação das amostras, é altamente recomendável a
separação das amostras em alíquotas. Assim evitam-se sucessivos processos de
congelamento e descongelamento evitando assim a degradação dos extratos, o que
pode levar o analista a erros.
Durante os experimentos realizados, um grupo de extratos (Figura 16) sofreram
degradação não apresentando suas bandas características. Por isso foi necessária
39
uma nova coleta de ostras (Ilha de Martins - Baía de Sepetiba) seguida por novas
extrações e corridas eletroforéticas.
A figura 16 mostra um gel de eletroforese obtido para os extratos das amostras
de ostras coletadas em Barra de Guaratiba, representadas pela sigla ST e também
extratos obtidos de ostras coletadas na Baía de Sepetiba, representadas pela sigla
SPT. Este gel apresenta 9 colunas, sendo que numeradas de 1 a 9. No primeiro e
último poço, temos as bandas do padrão de peptídeos de massas moleculares
conhecidas (de 6,21 a 16,95 kDa). No poço 2, tem-se a banda referente ao padrão de
MTs. Nos poços 3 ao 6, tem-se bandas pouco nítidas de extratos de ostras de Barra de
Guaratiba submetidas ao tratamento térmico. Nos poços 7 ao 9 tem-se bandas
protéicas de extratos de ostras de Barra de Guaratiba. Este gel foi revelado com
Coomassie Blue R-250 0,2% (p/v), Etanol 40%, ácido acético 10% em água.
Figura 16 – Imagem de gel 16,5% T, 3%C obtido por SDS-PAGE contendo extratos
que sofreram degradação (ST) e extratos de ostras coletadas na Baía de Sepetiba
(SPT).
40
4.4 – Detecção imunológica das bandas contendo MTs
A figura 17 mostra uma membrana de nitrocelulose obtida para os extratos das
amostras de ostras coletadas na Baía de Sepetiba. A membrana se encontra
organizada em 9 colunas (poços), numeradas de 1 a 9. No primeiro e último poço, tem-
se as bandas do padrão que contém proteínas de massa moleculares conhecidas (de
14,40 a 94,00 kDa). No poço 2,3 e 4 respectivamente tem-se as bandas referente ao
padrão purificado de MTs de cavalo e peixe. Nos poços 5 ao 9 tem-se bandas de
extratos obtidos através de ostras coletadas na Baía de Sepetiba. Pode-se observar
também que a banda para o padrão purificado de MT de peixe e cavalo se apresenta
na região correspondente a 7 kDa confirmando o resultado obtido através da
derivatização com mBBr. Os extratos aplicados também apresentaram bandas pouco
nítidas na mesma faixa de massa molecular.
Figura 17 – Imagem de uma membrana de nitrocelulose obtida após transferência gel
– membrana. A membrana foi corada utilizando Vermelho de Ponceau. Os extratos
foram preparados através de amostras de ostras coletadas em Barra de Guaratiba e
expostas a 100 mg. L-1 de Cd2+ por 48h.
41
A figura 18 mostra a revelação das bandas obtidas após a incubação de
anticorpos para o padrão purificado de metalotioneína e amostras. Nos poços com a
numeração de 1 a 7 temos bandas de extratos de ostras induzidas em laboratório após
a incubação de anticorpos específicos. Foi possível se observar bandas nítidas para os
extratos na região de 7 kDa e bandas pouco nítidas que podem ser devido a presença
de forma dimerizada da metalotioneína nos extratos.
Figura 18 – Membrana de nitrocelulose revelada apresentando bandas contendo
metalotioneína.
A membrana revelada, após a incubação de anticorpos específicos apresentou
as bandas referentes às MTs. Observaram-se também bandas pouco nítidas que se
referem a formas dimerizadas das MTs. O mesmo efeito pode ser observado no gel da
figura 13, onde aparecem as bandas para os dímeros e ainda outra menos nítida em
uma faixa de maior massa molecular.
42
5 – CONCLUSÕES
Os estudos relacionados à separação e identificação de proteínas através de
SDS-PAGE se mostraram adequados para o estudo das metalotioneínas. Foram
testados diferentes modos de detecção fornecendo diferentes opções para a
identificação de MTs com uma metodologia não cromatográfica. Do estudo destes
procedimentos pode-se concluir que:
1. Para se trabalhar com metalotioneínas, proteínas de baixa massa molecular, as
condições propostas por Schagger, utilizando tampão contendo tricina, se
mostraram mais adequadas. Porém foi necessário fazer algumas modificações, com
o objetivo de se reduzir o tempo de preparo dos géis e menor consumo de
reagentes.
2. O Coomassie Brilliant Blue R250 se mostrou eficiente para a detecção das
bandas e identificação de bandas contendo até 0,24µg de MTs. Por isso optou-se
pela não utilização da impregnação por prata, o que aumenta o custo e o tempo de
análise.
3. A SDS-PAGE, aliada a derivatização com bromobimano, se mostrou adequada
para a quantificação de metalotioneínas extraídas de ostras.
4. A técnica de Imunoblotting se mostrou uma técnica específica e eficaz para a
identificação de metalotioneínas, confirmando assim os resultados obtidos através
da derivatização com bromobimano. Embora mais trabalhosa pode ser uma
alternativa para a identificação da metalotioneína, uma vez que não se testou uma
analise quantitativa das MTs através desta técnica.
43
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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