UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

CHRISTIANE DE OLIVEIRA BENSUSAN

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE FORMAS SOLÚVEIS DO RECEPTOR

DE PRODUTOS FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA EM

PACIENTES COM DIABETES MELLITUS TIPO 2

NITERÓI

2017

CHRISTIANE DE OLIVEIRA BENSUSAN

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE FORMAS SOLÚVEIS DO RECEPTOR

DE PRODUTOS FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA EM

PACIENTES COM DIABETES MELLITUS TIPO 2

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense como

parte dos requisitos necessários à

obtenção do Grau de Mestre. Área de

Concentração: Ciências Médicas

Orientadora: Profª Drª Giselle Fernandes Taboada

Co-orientadora: Profª Drª Giovanna Aparecida Balarini Lima

NITERÓI-RJ

2017

FICHA CATALOGRÁFICA

B474

Bensusan, Christiane de Oliveira

Avaliação dos níveis de formas solúveis do

receptor de produtos finais de glicação avançada em

pacientes com diabetes mellitus tipo 2 / Christiane

de Oliveira Bensusan.- Niterói: 2017.

101 f.

Orientador: Giselle Fernandes Taboada.

Co-Orientador: Giovanna Aparecida Balarini Lima.

Dissertação(Mestrado em Ciências Médicas)-

Universidade Federal Fluminense, Faculdade de

Medicina, 2017.

1. Produtos Finais de Glicosilação Avançada -

Agonistas. 2. Isoformas de Proteínas. 3. Diabetes

Mellitus tipo 2. 4. Complicações do Diabetes. I.

Título.

CDD 616.462

CHRISTIANE DE OLIVEIRA BENSUSAN

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE FORMAS SOLÚVEIS DO RECEPTOR

DE PRODUTOS FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA EM

PACIENTES COM DIABETES MELLITUS TIPO 2

Dissertação submetida ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense como

parte dos requisitos necessários à

obtenção do Grau de Mestre. Área de

Concentração: Ciências Médicas

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Prof. Dr.

______________________________________________________________________

Prof. Dr.

______________________________________________________________________

Prof. Dr.

NITERÓI – RJ

2017

À minha amada família, base da minha vida,

em especial meus pais, Sandra Regina de

Oliveira Bensusan e Henrique Bensusan Filho,

pelo apoio e amor incondicional.

AGRADECIMENTOS

A Deus, meu sustentáculo, por estar sempre comigo, guiar os meus passos e permitir que

completasse mais essa etapa em minha vida.

Aos meus pais, Sandra e Henrique, pela preciosa ajuda nesse período e por tudo o que fazem

por mim. Sem vocês não seria possível.

Aos meus irmãos Fabio e Thiago, e minhas cunhadas, Luciene e Bianca, pelo apoio e

compreensão.

À minha orientadora, Professora Giselle, por acreditar no meu potencial e por todos os

ensinamentos, suporte científico, paciência, incentivo, amizade e carinho durante essa

jornada.

À minha co-orientadora, Professora Giovanna, por toda atenção, contribuição técnica, carinho

e amizade nesse período.

A vocês, Professoras Giselle e Giovanna, muito obrigada pelo exemplo, orientações e

participação efetiva na minha vida profissional. Foi uma honra ter sido orientada por vocês.

Ao professor Rubens Antunes, pela disponibilidade e pela revisão impecável da minha

dissertação.

Aos professores Gilberto Miranda e Wolney Figueiredo por me acolherem sempre com

apreço em seus ambulatórios durante a longa fase de inclusão dos pacientes.

Ao Anderson, companheiro de mestrado, que dividiu comigo as dificuldades desse período,

por todo auxílio e amizade ao longo dessa nossa caminhada.

À Professora Luciene e seus alunos, pela imprescindível ajuda com o processamento das

amostras sanguíneas e dosagem do sRAGE dos pacientes.

Ao Oftalmologista do HUAP-UFF, Dr Eduardo Damasceno, e toda sua equipe, e à

Oftalmologista Heliane Almeida, pela gentileza e colaboração na realização da fundoscopia

dos pacientes do estudo.

Às biólogas Solange Lopes e Maria Alice Cardozo, sempre atenciosas e dispostas a me

ajudar, e a toda equipe do laboratório do HUAP-UFF, pela inestimável assistência ao longo

dessa caminhada.

Aos funcionários do Arquivo do HUAP-UFF, pela boa vontade e solicitude para comigo

durante esse longo período.

Às residentes do serviço de Endocrinologia do HUAP-UFF, pela colaboração durante a etapa

de inclusão dos pacientes.

Aos pacientes, parte fundamental desse projeto, sem a qual seria impossível a concretização

dessa pesquisa, obrigada pela doação e por suas contribuições à ciência. Vocês merecem o

meu eterno agradecimento.

Às minhas afilhadas (Ana Cláudia e Sophia), aos meus padrinhos (Elaine e Marco), às minhas

tias (Gelza e Ana Lúcia), aos meus tios (Zuza, Paulinho e Geraldo), e a todos os familiares e

amigos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse projeto, muito

obrigada.

“Tudo posso naquele que me fortalece”.

(Filipenses 4:13)

RESUMO

Introdução: O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) representa um importante problema de saúde

pública, considerando sua grande morbi/mortalidade, decorrente das complicações crônicas da

doença. A formação de produtos finais de glicação avançada (AGE) representa um dos

diversos mecanismos fisiopatológicos implicados na gênese das complicações do DM2.

Através da ligação dos AGE com os seus receptores teciduais (RAGE) vias intracelulares são

ativadas, levando ao aumento da resposta inflamatória e à indução de estresse oxidativo, que

culminam com as complicações micro e macrovasculares do DM2. Por outro lado, há um pool

de RAGE solúveis (sRAGE), constituído por variantes do RAGE (esRAGE e cRAGE), com

capacidade de interagir com os mesmos ligantes do RAGE tecidual, sem, entretanto,

desencadear a transdução do sinal intracelular após a sua ligação. Dessa forma, o sRAGE

funcionaria como um fator protetor para o desenvolvimento das complicações crônicas do

DM2. No entanto, a associação entre os níveis de sRAGE com a presença de complicações

micro e macrovasculares do DM2, assim como a associação entre os níveis de sRAGE com o

grau de controle glicêmico, não está bem estabelecida, já que os trabalhos existentes na

literatura mostram resultados divergentes. Objetivos: O presente estudo visou compreender

melhor as correlações entre os níveis de sRAGE, as complicações crônicas do DM2 e o

controle glicêmico, através da avaliação de pacientes DM2 acompanhados no Hospital

Universitário Antônio Pedro. Métodos: Foram incluídos 89 pacientes DM2, 43 com

complicações e 46 sem complicações. Cada um desses dois grupos pacientes foi subdividido,

de acordo com o controle glicêmico, em outros 3 subgrupos. Os pacientes foram submetidos a

uma avaliação clínica e laboratorial, com dosagem de sRAGE e hemoglobina glicada. O

sRAGE foi mensurado no soro dos pacientes utilizando-se o teste imunoenzimático ELISA.

Resultados: Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa nos níveis de sRAGE

plasmático entre os pacientes DM2 com e sem complicações microvasculares do DM2, bem

como não foi constatada correlação do sRAGE com o controle glicêmico. Conclusão: Novos

estudos são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos na produção e

regulação da concentração das formas solúveis do RAGE e esclarecer a relação de causa-

efeito entre os níveis séricos do sRAGE e as complicações crônicas do DM2.

Palavras Chaves: Receptores solúveis de AGEs, sRAGE, diabetes mellitus tipo 2.

ABSTRACT

Background: Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major public health problem, considering

its high morbidity and mortality due to chronic complications. The formation of advanced

glycation end products (AGE) is one of several pathophysiological mechanisms involved in

the development of complications of T2DM. By binding of AGE with its tissue receptors

(RAGE), intracellular pathways are activated, leading to increased inflammatory response and

the induction of oxidative stress, which culminate in the micro and macrovascular

complications of T2DM. Moreover, there is a pool of soluble RAGE (sRAGE) consisting of

variants of RAGE (esRAGE and cRAGE), with ability to interact with the same tissue RAGE

ligands, without, however, trigger the intracellular signal transduction after binding. Thus,

sRAGE would behave as a protective factor for the development of chronic complications of

T2DM. Nevertheless, the association between sRAGE levels with the presence of micro and

macrovascular complications of T2DM, as well as the association between sRAGE levels

with the degree of glycemic control, is not well established, since the studies in the literature

show divergent results. Objectives: This study aimed to better understand the correlations

between the levels of sRAGE, the chronic complications of T2DM and glycemic control,

through the evaluation of T2DM patients treated at University Hospital Antônio Pedro.

Methods: A total of 89 T2DM patients were included, 43 with complications and 46 without

complications. Each of these two groups was divided according to glycemic control, in other

3 groups. The patients underwent a clinical evaluation and laboratory, dosing sRAGE and

glycated hemoglobin. sRAGE was measured in serum of patients by ELISA. Results: No

statistically significant difference was found in plasma sRAGE levels between T2DM patients

with and without microvascular complications, as well as no correlation between sRAGE and

glycemic control. Conclusion: Further studies are needed to better elucidate the mechanisms

involved in producing and regulating the concentration of soluble forms of RAGE and to

clarify the cause-effect relationship between serum levels of sRAGE and the chronic

complications of T2DM.

Keywords: soluble receptors for AGEs, sRAGE, type 2 diabetes mellitus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Vias metabólicas ativadas em consequência da hiperglicemia, f. 29

Figura 2 - Mecanismos do dano induzido pela hiperglicemia, f.30

Figura 3 - Formação dos AGEs, f. 32

Figura 4 - Estrutura do RAGE, f. 37

Figura 5 - Interação AGE-RAGE e ativação dos mecanismos intracelulares relacionados ao

desenvolvimento das complicações crônicas do DM2, f. 39

Figura 6 - Variantes do RAGE e formação do pool de RAGE solúveis (sRAGE), f. 40

Figura 7 - Interação AGE-sRAGE e ausência de transdução do sinal intracelular, f. 41

Figura 8 - Variantes do RAGE, f. 43

Figura 9 - Distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos, f. 56

Figura 10 - Distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos, f. 62

Figura 11 - Relação cintura/quadril dos pacientes DM2, f. 68

Figura 12 - Colesterol total dos pacientes DM2, f. 68

Figura 13 - LDL dos pacientes DM2, f. 68

Figura 14 - sRAGE de acordo com a distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos, f. 70

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Estudos sobre as complicações do DM e formas solúveis do RAGE, f. 48

Tabela 2 - Estudos sobre controle glicêmico e formas solúveis do RAGE, f. 50

Tabela 3 - Influência das medicações nos níveis de sRAGE, f. 52

Tabela 4 - Características clínicas dos pacientes DM2, f. 64

Tabela 5 - Características de exame físico dos pacientes DM2, f. 65

Tabela 6 - Características laboratoriais dos pacientes DM2, f. 66

Tabela 7 - sRAGE dos pacientes DM2, pré-DM e controles, f. 69

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AAS – Ácido acetilsalicílico

ADAM – Proteínas que contém domínio desentegrina e metaloproteinase

ADAM 10 - Alfa secretase membro da família ADAM

ADO - Antidiabético oral

AFGP - 1-alquil-2-formil-3,4-diglicosil pirrol

AGE-R1 ou OST-48 – Receptor de AGE do tipo 1 ou oligossacariltransferase - 48 kDa

(oligosaccharyl transferase- 48kDa)

AGE-R2 ou 80K-H – Receptor de AGE do tipo 2 ou fosfoproteína 80K-H (80 K-H

phosphoprotein)

AGE-R3 ou galectina-3 - Receptor de AGE do tipo 3

AGEs - Produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end products)

Agonistas do PPAR- - Agonistas dos receptores ativados por proliferador de peroxissomo

(tiazolidinedionas)

ALEs - Produtos finais da lipoxidação avançada (advanced lipoxidation end products)

AKT - Serina-treonina quinase

AP-1 - Proteína ativadora 1 (fator de transcrição)

BRA - Bloqueadores do receptor da angiotensina

CA – Cintura abdominal

Cal – Concentração de albumina

CD36 - Grupamento de diferenciação 36 (cluster of differentiation 36) – membro 3 da classe

B dos receptores depuradores (scavenger) ou glicoproteína III-b

Cdc42 - Ciclo de divisão celular 42 (proteína da família Rho de GTPases)

CEL - Carboxietilisina

CKD-EPI – Fórmula para o cálculo da TFG do grupo Chronic Kidney Disease Epidemiology

Collaboration

Clcr – Clearance de creatinina

CML - Carboximetilisina

cRAGE - RAGE clivado (cleaved RAGE)

CT - Colesterol total

DAG - Diacilglicerol

DHAP - Dihidroxiacetona fosfato

DM – Diabetes mellitus

DM2 – Diabetes mellitus tipo 2

DN-RAGE - RAGE dominante no estado negativo

ΔN-RAGE - Delta RAGE

DOLD - Dímero de 3-deoxiglicosona-lisina

EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético (anticoagulante)

EGF- like – Receptor semelhante ao fator de crescimento epidérmico (epidermal growth

factor-like)

EIM – Espessura da íntima-média

ELISA – Ensaio imunoenzimático (enzyme linked immuno sorbent assay)

Endotelina 1 – Vasoconstrictor produzido tanto nas células endoteliais como nas células

musculares lisas dos vasos

ERK1 e 2 - Quinases reguladas por sinal extracelular

EROs - Espécies reativas de oxigênio

E-selectina - Selectina endotelial

esRAGE - RAGE secretor endógeno (endogenous secretory RAGE)

EUA – Excreção urinária de albumina

FEEL-1 e FEEL-2 – Receptores depuradores contendo domínio de ligação - 1 e 2 (link

domain-containing scavenger receptor-1 e 2 )

FFI - 2-(2-fluoril)-4,5-furanil-1-H-imidazol

G - Guanina

GAP - Gliceraldeído-3-fosfato

GAPDH - Enzima glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

G-H1 - Hidroimidazolona derivada de glioxal

GJ - Glicemia de jejum

Gln - Glicosamina

Glu – Glicose

GO – Glioxal

GOLD - Dímero de glioxal-lisina

GSH - Glutationa reduzida (molécula antioxidante)

GTP - Guanosina trifosfato

GTPases - Guanosinas trifosfatases (enzimas que hidrolizam o GTP)

HbA1c - Hemoglobina glicada

HDL - Lipoproteínas de alta densidade plasmática

HOMA-IR- Índice de resistência insulínica (homeostasis model assessment insulin

resistance)

HOMA-%B – Índice para avaliação da função das células beta pancreáticas (homeostasis

model assessment b-cell function)

ICAM - Molécula de adesão intercelular 1

IECA - Inibidores da enzima conversora da angiotensina

IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

IgG – Imunoglobulina G

IgM – Imunoglobulina M

IL-1 - Interleucina 1

IL-6 - Interleucina 6

IMC – Índice de massa corporal

Inibidores da HMG-CoA redutase – Inibidores da enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-

coenzima A redutase (estatinas)

JAK - Janus quinase

JNK - Quinase c-Jun N-terminal

kDa – Kilodalton (unidade de massa atômica/molecular)

LE - Receptor semelhante ao fator de crescimento epidérmico tipo laminina (laminin-type

epidermal growth factor-like)

LDL - Lipoproteínas de baixa densidade plasmática

LOX-1 – Receptor de LDL oxidada semelhante à lectina -1 (lectin-like oxidized LDL

receptor-1)

MAPK - Proteínas quinases ativadas por mitógenos

MG - Metilglioxal

MG-H1 - Hidroimidazolona derivada de metilglioxal

MMPs - Metaloproteinases

MMP-9 - Metaloproteinase da matriz extracelular-9

MOLD - Dímero de metilglioxal-lisina

NAD⁺ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)

NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)

NADP⁺ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada)

NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)

NADPH oxidase - Enzima nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato oxidase

ND – Nefropatia diabética

NF-kβ - Factor nuclear kappa B

NO - Óxido nítrico

O2⁻ - Radical superóxido (espécie reativa do oxigênio)

PAsist - Pressão arterial sistólica

PAdiast - Pressão arterial diastólica

PGI2 - Prostaciclina

PI3K - Fosfatidilinositol-3-quinase

PKC - Proteína quinase C

Pré-DM – Pré-diabetes mellitus

p38 - Proteína quinase ativada por mitógeno p38

Rac - Substrato C3 de toxina botulínica relacionada ao RAS (proteína da família Rho de

GTPases)

RAC – Relação albumina/creatinina em amostra isolada de urina

RAGE - Receptor para os AGEs

RAS - Proteína oncogênica do vírus de sarcoma de rato (rats sarcome)

RCQ – Relação cintura-quadril

RD – Retinopatia diabética

RDNP – Retinopatia diabética não proliferativa

RDP – Retinopatia diabética proliferativa

RNPhn H - Partículas de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas H

sRAGE - RAGE solúvel (soluble RAGE).

STAT 3 - Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3

TFG – Taxa de filtração glomerular

TGF-β – Fator de crescimento transformador beta (transforming growth factor beta)

TNFα - Fator de necrose tumoral alfa

TG - Triglicerídeos

UDP- GLc NAc - Ridina 5'-difosfato-N-acetilglicosamina

VCAM - Molécula de adesão celular-vascular 1

VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular

vs - versus

3-DG - 3-deoxiglicosona

3DG-H1 - Hidroimidazolona derivada de 3-deoxiglicosona

1000 x g - Força centrífuga relativa aplicada 1000 vezes maior que a força da gravidade

SUMÁRIO

Página

RESUMO....................................................................................................................................9

ABSTRACT..............................................................................................................................10

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................11

LISTA DE TABELAS..............................................................................................................12

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS .......................................................13

1- INTRODUÇÃO...................................................................................................................22

2- REVISÃO DE LITERATURA .........................................................................................23

2.1- DIABETES MELLITUS...................................................................................................23

2.2- COMPLICAÇÕES CRÔNICAS DO DM2.....................................................................24

2.2.1- Nefropatia diabética..........................................................................................24

2.2.2- Retinopatia diabética........................................................................................25

2.2.3- Neuropatia diabética.........................................................................................26

2.2.4- Complicações macrovasculares.......................................................................27

2.2.5- Fisiopatologia das complicações do DM2.......................................................28

2.3- PRODUTOS FINAIS DA GLICAÇÃO AVANÇADA (Advanced glycation end products

- AGEs).....................................................................................................................................31

2.3.1- Bioquímica dos AGEs.......................................................................................31

2.3.2- Metabolismo dos AGEs....................................................................................33

2.3.3- Mecanismos de ação dos AGEs........................................................................35

2.4- RECEPTORES PARA OS PRODUTOS FINAIS DA GLICAÇÃO AVANÇADA......36

2.4.1- RAGE.................................................................................................................36

2.4.2 - sRAGE..............................................................................................................39

2.4.3- Outros receptores para os produtos finais da glicação avançada................43

2.5- AGEs E COMPLICAÇÕES DO DM2..............................................................................44

2.6- sRAGE E COMPLICAÇÕES DO DM2...........................................................................46

2.7- sRAGE E CONTROLE GLICÊMICO..............................................................................49

2.8- sRAGE E MEDICAÇÕES................................................................................................51

2.9- sRAGE E EXERCÍCIO FÍSICO.......................................................................................52

2.10- sRAGE E ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA (IMC)....................................................52

2.11- sRAGE E FUNÇÃO RENAL.........................................................................................53

2.12- sRAGE E PRÉ-DM.........................................................................................................54

3- OBJETIVOS.......................................................................................................................55

3.1- GERAL........................................................................................................................ ......55

3.2- ESPECÍFICOS..................................................................................................................55

4- PACIENTES E MÉTODOS..............................................................................................56

4.1- DESENHO DO ESTUDO.................................................................................................56

4.2- CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...........................................................................................56

4.3- PACIENTES......................................................................................................................56

4.3.1- Critérios de inclusão.........................................................................................57

4.3.2- Critérios de exclusão.........................................................................................57

4.4- FLUXO DA PESQUISA...................................................................................................57

4.4.1- Avaliação clínica................................................................................................58

4.4.2- Avaliação laboratorial......................................................................................59

4.5- DOSAGEM DO sRAGE...................................................................................................59

4.6- DOSAGEM DE HBA1C...................................................................................................60

5- ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................61

6- RESULTADOS...................................................................................................................62

7- DISCUSSÃO.......................................................................................................................72

8- CONCLUSÕES...................................................................................................................82

9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................83

10-ANEXOS.............................................................................................................................98

10.1- CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA.................................................98

10.2- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)........................99

10.3- FICHA DE COLETA DE DADOS...............................................................................101

22

1 INTRODUÇÃO

As complicações crônicas do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) causam um grande

impacto na vida dos pacientes, seus familiares e no sistema público de saúde do mundo todo.

O adequado conhecimento da fisiopatologia da doença e de suas complicações é de

fundamental importância, visando uma melhora no diagnóstico, tratamento e prevenção

dessas complicações (Winer et al., 2004; Forouhi et al., 2014).

Sabe-se que os produtos finais da glicação avançada (AGE), através de suas ligações

com seus receptores presentes na superfície da célula (RAGE), participam de forma

determinante no desenvolvimento das complicações do DM2. Por outro lado, ao se ligarem a

receptores solúveis no sangue (sRAGE), os AGEs não ativam as vias intracelulares que

resultam nos danos teciduais que caracterizam as complicações crônicas da doença

(Robertson, 2004; Hudson et al., 2008).

Esse papel protetor do sRAGE, entretanto, ainda não está completamente definido,

uma vez que estudos disponíveis demonstram resultados conflitantes em relação a sua

associação com as complicações crônicas do DM e com o controle glicêmico. O

esclarecimento desta questão é relevante, podendo servir como base para possíveis pesquisas

futuras relacionadas ao desenvolvimento de terapias que visem à elevação dos níveis de

formas solúveis do RAGE com o objetivo de prevenir, retardar ou reverter as complicações

crônicas do DM2 (Devangelio et al., 2007; Humpert et al., 2007; Koyama et al., 2005; Al-

Mesallamy et al., 2011; Kerkeni et al., 2012).

Sendo assim, este estudo teve por objetivo avaliar os níveis de sRAGE em indivíduos

com DM2 e correlacioná-los com as complicações crônicas microvasculares e com os níveis

glicêmicos dos pacientes avaliados. Para isso foi realizado um estudo transversal.

23

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DIABETES MELLITUS

O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) é uma doença caracterizada pela hiperglicemia

persistente, resultado do metabolismo inadequado da glicose. A fisiopatogenia envolve

basicamente dois defeitos principais: a resistência à ação da insulina, que resulta na redução

da sua utilização periférica pelos adipócitos e músculo esquelético e no aumento da produção

hepática de glicose, e a falência progressiva da secreção de insulina pelas células

pancreáticas (DeFronzo, 1988).

A prevalência de DM2 vem aumentando nas últimas décadas, principalmente

relacionada, dentre outros fatores, ao aumento da prevalência de obesidade (Winer et al.,

2004; Forouhi et al., 2014). As últimas estimativas mostram uma prevalência global de 415

milhões de pessoas com diabetes entre 20-79 anos, dos quais 193 milhões desconhecem este

diagnóstico. Cerca de 75% vivem em países de baixa e média renda. Noventa porcento do

total de pessoas com diabetes no mundo correspondem a pacientes com DM2 (Internacional

Diabetes Federation –IDF, 2015; World Health Organization – WHO, 2015). É uma doença

que aumenta a cada ano, devendo atingir 642 milhões de pessoas em 2040, um em cada dez

adultos. No Brasil, há cerca de 14,3 milhões de diabéticos, com estimativa deste número subir

para 23,3 milhões em 2040. (Internacional Diabetes Federation – IDF, 2015).

Este fato representa um problema de saúde pública, visto a grande morbi/mortalidade

associadas, em decorrência das complicações crônicas do DM2 (Winer et al., 2004; Forouhi et

al., 2014). Em 2015, o diabetes foi responsável por aproximadamente cinco milhões de mortes

no mundo e por um gasto em despesas de saúde entre 673 milhões e 1,197 bilhões de dólares

(12% das despesas da saúde global) [Internacional Diabetes Federation – IDF, 2015]. A

Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que o diabetes será a sétima principal causa de

morte em 2030 (World Health Organization – WHO, 2015).

As complicações crônicas da doença, entretanto, podem preceder o aparecimento do

DM, e surgirem ainda na fase de pré-diabetes (glicemia de jejum alterada ou tolerância à

glicose diminuída), o que torna a situação ainda mais séria (Franklin et al., 1990; DECODE,

1999; Tominaga et al., 1999; Shaw et al.,2000; Meigs et al., 2002; Singleton et al.,2003;

24

Bartnik et al., 2004;). Nesse contexto, 318 milhões de adultos no mundo com tolerância à

glicose diminuída, além de apresentarem um alto risco de desenvolverem DM2, também

possuem um risco aumentado de sofrerem as complicações crônicas da doença (Internacional

Diabetes Federation –IDF, 2015).

2.2 COMPLICAÇÕES CRÔNICAS DO DM2

As complicações crônicas do DM2 são divididas em complicações micro e

macrovasculares. As complicações microvasculares correspondem à retinopatia, nefropatia e

neuropatia, e as macrovasculares incluem as doenças cardiovascular, cerebrovascular e

arterial periférica.

2.2.1 Nefropatia Diabética

A nefropatia diabética (ND) acomete cerca de 30% a 40% dos indivíduos com

diabetes e é a principal causa de insuficiência renal terminal (National Kidney Foundation,

KDOQI, 2012; de Boer et al., 2011; Collins et al., 2012; Gallagher et al., 2016). Entre os

pacientes com DM, os portadores de doença renal do diabetes constituem um subgrupo de

maior risco cardiovascular (Valmadrid et al., 2000; Newman et al., 2005; Perkovic et al.,

2008; Matsushita et al., 2010; Bello et al., 2011; Viana et al., 2012; Afkarian et al., 2013).

A ND deve ser rastreada anualmente, sendo iniciada esta rotina logo após o

reconhecimento do diagnóstico do DM2 (American Diabetes Association - ADA, 2016). A

atual classificação da ND em estágios leva em consideração a taxa de filtração glomerular

(TFG), a partir da creatinina sérica, e a excreção urinária de albumina (EUA) [American

Diabetes Association - ADA, 2016].

Atualmente, por ser mais acurada, a fórmula recomendada para cálculo da TFG é a

CKD-EPI, a qual leva em consideração, além da concentração da creatinina, gênero, etnia e

idade (Levey et al., 2009; KDIGO, 2012). Nos pacientes sem dano renal (com EUA normal)

será considerado doença renal crônica naqueles com TFG abaixo de 60 mL/min/1,73m²

(KDIGO, 2012).

A avaliação de rotina da EUA pode ser feita pela concentração de albumina (Cal) ou

relação albumina/creatinina (RAC) em amostra isolada de urina (Newman et al., 2000; Incerti

25

et al., 2005; Miller et al., 2009; KDIGO, 2012; American Diabetes Association - ADA, 2016).

Conforme o resultado, a EUA pode ser classificada em três estágios de albuminúria: normal

(Cal < 17 mg/L ou RAC < 30 mg/g), alta (Cal 17-173 mg/L ou RAC 30-300 mg/g) e muito

alta (Cal ≥ 174 mg/L ou RAC > 300 mg/g). Esses estágios correspondem, respectivamente, a

normoalbuminúria, microalbuminúria e macroalbuminúria, na nomenclatura antiga (KDIGO,

2012). Todo teste de albuminúria anormal deve ser confirmado em duas de três amostras

coletadas dentro de um período de três a seis meses, devido à possibilidade de variabilidade

diária da EUA. (American Diabetes Association - ADA, 2016). A elevação da EUA

representa um importante fator de risco para a progressão da ND (Newman et al., 2005; Viana

et al., 2012), entretanto esta evolução não é regra, podendo ocorrer regressão da

microalbuminúria em aproximadamente 30% dos pacientes, comumente associada à

intervenção terapêutica (Perkins et al., 2003).

A EUA e TFG são preditores independentes de doença cardiovascular e de

mortalidade nos pacientes DM2 (Ninomiya et al., 2009; Drury et al., 2011). Sendo assim, os

dois parâmetros devem ser sempre avaliados, pois parte dos indivíduos com DM pode

apresentar somente aumento da EUA com TFG preservada e, por outro lado, em torno de 25%

dos pacientes podem apresentar apenas TFG reduzida com EAU normal (KDIGO, 2012).

2.2.2 Retinopatia Diabética

A retinopatia diabética (RD) é a principal causa de cegueira em pessoas com idade

entre 20 e 74 anos (Singh et al., 2008; Ali ey al., 2009; Thomas et al., 2012). Os pacientes

com DM apresentam um risco 25 vezes maior que a população geral de ficar cegos (Esteves

et al., 2008), sendo a forma proliferativa da doença, frequentemente, a mais associada à perda

visual grave. Estima-se que 50% dos pacientes com RD proliferativa não tratada evoluem em

cinco anos para cegueira (Beetham, 1963; Deckert et al., 1967; Caird et al., 1968).

Os dois principais fatores de risco para o desenvolvimento ou progressão da RD são a

duração do diabetes e o mau controle glicêmico (Aiello et al., 1998; Frank, 2015). Além

disso, a RD e ND são complicações microvasculares que quase sempre coexistem. A RD e o

edema macular são três vezes mais frequentes na presença de proteinúria e, da mesma forma,

a presença de RD grave é preditora de proteinúria concomitante (Aiello et al., 1998; Singh et

al., 2008; Frank, 2015) Em pacientes com DM2, a presença de microalbuminúria aumenta

mais de três vezes a chance de existência de RD (Boelter et al., 2006).

26

Clinicamente é diagnosticada a partir de sinais oftalmoscópicos característicos, como

microaneurismas, hemorragias e manchas algodonosas (Antonetti et al., 2006), sendo

classificada em não proliferativa (leve, moderada ou grave) ou proliferativa, podendo ou não

estar associada a edema macular diabético (Wilkinson et al., 2003)

O rastreamento da RD, no paciente DM2, deve ser feito através de avaliação

oftalmológica na ocasião do diagnóstico do DM, visto que em torno de 35% das mulheres e

38% dos homens com DM2 apresentam algum grau de RD à época do diagnóstico (Kohner et

al., 1998). O acompanhamento deve ser anual, podendo ser menor, dependendo do grau de

retinopatia ou maculopatia encontrada (Morales et al., 2010)

2.2.3 Neuropatia diabética

A neuropatia diabética é definida como um dano neurológico em pacientes com DM,

após a exclusão de outras causas (Greene et al., 1990; Boulton et al., 1998; Boulton et al.,

2004; Boulton et al., 2005; England et al., 2005; Boulton et al., 2007; Tracy et al., 2008;

American Diabetes Association - ADA, 2016). Caracteriza-se pela desmielinização segmentar

e degeneração axonal dos neurônios periféricos, acompanhadas de anormalidades funcionais,

como a redução da condução nervosa e do fluxo sanguíneo (Guven et al., 2004). Afeta cerca

de 30 a 50% dos pacientes DM2 (Boulton et al., 2004; Callaghan et al., 2012; Martin et al.,

2014), entretanto é difícil estabelecer ao certo a prevalência deste distúrbio devido à

diversidade das suas manifestações (Guven et al., 2004).

As duas principais formas de apresentação da neuropatia diabética são a

polineuropatia sensitivo-motora simétrica distal, correspondendo a 80% dos casos (Jack et al.,

2012), e a neuropatia autonômica (que pode ser por comprometimento cardiovascular,

respiratório, digestivo, geniturinário e/ou por disfunção sexual). As demais formas incluem a

mononeuropatia focal, neuropatia multifocal e radiculopatia/plexopatia (Vinik et al., 2003;

Guven et al., 2004; Brownlee et al., 2011; Callaghan et al., 2012).

A polineuropatia periférica está relacionada a um importante impacto na qualidade de

vida do paciente, seja devido à dor crônica, comprometimento do sono ou risco de amputação

das extremidades (Vinik et al., 2013). Cerca de 15% desses pacientes desenvolvem úlceras

nos pés, a principal causa de amputação não traumática de membros inferiores (Callaghan et

al., 2012; Barshes et al., 2013), como consequência da própria neuropatia e também do

comprometimento da cicatrização de feridas no indivíduo diabético (Guven et al., 2004).

27

Logo, todos os DM2 devem ser avaliados no momento do diagnóstico, com

reavaliações anuais ou mais freqüentes, se necessário (Boulton et al., 2004; Tesfaye et al.,

2010; Callaghan et al., 2012; Vinik et al., 2013; American Diabetes Association - ADA,

2016). Essa avaliação neurológica deve incluir o teste do monofilamento (para testar a

sensibilidade tátil protopática), avaliação da sensibilidade vibratória e dolorosa, temperatura,

reflexo aquileu e força dos membros inferiores (Bickley, 2001; Boulton et al., 2008).

Aproximadamente 50% dos pacientes com neuropatia periférica são assintomáticos, e por isso

a busca ativa deve ser sempre realizada. Os pés devem ser examinados em todas as consultas,

além de orientação quanto ao uso de calçados adequados, cuidados e auto-exame dos pés, e

medidas para prevenir as úlceras quando já instalada a neuropatia (Vinik et al., 2013;

American Diabetes Association - ADA, 2016).

2.2.4 Complicações macrovasculares

As complicações macrovasculares do paciente diabético correspondem à própria

doença aterosclerótica que acomete a população não diabética. Em diabéticos, entretanto é

mais frequente, surge mais precocemente e é mais grave (Kannel et al., 1979; Stratton et al.,

2000; Deedwania et al., 2005). O DM é considerado um fator de risco independente e

importante para doença arterial coronariana, acidente vascular cerebral e doença arterial

periférica (Schwartz et al., 1992; Stamler et al., 1993). A doença cardiovascular representa a

principal causa de morte e morbidade entre os pacientes diabéticos (Leon et al., 2015). O

estudo de Framingham mostrou que a incidência de doença cardiovascular entre os homens e

as mulheres diabéticas foi duas e três vezes maior do que entre os homens e mulheres não

diabéticos, respectivamente (Kannel et al., 1979). Adultos com diabetes apresentam taxas de

mortalidade por doença cardíaca e cerebrovascular de duas a quatro vezes maiores do que

aqueles sem diabetes. (Matheus et al., 2013; Centers for Disease Control and Prevention,

2011).

A prevenção da doença macrovascular no DM está associada ao tratamento e controle

adequados da doença, assim como dos outros fatores de risco frequentemente associados ao

diabetes, como: hipertensão, dislipidemia, obesidade, sedentarismo e tabagismo (Stettler et

al., 2006; Gerstein et al., 2008; Gaede et al., 2008).

28

2.2.5 Fisiopatologia das complicações crônicas do DM2

Vários mecanismos fisiopatológicos foram implicados na gênese das complicações

crônicas do DM2, dentre os quais destacam-se os seguintes:

a) Aumento do fluxo da via do poliol;

b) Ativação da proteína quinase C (PKC);

c) Aumento do fluxo da via da hexosamina;

d) Aumento da formação dos produtos finais da glicação avançada (AGE, advanced

glycation endproducts);

e) Aumento do estresse oxidativo (Brownlee, 2001; Oliveira et al., 2013).

A hiperglicemia tem um papel central na ativação desses mecanismos. O aumento do

metabolismo intracelular da glicose, secundário a hiperglicemia, aumenta a formação de

superóxido pela cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, uma espécie reativa de

oxigênio (ERO) (Du et al., 2000; Nishikawa et al., 2000). Nessas condições, há um

desbalanço entre a produção acentuada de radicais livres e a defesa antioxidante (que se

encontra diminuída), caracterizando o aumento do estresse oxidativo (Wajchenberg, 2002). O

superóxido inibe parcialmente enzima glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

(GAPDH) acumulando, a montante, intermediários glicolíticos. Estes são então desviados

para as vias metabólicas supracitadas (Brownlee, 2001), figura 1. A ativação dessas vias gera

um aumento da produção de substâncias que lesam o endotélio (como citocinas pró-

inflamatórias, mediadores vasoconstrictores, pró-coagulantes e pró-mitogênicos e mais

EROs). Além disso, observa-se redução de fatores protetores endógenos (como as enzimas

antioxidantes, óxido nítrico e prostaciclina), resultando em disfunção endotelial e, por

conseguinte, nas complicações vasculares do DM2 (Bucala et al., 1991; De Caterina et al.,

1995; Brownlee, 2001; Wajchenberg, 2002; Oliveira et al., 2013; Goldin et al., 2006), figura

2.

Entre os mecanismos patogênicos descritos, a formação de produtos finais de glicação

avançada e sua interação com o seu receptor (RAGE), parecem ter uma participação muito

importante no desenvolvimento das complicações crônicas do DM (Robertson, 2004), figura

2.

29

Figura 1: Vias metabólicas ativadas em consequência da hiperglicemia.

NADP⁺: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada); NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato

(forma reduzida); NAD⁺: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada); NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo

(forma reduzida); Gln: glicosamina; Glu: glicose; UDP- GLc NAc: Uridina 5'-difosfato-N-acetilglicosamina; DHAP:

dihidroxiacetona fosfato; DAG: diacilglicerol; PKC: proteína quinase C; GAPDH: enzima glicolítica gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase ; O2⁻: radical superóxido (espécie reativa do oxigênio); AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced

glycation end products).

Adaptado de Brownlee, 2001.

30

Figura 2: Mecanismos do dano induzido pela hiperglicemia.

GSH: glutationa reduzida (molécula antioxidante); NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma

reduzida); UDP- GLc NAc: Uridina 5'-difosfato-N-acetilglicosamina; DAG: diacilglicerol; PKC: proteína quinase C;

EROs: espécies reativas de oxigênio; AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end

products).

O aumento do estresse oxidativo (pelo aumento de EROs e diminuição de enzimas

antioxidantes) participa tanto, na fase inicial, da ativação das outras quatro vias metabólicas,

quanto como consequência da ativação dessas vias (Brownlee, 2001).

Dentre as células da microvasculatura, as células endoteliais dos capilares da retina, as

células mesangiais do glomérulo renal, os neurônios e as células de Schwann são

especialmente afetadas pela hiperglicemia, devido à incapacidade desses tipos celulares

regularem o transporte de glicose para o meio interno, ficando susceptíveis às altas

concentrações de glicose durante os estados hiperglicêmicos (Brownlee, 2001; Brownlee,

2005). Assim, o endotélio dos leitos microvasculares e as células associadas são

progressivamente danificados pela hiperglicemia, resultando (dentre outras alterações) em

oclusão capilar, isquemia e falência de órgãos (Vlassara et al., 2003; Basta et al., 2004).

Além da hiperglicemia, a hiperinsulinemia compensatória à resistência insulínica,

ainda na fase inicial da doença, também parece contribuir para a disfunção endotelial. A

insulina estimula a produção de lipídios, proliferação de células musculares lisas, síntese de

colágeno e vários fatores de crescimento, sendo considerada um fator de risco independente

31

de aterosclerose. Por outro lado, a insulina estimula a produção de óxido nítrico (NO), um

potente vasodilatador e inibidor da adesão plaquetária. Apesar disso, a biodisponibilidade

reduzida do NO, secundária à sua reação com os ânions superóxidos aumentados e

consequente produção de peroxinitrito, estaria relacionada à piora evolutiva da resistência

insulínica e dano endotelial nas fases iniciais da doença, o que poderia explicar a presença de

complicações diabéticas em indivíduos pré-diabéticos (Wajchenberg, 2002).

2.3 PRODUTOS FINAIS DA GLICAÇÃO AVANÇADA (Advanced glycation end products

- AGEs)

2.3.1 Bioquímica dos AGEs

Os AGE são o resultado das reações de glicação não-enzimática e glicoxidação de

proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (Oliveira et al., 2013).

O clássico consiste na glicação, também chamada reação de Maillard, na qual um

grupamento carbonila de um açúcar redutor, como a glicose, reage, de forma não enzimática,

com um grupamento amina de proteínas extracelulares, formando um composto instável

denominado base de Schiff. Esta base sofre rearranjos moleculares tornando-se um composto

mais estável, o produto de Amadori, também conhecido como early Maillard reaction

products (early MRPs) ou produtos iniciais da reação de Maillard, sendo a hemoglobina

glicada um exemplo (Bierhaus et al., 1998; Monnier, 2003; Bos et al., 2011). Os produtos de

Amadori produzidos possuem grupos carbonilas reativos, os quais se condensam com grupos

aminas primários acessíveis, originando os produtos finais da glicação avançada (AGEs),

também conhecidos como produtos avançados da reação de Maillard (Bierhaus et al., 1998;

Monnier, 2003; Bos et al., 2011).

A formação dos AGEs se dá também por vias alternativas, através da glicoxidação, a

partir de precursores dicarbonílicos altamente reativos, oriundos da glicose no meio

intracelular, como o glioxal (GO), metilglioxal (MG) e 3-deoxiglicosona (3-DG). O GO é

produzido pela auto-oxidação da glicose. O MG é gerado pela glicólise, a partir da

fragmentação do gliceraldeído-3-fosfato (GAP) e da dihidroxiacetona fosfato (DHAP),

intermediários glicolíticos acumulados. Já a 3-DG é formada a partir da decomposição dos

produtos de Amadori. Estes compostos dicarbonílicos altamentente reativos (GO, MG e 3-

DG) reagem com grupos aminas de proteínas intra e extracelulares, produzindo os AGEs

32

(Thornalley, 1990; Wells-Knecht et al., 1995; Huebschmann et al., 2006; Bos et al., 2011). Os

compostos dicarbonílicos chegam a ser 20 mil vezes mais reativos do que a glicose e são os

principais intermediários da formação dos AGEs (Meade et al., 2003), corroborando a idéia

de que a hiperglicemia intracelular é o evento iniciador primário da síntese de AGEs, tanto

intra quanto extracelulares. (Degenhardt et al., 1998; Brownlee, 2001; Brownlee, 2005),

figura 3.

Essas vias alternativas também são chamadas de vias do “estresse carbonílico” e da

mesma forma que ocorre a oxidação dos açúcares (glicoxidação) para formação de AGEs

pode acontecer também a oxidação dos lipídeos ou lipoxidação, com formação de ALEs

(produtos finais da lipoxidação avançada - advanced lipoxidation end products), substâncias

semelhantes aos AGEs (Barbosa et al., 2008).

Figura 3: Formação dos AGEs.

AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end products).

Adaptado de Oliveira et al., 2013.

As interações amino-carbonila que geram AGEs geralmente envolvem os grupamentos

aminas dos aminoácidos lisina e arginina, pois são especialmente suscetíveis à reação. Os

AGEs derivados da lisina são: carboxietilisina (CEL), pirralina, dímero de glioxal-lisina

33

(GOLD), dímero de metilglioxal-lisina (MOLD), dímero de 3-deoxiglicosona-lisina (DOLD)

e carboximetilisina (CML), sendo este último o AGE que apresenta maior concentração sérica

nos humanos. Os AGEs derivados da arginina são: hidroimidazolona derivada de glioxal (G-

H1), hidroimidazolona derivada de metilglioxal (MG-H1) e hidroimidazolona derivada de 3-

deoxiglicosona (3DG-H1). Alguns AGEs podem resultar da condensação cruzada entre lisina-

arginina, como por exemplo a pentosidina. Outros AGEs representativos são o 1-alquil-2-

formil-3,4-diglicosil pirrol (AFGP) e 2-(2- fluoril)-4,5-furanil-1-H-imidazol (FFI) (Schleicher

et al., 2001; Ahmed N. et al, 2002; Dettoraki et al., 2009; Miyazawa et al., 2012).

2.3.2 Metabolismo dos AGEs

A principal fonte de formação de AGEs é endógena (Leslie et al., 2003), ocorrendo

lentamente em condições fisiológicas (Forbes et al., 2005). Entretanto, em condições de

hiperglicemia, há aceleração da produção de AGEs (Lapolla et al., 2005; Jay et al., 2006), o

que explica as concentrações séricas significativamente mais elevadas nos indivíduos

diabéticos do que nos não diabéticos (Sharp et al., 2003).

Além da formação endógena, os AGEs podem ser introduzidos no organismo por

fontes externas, como o fumo e, principalmente, a dieta (Leslie et al., 2003; Vlassara, 2005;

Barbosa et al., 2016). Aproximadamante 10% dos AGEs ingeridos pela dieta são absorvidos

e, destes, dois terços ficam retidos no organismo e apenas um terço é eliminado dentro de 48

horas (Sharp et al., 2003). Diversos estudos demonstraram que os alimentos ricos em lipídeos

e proteínas são as principais fontes dietéticas de AGEs (Goldberg et al., 2004; Uribarri et al.,

2005; Goldin et al., 2006; Uribarri, 2010), entretanto, o estudo realizado por Assar et al

encontrou maiores teores de AGEs nos alimentos ricos em carboidratos (Assar et al., 2009).

Além disso, a taxa de formação dos AGEs é influenciada pelo tipo de processamento dos

alimentos, dependendo da temperatura, umidade, tempo e pH, por exemplo (Goldberg et al.,

2004; Henle, 2005; Barbosa et al., 2016). Dessa forma, a formação dos AGEs é potencializada

por métodos de preparo que utilizam altas temperaturas e baixa umidade (fritar, assar ou

grelhar), enquanto tempo reduzido, baixas temperaturas, alta umidade e exposição ao meio

ácido previamente ao processamento associam-se a menores quantidades de AGEs (cocção

com calor úmido, como cozinhar a vapor, escalfar, fever ou escaldar; marinar com soluções

ácidas, como limão ou vinagre) (Goldberg et al., 2004; Uribarri et al., 2010). Considerando-se

o escurecimento como fator de avaliação da reação de Maillard, verificou-se que 4 semanas a

34

20 ºC, 3 horas a 100 ºC e 5 minutos a 150 ºC conferem o mesmo resultado aos alimentos,

evidenciando-se a importância das condições de processamento nesse contexto (Ledl et al.,

1990).

O organismo, por outro lado, possui mecanismos de defesa para contrabalancear o

acúmulo de AGEs secundário à produção endógena e absorção exógena. Estes mecanismos

incluem, por exemplo, sistemas enzimáticos e células depuradoras (scavenger) e sua

eficiência também depende da depuração (clearance) renal (Bierhaus et al., 1998; Thornalley,

2003; Nakamura et al., 2003). Dentre os sistemas enzimáticos, a oxaldeído redutase e a aldose

redutase são responsáveis pela detoxificação de intermediários dicarbonílicos reativos

(Thornalley, 2003). Os complexos enzimáticos glioxilase I e II, a frutosamina-3-cinase e a

frutosamina oxidase (amadoriase) são responsáveis pela interrupção das reações de glicação

em diferentes estágios (Vlassara et al., 2003). Por fim, a lisozima é uma enzima responsável

por auxiliar na remoção de AGEs. Já as células scavenger, como os macrófagos, endocitam

AGEs, os degradam intracelularmente e, em seguida, liberam na circulação AGE-peptídeos

solúveis e de baixo peso molecular, também denominados “segunda geração de AGEs”, os

quais são excretados pela urina (Bierhaus et al., 1998). Assim, a efetiva remoção de AGES

depende da adequada depuração renal, sendo a disfunção renal presente em indivíduos

nefropatas um importante fator de contribuição para as altas concentrações de AGEs nesses

pacientes (Nakamura et al., 2003).

O reservatório (pool) endógeno de AGEs é, assim, o resultado do balanço entre a

formação endógena e a absorção exógena de AGEs, de um lado, e a degradação e a

eliminação de AGEs pelos mecanismos de defesa, de outro (Jakus et al., 2004). Diante de

situações de excesso de AGEs, como no diabetes, hiperlipidemia, insuficiência renal e

consumo de dietas com grande quantidade de AGEs, os sistemas de defesa não são suficientes

para contrabalancear a produção/absorção, pendendo a balança para o lado de acúmulo desses

compostos (Vlassara et al., 2003).

Além disso, o metabolismo dos AGEs também pode sofrer influência de fatores

genéticos, justificando a predisposição dos indivíduos para as doenças relacionadas aos

AGEs, como diabetes, aterosclerose, artrite, osteoporose e doença de Alzheimer (Leslie et al.,

2003; Takeuchi et al., 2004).

35

2.3.3 Mecanismos de ação dos AGEs

Os AGEs danificam as células através de três mecanismos básicos, conforme a seguir:

a) Modificam várias proteínas intracelulares, alterando, assim, suas funções, e com

isso comprometendo várias propriedades celulares importantes para a homeostase

vascular (Bierhaus et al., 1998; Brownlee, 2001; Brownlee, 2005). As principais

proteínas intracelulares modificadas por AGEs são: o fator de crescimento

fibroblástico básico, com consequente redução em 70% da atividade mitogênica do

citosol das células endoteliais; as proteínas envolvidas no processo de endocitose

de macromoléculas; e as proteínas, bem como os nucleotídeos, envolvidos na

transcrição gênica (Giardino et al., 1994; Shinohara et al., 1998; Brownlee, 2001;

Brownlee, 2005; Goldin et al., 2006);

b) Modificam os componentes da matriz extracelular (proteínas), alterando suas

propriedades estruturais e funcionais, os quais passam a interagir anormalmente

com outros componentes da matriz e com os receptores celulares para as proteínas

da matriz, conhecidos como integrinas (Bierhaus et al., 1998; Brownlee, 2001;

Brownlee, 2005). As modificações causadas pelos AGEs no colágeno tipo 1

induzem ligações cruzadas entre suas moléculas, reduzindo a elasticidade dos

vasos, com consequente aumento da rigidez da vasculatura (Tanaka et al., 1988;

Huijberts et al., 1993; Brownlee, 2005; Goldin et al., 2006). A formação de AGEs

no colágeno tipo IV da membrana basal inibe a ligação lateral entre essas

moléculas, prejudicando a formação de uma estrutura semelhante a uma rede que

normalmente ocorre (Tsilbary et al., 1988). Já a formação de AGEs na laminina

diminui a sua auto-montagem, reduzindo a sua interação com o colágeno tipo IV e

com as proteoglicanas de heparan sulfato (Charonis et al., 1990; Brownlee, 2005;

Goldin et al., 2006). Em relação à interferência dos AGEs na interação matriz-

célula, eles modificam, por exemplo, os domínios de ligação celular do colágeno

tipo IV, diminuindo, assim, a adesão das células endoteliais (Haitoglou et al.,

1992; Brownlee, 2001). Além disso, os AGEs ligados à matriz vascular podem

interferir quimicamente com a biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), um

importante regulador do tônus vascular, prejudicando, dessa forma, a vasodilatação

36

endotélio-dependente (Bucala et al., 1991; De Caterina et al., 1995; Wajchenberg

et al., 2002).

c) Os AGEs formados a partir de proteínas plasmáticas se ligam a receptores

específicos, chamados de RAGE, presentes na superfície de diversos tipos de

células, levando à produção de citocinas inflamatórias, fatores de crescimento e

moléculas pró-coagulantes, dentre outras substâncias, que contribuem para a

patologia vascular do DM (Doi et al., 1992; Bierhaus et al., 1998; Brownlee, 2001;

Brownlee, 2005).

Dentre os mecanismos pelo quais os AGEs contribuem para o desenvolvimento e

progressão das complicações vasculares do DM, este último (a interação AGE-RAGE)

merece destaque (Barbosa et al., 2008).

2.4 RECEPTORES PARA OS PRODUTOS FINAIS DA GLICAÇÃO AVANÇADA

2.4.1 RAGE

O RAGE é um receptor de superfície celular. Corresponde a uma proteína

transmembrana tipo 1, de 404 aminoácidos e aproximadamente 55kDa, membro da

superfamília dos receptores de superfície celular tipo imunoglobulinas, que tem diversos

ligantes além dos AGEs, como a família S100/calgranulina de mediadores pro-inflamatórios

citocina-símiles, o grupo de alta mobilidade B1 (HMGB1/anfoterina, uma proteína pró-

inflamatória) e as fibrilas amilóides (Stern et al., 2002; Yonekura et al., 2003; Chuah et al.,

2013). Possui três domínios: um extracelular, um transmembrana hidrofóbico e uma cauda

intracelular citoplasmática altamente carregada (Kalea et al., 2009; Schmidt et al., 2001). O

domínio extracelular é formado por um peptídeo sinalizador N-terminal e três domínios do

tipo imunoglobulina, sendo um do tipo V (variável) e dois do tipo C (constantes) [Kislinger et

al., 1999]. O domínio V é o principal domínio de interação com os ligantes, apresentando dois

supostos locais de ligação para os AGEs (Kislinger et al., 1999). O domínio citoplasmático,

por sua vez, é fundamental para a sinalização intracelular induzida pelo ligante e deleções

deste domínio resultam em receptores RAGE no estado negativo, ou seja, bloqueiam a

indução da sinalização intracelular e, por conseguinte, a eficácia do receptor (Kislinger et al.,

1999), figura 4.

37

Figura 4: Estrutura do RAGE.

Adaptado de Oliveira et al., 2013.

O RAGE é expresso numa grande variedade de tipos celulares, incluindo as células

alvos das complicações diabéticas, tais como as células endoteliais, células musculares lisas

vasculares, podócitos e células mesangiais glomerulares, células neuronais e fagócitos

mononucleares (macrófagos), e também em outros tipos celulares, como hepatócitos,

linfócitos e células do tecido pulmonar (Hori et al., 1995; Ritthaler et al., 1995; Miyata et al.,

1996; Yan et al., 1996; Lindsey et al., 2009). Em condições fisiológicas, o RAGE é

minimamente expresso nos tecidos e na vasculatura. Entretanto, sob condições de excesso de

AGEs, a sua expressão está aumentada, visto que é auto-regulada pela interação do RAGE

com seus ligantes através de um mecanismo ativado pelo redox intracelular , caracterizando,

assim, um feedback positivo (Goldin et al., 2006; Lin, 2006; Ceriello et al., 2009). Dessa

forma, expressão do RAGE na superfície das células está marcadamente mais elevada em

patologias associadas ao acúmulo de AGEs e aumento da ativação do estresse celular, como

ocorre no diabetes, doença de Alzheimer, doenças cardiovasculares, aterosclerose, tumores e

inflamação (Lindsey et al., 2009; Ceriello et al., 2009).

A interação RAGE-AGE gera transdução de sinal através da ativação de várias

cascatas de sinalização intracelulares. Assim, o RAGE pode mediar a ativação da NADPH

oxidase, com indução do estresse oxidativo (Schmidt et al., 2000), e o recrutamento de

diversas vias efetoras intracelulares, incluindo PI3K/AKT (fosfatidilinositol-3-quinase/serina-

treonina quinase), JAK/STAT (janus quinase/transdutor de sinal e ativador de transcrição) e

proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) via RAS, tais como a ERK1 e 2 (quinases

reguladas por sinal extracelular), e via GTPases da família Rho (Cdc42 e Rac), tais como p38

e JNK (quinase c-Jun N-terminal) [Lander et al., 1997; Kislinger et al., 1999; Hofmann et al.,

38

1999; Huttunen et al., 1999; Taguchi et al., 2000; Huang et al., 2001; Yeh et al., 2001;

Bierhaus et al., 2005; Tan et al., 2006; Goldin et al., 2006; Zeng et al., 2009; Bierhaus et al.,

2009; Barlovic et al., 2010; Ramasamy et al., 2011; Fleming et al., 2011; Riehl et al., 2011;

Hegab et al., 2012; Chuah et al., 2013]. Muitas dessas vias culminam com a ativação do fator

de transcrição nuclear NF kappaB (Bierhaus et al., 2001; Yan et al., 1994; Lander et al.,

1997), com subsequente estímulo dos seus genes alvos, resultando em aumento da expressão

de citocinas (IL-1, IL6, TNF-α, fator estimulador de colônias de macrófagos, fator

estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos) , fatores de crescimento (VEGF, IGF-I,

fator de crescimento derivado de plaquetas), mediadores vasoconstrictores (endotelina-1),

moléculas pró-inflamatórias (moléculas de adesão celular VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina),

moléculas pró-coagulantes (fator tecidual) e metaloproteinases, além do próprio RAGE

(Vlassara et al., 1988; Skolnik et al., 1991; Kirstein et al., 1992; Doi et al., 1992; Abordo et

al., 1996; Schmidt et al., 1995; Lu et al., 1998; Goldin et al., 2006; Barbosa et al, 2008),

figura 5. Essa exacerbação da resposta inflamatória resulta em mudanças fenotípicas das

células afetadas, disfunção endotelial e, consequentemente, no desenvolvimento das

complicações vasculares do DM (Doi et al., 1992; Bierhaus et al.,1998; Brownlee, 2001;

Brownlee, 2005; Harja et al., 2008). Acredita-se que a superexpressão do RAGE secundária

ao feedback positivo que acontece na interação RAGE-AGE gere um ciclo vicioso, que pode

explicar a perpetuação das complicações diabéticas mesmo após alcançado um bom controle

glicêmico; fenômeno conhecido como memória metabólica (Yamagishi et al., 2012), figura 5.

O gene do RAGE está localizado no cromossoma 6p21.3, no complexo principal de

histocompatibilidade, entre os genes para classes II e III (Sugaya et al., 1994). Existem mais

de 50 variantes genéticas descritas para o gene RAGE (Hancock et al., 2010; Kalousová et al.,

2010; Lu et al., 2010), com evidências, em alguns estudos, de associação entre polimorfismos

do RAGE e algumas patologias, como tumor de mama (Tesarová et al., 2007), tumor do

pâncreas (Krechler et al., 2010), de tumor gástrico (Gu et al., 2008), esclerose múltipla (Li et

al., 2011), complicações diabéticas (Kalousová et al., 2010) e função pulmonar (Hancock et

al., 2010). O gene RAGE pode, ainda, sofrer processamento (splicing) alternativo gerando

diversas variantes, descritas a seguir (Hudson et al., 2008).

39

Figura 5: Interação AGE-RAGE e ativação dos mecanismos intracelulares relacionados ao

desenvolvimento das complicações crônicas do DM2.

AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end products); RAGE: receptor para os AGEs; NADPH

oxidase: enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatooxidase; EROs: espécies reativas de oxigênio; PI3K:

fosfatidilinositol-3-quinase; AKT: serina-treonina quinase; JAK: janus quinase; STAT 3: transdutor de sinal e ativador de

transcrição 3; RAS: proteína oncogênica do vírus de sarcoma de rato (rats sarcome); ERK1 e 2: quinases reguladas por

sinal extracelular; Cdc42 (ciclo de divisão celular 42) e Rac (substrato C3 de toxina botulínica relacionada ao RAS):

proteínas da família Rho de GTPases (guanosinas trifosfatases) ; p38: proteína quinase ativada por mitógeno p38; JNK:

quinase c-Jun N-terminal; AP-1: proteína ativadora 1 (fator de transcrição); NF-kβ: factor nuclear kappa B ; E-selectina;

selectina endotelial; ICAM: molécula de adesão intercelular 1, VCAM: molécula de adesão celular-vascular 1; IL-1:

interleucina 1 ; IL-6: interleucina 6; TNFα: fator de necrose tumoral alfa.

Adaptado de Riehl et al., 2009; Hegab et al., 2012.

2.4.2 sRAGE

Além do RAGE expresso nas membranas celulares, também conhecido como RAGE

completo, diversas variantes do RAGE foram descritas, dentre elas algumas secretadas na

forma solúvel (Hudson et al., 2008). A formação de variantes solúveis é um fenômeno

comum entre os receptores de membrana, podendo, estas variantes, atuarem como

reguladores, agonistas ou antagonistas da forma funcional acoplada à membrana (Schlueter et

al., 2003; Hudson et al., 2008).

40

O primeiro processo de formação de isoformas solúveis do RAGE é através do

processamento (splicing) alternativo do intron 9, com a remoção do exon 10 do gene RAGE,

que codifica a hélice transmembrana e cauda citosólica do RAGE completo (Yonekura et al.,

2003; Oliveira et al., 2013). Esta variante é denominada esRAGE (RAGE secretor endógeno

ou endogenous secretory RAGE), possui aproximadamente 48 kDa, e consiste na porção

extracelular do RAGE (Yonekura et al., 2003).

O outro mecanismo capaz de gerar formas solúveis do RAGE é a clivagem proteolítica

da porção extracelular do RAGE tecidual pelas proteases MMP-9 (metaloproteinase da matriz

extracelular-9) e ADAM 10 (alfa secretase membro da família ADAM – proteínas que contém

domínio desentegrina e metaloproteinase). Este processo gera o cRAGE (RAGE clivado ou

cleaved RAGE) (Raucci et al., 2008; Zhang et al., 2008), a isoforma solúvel predominante

no soro humano (Hudson et al., 2008; Raucci et al., 2008).

A este pool de RAGE solúveis (esRAGE + cRAGE) denominamos sRAGE (RAGE

solúvel ou soluble RAGE) (Hudson et al., 2008), figura 6.

Figura 6: Variantes do RAGE e formação do pool de RAGE solúveis (sRAGE).

AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end products); RAGE: receptor para os AGEs; esRAGE:

RAGE secretor endógeno (endogenous secretory RAGE); cRAGE: RAGE clivado (cleaved RAGE); sRAGE: RAGE solúvel

(soluble RAGE).

Adaptado de Oliveira et al., 2013.

41

Os sRAGE possuem as mesmas regiões V e C encontradas no RAGE expresso nas

membranas celulares, mas não apresentam hélice transmembrana e cauda citosólica. Assim,

as formas solúveis do RAGE interagem com os mesmos ligantes do RAGE tecidual,

entretanto não ocorre transdução de sinal após a sua ligação. Os AGE ficam assim impedidos

de interagir com os RAGE teciduais e, dessa maneira, de ativar as vias efetoras intracelulares

que causam os danos nas células, de modo que os sRAGE são fatores protetores para o

organismo (Raucci et al., 2008; Zhang et al., 2008; Hudson et al., 2008; Bierhaus et al.,

2009), figura 7.

Figura 7: Interação AGE-sRAGE e ausência de transdução do sinal intracelular.

AGEs: produtos finais da glicação avançada (advanced glycation end products); RAGE: receptor para os AGEs; sRAGE:

RAGE solúvel (soluble RAGE); NADPH oxidase: enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatooxidase; EROs: espécies

reativas de oxigênio; ERK1 e 2: quinases reguladas por sinal extracelular; MAP quinases: proteínas quinases ativadas por

mitógenos; p38: proteína quinase ativada por mitógeno p38; PI3K: fosfatidilinositol-3-quinase; AKT: serina-treonina quinase;

NF-kβ: factor nuclear kappa B ; VEGF: fator de crescimento endotelial vascular.

Adaptado de Kalea et al., 2009; Hegab et al., 2012.

42

Já foi demonstrado que sRAGE recombinante é capaz de prevenir ou mesmo reverter

complicações micro e macrovasculares do DM in vitro e em modelos animais (Park et al.,

1998; Bucciarelli et al., 2002b), assim como bloquear o desenvolvimento e progressão de

diversos outros estados patológicos, como o câncer, por exemplo (Lanati et al., 2010). Logo,

a identificação dos mecanismos envolvidos na produção e regulação da concentração das

formas solúveis do RAGE pode ser útil na inibição da sinalização intracelular pelos ligantes

do RAGE em vários estados patológicos, bem como contribuir para o desenvolvimento de

novas abordagens terapêuticas (Oliveira et al., 2013).

Ohe et al. demonstraram que elementos com ação cis ricos em guanina (G), presentes

no intron 9, participam da regulação do splicing alternativo do RAGE através da interação

com partículas de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas H (RNPhn H). Enquanto

mutações dessas regiões resultam no aumento drástico da produção do esRAGE e inibição da

produção do RAGE completo, a introdução artificial de trechos G causa uma importante

redução do esRAGE e aumento do RAGE completo (Ohe et al., 2010).

Santilli et al., por outro lado, afirmam que a ativação do RAGE através da ligação com

seus ligantes pode inibir a produção do esRAGE, como uma forma de auto-amplificar a

resposta patogênica sem nenhuma competição com outros receptores para os seus ligantes.

Além disso, eles ressaltam que um ambiente intracelular de aumento do estresse oxidativo

também estaria relacionado à redução da expressão do esRAGE, na medida em que o

mecanismo de splicing alternativo é altamente sensível ao equilíbrio redox (Santilli et al.,

2009). No entanto, é controverso se a regulação da formação dos RAGEs solúveis ocorre

desta maneira ou se o aumento da expressão do RAGE tecidual e, portanto, do dano celular,

estimularia a geração de formas solúveis do RAGE, considerando que o cRAGE pode ser

produzido por clivagem do RAGE da superfície celular e, assim, refletir a expressão do

RAGE tecidual (Nakamura et al., 2008).

A quantificação do sRAGE é feita através de métodos imunoenzimáticos. Existem

dois sistemas comerciais de ELISA. Um para avaliação das concentrações do sRAGE a partir

de um anticorpo monoclonal com capacidade de reconhecimento da porção N-terminal da

proteína, comum a todas as formas solúveis do RAGE, e outro específico para identificação

do esRAGE, através de anticorpos que se ligam a porção C-terminal. Ainda não estão

disponíveis ensaios específicos para o cRAGE (Brown et al., 2008).

Outras variantes do RAGE compreendem as isoformas teciduais: RAGE dominante no

estado negativo (DN-RAGE) e Delta-RAGE (ΔN-RAGE). Ambas consistem em proteínas de

43

membrana e, assim como as formas solúveis do RAGE, não possuem funcionalidade (não são

capazes de ativar as vias efetoras intracelulares que causam os danos nas células/tecidual). A

DN-RAGE interage com ligantes, mas não desencadeia a transdução do sinal devido à

ausência da cauda citosólica intracelular, enquanto a isoforma ΔN-RAGE fica impossibilitada

de interagir com os ligantes por falta do domínio V (Oliveira et al., 2013), figura 8.

Figura 8: Variantes do RAGE

RAGE: receptor para os AGEs; esRAGE: RAGE secretor endógeno (endogenous secretory RAGE); cRAGE: RAGE clivado (cleaved

RAGE); sRAGE: RAGE solúvel (soluble RAGE), ΔN-RAGE: delta RAGE; DN-RAGE: RAGE dominante no estado negativo.

Adaptado de Oliveira et al., 2013.

2.4.3 Outros receptores para os produtos finais de glicação avançada

Além do RAGE, foram identificados, em diferentes tipos de células, outros diversos

receptores de superfície celular com capacidade de ligação aos AGEs, como, por exemplo, o

complexo de receptores de AGEs (AGE-R1 ou OST-48, AGE-R2 ou 80K-H e AGE-R3 ou

galectina-3), os receptores depuradores (scavenger) de macrófagos classe A tipo I e II, os

receptores depuradores (scavenger) classe B (CD36 e classe B tipo I), os receptores

depuradores (scavenger) classe E, LOX-1 (lectin-like oxidized LDL receptor-1 ), fasciclina,

44

FEEL-1 e FEEL-2 (link domain-containing scavenger receptor-1 e 2 ), EGF-like (epidermal

growth factor-like) e LE (laminin-type epidermal growth factor-like) (Stitt et al., 1997; Chen

et al., 2001; Jono et al., 2002; Bucciarelli et al., 2002a; Tamura et al., 2003). Esses outros

receptores, diferentemente do RAGE, não demonstram qualquer atividade de transdução de

sinal intracelular após a interação com os AGEs. Eles, ao contrário, estão associados à

detoxificação e eliminação desses compostos da circulação. O CD36, entretanto, desempenha

um importante papel na indução do estresse oxidativo na célula (Nakajou et al., 2005;

Horiuchi et al., 2005).

2.5 AGE E COMPLICAÇÕES DO DM2

A participação dos AGEs na patogenia das micro e macroangiopatias diabéticas é fato

bem estabelecido na literatura (Vlassara et al., 2002). Acredita-se que a mensuração desses

produtos no soro ou nos tecidos dos pacientes diabéticos possa ser útil para avaliar o risco de

progressão da doença (Monnier et al., 2005). Entretanto, a efetiva contribuição de cada AGE

para as alterações celulares e teciduais observadas no diabetes ainda é incerta, dentre outros

motivos, devido às limitações dos diferentes ensaios utilizados para quantificar os AGEs

(Monnier et al., 2005). Os produtos de glicoxidação CML e pentosidina foram associados à

nefropatia e à retinopatia (Genuth et al., 2005), enquanto a neuropatia foi relacionada a quase

todos os marcadores avaliados, sugerindo que o nervo seja mais suscetível ao estresse

carbonílico total do que a vias específicas de formação de AGEs (Monnier et al., 2005).

O envolvimento dos AGEs no surgimento e progressão da retinopatia diabética é

considerável (Yu et al., 2001). Os AGEs podem ser detectados nos vasos sanguíneos de

retina, sendo responsáveis pelo aumento da permeabilidade das células endoteliais e oclusão

vascular (Franke et al., 2003), bem como contribuindo com a angiogênese e

neovascularização através da superprodução do fator de crescimento das células do endotélio

vascular (VEGF), a partir da sua interação com os seus receptores RAGE presentes nas

células endoteliais (Ahmed, 2005). Além disso, a interação AGE-RAGE nos pericitos

desencadeia reações celulares que causam a perda dos pericitos, um dos eventos

característicos da RD (Ahmed, 2005).

Sabe-se também que a membrana basal glomerular, as células mesangiais, os

podócitos e as células tubulares renais acumulam altos níveis de AGEs, os quais, através da

interação com os RAGEs, aumentam a liberação do fator de crescimento β (TGF-β), que

45

estimula a síntese de componentes da matriz do colágeno, contribuindo para o espessamento

da membrana basal, característico da nefropatia diabética (Vlassara et al., 2002). O acúmulo

de AGEs no colágeno da membrana basal também contribui para o espessamento da

membrana basal, bem como para alterações na filtração glomerular. A redução da filtração e

consequente perda da função glomerular também se deve à compressão dos capilares e

diminuição da superfície de filtração, secundárias à expansão do leito mesangial devido ao

aumento da síntese de proteínas da matriz e de colágeno tipo IV em resposta aos AGEs-

RAGEs nas células mesangiais (Vlassara et al., 2002).

Nos indivíduos diabéticos há também um aumento da glicação da mielina, com

acúmulo de AGEs nessa substância. A mielina glicada fica suscetível à fagocitose por

macrófagos, os quais secretam proteases, contribuindo para a desmielinização neuronal. Os

AGEs acumulados na mielina também se ligam à proteínas plasmáticas, como IgG e IgM,

estimulando reações imunes que potencializam a desmielinização do nervo na neuropatia

diabética. Além disso, foi evidenciado que a disfunção neuronal está estreitamente associada à

ativação do NF-κB, com expressão de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-6 e o TNF-α.

Considerando que a ativação do NF-κB resulta da interação AGE-RAGE, pressupõe que os

AGEs contribuam significativamente para a disfunção neuronal no diabetes (Ahmed, 2005).

Adicionalmente, os AGEs também podem participar do processo de espessamento dos vasos

sanguíneos que suprem o nervo, resultando em isquemia vascular, um fator provavelmente

importante no desenvolvimento dessas alterações neurais (Ahmed, 2005).

Juntamente com a neuropatia diabética, o comprometimento da cicatrização de feridas

que ocorre nos indivíduos diabéticos tem um papel fundamental no desenvolvimento de

úlceras nos membros inferiores responsáveis pelo grande número de amputações nos

pacientes diabéticos. A resposta inflamatória que sucede à lesão é crucial para a rápida

cicatrização da ferida. O que acontece no diabetes é que inicialmente há um retardo no afluxo

de células inflamatórias para o local do ferimento, entretanto, quando estas células se

estabelecem, ocorre então um estado de inflamação crônica, impedindo o depósito de

componentes da matriz, o remodelamento e, por fim, o fechamento da ferida. Essa resposta

inflamatória sustentada é acompanhada pela interação AGE-RAGE, que estimula a liberação

de moléculas pró-inflamatórias, como o TNF-α e as metaloproteinases (MMPs) destruidoras

da matriz, as quais limitam o fechamento da ferida. Soma-se a isso, o fato de que a interação

AGE-RAGE nos fibroblastos está relacionada com a redução do depósito necessário do

colágeno, comprometendo ainda mais o processo normal de cicatrização (Ahmed, 2005).

46

Em relação à macroangiopatia diabética, os AGEs participam dos estágios iniciais da

aterogênese, desencadeando o processo inflamatório-proliferativo, além de contribuirem para

a propagação da inflamação e comprometimento vascular na doença já estabelecida (Goldin et

al., 2006; Basta et al., 2004). Eles contribuem para esse processo aterogênico de diversas

formas: causam o enrijecimento da vasculatura através das ligações cruzadas que induzem nas

proteínas da matriz; oxidam lipoproteínas de baixa densidade plasmáticas (LDL),

promovendo a formação da LDL oxidada, que é mais aterogênica; inativam diretamente

fatores relaxantes derivados do endotélio, como o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina (PGI2);

e modulam várias propriedades celulares e a produção de diversas substâncias ao interagirem

com receptores celulares. Dentre essas substâncias, há produção de endotelina-1 pelas células

endoteliais, um potente vasoconstritor; citocinas inflamatórias pelas células que se acumulam

nas placas ateroscleróticas, como os fagócitos mononucleares e as células musculares lisas;

além de moléculas de adesão leucocitárias endoteliais, pró-coagulantes e que aumentam a

permeabilidade vascular (Goldin et al., 2006; Basta et al., 2004).

2.6 sRAGE E COMPLICAÇÕES DO DM2

A associação entre os níveis de sRAGE e esRAGE com a presença de complicações

micro e macrovasculares do DM ainda não está bem estabelecida.

Humpert PM et al, em 2007, ao estudarem os níveis de sRAGE e esRAGE em 110

DM2 com albuminúria demonstraram que os níveis de sRAGE estão associados com

albuminúria, mas não com complicações macrovasculares (EIM da carótida) [Humpert et al.,

2007b]. Da mesma forma, Tan et al., em 2006, Kanková et al., em 2008, e Zeyada et al., em

2013, também observaram uma correlação positiva entre os níveis de sRAGE e albuminúria

ao analisarem 318 DM2, 265 pacientes diabéticos (tipo 1, tipo 2 e LADA) e 48 DM2,

respectivamente (Tan et al., 2006; Kanková et al., 2008; Zeyada et al., 2013). Em

contrapartida, Yu et al., em 2010, não encontraram associação significativa entre os níveis de

sRAGE e albuminúria ao avaliarem 180 DM2 em estágio inicial de nefropatia diabética (Yu

et al., 2010) e Koyama et al., em 2005, descreveram uma associação inversa entre os níveis de

esRAGE e a presença de doença macrovascular (aterosclerose nas artérias carótida e femoral -

EIM) [Koyama et al., 2005].

Em relação à retinopatia diabética (RD), Al-Mesallamy et al., em 2011, estudaram a

associação entre sRAGE e retinopatia em 37 pacientes DM2 e 20 saudáveis e não viram

47

diferença entre controles e DM2 sem RD (1712,69 pg/ml versus 1833,1 pg/ml), mas

observaram uma redução significativa do sRAGE nos DM2 com RD não proliferativa e

proliferativa em relação aos diabéticos sem RD (1331,13 pg/ml, 934,87 pg/ml versus 1833,1

pg/ml, respectivamente; p<0,05), demonstrando uma associação negativa do sRAGE e estágio

da RD e sugerindo que o sRAGE pode ser um fator protetor e marcador útil para indicar

susceptibilidade individual para essa complicação (Al-Mesallamy et al., 2011). Já, Kerkeni et

al., em 2012, ao estudarem 100 pacientes DM2 (40 RDNP e 60 RDP) e 30 saudáveis

constataram que o sRAGE foi significativamente maior nos DM em relação aos controles

(206,45 pg/mL versus 148,72 pg/mL; p<0,001) e, entre os DM2, foi significativamente maior

nos que tinham RD proliferativa comparado com aqueles que tinham RD não proliferativa

(223,21 pg/mL versus 178,54 pg/mL; p=0,01) [Kerkeni et al., 2012]. Assim como Kerkeni et

al., Ng et al., em 2013, ao estudarem 371 pacientes DM2 (171 sem RD, 125 RDNP e 75 RDP)

e 235 saudáveis também observaram níveis de sRAGE significativamente mais elevados nos

pacientes diabéticos, com e sem RD, em comparação aos controles. Além disso, verificaram

que o sRAGE foi significativamente mais elevado nos pacientes DM2 com RD em relação

aos DM2 sem RD, e entre os DM2 com RD, foi significativamente mais elevado nos

pacientes com RDP quando comparados aos pacientes com RDNP, mostrando uma correlação

positiva dos níveis de sRAGE com a severidade da RD (Ng et al., 2013). Por outro lado, Yang

et al., não identificaram diferença estatisticamente significativa nos níveis de sRAGE entre

372 DM2 com RD e 668 sem RD (Yang et al., 2013).

Grossin et al., em 2008, avaliaram os níveis de sRAGE em 30 DM2 (20 sem

complicações microvasculares e 10 com nefropatia e retinopatia diabéticas) e 29 controles.

Eles constataram que os níveis plasmáticos do sRAGE foram semelhantes nos DM sem

complicações e controles, e entre os pacientes diabéticos, aqueles com complicações

microvasculares (nefro e retinopatia) apresentaram níveis significativamente menores que os

DM sem complicações (Grossin et al., 2008).

No que se refere à neuropadia diabética, El-Mesallamy et al., em 2011, também

avaliaram a associação entre sRAGE e neuropatia em 30 pacientes DM2 sem neuropatia ou pé

diabético, 30 DM2 com pé diabético e neuropatia e 20 controles saudáveis. Eles observaram

que os níveis de sRAGE foram significativamente aumentados nos pacientes DM2 sem

neuropatia quando comparados aos com controles saudáveis (1656,6 vs 1111,7 pg/mL,

respectivamente; p<0,05). No entanto, os níveis de sRAGE foram significativamente menores

nos pacientes com pé diabético associado à neuropatia em comparação com os pacientes DM2

48

sem neuropatia e com os controles (1049,6 vs 1656,6 e 1111,7 pg/ml, respectivamente; p<

0,05), sendo que os níveis de sRAGE foram significativamente mais baixos naqueles

pacientes com graus mais avançados de neuropatia em relação aos pacientes com quadros

mais brandos (El-Mesallamy et al., 2011). No estudo de Aubert et al., entretanto, o sRAGE

foi independentemente e positivamente associado à presença de neuropatia periférica em 198

pacientes DM2, enquanto que no estudo de Humpert et al. tanto o sRAGE quanto o esRAGE

não tiveram associação com neuropatia periférica ou autonômica em 108 DM2 (Aubert et al.,

2014; Humpert et al., 2007a).

A tabela 1 resume os estudos sobre associação entre os níveis das formas solúveis do

RAGE e a presença de complicações do DM (retinopatia e nefropatia).

Tabela 1: Estudos sobre as complicações do DM e formas solúveis do RAGE.

Autores Avaliação Conclusões

Estudos em nefropatia Tan et al.,

2006

Avaliação dos AGEs e

severidade da ND no

sRAGE

-↑sRAGE DM vs controles

-↑sRAGE DM proteinúria vs controles

- Associação positiva entre sRAGE e severidade da ND

- Correlação positiva do sRAGE com albuminúria ( r=0,24;

p<0,01) e negativa com Clcr (r=−0,30; p<0,001)

Humpert et

al., 2007b

sRAGE e esRAGE em

DM2 com albuminúria

- sRAGE tem correlação fraca com albuminúria (r=0,18;

p=0,05) e sem correlação com TFG

Kanková et

al., 2008

sRAGE e função renal

em DM

- ↑sRAGE ND vs normoalbuminúria e controles

- Sem diferença entre os controles e os com normoalbuminúria - sRAGE positivamente correlacionado com albuminúria

(r=0,22; p<0,001) e estágios da ND, e negativamente com

TFG (r=-0,28; p<0,001)

- TFG única variável independente associada com sRAGE

Yu et al.,

2010

sRAGE na fase inicial da

nefropatia em DM2 - Não foi encontrada correlação entre sRAGE e RAC

- Correlação negativa com TFG (β = -0.21; p= 0,04)

Zeyada et al., 2013

sRAGE como marcador

de DM e ND

-↑sRAGE ND vs sem ND e controles

- Sem diferença entre os grupos microalbuminúria e

proteinúria

- Sem diferença entre os grupos sem ND e controles

- Correlação positiva do sRAGE com RAC (r=0,506; p<0,05)

e com creatinina sérica (r=0,356; p<0,05)

Em resumo... Os resultados sugerem uma correlação positiva fraca entre sRAGE e albuminúria e

correlação negativa com TFG.

Estudos em retinopatia Al-

Mesallamy

et al., 2011

sRAGE na RD e sua

associação com

gravidade de RD

- ↓sRAGE RDNP e RDP x controles e DM2 sem RD

- sem diferença entre controles e DM2 sem RD

-↓sRAGE RDP x RDNP

- Associação negativa entre sRAGE e estágio da RD

Kerkeni et

al., 2012

sRAGE (e outros

marcadores) e gravidade

da RD

- ↑ sRAGE DM2 x controles

- ↑ sRAGE RDP x RDNP

Yang et al.,

2013

sRAGE e risco RD - Não houve diferença estatisticamente significativa nos níveis

de sRAGE entre os pacientes com e sem RD

49

Ng et al.,

2013

sRAGE e RD - ↑ sRAGE DM2 com e sem RD vs controles

- ↑ sRAGE RD vs sem RD

- ↑ sRAGE RDP vs RDNP

- correlação positiva com a severidade da RD

Em resumo... Os resultados são divergentes. Enquanto dois estudos mostram uma correlação

positiva entre sRAGE e severidada da RD, um estudo sugere uma correlação negativa e outro não

observa diferença entre os pacientes com e sem RD.

Estudos em nefropatia e retinopatia Grossin et

al., 2008

Avaliação dos níveis de

sRAGE e AGE (CML) em DM com e sem

complicações

microvasculares (RD e

ND)

-↓ sRAGE DM com complicações vs DM sem complicações

- sRAGE semelhante nos DM sem complicações e controles

ND: nefropatia diabética; TFG: taxa de filtração glomerular, RD: retinopatia diabética; RDNP: retinopatia diabética não proliferativa; RDP:

retinopatia diabética proliferativa; Clcr: clearance de creatinina; RAC: relação albuminúria/creatinúria.

2.7 sRAGE E CONTROLE GLICÊMICO

Adicionalmente, a associação entre os níveis de sRAGE e esRAGE com o grau de

controle glicêmico também não foi bem elucidada.

Em um estudo em 2007, Devangelio et al. avaliaram os níveis de sRAGE em 86 DM2

e 43 controles e constataram que os pacientes diabéticos apresentaram níveis de sRAGE

significativamente menores em relação aos controles (849 pg/mL versus 1250 pg/mL;

p<0,0001) [Devangelio et al., 2007], sendo esses níveis inversamente correlacionados com a

hemoglobina glicada (HbA1c), um marcador de controle glicêmico muito utilizado na prática

clínica. Neste mesmo trabalho, também foi muito interessante a constatação de que a melhora

do controle glicêmico (e dos níveis de HbA1c) através da utilização de hipoglicemiantes orais

(metformina ou glicazida), em 24 pacientes com DM recém diagnosticado, ou insulina, em 12

pacientes mal controlados, resultou em um significativo aumento dos níveis de sRAGE (786

pg/mL versus 1044 pg/mL; p<0,0001) [Devangelio et al., 2007].

Koyama et al. também observaram, ao avaliarem 203 indivíduos DM2 e 134 não

diabéticos (16 pré-diabéticos e 118 com tolerância normal à glicose), que os níveis

plasmáticos de esRAGE foram significativamente e inversamente correlacionados com a

HbA1c (Koyama et al., 2005).

Da mesma forma, Motawi et al., ao avaliarem 28 DM2 bem controlados (HbA1c ≤

7%), 42 DM2 mal controlados (HbA1c > 7%) e 20 controles saudáveis, viram que os níveis

de sRAGE foram significativamente menores no grupo de pacientes diabéticos mal

controlados em comparação com o grupo controle (600,06 versus 804,92 pg/mL; p = 0,01),

50

porém não observaram diferença significativa entre o sRAGE do grupo de diabéticos bem

controlados e o do grupo controle (Motawi et al., 2013).

Em contrapartida, Zeyada et al., em 2013, identificaram uma correlação positiva

entre os níveis de sRAGE e a HbA1c ao estudarem 48 DM2 (com e sem nefropatia diabética)

e 17 controles.

Por outro lado, em 2007, Humpert et al. não encontraram correlação entre os níveis de

sRAGE e esRAGE e a HbA1c em 110 DM2 com albuminúria (Humpert et al., 2007b), bem

como Grossin et al. (2008), Kanková et al. (2008) e Yu et al. (2010), também não acharam

correlação estatística entre os níveis plasmáticos de sRAGE e a HbA1c ao avaliarem,

respectivamente, 30 DM2 (20 sem complicações microvasculares e 10 com nefropatia e

retinopatia diabéticas) e 29 controles (Grossin et al., 2008), 265 DM (171 com e 94 sem

nefropatia diabética) [Kanková et al., 2008] e 180 DM2 em estágio inicial de nefropatia

diabética (Yu et al., 2010).

A tabela 2 resume os estudos sobre associação dos níveis das formas solúveis do

RAGE e controle glicêmico.

Tabela 2: Estudos sobre controle glicêmico e formas solúveis do RAGE.

Autores Avaliação Conclusões Motawi et

al., 2013

Efeito do controle

glicêmico no sRAGE e

marcadores do estresse

oxidativo

- ↓ sRAGE DM2 mal controlados x controles

- Sem diferença no sRAGE entre DM2 bem controlados e controles

Koyama et

al., 2005

Associação do

esRAGE com os

componentes da Sd

metabólica e

aterosclerose

- ↓ esRAGE DM e pré-DM x tolerância normal à glicose

- esRAGE inversamente associado com HbA1c

Devangelio

et al., 2007

Comparação dos níveis

de sRAGE entre DM2

e controles

- ↓sRAGE DM2 x controles

- HbA1c correlacionada inversamente com sRAGE (Rho = -0,291;

p = 0,007)

-↑ sRAGE após melhora do controle metabólico (HbA1c) por

ADOs (n=24) ou insulina (n=12)

Humpert et

al., 2007b

Comparar sRAGE e

esRAGE em DM2 com

albuminúria –

(aplicabilidade como

marcadores de doença

vascular e controle

glicêmico no DM2).

- Nem sRAGE, nem esRAGE tem correlação com controle

glicêmico

Grossin et

al., 2008

Avaliação dos níveis de

sRAGE e AGE (CML)

em DM com e sem

complicações

- Sem correlação estatística entre sRAGE e HbA1c

51

microvasculares (RD e

ND)

Kanková et

al., 2008

Estudo das relações

entre sRAGE, função

renal e variabilidade

genética do gene

RAGE

- Sem correlação significativa entre sRAGE e HbA1c

Yu et al.,

2010

sRAGE na fase inicial

da nefropatia em DM2

- Sem correlação entre sRAGE e HbA1c

Zeyada et al., 2013

sRAGE como

marcador de DM e ND

- Correlação positiva do sRAGE com HbA1c (r=0,36; p<0,05)

Em resumo... Alguns estudos sugerem uma associação inversa das formas solúveis do RAGE com o

controle glicêmico, porém outros não observam correlação entre essas variáveis, e apenas um estudo

mostrou uma correlação positiva.

HbA1c: hemoglobina glicada; ADO: antidiabético oral.

2.8 sRAGE E MEDICAÇÕES

É importante notar que diversas medicações comumente utilizadas no tratamento de

pacientes com DM2 podem modular os níveis de sRAGE, possivelmente interferindo com os

resultados discordantes dos trabalhos citados anteriormente (Lanati et al., 2010).

Enquanto os inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA) [Forbes et al.,

2005; Humpert et al., 2007b], os agonistas do PPAR- (tiazolidinedionas) [Tan et al., 2007;

Oz Gul et al., 2010; Koyama et al., 2014] e os inibidores da HMG-CoA redutase (estatinas)

[Santilli et al., 2007; Lu et al., 2011; Tam et al., 2010] aumentam a produção e secreção do

sRAGE no plasma, a nifedipina diminuiu (Forbes et al., 2005) e a glimepirida (sulfaniluréia)

tendeu a reduzir os níveis de sRAGE (Nakamura et al., 2014).

Em relação aos bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA), Humpert et al.,

constataram níveis significativamente mais elevados de sRAGE e esRAGE nos pacientes

tratados com BRA, enquanto Nakamura et al. e Grossin et al. demonstraram diminuição dos

níveis sanguíneos de sRAGE após tratamento com diferentes BRAs (candesartan, cilexetil,

irbesartan ou telmisartan) [Humpert et al., 2007b; Nakamura et al., 2005; Grossin et al.,

2010].

Por fim, Lam et al. ao avaliarem o efeito da insulina nos níveis das formas solúveis do

RAGE in vitro observaram um aumento da expressão de esRAGE e sRAGE após a

administração de insulina (Lam et al., 2013).

Os resultados dos trabalhos que avaliaram o efeito de diferentes medicações sobre os

níveis de sRAGE citados anteriormente encontram-se resumidos na Tabela 3.

52

Tabela 3: Influência das medicações nos níveis de sRAGE.

Medicação sRAGE

Anti-hipertensivos

IECA ↑

BRA ↑ ou ↓

Nifedipina ↓

Anti-diabéticos

Glimepirida Tendência a ↓

Agonistas do PPAR- (tiazolidinedionas) ↑

Insulina ↑

Hipolipemiantes

Inibidores da HMG-CoA redutase (estatinas) ↑

IECA: inibidores da enzima conversora da angiotensina; BRA: bloqueadores do receptor da

angiotensina.

Refs: Forbes et al., 2005; Tan et al., 2007; Oz Gul et al., 2010; Koyama et al., 2014; Santilli et al.,

2007; Lu et al., 2011; Tam et al., 2010; Forbes et al., 2005; Nakamura et al., 2014; Humpert et al.,

2007; Nakamura et al., 2005; Grossin et al., 2010; Lam et al., 2013.

2.9 sRAGE E EXERCÍCIO FÍSICO

Choi et al. avaliaram o efeito do exercício físico nos níveis de sRAGE. Setenta e cinco

mulheres DM2, com peso corporal estável (mudança do peso menor que 2 Kg nos últimos 6

meses) e estilo de vida sedentário (menos de 20 minutos de exercícios por semana)

participaram do estudo. As pacientes foram randomizadas em dois grupos: 37 no grupo

controle (atividade física habitual) e 38 no grupo de exercício aeróbico (60 minutos de

caminhada, em intensidade moderada, cinco vezes por semana, durante 12 semanas). Após as

12 semanas, período do estudo, os autores observaram que os níveis de sRAGE aumentaram

significativamente nos pacientes do grupo de exercício aeróbico (de 653,2 pg/ml para 751,1

pg/ml ; p = 0,003) , mas não nos do grupo controle (de 726,0 pg/ml para 718,3 pg/ml; p =

0,757), concluindo que o exercício aeróbico aumenta os níveis circulantes do RAGE solúvel

em pacientes com DM2 (Choi et al., 2012).

2.10 sRAGE E ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA (IMC)

Norata et al., demonstraram que, em indivíduos saudáveis, o sRAGE plasmático foi

significativamente menor naqueles com excesso de peso (IMC> 25 kg/m²) em comparação a

sujeitos magros (1460 +/- 640 pg/mL versus 1710 +/- 693 pg/mL; p < 0,05), concluindo que

53

os níveis de sRAGE se correlacionam negativamente com IMC e relação cintura/quadril

(Norata et al., 2009).

Da mesma forma, Koyama et al., observaram que o esRAGE foi significativamente e

inversamente correlacionado com os componentes da síndrome metabólica, incluindo o índice

de massa corporal, tanto nos indivíduos não diabéticos quanto nos diabéticos (Koyama et al.,

2005).

Em outro estudo, Brix et al. compararam os níveis de sRAGE de 85 pacientes com

obesidade grau III (média de IMC 45,4±7,9 kg/m²) com os de 40 controles não obesos

saudáveis (média de IMC 26,0 ± 5,5 kg/m²). Além disso, analisaram o efeito da perda de peso

induzida pela cirurgia bariátrica nos níveis de sRAGE desses indivíduos obesos mórbidos,

dois anos após o procedimento cirúrgico. Eles concluíram que os pacientes com obesidade

grau III apresentaram níveis significativamente mais baixos de sRAGE em comparação com

os controles não-obesos (1010 pg/ml versus 1501 pg/ml; p<0,001), e que esses níveis

plasmáticos de sRAGE aumentaram significativamente após a perda de peso induzida pela

cirurgia bariátrica (de 1010 pg/ml para 1261 pg/ml; p = 0.008). Os autores sugeriram que os

menores níveis de sRAGE em pacientes com obesidade grau III podem explicar o maior risco

de doença cardiovascular e câncer nesses pacientes, assim como o aumento de sRAGE após

redução do peso pode estar relacionado a menor resistência à insulina após a cirurgia

bariátrica (Brix et al., 2012).

Grossin et al., entretanto, não encontraram correlação estatística entre os níveis

plasmáticos de sRAGE e IMC ao avaliarem 30 DM2 (20 sem complicações microvasculares e

10 com nefropatia e retinopatia diabéticas) e 29 controles (Grossin et al., 2008).

2.11 sRAGE E FUNÇÃO RENAL

Os níveis plasmáticos de sRAGE e esRAGE estão associados com a gravidade da

disfunção renal, correlacionando-se positivamente com a concentração de creatinina sérica e

negativamente com a taxa de filtração glomerular (TFG) [Kalousová et al., 2006; Kanková et

al., 2008; Gohda et al., 2008]. Entretanto, deverá ser melhor elucidado se o aumento das

formas solúveis é causado apenas pela diminuição da função renal e, consequentemente, da

depuração do sRAGE, ou se o sRAGE é supra-regulado para proteger contra os efeitos

tóxicos de AGEs (Kalousová et al., 2006).

54

2.12 sRAGE E PRÉ-DIABETES

Biswas et al. não viram diferença significativa nos níveis séricos de sRAGE em

indivíduos pré-diabéticos quando comparados com controles e indivíduos DM2 recém

diagnosticados. Além disso, não observaram correlação entre sRAGE e resistência insulínica

(avaliada através HOMA-IR) ou entre sRAGE e função das células beta (avaliada através do

HOMA-%B) em pessoas com pré-diabetes e DM2 recentemente diagnosticado, sugerindo

que é improvável que o sRAGE seja um importante preditor de resistência à insulina e

disfunção das células beta durante o desenvolvimento do DM2 (Biswas et al., 2015).

Koyama H el al. observaram que os níveis plasmáticos de esRAGE foram

significativamente menores tanto nos pacientes com pré-DM quanto nos diabéticos, quando

comparados aos dos indivíduos não diabéticos. Assim como, o esRAGE foi inversamente

associado com o índice de resistência à insulina (avaliado através do índice HOMA) em todos

os indivíduos(Koyama et al., 2005). Estes achados foram posteriormente corroborados pelo

estudo de Huang et al., que constataram que ambos níveis de sRAGE e esRAGE em pré-

diabéticos e em diabéticos recém diagnosticados foram significativamente mais baixos do que

no grupo controle. Os autores verificaram ainda que, no grupo de pré-diabéticos, o sRAGE se

correlacionou positivamente com esRAGE e negativamente com a resistência insulínica

(HOMA-IR). Em conjunto esses achados sugerem que o sRAGE e o esRAGE são alterados

precocemente durante o pré-diabetes (Huang et al., 2015).

55

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Determinar os níveis de sRAGE em indivíduos com DM2.

3.2 ESPECÍFICOS

Determinar e comparar os níveis de sRAGE em indivíduos com DM2 com e sem as

complicações microvasculares - nefropatia e retinopatia.

Determinar e comparar os níveis de sRAGE em indivíduos com DM2 estratificados de

acordo com o nível de controle glicêmico (HbA1c < 7,0% – compensado, HbA1c 7,0 – 9,0%

moderadamente descompensado, HbA1c > 9,0% – gravemente descompensado).

Comparar e correlacionar os níveis das formas solúveis de RAGE nos indivíduos com

DM2 com outras variáveis (idade, sexo, uso de medicamentos, dislipidemia, hipertensão

arterial sistêmica e obesidade).

56

4 PACIENTES E MÉTODOS

4.1 DESENHO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo observacional, transversal.

4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este estudo foi analisado e aceito pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Medicina/HUAP em 02/09/11 (CAAE: 0264.0.258.000-11) [Anexo 10.1].

Todos os participantes da pesquisa foram esclarecidos sobre os procedimentos da

pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

4.3 PACIENTES

Foram incluídos indivíduos com DM2 com e sem complicações microvasculares

(nefro e retinopatia), do ambulatório do HUAP/UFF (Hospital Universitário Antônio Pedro/

Universidade Federal Fluminense), com idades acima de 18 anos.

Os pacientes com DM2 foram ainda subdivididos de acordo com o controle glicêmico,

em três subgrupos: compensados (HbA1c < 7,0%), moderadamente descompensados (HbA1c

entre 7 e 9,0%) e gravemente descompensados (HbA1c > 9,0%), figura 9.

Figura 9: Distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos.

Pacientes sem complicações microvasculares do DM

Pacientes com complicações microvasculares do DM

Compensados HbA1c < 7%

Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9%

Gravemente descompensados

HbA1c > 9%

Compensados HbA1c < 7%

Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9%

Gravemente descompensados

HbA1c > 9%

57

4.3.1 Critérios de inclusão

Indivíduos com diagnóstico de DM2 atendidos no Ambulatório do HUAP/UFF.

4.3.2 Critérios de exclusão

Conforme abaixo:

a) Tabagismo – considerado consumo atual, independente da quantidade;

b) Etilismo – considerado um consumo maior que 4 doses padrão por dia para homens

(ou maior que 14 por semana) e maior que 3 doses padrão por dia para mulheres (ou

maior que 7 por semana); sendo que 1 dose padrão equivale a 14g de etanol, o que

corresponde aproximadamente a 355 ml de cerveja, 150 ml de vinho e 45 ml de

destilado (National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism – NIAAA, 2005);

c) Doença viral crônica - hepatites B e C ou portadores do vírus HIV;

d) Doença infecciosa grave nos últimos 6 meses;

e) Taxa de filtração glomerular abaixo de 60 mL/min/1,73m², calculada pela fórmula

CKD-EPI (Kalousová et al., 2006);

f) Anemia;

g) Outras doenças graves, como neoplasia.

4.4 FLUXO DA PESQUISA

O recrutamento dos participantes foi feito durante as consultas médicas de rotina no

ambulatório do HUAP, através da avaliação dos seus prontuários. Neste primeiro momento

foram verificados os critérios de inclusão e a ausência de critérios de exclusão. Os pacientes

foram abordados nesta ocasião, apresentados ao projeto e esclarecidos quanto a possíveis

dúvidas. Os voluntários foram incluídos após a assinatura do termo de consentimento livre e

esclarecido (Anexo 10.2).

Após a inclusão no estudo, os participantes foram submetidos aos seguintes

procedimentos:

58

4.4.1 Avaliação clínica

Os dados relevantes para o estudo foram coletados em fichas próprias, conforme

anexo (Anexo 10.3), a partir de uma entrevista com o paciente no momento da consulta

médica e da revisão do prontuário.

Para a determinação da presença ou ausência de complicações microvasculares do

DM2 foi considerada a revisão dos prontuários:

a) Retinopatia: fundoscopia realizada anualmente no serviço de Oftalmologia do

HUAP com ou sem alterações relacionadas ao DM;

b) Nefropatia: pesquisa de albuminúria, através da concentração da albumina ou

relação albumina/creatinina em amostra isolada de urina, sendo considerada

presença de ND: duas amostras positivas, de três, coletadas em um período de três a

seis meses. Alguns indivíduos já iniciaram acompanhamento no HUAP em uso de

IECA ou BRA e foram classificados de acordo com a albuminúria atual. Desta

forma, no grupo de indivíduos considerados “sem nefropatia diabética”,

possivelmente, foram incluídos indivíduos sem nefropatia e indivíduos com

nefropatia incipiente. A tabela abaixo resume a classificação de ND utilizada no

estudo:

Pesquisa de albuminúria atual Passado de albuminúria ND

+ + / - ou desconhecido Presente

- - / + ou desconhecido Ausente

ND: nefropatia diabética.

Para a categorização dos pacientes de acordo com o controle glicêmico (bom e mau

controle glicêmico) foram utilizados os níveis de HbA1c, um marcador de controle glicêmico

rotineiramente utilizado para o seguimento dos pacientes, obtidos através da coleta de sangue.

Foram notados também, a partir da revisão do prontuário e entrevista com o paciente,

outros dados, como a presença ou não de complicações macrovasculares do DM2, a

terapêutica hipoglicemiante em vigência, o uso concomitante de outras medicações (como

anti-hipertensivos, hipolipemiantes e anti-agregantes plaquetários), a presença ou não de

59

outras comorbidades (como hipertensão arterial sistêmica e dislipidemia), dados

antropométricos (peso, altura, IMC, circunferência abdominal, quadril etc), dados de

identificação do paciente e outros parâmetros laboratoriais (glicemia de jejum, lipidograma

etc). Nem todos os dados coletados foram considerados variáveis do estudo. Alguns foram

obtidos para possibilitar uma descrição detalhada da casuística.

Foi considerada presença de complicação macrovascular uma história documentada de

evento cardio ou cerebrovascular ou de amputação não-traumática de membro e/ou a

existência de diagnóstico de doença coronariana, carotídea ou arterial periférica através de

método complementar pertinente (cateterismo cardíaco, teste ergométrico, cintilografia

cardíaca, Doppler arterial).

4.4.2 Avaliação laboratorial

A coleta de sangue foi realizada sempre pela manhã, com o paciente em jejum de oito

horas, no setor de coleta do laboratório do HUAP. As amostras foram coletadas pela bióloga

Solange Lopes da Silva: uma amostra de sangue em tubo com EDTA (para dosagem da

HbA1c) e outra em tubo sem EDTA (para dosagem do sRAGE). O tubo sem EDTA foi, em

seguida, transportado até o Laboratório Multidisciplinar para processamento: centrifugação

por 15 min a 1000 x g para separação do soro que foi aliquotado e estocado em freezer a -

70oC até a realização dos ensaios. O tubo com EDTA seguiu o fluxo normal dos exames

coletados no HUAP, sendo processado pelo laboratório de rotina.

4.5 DOSAGEM DO sRAGE

A determinação dos níveis de sRAGE foi realizada utilizando-se kits ELISA

comercialmente disponíveis (BioVendor, Brno, CZE), com limite de detecção de 19,2 pg/ml e

coeficientes de variação intra e interensaios de 4% e 7,2%, respectivamente, de acordo com os

protocolos do fabricante. As amostras foram analisadas em duplicata e os resultados

apresentados como a média das mensurações.

60

4.6 DOSAGEM DE HBA1C

A determinação dos níveis da HbA1c foi feita através do método de imunoensaio de

inibição turbidimétrica utilizando-se Kits comercialmente disponíveis (Siemens, Newark,

USA), cujo o valor de referência varia de 4,5-6,2%.

61

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises foram realizadas utilizando o programa estatístico SPSS versão 23.0 para

Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). O teste de Kolmogorov-Smirnov foi executado para

avaliação do padrão de distribuição das variáveis numéricas (normal ou assimétrica). Foram

utilizados testes paramétricos ou não-paramétricos na dependência deste padrão. Na análise

descritiva, as variáveis categóricas foram expressas através das suas percentagens e

frequências. As variáveis numéricas com distribuição normal foram expressas como média ±

desvio-padrão, enquanto as variáveis com distribuição assimétrica foram expressas como

mediana (intervalo interquartil). A comparação das variáveis numéricas entre grupos foi

realizada com os testes t de Student ou Mann-Whitney ou Kruskal Wallis. As correlações entre

variáveis numéricas foram estudadas utilizando-se o coeficiente de correlação de Pearson.

Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

62

6 RESULTADOS

Casuística

Inicialmente era estimado um total de 126 DM2 (63 pacientes com e 63 pacientes sem

complicações microvasculares) com base no cálculo amostral. Entretanto, após a revisão do

prontuário de 314 pacientes diabéticos, considerando os critérios de inclusão/exclusão, foi

possível incluir 89 pacientes DM2 no estudo, obtendo-se uma amostra por conveniência.

Os pacientes DM2, quando divididos por grupos e subgrupos, se distribuíram

conforme a figura 10. Ou seja, dos 89 pacientes DM2, 43 tinham complicações e 46 não

tinham complicações. Dos 43 pacientes com complicações, 11 estavam bem controlados

(HbA1c < 7%), 17 moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%) e 15 gravemente

descompensados (HbA1c > 9%). Já no grupo dos pacientes sem complicações, essa

distribuição por subgrupos foi de 16,17 e 13 pacientes respectivamente.

Figura 10: Distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos.

As características clínicas, de exame físico e laboratoriais dos seis subgrupos de DM2

são mostradas na tabela 4, 5 e 6, respectivamente.

Pacientes sem complicações crônicas do DM documentadas

n=46

Pacientes com complicações crônicas do DM documentadas

n=43

Grupo 1 Compensados HbA1c < 7%

n=16

Grupo 2 Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9% n=17

Grupo 3 Gravemente

descompensados HbA1c > 9%

n=13

Grupo 4 Compensados HbA1c < 7%

n=11

Grupo 5 Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9% n=17

Grupo 6 Gravemente

descompensados HbA1c > 9%

n=15

63

A única variável com distribuição normal foi a idade, sendo expressa como média ±

desvio-padrão. As demais variáveis, com distribuição assimétrica, foram expressas como

mediana (intervalo interquartil).

Setenta e um porcento dos pacientes pertenciam ao sexo feminino (63 pacientes). A

média de idade dos pacientes foi de 58,35 (± 8,26 anos). A mediana de duração do diabetes

foi de 120 meses (72-192). Dentre os DM2, 73 indivíduos (82%) eram hipertensos e 71 (80%)

dislipidêmicos. Cinquenta porcento dos pacientes diabéticos eram obesos (33% obesidade

grau 1, 11,4% obesidade grau 2 e 5,7% obesidade grau 3) e 34,1% tinham sobrepeso. A

retinopatia diabética estava presente em 35 dos pacientes DM2, sendo que 13 já tinham

realizado fotocoagulação com laser. A nefropatia estava presente em 22 DM2. Quatorze

pacientes possuíam tanto retinopatia quanto nefropatia diabética. Vinte e quatro pacientes

DM2 tinham história conhecida de doença macrovascular.

64

Tabela 4: Características clínicas dos pacientes DM2

Grupos

Variáveis

1

(n=16)

2

(n=17)

3

(n=13)

4

(n=11)

5

(n=17)

6

(n=15)

Total

(n=89)

p

Sexo (M/F) 6/10 3/14 3/10 7/4 5/12 2/13 26/63 ns

Idade (anos) 59,94 ±7,11 57,47 ±6,60 55,38 ±11,03 63,18 ±9,14 59,24 ±7,35 55,67 ±7,72 58,35 ±8,26 ns

Etnia (B/P/N) 4/8/4 7/4/6 6/1/6 6/2/3 7/8/2 5/7/3 35/30/24 ns

Tempo de DM

(meses)

90 (24-171) 106 (48-132) 120 (60-156) 120 (120-222) 168 (96-216) 134 (120-180) 120 (72-192) ns

Retinopatia - - - 9 14 12 35 *

Laser - - - 4 5 3 13 *

Nefropatia - - - 5 8 9 22 *

Retinopatia e

Nefropatia

- - - 3 5 6 14 *

Doença

macrovascular

3 4 4 5 6 2 24 ns

Atividade Física

(0/1/2)

6/1/8 10/2/5 10/2/1 4/1/5 11/1/5 9/5/1 50/12/25

Grupos: 1- DM2 sem complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 2- DM2 sem complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 3- DM2 sem complicações e gravemente

descompensados (HbA1c > 9%); 4- DM2 com complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 5- DM2 com complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 6- DM2 com complicações e

gravemente descompensados ( HbA1c > 9%).

Etnia: B- branca; P- parda; N- negra.

Atividade Física: 0- ausência de atividade física; 1- menos de 150min/sem de atividade aeróbica; 2- mais de 150min/sem de atividade aeróbica.

*sem diferença entre os grupos com complicações.

65

Tabela 5 Características de exame físico dos pacientes DM2

Grupos

Variáveis

1

(n=16)

2

(n=17)

3

(n=13)

4

(n=11)

5

(n=17)

6

(n=15)

Total

(n=89)

p

IMC (Kg/m²) 30,01

(25,37-33,38)

30,10

(27,07- 32,60)

29,22

(26,22- 29,97)

29,19

(27,33- 30,44)

33,04

(28,78- 37,53)

31,19

(26,75- 32,04)

29,99

(27,0- 32,90)

ns

Quadril (cm) 104

(100-110,75)

104

(96,5-108)

105

(100,75-107)

102,5

(100,5-105,5)

108

(102,75-114,5)

106,5

(102,5- 111)

105

(100-110)

ns

CA (cm) 100

(92-112)

95

(90-102)

98

(90-103,3)

101

(95,5-104,5)

111

(105,8-106,3)

99,5

(97-105,3)

100

(91-109)

0,022*

RCQ 0,97

(0,9-1,0)

0,93

(0,91-0,97)

0,92

(0,88- 0,98)

0,98

(0,93- 1,02)

1,01

(0,98-1,05)

0,94

(0,92- 0,97) d

0,96

(0,9-1,0)

0,029**

PAsist (mmHg) 122 (115-141) 120 (120-125) 130 (100-140) 120 (113-125) 131 (130-155) 140 (130-150) 128 (116-140) ns

PAdiast (mmHg) 70 (68-80) 70 (70-75) 70 (68-78) 70 (65-74) 70 (62-85) 78 (74-90) 70 (67-80) ns

Grupos: 1- DM2 sem complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 2- DM2 sem complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 3- DM2 sem complicações e gravemente descompensados

(HbA1c > 9%); 4- DM2 com complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 5- DM2 com complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 6- DM2 com complicações e gravemente

descompensados ( HbA1c > 9%).

IMC: índice de massa corpórea; CA: cintura abdominal, RCQ: relação cintura-quadril; PAsist: pressão arterial sistólica; PAdiast: pressão arterial diastólica.

* Diferença entre o grupo 5 e os grupos 2,3,4 e 6. **Diferença entre o grupo 5 e os grupos 1,2,3 e 6.

66

Tabela 6 Características laboratoriais dos pacientes DM2

Grupos

Variáveis

1

(n=16)

2

(n=17)

3

(n=13)

4

(n=11)

5

(n=17)

6

(n=15)

Total

(n=89)

p

HbA1c (%) 6,4 (6,1-6,6) 7,7 (7,2-8,3) 10,7 (9,5-11,4) 6,5 (6,1-6,8) 8,5 (7,5-8,7) 11,2 (9,8-11,6) 7,1 (6,2-8,8) <0,001

GJ (mg/dL) 105,5

(87,3-130,5)

132

(110-162)

169

(126-232)

104

(72-126)

156

(146-173)

165

(124-266)

141

(102-169)

0,001

CT (mg/dL) 147

(131,3-162,8)

173

(151-202)

176

(142-191)

148

(135-186,5)

157

(141-188)

217

(176-234)

166

(142-193)

0,004*

LDL (mg/dL) 80,5

(63,8-100,3)

96

(86,8-130,8)

103

(90-117)

81

(79-119)

96,5

(79,8-106,3)

132

(104,5-161)

98

(79-118)

0,01**

HDL (mg/dL) 44

(37,3-48,5)

42

(35-46)

56

(38-59)

42

(39,5-57,5)

45

(38-61)

46

(39-53,5)

44

(38-54)

ns

TG (mg/dL) 108

(92,3-147,5)

151

(108-204)

74,5

(67-113)

87

(76-115)

97

(57-140)

128

(68,5-165)

102,5

(70-155)

ns

Grupos: 1- DM2 sem complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 2- DM2 sem complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 3- DM2 sem complicações e gravemente descompensados

(HbA1c > 9%); 4- DM2 com complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 5- DM2 com complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 6- DM2 com complicações e gravemente

descompensados (HbA1c > 9%).

HbA1c: hemoglobina glicada; GJ: glicemia de jejum; CT: colesterol total; LDL: lipoproteínas de baixa densidade plasmática; HDL: lipoproteínas de baixa densidade plasmática; TG: triglicerídeos.

*Diferença entre o grupo 1 e os grupos 2,3 e 6, e entre o grupo 6 e os grupos 1,4 e 5.

** Diferença entre o grupo 1 e os grupos 3 e 6, e entre o grupo 6 e os grupos 1,4 e 5.

67

Foi encontrada diferença significativa entre os subgrupos em relação à RCQ, CA, CT

e LDL:

- O grupo 5 apresentou CA significativamente maior do que os grupos 2,3,4 e 6 e RCQ

significativamente maior do que os grupos 1,2,3 e 6, figura 11.

- O grupo 1 apresentou níveis de CT significativamente mais baixos do que os grupos

2,3 e 6. Além do grupo 1, o grupo 6 apresentou níveis significativamente mais elevados de

CT do que os grupos 4 e 5, figura 12.

- Da mesma forma, os níveis de LDL foram significativamente menores no grupo 1

quando comparados aos grupos 3 e 6. E o grupo 6 apresentou níveis significativamente

maiores de LDL em relação aos grupos 1,4 e 5, figura 13.

O tempo de duração do diabetes nos pacientes DM2 com complicações

microvasculares (grupos 4 + 5 + 6) foi significativamente maior do que nos pacientes sem

complicações microvasculares (grupos 1 + 2 + 3) [144 meses vs 108 meses; p=0,012), assim

como a PAsist (131 vs 120; p=0,034).

Quando avaliados quanto à atividade física, os indivíduos que realizavam 150 minutos

ou mais de atividade aeróbica por semana tiveram níveis significativamente mais baixos de

HbA1c, CT, e LDL quando comparados aos pacientes sedentários (6,8% vs 8,6%; p=0,003,

150mg,dl vs 175mg/dL; p=0,015 e 83,5mg/dL vs 105mg/dL; p=0,016, respectivamente), e

níveis significativamente mais baixos de HbA1c do que aqueles que realizavam menos de 150

minutos de atividade aeróbica por semana (6,8% vs 9,3%; p<0,001).

68

Figura 11: Relação cintura/quadril dos pacientes DM2.

Figura 12: Colesterol total dos pacientes DM2.

Figura 13: LDL dos pacientes DM2.

- Grupos 5 e 1: p=0,028

- Grupos 5 e 2: p=0,006

- Grupos 5 e 3: p=0,01

- Grupos 5 e 6: p=0,013

- Grupos 1 e 2: p=0,01

- Grupos 1 e 3: p=0,05

- Grupos 1 e 6: p<0,001

- Grupos 6 e 4: p=0,008

- Grupos 6 e 5: p=0,005

- Grupos 1 e 3: p=0,02

- Grupos 1 e 6: p=0,001

- Grupos 6 e 4: p=0,02

- Grupos 6 e 5: p=0,021

69

Níveis de sRAGE nos pacientes DM2

A mediana do sRAGE nos DM2 foi de 298 pg/ml (283,05-498,3). Os valores do

sRAGE nos seis subgrupos de DM2 encontram-se na tabela 7.

Tabela 7: sRAGE dos pacientes DM2, pré-DM e controles.

Grupos

Variável

1

(n=16)

2

(n=17)

3

(n=13)

4

(n=11)

5

(n=17)

6

(n=15)

Total

(n=89)

p

sRAGE

(pg/ml)

291,50

(283,05-

303,86)

296,33

(285,67-

509)

305,50

(280,5-

349,41)

353,92

(294,5-

405,97)

436,33

(282,92-

640,59)

291,83

(282,84-

493,34)

298

(283,05-

498,3)

ns

Grupos: 1- DM2 sem complicações e bem compensados (HbA1c < 7%); 2- DM2 sem complicações e moderadamente descompensados

(HbA1c 7-9%), 3- DM2 sem complicações e gravemente descompensados (HbA1c > 9%); 4- DM2 com complicações e bem compensados

(HbA1c < 7%); 5- DM2 com complicações e moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%), 6- DM2 com complicações e gravemente

descompensados ( HbA1c > 9%).

Comparação dos níveis de sRAGE entre os DM2 com e sem complicações

Quando comparados os pacientes DM2 com e sem complicações microvasculares

(retinopatia + nefropatia) não houve diferença de sRAGE (353,92 pg/ml vs 294 pg/ml,

respectivamente), assim como também não houve diferença quando comparados isoladamente

os pacientes com e sem nefropatia diabética (389,15 pg/mL vs 294 pg/mL, respectivamente),

e os pacientes com e sem retinopatia diabética (331,5 pg/mL vs 297,65 pg/mL,

respectivamente). Entre os pacientes com retinopatia diabética, aqueles que foram submetidos

à fotocoagulação com laser não apresentaram níveis de sRAGE diferentes daqueles que não

realizaram laser (309,59 pg/mL vs 353,92 pg/mL, respectivamente).

Observação: quando comparados os pacientes com e sem história conhecida de doença

macrovascular também não foi encontrada diferença significativa de sRAGE entre os grupos

(294,5 pg/mL vs 298,05 pg/mL, respectivamente).

70

Comparação dos níveis de RAGE nos DM2 de acordo com o controle glicêmico

Quando avaliada a mediana do sRAGE pelo nível glicêmico, de acordo com o valor da

HbA1c, encontramos um valor de 297,30 pg/ml no grupo de DM2 bem controlados (HbA1c <

7%), 304,49 pg/ml no grupo de DM2 moderadamente descompensados (HbA1c 7-9%) e

298,66 pg/ml no grupo de DM2 gravemente descompensados (HbA1c > 9%). Não houve

diferença significativamente estatística dos níveis de sRAGE entre os três grupos de controle

glicêmico.

Comparação dos níveis de sRAGE entre os DM2 com o mesmo controle glicêmico

divididos de acordo com a presença ou ausência de complicações microvasculares

Os DM2 com o mesmo controle glicêmico quando comparados em relação à presença

ou ausência de complicações, ou seja, grupo 1 com 4, 2 com 5 e 3 com 6, não apresentaram

diferença estatisticamente significativa dos níveis de sRAGE, conforme desenho esquemático

abaixo, figura 14.

Figura 14: sRAGE de acordo com a distribuição dos pacientes por grupos e subgrupos.

Pacientes sem complicações crônicas do DM documentadas

n=46

Pacientes com complicações crônicas do DM documentadas

n=43

Grupo 1 Compensados HbA1c < 7%

n=16

Grupo 2 Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9% n=17

Grupo 3 Gravemente

descompensados HbA1c > 9%

n=13

Grupo 4 Compensados HbA1c < 7%

n=11

Grupo 5 Moderadamente descompensados

HbA1c 7 - 9% n=17

Grupo 6 Gravemente

descompensados HbA1c > 9%

n=15

p=0,064

p=ns

p=ns

71

Comparação dos níveis de sRAGE dos DM2 com outras variáveis

Não houve diferença significativa dos níveis de sRAGE entre os sexos e etnias. Os

pacientes hipertensos não tiveram valores de sRAGE diferentes em relação aos não

hipertensos, assim como os pacientes dislipidêmicos em relação aos não dislipidêmicos e os

obesos em relação aos indivíduos sem obesidade, bem como não houve diferença do sRAGE

de acordo com o grau de obesidade (categorias de IMC). Também não houve diferença

significativa nos níveis de sRAGE entre os pacientes sedentários, os que faziam menos 150

minutos por semana de atividade física e aqueles que faziam mais de 150 minutos por semana

de atividade física (300,36 pg/mL vs 305,90 pg/mL vs 297,30 pg/mL, respectivamente). Da

mesma forma, quando avaliada a influência das medicações nos valores do sRAGE (IECA,

tiazolidinedionas, estatinas, glimepirida, nifedipina, BRA, insulina, AAS, metformina...), não

foi identificada diferença entre os pacientes que estavam em uso e aqueles que não estavam.

Quando realizadas as análises de correlação entre as variáveis, utilizando o coeficiente

de correlação de Pearson, não foram encontradas correlações estatisticamente significativas

entre o sRAGE e as seguintes variáveis: tempo de DM, idade, IMC, CA, RCQ, PAsist,

PAdiast, HbA1c, GJ, CT, LDL, HDL e TG.

72

7 DISCUSSÃO

No presente trabalho, vimos que dentre os pacientes com complicações, aqueles com

pior controle glicêmico (grupo 6) apresentaram níveis de CT e LDL mais elevados quando

comparados aos pacientes bem controlados (grupo 4) e moderadamente descompensados

(grupo 5). Da mesma forma, dentre os pacientes sem complicações, aqueles bem controlados

(grupo 1) tiveram níveis mais baixos de CT dos que os pacientes moderadamente e

gravemente descompensados (grupos 2 e 3) e níveis mais baixos de LDL do que os pacientes

gravemente descompensados (grupo 3). Como o DM2 está frequentemente associado à

síndrome metabólica e, assim, à outras condições clínicas de risco cardiovascular, como

dislipidemia e hipertensão arterial, é de se esperar uma correlação entre os descontroles

glicêmico e lipêmico, considerando, dentre outros fatores, uma má adesão ao tratamento por

parte desses pacientes (descompensados). Apesar do aumento do CT e LDL não fazer parte

dos critérios diagnósticos da síndrome metabólica, frequentemente, os pacientes portadores de

resistência insulínica e síndrome metabólica apresentam aumento da fração pequena e densa

do LDL, a qual possui um potencial aterosclerótico maior (Tchernof et al., 1996).

O grupo 5 apresentou CA significativamente maior do que os grupos 2,3, 4 e 6, e RCQ

significativamente maior do que os grupos 1,2,3 e 6. Não há uma explicação específica para

essa diferença, que, provavelmente, aconteceu ao acaso. Entretanto, após o screening de uma

enorme população (314 pacientes) para a inclusão de apenas 89 indivíduos, devido aos

critérios de inclusão e exclusão rigorosos, seria muito difícil conseguirmos controlar todos os

parâmetros (para termos grupos absolutamente iguais) e, assim, considerarmos a ausência de

diferença nos quesitos de CA e RCQ para incluirmos os pacientes no estudo. Como não houve

correlação do sRAGE com CA e RCQ, a diferença encontrada entre os grupos em relação a

esses parâmetros, provavelmente, não influenciou os resultados do estudo.

Sabe-se que a duração do DM2 é um importante fator de risco associado ao

desenvolvimento das complicações crônicas da doença (Kannel et al., 1979). Sendo assim,

como era esperado, os pacientes com complicações microvasculares do DM2 tiveram um

tempo de doença maior do que aqueles sem complicações. Esses pacientes com complicações

crônicas do DM2 encontram-se diante de um ambiente intracelular de maior estresse

oxidativo e ativação das vias metabólicas que lesam o endotélio, podendo justificar o aumento

da PA sistólica nesse grupo em relação àqueles sem complicações (Berry et al., 2001;

Widlansky et al., 2003).

73

Os pacientes que praticavam mais de 150 minutos de atividade física por semana

apresentavam níveis de CT, LDL e HbA1c significativamente menores do que os indivíduos

sedentários e níveis de HbA1c significativamente menores do que aqueles pacientes que

praticavam menos de 150 minutos por semana, mostrando que um melhor estilo de vida, com

prática de exercício físico, está relacionado a um melhor controle glicêmico e lipêmico

(Colberg et al., 2010). Provavelmente, esses pacientes mais adeptos à prática de atividade

física têm uma melhor adesão global ao tratamento (dieta, uso das medicações etc), o que

também contribui para esse melhor controle metabólico.

Em relação ao controle glicêmico, não observamos diferença estatisticamente

significativa dos níveis de sRAGE entre os DM2 bem controlados (HbA1c <7%),

moderadamente descontrolados (HbA1c 7-9%) e gravemente descontrolados (HbA1c > 9%),

bem como não encontramos correlação entre a HbA1c e o sRAGE nesses pacientes,

concordando com vários trabalhos da literatura (Humpert et al., em 2007; Grossin et al., 2008;

Kanková et al., 2008; Yu et al., 2010; Motawi et al., 2013).

Um único estudo mostrou uma correlação positiva entre o sRAGE e HbA1c (Zeyada

et al., 2013). Nele, porém, o tamanho amostral foi pequeno (48 DM2 e 17 controles) e foram

incluídos pacientes com TFG abaixo de 60 ml/min. Notadamente, os pacientes com pior

controle glicêmico eram os que possuíam os maiores níveis de creatinina sérica. Ora, é sabido

que o sRAGE se eleva na disfunção renal por diminuição da sua depuração e que este

aumento é relacionado ao grau de disfunção (Kalousová et al., 2006; Kanková et al., 2008;

Gohda et al., 2008). Assim, os resultados encontrados neste trabalho em relação ao controle

glicêmico, provavelmente, refletiram a correlação inversa do sRAGE com a TFG e não, de

fato, uma correlação positiva do sRAGE com a HbA1c.

Outros estudos, por outro lado, sugerem uma associação inversa das formas solúveis

do RAGE com o controle glicêmico (Koyama et al., 2005; Devangelio et al., 2007). Possíveis

explicações para os níveis das formas solúveis do RAGE se encontrarem mais baixos em

condições de pior controle metabólico, onde presumivelmente há mais AGEs, seriam o maior

consumo ou a menor produção do sRAGE. Diante de um ambiente com maior quantidade de

AGEs (hiperglicemia) há um aumento da expressão do RAGE, visto que é auto-regulada pela

interação do RAGE com os seus ligantes (AGEs), por um mecanismo de feedback positivo

(Goldin et al., 2006; Lin, 2006; Ceriello, 2009). O aumento do RAGE possibilita um aumento

dos níveis do c-RAGE, já que esta isoforma solúvel é obtida através da clivagem proteolítica

da porção extracelular do RAGE tecidual (Raucci et al., 2008; Zhang et al., 2008). Apesar de

74

estar sendo mais produzido, o c-RAGE estaria também sendo mais consumido, através da sua

ligação com os AGEs em maior quantidade, explicando os níveis mais baixos do sRAGE

nessas condições, uma vez que o sRAGE dosado pelos ensaios comerciais disponíveis é a

forma livre. A outra possibilidade de redução dos níveis do sRAGE, a diminuição da sua

produção, pode refletir a inibição da produção do esRAGE, consequente à ativação do RAGE

através da ligação com os AGEs. Essa inibição da produção da variante esRAGE ocorreria,

segundo Santilli et al., como uma forma de auto-amplificar a resposta patogênica sem

nenhuma competição do RAGE com outros receptores para os seus ligantes (Santilli et al.,

2009).

Essas hipóteses, bem como a associação inversa entre sRAGE e HbA1c, são

reforçadas no trabalho de Devangelio et al., o qual constatou um aumento dos níveis de

sRAGE com a melhora do controle glicêmico (caracterizado pela redução da HbA1c) em 36

pacientes, após uso de ADO ou insulina. Nesse mesmo trabalho, foi verificado que a

diminuição do sRAGE, quando comparado aos controles, foi detectada já no início da história

natural da doença, como observado no grupo de pacientes diabéticos recém-diagnosticados, e

que não houve diferença nos níveis do sRAGE desses pacientes para os dos DM de longa

duração, sugerindo que essa redução do sRAGE sofre mais influência do controle metabólico

do que do tempo de duração da doença, por exemplo. Além disso, a inclusão no estudo apenas

de DM2 livres de complicações micro e macrovasculares possibilitou concluir que os baixos

níveis de sRAGE estavam correlacionados, de fato, com o descontrole glicêmico e não com

doença vascular associada ao diabetes (Devangelio et al., 2007).

Su et al também corroboram a idéia de redução das formas solúveis do RAGE por

consumo ou diminuição da produção, num ambiente de pior controle metabólico, ao

detectarem níveis diminuídos do sRAGE sérico em pacientes DM2, enquanto os AGEs

séricos e a expressão do RAGE em monócitos estão aumentados (Su et al., em 2011).

Quanto às complicações microvasculares (nefropatia e retinopatia diabéticas), não

encontramos diferença estatisticamente significativa nos níveis de sRAGE dos pacientes com

complicações em relação aos pacientes sem complicações. Na literatura, há apenas um estudo

semelhante ao nosso, o de Grossin et al., o qual também considerou a presença ou ausência

concomitante de retinopatia e nefropatia diabéticas para classificar o paciente como tendo ou

não complicações microvasculares do DM, respectivamente (Grossin et al., 2008). Neste

estudo, diferentemente do nosso, foi verificado que os pacientes com complicações

microvasculares apresentavam níveis plasmáticos do sRAGE significativamente menores que

75

aqueles sem complicações. Entretanto, os indivíduos com complicações tinham níveis de

glicemia (p<0,05) e HbA1c (p<0,01) mais elevados do que os pacientes sem complicações.

Logo, a diminuição do sRAGE nos DM com complicações pode estar relacionada com o

descontrole glicêmico e não à presença das complicações microvasculares. Além disso,

Grossin et al., não descreveram, dentre os seus critérios de exclusão, disfunção renal (elevada

concentração de creatinina sérica ou baixa TFG) e outras condições que podem influenciar

nos níveis do sRAGE como tabagismo, etilismo, doenças virais, doenças inflamatórias agudas

ou crônicas, as quais também podem ter interferido no resultado.

Da mesma forma, quando avaliamos separadamente a retinopatia e a nefropatia,

continuamos não encontrando diferença nos níveis de sRAGE entre os pacientes com e sem

essas condições, ou seja, entre os pacientes com e sem nefropatia e entre os pacientes com e

sem retinopatia. Os nossos resultados estão de acordo com os de Yu et al., em 2010, que não

encontraram correlação do sRAGE com albuminúria na fase inicial da nefropatia diabética, e

Yang et al., em 2013, que não viram diferença estatisticamente significativa no sRAGE entre

os DM2 com e os sem RD.

Por outro lado, todos os outros trabalhos que avaliaram a nefropatia diabética

encontraram níveis mais altos de sRAGE nos pacientes com a complicação em relação

àqueles que não a tinham, e uma associação positiva do sRAGE com albuminúria e

severidade da ND (Tan et al., 2006; Humpert et al., 2007; Kanková et al., 2008; Zeyada et al.,

2013). Estes trabalhos, entretanto, incluíram pacientes com TFG abaixo de 60 mL/min e até

mesmo indivíduos com doença renal terminal em hemodiálise, diferentemente do nosso

estudo e do estudo de Yu et al., cujos pacientes incluídos tinham uma TFG acima de 60 e 90

ml/min, respectivamente. Sendo assim, o aumento dos níveis de sRAGE de acordo com a

evolução da ND e o grau de albuminúria deve estar refletindo muito mais a TFG, pela

diminuição da filtração do sRAGE, do que o grau de albuminúria propriamente dito.

Reforçando essa idéia, Kanková et al. (2008) constataram, na análise de regressão

multivariada, que a TFG foi a única variável independente associada com sRAGE, sendo o

principal determinante das concentrações de sRAGE.

Em relação aos outros estudos relacionados à retinopatia diabética, dois deles

evidenciaram níveis mais elevados de sRAGE nos pacientes com a complicação quando

comparados aos pacientes sem, além de uma correlação positiva do sRAGE com a severidade

da RD (Kerkeni et al., 2012; Ng et al., 2013), enquanto um trabalho mostrou o contrário, ou

seja níveis mais baixos de sRAGE nos pacientes com retinopatia em relação aos pacientes

76

sem complicação, e uma correlação negativa do sRAGE com os estágios da RD. (Al-

Mesallamy et al., 2011).

Assim como nos estudos acima sobre nefropatia, os resultados de Kerkeni et al.

também podem ter sofrido influência da depuração renal, já que eles, possivelmente,

incluíram pacientes com TFG abaixo de 60 ml/mim (considerando as médias da idade e da

creatinina sérica dos pacientes do estudo), e viram uma correlação positiva do sRAGE com a

creatinina sérica. Corroborando isso, eles demonstraram que a pentosidina, um AGE, foi um

fator independente associado com severidade da RD e que este aumento poderia estar

refletindo a diminuição da TFG, uma vez que a insuficiência renal é um dos principais

determinantes da pentosidina sérica. Logo, se o aumento da pentosidina pode estar associado

à diminuição da TFG, o aumento do sRAGE também pode estar.

Ng et al. (2013), por sua vez, incluíram pacientes tabagistas no estudo, os quais se

encontravam em número significativamente maior no grupo de pacientes sem complicações.

Sendo o tabagismo uma das principais fontes externas de AGEs, podemos aventar que essas

substâncias poderiam estar em maior quantidade no grupo de pacientes sem complicações, e

os níveis de sRAGE poderiam estar mais baixos consequente a um maior consumo devido à

ligação aos AGEs em maior quantidade.

Já os resultados de Al-Mesallamy et al. (2011) poderiam ser explicados levando-se em

consideração as hipóteses que discorremos quando abordamos o controle glicêmico, as quais

sugerem diminuição do sRAGE por consumo ou menor produção num ambiente de

descontrole metabólico (aumento de AGEs), pressupondo que os pacientes com complicações

estejam diante de um cenário de pior controle metabólico, e assim, mais AGEs. No entanto,

diferentemente dos estudos que sugerem uma correlação negativa do sRAGE com os AGEs

(Forbes et al., 2005; Grossin et al., 2008; Su et al., 2011), outros trabalhos, como o de Yu et

al., mostram uma correlação positiva entre essas variáveis (Tan et al., 2006; Kanková et al.,

2008; Yu et al., 2010; Kerkeni et al., 2012; Ng et al., 2013). Essa diferença poderia

provavelmente estar relacionada ao curso e à gravidade das complicações microvasculares, já

que as complicações não retratam, necessariamente, alterações pontuais, diferentemente de

quando se avalia o controle glicêmico. Dessa forma, indivíduos diabéticos na fase inicial das

complicações microvasculares, como ocorre no estudo de Yu et al. (2010), seriam capazes de

aumentar a produção de sRAGE compensatoriamente à formação de AGE induzida pela

hiperglicemia (aumento da produção maior que o do consumo: níveis de sRAGE poderiam

estar até aumentados). Com o acúmulo irreversível de AGE e o agravamento das

77

complicações microvasculares, a produção de sRAGE se tornaria, provavelmente, insuficiente

para tentar neutralizar o excesso de AGEs (aumento do consumo maior que o da produção:

níveis de sRAGE reduzidos). Logo, essa poderia ser uma outra possível explicação para os

níveis de sRAGE mais elevados nos pacientes com complicações, como foi visto em alguns

trabalhos anteriormente citados, bem como, também explicaria os resultados do nosso

trabalho e daqueles que não encontraram diferença dos níveis de sRAGE entre os pacientes

com e sem complicações, visto que entre um extremo e outro da balança produção versus

consumo, podemos ter o equilíbrio.

Não podemos esquecer a existência dos outros mecanismos fisiopatológicos que

participam da gênese das complicações crônicas do DM2, tais como o aumento do fluxo da

via do poliol, a ativação da proteína quinase C (PKC), o aumento do fluxo da via da

hexosamina e o aumento do estresse oxidativo (Brownlee, 2001). Não sabemos se existe

diferença interindividual em relação à predominância desses mecanismos, o que poderia

explicar a diferença no desenvolvimento das complicações microvasculares em indivíduos

com mesmo nível de sRAGE. Assim, apesar da capacidade de resposta do sRAGE na

tentativa de proteger o organismo das agressões que levam às complicações, os outros

mecanismos estariam atuando de forma distinta entre os indivíduos e por isso uns

desenvolveriam mais complicações do que outros. Da mesma forma, não podemos ignorar a

presença dos outros receptores de superfície celular (AGE-R1, AGE-R2, AGE-R3, receptores

scavenger de macrófagos classe A tipo I e II, receptores scavenger classe B tipo I, os

receptores scavenger classe E, LOX-1, fasciclina, FEEL-1 e FEEL-2, EGF e LE) com

capacidade de ligação aos AGEs, mas que, diferentemente do RAGE, atuam como

detoxificadores desses compostos, eliminando-os da circulação (Stitt et al., 1997; Chen et al.,

2001; Jono et al., 2002; Bucciarelli et al., 2002a; Tamura et al., 2003). É desconhecido se há

uma diferença na quantidade e distribuição desses receptores entre as pessoas, o que também

poderia justificar a desigualdade na geração das complicações entre os indivíduos com níveis

de sRAGE semelhantes.

Em suma, diante do que foi exposto, supomos que em condições de aumento dos

AGEs (hiperglicemia) o organismo responda com aumento da produção das formas solúveis,

possivelmente com predomínio da isoforma c-RAGE, considerando que é oriunda da

clivagem do RAGE, o qual está aumentado nessas situações. Dependendo do grau de

consumo do sRAGE (ligação aos AGEs), os seus níveis dosados (parcela livre de AGEs)

podem estar aumentados ou até mesmo não apresentarem diferença significativa em relação

78

aos pacientes em condições de melhor controle metabólico. Com a persistência e agravamento

do acúmulo de AGEs, a capacidade de produção das formas solúveis do RAGE chega ao

limite, não conseguindo mais aumentar a concentração do sRAGE na tentativa de neutralizar

os AGEs. Nesse momento, o aumento do consumo do sRAGE supera o da sua produção, e

isso reflete em níveis de sRAGE dosados mais baixos quando comparados aos dos indivíduos

com melhor controle metabólico. Com a persistência da agressão, o consumo do sRAGE

também atinge o seu limite, não sendo capaz de neutralizar adequadamente os AGEs em

excesso, que sobram em grande quantidade para se ligarem aos RAGEs, culminando, assim,

nas complicações crônicas do DM2.

Em relação às outras variáveis, não encontramos diferença significativa nos níveis de

sRAGE entre os sexos e etnias, bem como de acordo com a presença ou ausência de

hipertensão arterial sistêmica, dislipidemia, obesidade e realização de atividade física.

Também não observamos correlação entre sRAGE e tempo de DM, idade, IMC, CA, RCQ,

PA sistólica, PA diastólica, CT, LDL, HDL, TG e medicações usadas pelos pacientes (IECA,

tiazolidinedionas, estatinas, glimepirida, nifedipina, BRA, insulina, AAS, metformina).

Os trabalhos de Grossin et al., Devangelio et al. e Yu et al., assim como o nosso, não

encontraram correlação estatística entre os níveis plasmáticos de sRAGE e IMC (Grossin et

al., 2008; Devangelio et al., 2007, Yu et al., 2010), diferentemente dos demais trabalhos que

encontraram uma correlação inversa entre essas variáveis (Koyama et al., 2005; Norata et

al.,2009; Su et al., 2011). Brix et al. confirmaram esta associação negativa através de um

estudo prospectivo, que mostrou níveis de sRAGE mais baixos em obesos grau III em

comparação com os controles não-obesos e um aumento desses níveis plasmáticos de sRAGE

nesses indivíduos após a perda de peso induzida pela cirurgia bariátrica (Brix et al., 2012).

Quanto à atividade física, apesar do nosso trabalho não ter observado diferença nos

níveis de sRAGE entre os pacientes sedentários, os que praticavam menos de 150 minutos por

semana de exercício físico e os que praticavam mais de 150 minutos por semana, Choi et al.,

num estudo prospectivo, viram que o exercício aeróbico aumentava os níveis circulantes do

RAGE solúvel em pacientes com DM2. Nele, os DM2 submetidos a 60 minutos de

caminhada, em intensidade moderada, cinco vezes por semana, durante 12 semanas, tiveram

seus níveis de sRAGE aumentados, o que não foi observado no grupo controle (atividade

habitual de menos de 20 minutos de exercícios por semana) [Choi et al., 2012]. Além do

desenho do estudo ser diferente do nosso, eles consideraram, para a avaliação dos pacientes, o

dobro do tempo de atividade física que consideramos nosso (300 minutos por semana versus

79

150 minutos por semana), o que pode ter influenciado os resultados encontrados. Ademais,

isso nos permite cogitar a possibilidade de encontrarmos diferença nos valores do sRAGE

entre os grupos dos pacientes, caso consideremos um ponto de corte, para quantificação da

atividade física, mais alto do que 150 minutos por semana.

Uma limitação do nosso estudo foi o fato de não termos considerado a neuropatia

diabética, e sim apenas a retinopatia e a nefropatia diabéticas, para classificar os indivíduos

em portadores ou não de complicações microvasculares do DM2. Logo, podemos ter incluído

indivíduos com neuropatia no grupo de pacientes sem complicações, o que pode ter

interferido nos resultados encontrados. A neuropatia diabética, entretanto, é um diagnóstico

de exclusão, já que neuropatias não-diabéticas podem estar presentes em pacientes com DM, e

para isso é necessário excluir quadros neurológicos relacionados às deficiências vitamínicas

(vitamina B12 e do complexo B), outras doenças endócrinas e metabólicas (hipotireoidismo,

doença renal crônica, amiloidose), doenças infecciosas (herpes zoster, vírus da

imunodeficiência humana, sífilis, hanseníase), doenças do sistema imunológico (gamopatias e

mieloma), quadros inflamatórios (síndromes paraneoplásicas, doença reumática), condições

hereditárias (síndrome de Charcot-Marie-Tooth), intoxicações (metais pesados, como chumbo

e ouro), medicamentos (isoniazida, nitrofurantoína, dissulfiram, vincristina e outros

quimioterápicos), álcool e síndrome de compressão neural (Vinik et al., 2005; Vinik et al.,

2010 Brownlee et al., 2011; American Diabetes Association – ADA, 2016). Para tanto, em

nível de estudo científico, seria imprescindível uma avaliação criteriosa para a confirmação da

etiologia da neuropatia, com a realização de diversos exames complementares, inclusive, o

que prolongaria consideravelmente o tempo da pesquisa, bem como oneraria em demasia o

estudo, tornando-o, provavelmente, inviável.

Uma outra possível limitação do estudo foi não termos rastreado doença

macrovascular nos pacientes. No entanto, o rastreamento não foi realizado, pois esse não era o

foco do nosso trabalho. Consideramos como presença de complicação macrovascular uma

história documentada de evento cardio ou cerebrovascular ou de amputação não-traumática de

membro e/ou a existência de diagnóstico de doença coronariana, carotídea ou arterial

periférica através de método complementar pertinente (cateterismo cardíaco, teste

ergométrico, cintilografia cardíaca, Doppler arterial). Todavia, aqueles pacientes sem história

ou investigação prévia não foram submetidos à avaliação com exames complementares para

esse fim. Consequentemente, não sabemos se a distribuição entre os grupos em relação à

doença macrovascular é, de fato, homogênea, como encontramos, ou se há uma distribuição

80

heterogênea entre os grupos, influenciando os resultados do trabalho, mas não conseguimos

visualizá-la devido a um menor número de pacientes diagnosticados em razão da falta de

rastreamento.

Por outro lado, podemos considerar como ponto positivo do nosso estudo,

diferentemente da maioria dos estudos existentes na literatura, a seleção criteriosa dos

pacientes que foram incluídos na pesquisa. Ao sermos meticulosos com os critérios de

exclusão do estudo, excluindo inúmeras condições que poderiam influenciar nos níveis de

sRAGE, aumentamos a validade dos nossos resultados e a força do nosso estudo.

Os conhecimentos teóricos sobre a funcionalidade das formas solúveis do RAGE, bem

como os estudos em modelos animal e in vitro, que demonstram a capacidade do sRAGE

recombinante bloquear o desenvolvimento e a progressão de diversos estados patológicos,

como DM e suas complicações micro e macrovasculares, doença cardiovascular, disfunções

neurais e câncer, por exemplo (Wautier et al., 1996; Park et al.,1998; Goova et al., 2001;

Bucciarelli et al., 2002b; Chen et al., 2004; Lanati et al., 2010), sugerem fortemente que o

sRAGE exerce um papel protetor no organismo. Entretanto, as disparidades entre os estudos

clínicos anteriormente descritos não demonstram isso com clareza, possivelmente devido ao

desenho dos estudos e outros fatores de interferência (TFG, tabagismo, outros mecanismos

patogênicos de geração das complicações do DM, outros receptores de superfície celular com

“função protetora” etc). São necessários, então, estudos futuros, longitudinais prospectivos,

para confirmar esse papel protetor do sRAGE, assim como para melhor elucidar a regulação

dos mecanismos envolvidos na produção das isoformas solúveis do RAGE e a relação de

causa-efeito entre os níveis séricos do sRAGE e as complicações crônicas do DM2. O

seguimento, ao longo do tempo, de pacientes DM2 recém-diagnosticados, mantidos sob

condições semelhantes de controles glicêmico, pressórico, lipêmico, etc..., e expostos a uma

mesma dieta, com quantidade de AGEs conhecida, ajudaria no esclarecimento dessas

questões. Assim, a constatação de uma resposta do sRAGE diferente entre esses indivíduos

sujeitos a uma mesma agressão (quantidade de AGEs semelhantes), justificaria o fato de uns

desenvolverem complicações do DM ao longo do tempo e outros não. Por outro lado, a

verificação de uma capacidade de resposta semelhante entre esses indivíduos, indicaria que o

desenvolvimento das complicações crônicas do DM, no decorrer da evolução da doença, em

uns pacientes e não em outros, seria consequente ao aumento da agressão (AGEs) ao longo do

tempo, que superaria a capacidade de resposta do sRAGE (produção e consumo), ou seria à

custa da dominância de alguma outra via patogênica envolvida na gênese das complicações do

81

DM (via do poliol, via da proteína quinase C, via da hexosamina, estresse oxidativo). Nesse

sentido, também é importante a realização de estudos adicionais visando compreender melhor

se há variação individual da coparticipação dos demais mecanismos fisiopatológicos

envolvidos no desenvolvimento e progressão das complicações crônicas do DM, bem como

dos receptores de superfície celular que atuam como detoxificadores de AGEs. Por

conseguinte, o entendimento de todos esses pontos é de grande relevância, pois poderá

contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o DM2 e suas

complicações crônicas, como também para várias outras doenças.

82

8 CONCLUSÕES

O presente estudo não encontrou diferença estatisticamente significativa nos níveis de

sRAGE entre os pacientes DM2 com e sem complicações microvasculares da doença

(nefropatia e retinopatia), bem como não observou correlação do sRAGE com o controle

glicêmico e outras variáveis, como idade, sexo, uso de medicamentos, dislipidemia,

hipertensão arterial sistêmica e obesidade.

83

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98

10 ANEXOS

ANEXO 10.1 - CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

99

ANEXO 10.2 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Dados de identificação

Título do Projeto: Marcadores Genéticos de Ativação do Receptor de AGEs, Estresse Oxidativo e Formas Solúveis do

RAGE no Diabetes Mellitus Tipo 2.

Pesquisador Responsável: Dra. Giselle Fernandes Taboada.

Instituição a que pertence o Pesquisador Responsável: Universidade Federal Fluminense (UFF)

Telefone para contato: (21) 2629-9270 (serviço de endocrinologia do HUAP).

Nome do voluntário: _______________________________________________________________

Idade: ____________ anos R.G.: ______________________________________________

Você está sendo convidado a participar do estudo “Marcadores Genéticos de Ativação do Receptor de AGEs, Estresse Oxidativo e Formas Solúveis do RAGE no Diabetes Mellitus Tipo 2.”. Trata-se do projeto de pesquisa do Dr. Kléber Luiz de Araújo e Souza e um grupo de pesquisadores da UFRJ, UERJ, Unigranrio e UFF, envolvendo a Dra. Christiane de Oliveira Bensusan sob orientação da Dra. Giselle Fernandes Taboada.

INTRODUÇÃO:

O diabetes tipo 2 mal controlado pode gerar complicações, como problemas no coração (infarto), no cérebro (derrame), nas pernas e pés (risco de amputações), nos rins (falência dos rins) e nos olhos (cegueira). Uma parte dessas complicações provavelmente acontece por causa de substâncias que são formadas em maior quantidade no corpo quando a glicose do sangue está aumentada. Por isso, é tão importante controlar a glicose no sangue: para evitar que as complicações do diabetes aconteçam.

Nesse estudo, será colhido sangue de pacientes com diabetes tipo 2 e de pessoas sem diabetes. Serão então medidas algumas substâncias que ajudam a proteger o seu corpo das complicações do diabetes, além de outros experimentos em laboratório realizados com uma parte do sangue chamada soro.

PROCEDIMENTOS:

Você será entrevistado (como numa consulta médica normal no Ambulatório de Endocrinologia do HUAP), e seu sangue será colhido (como em um exame de sangue normal).

RISCOS E DESCONFORTOS:

Os desconfortos possíveis do exame de sangue são dor, pequeno sangramento ou “mancha roxa” no local, como em qualquer exame de sangue.

BENEFÍCIOS:

Não há nenhum benefício para você pela participação no estudo. Mas você estará contribuindo para que os conhecimentos sobre o diabetes tipo 2 aumentem.

Universidade Federal Fluminense

Hospital Universitário Antônio Pedro

100

CUSTOS:

Você não receberá nenhum dinheiro, nem gastará seu dinheiro para participar dessa pesquisa.

SIGILO:

As suas informações, que são sigilosas, serão analisadas junto com as informações dos outros pacientes. Sua identificação não será divulgada.

A avaliação dos resultados dos exames será feita somente pelos pesquisadores do projeto, e pelos profissionais da saúde que atendem ou cuidam de você, e não será permitido o acesso de outras pessoas, garantindo proteção contra qualquer quebra de sigilo.

LIBERDADE DO PACIENTE:

É garantida a liberdade de querer não participar do projeto de pesquisa ou de retirar o consentimento a qualquer momento, no caso da aceitação, sem qualquer prejuízo ao seu tratamento no HUAP.

Em qualquer etapa do estudo você terá acesso à profissional responsável (Dra. Giselle Fernandes Taboada), que poderá ser encontrada no telefone (21) 2629-9270 do serviço de endocrinologia. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Prédio Anexo do HUAP – 4º andar, telefone 2629-9189 – email: etica@vm.uff.br

Acredito ter sido bem informado sobre o estudo acima.

Eu discuti com a Dra. Giselle Fernandes Taboada ou com a Dra. Christiane de Oliveira Bensusan sobre a minha decisão de participar do estudo. Ficaram claros para mim quais são os objetivos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimento permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas, que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar quando necessário, e que poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido ou no meu atendimento nesta Instituição.

Eu, _____________________________________________, RG no _____________________ declaro ter sido informado e

concordo em participar, como voluntário, do projeto de pesquisa acima descrito.

Niterói, _____ de ________________ de _________

______________________________________________________________________________

Nome e assinatura do paciente

________________________________________________________________________________

Testemunha

Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou

representante legal para a participação neste estudo.

Nome do pesquisador ________________________________________________________________

Assinatura do pesquisador: ______________________________________ Data: _______________

101

ANEXO 10.3 - FICHA DE COLETA DE DADOS

FICHA DOS PACIENTES COM DIABETES TIPO 2 - HUAP Data: _____/_____/2013

Nome:__________________________________________Prontuário:__________Tel: ________________

Idade: ___________ Sexo: ( ) F ( ) M Cor: _____________ Estado civil: _________________________

Escolaridade: ____________________ Profissão: ______________________________________________ Local de nascimento:______________________ Local de moradia: _______________________________

Medicamento Não Sim Nome do Medicamento Dose Tempo

Estatina meses

Glitazona meses

Sulfoniluréia meses

IECA meses

BRA meses

Insulina meses

Metformina meses

meses

meses

meses

meses

meses

Exercício físico: ( ) < 150 min/semana ( ) > 150 min/semana

Fuma? ( ) Nunca ( ) Já fumou, mas parou há _______(anos) ( ) Fuma: ___________________________

Doenças - Diabetes Tipo 2 diagnosticado há _____anos

Não Sim Não Sim Não Sim

Retinopatia Fez laser? Microalbuminúria

Neuropatia IAM / DAC Rev. Miocárdica / PTCA

IRC AVE Doença carotídea

Amputação D. arterial perifér. Claudicação intermitente

HAS: ( )Não ( )Sim Há _____ anos Dislipidemia: ( ) Não ( ) Sim Há _____anos

Outras doenças: _________________________________________________________________________

Últimos resultados de exames (colocar datas):

GJ: _______mg/dL (___/___/___) HbA1c: _______% (___/___/___) ( ) <7 % ( ) 7 a 9 % ( ) > 9%

CT: _____________ LDL: _____________ HDL: ___________ Tg: ____________ (___/___/___) Uréia: _____________ Creatinina:___________________ (___/___/___)

Urina – microalbuminúria: __________________ Razão albumina/creatinina: _____________________

Altura: _______ m Peso:______ kg IMC: ________ ( ) Normal ( ) Sobrepeso ( ) Obeso grau ___

Cintura: ______ cm Quadril: ________ cm Relação cintura / quadril: __________

Pressão arterial – Medida 1: ________________ mmHg Medida 2: ____________________ mmHg

Paciente com hemoglobina glicada: _________ e ( ) com ( ) sem complicações. Grupo: _____

Resultado sRAGE: __________________________