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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA

APLICADAS

ROBSON DOS SANTOS SOUZA MARINHO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI ZIKA VÍRUS DE SUBSTÂNCIAS NATURAIS

OBTIDAS DE ALGAS MARINHAS E DA SEMENTE DE URUCUM

Niterói, RJ

2018

II




Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Virologia

; Orientadora: Profª Drª Ana Maria Viana Pinto

Niterói, RJ

2018

III




Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Virologia

Aprovado em: ___ de __________ de 20___.

BANCA EXAMINADORA

Prof.ª Dr.ª Adriana de Abreu Corrêa – (UFF)

Prof.ª Dr.ª Diana Negrão Cavalcanti – (UFF)

Dr.ª Vanessa Salete de Paula – (IOC/FIOCRUZ)

Niterói, RJ

2018

IV

Dedico este trabalho, em especial, à minha família.

V

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus e aos meus guias espirituais.

A minha família, em especial minha mãe e minha avó, por todo o apoio, toda a ajuda

e incentivo que sempre me deram.

A Profª Drª Ana Pinto, minha orientadora, amiga e mãe adotiva por toda ajuda, carinho

e ensinamentos.

Aos meus companheiros de Laboratório Bruna, Priscila, Stephanie, Kátia, Wilker, Ana

Cláudia, Ingrid, Fernanda, Laís, Letícia, Arthur, Carol e Maria Clara.

Aos meus amigos Cinthya Domingues, Juliana Dias, Joylson Pereira e Magda

Antonele pelos bons momentos.

Ao Programa de Pós Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas pela

oportunidade de estudo.

A todos os professores do MIP, em especial aos da disciplina de Virologia.

A equipe do Laboratório de Virologia Molecular e Biotecnologia Marinha, em especial

Profª Drª Izabel Paixão, pelo carinho que sempre teve comigo, e à Rafaela, Max,

Leonise, Cláudio Cirne, Caroline, Valéria, Vinícius, Kaue, Leonardo, Thiago e

Aldenise.

Ao prof. Dr. Davis Fernandes Ferreira do Departamento de Virologia do

Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, por

ter cedido gentilmente a amostra de ZIKV para realização dessa dissertação.

A todos do Laboratório de Produtos Naturais de Algas Marinhas (ALGAMAR), em

especial as alunas Carol e Marcela, orientadas da professora Drª Diana Cavalcanti e

ao aluno José Brito, orientado da professora Drª Valéria Teixeira por nos fornecerem

as substâncias que permitiram a realização deste trabalho.

A todos do Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental (LVCA), Instituto Oswaldo

Cruz (IOC)/Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo carinho, atenção que sempre

tiverem comigo durante esses anos. Agradeço, especialmente, ao Dr Tulio Machado

Fumian, pela ajuda na construção do gblock utilizado nessa dissertação.

A equipe do Laboratório de Flavivírus, IOC/FIOCRUZ, em especial a Dra. Ana Maria

Bispo de Filippis, pelas doações de materiais.

A equipe do Laboratório de Vírus Respiratório e Sarampo da Fiocruz, em especial Dra.

Marilda Siqueira por doações de materiais de utilizado nesse trabalho.

VI

A Profª Drª Carmen Baur que gentilmente aceitou revisar minha dissertação.

Aos funcionários do Instituto Biomédico, em especial aos do MIP, Janaína, Joana,

Ana, Beth, Serginho, Laura, Simone, Lúcia e Romulo por terem sido sempre

atenciosos comigo.

A Capes, pela concessão da bolsa.

Aos membros da banca por avaliarem e melhorarem a qualidade deste trabalho.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.

Muito obrigado!

VII

RESUMO

O Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus emergente transmitido principalmente por vetores

do gênero Aedes spp., pelas vias sexuais e congênitas. A febre do Zika ganhou

destaque em 2015, quando atingiu proporções epidêmicas na América Central e do

Sul e foi associada a um importante aumento no número de casos de doenças

congênitas e desordens neurológicas no Brasil. Ainda não existe uma vacina contra o

vírus e nem drogas eficientes no tratamento. Nessa perspectiva, o presente trabalho

teve por objetivo avaliar a citotoxicidade e a atividade anti ZIKV de substâncias

naturais obtidas de algas marinhas (caulerpina e diterpeno 10,18-diacetoxy-8-

hydroxy-2,6-dolabelladiene) e da semente de urucum (geranilgeraniol). A avaliação

da citotoxicidade (CC50) foi realizada em diferentes células (Vero, HEK 293 eC6/36)

por três metodologias diferentes: 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium

bromide (MTT), vermelho neutro (VN) e cristal violeta (CV). A avaliação da atividade

antiviral in vitro foi realizada em célula Vero e determinada pela inibição da produção

de virion pela técnica de Reed Müechen e pela inibição da produção de genoma viral

pela técnica de One-Step RT-qPCR. A caulerpina e o diterpeno não foram citotóxicos

para as células testadas, diferente do geranilgeraniol que foi citotóxico para as três

linhagens celulares. Com base na diferença entre o título viral do controle não tratado

com o título viral da amostra tratada com concentrações diferentes das substâncias

pôde-se observar que as três moléculas reduziram o título viral, bloqueando a

produção de virions. As três substâncias não apresentaram atividade inibitória na

síntese de genoma viral. Assim, verificamos que a caulerpina, o 10,18-diacetoxy-8-

hydroxy-2,6-dolabelladiene e o geranilgeraniol não bloqueiam a produção de genoma

viral, mas bloqueiam a produção de virions possivelmente por outros mecanismos de

ação. Em função do geranilgeraniol ser mais citotóxico, especulamos as substâncias

caulerpina e diterpeno 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene como mais

promissoras para um possível tratamento anti ZIKV.

Palavras-chave: zika vírus, caulerpina, diterpeno, geranilgeraniol, atividade antiviral.

VIII

ABSTRACT

The Zika virus (ZIKV) is an emergent arbovirus transmitted mainly by vectors of the

genus Aedes spp., by the sexual and congenital routes. Zika fever became prominent

in 2015 when it reached epidemic proportions in Central and South America and was

associated with a significant increase in the number of cases of congenital diseases

and neurological disorders in Brazil. There is as yet no viral vaccine or treatment-

effective drugs. In this perspective, the present work aimed to evaluate the cytotoxicity

and anti ZIKV activity of natural substances obtained from seaweed (caulerpine and

diterpene 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene) and annatto seed

(geranilgeraniol ). Cytotoxicity evaluation (CC50) was performed in three different cells

(Vero, HEK 293 and C6/36) by three different methodologies: 3- (4,5-dimethylthiazol-

2yl) -2,5diphenyl tetrazolium bromide (MTT), neutral red ) and violet crystal (CV). The

evaluation of the antiviralin vitro activity was performed in Vero cell and determined by

the inhibition of virion production by the Reed Müechen technique and by the inhibition

of the viral genome production by the technique of One-Step RT-qPCR. Caulerpine

and diterpene were not cytotoxic to the tested cells, unlike geranilgeraniol that was

cytotoxic to the three cell lines. Based on the difference between the viral titer of the

control not treated with the viral titer of the sample treated with different concentrations

of the substances, it was observed that the three molecules significantly reduced the

viral titer, blocking the production of virions. The three substances showed no inhibitory

activity in viral genome synthesis. Thus, we find that caulerpine, diterpene 10,18-

diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene and geranylgeraniol do not block viral genome

production but block viral production possibly by other mechanisms of action. Because

geranilgeraniol is more cytotoxic, we speculate the substances caulerpine and

diterpene 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene as more promising for a

possible anti ZIKV treatment.

Key words: zika virus, caulerpine, diterpene, geranilgeraniol, antiviral activity.

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema representativo da organização genômica dos flavivírus .......... - 2 -

Figura 2: Representação esquemática do ciclo de replicação dos flavivírus ......... - 5 -

Figura 3: Estrutura do Zika vírus (ZIKV) ................................................................. - 7 -

Figura 4: Esquema representativo das formas imaturas e maduras do Zika vírus . - 7 -

Figura 5: Esquema da organização genômica do ZIKV. ........................................ - 8 -

Figura 6: Formas de transmissão do ZIKV ........................................................... - 10 -

Figura 7: Sequência da curva sintética padrão utilizada no protocolo de One-Step RT-

qPCR. ................................................................................................................... - 36 -

Figura 8: Estrutura da caulerpina (CAV) e do diterpeno (DIP) ............................. - 38 -

Figura 9: Estrutura do geranilgeraniol (GE). ......................................................... - 39 -

Figura 10: Microscopia óptica. (1) Controle de células Vero. (2) Presença de Efeito

Citopático (lise total) em amplificação da amostra ZIKVMR766. .......................... - 43 -

Figura 11: Gráfico de amplificação da curva padrão sintética estabelecido pelo

programa Step One v2.3®. .................................................................................. - 44 -

Figura 12: Paramêtros de qualidade da curva padrão sintética ........................... - 45 -

Figura 13: Gráfico de amplificação da curva padrão sintética nas concentrações 107,

106, 104 e 102 cópias/µL estabelecido pelo programa Step One v2.3®. .............. - 46 -

Figura 14: Parâmetros de qualidade da curva padrão sintética para quantificação de

Zika vírus. ............................................................................................................. - 47 -

Figura 15: Curva de amplificação da amostra estoque de Zika vírus ................... - 47 -

Figura 16: Atividade antiviral da CAV e do DIP pela técnica de Reed Müench. .. - 50 -

Figura 17: Curvas de amplificação do One-Step RT-qPCR para avaliação da atividade

anti ZIKV da CAV e do DIP .................................................................................. - 52 -

Figura 18: Atividade antiviral da CAV e do DIP pela técnica One-Step RT-qPCR.- 53 -

Figura 19: Atividade antiviral do GE pela técnica de Reed Müench. .................... - 56 -

Figura 20: Curvas de amplificação do One-Step RT-qPCR para avaliação da atividade

anti ZIKV do GE ................................................................................................... - 57 -

Figura 21: Atividade antiviral do GE pela técnica One-Step RT-qPCR. ............... - 58 -

Figura 22: Esquema representativo da técnica Reed Müench. ............................ - 87 -

X

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Iniciadores e sonda utilizados na One-Step RTqPCR .........................- 35 -

Quadro 2: Composição de reagentes utilizados na One-Step RTqPCR...............- 37 -

Quadro 3: Condições de amplificação utilizadas na One-Step RT-qPCR............. - 37 -

Quadro 4: Média e Desvio Padrão (DP) do Cycle Threshold (Ct) em relação às

concentrações da curva padrão sintética testadas ............................................... - 46 -

Quadro 5: Cálculo para determinação do título por TCID50/mL. .......................... - 88 -

XI

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Efeitos citotóxicos da CAV e do DIP. .................................................... - 48 -

Tabela 2: Atividade anti ZIKV por Reed Müechen e índices de seletividades (IS) da

CAV e do DIP. ...................................................................................................... - 49 -

Tabela 3: Quantificação de virion total da amostra controle não tratada e virion residual

total em amostra tratada com CAV e DIP. ........................................................... - 51 -

Tabela 4: Quantificação do RNA total da amostra controle não tratada e RNA residual

total em amostra tratada com CAV e o DIP.......................................................... - 54 -

Tabela 5: Efeitos citotóxicos do GE ...................................................................... - 55 -

Tabela 6: : Atividade anti ZIKV do GE por Reed Müechen e índices de seletividade

(IS) em células Vero. ............................................................................................ - 56 -

Tabela 7: Quantificação de virion total da amostra controle não tratada e virion residual

total em amostra tratada com GE ......................................................................... - 57 -

Tabela 8: Quantificação do RNA total da amostra controle não tratada e RNA residual

total em amostra tratada com GE ......................................................................... - 58 -

XII

LISTA DE ABREVIATURAS

µM - Micromolar

Algamar - Laboratório de Produtos Naturais de Algas Marinhas

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BVDV - Vírus da Diarréia Viral Bovina (do inglês Bovine Viral Diarrhea Virus)

BDV - Vírus da Doença da Fronteira (do inglês Border DiseaseVirus)

C – Capsídeo

CAV - Caulerpina

CC - Cultura Celular

CC50 - Concentração de substância capaz de matar 50% das células

CDC - Centro de Controle e Prevenção de Doenças (do inglês Centers for Disease

Control and Prevention)

CIVD – Diagnósticos In Vitro europeu

CG - Cópias Genômicas

CHIKV – Vírus Chikungunya (do inglês Chikungunya Virus),

CPE - Efeito Citopático (do inglês Cytopathic Effect)

CSFV - Vírus da Febre Suína Clássica (do inglês Classical Swine Fever Virus)

Ct -Cycle Threshold

CV - Cristal Violeta

D-MEM - Meio Mínimo Essencial de Eagle’s modificado por Dulbecco

DC-SIGN - Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-

integrin

DENV - Vírus da Dengue (do inglês Dengue Virus)

DIP - Diterpeno 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene

DMSO - Dimetilsulfóxido

DO - Densidade ótica

DP - Distância Proporcional

ECDC - Centro Europeu de Prevenção e Controle de Doenças (do inglêsEuropean

Centre for Disease Prevention and Control)

EC50 - Concentração de substância capaz de inibir 50% a produção de partículas virais

ECDC - Centro Europeu de Prevenção e Controle de Doenças (do inglês European

Centre for Disease Prevention and Control)

XIII

ECP - Efeito Citopático

EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético (do inglês Ethylenediamine tetraacetic

acid)

EUA – Estados Unidos da América

FDA – Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos(do inglês U.S. Food

& Drug Administration)

HCV – Vírus da Hepatite C (do inglês Hepatitis C Virus)

HIV – Vírus da Imunodeficiência Human (do inglês Human Immunodeficiency Virus)

HEK 293 – Célula de Rim de Embrião Humano (do inglê Human Embryonic

Kidney 293 cells)

HSV - Herpesvírus simples (do inglês Herpes simplex vírus)

IgM – Imunoglobulina M

IgG – Imunoglobulina G

ICTV - Comitê internacional de taxonomia viral (do inglês International Committee on

Taxonomy of Viruses)

IFA - Ensaio de imunofluorescência (do inglês Immunofluorescence Assay)

IS - Índice de Seletividade

JEV - Vírus da encefalite japonesa (do inglês Japanese encephalitis virus)

kb – quilo bases

kDa – quilo Dalton

L-15- Leibovitz 15

MDBK - Madin-Darby bovine kidney

MOI - Multiplicidade de Infecção (do inglês Multiplicity of Infection)

MR766 - Macaco Rhesus 766

MTT - Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2il) -2,5difenil tetrazólio (do inglês 3-(4,5-

dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide)

MVEV - Vírus da encefalite de Murray Valley (do inglês Murray Valley encephalitis

virus)

NPHV - Hepacivírus não primata (do inglês Non-Primate Hepacivirus)

NS - Não Estrutural (do inglês Non Structural)

nt - Nucleotídeo

NTAV - Vírus Ntaya (do inglês Ntaya Virus)

NTC - No Template Control

XIV

OMS - Organização Mundial de Saúde (do inglês WHO – World Health Organization)

OPAS - Organização Pan-Americana de Saúde (do inglês Pan American Health

Organization, PAHO)

ORF - Fase aberta de Leitura (do inglês Open Reading Frame)

P.F.U - Unidade Formadora de Placa (do inglês Plaque-Forming Unit)

PM – Proteína de Matriz

PrM - Proteína pecursora da proteína de Matriz

PCR - Reação em Cadeia pela Polimerase (do inglês Polymerase Chain Reaction)

p.i.– pós infecção

PRNT - Teste de Neutralização por Redução de Placas (do inglês Plate Reduction

Neutralization Test)

qPCR - PCR em Tempo Real

qRT-PCR - PCR em Tempo Real precedido por Transcrição Reversa

RMN – Ressonância Magnética Nuclear

RNA - Ácido Ribonucléico (do inglês Ribonucleic Acid)

RNAfs - RNA de fita simples

RpRd - RNA polimerase RNA dependente

RT - Transcrição Reversa (do inglês Reverse Transcription)

RT-PCR - Reação em Cadeia pela Polimerase Precedida por Transcrição Reversa (do

inglês Reverse Transcription-PCR)

RVFV - Vírus da febre de Vale do Rift (do inglês Rift Valley fever virus)

SFB - Soro Fetal Bovino

SGB - Síndrome de Guillain-Barré

SINASC - Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos

SLEV - Vírus da Encefalite de Saint Louis (do inglês Saint Louis Encephalitis Virus)

TE - Tris EDTA

TCID50- Dose Infecciosa de 50% da Cultura de Tecidos(do inglês 50%Tissue Culture

Infective Dose)

TR - Transcriptase Reversa

UTR- Região Não Traduzida (do inglês Untranslated Region)

UFF - Universidade Federal Fluminense

UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro

VN- Vermelho Neutro

XV

WNV - Vírus do Oeste do Nilo (do inglês West Nile Virus)

YFV - Vírus da Febre Amarela (do inglês Yellow Fever Virus)

ZIKV - Zika vírus

XVI

SUMÁRIO

Resumo .................................................................................................................... VII

Abstract ................................................................................................................... VIII

Lista de Figuras ......................................................................................................... IX

Lista de Quadros ........................................................................................................ X

Lista de Tabelas ........................................................................................................ XI

Lista de Abreviaturas ................................................................................................ XII

Sumário ................................................................................................................... XVI

1. Introdução .......................................................................................................... - 1 -

1.1 Revisão Bibliográfica - Família Flaviviridae ...................................................... - 1 -

1.1.1 Taxonomia e características gerais da família Flaviviridae ........................... - 1 -

1.1.2 Estrutura dos flavivírus .................................................................................. - 2 -

1.1.3 Propriedades das proteínas estruturais dos flavivírus ................................... - 2 -

1.1.3.1 Glicoproteína de Envelope (E) ................................................................... - 2 -

1.1.3.2 Proteína precursora da proteína M (PrM/M): .............................................. - 3 -

1.1.3.3 Proteína de Capsídeo (C): .......................................................................... - 3 -

1.1.4 Propriedades das proteínas não estruturais dos flavivírus ............................ - 3 -

1.1.4.1 Proteína NS1: ............................................................................................. - 3 -

1.1.4.2 Proteína NS2A: .......................................................................................... - 3 -

1.1.4.3 Proteína NS2B: .......................................................................................... - 4 -

1.1.4.4 Proteína NS3: ............................................................................................. - 4 -

1.1.4.5 Proteína NS4A ........................................................................................... - 4 -

1.1.4.6 Proteína NS4B: .......................................................................................... - 4 -

1.1.4.7 Proteína NS5: ............................................................................................. - 4 -

1.1.5 Ciclo de replicação dos flavivírus .................................................................. - 4 -

1.1.6 Características gerais do Zika vírus (ZIKV) ................................................... - 6 -

1.1.6.1 Morfologia e Estrutura ................................................................................ - 6 -

1.1.6.2 Estrutura do Genoma ................................................................................. - 7 -

1.1.6.3 Variabilidade Genética ............................................................................... - 8 -

1.1.6.4 Vetor e Transmissão .................................................................................. - 9 -

1.1.6.5 Patogenia e Manifestações Clínicas .........................................................- 11 -

1.1.6.6 Diagnóstico Laboratorial ............................................................................- 16 -

1.1.6.7 Prevenção e Controle ................................................................................- 20 -

XVII

1.1.6.8 Epidemiologia ............................................................................................- 21 -

1.1.6.9 Zika vírus no Brasil ....................................................................................- 23 -

1.2 Antivirais ..........................................................................................................- 24 -

1.2.1 Importância da terapêutica antiviral ..............................................................- 24 -

1.2.2 Antivirais para Zika vírus ..............................................................................- 25 -

1.2.3 Produtos naturais com atividade antiviral .....................................................- 26 -

1.2.3.1 Substâncias com atividades antivirais extraídas de algas marinhas .........- 26 -

1.2.3.2 Substâncias com atividades antivirais extraídas plantas ...........................- 28 -

2. Objetivos ...........................................................................................................- 32 -

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................- 32 -

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................- 32 -

3. Material e Métodos ............................................................................................- 33 -

3.1 Linhagens Celulares ........................................................................................- 33 -

3.2 Produção da massa viral da amostra ZIKV MR766 .........................................- 33 -

3.3 Determinação do título do estoque de ZIKV MR766 .......................................- 34 -

3.3.1 Titulação do estoque de ZIKV MR766 pelo método de Reed Müechen .......- 34 -

3.3.2 Titulação do estoque de ZIKV MR766 por Ensaio de Placa de Lise ...........- 34 -

3.3.3 Titulação do estoque de ZIKV MR766 pelo método One-Step RT-qPCR ....- 35 -

3.3.3.1 Extração do genoma viral ..........................................................................- 35 -

3.3.3.2 Detecção e quantificação de genoma do ZIKV MR766 pela técnica de One-

Step RT-qPCR ......................................................................................................- 35 -

3.5 Moléculas naturais isoladas de algas marinhas e da semente de urucum ......- 38 -

3.6 Avaliação da citotoxicidade das substâncias (CC50) .......................................- 39 -

3.7 Determinação da atividade antiviral por redução da produção de virion pela técnica

de Reed Müechen .................................................................................................- 41 -

3.8 Determinação da atividade antiviral por redução da produção de genoma viral pela

técnica de One-Step RT-qPCR .............................................................................- 41 -

3.8.1 Extração do genoma viral .............................................................................- 41 -

3.8.2 One-Step RT-qPCR......................................................................................- 41 -

3.9 Determinação do índice de seletividade (IS) ...................................................- 42 -

3.10 Critérios de avaliação das moléculas ............................................................- 42 -

3.11 Análises estatísticas ......................................................................................- 42 -

4. Resultados ........................................................................................................- 43 -

XVIII

4.1 Amplificação e titulação da amostra ZIKVMR766 ...........................................- 43 -

4.2 Estabelecimento do One-Step RT-qPCR ........................................................- 43 -

4.2.1 One-Step RT-qPCR e quantificação do genoma da amostra ZIKV MR766

estoque .................................................................................................................- 46 -

4.3 Determinação da atividade citotóxica, atividade antiviral e índice de seletividade

das substâncias obtidas de algas marinhas ..........................................................- 48 -

4.3.1 Detecção da atividade anti ZIKV da caulerpina e do diterpeno 10,18-diacetoxy-

8-hydroxy-2,6-dolabelladiene em célula vero pela técnica de Reed Müechen ......- 49 -

4.3.2 Detecção da atividade anti ZIKV da caulerpina e do diterpeno 10,18-diacetoxy-

8-hydroxy-2,6-dolabelladiene em célula vero pela técnica One-Step RT-qPCR ...- 51 -

4.4 Determinação da atividade citotóxica, atividade antiviral e índice de seletividade

da substância obtida da semente de urucum ........................................................- 54 -

4.4.1 Detecção da atividade anti ZIKV do geranilgeraniol em célula vero pela técnica

de Reed Müechen .................................................................................................- 55 -

4.3.2 Detecção da atividade anti ZIKV do geranilgeraniol em célula vero pela técnica

One-Step RT-qPCR ..............................................................................................- 57 -

5. Discussão ..........................................................................................................- 59 -

5.1 Atividade citotóxica ..........................................................................................- 60 -

5.2 Atividade antiviral ............................................................................................- 62 -

6. Conclusões ........................................................................................................- 64 -

7. Perspectivas ......................................................................................................- 65 -

8. Referências Bibliográfica ...................................................................................- 66 -

9.1 Titulação pelo método de Reed Müench .........................................................- 87 -

10. Anexos ............................................................................................................- 89 -

10.1 Artigo publicado na Journal of Applied Phycology .........................................- 89 -

10.2 Artigo publicado na Brazilian Journal of Microbiology ...................................- 90 -

10.3 Prêmio Banco do Brasil de Tecnologia Social de 2017 .................................- 91 -

- 1 -

1. INTRODUÇÃO

1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA - FAMÍLIA FLAVIVIRIDAE

1.1.1 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS GERAIS DA FAMÍLIA FLAVIVIRIDAE

A família Flaviviridae compreende um conjunto de vírus geneticamente

distintos, distribuídos por todo o mundo, e inclue agentes patogênicos para o

homem e outros animais. Essa família é composta por quatro gêneros: Flavivirus,

Pestivirus, Hepacivirus e Pegivirus (MUKHOPADHYAY et al., 2005; ICTV, 2016).

O gênero Flavivirus é constituido por 53 espécies, dentre elas: Vírus da Febre

Amarela (YFV), Vírus da Dengue 1, 2, 3 e 4 (DENV 1-4), Vírus do Oeste do Nilo

(WNV), Vírus Zika (ZIKV), Vírus da Encefalite de Saint Louis (SLEV) e vírus de

encefalites transmitidas por carrapato (LINDENBACH & RICE, 2003; STAPLES &

MONATH, 2008; KING et al., 2012; ICTV, 2016). A maioria dos flavivírus são

transmitidos para os hospedeiros vertebrados por vetores artrópodes, como

mosquitos e carrapatos, nos quais se replicam ativamente. O modo mais comum

de transmissão para os vertebrados ocorre durante o repasto sanguíneo do vetor

(fêmea) infectado com o vírus, que o libera com a saliva no hospedeiro (KUNO &

CHANG, 2005; ICTV, 2016).

No gênero Pestivirus encontram-se quatro espécies de importância

veterinária: Vírus da Diarréia Viral Bovina 1 (BVDV-1) e 2 (BVDV-2), Vírus da

Doença da Fronteira (BDV) e Vírus da Febre Suína Clássica (CSFV) (ICTV, 2016).

O gênero Hepacivirus é composto por 14 espécies, dentre elas o vírus da

hepatite C (HCV). Diversas espécies de hepacivírus foram recentemente descritas

em cães, cavalos, morcegos e roedores, sendo designadas de hepacivírus não

primata (NPHV) (LINDENBACH et al., 2007; ICTV, 2016). Neste gênero,

encontram-se hepacivírus isolados de morcego no Quênia (QUAN et al., 2013), de

roedores na Alemanha, Holanda, África do Sul e Namíbia (KAPOOR et al., 2013),

de equinos nos Estados Unidos, Reino Unido e Alemanha (BURBELO et al., 2012;

DREXLER et al., 2013) e de caninos nos Estados Unidos (KAPOOR et al., 2011).

O gênero Pegivirus, incluído na família Flaviviridae em 2012, é constituído por

11 espécies (Pegivirus A-K) que infectam primatas não humanos e morcegos

(ICTV, 2016).

- 2 -

1.1.2 ESTRUTURA DOS FLAVIVÍRUS

Os flavivírus são esféricos, pequenos, com 40 a 60 nm de diâmetro, e

possuem capsídeo (C) com simetria icosaédrica, envolvido por um envelope lipídico

contendo proteína de matriz (PrM/M) e a glicoproteína E. Como todos os vírus

envelopados, os vírus dessa família são sensíveis a solventes orgânicos,

detergentes e variação de temperatura (RIDPATH, 2005; ICTV, 2016).

O genoma dos flavivírus é constituído por um RNA de fita simples (RNAfs) de

polaridade positiva. Este genoma possui uma única fase aberta de leitura (ORF),

com aproximadamente 11 kb, flanqueada por duas regiões não codificantes (UTR),

que são importantes para regulação e expressão gênica viral. O produto da

tradução do RNA viral é uma poliproteína, cujo processamento gera três proteínas

estruturais (proteínas do capsídeo e de membrana e a glicoproteína de envelope)

e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)

(Figura 1) (VILLORDO et al., 2016).

Figura 1: Esquema representativo da organização genômica dos flavivírus

(Guzmanet al., 2010).

1.1.3 PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS ESTRUTURAIS DOS FLAVIVÍRUS

1.1.3.1 Glicoproteína de Envelope (E): É a maior proteína estrutural do virion, com

aproximadamente 60 kDa, sendo o principal componente antigênico viral. Esta

glicoproteína apresenta atividade hemaglutinante, é responsável pela interação do

vírus a receptores específicos (adsorção), está envolvida no processo de

endocitose, fusão no endossoma e indução da resposta imune no hospedeiro, além

de definir o tropismo ao tecido alvo (MODIS et al., 2004; DAI et al., 2016).

A glicoproteína E dos flavivírus é dimérica ecada monômero apresenta 3

domínios, sendo o domínio III importante na ligação ao receptor e indução de

- 3 -

anticorpos neutralizantes (LI et al., 2005; PIERSON et al., 2007; SIROHI et al.,

2016).

1.1.3.2 Proteína precursora da proteína M (PrM/M): É uma glicoproteína de

aproximadamente 26 kDa que faz parte da estrutura das partículas imaturas. Sua

clivagem por uma protease celular do tipo furina gera a proteína M de 8 kDa, sendo

esta a última etapa de maturação viral antes da liberação da partícula infecciosa

pela via exocítica do Golgi (CHAMBERS et al., 1990a; RICE et al., 1996; PIERSON

& DIAMOND, 2012).

1.1.3.3 Proteína de Capsídeo (C): Possui massa molecular de aproximadamente

11 kDa e se organiza em triangulações formando o capsídeo de simetria

icosaédrica. Ela é responsável pela proteção do genoma viral e dá forma ao virion

(CHAMBERS et al., 1990a; MA et al., 2004; SIROHI et al., 2016).

1.1.4 PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS NÃO ESTRUTURAIS DOS

FLAVIVÍRUS

As proteínas não estruturais estão envolvidas na modulação da resposta do

hospedeiro e na replicação viral, desempenhando funções na replicação do

genoma, montagem, organização e liberação do virion (LINDEBACH et al., 2007).

1.1.4.1 Proteína NS1: É uma glicoproteína com peso molecular entre 46 e 55 kDa,

sendo esta variação dependente do seu estado de glicosilação. Ela é necessária

para a replicação viral e evasão da resposta imune (AKEY et al., 2014).

Essa proteína pode ser encontrada em várias formas oligoméricas e em

diferentes localizações celulares: associada à membrana celular (mesmo não tendo

nenhuma região altamente hidrofóbica) ou dentro da célula em compartimentos

vesiculares, onde a sua forma dimérica parece interagir com outras proteínas não

estruturais e com o RNA viral (CHUNG & DIAMOND, 2008; BROWN et al., 2016).

Durante o processo de replicação viral, uma forma hexamérica da proteína

NS1 é secretada para o meio extracelular, o que pode explicar a detecção de

anticorpos contra esta proteína na fase aguda da doença (MACDONALD et al.,

2005; SCATURRO et al., 2015).

1.1.4.2 Proteína NS2A: Tem aproximadamente 24 kDa e é a primeira das quatro

menores proteínas hidrofóbicas (NS2A, NS2B, NS4A e NS4B) a ser processada. O

perfil hidrofóbico dessas proteínas sugere uma possível interação com as

- 4 -

membranas celulares (CHAMBERS et al., 1990a; BRINKWORTH et al., 1999). Ela

exerce função modulatória na atividade antiviral do interferon (LEUNG et al., 2008;

XIE et al., 2013).

1.1.4.3 Proteína NS2B: Proteína de aproximadamente 14 kDa que desempenha

papel fundamental na replicação viral. Ela contém sete domínios hidrofóbicos

relacionados com a interação com membranas e com atividade de cofator da

protease (NS3) (CHAMBERS et al., 1990b; FALGOUT et al., 1991; XIE et al., 2013).

1.1.4.4 Proteína NS3: É uma enzima multifuncional com aproximadamente 68 kDa

bastante conservada entre os flavivírus. Ela atua como: protease, para o

processamento de poliproteínas, trifosfatase, na formação do cap para cobrir o RNA

viral nascente e helicase, que juntamente com o cofator NS2B, desenrola a forma

dupla e replicativa do genoma viral (LINDENBACH & RICE, 2003; BROWN et al.,

2016).

1.1.4.5 Proteína NS4A: Ancora na membrana do retículo endoplasmático e

interage com as proteínas NS1, NS3 e NS5 (WESTAWAY et al., 2003; BROWN et

al., 2016).

1.1.4.6 Proteína NS4B: Detectada no núcleo da célula hospedeira durante o

processo de replicação viral, parece estar envolvida na inibição da síntese de

interferon (LINDENBACH & RICE, 2003; BROWN et al., 2016).

1.1.4.7 Proteína NS5: É a maior das proteínas não estruturais, com cerca de 100

kDa. Ela apresenta sequências altamente conservadas entre todos os flavivírus. A

análise dessas sequências possibilitou a determinação de dois sítios da proteína,

o primeiro encontrado na região C-terminal que é responsável pela atividade de

RNA polimerase RNA dependente (RpRd, polimerase viral) e um segundo sítio

localizado na região N-terminal com atividade de metiltransferase (LINDENBACH

et al., 2007; BROWN et al., 2016).

1.1.5 CICLO DE REPLICAÇÃO DOS FLAVIVÍRUS

Na infecção natural por flavivírus, mosquitos infectados inoculam partículas

virais no hospedeiro durante o repasto sanguíneo e o vírus inicia seu processo

replicativo no citoplasma da célula (Figura 2). Próximo ao local da picada, ocorre a

interação da glicoproteína E com receptores e co-receptores localizados na

superfície das células suscetíveis. Algumas moléculas presentes na superfície da

- 5 -

célula como TAM, TIM, manose, DC-SIGN e HSPG podem servir de receptor. A

partícula viral é endocitada em vesículas e o baixo pH do endossoma induz a fusão

do envelope do vírus com a membrana do lisossoma, provocando mudanças

conformacionais na proteína E, e, consequentemente, a liberação do

nucleocapsídeo no citoplasma da célula (CLYDE et al., 2006; SUTHAR et al.,2013;

NEUFELDT et al., 2018).

Após a decapsidação, o RNA viral é imediatamente traduzido pelos

ribossomos em uma única poliproteína, que é processada por protease viral NS2B-

NS3 e proteases celulares para gerar proteínas virais estruturais e não estruturais

(HEINZ & ALLISON, 2003; LINDENBACH et al., 2007).

Figura 2: Representação esquemática do ciclo de replicação dos flavivírus

(Adaptado de Heinz & Stiasny, 2012).

A síntese de RNA viral é catalisada por um complexo de replicação que inclui

a proteína não estrutural NS5 (RpRd), entre outras proteínas não estruturais. RNAs

de polaridade negativa são gerados a partir do RNA viral de polaridade positiva e

servem de molde para síntese de novas cópias de RNA de polaridade positiva, que

são então incorporados às novas partículas virais (FERNANDEZ-GARCIA et al.,

2009; KOSTYUCHENKO et al., 2016).

O RNA é envolto pela proteína C, formando o nucleocapsídeo, que brota em

direção ao lúmen do retículo endoplasmático, onde adquire uma bicamada lipídica

contendo heterodímeros prM/E (MACKENZIE, 2005). Estas partículas imaturas são

- 6 -

transportadas através das vias secretoras celulares para o complexo de golgi, onde

a proteína E é glicosilada. Posteriormente, ocorre a clivagem da proteína prM,

precursora da proteína M, por protease do hospedeiro com atividade de furina,

resultando no virion, que é liberado para o meio extracelular por exocitose

(PIERSON & DIAMOND, 2012; KOSTYUCHENKO et al., 2016). Pode ocorrer

também clivagem parcial da PrM, gerando, assim, partículas virais imaturas

(PERERA & KUHN, 2008).

1.1.6 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO ZIKA VÍRUS (ZIKV)

O ZIKV dissemina-se para órgãos e tecidos, inclusive sistema nervoso cental,

via corrente sanguínea. Ele também pode atravessar a barreira transplacentária e

replicar no embrião ou feto, resultando em abortamento, microcefalia e outras

malformações congênitas (MLAKAR et al., 2016). Existe também uma relação

entre a infecção pelo ZIKV e casos de síndrome de Guillain-Barré e encefalite em

pessoas adultas (OEHLER et al., 2014; KARWOWSKI et al., 2016).

O aumento de número de casos de malformações cerebrais resultantes de

uma falha na neurogênese durante a gestação e a associação a sindrome de

Guillian-Barré correlacionada a infecção pelo ZIKV levou a Organização Mundial de

Saúde (OMS) declarar o ZIKV como uma emergência em saúde pública de

importância mundial (OMS, 2016a).

1.1.6.1 Morfologia e Estrutura

A partícula do ZIKV possui uma estrutura semelhante aos demais vírus da

família Flaviviridae. Apresenta forma esférica, com aproximadamente 40 a 50 nm

de diâmetro. O envelope viral é constituído por uma bicamada lipídica, originária do

retículo endoplasmático da célula hospedeira, onde estão ancoradas as

glicoproteínas E e PrM/M (MLAKAR et al., 2016). Internamente, há um

nucleocapsídeo com formato icosaédrico composto pela proteína estrutural do

capsídeo (C) complexada a uma molécula de RNA viral (SILVA & SOUZA, 2016)

(Figura 3).

- 7 -

Figura 3: Estrutura do Zika vírus (ZIKV) (Adaptado de ViralZone, 2016).

Assim como em todos os flavivírus, duas formas virais podem ser distinguidas:

a imatura, apresentando a proteína de envelope (E) e a proteína precursora da

proteína M (PrM), e a madura, apresentando a proteína de envelope (E) e a proteína

de Matriz (M) (WANG et al., 2016) (Figura 4).

Figura 4: Esquema representativo das formas imaturas e maduras do Zika vírus

(ZIKV) (Adaptado de Heinz & Stiasny, 2012).

1.1.6.2 Estrutura do Genoma

O ZIKV possui genoma de RNAfs polaridade positiva, não segmentado, de

aproximadamente 11 kb. Ele contém uma única ORF, flanqueada por duas regiões

UTR, que codifica uma poliproteína (com aproximadamente 3300 aminoácidos) que

é processada para três proteínas estruturais (capsídeo [C], pré-membrana [PrM/M]

e Envelope [E]) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a,

- 8 -

NS4b e NS5) (KUNO & CHANG, 2007; PIORKOWSKI et al., 2016; VILLORDO et

al., 2016; ZHU et al., 2016) (Figura 5).

Figura 5: Esquema da organização genômica do ZIKV (Adaptado de Marano et al.,

2016).

1.1.6.3 Variabilidade Genética

O genoma completo do vírus (estirpe protótipo ZIKVMR766 – Macaco Rhesus

766) foi completamente sequenciado pela primeira vez em 2007 a partir de

amostras de cérebro de camundongo infectado (KUNO & CHANG, 2007).

Após o surto no estado de Yap, na Micronésia, Lanciotti e colaboradores

(2008) conduziram o primeiro estudo filogenético do ZIKV. O sequenciamento

completo do gene que codifica a NS5 revelou três linhagens ou subclados

diferentes: linhagem da África Oriental (protótipo Uganda – MR766), linhagem da

África Ocidental (cepas do Senegal) e linhagem asiática (estirpe de Yap ZIKV

2007). A linhagem asiática divergiu de um ancestral comum que se expandiu no

Sudeste da Ásia e Pacífico.

Com base em sequências genômicas completas, Haddow e colaboradores

(2012) descreveram duas linhagens principais do ZIKV: estirpe africana (Uganda,

Senegal e Nigéria) e estirpe asiática (Malásia 1966, Yap 2007 e Camboja, 2010).

Nas Américas estão sequenciados isolados do Brasil, Colômbia, Porto Rico e

Guatemala (CAMPOS et al., 2015; CAMACHO et al., 2016; LANCIOTTI et al.,

2016). Todos apresentaram mais de 99% de identidade nucleotídica com as

estirpes da Polinésia Francesa. Estas cepas podem constituir um grupo do

Hemisfério Ocidental dentro do genótipo asiático (LANCIOTTI & LAMBERT, 2016).

Baseado em dados epidemiológicos e de sequências nucleotídicas, suporta-

se a hipótese de que as cepas epidêmicas de ZIKV emergiram por meio de

mudança genética (mutações pontuais) no vírus da linhagem asiática (MUSSO et

al., 2016).

- 9 -

1.1.6.4 Vetor e Transmissão

O ZIKV é um arbovírus transmitido, principalmente, por vetor artrópode do

gênero Aedes, e mantido na natureza através da transmissão biológica do vetor ao

hospedeiro vertebrado suscetível (CDC, 2016a) (Figura 6).

O primeiro isolamento do ZIKV a partir de mosquito foi na espécie Aedes

africanus em 1948 (DICK et al., 1952). Isolados subsequentes do vírus nesta

espécie incluíram duas cepas da Floresta Lunyo, Uguanda (WEINBREN et al.,

1958) e 12 cepas da floresta Zika, Uganda (HADDOW et al., 1964). Outros

arbovírus, como YFV, chikungunya (CHIKV), vírus da febre do Vale Rift (RVFV) e

vírus Ntaya (NTAV) também foram isolados a partir de Aedes africanus (HADDOW

et al., 1961). Esses mosquitos preferem fazer repasto em macacos a humanos

(HADDOW & DICK, 1948), mas também se alimentam do sangue de roedores, aves

e répteis (HADDOW et al., 1964).

Na Ásia, o primeiro isolado do ZIKV foi obtido a partir de Aedes aegypti em

1966 (MARCHETTE et al., 1969). Foi o primeiro isolamento do vírus a partir de um

mosquito não Aedes africanus. O ZIKV também foi isolado a partir de um mosquito

macho Aedes furcifer. A distribuição sazonal da taxa de infecção do vírus em

mosquitos dessa espécie no Senegal mostrou dois picos de amplificação em Junho

e entre Setembro e Dezembro (DIALLO et al., 2011).

De acordo com relatos no Pacífico, confirmou-se que o ZIKV pode ser

transmitido por diferentes vetores durante surtos. Nas ilhas Yap, é transmitido por

Aedes hensilii, em Nova Caledônia por Aedes aegypti e na Polinésia Francesa por

Aedes aegypti e/ou Aedes polynesiensise no Gabão por Aedes albopictus (GRARD

et al., 2014). A competência de espécies americanas de Aedes aegypti e Aedes

albopictus para transmitir o ZIKV é pouco conhecida, mas estudos epidemiológicos

e experimentais demonstram que ambas as espécies são bem adaptadas para

transmitir dengue e chikungunya (VEGA-RUA et al., 2014).

O isolamento do vírus em mosquito não é evidência de que ele seja um vetor

desse vírus. Para demonstrar que um mosquito é um vetor, ele deve mostrar sua

capacidade de transmissão (DICK, 1953). O primeiro estudo de competência

vetorial do Aedes Aegypti para transmissão do ZIKV foi realizado em 1956

(BOORMAN & PORTERFIELD, 1956).

- 10 -

A principal forma de transmissão do ZIKV ocorre através da picada de fêmeas

hematófagas infectadas de mosquito Aedes spp. durante o repasto sanguíneo para

a maturação dos seus ovos (CDC, 2016a) (Figura 6).

Figura 6: Formas de transmissão do Zika vírus (ZIKV) (Adaptado de CDC, 2016a).

O mosquito se infecta ao ingerir sangue de um indivíduo infectado durante o

período de viremia (cerca de 5 dias) e pode transmitir o vírus, através da saliva,

para um indivíduo susceptível depois de um período de incubação de 8 a 12 dias.

Uma vez infectado, o mosquito transmite o vírus pelo resto de sua vida (em média

45 dias). É uma espécie doméstica de hábito diurno e que ovipõe,

preferencialmente, em água parada e limpa, acumulada em recipientes geralmente

fabricados pelo homem, como pneus, vasos de plantas, latas, cisternas, entre

outros (RIGAU-PEREZ et al., 1998).

As fêmeas infectadas também podem transmitir os vírus à próxima geração

de mosquitos por meio da transmissão transovariana, mas isso ocorre com pouca

frequência e, provavelmente, não contribui significativamente com a transmissão

humana (RIGAU-PEREZ et al., 1998).

A transmissão também pode ocorrer a partir de órgãos transplantados ou

transfusão de sangue de doadores infectados. O RNA de ZIKV e partículas viáveis

foram detectados em amostras de sangue de doadores assintomáticos na Polinésia

(MUSSO et al., 2014).

- 11 -

O ZIKV também pode ser transmitido sexualmente. A evidência inicial foi

confirmada a partir de dois pesquisadores norte-americanos que foram para uma

área endêmica no Senegal para coletar amostras de mosquitos. Um deles relatou

hematospermia e sua esposa, que não tinha viajado, apresentou artralgia,

exantema e úlcera oral, semelhante aos sintomas apresentados pelo marido. Pode-

se supor que, durante a fase aguda e virêmica da infecção, o dano ao endotélio

vascular resulte em células sanguíneas e partículas de ZIKV sendo liberados no

sêmen, favorecendo essa via de transmissão (FOY et al., 2011).

Relatos de casos confirmaram infecções por ZIKV em duas mães que

amamentaram seus recém nascidos. Ambas as mães apresentaram sinais clínicos

de erupção cutânea no prazo de poucos dias após o parto e os autores levantaram

a hipótese de que as crianças provavelmente foram infectadas no útero ou no

intraparto, uma vez que os soros dos lactentes eram positivos para ZIKV no prazo

de um dia após o início da amamentação. O autor deste estudo foi contactado e

confirmou que não foram relatadas complicações a longo prazo para nenhum dos

dois lactentes aos dois anos de idade (BESNARD et al., 2014).

Outro estudo sugerindo transmissão vertical do ZIKV ocorreu após a

descoberta de RNA do vírus em amostras de líquido aminiótico de duas gestantes

do estado da Paraíba, Brasil, cujos fetos foram diagnosticados com microcefalia

(CALVET et al., 2016). Este achado sugeriu que o vírus pode atravessar a barreira

placentária, ter tropismo por células neurais fetais, alterar a neurogênese e induzir

danos neurológicos (MLAKAR et al., 2016; CALVET et al., 2016).

Fluidos corporais, como saliva e urina, foram estudados como possíveis

veículos para a transmissão do ZIKV, uma vez que partículas viáveis do vírus foram

isoladas desses espécimes clínicos de dois pacientes na fase aguda no Brasil.

Entretanto, não se pode afirmar que eles possam ser infectantes a ponto de

transmitir o vírus a partir de um paciente infectado, já que a carga viral pode não

ser suficiente para a transmissão (BONALDO et al., 2016).

1.1.6.5 Patogenia e Manifestações Clínicas

O período de incubação do ZIKV varia de 3 a 12 dias (BURKE et al., 2016;

GOEIJENBIER et al., 2016). Ele replica em uma grande variedade de tipos

celulares de mamífero, incluindo neurônios, células astrogliais e células imunes da

pele, como fibroblasto dérmico, queratinócitos epidérmicos e células dendríticas.

- 12 -

Foi descrito que ZIKV adsorve na célula usando fatores de adesão, como DC-SIGN

(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) e

diversos membros da família de receptores de fosfatidilserina (HAMEL et al., 2015;

TAPPE et al., 2016).

As infecções pelo ZIKV geralmente são assintomáticas, cerca de 80% dos

casos, mas, quando sintomática, apresenta um quadro clínico manifestando-se

principalmente por febre baixa, exantema maculopapular, hiperemia conjuntival e

artralgia. Outros sinais e sintomas como cefaleia, dor retro-orbital, mialgia, edema

das extremidades e vômitos podem ocorrer (OLSON et al., 1981; DUFFY et al.,

2009; IOOS et al., 2014; BRASIL et al., 2016; CALVET et al., 2016).

Normalmente a infecção por ZIKV é autolimitada. No entanto, o aparecimento

de síndromes neurológicas e autoimunes já foram associadas à infecção (OEHLER

et al., 2014; ECDC, 2016).

1.1.6.5.1 Complicações neurológicas associadas à infecção pelo Zika virus

Síndrome de Guillain-Barré (SGB)

Infecções por arbovírus, como os flavivírus, algumas vezes podem levar a

quadros agudos autoimunes como a SGB e a polirradiculoneuropatia. A SGB

caracteriza-se por paralisia de membros superiores e inferiores, fraqueza muscular

e paralisia, que pode evoluir para doenças respiratórias, dificuldades de

deglutinação e óbito. Os déficits sensório-motores são simétricos e bilaterais

(OEHLER et al., 2014). A SGB é complexa, envolvendo os receptores do tipo Toll,

a produção de citocinas pró-inflamatórias, com atividade mielinotóxica, as

respostas imunes mediadas por células com a ativação de células T citótoxicas,

produção de auto-anticorpos e ativação do complemento (NYATI & PRASAD,

2014).

O primeiro relato da associação entre a infecção pelo ZIKV e a SGB foi na

Polinésia Francesa (OEHLER et al., 2014). Uma mulher teve febre, erupção

cutânea e conjuntivite sete dias antes de evoluir para um quadro de desordem

desmielinizante difusa que a levou à internação e confirmação da síndrome.

Antígenos virais e anticorpos neutralizantes não foram detectados, mas

imunoglobulinas M (IgM) e G (IgG) contra dengue e ZIKV foram detectados (KOGA

et al., 2015).

- 13 -

Um aumento na incidência de síndrome de Guillain-Barré foi observado à

medida que o surto de infecção pelo ZIKV na Polinésia Francesa progrediu, com

uma estimativa de 0,24 casos/1000 infecções. A maioria dos pacientes era do sexo

masculino (74%), com idade entre 36-56 anos e apresentaram sintomas

neurológicos em rápido progresso a partir do sexto dia. Foram detectados IgM e

IgG anti-ZIKV e anticorpos neutralizantes contra ZIKV em 98% e 100% dos

pacientes, respectivamente. Em nenhum dos pacientes com a síndrome houve a

detecção do RNA viral por RT-PCR, enfatizando não só o curto período de viremia

da infecção, mas também a natureza auto-imune da SGB (CAO-LORMEAU et al.,

2016).

Após a confirmação da circulação do ZIKV no Brasil, em 2015, o diagnóstico

de SGB foi confirmado em 42 (55%) de 76 pacientes do Estado da Bahia, com 26

(62%) deles declarando ter tido os sintomas da doença (OMS, 2016b). Segundo a

OMS (2016b), até o final de 2016, o aumento da incidência de SGB ocorreu em 13

países com circulação do ZIKV nas Américas. No Brasil, foram relatados 1708

casos de janeiro a novembro de 2016, com uma alta incidência registrada em

Alagoas (516,7%), Bahia (196,1%), Rio Grande do Norte (108,7%), Piauí (108,3%),

Espírito Santo (78,6%) e Rio de Janeiro (60,9%). Na América Latina, não se pôde

afirmar que as infecções por ZIKV foram responsáveis pela maioria dos casos de

SGB, pois muitos deles não foram confirmados laboratorialmente (LEDERMANN et

al., 2014; CAMPOS et al., 2015; FAUCI & MORENS, 2016).

Nas Américas, um aumento da SGB foi relatado em três países em El

Salvador, onde 54% dos casos investigados em 2015 apresentaram sintomas

compatíveis com a febre Zika anterior a SGB, na Venezuela, onde foi registrado um

aumento de 2 a 3 vezes em relação à média anual nacional, e na Martinica, onde

foi relatado pelo Ministério da Saúde frânces um primeiro caso de SGB

possivelmente associado à infecção por ZIKV (ECDC,2016). Coletivamente, essas

dados epidemiológicos reforçaram a hipótese de uma relação entre ZIKV e SGB.

Além disso, foi demonstrado um caso de mielite transversa em um

adolescente mexicano nove dias após o início dos sintomas da infecção

(MÉCHARLES et al., 2016). O vírus foi detectado na urina, soro e fluidos do cérebro

do paciente em um elevado número de cópias genômicas (CALVET et al., 2016).

Microcefalia e síndromes congênitas

- 14 -

Após a confirmação dos primeiros casos de ZIKV no nordeste do Brasil em

maio de 2015, houve uma rápida disseminação do vírus para outras regiões do

país, o que foi acompanhado pelo aumento significativo de notificações de recém-

nascidos com microcefalia pelo Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos

(SINASC). Posteriormente, um número excessivo de casos e registros de aborto

em outros estados do Nordeste (Paraíba e Rio Grande do Norte) foram observados.

Confrontando com este novo cenário e em resposta às crescentes preocupações

sobre a possível associação entre a infecção pelo ZIKV e a microcefalia em recém-

nato, o Ministério da Saúde do Brasil declarou o ZIKV como uma emergência de

saúde pública de preocupação nacional em novembro de 2015 (BRASIL, 2016;

HENNESSEY et al., 2016).

Outros três alertas foram emitidos em 2015: um pela Organização Pan

Americana de Saúde (OPAS) em 17 de Novembro (OPAS, 2015), um pelo Centro

Europeu de Prevenção e Controle de Doenças (ECDC) em 24 de novembro (ECDC,

2015) e um novo pela OPAS em 01 de dezembro (OPAS, 2015).

No Brasil, no final de janeiro de 2016, 3.893 casos de microcefalia já haviam

sido relatados desde outubro de 2015 (ProMED-mail, 2015). Os casos relatados

foram provenientes de 21 estados e 724 municípios do país (ECDC, 2016).

Após estudos retrospectivos na Polinésia Francesa, autoridades de saúde

relataram 17 casos de malformações do sistema nervoso central, incluindo

microcefalia em recém-nascidos coincidentes com o período de surto de ZIKV na

região (ECDC, 2015; OPAS, 2016).

A situação epidemiológica favoreceu a hipótese de causa e efeito entre ZIKV

e microcefalia. Além disso, o RNA viral foi detectado no líquido amniótico de duas

gestantes da Paraíba, Brasil, com histórico de doença exantemática e fetos com

microcefalia detectada na ultrassonografia fetal (OLIVEIRA et al., 2016).

A partir desses relatos, estudos adicionais foram conduzidos, possibilitando o

sequenciamento completo do vírus a partir do líquido aminiótico de mulheres

grávidas que revelou que o vírus compartilhava 97-100% de identidade nucleotídica

com a linhagem asiática isolada no surto da Polinésia Francesa. Além disso, a

presença do genoma viral nas pacientes gestantes por algumas semanas após a

fase aguda sugeria que a carga viral intrauterina resultava da replicação persistente

(CALVETet al., 2016). A identificação do genoma do ZIKV em células da placenta

em um aborto na oitava semana, por meio de técnicas de RT-qPCR, reforçou o

- 15 -

potencial da transmissão placentária (OPAS, 2016; DE OLIVEIRA & DA COSTA

VASCONCELOS, 2016). Um estudo realizado por Mlakar e colaboradores (2016)

demonstrou o neurotropismo do ZIKV e sua detecção no tecido cerebral. Um outro

estudo envolvendo dois abortos e dois recém-nascidos microcéfalos com

alterações histopatológicas limitadas ao cérebro no Brasil apresentou resultados

semelhantes, reforçando o neurotropismo do vírus. A presença do vírus no tecido

cerebral foi confirmado por RT-PCR e imunohistoquímica (MARTINES et al., 2016).

A microcefalia não é uma doença propriamente dita, mas sim um alerta de

destruição ou déficit do crescimento cerebral, podendo ser classificada como

primária (de origem genética, cromossômica ou ambiental, incluindo infecções) ou

secundária (quando resultante de evento danoso que atingiu o cérebro em

crescimento no fim da gestação ou no período peri e pós-natal). As sequelas da

microcefalia vão depender da sua etiologia e do tempo gestacional em que ocorreu

a infecção, sendo mais graves as anomalias quando a infecção ocorre no primeiro

trimestre da gravidez (HARRIS, 2015).

Ocorrem alterações cerebrais nos segundo e terceiro trimestres da gestação

(WOODS & PARKER, 2013; BRASIL et al., 2016). A microcefalia congênita pode

levar adiversas alterações, sendo as mais frequentes a deficiência intelectual,

paralisia cerebral, epilepsia, dificuldades de deglutinação e anomalias dos sistemas

visual e auditivo, além de distúrbios do comportamento, como TDAH (ASHWALet

al., 2009).

No exame físico dos recém-nascidos com anomalias celebrais, chama

atenção a microcefalia, geralmente grave, com importante desproporção

craniofacial. Outras dimorfias, como acentuada protuberância óssea occipital,

fontanelas fechadas ao nascer e excesso de pele e/ou dobras de pele no colapso,

além de hérnia umbilical, são frequentemente observadas (EICKMANN et al.,

2016).

- 16 -

Não se pode ignorar a possibilidade de que a microcefalia seja apenas a

primeira evidência relacionada com a infeçção pelo ZIKV e que outras

complicações, graves ou não, possam acometer outros órgãos que não apenas o

cérebro. Complicações oftalmológicas e auditivas em recém-nascidos não

microcéfalos de mães afetadas pelo vírus têm sido relatadas (STAPLES et al.,

2016; VENTURA et al., 2016).

1.1.6.6 Diagnóstico Laboratorial

O diagnóstico laboratorial é de grande importância pois permite a detecção

precoce da doença e do agente infeccioso, permitindo a condução de investigações

epidemiológicas pertinentes, minimizando, desta forma, a sua expansão. Existe

atualmente um esforço científico global para obter uma melhor compreensão do

ZIKV, seus vetores, modo de transmissão e história natural da doença. A chave

para este esforço é ter um diagnóstico preciso da infecção pelo vírus. Entretanto,

os testes disponíveis são limitados por inúmeros fatores (CHUA et al., 2017). Além

dos aspectos clínicos inespecíficos da infecção pelo ZIKV, o diagnóstico laboratorial

é um fator desafiante por conta da baixa viremia e reação cruzada de anticorpos

anti ZIKV com outros flavivírus (LANCIOTTI et al., 2007).

A infecção pelo ZIKV pode provocar sinais e sintomas semelhantes aos

observados em doentes infectados com outros arbovírus, incluindo DENV

(flavivírus relacionado) e o CHIKV (alfavírus relacionado). É importante notar que

um resultado positivo para esses vírus não se opõe a infecção do outro, podendo

ocorrer co-infecção com ZIKV, DENVe CHIKV (ROTH et al., 2014; WAGGONER et

al., 2016a; WAGGONER et al., 2016b).

As características clínicas da infecção por ZIKV, DENV e CHIKV são bastante

parecidas. Apesar disso a intensidade de cada sinal e/ou sintoma pode ajudar a

difenciá-las. Devido à amplitude do diagnóstico diferencial, os dados

epidemiológicos também favorecem o levantamento das hipóteses diagnósticas

(SUMMERS et al., 2015).

Um dos principais diagnósticos diferenciais realizado é para dengue, pela

abrangência no território brasileiro. Os quadros de febre, mialgia e cefaleia

geralmente são mais intensos nas infecções pelo vírus da dengue que nas

infecções por ZIKV, além de as infecções por dengue também estarem associadas

a quadros hemorrágicos. Ao contrário da infecção por ZIKV, a infecção por dengue

- 17 -

tipicamente não está associada à conjuntivite e edema de extremidades. Os

quadros de exantema nas infecções por ZIKV normalmente são mais exacerbados.

Além disso, as infecções por chikungunya normalmente se apresentam com dores

intensas nas articulações (podem ser até incapacitantes), afetando mãos, pés,

joelhos e costas, ao contrário do observado para ZIKV. Hepatomegalia

normalmente só é observada nas infecções por chikungunya (IOOS et al., 2014;

GINIER et al., 2016).

1.1.6.6.1 Isolamento Viral

O isolamento de ZIKV a partir de amostras de soro de macacos e Aedes

africanus foi realizado pela inoculação em cérebro de camundongos (DICK, 1952).

Os métodos de isolamento subsequentes incluíram a inoculação viral em ovos

embrionados e cultura de células (DIGOUTTE et al., 1992).

A inoculação do soro coletado na fase aguda em células de mosquito Aedes

albopictus (C6/36) e Aedes pseudoscutellaris (AP61) é comumente empregada

para isolamento do vírus da dengue (GUZMAN & KOURI, 2002). O isolamento viral

com a linhagem de C6/36 tem sido o método de escolha por sua facilidade de

manutenção e sensibilidade (ALERA et al., 2015; MELO, 2016).

O isolamento pode ser observado pela presença do efeito citopático (ECP).

No entanto, algumas amostras podem produzir discreto ou nenhum ECP, sendo

por isso indicada confirmação da presença do vírus através do teste de

imunofluorescência. No caso de dengue, o teste também é utilizado para identificar

o sorotipo utilizando-se anticorpos monoclonais sorotipo-específicos (DENV1 a 4)

(HENCHAL et al., 1982; GLUBER et al., 1984).

O ZIKV foi isolado por inoculação intratorácica nos mosquitos Toxorhynchites

splendens e posteriormente em células C6/36 com soro do doente (ALERA et al.,

2015). O vírus foi cultivado com sucesso a partir de sangue humano (CAO-

LORMEAU et al., 2014), urina (FONSECA et al., 2014) e sêmen (MUSSO et al.,

2015). Embora não tenha sido isolado do leite materno, foi detectado por RT-PCR

(BESNARD et al., 2014).

1.1.6.6.2 Detecção Molecular

A amplificação do material genético dos flavivírus requer a etapa de

transcrição reversa por possuírem o genoma de RNA (LANCIOTTI et al., 1992).

- 18 -

A Reação em Cadeia pela Polimerase em tempo real (qPCR) renovou o

conceito de amplificação, tornando a técnica muito mais rápida e eficiente que a

PCR convencional. Esta técnica combina a amplificação por PCR com uma sonda

fluorescente e detecção do produto amplificado no mesmo ensaio (ESPY et al.,

2006). O uso da fluorescência permite a detecção dos produtos, conforme eles são

produzidos, ou seja, em tempo real, sem a necessidade da eletroforese (HOLLAND

et al., 1991).

Na detecção molecular de ZIKV podem ser utilizadas duas estratégias: a

detecção de RNA de flavivírus, que requer testes adicionais para a identificação de

qual flavivírus foi amplificado, e a detecção específica de ZIKV (DA SILVA & GAO,

2016).

Os ensaios de PCR precedida por reação de transcrição reversa (RT-PCR)

permitem a detecção de novos flavivírus ou variantes de flavivírus conhecidos. Em

geral, esses protocolos amplificam a região terminal do gene que codifica a proteína

NS5 ou a porção 3` do genoma dos flavivírus por conta dessas regiões serem

altamente conservadas (LANCIOTTI, 2003). Entretanto, por vezes carecem de

sensibilidade. Por exemplo, o RT-PCR de flavivírus não amplificou o RNA de ZIKV

a partir de soro de um paciente doente. Entretanto, o material genético foi detectado

quando utilizando iniciadores específicos para ZIKV (WAEHRE et al., 2014).

O ZIKV foi detectado com sucesso em ensaios de RT-qPCR para flavivírus

utilizando amplificações parciais dos genes que codificam a proteína E (GAUNT &

GOULD, 2005), a proteína NS1 (MEIYU et al., 1997), a proteína NS3 (CHOW et al.,

1993) e a proteína NS5 (FULOP et al., 1993; SCARAMOZZINO et al., 2001).

Após a detecção de RNA de flavivírus, a identificação das espécies requer

testes adicionais. Muitos métodos podem ser utilizados, incluindo RT-PCR com

iniciadores específicos para cada espécie (GAUNT & GOULD, 2005), hibridização

(PIERRE et al., 1994) e sequenciamento (KONO & CHANG, 2007).

Protocolos de RT-PCR utilizando iniciadores e sondas específicos para ZIKV

foram desenvolvidos utilizando como alvo o gene que codifica a proteína do

envelope (FAYE et al., 2008) e o gene que codifica a proteína NS5. A detecção de

ZIKV por RT-PCR não é capaz de detectar a diversidade genética e distribuição

geográfica de todas as estirpes de ZIKV (FAYE et al., 2013).

Como os iniciadores e sondas disponíveis foram criados com base apenas

em algumas sequências do genoma, as novas sequências de ZIKV disponíveis

- 19 -

devem ser rapidamente depositadas no GenBank para assegurar que o protocolo

possa detectar a estirpe circulante. Os Kits comerciais de RT-PCR para ZIKV já

estão disponíveis, mas principalmente para uso em pesquisa (OMS, 2016b; CDC,

2016c).

1.1.6.6.3 Diagnóstico Sorológico

A sorologia para ZIKV é normalmente realizada por ELISA com confirmação

por teste de neutralização por redução de placas (PRNT), de acordo com protocolos

padrão (JOHNSON et al., 2000; MAEDA & MAEDA, 2013). Testes

imunoenzimáticos são utilizados para o diagnóstico de flavivírus devido a

praticidade e sensibilidade. Estes detectam anticorpos da classe IgM e IgG e

antígeno NS1. Atualmente existem três testes sorológicos comerciais em processo

de validação para ZIKV nas agências reguladoras de Administração de Alimentos e

Medicamentos americana (FDA) Diagnósticos In Vitro europeu (IVD) e na Agência

Nacional de Vigilância Sanitária brasileira (ANVISA) (OPAS, 2016).

A maior experiência no diagnóstico de infecções pelo ZIKV por sorologia foi a

partir de amostras de soro colhidas durante o surto de ZIKV no Estado de Yap,

Micronésia (LANCIOTTI et al., 2008). Análises sorológicas de pacientes infectados

foram realizadas com ELISA anti-IgG e anti-IgM para ZIKV para diferenciar infecção

primária e secundária. A confirmação foi feita pela técnica de PRNT para ZIKV,

DENV, YFV, WNV, SLEV, vírus da encefalite japonesa (JEV) evírus da encefalite

de Murray Valley (MVEV) (LANCIOTTI et al., 2008). Anticorpos IgM contra ZIKV

reagiram de forma cruzada com outros flavivírus, mas não com alfavírus, tais como

Chikungunya (DUFFY et al., 2009). Em infecções primárias por flavivírus, a

resposta de anticorpos IgM foi específica para ZIKV, mesmo sendo observado um

grau limitado de reação cruzada com outros flavivírus, mas com PRNT altamente

específico (LANCIOTTI et al., 2008).

Critérios sorológicos para confirmar a infecção por ZIKV durante o surto nas

ilhas Yap incluíram um exame positivo anti-IgM para ZIKV (ELISA), título igual ou

maior que 20 por PRNT e proporção igual ou maior que 4 entre ZIKV/DENV também

por PRNT (DUFFY et al., 2009).

Em casos de suspeita de ZIKV em uma população onde outros flavivírus são

endêmicos, o diagnóstico sorológico é difícil de interpretar porque o alto grau de

reações cruzadas nos ensaios IgM e IgG pode levar a resultados falso-positivos.

- 20 -

Durante o surto na Polinésia Francesa, o diagnóstico sorológico de ZIKV não foi

implementado por estar ocorrendo, simultaneamente, um surto de DENV-1 e

DENV-3 e mais de 80% da população adulta teranticorpos para, pelo menos, um

sorotipo deDENV (AUBRY et al., 2015; AUBRY et a., 2017). Se o risco de reações

cruzadas com outros flavivírus é alto na população adulta com provável infecção

anterior por flavivírus, o risco pode ser baixo para os novos imigrantes de áreas

onde ZIKV não é endêmico, turistas e crianças. Theiler & Casals (1958)

demonstraram que a imunização com a vacina da febre amarela não induz

produção de anticorpos contra ZIKV.

1.1.6.7 Prevenção e Controle

Ainda não existe um tratamento específico para as infecções por ZIKV. O

tratamento para sintomáticos é essencial porque as dores, como a artralgia e

cefaleia, constantemente relatadas pelos pacientes, representam um incômodo

bastante presente. É recomendado então que esses sintomas sejam tratados com

o uso de paracetamol. Diante de exantema maculopapular, é orientada a

administração de medicamento anti-histamínico (OMS, 2016a). O uso de ácido

acetilsalicílico não é recomendado devido ao risco de desenvolvimento da síndrome

de Reye (doença rara e grave que causa confusão mental, inchaço no cérebro e

danos ao fígado) em crianças e da possibilidade de ocorrência de complicações

hemorrágicas. Os pacientes devem ser aconselhados a beber bastante água,

principalmente aqueles que estiverem vomitando (BRASIL, 2015; OMS, 2016a).

Não há vacina para ZIKV, embora algumas estajam em fase de

desenvolvimento com a tecnologia da vacina contra a dengue. Portanto, são de

extrema importância ações que promovam o controle do vetor, evitando sua

proliferação. Tais ações são dificultadas por conta das características urbanas e

domiciliares do Aedes aegyptis e da grande importância epidemiológica e ampla

distribuição geográfica principalmente nas regiões tropicas, incluindo o Brasil. O

cuidado deve ser adicional nas primeiras horas da manhã e ao final da tarde,

período que corresponde ao de maior atividade desse vetor (SUMMERS et al.,

2015). Esses cuidados envolvem o uso constante de repelentes, roupas longas e

claras e uso de mosquiteiros (IOOS et al., 2014).

A redução da densidade do vetor é essencial para diminuir a possibilidade de

transmissão da doença. As ações com esse fim necessitam de adesão tanto das

- 21 -

instâncias governamentais e órgãos competentes, quanto da população em geral.

Em contrapartida, a sociedade também precisa se mobilizar e eliminar os possíveis

focos de Aedes presentes nas suas residências (OMS, 2016a).

Devido a possibilidade de transmissão do vírus por outras formas que não

através dos vetores (mãe para filho, sexual, transfusão de sangue, transplante) é

recomendado também implementar medidas de controle e prevenção que

considerem estas formas de transmissão como o uso de preservativo (OSTER et

al., 2016). A infecção pelo ZIKV passou a ser de notificação compulsória em 2016

devido ao aumento do número de casos e a associação com microcefalia no feto

(OMS, 2016b; CDC, 2016c).

1.1.6.8 Epidemiologia

O ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947, a partir de amostras de sangue

de macaco Rhesus sentinela estudado porum grupo de pesquisadores que

estudava imunidade de febre amarela entre os macacos da Floresta Zika, Uganda

(DICK et al., 1952). O nome da floresta onde ocorreu o primeiro isolamento foi dado

ao vírus.

Os primeiros casos de infecção humana pelo ZIKV foram descritos na África,

na década de 1960 e, em seguida, no sudeste da Ásia. Por aproximadamente meio

século, menos de 20 infecções humanas foram documentadas e a maioria dos

dados resultaram de inquéritos sorológicos do vírus da febre amarela (FAYE et al.,

2014).

Já em animais, o vírus foi isolado a partir de várias espécies de mosquitos

recolhidos durante estudos de arbovírus na África e de síndrome febril na Ásia

(DICK et al., 1952; MARCHETTE et al., 1969; CORNET et al., 1979).

Em 2007, foi registrada a primeira epidemia de febre do Zika, nas ilhas Yap

na Micronésia, quando cerca detrês quartos da população local foi infectada

(DUFFY et al., 2009). Após essa epidemia, infecções por ZIKV permaneceram

limitadas a casos esporádicos ou epidemias de pequena escala. A área de

distribuição e expansão do vírus faz dele causador de doença emergente

confirmadapelas epidemias que atingiram, posteriormente, a Polinésia Francesa

em 2013 e a Nova Caledônia em 2014 (CAO-LORMEAU et al., 2014; DUPONT-

ROUZEYROL et al., 2016).

- 22 -

Essas epidemias foram seguidas por surtos menores nas Ilhas Cook, Ilha de

Páscoa, Ilha Vanuatu, Ilha Salomão, Ilha Samoa,Ilha Fiji (ECDC, 2015) e em Cabo

Verde,África Ocidental (CDC, 2015b) e casos no Brasil (CAMPOS et al., 2015;

ZANLUCA et al., 2015) em 2015.No início de 2016, a circulação autóctone de ZIKV

foi relatada em mais de 20 países nas Américas do Sul, Central e do Norte, e

também no Caribe (HENNESSEY et al., 2016). A disseminação do ZIKV nos

continentes foi associada com a manifestações neurológicas, incluindo a sindrome

de Guillian-Barré em adultos na Polinésia Francesa (OEHLER et al., 2014) e no

Brasil e microcefalia em recém-nascidos no Brasil (SCHULER-FACCINI et al.,

2016a).

A circulação concomitante de ZIKV, DENV e CHIKV foi relatada na Polinésia

Francesa (CAO-LORMEAU et al., 2014) e no Brasil (CAMPOS et al., 2015).

Provavelmente, também ocorre em todas as Américas, Ásia, algumas ilhas do

Pacífico e África, onde DENV e CHIKV são endêmicos. É evidente que ZIKV seguiu

a mesma trajetória do DENV e CHIKV, espalhando-se para todos os países

infestados com Aedes aegypti e Aedes albopictus, mosquitos vetores desses vírus

(MUSSO et al., 2015).

Países como Filipinas e Tailândia têm relatado casos de ZIKV (ALERA et al.,

2015; BUATHONG et al., 2015). Casos importados foram relatados no Japão

(KUTSUNA et al., 2014; SHINOHARA et al., 2016), Austrália (PYKE et al., 2014;

LEUNG et al., 2015), Itália (ZAMMARCHI et al., 2015), Alemanha (TAPPE et al.,

2014), Noruega (WAEHRE et al., 2014), Canadá (FONSECA et al., 2014) e Estados

Unidos (FOY et al., 2011; SUMMERS et al., 2015; MCCARTHY, 2016).

Segundo a Organização PanAmericana da Saúde (OPAS, 2017b), a

transmissão autóctone de ZIKV ocorre em 40 países das Américas, incluindo a

Colômbia (16.419 casos relatados, 798 casos confirmados laboratorialmente),

Guatemala (17 casos suspeitos), México (transmissão local confirmada), Panamá

(três casos), Paraguai (seis casos confirmados laboratorialmente), Venezuela

(quatro caos confirmados laboratorialmente, 15 caso de SGB) e El Salvador (240

casos, 46 casos de SGB e 2 óbitos). Bolívia, Guiana, Equador, Guadalupe,

Guatemala, Porto Rico, Barbados, San Martin e Haiti relataram transmissão

ocasional após a introdução do vírus nesses países (OPAS, 2017b).

- 23 -

1.1.6.9 Zika vírus no Brasil

No Brasil, os primeiros casos suspeitos foram reportados em 2015 nas

cidades de Camaçari na Bahia e em Natal no Rio Grande do Norte. Os pacientes

apresentavam sintomas como erupções pruriginosas maculopapulares, cefaleia,

artralgia associada ou não a edema de extremidade, febre baixa ou ausente, dor

retro-orbitrária, mialgia e manifestações digestivas. A infecção pelo ZIKV foi

confirmada em amostras de soro de pacientes dos dois estados, através da

detecção do RNA do vírus por RT-qPCR (CAMPOS et al., 2015; ZANLUCA et al.,

2015).

Ainda em 2015, foram confirmados laboratorialmente três óbitos por ZIKV no

país: em São Luís, no Maranhão, Benevides, no Pará e Serrinha, no Rio Grande

do Norte. Foram registrados 215.319 casos prováveis de febre pelo ZIKV (taxa de

incidência de 105,3 caso/100 mil habitantes) distribuídos em 2.306 municípios,

tendo sido confirmados 130.701 (60,7%) dos casos. A análise da taxa de incidência

de casos prováveis (por 100 mil habitantes)porregiões geográficas demostrou que

a região Centro-Oeste apresentou a maior taxa de incidência (222casos/100 mil

habitantes). Destacam-se ainda, 671casos/100 mil habitantes em Mato Grosso,

414,2 casos/100 mil hibitantes no Rio de Janeiro e 340,5 casos/100 mil hibitantes

na Bahia (OPAS, 2017).

Segundo a Secretaria de Vigilância em Saúde (2017), o Brasil foi o primeiro

país a relatar óbitos confirmados por ZIKV. Uma das hipóteses levantadas para

explicar esses óbitos seria a mutação da variante circulante no Brasil para uma

mais virulenta. Associando os óbitos e os casos de microcefalia relatados durante

a epidemia no Brasil, alguns estudos relataram que as mutações no gene que

codifica a proteína do envelope viral de outros membros da família Flaviviridae

aumentaram a sua virulência e a sua capacidade de danificar o sistema nervoso

central (SIPS et al., 2012), sendo esssa uma possível explicação para o que

ocorreu no Brasil. Em relação às gestantes, foram registrados 17.000 casos

prováveis, sendo 11.052 confirmados por critério clínico-epidemiológico ou

laboratorial, segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação

em 2017 (OPAS, 2017).

Em 2018, até a Semana Epidemiológica (31/12/2017 a 20/01/2018), foram

registrados 131 casos prováveis de febre pelo vírus Zika no país, com taxa de

- 24 -

incidência de 0,1 casos/100 mil hab. Destes, 19 (14,5%) foram confirmados. A

análise da taxa de incidência de casos prováveis de Zika (número de casos/100 mil

hab.), segundo regiões geográficas, demonstra que as regiões Centro-Oeste,

Nordeste e Norte apresentam as maiores taxas de incidência: 0,2, casos/100 mil

hab. e 0,1 casos/100 mil hab., respectivamente. Entre os Estados, destacam-se

Goiás (0,4 casos/100 mil hab.), Rio Grande do Norte (0,3 casos/100 mil hab.),

Rondônia (0,2 casos/100 mil hab.) e Acre (0,2 casos/100 mil hab.). Até fevereiro

de 2018 nenhum óbito por vírus Zika foi confirmado (Secretaria de Vigilância em

Saúde, 2018).

Em relação às gestantes, foram registrados 40 casos prováveis, sendo cinco

confirmados por critério clínico-epidemiológico ou laboratorial, segundo dados da

Secretaria de Vigilância em Saúde (2018).

1.2 ANTIVIRAIS

1.2.1 IMPORTÂNCIA DA TERAPÊUTICA ANTIVIRAL

As pesquisas na área da quimioterapia antiviral efetivaram-se no início da

década de 1950, quando a investigação de agentes antineoplásicos levou ao

desenvolvimento de novos compostos capazes de inibir a síntese do DNA viral

(SAFRIN, 2008). Os testes in vitro de sensibilidade aos compostos antivirais

diferem significativamente daqueles aplicados a agentes antibacterianos. Como os

vírus necessitam de células para replicar, os sistemas de sensibilidade empregam

culturas de células.

Em geral, uma redução maior que 50% nos efeitos virais identifica um agente

como ativo contra determinado vírus (PATRICK, 2005). Muitos compostos antivirais

têm atividade in vitro contra diferentesvírus, mas não são eficazes clinicamente. A

distribuição da droga, tempo de infecção e problemas de administração pode limitar

a utilidade de muitos fármacos (WIGG, 2002).

Muitos fármacos são convertidos no organismo em compostos ativos ou

devem estar presentes continuamente para exercer um efeito antiviral. Os vários

testes in vitro de sensibilidade viral não podem reproduzir com exatidão todas as

situações in vivo (SQUIRES, 2001). De acordo com Page e colaboradores (2004),

a eficácia terapêutica de uma droga antiviral pode ser avaliada in vitro. No entanto,

a inexistência de testes padronizados dificulta interpretações rigorosas a respeito

das associações entre concentração das drogas e seus efeitos antivirais.

- 25 -

1.2.2 ANTIVIRAIS PARA ZIKA VÍRUS

Um problema das infecções por vírus emergentes é a falta de medidas

médicas disponíveis, incluindo o tratamento antiviral. Portanto, o desenvolvimento

de compostos antivirais de ação ampla e o rastreio de drogas existentes para o

potencial de reutilização são explorados como formas de acelerar o processo de

tratamento de doenças virais emergentes (MUMTAZ et al., 2016).

Atualmente não há medicamentos antivirais específicos para o tratamento de

ZIKV. A literatura relata a atividade anti ZIKV de alguns medicamentos

comercialmente aprovados como a cloroquina, daptomicina, ciclosporina,

micafungina e sofosbuvir (DELVECCHIO et al., 2016; LI et al., 2017; BARROW et

al., 2016; FERREIRA et al., 2017).

Alguns análogos de nucleósidos como o nucleósidos 2'-C-metilados, 7-deaza-

2'-C-metiladenosina (7DMA), 2'-C-metilcitidina (2CMC), ribavirina, favipiravir, T-

1105 mostraram atividade anti ZIKVin vitro (CAI et al., 2017, KAMIYAMA et al.,

2017). Além disso, o 7DMA também apresentou atividade in vivo contra o Zika

(ZMURKO et al., 2016).

A ribavirina e o favipiravir já estão aprovados para uso como medicamentos

antivirais contra o vírus da hepatite C e o vírus influenza A, respectivamente. Um

estudo recente mostrou a atividade inibitória desses dois fármacos contra as duas

linhagens de ZIKV (asiática e africana) em cultura de células (KIM et al., 2018).

Um grande desafio é como e quando esse tratamento anti ZIKV seria aplicado,

pois o medicamento deve estar ativo em células do sistema nervoso central,

atravessar a barreira hematoencefálica e transplacentária além de ser seguro para

as gestantes, seus fetos e bebês (JURADO et al., 2018).

O perfil de toxicidade de alguns desses medicamentos e inclusive a

teratogenicidade, limita o uso para tratar infecções por ZIKV em gestantes. Além

disso, a monoterapia pode provocar aparecimento de cepas resistentes enfatizando

a necessidade de desenvolvimento de fármacos com diferentes mecanismos de

ação (JURADO et al., 2018).

Diante disso, faz-se necessário a pesquisa com objetivo de sintetizar ou

procurar na natureza novas moléculas com atividade anti ZIKV.

- 26 -

1.2.3 PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTIVIRAL

Os produtos naturais são a base de muitos fármacos atualmente disponíveis

no mercado para o tratamento de muitas doenças humanas. Estima-se que cerca

de 50% dos medicamentos comercializados ainda têm sua origem em fontes

naturais. O sucesso é devido, em parte, à rica diversidade química encontrada em

extratos microbianos, de algas e em fontes botânicas (NIELSEN, 2002).

A química de produtos naturais, além de desempenhar um papel fundamental

no estudo da biodiversidade, é uma poderosa ferramenta para agregar valor a um

bioma, pela descoberta de novas moléculas bioativas ou pela aplicação das

substâncias já conhecidas em outras áreas da ciência. Os avanços nas técnicas de

separação e os métodos espectroscópicos modernos de identificação permitem

que os químicos de produtos naturais, em colaboração com botânicos e biólogos,

tracem perfis químicos de extratos brutos vegetais (CASTRO-PEREZ, 2007).

A busca racional por substâncias bioativas de fontes naturais como plantas,

algas, microrganismos, insetos ou animais marinhos é de extrema importância, pois

estes metabólitos podem fornecer protótipos de estrutura molecular complexa, que

dificilmente seriam obtidos por síntese ou pela química combinatória. As plantas

contém uma diversidade de compostos bioativos de várias classes (taninos,

flavonóides, terpenóides, cumarinas, proteínas, peptídeos e catequinas), algumas

delas, como o galato e epigalocatequina, com atividade anti-HIV (FERREIRA et al.,

2010).

O Brasil, com sua costa extensa, diversidade biológica invejável e um grande

número de pesquisadores na área de química de produtos naturais, não pode

abdicar dos estudos sobre o potencial tecnológico dos organismos marinhos.

Atualmente, vários grupos estão investigando substâncias isoladas de bactérias,

algas, fungos e invertebrados marinhos, com visão no seu potencial contra câncer,

trombose, infecções virais, bacterianas, parasitárias, fúngicas, etc. (SINGH &

BODIWALA, 2010).

1.2.3.1 Substâncias com atividades antivirais extraídas de algas marinhas

As algas marinhas são fontes ricas de metabólitos secundários bioativos de

estruturas e atividades diversas (BLUNTet al., 2010). Antes da década de 1950, as

propriedades medicinais das algas marinhas eram restritas aos medicamentos

tradicionais e populares (LINCOLN et al.,1991). A partir de 1980, foi descoberta

- 27 -

uma série desses metabólitos com propriedades farmacológicas, inclusive

antivirais, em bactérias marinhas, invertebrados e algas (GOUVEIA, 2012).

As macroalgas vermelhas encontram-se no filo Rhodophyta, com mais de

6.500 espécies (BURKHOLDER & SHARMA, 1969). Extratos da alga vermelha

Gelidium cartilagenium contêm polissacarídeos que inibem herpesvírus simplex

tipo 1 (HSV-1)(RICHARDS et al.,1978). RODRIGUEZ e colaboradores (2005)

isolaram três frações da alga Callophyllis variegata com atividade antiviral contra

HSV-1, HSV-2 e DENV-2. Todos os extratos e frações mostraram baixa

citotoxicidade para células de rim macaco verde africano (Vero), sugerindo que

extratos e frações contém compostos que são promissores agentes antivirais.As

algas pardas pertencem ao filo Phaeophytae são representantes macroscópicas da

grande e diversificada divisão das Ochrophyta.

As algas pardas são representantes conspícuos, tanto dos mares

temperados, onde se encontram as macroalgas gigantes, quanto dos mares

tropicais, caracterizados pela presença de grandes bancos formados por espécies

das ordens Fucales e Dictyotales (GRAHAM & WILCOX, 2008). As fucanas ou

fucoidanas, polissacarídeos sulfatados dessas algas, são também inibidores da TR

(transcriptase reversa) do HIV (QUEIROZ et al.,2008). O polissacarídeo da

Adenocystis utricularis foi capaz de exibir atividade do HSV-1 e 2 (PONCE et al.,

2003).

As substâncias terpenoídicas estão presentes tanto em algas vermelhas

quanto em pardas, com a diferença de que, nas primeiras, estas substâncias

apresentam-se normalmente halogenadas. As espécies do gênero Dictyota

representam uma fonte importante de diterpenos (NINOMYA et al.,1995; VALLIMet

al., 2005). Da Dictyota pfaffii foram isolados e testados dois diterpenos do tipo

dolabellano (grupo IIa) que, ao lado de um derivado reduzido, exibiram forte

atividade anti HSV-1 in vitro, mas pequena inibição sobre a transcriptase reversa

do HIV-1 (BARBOSA et al., 2004). No entanto, o produto de transformação 8,10,18-

tri-hidróxi-2,6-dalabelladieno foi mais efetivo contra o HIV-1 (CIRNE-SANTOS et al.,

2008). Os diterpenos inibiram a replicação deste vírus em células mononucleares

sanguíneas periféricas primárias humanas e em macrófagos, agindo como

inibidores da síntese/integração do DNA pró-viral, além de potencializar a atividade

antirretroviral do sulfato de azatanavir (BARBOSA et al., 2004; CIRNE-SANTOS et

al., 2006; 2008).

- 28 -

As algas verdes pertencem ao filo Chlorophytae são compostas por cerca de

8.000 espécies macro e microscópicas, marinhas e dulcícolas (VAN DER HOEK et

al.,1995). A espécie Caulerpa racemosa pode colonizar rapidamente novos

ambientes, formando coberturas monoespecíficas, sendo, portanto, considerada

invasora (DUMAY et al., 2002).

Há poucos estudos brasileiros sobre o isolamento e a elucidação estrutural de

produtos naturais de algas verdes bentônicas marinhas, com exceção de alguns

estudos com a caulerpina (WANGet al., 2007). A caulerpina é um dímero do ácido

3-indol-acrílico isolado de mais de 12 espécies de Caulerpa, de Codium

decorticatum, Halimeda incrassatae, das algas vermelhas Laurencia majuscula,

Hypnea musciformis, Caloglossa leprieuri e Chondria armata (GÜVEN et al., 2010).

Pinto e colaboradores (2012) relataram a atividade antiviral da caulerpina contra o

Vírus da Diarréia Viral Bovino (BVDV).

De outros gêneros de algas verde como a Bryopsis, do Havaí, isolou-se o

composto Kahalalide que possui atividade antiviral contra HSV-2 (HAMANN

&SCHEUER, 1993), a espécie Ulva fasciata, coletada na Índia, foi isolado o eritro-

sphinga-4,8-dien-N-palmitate, que apresentou atividade antiviral contra HSV- 1 e

HIV (SHARMAet al., 1996).

O gênero Enteromorpha possui potencial para alimentação, sendo encontrado

abundantemente na costa brasileira. A constatação da atividade antioxidante

poderia elevar potencialmente seu valor como alimento humano e expandir seu

mercado consumidor (RAYMUNDO et al., 2004).

No gênero Prasiola, a espécie Prasiola crispa apresentou excelente atividade

anti herpesvirus de equino tipo 1 (MARINHO et al., 2016).

1.2.3.2 Substâncias com atividades antivirais extraídas plantas

A utilização de plantas como fonte de substâncias antivirais é uma das

alternativas para o controle e tratamento de infecções virais. A seleção de espécies

vegetais a partir de dados etnofarmacológicos para estes estudos fornece

percentual maior de descoberta de novos compostos bioativos (DI STASI, 1996;

YUNES & CALIXTO, 2001; MACIEL et al., 2002). Entretanto, a disponibilidade do

material vegetal pode dificultar as pesquisas com produtos naturais, principalmente

daquelas espécies que podem estar em risco de extinção, em consequência do

extrativismo, desmatamento e da degradação ambiental (SIMÕES et al., 2004).

- 29 -

Além disso, para a identificação do princípio ativo é necessária grande quantidade

de matéria prima, a fim de realizar o fracionamento e determinação dos compostos

químicos (YUNES & CALIXTO, 2001).

Deste modo, a utilização de plantas medicinais cultivadas pode minimizar este

problema. As principais vantagens de se estudar plantas medicinais cultivadas são

os produtos de alta qualidade, produção em alta escala fornecendo grande

quantidade de matéria prima, baixo custo e preservação do meio ambiente.

Também se obtém a homogeneidade dos compostos químicos, já que a forma de

cultivo e a adaptação da planta a determinadas condições de clima, solo, altitude e

fertilidade podem influenciar a composição das substâncias nas plantas (DI STASI,

1996; SARTÓRIO et al., 2000).

1.2.3.2.1 Atividade biológica da Bixa orellana L - Urucum

A Bixa orellana L. é uma planta pertencete a família Bixaceae, gênero Bixa.

No Brasil a Bixa orellana L. é popularmente conhecida como urucum, um arbusto

nativo do Brasil mais especificamente da região amazônica. A Bixa orellana L. pode

ser encontrada em outros países da América do Sul e em outras regiões tropicais

do mundo com denominação annatto. Do pericarpio da semente da Bixa orellana

L. extrai-se o urucum, cujo interesse está relacionado com as suas propriedades

biológicas e aplicação nas indústrias de medicamentos, cosméticos, têxteis e de

alimentos (FRANCO, 2008).

A palavra urucum tem origem do tupi-Guarani “uru-ku” e significa vermelho. É

denominado, cientificamente, como Bixa orellana L. em homenagem a Francisco

de Orellana o primeiro explorador espanhol que navegou o rio Amazonas

(CARVALHO & HEIN, 1989).

A ampla distribuição geográfica dessa planta fez com que ela se tornasse

conhecida por muitos nomes. No Brasil Bixa orellana L. é conhecida como urucum,

urucu, urucu-uva, urucu-bravo, açofroa e bixa. Na América espanhola como

achiote, onotto, roekoe, bija, uruca. Na Espanha tem o nome de bija, na França de

rocouyer, na Alemanha de orlenasbaum, na Itália, Inglaterra e Estados Unidos de

annatto e na índia como kolssewil (CORREA, 1975; MARTORELL, 1975; SANTOS,

1958).

- 30 -

A primeira referência ao urucum foi atribuída à carta de Pero Vaz de Caminha

ao Rei D. Manuel informando a descoberta do Brasil dizia um trecho da carta:

“E segundo diziam esses que lá tinham ido, brincaram com eles.

Neste dia os vimos mais de perto e mais à nossa vontade, por

andarmos quase todos misturados: uns andavam quartejados

daquelas tinturas, outros de metades, outros de tanta feição como

em pano de ras, e todos com os beiços furados, muitos com os

ossos neles, e bastantes sem ossos. Alguns traziam uns ouriços

verdes, de árvores, que, na cor, queriam parecer de castanheiras,

embora mais pequenos. E eram cheios duns grãos vermelhos

pequenos, que, esmagando-os entre os dedos, faziam tintura muito

vermelha, de que eles andavam tintos. E quanto mais se

molhavam, tanto mais vermelhos ficavam”.

Nos escritos da História das antigas civilizações das Américas Central e do

Sul relatam que os astecas usavam os pigmentos de urucum para dar consistência

e aparência de sangue a uma bebida preparada a partir do cacau. Essa bebida era

utilizada em seus rituais simulando sangue humano. Os nativos da América do Sul

usavam óleos, ceras e gorduras extraídas de plantas ou animais para a preparação

dos corantes de urucum (ALMEIDA, 1931). Segundo Patino (1967) o urucum era

utilizado por essas civilizações como inseticida.

Para consumo o urucum passou a ser feito com a semente moída com

adenominação de colorau, em referência a uma especiaria portuguesa de

coloração similar feita com pimentão vermelho moído. Com o aumento do consumo

desse corante e a escassez das sementes de urucum a alternativa encontrada na

época foi a adição de milho às sementes de urucum (FREIRE, 1936). No século

XVIII os ingleses descobriram que o urucum é um corante muito útil na fabricação

de queijos. O urucum foi o primeiro corante vegetal a ser comercializado em larga

escala para a Europa (PATINO, 1967).

O Brasil é o maior produtor mundial de sementes e corantes de urucum, com

uma produção estimada anual de aproximadamente de 13.000 Toneladas.São

Paulo é o maior produtor brasileiro, seguido de Rondônia, Pará e Paraná. As

principais empresas processadoras de urucum estão instaladas principalmente ao

redor da Grande São Paulo e na região metropolitana de Campinas. O principal

produto derivado das sementes de urucum ainda é o colorau mas seus pigmentos

- 31 -

são encontrados em muitos produtos como massas, salsichas, queijos prata,

sorvetes, iogurtes, temperos, etc (SNA, 2015).

As bases químicas dos pigmentos do urucum são estudadas. A bixina, o

principal pigmento das sementes de urucum, foi primeiramente isolada

por Boussingault (1825). A elucidação de sua fórmula molecular foi apresentada

por Heiduschka & Panzer (1917) e Herzig & Faltis (1923) onde descreveram a

bixina como um éster monometílico de um ácido dicarboxílico insaturado.

Outros componentes de diversas partes do urucum têm sido isolados

(derivados isoprenóides, carotenóides, hidrocarbonetos aromáticos e flavonoides)

e testados para a verificação de sua atividade biológica. (DA COSTA&CHAVES,

2005; SANTOS, 2009). Muitos isoprenóides já foram identificados na semente de

urucu(geranilgeraniol, farnecilacetona, formiato de geranilgeranila, tocotrienol). O

geranilgeraniol, o constituinte predominante é encontrado na parte externa da

semente e óleo essencial do urucumem teores próximos a 2% (NARVAEZ et al.,

2001, DA COSTA & CHAVES, 2005; STRINGHETA & SILVA, 2008).

De acordo com Jondiko & Pattenden (1989) e Silva & colaboradores (2010) o

geranilgeraniol é um álcool diterpeno de cadeia linear utilizado nas biossínteses de

da vitamina K, tocoferóis, tocotrienóis, diversos hormônios e carotenóides. Na

medicina, o geranilgeraniol é utilizado na profilaxia e no tratamento de diversos

tipos de câncer, na inibição do crescimento de Staphylococcus aureus (INOUE et

al., 2005), no combate ao Tripanossoma cruzi (MENNA-BARRETO, et al., 2009) e

como inibidor da Micobacteria tuberculosis (VIK et al., 2007), entretanto até o

momento não há relatos sobre sua atividade antiviral.

Diante do cenário apresentado, torna-se essencial a pesquisa de novos

protótipos promissores que tenham efeitos tóxicos em células de Aedes (C6/36)

e/ou que interfiram na produção do Zika vírus bloqueando seu ciclo de replicação.

- 32 -

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a citotoxicidade e a atividade anti ZIKV da caulerpina e do diterpeno

10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene (obtidos de algas marinhas) e do

geranilgeraniol (obtido da semente de urucum).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar o título da amostra padrão ZIKV MR766 por Reed Müench,

Ensaio de placa de lise e One-Step RT-qPCR.

2. Avaliar a citotoxicidade (CC50) das substâncias caulerpina, diterpeno 10,18-

diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene e geranilgeraniol em células Vero,

HEK 293 e C6/36.

3. Estabelecer protocolo de One-Step RT-qPCR para avaliação da atividade

antiviral dessas três substâncias.

4. Avaliar a atividade anti ZIKV (EC50), em células Vero, das três substâncias

por Reed Müench e One-Step RT-qPCR.

5. Determinar se as três substâncias tem potencial promissor para serem

utilizadas como antiviral para o ZIKV.

- 33 -

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 LINHAGENS CELULARES

Células de rim de macaco verde africano (Vero-ATCC®CCL-81™) e células de

rim de embrião humano (HEK 293 - ATCC®CRL-1573™) foram cultivadas em

garrafas de 75 cm2 (SPL Life Sciences) contendo meio mínimo essencial de Eagle’s

modificado por Dulbecco (D-MEM) suplementado com 5% de soro fetal bovino

(Gibco BRL, Life Technologies), penicilina/estreptomicina (2,5 μg/L), gentamicina

(50 µg/mL), L-Glumanina 2%, fungizona (2,5 μg/L) e bicarbonato de sódio 7,5% e

mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37 ºC.

Células de Aedes Albopictus C6/36 (ATCC® CRL-1660™) foram cultivadas e

em garrafas de 75 cm2 (SPL Life Sciences) contendo meio Leibovitz (L-15, Gibco

BRL, Life Technologies) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco BRL,

Life Technologies), penicilina/estreptomicina (2,5 μg/L), gentamicina (50 µg/mL), L-

Glumanina 2%, fungizona (2,5 μg/L) e bicarbonato de sódio 7,5% e mantidas em

estufa com 5% de CO2 a 28 ºC.

3.2 PRODUÇÃO DA MASSA VIRAL DA AMOSTRA ZIKV MR766

O ZIKV MR766 é uma estirpe africana que foi inicialmente isolado de macaco

Rhresus na Uganda, África. Essa cepa teve seu genoma completamente

sequenciado pela primeira vez em 2007 a partir de amostras de cérebro de

camundongo infectado.

A amostra ZIKV MR766 utilizada nesse trabalho foi gentilmente cedida pelo

Dr. Davis Fernandes Ferreira do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e Dra. Izabel Paixão do Laboratório

de Virologia Molecular e Biotecnologia Marinha do Instituto de Biologia da UFF.

Para produção do estoque viral, uma suspensão contendo 1 MOI do ZIKV

MR766 foi inoculada em garrafa de 75 cm2 contendo células Vero (1x10⁴

células/mL) com 24 h de crescimento e 80% de confluência. Após 3 h de adsorção

a 37 ºC, o inóculo foi descartado e as células foram lavadas duas vezes com meio

D-MEM sem soro fetal bovino. Em seguida, foram adicionados 10 mL de meio de

manutenção (D-MEM contendo 2% de soro fetal bovino) e as células foram

reincubadas por 96 h a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO2, com observação diária

do efeito citopático. Após esse período, as células foram congeladas e

- 34 -

descongeladas três vezes. As suspensões foram clarificadas a 10.000 x g por 15

minutos para remoção dos debris celulares, aliquotadas, estocadas a -70 ºC e

posteriormente tituladas .

3.3 DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DO ESTOQUE DE ZIKV MR766

O título do estoque da amostra viral foi determinado pelo método de Reed

Müench, Ensaio de Placa de Lise e pela quantificação do genoma viral pelo método

quantitativo One-Step RT-qPCR.

3.3.1 TITULAÇÃO DO ESTOQUE DE ZIKV MR766 PELO MÉTODO DE REED

MÜECHEN

A amostra foi titulada, segundo o método das diluições limites, com cálculo do

ponto de 50% de infecção, de acordo com a metodologia clássica de Reed Müench

(LENETTE, 1964). O título infeccioso foi determinado pelo valor recíproco da

diluição do vírus com capacidade de infectar 50% das células inoculadas (Apêndice

9.1).

3.3.2 TITULAÇÃO DO ESTOQUE DE ZIKV MR766 PELO MÉTODO DE ENSAIO

DE PLACA DE LISE

A amostra também foi titulada pelo método do ensaio de placas de lise,

seguindo protocolo previamente descrito por Pinto e colaboradores (2014) com

modificações. Células vero cultivadas em placas de 24 poços (1x104 células/mL)

foram infectadas com 200 µL de diluições seriadas (10-1-10-10) do ZIKV MR766.

Após período de adsorção (3 h a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO2), o inóculo foi

removido para adição do meio de cobertura (metilcelulose 1,5% em D-MEM

contendo 2% de soro fetal bovino certificado da Invitrogen). Após reincubação de

96 h pós infecção (p.i.), as monocamadas foram fixadas e coradas com solução de

cristal violeta (CV) a 0,2% em formaldeído 10% e o título da amostra determinado,

como Unidade Formadora de Placa (P.F.U) de acordo com a fórmula:

P. F. U / mL = Total de placas de lise contadas x Recíproca da diluição

Volume do inóculo (µL) x 5

- 35 -

Onde,

Recíproca da diluição é o inverso da maior diluição em que se observou formação

de placas.

O volume foi multiplicado por 5 para corrigir o volume de amostra MR766 inoculado

de 200 µL para 1 mL.

3.3.3 TITULAÇÃO DO ESTOQUE DE ZIKV MR766 PELO MÉTODO ONE-STEP

RT-qPCR

Para a quantificação do estoque viral e posteriores análises, foi estabelecido

um protocolo de One-Step RT-qPCR utilizando curva padrão sintética desenhada

para esse estudo.

3.3.3.1 Extração do genoma viral

O RNA total do ZIKV foi extraído de 200 L do sobrenadante do estoque (item

3.2) utilizando-se o Kit PureLink™ Spin Column-Based Kit (Invitrogen® Life

Technologies, EUA), conforme recomendações do fabricante. Os RNAs extraídos

foram eluídos em Tris 10 mM contendo EDTA 1 mM (TE), aliquotados,

armazenados a -70 ºC e quantificados pela técnica de One-Step RT-qPCR

utilizando sistema de sonda de hidrólise TaqMan®.

3.3.3.2 Detecção e quantificação de genoma do ZIKV MR766 pela técnica de

One-Step RT-qPCR

Os iniciadores e a sonda utilizados para o estabelecimentoda técnica One-

Step RT-qPCR foram direcionados para a região do gene que codifica para a

proteína de envelope PrM do ZIKV, conforme previamente descrito por Lanciotti e

colaboradores (2008) (Quadro 1).

Quadro 1: Iniciadores e sonda utilizados no One-Step RT-qPCR para quantificação e

amplificação parcial do gene que codifica a proteína de envelope PrM do ZIKV.

Iniciadores Sequência (5´3´) Posição no

Genoma Referência

Sonda FAM-

AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA-ZENTM-lowaBlack®FQ

1107 – 1137 LANCIOTTI et

al., 2008

Primer Forward ZIKV 1086

CCGCTGCCCAACACAAG 1086 – 1102

Primer Reverse ZIKV 1162c

CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT 1162 – 1139

- 36 -

A curva sintética padrão utilizada nesse estudo foi desenhada pela Prof. Dra.

Ana Maria Viana Pinto (Universidade Federal Fluminense - UFF) e pelo Dr. Tulio

Machado Fumian (Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental, Instituto

Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz – LVCA/IOC/FIOCRUZ). Como modelo, foi

utilizada a sequência do gene que codifica para a proteína de envelope PrM do Zika

vírus variante ZIKASPH2015, submetida em 21 de dezembro de 2015 com acesso

disponível no Genbank (KU321639). A região escolhida para desenho da curva

padrão localiza-se entre a posição 1168 e 1294 do genoma do ZIKV (Figura 7).

5’ATATCAGACATGGCTTCGGACAGCCGCTGCCCAACACAAGGTGAAGCCTACCTT

GACAAGCAATCAGACACTCAAATGTCTGCAAAAGAACGTTAGTGGACAGAGGCTG

GGGAAATGGATGTGGA-3’

Figura 7: Sequência da curva sintética padrão utilizada no protocolo de One-Step

RT-qPCR. Ela compreende os nucleotídeos 1168 a1294 do gene que codifica para

a proteína PrM do Zika vírus. Em amarelo, rosa e verde estão sinalizadas as

sequências dos iniciadores Foward, Reverse e sonda, respectivamente.

Cinco microgramas do DNA liofilizado (curva sintética) foram diluídos em 200

µL de tampão TE pH 8,0. O número de cópias genômicas por µL (CG/µL) foi

calculado a partir da concentração de DNA medida em Nanodrop 2000®(Thermo

Scientific, EUA) e conforme cálculos no programa disponível em:

http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html.

Número de cópias-alvo = concentração em g/μL x número de Avogadro

(moléculas/μL) Nº de pares de bases x PM médio de um par de bases

Onde,

número de Avogadro = 6.0221409e+23; N º de pares de bases = 126; PM médio

de um par de bases = 660

A partir da concentração de DNA obtido, foram realizadas diluições seriadas

da curva na base 10 (de 10-1 a 10-7). Essas diluições foram aliquotadas para uso

único em cada experimento e armazenadas a -70 oC. Os parâmetros de qualidade

da curva padrão (R2, Slope e eficiência) foram determinados. As reações de qPCR

foram realizadas como kit GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega,

EUA), conforme recomendações do fabricante (Quadro 2).

- 37 -

Quadro 2: Composição da mistura de reagentes para detecção e quantificação do gene

que codifica a proteína de envelope PrM do ZIKV por One-Step RT-qPCR.

Reagentes

Volume da Reação (1x)

Amostras Curva

sintética

Controle

negativo

Água DNAse/RNAse livre 1,6 µL 1,6 µL 1,6 µL

GoTaq®Probe qPCR Master Mix (2X) 10 µL 10 µL 10 µL

GoScript ™ RT Mix para 1-Step RT-qPCR 0,4 µL 0,4 µL 0,4 µL

Primer Forward (20 µM) 1,0 µL 1,0 µL 1,0 µL

PrimerReverse (20 µM) 1,0 µL 1,0 µL 1,0 µL

Sonda (200 µM) 1,0 µL 1,0 µL 1,0 µL

Amostra 5,0 µL - -

Curva Padrão - 5,0 µL -

Controle negativo - - 5,0 µL

Volume Final 20 µL 20 µL 20 µL

O material genético foi amplificado emtermociclador ABI Prism 7500 SDS

(Applied Biosystems, EUA) com programação das condições de amplificação

sugeridas pelo fabricante do kit GoTaq® 1-Step RT-qPCR System (Quadro 3).

Quadro 3: Condições de amplificação utilizadas na detecção e quantificação do ZIKV pela

técnica de One-Step RT-qPCR.

Todos os experimentos incluíram curva padrão, controles positivos

(ZIKVMR766) e negativos (água) e No Template Controls (NTC). Todas as

amostras foram testadas em duplicata.

Etapas de reação Número de

ciclos Temperatura Tempo

Transcrição Reversa 1 45 ºC 15 minutos

Inativação da trascriptase

reversa e Ativação GoTaq®

polimerase

1 95 ºC 2 minutos

Desnaturação 1 95 ºC 15

segundos

Hibridização e Extensão 40 60 ºC 1 minuto

- 38 -

3.5 MOLÉCULAS NATURAIS ISOLADAS DE ALGAS MARINHAS E DA

SEMENTE DE URUCUM

As moléculas utilizadas nesse estudo foram obtidas da alga verde Caulerpa

racemosa (caulerpina), da alga parda Dictyota pfaffii (diterpeno 10,18-diacetoxy-8-

hydroxy-2,6-dolabelladiene) e da semente de urucum (geranilgeraniol).

O isolamento, purificação e elucidação estrutural da caulerpina (CAV) e do

diterpeno 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene (DIP) (Figura 8) foram

realizados pelo grupo da Prof. Dra. Valéria L. Teixeira do Laboratório de Produtos

Naturais de Algas Marinhas (Algamar) do Instituto de Biologia da UFF de acordo

com o método estabelecido por Ferreira (2009) e Cavalcanti e colaboradores (2006,

2011).

CAV DIP

Figura 8: Estrutura da caulerpina (CAV) isolada da alga verde Caulerpa racemosa

e do diterpeno 10,18-diacetoxy-8-hydroxy-2,6-dolabelladiene (DIP) isolado da alga

parda Dictyota pfaffii.

O isolamento, purificação e elucidação estrutural do geranilgeraniol (GE) foi

realizado pelo grupo da Prof. Dra. Diana Negrão Cavalcanti do Laboratório de

Produtos Naturais de Algas Marinhas (Algamar) do Instituto de Biologia da

Universidade Federal Fluminense.

Sementes secas (87,39 g) de Bixa orellana L. foram extraídas exaustivamente

em hexano (100 mL) à temperatura ambiente. A evaporação do solvente sob

pressão reduzida produziu um resuo de cor laranja (4% em peso seco das

sementes). O extrato bruto (1,0 g) foi fracionado em sílica gel 60 para cromatografia

em coluna (70-230 mesh ASTM) e então eluído com 100% n-hexano: EtOAc a 5: 5

[vol / vol], em etapas de 10% e 200 mL, dos quais 69 frações foram obtidas. O

fracionamento foi monitorado por cromatografia em camada delgada (sílica gel de

- 39 -

TLC 60 F254) e analisado por ressonância magnética nuclear 1H e 13C (RMN). A

fração bioativa (F23-25; 165,0 mg) foi recromatografada sucessivamente em sílica.

Coluna gel 60 (230-400 mesh-ASTM) usando n-hexano: EtOAc (8: 2 [vol / vol]). As

frações da coluna foram analisadas e as frações com padrões de traçado

semelhantes no TLC (sílica gel 60 F254) foram reunidas para originar composto 1

(130,0 mg). A estrutura do geranilgeraniol (Figura 9) foi então determinada por

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C e comparado com a literatura

(JONDIKO & PATTENDEN, 1989).

GE

Figura 9: Estrutura do geranilgeraniol (GE) isolado da semente de urucum.

3.6 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DAS SUBSTÂNCIAS (CC50)

A citotoxicidade das três moléculas estudadas foi avaliada por três

metodologias: sal tetrazólico 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium

bromide (MTT) (MOSMANN, 1983), vermelho neutro (VN) (FAUTZ et al., 1991) e

cristal violeta (CV) (SAOTOME et al., 1889). As substâncias foram testadas nas

concentrações 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 µM.

Duzentos microlitros de cada concentração foram adicionados em triplicata ao

cultivo de células Vero, HEK 293 ou C6/36 (1x104 células/mL) em placas de 96

poços com 24 h de crescimento. Seis cavidades contendo cultivo de células sem

tratamento foram utilizadas como controle de células (100% de viabilidade ou 0%

de citotoxicidade). As placas foram incubadas a temperatura de 37 ºC (Vero e HEK

293) e 28 ºC (C6/36) em ambiente de 5% CO2 por 96 h. Após este período, as

placas foram divididas em três grupos para determinar a concentração das

moléculas capaz de matar 50% das células (CC50).

- 40 -

Método 1: Avaliação da interferência das substâncias na respiração

celular por sal tetrazólico (MTT) – Para determinar o efeito tóxico das substâncias

na mitocôndria, 100 µL da solução de 1mg/mL de MTT foram adicionados em todas

as cavidades das placas contendo células tratadas e não tratadas com as

moléculas. As placas foram reincubadas por 3 h à temperatura de 37 ºC ou 28 ºC

em ambiente de 5% CO2. Após este período, o MTT foi descartado e adicionou-se

100 µL de DMSO PA. Após homogeneização e 15 min a temperatura ambiente, a

leitura da densidade ótica foi realizada pela leitora de ELISA DR-200 Bs/ Microplate

Reader (Kazuaki, Hangzhou city, China) utilizando filtro de 540 nm. O valor do CC50

foi calculado por regressão linear.

Método 2: Avaliação da integridade de membrana lisossômica pela

retenção do vermelho neutro (VN) – Para determinar o efeito tóxico das

substâncias no lisossomo, os sobrenadantes das placas contendo células tratadas

e não tratadas com as substâncias foram descartados para adição de 100 μL de

VN 0,01%, em todas as cavidades. Em seguida, as placas foram reincubadas a 37

ºC ou 28 ºC por 3 h em ambiente de 5% CO2 para penetração do corante nas células

vivas. O corante foi descartado e as células fixadas com 100 μL de solução de

formaldeído a 4% em PBS por 15 minutos, seguido da eluição do corantedas

células com 100 μL de solução de ácido acético 1% em metanol 50%. A leitura da

densidade ótica foi realizada pela leitora de ELISA DR-200 Bs / Microplate Reader

(Kazuak, Hangzhou city, China) utilizando filtro de 540 nm. O cálculo do valor da

CC50 foi determinado por regressão linear.

Método 3: Avaliação da integridade de DNA celular por cristal violeta

(CV) – Para determinar se as moléculas interferem na integridade do DNA celular,

foi utilizado o cristal violeta 0,5% em ácido acético a 30%. Para este teste, 100 μL

de CV foram adicionados em todas as cavidades das placas contendo células

tratadas e não tratadas com as substâncias. As placas foram mantidas em

temperatura ambiente por 15 minutos. Após esse período, o sobrenadante foi

descartado e as placas foram lavadas em água corrente. Após secagem em estufa,

o corante foi eluído com 100 μL de metanol PA homogeneizando suavemente com

movimentos rotatórios. A leitura da densidade ótica foi realizada em leitora de

ELISA DR-200 Bs / Microplate Reader (Kazuaki, Hangzhou city, China) utilizando

filtro de 540 nm. O cálculo do valor do CC50 foi determinado por regressão linear.

- 41 -

3.7 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL POR REDUÇÃO DA

PRODUÇÃO DE VIRION PELA TÉCNICA DE REED MÜECHEN

O ensaio de determinação de atividade antiviral seguiu o protocolo descrito

previamente por Pinto e colaboradores (2014) com modificações.

Células Vero (1x104 células/mL) crescidas em placas de 24 poços foram

inoculadas com a amostra ZIKV MR766 (1x105 P.F.U) e incubadas por 3 h para

adsorção do vírus. Após este período, o inóculo foi removido para adição de

concentrações diferentes das substâncias (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μM para

CAV e DIP e 1,5625, 3,25, 6,25, 12,5, 25 e 50 μM para GE). Como controles, foram

utilizadas células não infectadas (controle negativo) e infectadas não tratadas

(controle positivo).

As placas foram reincubadas a temperatura de 37 ºC em ambiente com 5%

de CO2. Após 96 h, as células foram rompidas e passaram por três ciclos de

congelamentos e descongelamentos. Os debris celulares foram removidos e as

suspensões virais congeladas a -70 ºC para posterior avaliação da inibição da

produção de vírion por titulação pelo método de Reed Müechen (Apêndice 9.1) e

avaliação da inibição da produção de genoma viral por One-Step RT-qPCR (item

3.8).

Os ensaios de Reed Müechen foram realizados em triplicata e a concentração

das moléculas necessária para reduzir 50% a produção de virions, em relação ao

controle positivo, foi determinada por regressão linear.

3.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL POR REDUÇÃO DA

PRODUÇÃO DE GENOMA VIRAL PELA TÉCNICA DE ONE-STEP RT-qPCR

3.8.1 EXTRAÇÃO DO GENOMA VIRAL

O RNA total contido em 200 L dos sobrenadantes (item 3.7) foi extraído

utilizando-se o Kit PureLink™ Spin Column-Based Kit (Invitrogen® Life

Technologies, EUA), conforme recomendações do fabricante.

3.8.2 ONE-STEP RT-qPCR

O RNA viral foi amplificado pela técnica de One-Step RT-qPCR no

termociclador ABI Prism 7500 SDS (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Foi

utilizado o kit GoTaq® 1-Step RT-qPCR (Promega, EUA) para detecção seguindo

os procedimentos desritos no item 3.3.3. Todos os ensaios incluíram controle

- 42 -

positivo, controle negativo, NTC e curva sintética padrão e as reações foram

conduzidas em duplicata.

3.9 DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE SELETIVIDADE (IS)

O índice de seletividade (IS) representa o grau de segurança para a utilização

de um composto “in vitro”. Este parâmetro farmacológico foi calculado através da

razão entre o CC50 e o EC50 de cada substância.

IS = CC50/EC50

Onde,

IS = Índice de Seletividade; CC50= Concentração Citotóxica 50% e EC50=

Concentração Efetiva 50%.

3.10 CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO DAS MOLÉCULAS

Foi estabelecido que as moléculas para serem consideradas eficazes

apresentem um percentual de inibição igual ou superior a 50% e valores de IS

acima de 10.

3.11 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os dados apresentados incluem a média ± desvio padrão da

triplicata/duplicata dos experimentos usando três determinações independentes.

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo Excel para Windows e valores

de p iguais ou inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

pelo teste t de Student.

- 43 -

4. RESULTADOS

4.1 AMPLIFICAÇÃO E TITULAÇÃO DA AMOSTRA ZIKV MR766

O isolado ZIKV MR766 foi inoculado em célula Vero (1x10⁴ células/mL) até

obtenção de lise total com 96 h (Figura 10). O título da amostra determinado por

Reed Müechen foi de 1x107,4 TCID50/mL (Apêndice 9.1) e por Ensaio de Placa de

Lise foi de 1x107 PFU/mL.

Figura 10: Microscopia óptica. (1) Controle de células Vero. (2) Presença de Efeito

Citopático (lise total) em amplificação da amostra ZIKV MR766 na célula Vero em

96 h.

4.2 ESTABELECIMENTO DO ONE-STEP RT-qPCR

O protocolo de One-Step RT-qPCR foi estabelecido com a utilização de curva

padrão sintética. A partir das diluições seriadas da curva sintética, foi estabelecido

o valor do Ct para pontos da curva nas concentrações 107, 106, 105,104, 103, 102 e

101 cópias/µL (Figura 11 e Quadro 4).

- 44 -

Figura 11: Gráfico de amplificação da curva padrão sintética nas concentrações

107, 106, 105, 104, 103, 102 e 101 cópias/µL, estabelecido pelo programa Step One

v2.3®.

- 45 -


concentrações da curva padrão sintética testadas.

Avaliando-se os parâmetros de qualidade da curva padrão, verificou-se

eficiência (Eff) de 98,114%, R² de 0,999 e Slope de -3,534, conforme observado na

Figura 12.

Figura 12: Paramêtros de qualidade da curva padrão sintética

Diluição da curva padrão sintética

Concentração da curva padrão sintética

(CG/µL) Ct Médio DP Ct

10-7 101 32,96 0,023106

10-6 102 29,43 0,005253

10-5 103 26,37 0,382057

10-4 104 22,45 0,101507

10-3 105 19,13 0,020592

10-2 106 15,46 0,118971

10-1 107 11,70 0,016984

- 46 -

4.2.1 ONE-STEP RT-qPCR E QUANTIFICAÇÃO DO GENOMA DA AMOSTRA

ZIKV MR766 ESTOQUE

Após estabelecimento do protocolo de One-Step RT-qPCR, foram testados

quatro pontos da curva sintética padrão para determinação da carga viral da

amostra ZIKV MR766 (Figura 13) (Quadro 5).

Figura 13: Gráfico de amplificação da curva padrão sintética nas concentrações

107, 106, 104 e 102 cópias/µL estabelecido pelo programa Step One v2.3®.


concentrações da curva padrão sintética testadas.

Diluição da curva padrão sintética

Concentração da curva padrão sintética

(CG/µL) Ct Médio DP Ct

10-6 102 33,16 5,8 E-02

10-4 104 27,85 2,8 E-01

10-2 106 19,51 1,7 E-01

10-1 107 16,76 1,4 E-02

Avaliando-se os parâmetros de qualidade dessa curva padrão, verificou-se

eficiência (Eff) de 94,108%, R² de 0,996 e Slope de -3,472, conforme observado na

Figura 14.

- 47 -

Figura 14: Parâmetros de qualidade da curva padrão sintética para quantificação

de zika vírus (ZIKV).

Após estabelecimento do protocolo de One-Step RT-qPCR, o mesmo foi

utilizado para amplificação da amostra estoque e sua quantificação (Figura 15). O

título da amostra ZIKV MR766 (controle de vírus) foi determinado em 9,5x1010

CG/mL.

Figura 15: Curva de amplificação da amostra estoque de Zika vírus (ZIKV) MR766.

A imagem mostra as curvas de amplificação da amostra estoque (controle de vírus)

e das quatro concentrações da curva padrão (107, 106, 104 e 102).

- 48 -

4.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA, ATIVIDADE ANTIVIRAL E

ÍNDICE DE SELETIVIDADE DAS SUBSTÂNCIAS OBTIDAS DE ALGAS

MARINHAS

O resultado da citotoxicidade (CC50) das substâncias obtidas da alga verde

Caulerpa racemosa (CAV) e da alga parda Dictyota pfaffii (DIP) mostram que essas

moléculas não são citotóxicas nas células Vero, HEK 293 e C6/36 pelas três

metodologias estudadas e nas concentrações testadas. Entretanto, o DIP

apresentou maior toxicidade que a CAV pelas três metodologias nas diferentes

células. Além disso, observa-se que ambas as moléculas foram menos citotóxicas

na célula HEK 293 (Tabela 1).

Tabela 1: Efeitos citotóxicos da CAV e do DIP em células Vero, HEK 293 e C6/36

estimados por Regressão Linear.

CC50: Concentração necessária para matar 50% das células; CV: Cristal Violeta; VN:

Vermelho Neutro;MTT: Sal Tetrazólico (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium

bromide.

Células Moléculas

Citotoxicidade

CC50 (µM) / 96 h

MTT VN CV

Vero

CAV

DIP

910 ± 3,6

466 ± 7,0

844 ± 3,6

486 ± 2,1

888 ± 8

471 ± 2,8

HEK 293

CAV

DIP

1327 ± 7,0

1211 ± 3,6

1091 ± 7,0

1028 ± 3,6

1584 ± 1,5

1518 ± 8,0

C6/36

CAV

DIP

921 ± 1,7

775 ± 1,0

1000 ± 3,8

841 ± 8,1

1006 ± 4,5

775 ± 1,6

- 49 -

4.3.1 DETECÇÃO DA ATIVIDADE ANTI ZIKV DA CAULERPINA E DO

DITERPENO 10,18-DIACETOXY-8-HYDROXY-2,6-DOLABELLADIENE EM

CÉLULA VERO PELA TÉCNICA DE REED MÜECHEN

A titulação diferencial pelo ensaio Reed Müechen determinou a atividade

antiviral da CAV e do DIP com a redução do título do ZIKV quando tratado com

concentrações diferentes dessas moléculas. Ambas as moléculas foram capazes

de inibir a produção de virion (Tabela 2). A CAV apresentou maior atividade antiviral

quando comparada ao DIP. Com relação ao valor de segurança da molécula

determinado pelo IS, a CAV é considerada a mais segura.

Tabela 2: Atividade anti ZIKV por Reed Müechen e índices de seletividades (IS) da CAV e

do DIP.

Moléculas

Atividade Antiviral

por Reed Müechen

EC50 (µM) / 96 h

Índice de Seletividade

(IS)

MTT VN CV

CAV 1,7 ± 1,4 535 496 522

DIP 2,5 ± 1,9 186 194 188

EC50: Concentração efetiva necessária para reduzir em 50% o título viral; MTT: Sal

Tetrazólico (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide; VN: Vermelho

Neutro; CV: Cristal Violeta; IS: Razão entre o CC50 das moléculas na célula Vero disponível

na tabela 1 e o EC50 desta tabela.

Observa-se que a CAV e o DIP apresentaram atividade antiviral, inibindo a

produção de virions nas seis concentrações testadas (Figura 16 e Tabela 3). As

concentrações 25, 50, 100 µM e 50, 100 µM apresentaram maiores atividades para

a CAV e DIP, respectivamente.

- 50 -

CAV

DIP

Figura 16: Atividade antiviral da CAV e do DIP em concentrações diferentes pela

técnica de Reed Müench.

89% 89% 90%100% 100% 100%

11% 11% 10%0% 0% 0%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

3,125 6,25 12,5 25 50 100 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão

Atividade Antiviral Virion Residual

85% 86% 86%92%

100% 100%

15% 14% 14%8%

0% 0%0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

3,125 6,25 12,5 25 50 100 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão


- 51 -

Tabela 3: Quantificação de virion total da amostra controle não tratada e virion residual total

em amostra tratada para determinação da atividade anti ZIKV MR766 pela CAV e pelo DIP

por Reed Müechen.

Concentrações das moléculas testadas pelo Reed Müechen

(µM)

Carga viral residual / mL

Carga viral inibida / mL

CAV

3,125 1,5 x 101 8,5 x 104

6,25 1,5 x 101 8,5 x 104

12,5 1,5 x 101 8,5 x 104

25 0 1 x 105

50 0 1 x 105

100 0 1 x 105

Controle de Vírus 1,0 x 105 0

DIP

3,125 2,0 x 101 8,0 x 104

6,25 2,0 x 101 8,0 x 104

12,5 2,0 x 101 8,0 x 104

25 1,5 x 101 8,5 x 104

50 0 1 x 105

100 0 1 x 105

Controle de Vírus 1,0 x 105 0

4.3.2 DETECÇÃO DA ATIVIDADE ANTI ZIKV DA CAULERPINA E DO

DITERPENO 10,18-DIACETOXY-8-HYDROXY-2,6-DOLABELLADIENE EM

CÉLULA VERO PELA TÉCNICA ONE-STEP RT-qPCR

As curvas obtidas da quantificação do genoma viral por One-Step RT-qPCR

para avaliação da atividade anti ZIKV MR766 da CAV e do DIP em comparação

com a quantificação do genoma da amostra não tratada (controle) mostram que

essas moléculas em todas as concentrações testadas não inibiram a produção de

genoma do vírus, uma vez que todas amplificaram em Cts semelhantes ao controle

(Figura 17 e 18) (Tabela 4).

- 52 -

CAV

DIP

Figura 17: Curvas de amplificação do One-Step RT-qPCR para avaliação da

atividade anti ZIKV MR766 da CAV e do DIP pela inibição da produção de genoma

do ZIKV em relação ao controle de vírus.

- 53 -

CAV

DIP

Figura 18: Atividade antiviral da CAV e do DIP pela técnica de One-Step RT-qPCR.

1% 1% 2% 2% 4% 6%

99% 99% 98% 98% 96% 94%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

3,125 6,25 12,5 25 50 100 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão

Atividade Antiviral RNA Residual

0% 0% 1% 2% 2% 2%

100% 100% 99% 98% 98% 98%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

3,125 6,25 12,5 25 50 100 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão


- 54 -

Tabela 4: Quantificação do RNA total da amostra controle não tratada e RNA residual total

em amostra tratada com CAV e o DIP para determinação da atividade anti ZIKV MR766

por One-Step RT-qPCR.

Concentrações das moléculas pelo One-Step RT-qPCR

(µM)

Ct Médio

Carga viral em cópias genômicas

residual / mL


inibidas / mL

CAV

3,125 13,56 9,5 x 1010 0

6,25 13,63 9,5 x 1010 0

12,5 13,70 9,5 x 1010 0

25 14,71 9,5 x 1010 0

50 14,90 9,0 x 1010 1,0 x 101

100 15,11 9,0 x 1010 1,0 x 101

Controle de Vírus 13,56 9,5 x 1010 0

DIP

3,125 13,56 9,5 x 1010 0

6,25 14,30 9,5 x 1010 0

12,5 14,56 9,5 x 1010 0

25 14,70 9,5 x 1010 0

50 14,87 9,5 x 1010 0

100 14,96 9,5 x 1010 0


4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA, ATIVIDADE ANTIVIRAL E

ÍNDICE DE SELETIVIDADE DA SUBSTÂNCIA OBTIDA DA SEMENTE DE

URUCUM

O resultado da citotoxicidade (CC50) do geranilgeraniol (GE) mostra que essa

molécula é citotóxica nas células Vero, HEK 293 e C6/36 pelas três metodologias

estudada. Entretanto, na célula C6/36 apresentou maior toxicidade (Tabela 5).

Dessa forma, a avaliação da atividade anti ZIKV em célula Vero foi realizada

nas concentrações 1,5625, 3,13, 6,25, 12,5, 25 e 50 µM.

- 55 -

Tabela 5: Efeitos citotóxicos do GE em células Vero, Hek 293 e C6/36 estimados por

Regressão Linear.

Células Molécula

Citotoxicidade

CC50 (µM) / 96 h

MTT VN CV

Vero

GE 75 ± 1,6 75 ± 1,7 100 ± 2,4

HEK 293

GE 100 ± 2,2 100 ± 2,5 75 ± 8.5

C6/36

GE 50 ± 2,2 37,5 ± 2,7 50 ± 5,5

CC50: Concentração necessária para matar 50% das células; CV: Cristal Violeta; VN:

Vermelho Neutro; MTT: Sal Tetrazólico (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium

bromide.

4.4.1 DETECÇÃO DA ATIVIDADE ANTI ZIKV DO GERANILGERANIOL EM

CÉLULA VERO PELA TÉCNICA DE REED MÜECHEN

A titulação diferencial pelo ensaio Reed Müechen determinou a atividade

antiviral do GE com a redução do título do ZIKV quando tratado com concentrações

diferentes dessa molécula. O resultado do EC50 determinado por regressão linear

pelo ensaio de Reed Müench foi 0,75 ± 1,4 µM (Tabela 6). Apesar desta molécula

ter apresentado valor de CC50 baixo, em concentrações que não foram citotóxicas

na Vero, ela inibiu a replicação do ZIKV com baixo valor de EC50 e alto índice de

seletividade (IS).

- 56 -

Tabela 6: : Atividade anti ZIKV do GE por Reed Müechen e índices de seletividade (IS) em

células Vero.

Molécula

Atividade Antiviral

por Reed Müechen

EC50 (µM) / 96 h

Índice de Seletividade

(IS)

MTT VN CV

GE 0,75 ± 1,4 100 100 133

EC50: Concentração efetiva necessária para reduzir em 50% o título viral; MTT: Sal

Tetrazólico (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide; VN: Vermelho

Neutro; CV: Cristal Violeta; IS: Razão entre o CC50 da molécula na célula Vero disponível

na tabela 5 e o EC50 desta tabela.

Observa-se que o GE foi capaz de inibir a produção de virion em todas as

concentrações testadas (Figura 19 e Quadro 7).

Figura 19: Atividade antiviral do GE em concentrações diferentes pela técnica de

Reed Müench.

81%86% 87% 90%

99% 100%

19% 14% 13%10%

1% 0%0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

1,5625 3,125 6,25 12,5 25 50 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão


- 57 -

Tabela 7: Quantificação de virion total da amostra controle não tratada e virion residual total

em amostra tratada para determinação da atividade anti ZIKV MR766 pelo GE por Reed

Müechen.

Concentrações do GE testadas pelo Reed Müechen

(µM)

Carga viral residual / mL

Carga viral inibida / mL

3,125 2,5 x 101 7,5 x 104 6,25 2,0 x 101 8,0 x 104 12,5 2,0 x 101 8,0 x 104 25 1,5 x 101 8,5 x 104 50 0 1,0 x 105

100 0 1,0 x 105 Controle de Vírus 1,0 x 105 0

4.3.2 DETECÇÃO DA ATIVIDADE ANTI ZIKV DO GERANILGERANIOL EM

CÉLULA VERO PELA TÉCNICA ONE-STEP RT-qPCR

As curvas obtidas da quantificação do genoma viral por One-Step RT-qPCR

para avaliação da atividade anti ZIKV MR766 do GE em comparação com a

quantificação do genoma da amostra não tratada (controle) mostraram que essa

droga inibiu abaixo de 50% a produção de genoma do ZIKV (Figuras 20 e 21)

(Tabela 8).

Figura 20: Curvas de amplificação do One-Step RT-qPCR para avaliação da

atividade anti ZIKV MR766 do GE pela inibição da produção de genoma do ZIKV

em relação ao controle de vírus.

- 58 -

Figura 21: Atividade antiviral GE pela técnica de One-Step RT-qPCR.

Tabela 8: Quantificação do RNA total da amostra controle não tratada e RNA residual total

em amostra tratada com o GE para determinação da atividade anti ZIKV MR766 pelo GE

por One-Step RT-qPCR.

Concentrações do GE testadas pelo One-Step RT-qPCR

(µM)

Ct Médio


residual / mL


inibida / Ml

1,5625 13,59 9,4 x 1010 1,0 x 101 3,125 14,75 7,3 x 1010 2,3 x 101

6,25 14,82 7,3 x 1010 2,3 x 101

12,5 15,00 5,3 x 1010 2,4 x 101

25 15,11 4,6 x 1010 2,8 x 101

50 15,19 4,0 x 1010 3,5 x 101


3%

23% 23% 26% 31% 34%

97%

77% 77% 74% 69% 66%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

1,5625 3,125 6,25 12,5 25 50 µM

Pe

rce

nta

ge

m d

e in

ibiç

ão


- 59 -

5. DISCUSSÃO

Os vírus são responsáveis por muitas doenças infecciosas cujo impacto sócio

econômico justifica a relevância do desenvolvimento de pesquisas com objetivo de

procurar, na natureza e ou por síntese química, moléculas com atividades antivirais

que possam ser utilizadas na terapêutica (PATRICK, 2005).

A identificação do agente etiológico da síndrome da imunodeficiência

adquirida humana e o progresso da biologia molecular, determinou vários

mecanismos de interaçãodo vírus com a célula do hospedeiro o que permitiu a

descoberta de novos alvos para quimioterapia antiviral, aumentando o interesse

dos pesquisadores pelos compostos naturais e ou sintéticos com atividade antiviral

(FLINT et al., 2009).

Na ciência médica utiliza-se antivirais em humanos infectados com vírus da

influenza A, vírus da hepatite C, vírus herpes simples 1 e 2 (FLINT et al., 2009).

Entretanto medicamentos não estão disponíveis no mercado para todas as viroses.

Por isso torna-se relevante a pesquisa em virologia humana, no sentido de elucidar

os eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de uma infecção por vírus, com

objetivo de desenvolvimento de novos agentes com atividade antiviral.

O trabalho com produtos naturais provenientes de algas marinhas ou plantas

com atividade antivirais depara com a sustentabilidade para produção desses

compostos em larga escala para estudo e aplicação no campo. Visto pelo lado da

sustentabilidade, a síntese de moléculas, baseada na estrutura dessas substâncias

naturais, tem que ser intensificada, a fim de que possamos ter produtos em

quantidade suficiente para atender a demanda da medicina humana (CASTRO-

PEREZ et al., 2007).

Embora o relato inicial do ZIKV datede 1947, a infecção em humanos era

comumente assintomática ou com sintomas leves, entretanto após epidemia de

ZIKV no Yan em 2007, na Polinésia Francesa em 2013 e no Brasil em 2015, a

infecção pelo ZIKV foi correlacionada com malformações congênitas como

microcefalia e danos neurológicos em adultos (DELVECCHIO et al., 2016).

Medidas educativas para controle de vetores e uso de inseticidas, repelentes

e uso de preservativo nas relações sexuais são os métodos de prevenção e

controle disponíveis utilizados para o controle da transmissãodo ZIKV. A falta de

vacina para prevenção, controlee antivirais para tratamento direciona os

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pesquisadores a desenvolverem pesquisa para produção de vacinas e ou procurar

na natureza ou obterem por síntese química moléculas com atividade antiviral.

Tratamentos profiláticos para as mulheres que pretendem engravidar em áreas

epidêmicas e os viajantes que migram para regiões afetadas representariam

ferramentas relevantes para reduzir a transmissão de ZIKV e evitar a propagação

da doença (SUMMER et al., 2015).

Este estudo foi elaborado com o objetivo de demonstrar a citotoxicidade da

caulerpina, do diterpeno 10,18-diacetóxi-8-hidroxi-2,6-dolabelladieno (obtidos de

algas marinhas) e do geranilgeraniol (obtido da semente de urucum) em diferentes

tipos celulares (Vero, HEK 293 e C6/36) e determinar se essas substâncias inibem

a produção de ZIKV.

5.1 ATIVIDADE CITOTÓXICA

Para determinar a atividade citotóxica das três moléculas utilizamos três

metodologias:

a) avaliação da integridade da mitocôndria, pela capacidade da metabolização

do MTT, pela succinato desidrogenase das mitocôndrias,uma enzima ativa

somente em células com cadeia respiratória intactas, resultando na produção do

precipitado azul de formazana. A quantidade de formazana é proporcional ao

número de células viáveis (MOSMANN, 1983).

b)avaliação da integridade de membrana e atividade lisossômica pela

capacidade das células vivas incorporarem o vermelho neutro dentro do lisossomo.

O vermelho neutro é um corante catiônico fraco, que penetra na membrana celular

e acumula nos lisossomos onde combina-se com a parte aniônica da matriz

lisossômica, importante para vírus que entram por endocitose, ou seja, drogas que

são tóxicas para lisossoma inibe a replicação viral, pois inibe a formação do

endossoma (FAUTZ et al., 1991).

c) avaliação da proliferação celular e integridade do DNA celular quantificado,

ou seja, o número de células pela incorporação do cristal violeta ao DNA celular

(SAOTOME et al., 1889).

Na fase de seleção das moléculas provenientes de algas marinhas (CAV e

DIP), os valores de CC50 expressivos nas células Vero, HEK 293 e C6/36

permitiram a avaliação da sua possível atividade anti ZIKV. Resultados de estudos

anteriores com essas moléculas relataram também sua baixa citotoxicidade em

- 61 -

célula Vero e célula de rim de bovino MDBK (Madin Darbin Bovine Kidney),

entretanto a CAV se mostrou menos citotóxica que o DIP. (VIDAL et al., 1984;

ABRANTES et al., 2010; PINTO et al., 2012; PORTO VIEIRA MACEDO et al.,

2012).

O geranilgeraniol é utilizado como coadjuvante no combate a diversos tipos

de câncer, além de ser um intermediário na síntese da vitamina E, vitamina K e

hormônios (DOS SANTOS., 2012). Alguns relatos mostram que o GE apresenta

alta toxicidade e por esse motivo é direcionado para tratamento anticâncer

(VASCONCELOS et al., 2004; ESPINDOLA, 2005; BARBOSA, 2011).

Fernandes e colaboradores (2013) estudando a viabilidade do carcinoma de

próstata humano frente ao geranilgeraniol mostraram que o CC50 foi de 80 ± 1,8.

Nossos resultados de CC50 dessa substância nas células Vero (MTT = 75 ± 1,6; VN

= 75 ± 1,7; CV =100 ± 2,4), HEK 293 (MTT = 100 ± 2,2; VN = 100 ± 2,5; CV = 75 ±

8,5) e C6/36 (MTT = 50 ± 2,2; VN = 37,5 ± 2,7; CV = 50 ± 5,5) foram semelhantes

ao observado por Fernandes e colaboradores (2013). Além da atividade anticâncer,

o GE inibe a proteína quinase C, a liberação de citocromo C, ativação de quinases

c-Jun N-terminal ativando a apoptose (WISEMAN et al., 2007).

O ZIKV no seu processo de interiorização na célula necessita formar o

endossoma para liberação do genoma no citoplasma da célula e dessa forma iniciar

a tradução. O genoma do ZIKV é RNA de simples fita polaridade positiva, ou seja,

tem atividade de RNA mensageiro (SUTHUAR et al., 2013). Se a substância

interferir na integridade lisossômica não ocorre a formação do endossoma e o vírus

não replica. Nesse caso a inibição da replicação não está relacionado com a

inibição do ZIKV e sim de uma via de sinalização celular importante para replicação

do vírus (PINTO et al., 2012).

Os baixos valores de CC50 observado pelo método de cristal violeta indicam

que o GE interfere também na integridade do DNA celular, o que constata sua

ampla aplicação na terapia anticâncer.

Segundo Patino (1967) a população indígena utiliza urucum como inseticida

e repelente, o GE é o constituinte majoritário da semente de urucum provavelmente

é o responsável pela atividade inseticida o que pode estar relacionado com o efeito

citotóxico (CC50) observado em célula de Aedes albopictus (C6/36).

- 62 -

Comparando os resultados do CC50 das três moléculas observamos que as

moléculas provenientes de algas marinhas (CAV e DIP) foram menos citotóxicas

que o GE nas diferentes linhagens celulares testadas.

5.2 ATIVIDADE ANTIVIRAL

Para que ocorra a replicação do ZIKV é necessário que após a interação do

vírus a receptores específicos interiorização com formação de endossoma,

liberação do genoma que por ser RNA de polaridade positiva funciona como RNA

mensageiro e liga-se a ribossomo onde ocorre a síntese de uma poliproteína que é

clivada em três proteínas estruturais (C, PrM/M, E) e sete proteínas não estruturais

(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). A replicação do ZIKV não ocorre

em cascata mais requer síntese de proteínas virais, RNA de

fitanegativa(intermediário de replicação) e RNA de fita positiva. O ZIKV também

necessita de componentes celulares para sua replicação e a maturação ocorre nas

membranas celulares internas e são liberados por exocitose (LINDENBACH &

RICE, 2003).

Uma variedade de atividades biológicas atribuída a CAV e o DIP já foram

relatadas (RAUB et al., 1987; AYYAD &BADRIA, 1994; TENÓRIO DE SOUZA et

al., 2009; WALIED et al., 2010; PORTO VIEIRA MACEDO et al., 2012; PINTO et

al., 2012; KAMAL & SETHURAMAN, 2012; SOARES et al., 2012; CRISTINA et al.,

2014). Porém, até o momento não há relatos sobre atividade anti ZIKV dessas duas

moléculas, o que torna o nosso estudo inédito.

A análise comparativados resultados da atividade antiviral obtidos pela

determinação do título de ZIKV após tratamento com a substância pela técnica de

Reed Müchen mostraram que a CAV (EC50 = 1,7 ± 1,4; IS = MTT = 535; VN = 496;

CV = 522) inibiu a produção de partículas infecciosas, com resultado de inibição de

aproximadamente 100% nas concentrações entre 25, 50 e 100 µM, com valor de

índice de seletividade (IS) elevado. Os resultados da atividade anti ZIKV do DIP

(EC50 = 2,5 ± 1,9; IS = MTT = 186; VN = 194; CV = 188) demonstram que essa

molécula inibiu a produção de ZIKV em aproximadamente 100% nas concentrações

entre 50 e 100 µM e apresentou bons valores de IS. Os resultados obtidos

corroboram com os resultados publicado por Pinto e colaboradores (2012) para

avaliação da atividade anti vírus da diarreia viral de bovino (BVDV)com essas

moléculas. O BVDV é um vírus pertencente à família Flaviviridae, gênero Pestivirus,

- 63 -

é um patógeno de bovino de importância econômica para indústria pecuária e não

é um arbovírus (PINTO et al., 2012).

A análise do resultado da atividade citotóxica (CC50) do GE revelou que ela foi

a molécula mais citotóxica. Entretanto em concentrações que não foram citotóxicas

para a célula VeroGE inibiu a produção de ZIKVcom baixo valor de EC50 (EC50 =

0,75 ± 1,4; IS = MTT = 100; VN = 100; CV = 133) e expressivos valores de IS.

Apesar do valor significativo do EC50 do geranilgeraniol, as moléculas extraídas de

algas marinha (CAV e DIP) apresentaram IS mais elevados, por isso consideradas

mais seguras.

Em adição ao estudo da atividade anti ZIKV pelas moléculas CAV, DIP e GE

avaliamos a atividade antiviral pela técnica One-Step RT-qPCR. Os resultados

obtidossugeremque essas moléculas não interferem na síntese de genoma do

ZIKV, ou seja, não interfere na transcrição sugerindo que a atividade antiviral

dessas moléculas seja pós transcricional. Visto que o resultado da titulação do ZIKV

tratado com as moléculas pela técnica de Reed Müechen mostrou inibição na

produção de virion.

Com relação ao GE, Fernandes e colaboradores (2013) trabalhando com

células de câncer de próstata, relatou que o GE não inibiu a produção de RNA

nessas células sugerindo que a atividade do GE é pós transcricional.

Neste trabalho estamos relatando pela primeira vez atividade antiviral do

geranilgeraniol. Relatos anteriores abordaram atividade desta molécula anti

Leishmania amazonenses, antibacteriana, antifúngicos, antioxidante, anti

convulsivante, anti agregantes de plaquetas e anticâncer (FERNANDES et al.,

2013).

Com relação a CAV e o DIP, resultados na literatura mostra a atividade

antiviral contra BVDV, HIV, HSV 1 e 2 (CIRNE-SANTOS et al., 200; PINTO et al.,

2012; PORTO VIEIRA MACEDO et al., 2012). Entretanto é o primeiro relato dessas

moléculas com atividade anti ZIKV.

Os resultados obtidos a partir desse estudo demonstram que CAV, DIP e GE

são bons canditatos a um fármaco a ser utilizado no tratamento de infecção por

ZIKV. Entretanto, outros estudos serão realizados para a análise dos mecanismos

de ação dessas moléculas.

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6. CONCLUSÕES

A titulação da amostra padrão ZIKV MR766 mostrou que o título determinado

por Reed Müench e Ensaio de placa de lise são similares e por RT-qPCR é maior,

pois o RT-qPCR diferente do Reed Müench e Ensaio de placa de lise detecta

somente o genoma viral e não virion.

O teste de citotóxicidade da CAV e do DIP mostrou que estas moléculas não

são citotóxicas nas três células testadas. Entretanto, ambas as moléculas

apresentaram maior toxicidade nas células Vero e C6/36 do que na célula HEK 293.

O teste de citotóxicidade do GE mostrou que ele é o mais citotóxico das três

moléculas naturais testadas. Ele foi tóxico nas três células, porém apresentou maior

toxicidade na célula C6/36.

O estabelecimento do protocolo de One-Step RT-qPCR nos permitiu avaliar a

atividade anti ZIKV dessas três substâncias naturais.

A avaliação da atividade anti ZIKVMR766, em células Vero, das três

substâncias naturais por Reed Müench mostrou que elas foram eficazes na inibição

da produção de virion.

Analisando a atividade anti ZIKVMR766 por RT-qPCR, foi observado que não

houve bloqueio da síntese de genoma da amostra pelas três moléculas.

As três substâncias testadas tem potencial para serem utilizadas como

antiviral para o ZIKV. Entretanto, em função do GE ser mais citotóxico,

consideramos as substâncias CAV e DIP como mais promissoras para um possível

tratamento anti ZIKV.

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7. PERSPECTIVAS

Estamos complementando esses resultados avaliando outros possíveis

mecanismos de ação dessas moléculas como a inibição da adsorção, inibição da

penetração e inativação da partícula viral.

Já observamos que essas moléculas não inibem a síntese de RNA da

amostra de ZIKV brasileiro em célula HEK293 por One-Step RT-qPCR.

Vamos titular por Reed Muechen e fazer imunofluorescência, pois esse ZIKV

não faz um efeito citopático muito bom.

Estamos realizando a cinética de replicação do ZIKV brasileiro por

microscopia eletrônica.

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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

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9. APÊNDICE

9.1 TITULAÇÃO PELO MÉTODO DE REED MÜENCH

A titulação por Reed Müench foi realizada seguindo protocolo previamente

descrito por Lenette (1964) (Figura 24).

1. Descongelar a amostra a ser titulada e mantê-la no gelo;

2. Preparar microtubos identificando-os: 10ˉ¹, 10ˉ², 10ˉ³, 10ˉ⁴ , 10ˉ⁵ , 10ˉ⁶ , 10ˉ⁷ ,

10ˉ⁸ , 10ˉ⁹ e 10ˉ¹⁰ .

3. Adicionar900 μL de meio sem soro em cada microtubo.

4. Transferir 100 μL da amostra tratada ou não tratada (original) para o microtubo

10-1.

5. Trocar de ponteira e homogeneizar a mistura.

6. Transferir 100 μL para o microtubo 10ˉ². Repetir até a última diluição (10-10).

7. Adicionar 100 μL de cada diluição com oito repetições na placa (cada coluna

correponde a uma diluição, 10-1 a 10-10 da esquerda para a direita).

8. Os poços da 11ª e 12ª colunas são utilizados para controle de células (CC) e

contém somente meio de cultivo sem soro.

9. Incubar a placa a 37 °C por 96 h, observando o aparecimento ou não de efeito

citopático.

10. Corar com cristal violeta.

Figura 22: Esquema representativo da técnica Reed Müench.

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11. Completar a quado abaixo e fazer os cálculos.

Quadro 5: Cálculo para determinação do título por TCID50/mL.

Diluição da

amostra

Intervalo

diluição

Unidade

diluição

Unidade

positiva

infecciosa

Frequência

acumulada

positiva (A)

Frequência

acumulada

negativa (B)

Coeficiente

Infecção

A/ (A+B)

Percentagem

de infectados

10ˉ¹ 1 8 8/8 55 + 8 = 63 0 1 100%

10ˉ² 1 8 8/8 47 + 8 = 55 0 1 100%

10ˉ³ 1 8 8/8 39 + 8 = 47 0 1 100%

10ˉ⁴ 1 8 8/8 31 + 8 = 39 0 1 100%

10ˉ⁵ 1 8 8/8 23 + 8 = 31 0 1 100%

10ˉ⁶ 1 8 8/8 15 + 8 = 23 0 1 100%

10ˉ⁷ 1 8 8/8 7 + 8 = 15 0 1 100%

10ˉ⁸ 1 8 5/8 2 + 5 = 7 8 – 5 = 3 0,7 70%

10ˉ⁹ 1 8 2/8 2 +0 = 2 8 - 2 + 3 = 9 0,18 18%

10ˉ¹⁰ 1 8 0/8 0 8 - 0 + 9 = 17 0 0%

Distância Proporcional (D.P) = (Percentagem acima de 50%) - 50%

(%acima de 50%) – (% abaixo de 50%)

D.P. = 70 - 50 = 20 / 52 = 0,384 ≈ 0,4

70 - 18

Log da diluição acima de 50% = log 10 -6 = - 6 log 10 = - 6 x 1 = - 6

Log do fator de diluição = log 10-1 = - 1 log 10 = -1 x 1 = -1

Dose infectante 50% = (log da diluição acima de 50%) + (D.P x Log do fator de diluição)

Log da DI50%= -6 + (0,4 x-1)= - 6 - 0.4 = -6,4

Dose infectante 50% (ID50) = corresponde à diluição de 10-6,4

TCID 50% = 10-6,4 x10-1 = 1x10-7,4 (multiplica por -1) donde o Título é 1x107,4

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10. ANEXOS

10.1 ARTIGO PUBLICADO NA JOURNAL OF APPLIED PHYCOLOGY

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10.2 ARTIGO PUBLICADO NA BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY

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10.3 PRÊMIO BANCO DO BRASIL DE TECNOLOGIA SOCIAL DE 2017

universidade federal fluminense instituto …...programa de pÓs graduaÇÃo em microbiologia e...

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