univerza v ljubljanipefprints.pef.uni-lj.si/4704/1/diplomsko-delo_ferkolj_4.9...ferkolj, a....
TRANSCRIPT
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
Anka Ferkolj
MORFOLOGIJA KOŽE ČLOVEŠKE RIBICE
(Proteus anguinus anguinus)
Diplomsko delo
Ljubljana, 2017
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
Dvopredmetni učitelj biologije in gospodinjstva
Anka Ferkolj
Mentorica: doc. dr. Lilijana Bizjak Mali
MORFOLOGIJA KOŽE ČLOVEŠKE RIBICE
(Proteus anguinus anguinus)
Diplomsko delo
Ljubljana, 2017
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
3
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva. Opravljeno je
bilo na Katedri za zoologijo, v skupini za Funkcionalno morfologijo vretenčarjev Oddelka za
biologijo Biotehniške fakultete, Univerza v Ljubljani.
Študijska komisija Pedagoške fakultete je potrdila temo in naslov diplomskega dela ter za
mentorico imenovala doc. dr. Lilijano Bizjak Mali.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Iztok Tomažič
Član: prof. dr. Lilijana Bizjak Mali
Član: prof. dr. Jelka Strgar
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne
knjižice Pedagoške fakultete.
Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Anka Ferkolj
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
4
KLJUČNA DOKUMENTACIJA (KDI)
ŠD Dn
DK
KG morfometrija/koža/Leydigove celice/sluzne žleze/Proteus anguinus anguinus
AV FERKOLJ, Anka
SA BIZJAK MALI, Lilijana
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta
LI 2017
IN MORFOLOGIJA KOŽE ČLOVEŠKE RIBICE
TD Diplomska naloga
IJ sl/en
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
5
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Dn
DC
CX Morphometry/skin/Leydig cells/mucous gland/ Proteus anguinus anguinus
AU FERKOLJ, Anka
AA BIZJAK MALI, Lilijana
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB University of Ljubljana, Faculty of Education
PY 2017
TI Morphology of skin of the European blind cave salamander Proteus anguinus
DT Graduation thesis
LA sl/en
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
6
ZAHVALA
Posebna zahvala gre najprej moji družini, še posebej mami in očetu, ki sta mi omogočila
študij, me pri tem spodbujala in nudila podporo.
Zahvaljujem se tehniški sodelovki Tajdi Gredar za pomoč in nasvete pri obdelavi podatkov.
Zahvaljujem se vsem prijateljem in sošolcem, ki so mi na kakršenkoli način pomagali, nudili
podporo in pomoč med študijem in pri izdelavi diplomske naloge.
Zahvaljujem se moji mentorici doc. dr. Lilijani Bizjak Mali za sodelovanje in pomoč.
Hvala.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
7
POVZETEK
Človeška ribica ali močeril (Proteus anguinus) je jamska repata dvoživka, endemit
podzemnih voda Dinarskega krasa. Je neotenična dvoživka, ki spolno dozori na stopnji
ličinke. Značilnosti ličink se odražajo tudi v zgradbi njene kože. V diplomskem delu smo na
histoloških preparatih prečnih prerezov trupa analizirali zgradbo kože različno velikih
osebkov. Primerjali smo debelino kože in relativno gostoto Leydigovih celic (Lyc) v
epidermisu in večceličnih sluznih žlez (SŽ) v dermisu. Ugotovili smo, da je pri večini
osebkov koža hrbtne strani trupa debelejša, kot na trebušni strani. Prav tako je debelejša pri
večjih osebkih. Relativna gostota Lyc je večja v epidermisu na hrbtni strani, kot na trebušni
strani trupa. Manjši osebki imajo v epidermisu več Lyc, večji osebki pa več SŽ v dermisu.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
8
ABSTRACT
The olm or proteus (Proteus anguinus) is a cave-dwelling urodelan amphibian, endemic to the
underground waters of the Dinaric karst. It is a neotenic amphibian that achieves sexual
maturity in its larval stage. Its larval characteristics are also reflected in the structure of its
skin. In my Bachelor’s thesis, we used the histological slides of cross sections of the body to
analyse the skin grossmorphology in specimens of different size. We compared the thickness
of the skin and the relative density of the Leydig cells ( “Lyc”) in the epidermis, and the
relative density of the multicellular mucus glands (“MG”) in the dermis. The research showed
that the skin on the dorsal side of the body is, in most cases, thicker than on the the ventral
side, as well as thatthe skin is thicker in larger specimens. The relative density of Lyc is larger
in the epidermis on the dorsal side of the body. Smaller specimens havemore Lyc in the
epidermis, whereas the larger ones have more MG in the dermis.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
9
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC
D - dermis
E - epidermis
H - hrbtenjača
K - koža
Lyc - Leydigove celice
M - skeletne mišice trupa
N - nevromast
SC - podkožje ali subcutis
SG - stratum germinatvum
SM - stratum mucosum
SŽ - sluzna žleza
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
10
KAZALO
1 UVOD ............................................................................................................................................... 1
2 PREGLED LITERATURE ...................................................................................................................... 3
2.1 KOŽA VRETENČARJEV .............................................................................................................. 3
2.2 KOŽA DVOŽIVK ......................................................................................................................... 4
2.3 KOŽA ČLOVEŠKE RIBICE ........................................................................................................... 5
3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE .............................................................................................................. 7
4 MATERIALI IN METODE ................................................................................................................... 8
4.1 MATERIAL ................................................................................................................................ 8
4.2 MORFOMETRIČNA ANALIZA .................................................................................................... 9
5 REZULTATI...................................................................................................................................... 10
5.1 ZGRADBA KOŽE TRUPA .......................................................................................................... 10
5.2 DEBELINA KOŽE TRUPA ......................................................................................................... 13
5.3 RELATIVNA GOSTOTA LEYDIGOVIH CELIC IN SLUZNIH ŽLEZ .................................................. 15
6 DISKUSIJA ...................................................................................................................................... 17
7 SKLEPI ........................................................................................................................................... 19
8 LITERATURA..................................................................................................................................20
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
11
KAZALO SLIK
Slika 1: Troglomorfna bela podvrsta človeške ribice (Proteus anguinus anguinus). ............................... 1
Slika 2: Koža trupa na prečnem prerezu, P.a.anguinus. ........................................................................ 11
Slika 3: Koža trupa pod večjo povečavo, P.a.anguinus, prečni prerez .................................................. 12
Slika 4: Koža trupa pri mlajšem osebku, P.a.anguinus, prečni prerez. ................................................. 12
Slika 5: Primerjava debeline kože hrbtne in trebušne strani trupa med različno velikimi osebki bele
podvrste močerila (P.a.anguinus). ........................................................................................................ 14
Slika 6: Primerjava relativnih gostot Leydigovih celic epidermisa dorzalne (Lyc-D) in ventralne strani
(Lyc-V) trupa med različno velikimi osebki bele podvrste močerila (P.a anguinus). ........................... 16
Slika 7: Primerjava relativnih gostot sluznih žlez7 dermisa na dorzalni (SŽ-D) in ventralni strani (SŽ-
V) trupa med različno velikimi osebki bele podvrste močerila (P.a. anguinus) .................................... 16
KAZALO TABEL
Tabela 1: Podatki o živalih bele podvrste močerila (P.a.anguinus). .......................................... 8
Tabela 2: Povprečna debelina epidermisa in dermisa pri osebkih bele podvrste močerila
(P.a.anguinus). ......................................................................................................................... 13
Tabela 3: Relativna gostota Leydigovih celic (Lyc) v epidermisu in sluznih žlez (SŽ) v
dermisu kože hrbtne in trebušne strani trupa pri beli podvrsti močerila (P.a. anguinus).........15
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
1
1 UVOD
Močeril ali človeška ribica (Proteus anguinus) je jamska repata dvoživka iz družine
močerilarjev (Proteidae). Je edini pravi jamski vretenčar v Evropi in hkrati najpomembnejša
biološka znamenitost podzemeljskih voda Dinarskega Krasa (Sket, 1997). Prav tako je tudi
neotenična dvoživka, saj se ne preobrazi (Durand, 1971; Fox in Durand, 1990), kot to velja za
večino ostalih dvoživk (Duellman in Trueb, 1986). Zaradi upočasnjenega telesnega razvoja in
normalnega razvoja gonad doseže spolno zrelost na stopnji ličinke. Kot odrasla in spolno
zrela ohrani nekatere mladostne (juvenilne) znake ličinke, kot so zunanje škrge, škržne reže,
koža z mnogimi značilnostmi ličinke in repna kožna plavut (Bulog in sod., 2000; Bulog,
2014).
Z odkritjem črnega močerila leta 1986, je bila vrsta Proteus anguinus razdeljena na dve
podvrsti, na prvo poznano troglomorfno belo podvrsto močerila (P.anguinus anguinus) in
drugo ne-troglomorfno črno podvrsto močerila (P.anguinus parkelj) (Sket in Arntzen, 1989).
Bela podvrsta človeške ribice (P. anguinusanguinus) je popolnoma troglomorfna z zunanjo
podobo jamskih živali: koža brez temnega pigmenta, pokrnele oči z ostanki očesne leče in z
degeneriranimi čutnicami v mrežnici, nesorazmerna rast glave v dolžino z njenim podaljšanim
in prisekanim sprednjim delom (Slika 1) (Bulog, 2014).
Slika 1: Troglomorfna bela podvrsta človeške ribice (Proteus anguinus anguinus) (Foto: Domin
Dalessi, 2012; Speleološki laboratorij Oddelka za biologijo).
Človeška ribica je tudi biološko prilagojena na podzemlje: potreba po hrani je sorazmerno
majhna, presnova upočasnjena, osebni razvoj počasen, število potomcev je majhno; nekatera
čutila (kemoreceptorji, mehanoreceptorni nevromasti, elektroreceptorni ampularni organi in
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
2
notranje uho) pa ima bolj razvita in občutljiva kot pa površinske dvoživke, sposobna pa je tudi
zaznavati zemeljsko magnetno polje (Bulog in sod., 2000; Bulog, 2014).
Raziskave človeške ribice so bile usmerjene tudi v analizo njene kože. Narejena je bila
biokemijska analiza kožnih pigmentov (Istenič in Ziegler, 1974), raziskovali so vplive
hormonov ščitnice na spremembe v koži (Fox in Durand, 1990), narejene so bile tudi
raziskave elekto- in mehanoreceptorjev v epidermisu kože (Istenič in Bulog, 1984; Mali,
1990) in podrobna analiza ultrastrukture kože (Kos, 1992).
Koža dvoživk ima pomembno zaščitno in respiratorno vlogo ter omogoča transport vode in
ionov (Liem, 2001). Te različne funkcije kože dvoživk se odražajo v njeni kompleksni
zgradbi. Ob metamorfozi se v koži pojavijo številne spremembe, enocelične žleze epidermisa
izginejo, v dermisu pa se oblikujejo večcelične sluzne in strupne žleze. Izločki žlez kožo
vlažijo in preprečujejo evaporacijo vode ter ščitijo pred patogenimi bakterijami in glivami.
Vrhnji stratum mucosum epidermisa nadomesti tanek poroženeli sloj ali stratum corneum
(Liem, 2001).
Pri odraslih neoteničnih dvoživkah koža ohrani mnoge značilnosti ličink in tako je tudi pri
človeški ribici (Fox in Durand, 1990; Kos, 1992). Koža ima zunanji tanek in neporoženeli
stratum mucosum, v epidermisu so številne žlezne celice ali Leydigove celice in
mehanoreceptorni nevromasti. V dermisu so tudi večcelične sluzne žleze, ki so značilne za
kožo odraslih dvoživk.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
3
2 PREGLED LITERATURE
2.1 KOŽA VRETENČARJEV
Koža je ena od najbolj izpostavljenih mejnih plasti telesa (Liem in sod., 2001). Med svojimi
številnimi funkcijami je predvsem odgovorna za ohranjanje strukturne in fiziološke pregrade
med notranjim in zunanjim okoljem organizma (Seifert in sod., 2012). Koža vretenčarjev je
sestavljena iz številnih tkiv, vključno z epitelijem, vezivnim tkivom v katerem so krvne žile,
žleze, senzorični receptorji, živci, maščobne celice, gladke mišice in druge strukture. Koža
ščiti pred ultravijoličnim sevanjem in drugimi zunanjimi dejavniki. Izločki žlez imajo zaščitno
vlogo, služijo kot kemični signali v komunikaciji ali pa imajo prehranske funkcije. Koža pri
višjih vretenčarjih sodeluje pri sintezi vitamina D in uravnava krvni tlak ter ima pomembno
imunološko funkcijo. Pri dvoživkah ima pomembno obrambno vlogo pred plenilci in
mikroorganizmi, služi dihanju ter transportu ionov in vode (Chammas in sod., 2014).
Osnovna struktura kože in njen embrionalni razvoj sta enaka pri vseh vretenčarjih (Liem in
sod., 2001). Zunanji del kože, vrhnjica ali epidermis, ki jo gradi stratificiran epitelij, nastane
iz embrionalnega ektoderma. Leži na bazalni lamini in prekriva dermis iz fibroznega veznega
tkiva, ki je po nastanku iz mezenhimskih celic (Liem in sod., 2001).
Pri vseh vretenčarjih je epidermis oblikovan v več slojev, najbolj notranji sloj je t. i. temeljna
plast ali stratum germinativum, ki je običajno iz enega do dveh slojev celic. V temeljni plasti
nastajajo nove celice epidermisa, se pomikajo proti površini, spreminjajo obliko in pri
kopenskih vretenčarjih postopoma poroženijo in oblikujejo zunanji poroženeli sloj ali stratum
corneum. Epidermalne celice imajo torej sposobnost sinteze keratina, ki je v vodi netopen
protein. Jedro in ostali celični organeli v poroženelih celicah propadejo, mrtve celice pa se iz
poroženele plasti luščijo (Liem in sod., 2001).
Dermis je vlaknato vezivno tkivo, sestavljeno predvsem iz zunajceličnega kolagena in
elastičnih vlaken vgrajenih v osnovo iz makromolekul, ki vežejo vodo, kar daje dermisu
želatinasto konsistenco. Primarni celični elementi dermisa so podolgovate vezivne celice ali
fibrobasti, ki sintetizirajo vlakna. V dermisu so maščobne celice, gladka mišična vlakna, bele
krvničke in makrofagi. Makrofagi so fagocitne celice, ki pomagajo zaščititi telo pred tujimi
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
4
mikroorganizmi in okužbami (Liem in sod., 2001). V vezivnem delu kože rib, dvoživk in
plazilcev so tudi pigmentne celice ali kromatofore.
2.2 KOŽA DVOŽIVK
Koža dvoživk je bila od nekdaj predmet številnih morfoloških in fizioloških raziskav (cit. v
Perrota in sod., 2011). Večina raziskav je bila narejenih na brezrepih dvoživkah, predvsem
zaradi sprememb, ki se zgodijo ob preobrazbi ali metamorfozi.
Vodne ličinke dvoživk imajo kožo podobno ribji, vendar brez lusk. Po metamorfozi ostaja
povrhnjica relativno tanka, njene celice pa sintetizirajo roževino ali keratin, ki se kopiči v
vrhnjih celicah epidermisa. Odrasle dvoživke imajo tanek roževinasti sloj ali stratum
corneum, iz redko več kot le nekaj slojev celic, zato je kožno dihanje še vedno mogoče. Tanek
roževinasti sloj pa ne zagotavlja popolne zaščite pred izsuševanjem in drgnjenjem, s čimer se
soočajo vsi kopenski vretenčarji. Zunanji roženi del epidermisa se redno lušči in obnavlja.
Njegovo luščenje kontrolirajo hormoni (Liem in sod., 2001). Na različnih predelih telesa in
med različnimi fazami življenjskega cikla dvoživk je debelina epidermisa zelo raznolika
(Chammas in sod., 2014).
V dermisu kože odraslih dvoživk so večcelične alveolarne žleze. Žleze so predvsem dveh
tipov: sluzne žleze, katerih izločki ščitijo površino kože, zmanjšajo izgubo telesne vode in
ohranjajo površino vlažno, in granularne žleze, ki izločajo toksične snovi. Razdražljivi izločki
odvračajo potencialne plenilce, kače, rakune in druge plenilce. Izločki kožnih žleze dvoživk
tudi ščitijo pred patogenim bakterijami in glivami, ki so prisotne v mokriščih in vlažnih tleh,
kjer živijo dvoživke (Liem in sod., 2001).
Koža dvoživk je prepustna, dobro ožiljena in bogata z žlezami, ki so razporejene po celem
telesu (Chammas in sod., 2014).
SPREMEMBE V KOŽI MED METAMORFOZO
Pri ličinkah dvoživk je epidermis iz treh glavnih slojev, in sicer iz zunanjega sloja ali stratum
mucosum, notranjega temeljnega sloja ali stratum germinativum, v vmesnem sloju pa so 1 do
3 plasti celic vrhnjice, ki vključujejo tudi Leydigove celice in celice bogate z mitohondriji
(Perrota in sod, 2011).
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
5
Življenjski krog večine dvoživk vključuje fazo ličinke, ki je običajno vodna, medtem ko so
odrasle dvoživke večinoma kopenske. Prehod ličink do odraslega načina življenja vključuje
številne strukturne, fiziološke in vedenjske spremembe (Duellman in Trueb, 1986). Proces
preobrazbe ali metamorfoze je postopen in reguliran s hormoni (Chammas in sod., 2014).
Intenzivnim spremembam med razvojem ličink predvsem pa med metamorfozo je podvržena
tudi koža. Slednja postopoma postaja vse bolj kompleksno grajena, med metamorfozo pa se
dogodijo tudi strukturne spremembe. Nekatere celice, ki imajo pomembno vlogo v zgodnjem
življenju ličink, izginejo, druge strukture, kot so dermis in kožne žleze pa se formirajo
(Duellman in Trueb, 1086). Med metamorfozo se razvijejo večcelične sluzne in zrnate žleze,
znane tudi kot strupne žleze (Chammas in sod., 2014).
Diferenciacija kože dvoživk je pod kontrolo hormonov ščitnice. Pri poznih fazah ličink raven
ščitničnih hormonov narašča, kar spodbudi izrazite spremembe v epiteliju. Te spremembe
vključujejo izginotje nekaterih tipov celic in razvoj večceličnih žlez. Poveča se število slojev
celic epidermisa zaradi intenzivnih mitotskih delitev celic v temeljnem sloju in njihove
migracije celic na površino. V vrhnjem sloju epidermisa so celice ploščate in tudi poroženele,
saj je med metamorfozo aktiviran tudi proces sinteze keratina v celicah epidermisa (Chammas
in sod., 2014).
Za epidermis ličink so značilne Leydigove celice (Lyc), ki so pri večini dvoživk prisotne le do
metamorfoze (Lindinger, 1984). Največ študij na Lyc je bilo narejenih na ličinkah repatih
dvoživk (cit. v Lindinger, 1984). Lyc so velike in zavzemajo skoraj celotno debelino
epidermisa; raztezajo se od spodnjega stratum germinativuma do vrhnjega stratum mucosuma.
Predvidevajo, da je vloga Leydigovih celic notranja zaloga tekočine, ki je ključna v primeru
izsuševanja vodnega telesa, v katerem se ličinke zadržujejo (Kelley, 1966 cit. v Lindinger,
1984). Izloček, ki ga Lyc proizvajajo, se sprošča v intersticielne prostore med celice. Nekateri
trdijo, da je izloček vodnati, drugi, da je mukozen, ščitil pa naj bi pred bakterijami in virusi
(cit. v Fox in Durand, 1990).
2.3 KOŽA ČLOVEŠKE RIBICE
Dosedanje raziskave kože človeške ribice so bile usmerjene v biokemijsko analizo kožnih
pigmentov (Istenič in Ziegler, 1974), v ugotavljanje sprememb kože pod vplivom hormonov
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
6
ščitnice (Fox in Durand, 1990), v raziskave elekto- in mehanoreceptorjev epidermisa (Istenič
in Bulog, 1984 ; Mali, 1990) in v podrobno analizo ultrastrukturne zgradbe (Kos, 1992).
Proteus je obligatno neoteničen, torej se ne preobrazi, saj so njegova tkiva neobčutljiva za
hormone ščitnice (Langecker, 2000 cit v Bulog in sod., 2000). Slednje se odraža tudi v
zgradbi njegove kože, saj so ohranjene značilnosti kože ličink; epidermis je tanek in
neporoženel, v njem so številne Leydigove celice, ciliarne celice in čutilni organi, kot so
mehanoreceptorni nevromasti in elektroreceptorni ampulalni organi (Istenič in Bulog, 1984;
Fox in Durand, 1990; Kos, 1990). V dermisu so večcelične sluzne žleze, ki so značilne za
kožo odraslih dvoživk. Koža pri beli podvrsti človeške ribice je le rahlo pigmentirana;
pigmentnih celic, ki sintetizirajo pigment melanin, je malo. Njena koža pa vsebuje tudi
riboflavin, zaradi česar je lahko rumenkasto bela ali rožnatih barv (Istenič in Ziegler 1974).
Celotni živeljnjski cikel človeške ribice je vezan na vodno okolje, to pa tudi pomeni, da je
izpostavljena potencialnim onesnažilom v njenem okolju. Preko njene tanke kože, škrg in
prebavnega trakta namreč prehajajo kovine in druga potencialna onesnažila (Bulog in sod.,
2000). Ker pa je človeška ribica dolgoživa, njena življenjska doba je 70 let ali več, so lahko
zanjo usodne že nižje, a dolgotrajne koncentracije strupenih snovi, ki se v njenih tkivih
postopoma kopičijo (Bulog in sod., 2000, Bulog in sod., 2002).
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
7
3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
Namen naloge je primerjati morfološko zgradbo kože trupa med različno velikimi oz. starimi
osebki bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus). Primerjati želimo predvsem
debelino kože ter relativno gostoto Leydigovih celic v epidermisu in večceličnih sluznih žlez
v dermisu trupa na hrbtni in trebušni strani.
Predvidevamo, da bo koža pri mlajših osebkih tanjša in z večjim številom enoceličnih žleznih
vključkov. Pričakujemo tudi razlike v debelini kože hrbtne in trebušne strani trupa.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
8
4 MATERIALI IN METODE
4.1 MATERIAL
Analizo kože smo naredili na histoloških preparatih prečnih prerezov trupa bele podvrste
človeške ribice ali močerila (Proteus anguinus anguinus). Naš vzorec je vključeval histološke
preparate sedmih osebkov, ki so bili izlovljeni v Planinski jami (JV Slovenija) (Tabela 1).
Živali so bile velike od 192 do 290 mm, s premerom trupa od 5 do 16 mm (Tabela 1).
Histološki preparati so bili tudi že barvani in so del arhivske zbirke skupine za Funkcionalno
morfologijo vretenčarjev, Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Tabela 1: Podatki o živalih bele podvrste močerila (P.a.anguinus).
Evidenčna
številka
osebka
Lokaliteta Datum
ulova
Dolžina
osebka
(mm)
Premer
trupa
(mm)
PaaR Planinska
jama
/ / 5
Paax5 Planinska
jama
/ / 5
Paa46 Planinska
jama
12.1.1981 192 6
Paa82 Planinska
jama
2.9.1983 245 10
Paa84 Planinska
jama
7.11.1983 260 10
Paa58 Planinska
jama
20.10.1981 290 12
Paax1 Planinska
jama/
/ / 15
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
9
4.2 MORFOMETRIČNA ANALIZA
Morfometrija je zajemala naslednje meritve:
- merjenje debeline kože na hrbtni in trebušni strani trupa, vedno v osrednjem delu
prereza, za vsak osebek deset meritev za vsako stran trupa, vedno v področju kože, ki
je vključevala sluzne žleze v dermisu
- štetje Leydigovih celic v epidermisu in sluznih žlez v dermisu na hrbtni in trebušni
strani kože pod 100x povečavo in na dolžini kože 1500 µm. Za vsak osebek je bilo
narejenih deset štetij na naključno izbranih serijskih rezinah trupa.
Preparate smo pregledovali s svetlobnim mikroskopom OPTON-Axioskop, opremljenim z
digitalno kamero Leica DFC290 HD. Debelino kože smo izmerili s pomočjo programa LAS
V4 (Leica). Vedno smo merili v osrednjem delu prečnega prereza trupa hrbtne in trebušne
strani.
Podatke meritev smo vstavili v Excelovo tabelo in izračunali povprečja in standardne odklone
ter rezultate grafično predstavili.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
10
5 REZULTATI
Na prečnih prerezih trupa sedmih osebkov bele podvrste močerila (Proteus anguinus
anguinus) smo izmerili debelino kože hrbtne in trebušne strani trupa ter prešteli Leydigove
celice v epidermisu in sluzne žleze v dermisu na dolžini kože 1500 µm.
5.1 ZGRADBA KOŽE TRUPA
Kožo gradi tanek epidermis in pod njim ležeči tanek dermis (Slika 2A). Epidermis je
večplasten ploščati epitel iz pet do največ osem plasti celic, odvisno od velikosti osebka (Slika
2B, 3, 4). Pri manjših osebkih je epidermis tanjši. Celice epidermisa oblikujejo štiri med seboj
težko ločljive sloje (Kos, 1992): 1) najbolj notranji temeljni sloj ali stratum germinativum, 2)
nad njim ležeči trnasti sloj ali stratum spinosum, 3) sledi zrnati sloj ali stratum granulosum in
4) najbolj zunanji mukozni sloj ali stratum mucosum. Stratum germinativum gradijo kubične
do cilindrične celice, ki ležijo nad bazalno lamino, celice stratum spinosuma so okrogle,
poligonalne in podaljšane, stratum granulosum ima kubične celice, celice v zunanji plasti
(stratum mucosum) pa so sploščene (Kos, 1992). Temu ustreza tudi izgled njihovih jeder, ki
so pokončna v germinalni plasti, v vmesnih plasteh so okrogla ter sploščena in ležeča v vrhnji
plasti (Slika 3).
V epidermisu so številne Leydigove celice (Lyc) (Slika 2A-B, 3), ki so tipična značilnost kože
ličink dvoživk (Fox in Durand, 1990; Kos, 1992). Slednje so videti številčnejše pri
mlajših/manjših osebkih (Slika 4). Lyc so velike in ovalnih oblik, jedro je majhno in v centru
celice (Slika 3, 4). Lyc so v koži hrbtne kot tudi trebušne strani.
V epidermisu so tudi mehanoreceptorni nevromasti, ki so čebulastih oblik in se raztezajo čez
celo debelino epidermisa (Slika 3).
Dermis je dobro ožiljen, v njem so okrogle večcelične sluzne žleze, ki se z izvodilom odpirajo
na površje (Slika 2A-B, 3). Epitel sluznih žlez je sploščen (Slika 3).
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
11
Slika 2: Koža trupa na prečnem prerezu, P.a.anguinus. E, epidermis; H, hrbtenjača; D, dermis, K,
koža; Lyc, Leydigove celice; M, skeletne mišice trupa; SC, podkožje ali subcutis; SG, stratum
germinatvum; SM, stratum mucosum; SŽ, sluzna žleza. Mallory Haid barvanje.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
12
Slika 3: Koža trupa pod večjo povečavo, P.a.anguinus, prečni prerez,. E, epidermis; D, dermis, Lyc,
Leydigove celice; N, nevromast; SC, podkožje ali subcutis; SG, stratum germinatvum; SM, stratum
mucosum; SŽ, sluzna žleza. Trikromno barvanje.
Slika 4: Koža trupa pri mlajšem osebku, P.a.anguinus, prečni prerez. D, dermis, Lyc, Leydigove
celice; SC, podkožje ali subcutis; SG, stratum germinatvum; SM, stratum mucosum; SŽ, sluzna žleza.
Barvanje H&E.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
13
5.2 DEBELINA KOŽE TRUPA
Razpon debeline epidermisa hrbtne strani trupa različno velikih osebkov je od 51,3µm (±
13,5) do 136,2µm (± 29,8) in trebušne strani od 37,3µm (± 4,1) do 131,8 (± 14,4) (Tabela 2).
Razpon debeline dermisa hrbtne strani pa od 93,1 (± 5,2) do 266,1 (± 45,9), in od 80,4 (± 6,6)
do 238,6 (± 20,3) z trebušne strani (Tabela 2).
Pri večini osebkov je koža hrbtne strani trupa debelejša (Slika 5). Koža je debelejša pri
osebkih, ki so večji oz. imajo večji premer trupa (Tabela 2, Slika 5). Manjši osebki so imeli
kožo tanjšo.
Tabela 2: Povprečna debelina epidermisa in dermisa pri osebkih bele podvrste močerila (P.a.
anguinus).
Številka
osebka
Premer
trupa
(mm)
Povprečna debelina kože in standardni odklon
Hrbtna stran trupa Trebušna stran trupa
Debelina
epidermisa (µm)
Debelina
dermisa
(µm)
Debelina
epidermisa
(µm)
Debelina
dermisa (µm)
1 5 67,1 ± 5,8 133,6 ± 11,1 70 ± 8,4 109,3 ± 15,2
2 5 51,3 ± 13,5 93,1± 5,2 37,3 ± 4,1 80,4 ± 6,6
3 6 98,9 ± 29,8 154,4 ± 18,7 84,6 ± 14,1 134,3 ± 15,2
4 10 136,2 ± 29,8 257,8 ± 30,3 131,8 ± 14,1 232,1 ± 15,2
5 10 97,0 ± 8,1 253,6 ± 15,9 110,2 ± 16,7 236,2 ± 17
6 12 101,9 ± 22,1 248,5±19,94 117,2 ± 20,37 235,9 ± 19,38
7 15 135,8 ± 43,0 266,1 ± 45,9 104,1 ± 9,0 238,6 ± 20,3
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
14
Slika 5: Primerjava debeline kože hrbtne in trebušne strani trupa med različno velikimi osebki bele
podvrste močerila (P.a.anguinus). Osebki 1, 2, 3 so imeli premer trupa od 5 do 6mm, osebki 4, 5 in 6
pa od 10 do 16 mm.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
15
5.3 RELATIVNA GOSTOTA LEYDIGOVIH CELIC IN SLUZNIH
ŽLEZ
Pri manjših osebkih (s premerom trupa od 5 do 6 mm) je bilo število Leydigovih celic (Lyc)
na hrbtni strani trupa od 23,1 (± 3,8) do 26,3 (± 4,4) in na trebušni strani trupa od 13,7 (± 2,9)
do 17,7 (± 4,3) (Tabela 3). Pri večjih živalih (s premerom trupa od 10 do 15 mm) je bilo
število Lyc na hrbtni in trebušni strani nižje kot pri manjših osebkih, in sicer od 18,5 (± 3,1)
do 24,4 (± 5,9) na hrbtni strani trupa in od 9,7 (± 3,9) do 14,6 (± 2,84) na trebušni strani
(Tabela 3). Relativna gostota Lyc pri vseh osebkih je večja v epidermisu hrbtne strani trupa
(Tabela 3, Slika 6).
Pri manjših osebkih (s premerom trupa od 5 do 6 mm) je bilo število sluznih žlez (SŽ) na
hrbtni strani od 1,9 (± 0,7) do 3 (± 0,7) in na trebušni strani od 1,4 (± 0,7) do 3,2 (± 0,9)
(Tabela 3). Pri večjih živalih (s premerom trupa od 10 do 15mm) je bilo število sluznih žlez
na hrbtni in trebušni strani večje kot pri manjših osebkih, in sicer na hrbtni strani od 2,3 (±
0,95) do 4,3 (± 1,2) ter na trebušni strani od 3,7 (± 0,67) do 4,9 (± 1,2) (Tabela 3). Relativna
gostota sluznih žlez (SŽ) v dermisu je večja pri večjih osebkih (Tabela 3, Slika 7).
Tabela 3: Relativna gostota Leydigovih celic (Lyc) v epidermisu in sluznih žlez (SŽ) v dermisu kože
hrbtne in trebušne strani trupa pri beli podvrsti močerila (P.a. anguinus).
Osebki Premer
trupa (mm)
Relativna gostota Lyc in
standardni odklon
Relativna gostota SŽ in
standardni odklon
Lyc-D Lyc-V SŽ-D SŽ-V
1 5 23,1 ± 3,8 17,7 ± 4,3 1,9 ± 0,7 1,4 ± 0,7
2 5 26,3 ± 4,4 13,7 ± 2,9 3,0 ± 0,7 1,9 ± 0,7
3 6 26,1 ± 3,4 17,3 ± 2,9 2,9 ± 0,7 3,2 ± 0,9
4 10 22,8 ± 3,4 13,2 ± 2,9 3,8 ± 0,7 4,3 ± 0,9
5 10 18,8 ± 3,2 9,7 ± 3,9 3,2 ±0,6 4,9 ± 1,2
6 12 18,5 ± 3,1 14,6 ± 2,8 2,3 ± 0,9 3,7 ± 0,7
7 15 24,4 ± 5,9 10,7 ± 3,4 4,3 ± 1,2 4,9 ± 1,0
Legenda: Lyc-D, Leydigove celice dorzalne strani trupa; Lyc-V, Leydigove celice ventralne strani trupa; SŽ-D,
sluzne žleze dorzalne strani trupa; SŽ-V, sluzne žleze ventralne strani trupa.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
16
Slika 6: Primerjava relativnih gostot Leydigovih celic epidermisa dorzalne (Lyc-D) in ventralne strani
(Lyc-V) trupa med različno velikimi osebki bele podvrste močerila (P.a anguinus). Osebki 1–3 so
imeli premer trupa od 5 do 6mm, osebki 4–7 pa od 10 do 15 mm.
Slika 7: Primerjava relativnih gostot sluznih žlez7 dermisa na dorzalni (SŽ-D) in ventralni strani (SŽ-
V) trupa med različno velikimi osebki bele podvrste močerila (P.a. anguinus). Osebki 1–3 so imeli
premer trupa od 5 do 6mm, osebki 4–7 pa od 10 do 15 mm.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
17
6 DISKUSIJA
V diplomskem delu smo primerjali morfološko zgradbo kože trupa med različno velikimi oz.
starimi osebki bele podvrste močerila (Proteus anguinus anguinus). Izmerili smo debelino
kože ter na 1,5 mm kože prešteli število Leydigovih celic v epidermisu in večceličnih sluznih
žlez v dermisu na dorzalni in ventralni strani trupa.
Z nastopom metamorfoze se v koži dvoživk pojavijo morfološke spremembe, ki vključujejo
stratifikacijo epidermalnih plasti ter izginotje tipičnih larvalnih celic (cit. v Perrotta in sod.,
2011). Epidermis odraslih dvoživk sicer ostaja tanek, vendar kaže enako splošno ureditev
značilno za druge vretenčarje, z zunanjim roženim slojem ali stratum corneum in
spremenljivim številom celic epidermisa (Perrota in sod., 2011). Koža odraslih neoteničnih
dvoživk obdrži tipične značilnosti ličink, le da se epidermis stratificira, v dermisu pa se
oblikujejo večcelične žleze (Lindinger, 1984; Fox in Durand, 1990; Chammas in sod., 2014).
Rezultati primerjalne študiji kože ličink in odraslih osebkov neoteničnega repatca rodu
Necturus (Lindinger, 1984) so potrdili kompleksnejšo zgradbo epidermisa in dermisa pri
odraslih osebkih, kot pa jo imajo njihove ličinke. Tudi koža proteusa ima vse značilnosti kože
ličink, epidermis je tanek in vključuje številne Leydigove celice, v vrhnji plasti epidermisa ni
rožene plasti, temveč tanek stratum mucosum Tanek je tudi dermis, ki pa vključuje tudi
večcelične mukozne žleze, ki so sicer značilne za kožo odraslih dvoživk.
Pri večini osebkov proteusa v naši raziskavi je bila koža hrbtne strani trupa debelejša, prav
tako je bila koža debelejša pri večjih osebkih. Do podobnih rezultatov so prišli tudi Chammas
in sodelovci (2014), le, da so v omenjeni raziskavi merili debelino kože pri krastači Rhinella
granulosa (Bufonidae). Debelejša koža predvsem hrbtnega dela odraslih dvoživk je posledica
razvoja dermisa in večceličnih žlez kot tudi debelitve rožene plasti epidermisa (Chammas in
sod., 2014). V koži proteusa smo pri večjih osebkih našli več sluznih žlez (SŽ). Razen pri
manjših/mlajših osebkih, pri ostalih osebkih nismo našli bistvenih razlik v relativni gostoti SŽ
med hrbtno in trebušno stranjo kože. Pri mlajših osebkih je relativna gostota SŽ večja v
hrbtnem delu kože.
Značilnost epidermisa kože človeške ribice so številne velike Leydigove celice in čutilni
organi sistema bočne linije (Fox in Durand, 1990). Naša analiza je pokazala, da je Leydigovih
celic (Lyc) več na hrbtni strani trupa, prav tako je njihovo število večje pri manjših osebkih.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
18
Fox in Durand (1990) ugotavljata, da je povrhnjica starejših proteusov podobna
komponentam kože ličink, kar kaže na to, da se Lyc spreminjajo s starostjo. Lyc so
nameščene med zunanjimi in bazalnimi epidermalnimi celicami in se z njimi spenjajo preko
dezmosomov (Fox in Durand, 1990). Lyc imajo tipično morfologijo, v njihovi citoplazmi so
številne okrogle do ovalne ali pa podolgovate in elektronsko goste granule ter svetli vezikli
(Fox in Durand, 1990). Izloček, ki ga producirajo, se sprošča v intersticielne prostore med
celice. Vloga Lyc pravzaprav ni razjasnjena. Nekateri trdijo, da je sekret vodnati, drugi, da je
mukozen, ščitil pa naj bi pred bakterijami in virusi (cit. v Fox in Durand, 1990).
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
19
7 SKLEPI
Z rezultati raziskave lahko potrdimo:
1. da je debelina kože hrbtne strani trupa večja kot je debelina kože na trebušni strani trupa,
2. da je koža pri manjših / mlajših osebkih tanjša od kože večjih / starejših osebkov,
3. da je relativna gostota Lyc večja v epidermisu na hrbtni strani, kot na trebušni strani trupa.
4. da je pri mlajših osebkih relativna gostota Leydigovih celic večja,
5. da je relativna gostota sluznih žlez v dermisu večja pri večjih osebkih.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
20
8 LITERATURA
Bizjak Mali, L. (2010). Primerjalna anatomija vretenčarjev. Študijsko gradivo, Oddelek za
biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani. str. 101.
Bulog, B., Mihalj, K., Jeran, Z., & Toman, M. (2002). Trace element concentrations in the
tissues of Proteus anguinus (Amphibia, Caudata) and the surrounding environment. Water Air
Soil Poll. 136: 147–163.
Bulog, B. (2014). Človeška ribica. Narava Bele krajine. Metlika: Belokranjski muzej Metlika.
str. 177.
Bulog, B., Bizjak-Mali, L., Kos, M., Mihajl, K., Prelovšek, P. M., & Aljančič, G. (2000).
Biology and functional morphology of Proteus anguinus (Amphibia, Caudata). Acta biologica
Slovenica, 43 (3): 85–102.
Chammas, S. M., Carneiro, S. M, Ferro, R. S., Antoniazzi, M. M., & Jared, C. (2014).
Development of integument and cutaneous glands in larval, juvenile and adult toads (Rhinella
granulosa): a morphological and morphometric study. Acta Zoologica. Stockholm. 0: 1–18.
Duellman, W., & Trueb, L. (1986). Biology of Amphibians. In: Duellman, W. (ed.): Musculo-
Skeletal System,1st ed. McGraw-Hill, New York, pp. 289–365.
Fox, H., & Durand, J. (1990). An examination of the effect of thyroid hormone on the skin of
the neotenic Proteus anguinus. Eur Arch Biol (Bruxelles) 101:269–284.
Istenič, L., & Ziegler, I. (1974). Riboflavin as »Pigment« in the Skin of Proteus anguinus L.
Die Naturwissenschaften 12: 686–687.
Istenič, L., & Bulog, B. (1984). Some evidence for the ampullary organs in the European cave
salamander Proteus anguinus (Urodela, Amphibia). Cell Tissue Res, 235 (2): 393–402.
Kos, M. (1992). Ultrastruktura kože močerila (Proteus anguinus Laurenti, Urodela,
Amphibia) in primerjava kože nepigmentiranega in pigmentiranega osebka. Diplomsko delo,
Univerza v Ljubljani. str. 1–33.
Liem K.F., Bemis W. E., Walker W. F., & Grande L. (2001). Functional anatomy of the
vertebrates: An evolutionary perspective. Third editions. Thomson Brooks/Cole. USA.
Ferkolj, A. Morfologija kože človeške ribice (Proteus anguinus anguinus).
Dipl. Delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo, 2017.
21
Lindiger, M.I. (1984). Fine structure of the abdominal epidermis of the adult mudpuppy,
Necturus maculosus (Rafinesque). Cell Tissue Res 238:395–405.
Perrotta, I., Sperone, E., Bernabo, I., Tripepi, S., & Brunelli, E. (2011). The shift from aquatic
to terrestrial phenotype in Lissotriton italicus: larval and adult remodelling of the skin. 115:
170–178 .
Seifert, A. W., Monaghan, J. R., Voss, S. R., & Maden, M. (2012). Skin regeneration in adult
Axolotls: A Blueprint for scar-free healing in Vertebrates. PlosOne 7 (4): e32875.
Sket, B., & Arntzen, J. W. (1994). A black, non-troglomorphic amphibian from the karst of
Slovenia: Proteus anguinus parkelj n. ssp. (Urodela: Proteidae). Bijdragen tot de Dierkunde,
64 (1), 33–53.
Sket, B. (1997). Distribution of Proteus (Amphibia: Urodela: Proteidae) and its possible
explanation. Journal of Biogeography, 24, 63–280.