univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta … · kg molekularna biologija / molekularna genetika...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ZOOTEHNIKO

mag. Aleš SNOJ, dipl. ing. kmet.

MOLEKULARNO BIOLOŠKA KARAKTERIZACIJA SOŠKE POSTRVI

(Salmo marmoratus, Cuvier 1817)

DOKTORSKA DISERTACIJA

MOLECULAR BIOLOGIC CHARACTERIZATION OF MARBLE TROUT

(Salmo marmoratus, Cuvier 1817)

DISSERTATION THESIS

Domžale, 1997

Snoj, A. Molekularno biološka karakterizacija soške postrvi (Salmo marmoratus, Cuvier 1817). Dokt. dis., Domžale, BF, Oddelek za zootehniko, 1997

II

Doktorska disertacija je bila opravljena v genetskem laboratoriju Katedre za genetiko na Oddelku za zootehniko Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Znanstveno-pedagoški svet Oddelka za zootehniko je za mentorja doktorske disertacije imenoval prof. dr. P. Dovča in za somentorja prof. dr. J. Poharja.

Mentor: prof. dr. Peter Dovč Somentor: prof. dr. Jure Pohar Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Franc Habe Član: prof. dr. Radovan Komel Član: prof. dr. Jure Pohar Član: prof. dr. Peter Dovč Datum zagovora: 4. nov. 1997

Disertacija predstavlja rezultate lastnega znanstveno-raziskovalnega dela.

Doktorand: Aleš Snoj


III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dd UDK 577:575:597.5(043)=863 KG molekularna biologija / molekularna genetika / Salmo marmoratus / soška postrv /Salmo trutta / potočna postrv / DNA polimorfizem / mitohondrijska DNA / mikrosatelitna DNA / genetski markerji KK AGRIS L05 / L40 / L50 / 8130 AV SNOJ, Aleš SA DOVČ, Peter ment./ POHAR, Jure soment. KZ 1230 Domžale, SLO, Groblje 3 ZA Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko LI 1997 IN MOLEKULARNO BIOLOŠKA KARAKTERIZACIJA SOŠKE POSTRVI (Salmo marmoratus, Cuvier 1817) TD doktorska disertacija OP X, 111 s., 16 tab., 22 sl., 175 ref. IJ SL JI sl/ en AI Iskali smo genetski polimorfizem, s katerim bi bilo mogoče razlikovati med

soško (Salmo marmoratus) in potočno postrvjo (S. trutta f. fario), in opredeliti sorodstvene odnose med obema taksonoma. Znotraj kontrolne regije mitohondrijske DNA (mtDNA) smo našli tri polimorfna mesta s petimi genetskimi variantami, od katerih je bila ena značilna izključno za soško postrv, preostale pa so posamično opredeljevale ohridsko postrv, donavski in atlantski tip potočne postrvi. Pri analizi mikrosatelitne DNA smo našli dva informativna lokusa: lokus 10/9, na katerem smo odkrili 12 alelov, izmed katerih so bili trije značilni le za soško postrv, in lokus 3/77 s štirimi najdenimi aleli, od katerih je eden opredeljeval samo atlantski tip potočne postrvi. S temi genetskimi markerji smo ugotovili, da v nekaterih pritokih Soče še živijo genetsko čiste soške postrvi, in močno kontaminiranost slovenskih voda z neavtohtono potočno postrvjo atlantskega tipa. Na osnovi nukleotidne divergence znotraj kontrolne regije mtDNA med soško postrvjo in preostalimi tipi potočnice, ki znaša 1.2 %, smo ugotovili, da soške postrvi ni mogoče uvrščati v rod Salmo kot samostojno vrsto temveč le kot obliko vrste S. trutta.


IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dd DC 577:575:597.5(043)=863 CX molecular biology / molecular genetics / Salmo marmoratus / marble truot / Salmo trutta / brown trout / DNA polymorphism / mitochondrial DNA / microsatellite DNA / genetic markers CC AGRIS L05 / L40 / L50 / 8130 AU SNOJ, Aleš AA DOVČ, Peter supervisor / POHAR, Jure co-adviser PP 61230 Domžale, SI, Groblje 3 PB Univ. of Ljubljana, Biotechnical Fac., Zootechnical dep. PY 1997

TI MOLECULAR BIOLOGIC CHARACTERIZATION OF MARBLE TROUT

(Salmo marmoratus, Cuvier 1817) DT dissertation thesis NO X, 111 p., 16 tab., 22 fig., 175 ref. LA SL AL sl/ en AB A genetic polymorphism enabling a discrimination between marble (Salmo

marmoratus) and brown trout (S. trutta f. fario) and to determine genetic distances between the two species was sought. Within the mitochondrial DNA (mtDNA) D-loop region three polymorphic sites constructing five different genotypes were found, one of them being characteristic only for marble trout, the others specifying the Ohrid, the Danubian and the Atlantic type of brown trout, respectively. Analyzing microsatellite DNA two informative loci were found: the locus 10/9 revealed 12 alleles, three of them being specific only for marble trout, and the locus 3/77 with four alleles, one of them characterizing solely the Atlantic brown trout population. Using these genetic markers it was discovered that in some tributaries of the Soča river genetically pure marble trout still could be found. Besides, an intense contamination of Slovenian rivers with non-native brown trout of Atlantic origin was revealed. According to the nucleotide divergence within the mtDNA D-loop region between marble trout and the other types of S. trutta, which is 1.2 %, marble trout should be considered as a subspecies of the species S. trutta rather than a distinctive species within the genus Salmo.


V

KAZALO VSEBINE

Kjučna dokumentacijska informacija (KDI) z izvlečkom .............................. III Key words documentation (KWD) incl. abstract ...........................................IV Kazalo tabel ................................................................................................. VII Kazalo slik ..................................................................................................VIII Okrajšave ........................................................................................................IX

1 UVOD...............................................................................................................1

2 PREGLED LITERATURE...............................................................................3 2.1 ALOENCIMI....................................................................................................3 2.2 MITOHONDRIJSKA DNA..............................................................................4 2.2.1 Lastnosti mtDNA..............................................................................................5 2.2.2 Mitohondrijska DNA kot genetski marker .......................................................7 2.3 PONAVLJAJOČA SE ZAPOREDJA DNA.....................................................9 2.3.1 Sateliti .............................................................................................................10 2.3.2 Minisateliti ......................................................................................................10 2.3.3 Mikrosateliti....................................................................................................11 2.3.3.1 Lastnosti mikrosatelitov..................................................................................12 2.3.3.2 Mikrosateliti kot genetski markerji.................................................................15 2.4 SPLOŠNO O SALMONIDIH.........................................................................17 2.5 SOŠKA POSTRV...........................................................................................17 2.6 POTOČNA POSTRV .....................................................................................20 2.7 PRIMERJALNE ŠTUDIJE SOŠKE IN POTOČNE POSTRVI TER SORODNIH SALMONIDOV........................................................................21 2.7.1 Osteološke analize ..........................................................................................21 2.7.2 Kariotipiziranje ...............................................................................................22 2.7.3 Aloencimimske analize...................................................................................22 2.7.4 Analize mtDNA..............................................................................................25 2.7.5 Mikrosatelitne analize.....................................................................................28

3 MATERIAL IN METODE.............................................................................31

3.1 VZORCI .........................................................................................................31 3.1.1 Izolacija mtDNA.............................................................................................34 3.1.2 Izolacija genomske DNA................................................................................36 3.2 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA .........................................................37 3.2.1 Polimerazna verižna reakcija (PCR)...............................................................37 3.2.2 Sekvenciranje mtDNA....................................................................................38 3.2.3 Sekvenčna analiza...........................................................................................38 3.2.4 Restrikcijska analiza .......................................................................................39 3.3 ANALIZA MIKROSATELITNE DNA .........................................................39 3.3.1 Kloniranje .......................................................................................................39 3.3.1.1 Priprava DNA insertov ...................................................................................39 3.3.1.2 Priprava vektorja.............................................................................................40 3.3.1.3 Priprava kompetentnih celic ...........................................................................42 3.3.1.4 Ligacija ...........................................................................................................43


VI

3.3.1.5 Transformacija ................................................................................................44 3.3.1.6 Manipuliranje s transformiranimi celicami.....................................................44 3.3.2 Detekcija pozitivnih kolonij ...........................................................................44 3.3.2.1 Preslikava kolonij, liza bakterij ter denaturacija DNA...................................44 3.3.2.2 Hibridizacija ...................................................................................................46 3.3.2.3 Detekcija na rentgenskem filmu .....................................................................46 3.3.3 Analiza DNA insertov ....................................................................................46 3.3.3.1 Izolacija pozitivnih plazmidov .......................................................................46 3.3.3.2 Polimerazna verižna reakcija (PCR)...............................................................47 3.3.3.3 Sekvenciranje insertov....................................................................................48 3.3.4 Načrtovanje oligonukleotidnih začetnikov .....................................................48 3.3.5 Optimiziranje pogojev PCR............................................................................48 3.3.6 Analiza mikrosatelitnega polimorfizma..........................................................49 3.3.7 Statistična analiza ...........................................................................................50 3.3.7.1 Heterozigotnost - opažena in pričakovana......................................................50 3.3.7.2 Vrednost PIC ..................................................................................................50 3.4 SEKVENCIRANJE ........................................................................................51 3.5 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU..........................................52 3.5.1 Preparativna elektroforeza ..............................................................................53

4 REZULTATI ..................................................................................................54

4.1 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA .........................................................54 4.1.1 Polimerazna verižna reakcija ..........................................................................54 4.1.2 Sekvenciranje mtDNA....................................................................................54 4.1.3 Sekvenčna analiza...........................................................................................55 4.1.4 Restrikcijska analiza .......................................................................................61 4.2 ANALIZA MIKROSATELITNE DNA .........................................................62 4.2.1 Kloniranje .......................................................................................................62 4.2.2 Analiza DNA insertov ....................................................................................65 4.2.3 Oligonukleotidni začetniki..............................................................................68 4.2.4 Analiza mikrostelitnega polimorfizma ...........................................................69

5 DISKUSIJA ....................................................................................................75

5.1 MITOHONDRIJSKA DNA............................................................................75 5.2 MIKROSATELITNA DNA............................................................................86

6 POVZETEK....................................................................................................92

7 SUMMARY....................................................................................................94

8 ZAHVALA.....................................................................................................96

9 REFERENCE .................................................................................................97


VII

KAZALO TABEL

Tabela 1 Taksonomska razvrstitev soške postrvi in njenih bližnjih sorodnikov ....... 18 Tabela 2 Grupacije in vsote vzorcev glede na vrsto, lokaliteto in opravljene analize.......................................................................................................... 33 Tabela 3 Gojišča in raztopine za bakterijske kulture ................................................. 43 Tabela 4 Pufri za bakterijsko lizo, denaturacijo in renaturacijo DNA....................... 45 Tabela 5 Pufri in raztopine pri izolaciji plazmidne DNA z alkalno lizo .................. 47 Tabela 6 Nukleotidna zaporedja amplificiranega dela kontrolne regije mtDNA ...... 55 Tabela 7 Polimorfna mesta in različni genotipi, oblikovani na osnovi opaženih ......... mutacij ......................................................................................................... 56 Tabela 8 Porazdelitev genotipov med populacijami soške in potočne postrvi z .......... različnim geografskim izvorom................................................................... 57 Tabela 9 Matrika parnih sekvenčnih divergenc, izraženih v odstotkih ..................... 59 Tabela 10 Nukleotidne divergence med nekaterimi skupinami genotipov in znotraj ... njih ............................................................................................................ 59 Tabela 11 Diagnostični restrikcijski encimi za določanje posameznih genotipov .... 61 Tabela 12 Nekatere lastnosti šestih kloniranih DNA insertov................................... 67 Tabela 13 Oligonukleotidni začetniki, načrtovani za amplifikacijo sedmih ................. mikrosatelitnih lokusov............................................................................. 69 Tabela 14 Porazdelitev alelov in genotipov na lokusu 3/77 ...................................... 71 Tabela 15 Porazdelitev alelov in genotipov na lokusu 10/9 ...................................... 71 Tabela 16 Frekvence alelov lokusa 10/9 pri različnih populacijah postrvi ............... 74


VIII

KAZALO SLIK

Slika 1 Nastanek mikrosatelitov ............................................................................. 15 Slika 2 Soški postrvi iz Zadlaščice (foto: Andreja Ramšak) ................................... 19 Slika 3 Potočna postrv iz Mahnečice (foto: Andreja Ramšak)................................ 21 Slika 4 Soški postrv iz Zadlaščice in iz Trebuščice................................................. 32 (foto: Dušan Jesenšek) Slika 5 Shematični prikaz in značilnosti vektorja pBluescriptII SK+.................. 41 Slika 6 PCR produkti variabilnega dela kontrolne regije mtDNA na 2 % agaroznem gelu. ............................................................................................................. 54 Slika 7 Sekvenčni polimorfizem 330 bp dolgega dela kontrolne regije pri ............... geografsko različnih populacijah soške in potočne postrvi......................... 57 Slika 8 Filogenetsko drevesce, izdelano na osnovi metode UPGMA..................... 60 Slika 9 Filogenetsko drevesce, izdelano na osnovi metode Neighbour-Joining. .... 60 Slika 10 Restrikcijska analiza amplificiranega dela kontrolne regije mt DNA z ......... encimi Sma I, Ava I in Alu I ........................................................................ 62 Slika 12 Kloni E. coli (foto: Andreja Ramšak).......................................................... 64 Slika 13 Replike pozitivnih bakterijskih kolonij na rentgenskem filmu.................... 65 Slika 14 Ocenjevanje velikosti DNA insertov z gelsko elektroforezo. ..................... 66 Slika 15 Rezultat optimiziranja PCR ......................................................................... 66 Slika 16 Nukleotidni sekvenci dveh mikrosatelitov s sosednima regijama. .............. 68 Slika 17 Alelni polimorfizem na lokusu 3/77. ........................................................... 70 Slika 18 Alelni polimorfizem na lokusu 10/9 ............................................................ 70 Slika 19 Donavski tip potočne postrvi (foto: Andreja Ramšak) ................................ 77 Slika 20 Atlantski tip potočne postrvi (foto: Andreja Ramšak)................................. 78 Slika 21 Deaminacija metiliranega citozina v timin .................................................. 80 Slika 22 Različne vrste nukleotidnih substitucij........................................................ 81


IX

OKRAJŠAVE

A adenin

AAT aspartat aminotransferaza

AMP ampicilin

bp bazni par

C citozin

CI mešanica kloroforma in izoamilalkohola

CIAP calf intestinal alkaline phosphatase

CK kreatin kinaza

DNA desoksiribonukleinska kislina

EDTA etilen diamin tetraacetat

Es (EST) esteraza

FISH fluorescenčna in situ hibridizacija

G gvanin

HSP heat-shock proteins

IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

kb kilobazni pari

LB Luria broth

LDH laktat dehidrogenaza

MDH malat dehidrogenaza

ME maleatni encimi

MEP maleatni NADH-odvisni encimi

mtDNA mitohondrijska DNA

NADH nikotinamidadenin dinukleotid, reducirana oblika

O.D. optical density

PCI mešanica fenola, kloroforma in izoamilalkohola

PCR polymerase chain reaction

PEG polietilenglikol

RAPD random amplified polymorphic DNAs

RD ribiška družina


X

RFLP restriction fragment length polymorphism

RNA ribonukleinska kislina

rRNA ribosomska RNA

SDS sodium dodecil sulphate

SOD superoksid dismutaza

SSC saline sodium citrate

STE salt Tris-EDTA buffer

T timin

TBE Tris-borat-EDTA pufer

TE Tris-EDTA pufer

TEK Tris-EDTA-kalijev pufer

TEMED N,N,N’,N’-tetrametil etilen diamin

TET tetraciklin

TF transferin

TLE Tris-low EDTA buffer

Tris tris(hidroksimetil) aminometan (=2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-

propandiol)

tRNA transfer RNA

UPGMA unweighted pair-group method of arithmetic averages

X-gal 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid

Z-DNA levosučna DNA


1

1. UVOD Soška postrv (Salmo marmoratus) je endemit, značilen za večino porečja Jadranskega

morja. Spada v družino salmonidov in po Cuvier-u (1817) velja za samostojno

živalsko vrsto. V Sloveniji je soška postrv živela v celotnem porečju Soče, kjer je bila

tudi edini predstavnik salmonidov. Vendar pa je že od začetka tega stoletja, odkar so

začeli v njeno življensko okolje vlagati potočno postrv (Salmo trutta f. fario) in

šarenko (Oncorhynchus mykiss), v očitnem nazadovanju; ne le zaradi konkurenčnosti

obeh vloženih vrst, pač pa tudi zato, ker se je soška postrv s potočno križala. Pojavili

so se križanci, ki so se nadalje uspešno križali s soško ali potočno postrvjo ali pa med

seboj. Zaradi stalnega ponavljanja tega procesa je prišlo do resne nevarnosti, da soška

postrv v Sloveniji izumre.

Zaradi naraščanja splošne naravovarstvene zavesti, ki vključuje tudi ohranjevanje

redkih živalskih vrst, se je problem ogroženost soške postrvi v Sloveniji v zadnjih leti

zelo aktualiziral. Pojavile so se težnje po revitalizaciji soškega porečja s soško

postrvjo, pa ne le kot suhoparna želja po ohranitve vrste ali kot pragmatični prispevek

k moderni zasnovi turističnega razvoja, ampak tudi v smislu ohranjana narodne

naravne dediščine. Načrt “programa reintrodukcije”, ki ga je izdelala RD Tolmin,

temelji na ribogojniški vzreji genetsko čistih plemenskih soških postrvi, katerih

potomstvo bi bilo namenjeno za poribljanje soškega porečja. Vzreja genetsko čistih

soških postrvi je težavna, saj ni specifičnih morfoloških znakov, ki bi omogočali

zanesljivo ločevanje soške postrvi od njenih križancev s potočno postrvjo. Vpeljati je

treba natančno in hitro metodo, ki bi omogočala ločevanje med omenjenima

populacijama. Obetavne so nedavne aloencimske raziskave tujih strokovnjakov, na

osnovi katerih so našli nekaj markerjev, karakterističnih za soško postrv. Ključna

pomanjkljivost te metode pa je, da je treba v analitske namene ribe žrtvovati. Na

splošno za metode, ki temeljijo na elektroforezi proteinov, velja, da so pri določanju

genetske variabilnosti premalo učinkovite, ker zaznavajo le tisti del genoma, ki kodira

topne proteine. Bolj temeljito in obsežno je raziskovanje genetske variabilnosti na

nivoju desoksiribonukleinske kisline (DNA). Zato smo v svoji raziskavi želeli soško

postrv v primerjavi s potočno postrvjo raziskati predvsem z molekularno genetskega

vidika z namenom, da bi našli genetski marker, karakterističen za soško postrv, in

poiskali tak genetski polimorfizem, ki bi omogočal določiti genetske razdalje in


2

sorodstvene odnose med obema vrstama. To bi bil pomemben prispevek k izboljšavi

programa za ohranitev te ogrožene vrste, poleg tega pa bi se lahko prepričali, ali je

opredelitev soške postrvi kot samostojne vrste upravičena. V ta namen smo se odločili

preučevati dva različna genetska sistema: mitohondrijsko DNA, ki je zaradi strukturne

preprostosti genoma, hipervariabilnih regij, homozigotnosti ter še nekaterih drugih

lastnosti eden izmed najprimernejših objektov za molekularno genetske in

populacijske študije, ter mikrosatelitno DNA, ki zaradi svoje lokusno specifične

hipervariabilnosti predstavlja odlično molekularno orodje, s katerim je mogoče

opredeljevati razmerja med sorodnimi osebki na nivoju rodu in nižjih taksonomskih

enot.


3

2. PREGLED LITERATURE Molekularna sistematika se ukvarja z dvema področjema raziskav: (1) ugotavlja

razvoj makromolekul in (2) na tej osnovi rekonstruira razvojno zgodovino genov in

organizmov ter, širše gledano, razlaga in pojasnjuje biološko raznolikost (Moritz in

Hillis, 1996). Evolucija makromolekul obravnava obsežnost in vrste sprememb, do

katerih je prihajalo v genetskem materialu (DNA) in njegovih produktih (proteinih).

Poleg tega opredeljuje tudi mehanizme, ki so te spremembe povzročili. Obstajajo

različne metode, s katerimi lahko raziskujemo molekularno strukturo proteinov in

nukleinskih kislin. Znotraj obojih si lahko izbiramo posamezna področja, ki nudijo

različno naravo in obseg informacij.

V nadaljevanju opisujemo tri metodološka področja molekularne sistematike, ki so

ključnega pomena za našo raziskavo. To so aloencimi, mitohondrijska DNA in

repetitivne sekvence DNA. Prvih nismo uporabljali neposredno, ampak smo z

rezultati, temelječimi na aloencimskih raziskavah drugih raziskovalcev, dopolnjevali

in primerjali lastne ugotovitve. Drugi dve področji predstavljata osnovna raziskovalna

modela naše raziskave, zato ju obravnavamo širše in podrobneje.

2.1 ALOENCIMI Kot primerno orodje za molekularno opredeljevanje različnih genetskih dogajanj in

pojavov se je pokazala elektroforeza proteinov. Omogoča ugotavljanje alelnih variacij

(Ferguson in Masson, 1981), zaradi česar jo uporabljajo za ocenjevanje genetske

variabilnosti naravnih populacij, ugotavljanje genetskega toka, meje vrste in

hibridizacije ter za opredeljevanje filogenetskih odnosov (Murphy et al., 1996).

Večinoma so predmet tovrstnega raziskovanja encimi, ker s primernim postopkom

barvanja omogočajo specifično in relativno preprosto vizualizacijo na gelu (Hunter in

Markert, 1957). Pri preučevanju sorodnih populacij pogosto analizirajo in primerjajo

različne oblike polipeptida (aloencime). Aloencimi so opredeljeni kot različne

genetske variante določenega lokusa. Podatki so tem bolj informativni, čim več

aloencimskih lokusov je v raziskavi in kolikor bolj so ti lokusi polimorfni. Ker

dedovanje aloencimov poteka po Mendlovih zakonih in se večinoma odraža na

kodominanten način, omogočajo aloencimske študije zanesljiv posreden vpogled v

genetsko strukturo raziskovanega organizma. Ta metoda je v 70-ih letih predstavljala


4

glavno orodje, ki je omogočalo poglobljeno preučevanje genetske variabilnosti

vključno s kvantitativnimi ocenami genetske variabilnosti med populacijami in znotraj

njih in ugotavljanjem evolucijskih trendov (Utter in sod., 1989). V današnjem času

elektroforezo proteinov v veliki meri nadomeščajo modernejše tehnike, ki temeljijo na

analizah DNA, vendar je ta metoda še vedno popularna za ugotavljanje novih

molekularnih markerjev (Avise, 1994).

Čeprav so se aloencimski markerji izkazali kot dragocen in relevanten pripomoček pri

opredeljevanju sorodnosti populacij, je vendarle potrebno omeniti določene

pomanjkljivosti te metode, na katere opozarjajo nekateri raziskovalci (Gyllensten in

Wilson, 1987; Billington in Hebert, 1991, Utter in sod., 1988). Substitucije

aminokislin v proteinih, ki jih pokaže elektrofreza, so indirekten odsev dejanskih

nukleotidnih substitucij. Znano je, da zaradi degeneriranega genetskega koda

določene bazne substitucije znotraj kodona ne povzročajo spremembe aminokisline.

Poleg tega Lewontin (1974) ugotavlja, da je v povprečju z elektroforezo mogoče

zaznati le tretjino vseh aminokislinskih substitucij. Očitno je torej, da preko

elektroforetskih rezultatov ni mogoče vedno zanesljivo sklepati na genotip. Tudi

področje DNA, ki ga pokriva elektroforeza aloencimov, je majhno, saj se nanaša le na

tisti del genoma, ki kodira topne proteine (Hynes in sod., 1989). Vsem omenjenim

težavam se je mogoče izogniti z vpeljavo novejših molekularnih tehnik, katerih

neposreden predmet raziskave je sama DNA. Te tehnike omogočajo identifikacijo

neomejenega števila genetskih markerjev. Nekatere temeljijo na določanju

nukleotidnega zaporedja homolognih fragmentov DNA primerjanih organizmov, na

naključnem pomnoževanju polimorfne DNA, na restrikcijski analizi DNA, druge spet

na principu DNA-DNA ali cDNA-DNA hibridizacije. Tudi tovrstne tehnike se med

seboj razlikujejo glede na naravo informacij, ki jih nudijo, in na obseg genoma, ki ga

analizirajo (Harrison, 1991).

2.2 MITOHONDRIJSKA DNA Eden izmed najbolj uporabnih modelov DNA za ugotavljanje genetske strukture

populacij, taksonomskih opredelitev in filogenetskih odnosov, križanja, introgresije

ter procesa nastajanja novih vrst je mitohondrijski genom (Avise et al, 1987).

Variabilnost mitohondrijske DNA (mtDNA) je mogoče ugotavljati neposredno z

določanjem nukleotidnih zaporedij (sekvenciranjem), mnogi raziskovalci pa so se


5

zaradi praktičnih razlogov odločali za restrikcijsko analizo fragmentov mtDNA, za

objekt svoje raziskave pa so izbrali celokupno mtDNA (Gyllensten in Wilson, 1988).

Tovrstne študije sicer omogočajo vpogled v genetski polimorfizem mitohondrijskega

genoma, ne opredeljujejo pa same narave te variabilnosti (Beckenbach in sod., 1989).

V ta namen je potrebno podrobneje analizirati specifične regije mitohondrijskega

genoma. Prvotno so bile take raziskave povezane s kloniranjem in sekvenciranjem

raziskovanih regij, čemur so se zaradi zamudnosti in zapletenosti teh postopkov

številni raziskovalci izogibali. Razvoj preprostejših tehnik sekvenciranja in predvsem

vpeljava pomnoževanja DNA s polimerazno verižno reakcijo (PCR; Mullis in

Faloona, 1987) v prakso pa sta bistveno olajšala analizo posameznih regij

mitohondrijskega genoma, s čimer se je vrednost mtDNA kot raziskovalnega objekta

še povečala.

2.2.1 Lastnosti mtDNA

Mitohondrijska DNA vretenčarjev je kovalentno zaprta krožna molekula, ki glede na

endosimbiotsko teorijo o izvoru mitohondrijev, predstavlja reliktno prokariontsko

DNA v eukariontski celici (Gray, 1989). Njena velikost se giblje med 14-26 kb

(Billington in Herbert, 1991), pri salmonidih so jo ocenili na 16670 bp (Berg in Ferris,

1984). Glede na primerjave celotne nukleotidne sekvence mtDNA človeka, krave in

miši ugotavljajo, da sta organizacija in število genov v mtDNA zelo ohranjeni

(Anderson in sod., 1981,1982; Bibb in sod., 1982). Hibridizacijske študije mtDNA pri

ciprinidih, salmonidih in polenovkah so pokazale, da podobna genska razvrstitev

obstaja tudi pri ribah (Araya in sod.,1984; Davidson in sod., 1989, Thomas in

Beckenbach, 1989). Večino mitohondrijskega genoma sestavljajo kodogene regije, ki

kodirajo dve rRNA mitohondrijskega ribosoma, 22 tRNA molekul in 13 polipeptidov,

ki so sestavni del mitohondrijske respiratorne verige. Za regulacijo replikacije in

transkripcije skrbi kontrolna regija (angl. D-loop region; Borst in Grivell, 1981), ki

meri približno 1 kb in predstavlja edino posredovalno sekvenco v mitohondrijskem

genomu. Geni so zgoščeno razvrščeni drug ob drugem brez vmesnih intronov; v

mitohondrijskem genomu so odkrili tudi 13 odprtih čitalnih okvirov, ki naj bi kodirali

naslednje proteine: citokrom b, tri podenote citokrom oksidaze, dve podenoti ATP

sintaze (FOF1ATPaza) in sedem podenot NADH dehidrogenaze (Gillham, 1994;

Anderson in sod., 1982; Montoya in sod., 1983). Translacija temelji na posebnem


6

genetskem kodu, ki se razlikuje od univerzalnega (Borst in Grivelll, 1981; Barrell in

sod., 1979). Mitohondrijska DNA ima popolnoma samostojen replikacijski sistem. V

somatskih celicah se pojavlja v velikem številu kopij (do 1000 na celico), zaradi česar

je izolacija mtDNA relativno preprosta (Billington in Herbert, 1991). Zanimivo je, da

je v zreli jajčni celici okoli miljon, v spermiju pa le okoli 50 kopij mtDNA. Dedovanje

mtDNA velja za maternalno (kljub nekaterim dokazom o biparentalnem dedovanju

mtDNA pri nevretenčarjih; Hoeh in sod., 1991), kar so dokazali z recipročnimi

križanji npr. konja in osla. Poleg majhnosti mitohondrijskega genoma, njegovega

preprostega genetskega ustroja, lahke izolacije mtDNA in njegovega maternalnega

dedovanja je potrebno omeniti še eno lastnost, ki je zlasti pomembna pri genetskem

opredeljevanju sorodnih populacij. Gre za visoko stopnjo mutacij, ki je pri mtDNA

vretenčarjev v poprečju za en velikostni red večja kot pri kromosomski DNA in je

ocenjena na 5.7 X 10-8 substitucij na sinonimno nukleotidno mesto na leto (Brown in

sod., 1982). Osnovni vzrok temu je najbrž “intenzivnejša dinamika” mtDNA, ki se v

primerjavi z jedrno pomnožuje tudi pet do 10 krat hitreje (Brown in sod., 1979). Večja

pogostnost mutacij v mtDNA je lahko tudi posledica neučinkovitih popravljalnih

mehanizmov (Tomkinson in Linn, 1986), nezanesljivosti procesa replikacije DNA (Li

in Grauer, 1991), visoke koncentracije mutagenih snovi (superoksidni radikali, O-2),

ki nastajajo pri metaboličnih procesih mitohondrija (Li in Grauer, 1991) ali manjšega

selekcijskega pritiska v določenih regijah, kjer zato prihaja do hitre fiksacije mutacij

(Cann in sod., 1984). Stopnja sekvenčne divergence se vzdolž mtDNA molekule

spreminja. Primerjalno sekvenciranje in restrikcijske analize so pokazale, da je

frekvenca mutacij največja v kontrolni regiji, najmanjša pa v regijah, ki kodirajo

rRNA molekule (Ferris in Berg, 1988). Večina genetskih sprememb so preproste

bazne substitucije (tranzicije in transverzije1) in kratke insercije ali delecije, ki pa so

redke. Večinoma se vse opisane mutacije pojavljajo v kontrolni regiji. Tudi ta regija

ima različno konzervirane segmente; v splošnem je najbolj ohranjen njen centralni

del, ki je velik približno 270 bp in je značilen tudi po nadpoprečno visoki vsebnosti

gvaninskih in citozinskih baz (Shedlock in sod., 1992). Vsebuje polipirimidinski blok,

ki bi lahko predstavljal vezno mesto za mitohondrijske regulatorne proteine oz.

transkripcijske faktorje (Mignote in sod., 1985). Njegova sosednja fragmenta sta

variabilna in imata nadpoprečno visoko vsebnost adeninskih baz. Znotraj teh sicer

1Tranzicje so substitucije med A in G (purini) ali med C in T (pirimidini), transverzije pa so substitucije


7

variabilnih fragmentov pa se nahaja nekaj kratkih (od 15 do 20 bp), vendar izredno

konzerviranih elementov. Nekateri izmed njih naj bi bili neposredno vključeni v

inicijacijo oz. terminacijo replikacije (Digby in sod., 1992). Substitucije se v manjšem

obsegu pojavljajo tudi v kodirajočih regijah, kjer so praviloma sinonimne in ne

povzročajo aminokislinskih sprememb. (Meyer in Wilson, 1990). Večina

raziskovalcev poroča o tranzicijskem odklonu, ki pomeni, da je število tranzicij večje

od števila transverzij (Li in Graur, 1991). Tranzicijski odklon se zmanjšuje z

naraščanjem sekvenčne divergence, ker število tranzicij po določenem času doseže

vrh; nadalje so možne le povratne mutacije, ki pa jih ni mogoče prepoznati. Poleg

tranzicijskega odklona izraža mtDNA tudi kompozicijski odklon, t.j. pogostejše

pojavljanje določenega nukleotida v eni od obeh verig mtDNA (Brown, 1985). Tudi

spremembe dolžine mtDNA molekul (dolžinska heteroplazmija) praviloma izhajajo iz

dolžinskih razlik kontrolne regije. Te so posledica različnega števila tandemskih

ponovitev v tej regiji (Moritz in sod., 1987). V splošnem je dolžinska heteroplazmija

za razliko od točkovne heteroplazmije, ki je zelo redka, pri vretenčarjih (razen pri

sesalcih) pogosta. Vzrok za to je najbrž v tem, da so mutacije, ki povzročajo

spremembo dolžine, pogostnejše od tistih, ki povzročajo točkovne spremembe

(Harrison, 1989).

2.2.2 Mitohondrijska DNA kot genetski marker

Za mtDNA je značilna variabilnost, do katere prihaja med posameznimi taksoni

(interspecifična divergenca) ali pa znotraj določenega taksona (intraspecifična

divergenca). Zaradi te lastnosti predstavlja mtDNA marker, s katerim lahko dobro

razlagamo strukture populacije in zasledujemo intraspecifične variacije posameznih

geografsko ločenih populacij.

Fenomen maternalnega dedovanja mtDNA zagotavlja, da ostaja mitohondrijski

genom nespremenjen tudi po fazi reprodukcije, ko pri diploidni kromosomski DNA

prihaja do segregacije in rekombinacij. Zato analiza genoma mtDNA omogoča

zasledovanje ženskih linij v populacijah. Širše gledano maternalno dedovanje

omogoča zasledovanje bližnjih evolucijskih dogodkov, kot so naravne ali umetne

naselitve (kolonizacije) in drastični padci v populacijski gostoti (efekt ozkega grla).

med purinom in pirimidinom. (Li in Graur, 1991)


8

Mitohondrijska DNA predstavlja univerzalen genetski marker, saj regije z različno

stopnjo konzerviranosti omogočajo zasledovanje evolucijskega razvoja tako v bližnji

kot zelo davni preteklosti.

Čeprav je določitev odnosov med sorodnimi vrstami na osnovi mtDNA markerjev v

mnogih primerih v skladu z morfološkimi, aloencimskimi in drugimi genetskimi

opredelitvami le-teh, občasno vendarle prihaja do neskladij (Harrison, 1989). V

primerih križanja med sorodnimi vrstami lahko to neskladje razložimo z diferencialno

introgresijo. Ta pojem razlaga teorija hibridne cone, ki predpostavlja, da je usoda

določenega markerja pri introgresiji odvisna od tega, ali je ta marker vezan z geni, ki

negativno vplivajo na reprodukcijo ali ne. Če je, je širjenje takega markerja skozi

hibridno cono oteženo ali onemogočeno; in ker markerji mtDNA fizično niso vezani z

jedrnim genomom, je njihova introgresija v primerjavi z jedrnimi markerji lahko večja

(Barton in Hewitt, 1989). Do neskladja med markerji mtDNA in jedrne DNA lahko

pride tudi zaradi naključne fiksacije ali izginotja določenih polimorfnih variant

mitohondrijskega genotipa (Avise in sod., 1983; Niegel in Avise, 1986). Posledično

lahko izolacija sorodnih populacij, pri katerih pride do fiksacije enega od obstoječih

alelov nekega mitohondrijskega markerja, privede v situacijo, ko se te populacije

navkljub podobni jedrni genetski identiteti v smislu mtDNA bistveno razlikujejo.

Lahko pa se zgodi, da se neka subpopulacija diferencira do take mere, da nastopi kot

samostojna vrsta, istočasno pa ohranja mitohondrijski genotip svojih prednikov.

Omenjenim problemom se lahko izognemo le tako, da poleg mitohondrijskega

genoma v raziskavo vključimo še jedrni genom (Ferris in Berg, 1988).

Izmed prednostnih lastnosti, ki mtDNA uvrščajo med učinkovite genetske

raziskovalne objekte, je treba izpostaviti tudi nekatere, ki se ob določenih analitskih

pristopih lahko izkažejo tudi kot pomanjkljivosti. Ena izmed takih lastnosti je

maternalno dedovanje mtDNA. Zaradi maternalnega dedovanja mtDNA namreč

določitev mitohondrijskih diagnostičnih markerjev, ki bi omogočali nepristransko

razlikovanje med hibridi in genetsko čistimi populacijami, ni mogoča. V takih

primerih so veliko bolj informativni markerji, s katerimi lahko zasledujemo tako

maternalno kot paternalno dedovanje.

Nadalje lahko pri analizah zelo sorodnih osebkov predstavlja problem premajhna

variabilnost mtDNA.

Zaradi neodvisnega dedovanja mtDNA od kromosomske DNA lahko sklepi, ki

temeljijo samo na osnovi mtDNA, podajo nerealno sliko o stanju raziskovane


9

populacije. Geni mtDNA namreč precej lažje prehajajo skozi hibridne cone kot pa

jedrni geni, kar lahko povzroči zmedo v filogenetskih in drugih populacijskih

analizah.

Zato je pri populacijskio genetskih študijah poleg mtDNA priporočljivo v raziskavo

vključiti še kromosomske markerje. Ti naj bi bili seveda čim bolj informativni in

obenem praktični za delo. Kot eden izmed genetskih markerjev z omenjenimi

kvalitetami so se v drugi polovici 80-ih in v prvi polovici 90-ih let nedvomno

pokazale repetitivne sekvence DNA, od katerih po svoji učinkovitosti še posebno

izstopajo mikrosateliti.

2.3 PONAVLJAJOČA SE ZAPOREDJA DNA Ponavljajoča se zaporedja ali repetitivne sekvence DNA zavzemajo velik del genoma

večine evkariontov. Vključujejo satelitno DNA ter minisatelitne in mikrosatelitne

sekvence DNA (Charlesworth, 1994).

Izraz satelitna DNA z vsemi svojimi izpeljankami se je pojavil, še preden so sploh

poznali njeno pravo molekularno strukturo. Pri ultracentrifugiranju v bujonskem

gostotnem gradientu genomska DNA tvori frakcijo, katere položaj je odvisen od

količine gvanina (G) in citozina (C) v DNA. Kmalu so odkrili, da pri takem

centrifugiranju DNA prokariontov praviloma oblikuje en sam sedimentni pas, medtem

ko evkariontska DNA tvori ali zelo difuzen sedimentni pas ali pa več ločenih pasov

hkrati. Te dodatne sedimentne pasove so poimenovali satelite, pripadajočo DNA pa

satelitno DNA. Ugotovili so, da to frakcijo sestavlja zelo repetitivna DNA z milijoni

tandemskih ponovitev relativno kratkih nukleotidnih motivov. Kompleksnost takih

sekvenc je zelo omejena, zato lahko njihova poprečna vsebnost G in C znatno odstopa

od njune vsebnosti v preostalem genomu. Nekateri sateliti pa vendar ne odstopajo od

večinske frakcije DNA in se pri ultracentrufugiranju od nje ne ločijo; satelite te vrste

so poimenovali kriptični ali skriti sateliti (Tautz in sod., 1986; Tautz, 1993).


10

2.3.1 Sateliti

Satelitna DNA je postala sinonim za ponavljajoče se tandemske ponovitve DNA,

katerih repetitivnost se giblje med 103 do 107 ponovitev na lokus. Dolžina posamezne

ponavljajočega se motiva je od dva do nekaj tisoč bp. Satelitna DNA se navadno

nahaja v heterokromatinu, večinoma v centromerah, telomerah ali na Y kromosomu

(Charlesworth in sod., 1994). Pri evkariontih zavzema približno 30 % celotnega

genoma (Abercrombie in sod., 1992).

2.3.2 Minisateliti

Minisateliti se razlikujejo od satelitov predvsem po zmernejši ponovljivosti

tandemskih enot, ki se giblje od dva do nekaj 100 na lokus. Dolžina enote je od devet

do 100 bp, večinoma pa meri okoli 30 bp. Po genomu so razporejeni bolj homogeno

kot sateliti; so tudi v eukromatinu, največ pa jih je v bližini telomernih regij. Našli so

jih pri vretenčarjih, glivah in rastlinah (Armour in Jeffreys, 1992). Minisatelite je

odkrilo po naključju v začetku 80-ih let več raziskovalnih skupin. Opazili so izrazit

polimorfizem v številu ponavljajočih se enot. Veliko minisatelitnih lokusov kaže čez

90 % heterozigotnost; stopnje mutacij so običajno zelo visoke in presegajo vrednost

102 na generacijo. Zaradi tega imajo minisatelitni lokusi ogromno število alelov, ki so

individualno zelo specifični. Na osnovi tega polimorfizma je Alex Jeffreys, ki je

minisatelitom dodelili to generično ime, razvil tehniko, ki jo je poimenoval “DNA-

fingerprinting” (Jeffreys in sod., 1985). Ta omogoča razlikovanje med najbolj

sorodnimi osebki. Pri tej tehniki genomsko DNA razrežejo z restrikcijskimi encimi na

ustrezno dolge fragmente, ki jih z gelsko elektroforezo razvrstijo po velikosti.

Fragmenti z minisateliti se med posamezniki razlikujejo po velikosti v skladu z

obsegom polimorfizma določenega minisatelitnega lokusa. Na tak način vsak osebek

izoblikuje svojstven vzorec fragmentov DNA. Več kot je v raziskavo vključenih

lokusov, tem bolj je vzorec kompleksen in specifičen. Vizualizacija fragmentov

poteka s hibridizacijo označene oligonukleotidne sonde z določenimi minisatelitnimi

motivi, ki jih sonda specifično prepoznava. Taka sonda (multilokusna sonda)

identificira alele različnih minisatelitnih lokusov naenkrat; to sicer povečuje

variabilnost med osebki, ne omogoča pa določanj posameznih genotipov. Poleg tega

je zaradi kompleksnosti rezultatov ponovljivost poskusov slaba pa tudi praktična


11

interpretacija rezultatov je zelo komplicirana in zamudna. Te pomanjkljivosti so

poskušali izboljšati z lokusno specifičnimi sondami, ki poleg osnovne minisatelitne

sekvence specifično prepoznavajo tudi unikatni del robnega zaporedja ob minisatelitu.

To omogoča ugotavljanje posameznih genotipov, vendar pa zmanjšuje stopnjo

idividualne specifičnosti. Poleg tega določitev regije ob minisatelitu zahteva dodatne

laboratorijske analize, ki so zaradi dolgih minisatelitnih sekvenc komplicirane in

dolgotrajne. Zaradi jasnosti so pristop z lokusno specifično sondo poimenovali

“DNA-profiling” za razliko od izraza “DNA-fingerprinting”, ki se nanaša na

večlokusne sonde (Jeffreys in sod., 1991).

2.3.3 Mikrosateliti

Mikrosateliti1 so zaporedja kratkih in ponavljajočih se nukleotidnih enot v genomski

DNA, ki so dolge od enega do šest bp (Tautz, 1993). Znotraj lokusa se lahko ponovijo

od pet do sto krat.

Nekatere oblike mikrosatelitov so opazili že v 70-ih letih; imenovali so jih

polipirimidinske regije (/TC/n; Birnboim in Straus, 1975). Nadalje so poročali še o

dveh vrstah mikrosatelitov (GATA)n in (GACA)n, ki so jih odkrili pri navzkrižni

hibridizaciji s satelitno DNA iz spolnega kromosoma W pri kačah (Epplen in sod.,

1982). To odkritje je v tistem času sprožilo veliko polemik o morebitnem vplivu

repetitivnih sekvenc DNA na določanje spola, ki so se kasneje izkazale za

neosnovane. Leta 1982 so pri kvasovkah in vretenčarjih odkrili veliko število

mikrosatelitov z osnovno enoto GT. Približno v istem času je bilo ugotovljeno, da

lahko DNA zavzame obliko levosučne vijačnice (Z-DNA) in sicer predvsem na

odsekih, kjer se enakomerno izmenjujejo purini in pirimidini (Hamada in sod., 1982).

To je sprožilo ugibanja o tem, ali morda mikrosateliti vplivajo na formacijo Z-DNA, s

čimer bi lahko posredno vplivali tudi na regulacijo izražanja genov in rekombinacijo

ter na kondenzacijo kromosomov (Lagercrantz in sod., 1993). Prepričljivih dokazov, s

katerimi bi lahko te predpostavke ali potrdili ali zanikali, zaenkrat še niso našli.

Nadalje sta Tautz in Renz (1984) pri vrstah različnih evkariontskih organizmov našla

še preostale oblike mikrosatelitov. S pojavom PCR se je možnost raziskovanja

mikrosatelitov bistveno povečala. Leta 1989 so s to tehniko tri raziskovalne skupine

1 V literaturi jih pogosto označujejo s kraticami SSRs (simple sequence repeats) ali STRs (simple tandem repeats).


12

neodvisno ugotovile, da mikrosatelitni lokusi po večini nastopajo kot skupina alelov,

ki se med seboj razlikujejo v številu ponovitev osnovne enote mikrosatelita (Tautz,

1989; Weber in May, 1989; Litt in Luty, 1989).

2.3.3.1 Lastnosti mikrosatelitov

Mikrosatelite so našli pri vseh do sedaj raziskovanih evkariontih, v manjšem obsegu

pa tudi pri nekaterih eubakterijah in drugih prokariontih (Tautz, 1989). Praviloma so

mikrosatelitni lokusi majhni in ne presegajo 100 bp. Večinoma so omejeni na

eukromatin, kjer so bolj ali manj enakomerno razporejeni (Stallings in sod., 1991).

Mikrosateliti se v evkariontskem genomu pojavljajo najmanj vsakih 10 kb enkrat

(Tautz, 1989). Do nedavnega je veljalo, da so mikrosateliti najbolj pogosti pri sesalcih

in socialnih žuželkah (Glenn, 1995), novejše raziskave (Slettan in sod., 1996) pa

kažejo, da je zastopanost mikrosatelitov pogosta tudi pri ribah.

V osnovni enoti mikrosatelita lahko načeloma nastopajo vse permutacije baz.

Obstajajo pa razlike v pogostnosti pojavljanja osnovnih motivov (Karlin in Burge,

1995). Pri vretenčarjih je najpogostejši ponavljajoči se motiv CA, sledijo mu AG,

AAC, AAG in AAT (Glenn, 1995). Ocenjujejo, da se v podganjem oz. človeškem

genomu mikrosatelit (CA)n ponovi poprečno enkrat na vsakih 15 oz. 30 kb,

mikrosatelit (AG)n pa na vsakih 50 oz. 113 bp (Stallings, 1991; Beckmann in Weber,

1992). Pri rastlinah so najbolj zastopani motivi A, AT in GA, ki se pojavljajo pri 75 %

vseh rastlinskih mikrosatelitov (Lagercrantz in sod., 1993). V splošnem velja, da so

bolj kompleksni motivi redkejši. Mikrosateliti so podvrženi visoki stopnji mutacij

(10-3 do 10-4 na lokus na generacijo pri dinukleotidnih mikrosatelitih), kar se odraža v

izrazitem dolžinskem polimorfizmu; pri nekaterih mikrosatelitnih lokusih so opazili

celo do 50 alelov (Amos in sod., 1993). Stopnja polimorfizma je v glavnem

sorazmerna s številom ponovitev osnovnega motiva. Alelna hipervariabilnost se začne

že pri mikrosatelitih z desetimi ponovitvami dinukleotidnega motiva (Weber, 1990),

medtem ko so mikrosateliti z osmimi ponovitvami in manj praviloma monomorfni

(Valdes in sod., 1993; Armour in sod., 1994). Mikrosateliti se dedujejo po Mendlovih

zakonih in kažejo alelno kodominanco (Litt in Luty, 1989). Pomembna značilnost

mikrosatelitov je relativno velika ohranjenost njihovih lokusov med sorodnimi

vrstami (Moore in sod., 1991). To omogoča napovedovanje določenega

mikrosatelitnega lokusa v še neraziskanem genomu. Visoka ohranjenost


13

mikrosatelitnih lokusov nakazuje, da bi mikrosateliti v molekularno genetskem

kontekstu lahko predstavljali esencialne elemente. Direkten dokaz za to so

mikrosateliti (CT)n, ki so jih našli v promotorskih regijah dveh genov, ki kodirata

“heatshock proteine” (HSP) in se nahajata v genomu vinske mušice (Drosophila

melanogaster). Omenjene repetitivne sekvence predstavljajo vezna mesta za

transkripcijske faktorje in tako igrajo pomembno vlogo pri kontroli izražanja HSP pri

vinski mušici (Glaser in sod., 1990; Lu in sod., 1993; Tsukiyama in sod., 1994).

Čeprav se mikrosateliti v veliki večini nahajajo blizu genov, je to zaenkrat edini

primer, ki neposredno kaže na vlogo mikrosatelitov pri genski regulaciji (Stallings,

1995). Zaradi pojavljanja mikrosatelitov v kodogenih regijah so sekvence ob

mikrosatelitih običajno dobro ohranjene. To je še posebej pomembno pri načrtovanju

oligonukleotidnih začetnikov, namenjenih za pomnoževanje mikrosatelitov. Rezultati

tovrstnih raziskav pri ptičih in sesalcih kažejo, da so te regije zelo dobro ohranjene pri

organizmih znotraj določenega rodu (Moore in sod., 1991; Glenn, 1995), kjer je

navzkrižna uporaba oligonukleotidnih začetnikov praviloma možna. Pri individuih iz

različnih družin pa so te regije že tako spremenjene, da je navzkrižna aplikacija

oligonukleotidnih začetnikov večinoma neuspešna (Glenn, 1995). Na splošno velja,

da vsaka mutacija v zaporedju DNA, kamor se med PCR vežejo oligonukleotidni

začetniki, lahko omeji ali prepreči njihovo vezavo in s tem potek samega

pomnoževanja. Če se taka mutacija pojavi le na enem od obe alelov nekega

heterozigota, eden od obeh PCR-produktov izostane in osebek je napačno opredeljen

kot homozigot (Callen in sod., 1993). Nepomnoženi aleli-imenujejo jih tihi ali nulti

aleli-lahko precej zapletejo interpretacijo tovrstnih rezultatov, saj navidezno kažejo na

odstopanja od zakonov Mendlovega dedovanja.

Dolžinski polimorfizem mikrosatelitov verjetno nastane kot posledica nepopravljenih

ali napačno popravljenih napak, do katerih lahko pride pri replikaciji mikrosatelitne

sekvence (Strand in sod., 1993; Stallings, 1994). Predpostavljajo, da se ta proces

začne z odmikom polimeraznega kompleksa od enojne DNA vijačnice, na kateri

poteka replikacija. (to se “in vivo” dogaja na zaostajajoči niti, pri PCR amplifikaciji

pa je odmik (zastoj) polimeraze odvisen od njene procesivnosti.) Takrat lahko zaradi

osvobojenega konca ena od obeh niti za nekaj nukleotidov zdrsne nazaj ob svoji

sosedi. Ta zdrs povzroči nastanek zanke, ki jo tvorijo izrinjeni nukleotidi. Zanka se

lahko giblje in potuje do konca repetitivne sekvence, kjer je komplementarnost

prekinjena. Popravljalni mehanizem lahko zanko ali odreže ali jo ponovno vgradi v


14

verigo s tem, da na komplementarni niti vstavi manjkajoče nukleotide (Schlötterer in

Tautz, 1992). Pri replikaciji “in vivo” je matrična nit v primerjavi z Okazakijevimi

fragmenti precej bolj vpeta in rigidna, zato obstaja večja verjetnost, da pride do zdrsa

nastajajoče niti. V tem primeru lahko DNA ostane nespremenjena ali pa se podaljša.

To potrjuje domneva, da je razvoj mikrosatelitov usmerjen k zvišanju števila

ponovitev (Rubinsztein in sod., 1995). Situacija je nekoliko drugačna pri PCR-

amplifikaciji, kjer imata obe niti enako gibljive konce. Tu sekundarne struktrure laže

tvori daljša veriga. Ker pri PCR popravljalnih mehanizmov ni, je edina možna

posledica take replikacijske napake skrajšanje nastajajoče verige (Murray in sod.,

1993). To teorijo potrjujejo tudi praktične ugotovitve mnogih raziskovalcev, ki so pri

pomnoževanju mikrosatelitov s PCR (zlasti tistih z dinukleotidnimi zaporedji)

neposredno ob osnovnem produktu opazili še niz dodatnih, manjših, ki so se med

seboj razlikovali za en ali dva nukleotida (Murray in sod., 1993; Schlötterer in Tautz,

1992). Omenjen model predstavlja osnovno razlago za nastanek mikrosatelitnega

polimorfizma in predpostavlja, da do spreminjanja dolžine alelov prihaja postopoma

(Valdes in sod., 1993). Analiza frekvenčne porazdelitve alelov glede na njihovo

dolžino pri več kot stotih humanih mikrosatelitih je pokazala, da ta predpostavka v

splošnem drži; aleli se med seboj razlikujejo največkrat v eni ali dveh ponovitvah.

Občasno se pojavljajo tudi obsežnejša odstopanja, ki pa so redka. Domnevajo, da so

le-ta posledica izmenjave neenakomerno velikih regij repetitivne DNA pri “crossing-

over-ju” (Valdes in sod., 1993; Charlesworth in sod., 1994).

Veliko je torej raziskanega o razvoju mikrosatelitov, malo pa je znanega o njihovem

nastajanju. Pred kratkim je Messier s sodelavci (1996) poročal o izsledku neodvisnega

rojstva dveh mikrosatelitov, ki se nahajata v regiji η-globinskih psevdogenov pri

nekaterih primatih (slika 1). Nastanek obeh mikrosatelitov sta povzročili dve različni

točkovni mutaciji znotraj osemnukleotidne osnove, iz katere sta nastala oba

mikrosatelita. Ena izmed mutacij je povzročila pojav dveh enakih tetranukleotidnih

enot, druga pa nastanek dinukleotidnega mikrosatelita s petimi ponovitvami. V času

evolucije se je pri nekaterih primatih (gorila /Gorilla gorilla/, šimpanz /Pan

troglodytes/ in bonobo /P. paniscus/) tetranukleotidni dvojček podaljšal za dve enoti,

pri človeku pa za štiri. Mikrosatelit (GT)5 pa je skozi evolucijo pridobil še eno enoto

(sovasta opica). Primati, pri katerih do omenjenih dveh točkovnih mutacij ni prišlo,

ohranjajo prvotno sekvenco nespremenjeno še danes. Avtor ugotavlja, da je za


15

nastanek mikrosatelita potrebno določeno minimalno število ponovitev, ki se glede na

tip mikrosatelita razlikuje. Zanimivo je, da za nastanek tetranukleotidnega

mikrosatelita zadostujeta že dve začetni enoti. Kaže, da so točkovne mutacije eden

izmed mehanizmov, ki so sposobni ustvarjati mikrosatelitne arhetipe. Vrste, pri

katerih do omenjenih dveh točkovnih mutacij ni prišlo, ohranjajo prvotno sekvenco

nespremenjeno še danes.

Človek

Šimpanz

Bonobo

Gorila

Orangutan

Gibon

Rezus

Patas

Gvereza

Langur

Brezpalčarka

Kapucinka

Sovasta opica

OpiceStarega sveta

OpiceNovega sveta

Hominoidi

Slika 1 Nastanek mikrosatelitov (Messier in sod., 1996)

2.3.3.2 Mikrosateliti kot genetski markerji

Mikrosateliti so postali v 90-ih letih pomembno orodje pri študijah populacijskih

struktur in njihove dinamike. Kot genetski markerji so se uveljavili zlasti zaradi

svojega izrazitega alelnega polimorfizma, kodominantnega dedovanja genotipov in

ohranjenosti mikrosatelitnih lokusov med sorodnimi vrstami. Poleg tega mikrosateliti

predstavljajo običajno zadovoljiv kompromis med visoko variabilnostjo in

nezaželjeno visoko stopnjo mutacij. Praviloma mikrosateliti niso podvrženi močnim

selekcijskim pritiskom, zato veljajo za nevtralne genetske markerje. Pomembna je

tudi sorazmerno lahka tehnična obvladljivost tega raziskovalnega modela. PCR, ki je

v analitiki mikrosatelitov osrednjega pomena, je namreč relativno preprosta tehnika,

ki deluje že z minimalnimi (pikogramskimi) količinami vzorcev. To omogoča

analiziranje celo izrazito majhnih organizmov, zagotavlja pa tudi neškodljivo jemanje


16

vzorcev pri večjih živalih, kar je predvsem pomembno pri raziskovanju redkih in

ogroženih vrst (Queller in sod., 1993, Dowling in sod., 1996).

Uporabnost mikrosatelitov kot genetskih markerjev je široka. Uporabljajo jih pri

ocenah efektivne velikosti populacij in stopnje sorodstva ter “inbreedinga” (Edwards

et al, 1992), z njimi preučujejo pelodno disperzivnost in zasledujejo migracije

populacij (Queller in sod., 1993). Mikrosateliti so pomembni tudi v sodstvu, kjer jih

uporabljajo za forenzične ekspertize (Budowle in sod., 1991; Roewer in sod., 1991;

Sajantila in sod., 1994). V evolucijski biologiji so primerni za določanje klonov ali

linij (Slingsby in sod., 1996), za sistematizacijo sorodnih populacij ali vrst

(Schlötterer in sod., 1991) ter za gensko kartiranje (Weissenbach in sod., 1992;

Hearne in sod., 1992). Mikrosateliti se v zadnjih letih uveljavljajo tudi na širšem

področju akvakulture. Z njimi raziskujejo populacijsko strukturo in genetsko

variabilnost divjih vrst. V ribogojstvu pa jih vključujejo že v selekcijske, gojitvene in

repopulacijske programe, kjer je poznavanje sorodnosti med individui bistveno za

izdelavo paritvenega načrta in kasneje za vpogled v novonastalo stanje v populaciji in

za eventuelno nadaljnje ukrepanje oz. posege (Wright, 1995).


17

2.4 SPLOŠNO O SALMONIDIH Salmonidi (Salmonidae) so relativno majhna ribja družina, ki po nekaterih ameriških

avtorjih (Nelson,1984) obsega do 10 rodov po nekatrerih evropskih pa le pet (tabela

1). Skupna in tipična anatomska značilnost vseh salmonidov je tolsta plavut ali

tolščenka, ki leži med hrbtno in repno plavutjo. Njihovo telo je hidrodinamične

oblike, kar jim daje zelo dobre plavalne sposobnosti. Salmonidi so plenilci in se

prehranjujejo z različnimi vodnimi živalmi in z insekti.

Salmonidi so karakteristični za Zemeljsko severno hemisfero. Naseljujejo porečja

Severnega ledenega morja in severnega dela Pacifika in Atlantika ter morja in reke

Evrope, vzhodne Azije in Severne Amerike (Lagler, 1977). V slovenski sladkovodni

ihtiofauni so zastopani vsi tu navedeni rodovi iz družine salmonidov razen ozimic in

mehkoustih postrvi. Rodova Salmo in Hucho sta avtohtona, medtem ko Salvelinus in

Oncorhynchus izvirata od drugod.

Ribe te družine so izredno spremenljive tako po videzu kot po načinu vedenja in

razmnoževanja (Povž in Sket, 1990). Vsi rodovi so fiziološko prilagojeni na življenje

v morju, dejansko pa v morju živijo le t.i. anadromne vrste ali forme (npr. atlantski

losos), za katere je značilno, da prihajajo v sladko vodo le na drst. Življensko okolje

(morje, jezero ali reka) ima velik vpliv na fenotip salmonidov. Po današnjem

prepričanju so v Sloveniji vsi avtohtoni salmonidi ustaljeni in se ne selijo v morje

(Vuković, 1982).

2.5 SOŠKA POSTRV Soška postrv taksonomsko spada v razred Osteichtyes, v red Salmoniformes, v družino

Salmonidae in v rod Salmo (Robins in sod., 1980; Sket, 1967; tabela 1).


18

Tabela 1 Taksonomska razvrstitev soške postrvi in njenih bližnjih sorodnikov po prevladujoči klasifikaciji

Razred: Osteichtyes (kostnice)

Red: Salmoniformes

Družina: Salmonidae (salmonidi)

� Rod: Salmo

◊ Vrsta: S. salar (atlantski losos)

◊ Vrsta: S. trutta (postrv)

♦ forma: trutta (morska postrv)

♦ forma: fario (potočna postrv)

♦ forma: lacustris (jezerska postrv)

♦ forma: letnica (ohridska postrv)

◊ Vrsta: S. marmoratus (soška postrv)

� Rod: Hucho (sulci)

� Rod: Salmothymus (mehkouste postrvi)

� Rod: Oncorhynchus (pacifiški lososi)

� Rod: Salvelinus (zlatovčice)

� Rod: Coregonus (ozimice)

Družina: Thymallyidae (lipani)

� Rod: Thymallus (lipani)

◊ Vrsta: T. thymallus (donavski lipan)

◊ Vrsta: T. arcticus (arktični lipan)

◊ ? : T. ? (soški lipan)

Naselitveno območje soške postrvi je izključno porečje Jadranskega morja.

Najštevilnejša je v Soči in njenih pritokih ter v severnoitalijanskih rekah z izlivom v

Jadransko morje (Povž in Sket, 1990). Velja za najbolj ogroženo ribjo vrsto pri nas

(poglavje Uvod).

Opis soške postrvi, ki ga navajamo, je skoraj v celoti povzeto po Polževi in sod.

(1996).

Odrasla soška postrv ima dolgo valjasto, bočno rahlo stisnjeno telo z veliko glavo, ki

zajema 22-25 % celotne dolžine telesa. Osnovna barva telesa je olivno rjava ali olivno


19

zelena, od hrbta navzdol se razpreda po srebrnosivi podlagi temnejša marmoriranost v

rumeno olivno zelenih barvah z bakrenimi odtenki. Nemalokrat sega marmoriranost

pod pobočnico. Trebuh je vedno belkast ali rumenkast. Obarvanost soških postrvi se

zelo spreminja skladno z okoljem. Včasih so tako svetle, da je značilna marmoriranost

skoraj zabrisana. Kljub temu je vedno zaznati marmoriranost z bakrenimi odtenki na

srebrnosivi podlagi. Hrbtna plavut je temno pikasta, ostale so enobarvne sivkasto

olivno zelene ali olivno rjave. Tolščenka je olivno rjavkasta in nemalokrat ima na

zgornjem robu veliko rdečo liso. Repna plavut je rahlo zarezana. Soške postrvi iz

nekaterih vodotokov imajo po pobočnici rdeče, vendar z ostalim pigmentom zelo zlite

pege nepravilnih oblik (slika 2). Zraste do 140 cm v dolžino (Vuković, 1982).

Slika 2 Soški postrvi iz Zadlaščice (foto: Andreja Ramšak)


20

2.6 POTOČNA POSTRV Potočna postrv (Salmo trutta f. fario) je avtohtona slovenska vrsta in kot taka značilna

za vse zgornje tokove slovenskega donavskega porečja. Predstavlja eno izmed treh

oblik, ki jih je postrv (S. trutta) razvila glede na danosti, pogojene z njenim

življenskim okoljem. Tako poleg potočne obstajata še morska anadromna (f. trutta)

(Robins in sod., 1980) in jezerska (f. lacustris) oblika. Potočna postrv naseljuje

zgornje predele tistih vodotokov, kjer se življenski pogoji s tokom navzdol zanjo

slabšajo (predatorji, neprimerna temperatura in onesnaženost vode) in ji ne omogočajo

zadostnega preživetja pri migraciji v morje in nazaj. V takih pogojih so favorizirane

tiste populacije, ki so se prilagodile na ustaljen (nemigratoren) način življenja. Vse tri

forme so genetsko enake in se med seboj uspešno križajo, razlikujejo pa se po videzu

(Hindar in sod., 1991). Potočna postrv se od soške izrazito razlikuje. “Po hrbtu je

sivkastozelena z olivnim, rjavim ali črnim odtenkom. Po telesu ima temne in rdeče,

svetleje obrobljene pege. Nikoli nima marmoriranega vzorca, ampak je le pikasta.

Svetlo obrobljene črne in rdeče ali oranžne pege so različno velike in različno

nameščene po telesu. Število ni stalno. Po zgornjem delu telesa so pogostejše. Temne

pege prevladujejo po hrbtu in zgornjem delu bokov, rdeče in oranžne so na hrbtni

plavuti, včasih po glavi, večina pa jih je ob pobočnici ali pod njo. Rdeče pege so tudi

na tolščenki. Po škržnem poklopcu so jasno vidne temne, svetlo obrobljene pege.

Rdeč pigment, ki je vedno svetlo obrobljen, je tudi po glavi in po poklopcih” (Povž in

sod., 1996; slika 3). Od vseh treh form je najmanjša in zraste do 50 cm v dolžino,

njena poprečna velikost pa je od 25 do 35 cm. Do velike morfološke variabilnosti,

pogojene z okoliškimi vplivi določenega življenskega prostora, prihaja tudi med

različnimi populacijami potočne postrvi. Na tej osnovi so bile v prvi polovici tega

stoletja večinoma neupravičeno opisane številne nove vrste in podvrste postrvi (Sket,

1967), od katerih se jih je do danes uveljavilo le malo (npr. gardska postrv (Salmo

carpio) in ohridska postrv (Salmo trutta letnica)).


21

Slika 3 Potočna postrv iz Mahnečice (foto: Andreja Ramšak)

2.7 PRIMERJALNE ŠTUDIJE SOŠKE IN POTOČNE POSTRVI TER SORODNIH SALMONIDOV Potočna postrv je bila na začetku tega stoletja vložena v porečje Soče in postala

neposreden tekmec soški postrvi. Ker sta se obe vrsti medsebojno uspešno križali, je

ta dogodek med ihtiologi sprožil vprašanje, ali gre pri soški postrvi za samostojno

vrsto ali le za formo S. truttae.

2.7.1 Osteološke analize

Prve študije, ki so resneje obravnavale to problematiko, so bile osteološke. Predmet

tovrstnih raziskav so skeletne karakteristike. Ker te ostajajo skozi ontogenetski,

funkcionalni in spolni razvoj osebka veliko bolj konstantne od zunanjih morfoloških


22

znakov, omogočajo relativno dobre sistematske opredelitve (Norden, 1961; Miller,

1972). Dorofeeva (1974) je preučevala skelet rib iz rodu Salmo in potrdila razlike med

potočno in soško postrvjo. Primerjala je kosti glave in na osnovi razlik v obliki

lobanje, ralnika, lingvalnih plošč, predčeljustnice in števila zob na predčeljustnici

opredelila soško postrv kot samostojno skupino.

2.7.2 Kariotipiziranje

Naslednji kriterij, ki so ga poskušali uporabljali pri sistematizaciji salmonidov, je bil

kariotip (Gjedrem in sod., 1977; Hartley in Horne, 1984). Večina raziskovalcev je

poročala o variabilnosti kromosomskega števila znotraj določene vrste in celo znotraj

posameznega osebka pri salmonidih. Ob upoštevanju poprečnih vrednosti so uspeli

določiti kromosomska števila, značilna za posamezno vrsto, vendar pa te vrednosti

niso značilne tudi za odgovarjajoči rod. Kariotipizacijo soške postrvi je prva izdelala

Prokofieva (1934) in ugotovila 84 kromosomov. Njene izsledke je potrdil Pomini

(1939), medtem ko so Pohar in Al-Sabti (1979) ter Swardson (Ocvirk, 1995) pri soški

postrvi zabeležili 80 kromosomov. Enako število kromosomov je karakteristično tudi

za potočno postrv in jezersko zlatovčico (Salvelinus alpinus), medtem ko ima

atlantski losos (Salmo salar) od 56 do 58 kromosomov (Hartley in Horne, 1984). Iz

navedenega je očitno, da pri določanju in razvrščanju salmonidov v vrste kariotipski

kriterij ni relevanten.

2.7.3 Aloencimimske analize

Prve aloencimske študije postrvi so bile opravljene na populacijah atlantskega porečja

(Allendorf in sod., 1976; Ryman in sod., 1979; Ferguson in Mason, 1981; Crozier in

Ferguson, 1986; Hansen in sod., 1993). Nekateri avtorji poročajo o “kompleksni

genetski strukturi” atlantske postrvi, kar razlagajo z njeno prilagoditvijo na različne

okoliške razmere (Ferguson, 1989). V splošnem pa kaže, da se populacije atlantske

postrvi genetsko ne razlikujejo bistveno. To naj bi bila posledica zadnje ledene dobe,

ko je bila večina severne Evrope prekrita z ledeniki, zaradi česar se je življenski

prostor postrvi skrčil in populacija poenotila. Druge tovrstne raziskave, ki so

vključevale sredozemske populacije postrvi, so razkrile genetsko raznolikost med

sredozemskimi in atlantskimi populacijami (Apostolidis in sod., 1996; Garcia Marin

in sod., 1991; Largiadèr in Scholl, 1996). Ugotovili so štiri diagnostične alele: laktat


23

dehidrogenazo (LDH)-C 90 in transferin (TF) 100, značilna za atlantsko postrv, in

LDH-C 100 in TF 102, značilna za mediteranske populacije (Krieg in Guyomard,

1985; Guyomard, 1989). Ugotovljen je bil tudi genetski polimorfizem znotraj

mediteranskih populacij (Guyomard in Krieg, 1983; Krieg in Guyomard, 1983).

Podobno stanje so z aloencimskimi študijami ugotovili tudi pri populacijah postrvi

donavskega (črnomorskega) in kaspijskega porečja (Osinov, 1984, 1989). Čeprav tudi

znotraj teh populacijah prihaja do genetske variabilnost, pa v primerjavi z

mediteranskimi ali atlantskimi izražajo genetsko enotnost (Apostolidis in sod., 1996).

Forneris (1987) je poskušal z aloencimskimi testi razjasniti sistematski status soške

postrvi. Na osnovi petih encimskih kompleksov (malat dehidrogenaze (MDH),

superoksid dismutaze (SOD), esteraz (Es), maleatnih encimov (ME) in laktat

dehidrogenaze) je primerjal soško postrv iz zgornjega porečja reke Pad z divjimi in

ribogojniškimi populacijami potočnih postrvi iz Italije. Variabilnost med populacijami

je bila navzoča samo pri MDH, SOD in pri Es in je odražala genetsko homogenost

populacij soške postrvi in ribogojniške potočne postrvi ter heterogenost populacij

divje potočne postrvi. Alelne variante, ki bi bila karakteristična samo za soško postrv,

niso odkrili pri nobenem od preučevanih lokusov. Leta 1993 je francoska skupina

raziskovalcev (Berrebi in sod., 1994) v sodelovanju z Ribiško družino Tolmin začela

z aloencimskimi raziskavami soške postrvi iz soškega porečja.

Preučevali so dve geografsko ločeni populaciji soške postrvi iz Zadlaščice in

Trebuščice, populacijo potočne postrvi iz Iščice (donavsko porečje) in križance med

obema vrstama, ki so jih vzorčili v potokih Bača in Volarija. V raziskavo so vključili

15 encimskih sistemov. Izmed 31 odgovarjajočih lokusov so bili diagnostični trije:

-Aspartat aminotransferaza 1 (AAT-1) z aleli 100, 130 in 180, od katerih je bil prvi

značilen za potočno postrv, druga dva pa za soško.

-Superoksid dismutaza 1 z alelom 50, značilnim za soško postrv in z alelom 100, ki je

bil tipičen za potočno postrv.

-Laktat dehidrogenaza 5, za katero so odkrili tri genetske variante. Alel 120 je bil

značilen za soško postrv iz Trebuščice, kjer se je pojavljal s frekvenco 0.97, alel 105

pa za soško postrv iz Zadlaščice s frekvenco pojavnosti 0.96. Med obema

populacijama soške postrvi so opazili navzkrižno introgresijo omenjenih alelov s

frekvenco 0.03 oz. 0.04. Pri potočni postrvi iz Iščice pa so poleg alelov 120 s

frekvenco 0.02 in 105 s frekvenco 0.22 našli še alel 100 s frekvenco 0.76. Avtor na

osnovi svojih predhodnih raziskav, v katerih je bilo ugotovljeno, da je alel LDH-5 100


24

značilen za atlantski tip postrvi, ugotavlja, da ta alel v Iščici ni nepričakovan. Tja naj

bi prišel s poribljanjem Iščice in njenih pritokov s potočno postrvjo atlantskega

porekla. Tudi prisotnost alela 105 v Iščici ni presenetljiva. Ta alel so opazili pri večini

vrst iz rodu Salmo, zato velja za marker s starodavnim poreklom, značilen tako za

sredozemski kot tudi za donavski tip postrvi (Berrebi, osebn informacija).Težje je

razložljiv pojav tega alela v Zadlaščici. Berrebi zaključuje, da alel LDH-5 105 v

Zadlaščici najverjetneje predstavlja relikten ostanek mediteranske postrvi, ki naj bi v

pradavnini naseljevala porečje reke Pad. Skozi tok evolucije naj bi se na določenem

področju pojavila nova oblika in se v končni fazi diferencirala v podvrsto marmoratus

(npr. LDH -5 120). Nadalje naj bi naravna selekcija favorizirala to novo obliko,

istočasno pa eliminirala vse oblike f. fario, vključno z aleli na diagnostičnih lokusih;

izjemoma naj bi se temu selekcijskemu pritisku izognile populacije s področij, ki so

skozi čas teh dogajanj ostajala zelo izolirana, kot je npr. zgornji tok Zadlaščice.

Zanimiva je tudi raziskava Giuffre in sod. (1996), v kateri so na osnovi aloencimov

preučevali različne populacije soške, avtohtone potočne in gardske postrvi (Salmo

carpio-endemit Gardskega jezera), živeče v porečju Pada, in jih primerjali z

ribogojniškimi postrvmi atlantskega porekla. Eden izmed zelo informativnih lokusov

je bil LDH-C s tremi aleli, od katerih je bil alel 90 razpoznaven za atlantski tip

postrvi, alel 100 za sredozemski (avtohtona potočna postrv) in alel 120 za soško

postrv. Treba je omeniti, da so alel 100 s frekvenco od 0.1 do 0.4 našli tudi pri

nekaterih populacijah soške postrvi. Ker so omenjen alel našli tudi pri atlantskem

lososu, Giuffra ugotavlja, da bi bil ta alel pri soški postrvi lahko ancestralnega izvora,

čeprav dopušča tudi možnost, da bi na to vplivala introgresija z avtohtono potočnico.

Zaradi subjektivnih ocen velikosti posameznih alelov na gelu je včasih težko

primerjati tovrstne rezultate med posameznimi raziskovalnimi skupinami. Tudi v

primeru lokusa LDH prihaja do neskladij med omenjenimi rezultati in rezultati

Berrebija (1994), saj ta za atlantski tip navaja alel 100, za sredozemskega pa 105. Ob

logičnem premisleku pa je mogoče ugotoviti, da sta alelna para 90 in 100 ter 100 in

105 identična in da je do omenjenih neskladij prišlo zaradi različne interpretacije istih

opažanj. Giuffera in sod. so ugotovili, da poleg LDH-C 120 karakterizirajo soško

postrv še AAT-125 in 180, CK-C1 95, EST-1 98, sMEP-2 105, sSOD-1 50 in TF 75,

in s tem potrdili že opaženo diagnostično vrednost lokusa SOD-1.

Na osnovi omenjene raziskave avtorji opredeljujejo soško postrv kot samostojno,

prvobitno in v odnosu do potočne postrvi parapatrično vrsto.


25

Apostolidis s sod. (1996) je na osnovi 26 aloencimskih lokusov ugotavljal genetsko

strukturo in filogenetske relacije med populacijami postrvi različnih grških in

španskih voda sredozemskega porečja, atlantskega porečja v Španiji, Franciji in Češki

ter populacijo ohridske postrvi iz Albanije. Tudi on poroča o markerju LDH-5 90 kot

karakterističnem za atlantski tip, in o markerju LDH-5 100, tipičnem za sredozemske

populacije. V omenjeno raziskavo soška postrv ni bila vključena, zanimivo pa je, da

so alel SOD-1 50, ki sicer velja za diagnostični marker soške postrvi, našli pri tudi

ohridski postrvi (s frekvenco 0.375) in pri postrveh iz grške reke Alfios (s fekvenco

0.875). Drugih alelov, značilnih za soško postrv, v tej raziskavi niso našli.

2.7.4 Analize mtDNA

Pri salmonidih je bilo opravljenih veliko analiz na mtDNA, v katerih so večinoma

preučevali inter- in intraspecifično divergenco posameznih vrst in/ali populacij (Berg

in Ferris, 1984; Wilson in sod., 1985; Gyllensten in Wilson, 1988, Hynes in

sod.,1989; Danzmann in Ihssen, 1995 itd). Pregledno poročilo o raziskavah

interspecifične divergence, ki poleg salmodidov obravnava še mnoge druge družine

rib, sta podala Billington in Herbert, 1991. Nedvomno je treba omeniti raziskavo

Berga in Ferrisa (1984), v kateri sta prva analizirala mitohondrijski genom kostnic

nasploh. Izvedla sta restrikcijsko endonukleazno analizo mtDNA štirih predstavnikov

iz družine salmonidov: pacifiškega lososa (Oncorhynchus tchawitcha), šarenke (O.

mykiss), postrvi (S. trutta), in potočne zlatovčice (Salvelinus fontinalis). Ugotovila sta,

da je mitohondrijski genom salmonidov nekoliko večji od človeškega in prva podala

njegovo velikost, ki sta jo ocenila na 16670 bp. Na osnovi 15 restrikcijskih encimov

sta s kladističnimi in fenetičnimi metodami sistematično analizirala filogenetske

odnose med preučevanimi vrstami in dognala, da sta si šarenka in pacifiški losos

filogenetsko bliže kot postrv in šarenka ali postrv in pacifiški losos.1

Gyllesten in Wilson (1988) sta izvedla podobno raziskavo, le da sta vanjo vključila

populacije postrvi iz različnih geografskih področij, atlantskega lososa, dve vrsti

ameriške postrvi (O. mykiss in O. clarki) ter potočno zlatovčico kot zunanjo skupino

(angl. outgroup). Restrikcijsko analizo celotne mtDNA sta izvedla s 13 restrikcijskimi

encimi in ugotovila tesne sorodstvene vezi med atlantskim lososom in postrvjo in med

ameriškimi postrvmi. Na osnovi svojih rezultatov posplošujeta, da se intraspecifična


26

variabilnost mtDNA pri salmonidih giblje od 0.1 do 2 %, kar sodi v okvire vrednosti,

ki so značilne tudi za vrstne populacije kopenskih vretenčarjev. Odstotek sekvenčne

divergence med vrstami je bil bistveno večji in se je gibal med 3 do 14 %. Avtorja

tudi ugotavljata, da je pri gojenih populacijah postrvi variabilnost mtDNA v

primerjavi z variabilnostjo jedrne DNA precej manjša.

Haynes s sodelavci (1989) je z restrikcijskimi profili mtDNA analiziral naravne in

ribogojniške populacije postrvi. Odkril je diagnostični restrikcijski vzorec, ki

omogoča razlikovanje med omenjenima tipoma populacij.

V 90-ih letih so se tudi pri salmonidih raziskave mtDNA osredotočile na posamezne

regije mitohondrijskega genoma. Pojavile so se torej potrebe po natančnem

poznavanju njegovega nukleotidnega zaporedja. Začela so se sekvenciranja najbolj

zanimivih regij mtDNA kot so kontrolna regija (Shedlock in sod., 1992), gen za

citokrom b (McVeigh in sod., 1991), geni za tRNA (Digby in sod., 1992)...itd. Pri

komercialno zanimivejših vrstah, kot je npr. šarenka, pa so kmalu sekvencirali celoten

mitohondrijski genom (Zardoya in sod., 1995).

O zanimivih izsledkih raziskave, ki je temeljila na poznavanju nukleotidnega

zaporedja gena za citokrom b, poročata McGowan in Davidson (1992). Preučevala sta

križanje postrvi (S. trutta) z atlantskim lososom (S. salar). (To medvrstno križanje je

prvi opazil Verspoor; 1988). Zanimalo ju je predvsem, ali so križanci posledica

križanja lososove samice s postrvjim samcem ali obratno. Ker se losos in postrv

razlikujeta v sekvenci gena za citokrom b, sta pri križancih, ki sta jih določila z

elektroforezo aloencimov, pregledovala prav to regijo in pri vseh vzorcih opazila

maternalni genotip. Iz tega sta zaključila, da so vsi križanci posledica parjenja

postrvjih samic s samci lososa.

Prve podrobne raziskave kontrolne regije pri salmonidih oz. pri ribah nasploh je

opravil Shedlock s sodelovci (1992). Posekvenciral je celotno kontrolno regijo šestih

vrst anadromnega pacifiškega lososa (rod Oncorhynchus), atlantskega lososa in

arktičnega lipana (Thymallus arcticus). Ko je sekvence med seboj primerjal, je opazil,

da so regije, ki veljajo pri drugih vretenčarjih za konzervirane, enako ohranjene tudi

pri salmonidih. Poroča o nenaključni razporeditvi substitucij, insercij in delecij, zaradi

česar sklepa, da so deli kontrolne regije pri salmonidih pod različnimi selekcijskimi

1To je bilo za tisti čas novo spoznanje, saj sta po takrat veljavni sistematiki postrv in šarenka sodili v rod Salmo, pacfiški losos pa v rod Oncorhynchus.


27

pritiski, in ugotavlja, da je pretežni del kontrolne regije salmonidov verjetno podvržen

približno enaki stopnji divergence kot preostali del mitohondrijskega genoma.

Bernatchez s sodelavci (1992) je izvedel prvo podrobnejšo analizo postrvi na osnovi

kontrolne regije mitohondrijskega genoma. Analiziral je nukleotidna zaporedja njenih

variabilnih regij in tako raziskoval filogenetske odnose morfološko in geografsko

različnih populacij postrvi v Evropi. V raziskavo je vključil vse tri ekološke forme

postrvi: anadromno, jezersko in potočno, zraven pa še soško, gardsko in korzijško

postrv (S. macrostigma1). Zemljepisno gledano so vzorci predstavljali 24 različnih

populacij iz atlantskega, donavskega, sredozemskega in jadranskega porečja. Znotraj

640 bp dolge kontrolne regije je odkril 21 polimorfnih mest (17 tranzicij, šest

tranzverzij in tri delecije oz. insercije) in na tej osnovi izdelal 12 različnih genotipov.

Po obdelavi podatkov je lahko te genotipe razvrstil v pet osnovnih, filogenetsko

različnih skupin, ki so pretežno sovpadale s specifičnim geografskim izvorom

vzorcev; prvo skupino je predstavljala sredozemska populacija, drugo jadranska, tretjo

donavska, četrto atlantska, peto skupino pa soška postrv. Za to skupino so bili značilni

trije genotipi (Ma1, Ma2 in Ma3), od katerih je prva dva vedno našel pri soških

postrveh, genotipa Ma3 pa pri soški postrvi ni zasledil; opazil ga je le pri eni gardski

postrvi in eni potočni postrvi iz francoske reke Tes (1.3 % celotne testne populacije).

Pri tem je treba omeniti, da je bila ta reka več let poribljana s potočnomi postrvmi iz

Italije. Srednja vrednost interpopulacijske sekvenčne divergence je bila 1.05 %,

intrapopulacijske pa 0.25 %. Nobene povezave ni opazil med omenjenimi

filogenetskimi skupinami in okoljskimi oblikami postrvi. Na osnovi svojih rezultatov

Bernatchez ugotavlja, da je postrv ena izmed najbolj genetsko strukturiranih vrst, kar

so jih doslej preučevali. Ob upoštevanju univerzalne molekularne ure, ki naj bi pri

vretenčarjih pomenila približno dva procenta sekvenčne divergence na miljon let,

predpostavlja, da je vseh pet skupin izšlo iz skupnega prednika več ali manj istočasno

pred najmanj 450000 do 700000 leti. Soško postrv opredeljuje kot evolucijsko

samostojno monofiletsko vrsto, ne strinja pa se z Behnekejevo hipotezo o soški

postrvi kot arhetipu vseh preostalih postrvi.

Giuffra in sodelavci (1994) so omenjeno raziskavo nadaljevali in razširili. Pri

populacijah postrvi severnoitalijanskega porečja so preučevali 5'-del kontrolne regije,

fragment gena za citokrom b in gen za ATP-azno podenoto VI. Še posebej jih je

1Ena izmed taksonomsko vprašljivih vrst postrvi


28

zanimal filogenetski status soške in gardske postrvi, zato so v raziskavo vključili

poleg devet geografsko različnih populacij potočne postrvi še osem geografsko

različnih populacij soške postrvi in gardsko postrv. Vključili so še dve populaciji

ribogojniških potočnih postrvi, ki jih uporabljajo za poribljanje italijanskih voda. Na

tak način so želeli ugotoviti morebitno kontaminiranost nativnih populacij z

ribogojniškimi. 5'-del kontrolne regije (310 bp) so pregledali z diagnostičnimi

restrikcijskimi encimi, ki so jih izbrali na osnovi izsledkov Bernatcheza in sod.

(1992), medtem ko so fragment za citokrom B (295 bp) in gen za ATP-azno podenoto

VI (315 bp) sekvencirali. Stopnja variabilnosti pri kodogenih regijah je bila malo

manjša od tiste pri kontrolni regiji. Pri fragmentu za citokrom b so odkrili šest

substitucijskih mest, pri genu za ATP-azno podenoto VI 11 in pri 5'-koncu kontrolne

regije 17. Vse substitucije pri kodogenih regijah so bile tranzicijske in le ena je

povzročila aminokislinsko spremembo (Ile→Val). Pri celotni kontrolni regiji pa je

bilo razmerje med tranzicijami in transverzijami 3:1. Na osnovi kombinacij

polimorfnih mest v kodogenih regijah so sestavili osem različnih genotipov, od

katerih jih je sedem sovpadlo z genetskimi variantami kontrolne regije; le v enem

primeru so se individui z identičnim genotipom kontrolne regije med seboj razlikovali

v genotipu kodogene regije. S fenetično in kladistično analizo podatkov za fragment

citokroma b in gen ATP-azne podenote VI so potrdili pet filogenetsko specifičnih

skupin, o katerih je poročal že Bernatchez (1992). Avtorjem je uspelo ugotoviti, da je

izmed omenjenih petih skupin izvorno najstarejša tista, ki opredeljuje atlantski tip

postrvi. Zanimivo je, da je ta ugotovitev pogojena z identiteto štirih nukleotidnih mest

na genu za ATP-azno podenoto VI pri atlantskem tipu postrvi in atlantskem lososu ter

različnosti istih nukleotidnih mest pri preostalih štirih skupinah postrvi. Pri teh štirih

skupinah so sicer ugotovili filogenetsko različnost, niso pa uspeli izračunati statistično

značilnih evolucijskih razdalj med njimi. Na osnovi distančne matrice mrežne

interpopulacijske nukleotidne divergence so ugotovili, da vse populacije soške postrvi

oblikujejo jasno izraženo posebno monofiletsko skupino, medtem ko se morfološko

identične populacije potočne postrvi združujejo v tri različne veje. V eno od teh sodi

tudi gardska postrv, ki ne predstavlja izrazito samostojne populacije.

2.7.5 Mikrosatelitne analize


29

Poročila o raziskavah in študijah mikrosatelitov pri salmonidih so razmeroma redka.

Večinoma poročajo le o detekciji določenih mikrosatelitov, manj pa se ukvarjajo z

interpretacijo samih rezultatov. Ta se večinoma nanaša na ugotavljanje inter- in

intraspecifične variabilnosti divjih in ribogojniških populacij. Obravnavane so

predvsem komercialno zanimive vrste kot so šarenka (Sakamato in sod., 1994 a,b,c,d;

Ishikawa in sod., 1994 a,b), atlantski losos (Slettan et al, 1995 a, b, 1996; Clabby in

sod., 1995; Fontaine in sod., 1995) in pacifiški losos (Spidle in Bentzen, 1995).

Potočna postrv se kot objekt tovrstnih raziskav v literaturi pojavlja le trikrat. Tako

Estoup s sod. (1993) poroča o trinajstih (GT)n in štirih (CT)n mikrosatelitnih lokusih,

ki jih je našel v genomski DNA potočne postrvi. Ugotavlja, da se mikrosatelita (GT)n

in (CT)n v postrvjem genomu pojavljata približno enkrat na 23 oz. 76 kb. Natančneje

je analiziral tri lokuse. Pri štirih testnih populacijah, ki so v osnovi predstavljale

atlantski in sredozemski tip postrvi in so štele 40 vzorcev, je opazil alelni

polimorfizem (6 do 5 alelov na lokus); največje razlike so bile med atlantskimi in

sredozemskimi populacijami, najmanjše pa znotraj skupin. Na osnovi alelne

segregacije pri sestrskih skupinah potomcev je potrdil Mendelistično dedovanje

mikrosatelitnih genotipov tudi pri potočni postrvi. Poroča še o navzkrižnem delovanju

oligonukleotidnih začetnikov, s katerimi je lahko pomnoževal taiste mikrosatelite tudi

pri šarenki.

Martínez s in sod. (1995) poročajo o petnajstih (GT)n in treh (CAG)n mikrostelitih, ki

so jih izolirali iz genoma atlantskega lososa. Odkrili so veliko interspecifično

variabilnost in več kot 90 % heterozigotnost na omenjenih lokusih. Lokusno

specifičnost oligonukleotidnih začetnikov so preizkusili tudi na potočni postrvi,

šarenki in ozimici. Največjo navzkrižno učinkovitost so ugotovili pri potočni postrvi.

Pri pregledu njenih različnih populacij iz Španije, Nemčije, Irske in Slovenije so

opazili še večji polimorfizem kot pri atlantskem lososu. S fluorescenčno hibridizacijo

“in situ” (FISH) so locirali (GT)n mikrosatelite in ugotovili, da se nahajajo pretežno

na centromerni regiji akrocentričnih kromosomskih parov.

Poteaux in Berrebi (1995) sta preučevala populacijsko strukturo potočne postrvi iz

sredozemskih lokacij, ki se med seboj razlikujejo po obsegu poribljenosti. Ker se jima

pri tako detajlnih študijah aloencimske in mitohondrijske analize niso zdele zadosti

informativne, sta poleg njih v raziskavo vključila tri mikrosatelitne markerje; enega

sta našla v literaturi, dva pa v bazi podatkov iz genske banke. Opazila sta 15 ali 16-

alelni polimorfizem znotraj posameznega lokusa, ki je bil majhen pri nativnih


30

populacijah in bistveno večji pri populacijah, ki jih redno dopolnjujejo z vlaganjem

ribogojniških postrvi. Detektirala sta tudi alele, ki so bili striktno karakteristični za

vsako od obeh populacij. Podrobnejših podatkov v svojem prispevku avtorja ne

navajata.


31

3. MATERIAL IN METODE

3.1 VZORCI V raziskavo smo vključili 96 rib: 64 soških postrvi, 30 potočnih postrvi, enega

križanca med potočno in soško postrvjo ter eno šarenko. 45 vzorcev je bilo vključenih

v analizo mtDNA, 84 vzorcev pa v analizo mikrosatelitne DNA; obe raziskavi skupaj

sta bili opravljeni na 33 vzorcih (tabela 2).

Primerki soške postrvi so bili iz dveh plemenskih jat RD Tolmin, ki izvirata iz dveh

geografsko ločenih populaciji iz zgornjega toka potokov Zadlaščice in Trebuščice.

Oba potoka spadata v porečje Soče; Zadlaščica se izliva v Tolminko, Trebuščica v

Idrijco. Lokaciji, od koder ti vzorci izhajajo, sta med seboj ločeni z naravnimi

preprekami, ki onemogočajo migracijo rib proti toku, in po zagotovilih ribiške družine

Tolmin nista bili nikoli organizirano poribljani s potočno postrvjo. Tudi glede na

rezultate aloencimske analize (Berrebi, 1994) predstavljata omenjeni populaciji čisto

soško postrtv. Obe populaciji imata za vrsto značilen fenotip, med seboj pa se

nekoliko razlikujeta. Soške postrvi iz Zadlaščice imajo široke proge in bolj ali manj

izrazito pego na tolščenki. Na zgornji strani glave imajo značilen marmoriran vzorec v

obliki črke X. Mlade ribe imajo rdečkaste pike, odrasle nikoli. Ribe iz Trebuščice

imajo ozke marmorirane proge. Tolščenka je do polovice rdeča. Mlade ribe imajo

rdečeoranžen pikast spodnji del hrbtne plavuti. Plavutnice so ob robovih

rdečeoranžne. Po bokih imajo bakren odtenek, mlajše ribe, ki so svetlejše, imajo

rdečeoranžne in svetlo obrobljene pike nad pobočnico; starejšim ribam se rdeče pike

skoncentrirajo samo v ravni črti ob pobočnici (Povž in sod., 1996; slika 4).

Analizirali smo 45 rib iz Zadlaščice in 19 iz Trebuščice.


32

Slika 4 Soška postrv iz Zadlaščice (zgoraj) in iz Trebuščice (spodaj; foto: Dušan Jesenšek)

Potočno postrv predstavljajo primerki petih geografsko ločenih in specifičnih

populacij. Osem vzorcev je bilo iz Iške. Ta reka spada v donavsko porečje in je redno

poribljana s potočno postrvjo iz ribogojnice Povodje, ki razpolaga s postrvmi

domnevno atlantskega porekla. 14 vzorcev je bilo iz Mahnečice. Ta potok predstavlja

del kraškega rečnega sistema in se izliva Cerkniščico. V Cerkniščico sicer redno

vlagajo ribogojniško potočno postrv; ker pa je lokacija vzorčenja od preostalega

vodotoka ločena z visokim slapom, ki preprečuje migracijo rib proti toku, smo

predvidevali, da ti vzorci predstavljajo avtohtono populacijo. Trije primerki potočnice

prihajajo iz ribogojnice Povodje, naslednji trije pa iz ribogojnice Mount Lassen Fish


33

Farm, Kalifornia. Vseh šest naj bi predstavljalo atlantski tip postrvi. V raziskavo smo

vključili tudi dva primerka ohridske postrvi iz Ohridskega jezera.

Lipan je bil ujet v reki Iščici, šarenka pa je bila iz ribogojnice Pšata BF Oddelka za

zootehniko.

Tabela 2 Grupacije in vsote vzorcev glede na vrsto, lokaliteto in opravljene analize: mtDNA/MS (analiza mitohondrijske in mikrosatelitne DNA), mtDNA (analiza samo mitohondrijske DNA), MS (analiza samo mikrosatelitne DNA).

Vrsta Lokacija mtDNA/MS mtDNA MS ΣΣΣΣ ΣΣΣΣ

S. trutta

Iška 6 2 0 8

Mahnečica 5 4 5 14

Povodje 3 0 0 3

Mount Lassen 0 0 3 3

Ohridsko j. 2 0 0 2

ΣΣΣΣ 16 6 8 30

S. marmoratus

Zadlaščica 7 4 34 45

Trebuščica 8 3 8 19

ΣΣΣΣ 15 7 42 58

križanec1 Kanomlja 0 0 1 1

O. mykiss Pšata 1 0 0 1

ΣΣΣΣ 32 13 51 96

1Križanec med soško in potočno postrvjo


34

Mitohondrijsko DNA smo izolirali večinoma iz svežega ali zamrznjenega tkiva jeter,

ledvic in vranice, genomsko DNA (in delno mtDNA) pa iz svežega ali zamrznjenega

krvnega sedimenta.

Kri smo jemali iz lateralne vene anasteziranih rib. Pri odvzemu krvi smo v skladu z

velikostjo ribe uporabljali dvo- ali trimililitrske vakuumske zbiralce (Becton-

Dickinson) z EDTA (K3) in igle 0.5 X 17 mm (Veneflex) ali 0.7 X 40 mm (Becton

Dickinson). Volumni krvnih vzorcev so se gibali med približno 50 µl in dvema

mililitroma. Zbrano kri smo hranili na ledu in jo najkasneje v 12 urah centrifugirali

(1300 g, 30 min, 4°C) in krvni sediment takoj uporabili za izolacijo DNA ali pa ga

shranili pri -25°C.

3.1.1 Izolacija mtDNA

Mitohondrijsko DNA iz jeter, ledvic ali vranice smo izolirali po protokolu, ki ga

opisujeta White in Densmore (1992). Ta protokol zagotavlja sorazmerno učinkovito

izolacijo (6-7 µg mtDNA/g tkiva) relativno čiste mtDNA brez ultracentrifugiranja.

Bistveni koraki tega izolacijskega protokola so gradientno centrifugiranje s

saharoznim podslojem, ki omogoča učinkovito ločitev nepoškodovanih

mitohondrijev, in uporaba neionskega detergenta, ki prioritetno lizira mitohondrijske

membrane.

Pri izolaciji smo uporabljali naslednje sestavine:

• pufer TEK: 50 mM Tris; 10 mM EDTA; 1.5 % KCl, pH 7.5

• 15 % sharoza v TEK-u

• 10 % Nonidet v TEK-u

• Fenol, nasičen s TEK-om, pH 7.5-8.0

• PCI: fenol:kloroform:izoamil alkohol, 25:24:1

• CI: kloroform:izoamil alkohol, 24:1

• 96 % etanol

• 75 % etanol

• pufer TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA

1 do 3 g svežega ali zamrznjenega zmaceriranega tkiva smo resuspendirali v 5-

kratnem volumnu pufra TEK in ga homogenizirali. Homogenizat smo prenesli v 50-

mililitrsko centifugirko in ga podslojili s približno enakim volumnom 15 % saharoze

v TEK-u. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 1000 X g pri 4°C smo supernatant


35

prenesli v novo centrifugirko in ponovili postopek podslojevanja in centrifugiranja.

Supernatant smo nato centrifugirali pri 18000 X g 30 min pri 4°C. Oblikoval se je

dvoslojen sediment; spodnji sloj, ki je svetlejši in gostejši, je iz glikogena, zgornjega

pa tvorijo mitohondriji. S spiranjem vrhnjega sloja sedimenta z 10 ml TEK-a smo

mitohondrije resuspendirali in suspenzijo centrifugirali pri 18000 X g 30 min pri 4°C.

Postopek smo ponavljali, dokler se je v sedimentu še pojavljal glikogen. Očiščen

mitohondrijski sediment smo resuspendirali v 0.9 ml TEK-a, prenesli suspenzijo v 1.5

mililitrsko mikrocentrifugirko Eppendorf (epico) in dodali 10 vol. % 10 % raztopine

Nonideta v TEK-u. Po desetminutni inkubaciji pri sobni temperaturi smo suspenzijo

centrifugirali pri 12000 X g 10 minut pri sobni temperaturi. Sledila je organska

ekstrakcija: supernatantu z mtDNA smo dodali enak volumen fenola, suspenzijo

dobro premešali in jo po 5-minutni inkubaciji centrifugirali 10 min pri 12000 g.

Vodno (zgornjo) fazo, ki vsebuje DNA, smo prenesli v novo epico in ponovili

ekstrakcijo najprej s PCI in potem še s CI, s čimer smo odstranili preostali fenol.

Sledila je etanolna precipitacija DNA: vodno fazo smo prenesli v novo epico, dodali

dvojni volumen 96 % na -20°C ohlajenega etanola, raztopino dobro premešali in jo

inkubirali pri -20°C 2 uri ali čez noč. Precipitat smo centrifugirali pri 12000 g 10

minut pri 4°C, odlili supernatant, oprali sediment s 75 % etanolom in ponovili

centrifugiranje. Sediment smo posušili in ga raztopili v ustreznem volumnu

bidestilirane vode.

Izolacijo mtDNA iz krvnega sedimenta smo z določenimi spremembami izvedli po

protokolu, ki je primeren za izolacijo mtDNA iz krvi sesalcev (White in Densmore,

1992). Eritrociti sesalcev v nasprotju z eritrociti nižjih vretenčarjev nimajo niti jeder

niti mitohondrijev, zato smo izhodni volumen tkiva (1 do 5 ml), ki ga predpisuje

protokol, zmanjšali približno za desetkrat (na ∼100 µl). Krvne celice smo lizirali z

dvakratnim zamrzovanjem in odmrzovanjem. Krvni sediment smo namesto krvi

uporabljali zato, ker smo se na ta način znebili večine serumskih proteinov, ki z

zamreženostjo, do katere prihaja pri njihovi precipitaciji, zelo motijo potek same

izolacije mtDNA. Protokol predvideva uporabo naslednjih sestavin:

• pufer STE: 10 mM NaCl; 10 mM Tris HCl, pH 8.0; 25 mM EDTA

• TE

• 1.5 M saharoza v TE

• 20 % SDS


36

• s CsCl nasičena vodna raztopina (5 M NaCl)

• homogenizacijski pufer HB: 1.5 M saharoza v TE: STE, 1:5

100 µl krvnega sedimenta smo resuspendirali v 12 ml ledeno mrzlega pufra HB.

Suspenzijo smo centrifugirali pri 3000 x g 5 min pri 4°C. Supernatant, ki vsebuje

mitohondrije, smo centrifugirali pri 20000 x g 20 min pri 4°C (sediment, ki vsebuje

jedra, je mogoče uporabiti za izolacijo genomske DNA) in sediment raztopili v 1 ml

pufra TE, segretega na sobno temperaturo. Tej raztopini smo dodali 0.125 ml 20 %

SDS, premešali in inkubirali 10 min pri sobni temperaturi. Na ta način smo lizirali

mitohondrijske membrane. Proteine, lipide in SDS smo precipitirali z 200 µl 5 M

NaCl in z inkubacijo raztopine pri 4°C 2 uri ali čez noč. Precipitat smo odstranili s

centrifugiranjem pri 20000 X g 20 min pri 4°C. V naslednji fazi protokol predpisuje

gostotno gradientnio ultracentrifugiranje supernatanta. Ker nismo potrebovali visoko

kvalitetne mtDNA, smo ta zamudni korak izpustili in ga nadomestili z ekstrakcijo s

fenolom in kloroformom in z etanolno precipitacijo mtDNA. Oborino smo oprali v 75

% etanolu, jo posušili in raztopili v ustreznem volumnu bidestilirane vode.

Koncentracijo izolirane mtDNA smo ocenjevali na elektroferogramih s standardi z

znanimi koncentracijami.

3.1.2 Izolacija genomske DNA

Genomsko DNA smo izolirali po protokolu Medrana in sodelavcev (1990). Protokol

je namenjen za izolacijo genomske DNA iz eritrocitov z jedri. Odlikuje se po visoki

kvaliteti izolirane DNA in po preprosti in hitri izvedbi in je okolju prijazna, saj ne

vključuje niti organskih topil niti katerihkoli drugih toksičnih kemikalij.

Pet do 20 µl krvnega sedimenta smo resuspendirali v 3 ml liznega pufra (10 mM Tris,

400 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5 % SDS, 0.3 mg proteinaze K/ml, pH 8.2) in

suspenzijo inkubirali z občasnim mešanjem 2 uri pri 50°C. Proteine smo odstranili z

izsoljevanjem: suspenziji smo dodali 1 ml 6 M NaCl, raztopino močno stresali 15 s, jo

centrifugirali 15 min pri 1300 x g, odlili supernatant v novo centrifugirko in celoten

postopek še dvakrat ponovili. DNA smo iz supernatanta oborili z dodatkom dvojnega

volumna 96 % etanola, ogretega na sobno temperaturo. Oborino smo dvakrat oprali v

70 % etanolu, jo posušili in raztopili v ustreznem volumnu bidestilirane vode.


37

Koncentracijo in kvaliteto izolirane genomske DNA smo ocenjevali na osnovi

spektrofotometričnih vrednosti, ki smo jih izmerili pri valovnih dolžinah 260 in 280

nm.

1 O.D.260 nm = 50 ng DNA/µl

pod pogojem, da je A260nm/A280nm ≥ 1.7

3.2 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA

3.2.1 Polimerazna verižna reakcija (PCR)

S polimerzno verižno reakcijo smo pomnoževali variabilni fragment 5’-konca

kontrolne regije mtDNA. Uporabljali smo naslednji par oligonukleotidnih začetnikov

(Dovč in Hecht., 1994):

• HF (Haevy strand Forward), ki je bil na 5’-koncu označen z digoksigeninom:

5’-CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG-3’

• 28RIBa, ki predstavlja skrajšano obliko oligonukleotidnega začetnika “28”:

5’-CAC CCT TAA CTC CCA AAG CTA AG-3’

Komplementarno zaporedje oligonukleotida HF se nahaja v ohranjenem centralnem

delu kontrolne regije, medtem ko oligonukleotid 28RIBa specifično prepoznava

nukleotidno sekvenco v genu za tRNAPhe. Omenjeni oligonukleotidni par omogoča

amplifikacijo iste regije mtDNA pri mnogih vrstah vretenčarjev.

V polimerazni verižni reakciji smo uporabljali reakcijsko mešanico s končnim

volumnom 40 µl, ki je vsebovala naslednje komponente:

• 20 mM Tris-HCl/pH 8.4

• 50 mM KCl

• deoksinukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) s koncentracijo 0.2 mM

• oligonukleotidna začetnika s koncentracijo 0.75 µM

• 1.5 mM MgCl2

• 0.5 enote polimeraze Taq (Gibco BRL)

• ∼10 ng mtDNA

PCR je potekala v cikličnem termostatu Perkin Elmer 2400. Začela se je s petminutno

denaturacijo mtDNA pri 94°C, ki ji je sledilo 32 ciklov z naslednjim časovno-

temperaturnim profilom: 1 min pri 94°C, 1 min pri 46°C in 1 min pri 72°C.


38

3.2.2 Sekvenciranje mtDNA

Pri sekvenciranju PCR produktov mtDNA smo uporabili z digoksigeninom označen

oligonukleotidni začetnik HF.

Princip in metoda sekvenciranja sta opisana v poglavju 3.4.

3.2.3 Sekvenčna analiza

Analizo sekvenc smo opravili z računalniškim programom DNASIS™ (Pharmacia).

Na ta način smo ugotavljali pozicije polimorfnih mest in restrikcijska mesta,

karakteristična za posamezne genetske variante določenega polimorfnega mesta, ter

iskali ustrezne restrikcijske encime.

Filogenetske odnose med posameznimi genotipi smo ovrednotili s fenetično in

kladistično analizo. Parne genetske distance smo izračunali po sledeči formuli

dij = zd /zt,

kjer je zd število nukleotidov, ki se razlikujejo med dvema sekvencama, zt pa je število

vseh med seboj primerjanih nukleotidov (Avise, 1994). Dobljene vrednosti smo

korigirali najprej glede na tipe mutacij, ki smo jim določili različne teže. Razlikovali

smo med tranzicijami (I), transverzijami (Z) in delecijami oz. insercijami (D).

Ponderski koeficient posameznega tipa mutacije je predstavljala recipročna vrednost

njenega pojavljanja v odnosu do števila vseh mutacij, ki so se pojavljale na analizirani

regiji DNA: tranzicija = 1, transverzija = 2, delecija/insercija = 8.

dijcor1 = dij (ΣIij + 2ΣZij + 8ΣijD) /Nij,

kjer so ΣIij, ΣZij in ΣijD vsote posameznih tipov mutacij in N vsota vseh mutacij.

Frekvenco mutacijskih tipov in dinamiko spreminjanja njihovega razmerja smo

ocenjevali na osnovi nukleotidnih sekvenc identične regije DNA znotraj vrste (12

geografsko različnih populacije postrvi), znotraj rodu (postrv in atlantski losos) ter

znotraj družine (atlantski losos in šarenka) in med družinami znotraj podreda

Salmonoidae (atlantski losos in lipan). Omenjene podatke smo povzeli po lastnih in

literaturnih virih (Bernatchez in sod., 1992; Zardoya in sod., 1995; Shedlock in sod.,

1992; Digby in sod., 1992). Tako dobljene vrednosti parnih distanc smo korigirali še z

metodo transformirane distance (Klotz in sod., 1979), ki temelji na upoštevanju

zunanjika.

dijcor2 = [(dij - diD - djD) /2] + dD,


39

kjer D označuje zunanjik, dD = (diD + djD +… dnD) /n. Za zunanjo skupino smo izbrali

atlantskega lososa.

Nukleotidno divergenco med posameznimi skupinami ali znotraj njih smo računali

kot poprečje parnih distanc ustreznih populacij.

Filogenetsko drevo smo izdelali na osnovi dvakrat korigiranih parnih ditanc po

metodah UPGMA in Neighbour joining (računalniški program MEGA; Kumar in

sod., 1993).

3.2.4 Restrikcijska analiza

Na osnovi sekvenčne analize smo izbrali tri restrikcijske encime (Alu I, Ava I in Sma

I; Gibco BRL), s katerimi smo z restrikcijsko analizo PCR produktov ugotavljali

posamezne genotipe polimorfnih lokusov.

Pripravljali smo 20 µl restrikcijske reakcije, ki so vsebovale:

• ≤ 20 vol.% encima (20-5 enot)

• 2 vol.% 10X restrikcijskega pufra

• 300 ng DNA

• bidestilirano vodo do končnega volumna

Inkubacija je potekala 2 do 3 ure pri 37°C.

3.3 ANALIZA MIKROSATELITNE DNA

3.3.1 Kloniranje

Večina protokolov, ki smo jih uporabljali pri kloniranju, je opisana v priročniku

“Microsatellie Manual”(Glenn, 1995). Protokoli, ki izhajajo iz drugih virov, so

posebej navedeni.

3.3.1.1 Priprava DNA insertov

Za pripravo DNA insertov smo uporabljali visoko kvalitetno genomsko DNA, ki smo

jo izolirali iz naključno izbranega vzorca krvi soške postrvi. DNA smo razrezali z

restrikcijskim encimom Sau3A I (Gibco BRL; prav tako uporabna sta izoshizomera

Dpn II in Mbo I), ki prepoznava sekvenco 5’-!GATC-3’ in pri cepitvi pušča

GATC/CTAG-proste konce. Pripravili smo 50 µl restrikcijsko reakcijo, ki je

vsebovala:


40

• 2 µl Sau3A I (20 enot)

• 5 µl 10 X restrikcijskega pufra

• 10 µg genomske DNA

• bidestilirano vodo do 48 µl

Po 1.5-urni inkubaciji pri 37°C smo dodali še:

• 2 µl encima (20 enot)

Sledila je triurna inkubacija pri 37°C.

Restrikcijsko mešanico smo nanesli na 1 % agarozni gel in po končani elektroforezi

(40 V, 60 do 90 min) iz gela izolirali (poglavje 3.5.1) zvezni interval restrikcijskih

fragmentov (DNA insertov) v velikosti od ∼90 do ∼650 bp. DNA inserte smo očistili

(poglavje 3.5.1) in raztopili v bidestilirani vodi ter pripravili raztopino (60 µl) s

koncentracijo ∼25 ng DNA/µl.

3.3.1.2 Priprava vektorja

Kot vektor smo uporabljali fagemid pBluescriptII SK+ (Stratagene; slika 5). Ta

fagemid je dolg 2961 bp, nosi gen za rezistenco na ampicilin in ima obsežen

polilinker s 24 restrikcijskimi mesti, ki ga obdajata promotorja za T3 in T7 RNA

polimerazo. Polilinker in omenjena promotorja se nahajata na 5’-koncu fragmenta

gena lacZ. Ta lastnost vektorja omogoča v kombinaciji z ustrezno bakterijsko linijo

(ki ima na F’ episomu ∆M 15 lac gen) in primernim substratom (X-gal) belo/modro

selekcijo kolonij1.

1 Celice, ki nosijo vektor z insertom, so bele, tiste, ki nosijo vektor brez inserta, so modre; celice, ki nimajo vektorja, v gojišču z ampicilinom ne rastejo.


41

Slika 5 Shematični prikaz in značilnosti vektorja pBluescriptII SK+ (Stratagene).

Restrikcija vektorja

Vektor smo razrezali z restrikcijskim encimom BamH I, ki prepoznava sekvenco 5’-

G!GATCC-3’ in pri cepitvi pušča GATC/CTAG proste konce. Pripravili smo 20 µl

restrikcijsko reakcijo, ki je vsebovala:

• 2 µl BamH I (20 enot)

• 2 µl 10 X restrikcijskega pufra

• 10 µg vektorja


Sledila je inkubacija 2 uri pri 37°C.


42

Defosforilacija vektorja

Vektorja smo defosforilirali z alkalno fosfatazo iz intestinuma teleta (CIAP; Gibco

BRL) neposredno po restrikciji. Restrikcijski mešanici smo dodali 2 µl CIAP (42.8

enote) in 5 µl pufra za razredčenje (Gibco BRL). Defosforilacijskega pufra nismo

dodali. Inkubirali smo 1 uro pri 37°C. Lineariziran in defosforiliran vektor smo

izolirali s preparativno elektroforezo in ga očistili (poglavje 3.5.1) ter pripravili

raztopino (40 µl) s koncentracijo 200 ng DNA/µl.

3.3.1.3 Priprava kompetentnih celic

Uporabljali smo sev E. coli XL1-Blue MRF’ (Epicurian Coli Supercompetent Cells;

Stratagene). Ta sev ima na F’-episomu poleg ∆M 15 lac gena, ki omogoča belo/modro

selekcijo kolonij, še Tn10 gen, ki daje celicam rezistentnost na tetraciklin. Celice

lahko ob večkratni manipulaciji izgubijo F’- episom (F’--celice) in so bele barve,

četudi ne vsebujejo vektorja z insertom. Z vključitvijo tetraciklina v gojišče je rast

navidezno pozitivnih F’- kolonij preprečena.

Kompetentne celice smo pripravili po metodi Nishimure in sod. (1990; obdelava s

polietilen glikolom /PEG/).

3 ml LB/Tet tekočega gojišča (tabela 3) v 10-ml erlenmajerici smo inokulirali z eno

bakterijsko kolonijo, ki je zrasla čez noč pri 37°C na LB/Tet trdem gojišču (tabela 3)

in inkubirali čez noč na stresalniku (37°C, 250 min-1). Nato smo z 1 ml te kulture

inokulirali 100 ml suplementarnega LB/Tet gojišča (tabela) v 250-ml erlenmajerici.

Tako pripravljeno kulturo smo inkubirali pri 37°C in 250 min-1, dokler ni O.D.

dosegla vrednost ∼0.5 (v času treh do petih ur). Bakterijsko kulturo smo ohladili z

desetminutno inkubacijo na ledu, jo prenesli v ohlajeno polipropilensko centrifugirko

in centrifugirali 10 min pri 1500 g in 4°C. Bakterijski sediment smo resuspendirali z 1

ml ledenomrzlega suplementarnega LB/Tet gojišča in dodali 5 ml suplementarne PEG

raztopine (tabela 3). Sledilo je rahlo mešanje suspenzije, ki smo jo nato raztočili v

podhlajene 1.5-ml epice (20 µl/epico). Po najmanj 30-minutni inkubaciji v tekočem

dušiku smo celice ali uporabili za transformacijo ali jih shranili na -70°C, kjer ostajajo

kompetentne do dveh let.

Tako obdelane celice so primerne za transformacijo s temperaturnim šokom.

Učinkovitost take transformacije se giblje med 106 do 107 transformant/µg nerezanega

vektorja.


43

Tabela 3 Gojišča in raztopine za bakterijske kulture

LB tekoče gojišče (1 l) LB/Tet gojišče

NaCl, 10 g LB gojišče

pepton, 10 g ohladiti na 55°C

kvasni ekstrakt, 5 g tetraciklin, 12 µg/ml gojišča

voda do 1 l

pH 8.2 (s 5 M NaOH)

avtoklavirati

LB trdo gojišče (1 l) LB/Amp gojišče

LB tekoče gojišče LB gojišče

baktoagar, 20 g ohladiti na 55°C

pH 8.2 (s 5 M NaOH) ampicilin, 100 µg/ml gojišča

avtoklavirati

Suplementarno LB tekoče gojišče Suplementarna PEG raztopina

LB tekoče gojišče LB tekoče gojišče

avtoklavirati glicerol, 36 % (v/v)

MgSO4, 10 mM PEG 8000, 12 % (u/v)

glukoza, 0.2 % (u/v) MgSO4, 12 mM

sterilno filtrirati

3.3.1.4 Ligacija

Za ligacijo DNA insertov v vektor smo uporabili količinsko razmerje 8 : 1. To

razmerje teoretično zagotavlja, da je število kohezivnih koncev vektorja in insertov v

ligacijski reakciji enako. Izračunali smo ga preko razmerja med dolžino vektorja in

poprečno dolžino DNA insertov:

2961 bp : 370 bp ≈ 8

Pripravili smo 20 µl ligacijsko reakcijo, ki je vsebovala naslednje komponente:


44

• 2 µl T4 DNA ligaze (2 enoti; Gibco BRL)

• 4 µl 5 X ligacijskega pufra

• 400 ng vektorja [200 ng/µl]

• 50 ng insertne DNA [25 ng/µl]


Po inkubaciji pri 16°C čez noč smo dodali dvojni volumen pufra TLE (tris-Low-

EDTA: 10 mM Tris /pH 8.0/, 0.1 mM EDTA) in inkubirali še 15 do 20 min pri 65°C.

3.3.1.5 Transformacija

Transformacijo smo izvedli s temperaturnim šokom. Kompetentne celice smo odtalili

na ledu in prenesli po 100 µl celične suspenzije v 15-ml ohlajene centrifugirke. Vsaki

smo dodali po 2,5 µl ligacijske mešanice (∼17 ng DNA), rahlo premešali suspenzijo,

jo inkubirali najprej 15 do 30 min na ledu in nato natančno 60 sekund v vodni kopeli,

ogreti na točno 42°C. Po 1 do 2 minutni inkubaciji na ledu smo celični suspenziji pri

sobni temperaturi dodali 900 µl LB gojišča, ogretega na sobno temperaturo, in celice

ikubirali 1 uro pri 37°C v stresalniku (20 min pri 100 min-1, 40 min pri 225 min-1).

3.3.1.6 Manipuliranje s transformiranimi celicami

Transformirane celice smo nanesli na LB Amp/Tet plošče (Φ = 9 cm), ki smo jih

predhodno premazali s 40 µl raztopine X-gal (Gibco BRL; 20 mg/ml 10 % dimetil

formamida) in 25 µl 100 mM vodne raztopine IPTG (Gibco BRL). Volumen nanosa

je bil 100 µl bakterijske suspenzije na ploščo. Kolonije so zrastle po 14 do 24-urni

inkubaciji pri 37°C. Bakterijske klone z rekombinantnim vektorjem smo prenesli na

sveže LB/Amp/Tet trdno gojišče (100 kolonij na petrijevko), in inkubirali pri 37°C,

dokler niso kolonije zrasle do velikosti, primerne za preslikavo na membrano.

3.3.2 Detekcija pozitivnih kolonij

3.3.2.1 Preslikava kolonij, liza bakterij ter denaturacija DNA

Preslikavo bakterijskih kolonij smo izvedli v hladni sobi pri ∼10°C tako, da smo

membrano (Amersham, Hybond-N+ 0.45 µm, Φ 82 mm) za 15 min položili na

bakterijske kolonije.


45

Za bakterijsko lizo, denaturacijo in renaturacijo DNA smo uporabljali pufre, ki so

opisani v tabeli.

Tabela 4 Pufri za bakterijsko lizo, denaturacijo in renaturacijo DNA

Lizni pufer: -10 % SDS

Denaturacijski pufer: -0.5 M NaOH

-1.5 M NaCl

Renaturacijski pufer: -1 M HCl

-1.5 M NaCl

-10 mM MgCl2

-pH 7.7 (s konc. HCl)

Hibridizacijski pufer (20X SSC): -3 M NaCl

-0.3 M Na-citrat

Raztopina proteinaze K: -2X SSC

-0.5 % SDS

-10 % proteinaza K

Pufer za spiranje: -2X SSC

-0.5 % SDS

Pripravili smo tri horizontalno ležeče trakove filtrskega papirja 3MM, ki smo jih

prepojili z liznim, denaturacijskim oziroma renaturacijskim pufrom. Nanje smo v prav

tem vrstnem redu polagali membrano (s kolonijami navzgor), ki smo jo pustili na

vsakem od trakov po ∼5 min. Sledilo je sušenje membrane pri sobni temperaturi (5

min do 2 uri), nato pečenje membrane 30 min pri ∼90°C in inkubacija membrane 1

uro ali čez noč v raztopini proteinaze K pri 37°C in s stresnjem 100 min-1. Nato smo

membrano inkubirali v 50 ml pufra za spiranje s stresanjem (100 min-1) nekaj ur pri

65°C, nato pa še dvakrat v 50 ml pufra 2 X SSC s stresanjem (100 min-1) pri 55°C.


46

3.3.2.2 Hibridizacija

Za detekcijo pozitivnih kolonij smo uporabljali QUICK-LIHGT Genome Mapping

Probe Kit (FMC) s sondama (CA)n in (GA)n. Na sonde je pripeta alkalna fosfateza, ki

v stiku z dioksietanskim substratom (Lumi-Phos 480 dioxetane; FMC) inducira “in

situ” kemiluminiscenco, ki je zaznavna z rentgenskim filmom. Hibridizirali smo pri

55°C z obema sondama hkrati, natančno po navodilih proizvajalca.

3.3.2.3 Detekcija na rentgenskem filmu

Kemiluminiscenčni signal smo ugotavljali z ekspozicijo membrane na rentgenski

film, ki je potekala čez noč pri sobni temperaturi. Rentgenski film smo razvijali ročno,

pri čemer smo uporabljali standardne kemikalije za razvijanje (Sigma/Kodak).

Pozicije temnih lis, ki so se pojavile na filmu in so odražale pozitivne kolonije, so

omogočale identifikacijo le-teh na trdnem gojišču.

3.3.3 Analiza DNA insertov

3.3.3.1 Izolacija pozitivnih plazmidov

Plazmidno DNA smo izolirali po principu alkalne lize (Ausubel in sod., 1994), ki

omogoča njeno izolacijo iz majhnih količin različnih kultur transformiranih bakterij.

Bakterijska liza poteka v raztopini NaOH in SDS (SDS denaturira bakterijsko lipidno

membrano in proteine, NaOH pa kromosomsko in plazmidno DNA. Kalijev acetat

povzroči hitro renaturacijo cirkularnih plazmidnih DNA molekul ter precipitacijo

večine kromosomske DNA, bakterijskih proteinov in SDS. Precipitat odstranimo s

centrifugiranjem, renaturirano plazmidno DNA pa skoncentriramo z etanolno

precipitacijo.

S posamezno pozitivno kolonijo smo inokulirali 5 ml LB/Amp/Tet tekočega gojišča

(tabela 3) in inkubirali čez noč pri 37°C na stresalniku (225 min-1). S cenrtifugiranjem

(20 s, 12000 x g) dvakrat po 1.5 ml bakterijske kulture v 1.5-mililitrski epici smo

sedimentirali bakterije in jih resuspendirali v 100 µl pufra GTE (tabela 5). Suspenzijo

smo inkubirali 5 min pri sobni temperaturi, ji dodali 200 µl raztopine NaOH/SDS

(tabela 5), jo premešali z obračanjem epice in jo postavili za 5 min na led. Nato smo

dodali 150 µl raztopine kalijevega acetata (tabela 5), raztopino močno premešali in

inkubirali 5 min na ledu. Po sledečem tri-minutem centrifugiranju (12000 x g) smo


47

supernatant prenesli v svežo epico in precipitirali DNA z 0.8 ml 95 % etanola in 10

minutno inkubacijo pri sobni temperaturi. Precipitat smo skoncentrirali s

centrifugiranjem (5 min, 12000 x g, sobna T), ga trikrat oprali v 1 ml 70 % etanola,

posušili in raztopili v ustreznem volumnu vode.

Tabela 5 Pufri in raztopine, uporabljani pri izolaciji plazmidne DNA z alkalno lizo

Pufer GTE: -50 mM glukoza

-25 mM Tris, pH 8

-10 mM EDTA

-avtoklavirati, hraniti pri 4°C

-lizocim [4 mg /ml], dodati pred

uporabo

Raztopina NaOH/SDS: -0.2 M NaOH (sveže pripravljen iz

10 M koncentrata)

-1 % SDS

Raztopina K-acetata: -3 M K-acetat

-11.5 % led-ocetna kislina

-pH 4.8

3.3.3.2 Polimerazna verižna reakcija (PCR)

Izolirane plazmide smo uporabili kot matrično DNA za polimerazno verižno reakcijo,

s katero smo testirali klonirane DNA inserte. Uporabljali smo univerzalna

oligonukleotidna začetnika T3 (5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3') in T7 (5'-

GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3'). V polimerazni verižni reakciji smo

uporabljali reakcijsko mešanico s končnim volumnom 10 µl, ki je vsebovala 0.1 enoto

polimeraze Taq (Gibco BRL). Preostale komponente PCR in njihove koncentracije so

navedene v poglavju 3.2.1.


48

PCR je potekala v cikličnem termostatu Perkin Elmer 2400. Začela se je z

dvominutno denaturacijo DNA pri 94°C, ki ji je sledilo 29 ciklov z naslednjim

časovno-temperaturnim profilom: 1 min pri 94°C, 30 s pri 50°C in 1.5 min pri 72°C.

Pomnožene regije smo analizirali z elektroforezo na 2 % agaroznem gelu (poglavje

3.5) in z direktnim sekvenciranjem PCR produktov.

3.3.3.3 Sekvenciranje insertov

S sekvenciranjem smo preverjali prisotnost mikrosatelitov, ugotavljali njihove

lastnosti in pozicijo mikrosatelitov v insertih. Na tej osnovi smo odbirali

mikrosatelite, ki so ustrezali pogojem za oblikovanje genetskih markerjev.

DNA inserte smo sekvencirali z obeh strani (s 5'- in s 3'-konca), pri čemer smo

uporabljali univerzalna oligonukleotidna začetnika T3 in T7, označena z

digoksigeninom.

Princip in metoda sekvenciranja sta opisana v poglavju 3. 4.

3.3.4 Načrtovanje oligonukleotidnih začetnikov

Na osnovi nukleotidnih sekvenc DNA insertov, ki so obdajale mikrosatelite, smo

načrtovali specifične pare oligonukleotidnih začetnikov. Pri tem smo si pomagali z

računalniškim programom Oligo™ (Ver 3.3) in se poskušali držati naslednjih

parametrov:

• dolžina oligonukleotida: ≥18 in ≤22 nukleotidov

• temperatura prileganja: ≥57 in ≤63°C

• odstotek GC: ≥20 in ≤80 %

• število neznanih baz: 0

• avtokomplementarnost: ≤12 baz

• avtokomplementarnost na 3'-koncu: ≤8 baz

3.3.5 Optimiziranje pogojev PCR

Pare oligonukleotidnih začetnikov smo najprej preizkusili s standardno PCR (3.2.1) in

amplifikate preverili na 2 % agaroznem gelu (3.5). Za matrično DNA smo izbrali isti

vzorec, kot smo ga uporabili za kloniranje. PCR je potekala pri treh različnih

temperaturah prileganja: 50, 55 in 60°C. Če so se nespecifično pomnožene regije še

pojavljale, smo jih poskušali odpraviti z znižanjem koncentracije MgCl2 (2 do 3 krat).


49

Artefakte, ki so bili večji od pravega PCR produkta, smo poskušali eliminirali tudi s

krajšanjem časa polimerizacije in prileganja. Univerzalna PCR, ki nam jo je uspelo

optimizirati za pomnoževanje vseh mikrosatelitov, ki jih obravnavamo v pričujoči

raziskavi, je potekala v cikličnem termostatu Perkin Elmer 2400 in se je začela z

triminutno denaturacijo DNA pri 94°C, ki ji je sledilo 30 ciklov z naslednjim

časovno-temperaturnim profilom: 45 s pri 94°C in 25 s pri 60°C.

3.3.6 Analiza mikrosatelitnega polimorfizma

Optimizirano PCR smo uporabljali za analizo mikrosatelitnega polimorfizma. Alele

določenega lokusa smo med seboj ločevali z denaturacijsko poliakrilamidno gelsko

elektroforezo in jih prenešene na membrano kolorimetrično detektirali (poglavje 3.4).

Samo eden izmed obeh oligonukleotidnih začetnikov, ki smo jih vključili v PCR, je

bil označen z digoksigeninom. S tem smo dosegli vizualizacijo samo ene verige

posameznega alela, kar je bistveno oljašalo interpretacijo rezultatov pri analizi

mikrosatelitnega polimorfizma.

Po končani PCR smo vzorcem dodali formamidni pufer (Taq DNA sequencing Kit,

Boehringer Mannheim; 33 % končnega volumna). Vzorce smo po toplotni

denaturaciji (3 min pri 85°C) takoj ohladili na ledu in jih nanesli na ogret gel (0.7

µl/žepek). Vsi postopki elektroforetske ločbe, prenosa na membrano in kolorimetrične

detekcije so enaki tistim, ki so opisani v poglavju 3.4.


50

3.3.7 Statistična analiza

Mikrosatelite je mogoče analizirati na način, ki je sicer primeren za vrednotenje

aloencimskega polimorfizma (Hoelzel in Bacroft, 1992).

3.3.7.1 Heterozigotnost - opažena in pričakovana

Opažena ali neposredno izračunana heterozigotnost je delež osebkov z dvema

različnima aleloma. Izračunamo jo po sledeči formuli:

ho = nhet /ntot

kjer je nhet število heterozigotnih živali in ntot velikost vzorca.

Pod predpostavko, da je populacija v Hardy-Weinbergovem ravnotežju, lahko

pričakovano heterozigotnost določimo preko frekvence alelov na določenem lokusu s

sledečo formulo:

hE = 1 - � pi2

kjer je pi frekvenca i-tega alela.

Odklone od Hardy-Weinbergovega ravnotežja ocenjujemo s testom χ2 (Hartl in

Clarke, 1988).

χ2 = (1 - ho /hE)2 . n

kjer je ho/hE kvocient med opaženo in pričakovano heterozigotnostjo in n velikost

populacije. Stopinje prostosti izračunamo po formuli

df = r . (r - 1) /2

kjer je r število alelov na lokusu.

3.3.7.2 Vrednost PIC (polymorphism information content)

Vrdnost PIC določenega lokusa smo računali po formuli, ki jo je predlagal Botstein s

sod. (1980):

n n-1 n

PIC = 1 - � pi2 - 2. � � pi

2 pj

2

i=1 i=1 j=i+1

kjer je pi frekvenca i-tega alela in n število osbkov v preučevani populaciji. Za izračun

vrednosti PIC smo uporabili računalniški program, ki ga je napisal Dr. M. Gibbs.


51

3.4 SEKVENCIRANJE Nukleotidno zaporedje pomnožene DNA smo določali po ustaljeni dideoksi metodi

(Sanger in sod., 1977). Uporabljali smo Taq DNA Sequencing Kit (Boehringer

Mannheim) za neradioaktivno sekvenciranje eno- in dvoverižne DNA z

oligonukleotidnim začetnikom, označenim z digoksigeninom, in ciklično sekvenčno

reakcijo. PCR amplifikate, ki smo jih nameravali uporabiti kot matrično DNA v

sekvenčni reakciji, smo s preparativno agarozno elektroforezo predhodno očistili

preostanka oligonukleotidnih začetnikov, nukleotidov in eventuelnih nespecifičnih

PCR produktov (poglavje 3.5.1). Približno koncentracijo očiščenih PCR produktov

smo ocenili spektrofotometrično ali po jakosti signala na agaroznem gelu; za

sekvenčno reakcijo enega vzorca smo uporabili približno 50 ng PCR produkta.

Sekvenčne reakcije smo pripravili strogo po navodilih proizvajalca. Uporabljali smo

deazne dideoksinukleotide. Sekvenčna reakcija je tekla v cikličnem termostatu Perkin

Elmer 2400 z začetno petminutno denaturacijo pri 95°C, ki ji je sledilo 30 ciklov z

naslednjim časovno-temperaturnim profilom: 30 s pri 95°C, 30 s pri 58°C in 1 min pri

70°C. Sekvenčno reakcijo smo ohladili na 4°C in dodali formamidni pufer (Taq DNA

Sequencing Kit, Boehringer Mannheim), ki je vseboval tudi barvili bromfenol modro

in ksilen cianol. Pred nanosom na gel smo sekvenčne reakcije toplotno denaturirali (3

min pri 85°C) in jih do nanosa hranili na ledu.

Gelska elektoforeza in prenos na membrano sta potekala na aparatu “Direct-Blotting-

Electrophoresis GATC 1500 DNA-Sequencer” (GATC, Inc.). To napravo dopolnjuje

programska enota CCU 1500, ki kontrolira pomikanje membrane pod gelom.

Uporabljali smo 0.19 mm tanek in 32 cm dolg 4 % denaturacijski poliakrilamiden gel,

ki smo ga pripravili po navodilih proizvajalca in z originalnimi kemikalijami iz

proizvajalčevega kompleta (GATC, Inc.). Uporabljali smo odzračen elektrodni pufer

1X TBE (50 mM Tris, 50 mM borna kislina, 1 mM EDTA; pH 8.2).

Vzorce (1.8 µl/žepek) smo nanesli na predhodno ogret gel (30 W, 30 min), začetni tek

je trajal 10 min pri 500 V, ločitveni pa približno tri ure in pol pri konstantni moči 30

W (∼1500 V, ∼19 mA). Uporabljali smo 40 cm dolgo najlonsko membrano (GATC,

Inc.), ki smo jo pognali ob izteku barvila bromfenol modro iz gela, kar je približno

sovpadalo s prihodom prvih nukleotidov na spodnji konec gela. Hitrost membrane je

bila 19 cm/h, pri čemer se je na membrani ločilo približno 400 nukleotidov.


52

Po končani elektroforezi smo membrano posušili na sobni temperaturi in jo 2 min

obsevali pod UV pri 302 nm.

Za vizualizacijo sekvenčnih produktov smo uporabili DIG Nucleic Acid Detection Kit

(Boehringer Mannheim). Princip delovanja tega detekcijskega sistema temelji na

standardni imunološki detekciji in kolorimetrični reakciji in vključuje z alkalno

fosfatazo konjugirana protitelesa, specifična za digoksigenin, X-fosfat (5-bromo-4-

kloro-3-indolil /BCIP/) in fosfatazni substrat (nitromodra tetrazolna sol /NBT/).

Barvna reakcija poteče v alkalnem mediju in se pokaže v obliki modrega precipitata,

ki se pojavi v času od nekaj minut do nekaj ur po začetku reakcije.

Praktično detekcijo, ki temelji izključno na uporabi komercialno pripravljenih

kompoment v kompletu, smo izvajali po navodilih proizvajalca. Inkubacije membrane

v različnih medijih so potekale v valju hibridizacijske pečice (Hybaid).

3.5 ELEKTROFOREZA NA AGAROZNEM GELU Z agarozno gelsko elektroforezo smo ločevali med seboj fragmente DNA, večje od 50

bp. Uporabljali smo jo v analitske in preparativne namene. Velikost elektroforetskih

frakcij smo ocenjevali primerjalno z dvema velikostnima standardoma, ki sta

enakomerno pokrivala področji od 100 do 2000 bp ter od 500 do 12200bp (100 bp

DNA Ladder in 1000 bp DNA Ladder; Gibco BRL).

Uporabljali smo horizontalno elektroforezno enoto (Pharmacia) z dvema različno

velikima kalupoma za gel z dimenzijami 5.5 X 7.5 cm in 7.5 X 10.5 cm in elektrodni

pufer 1X TBE. Agarozno raztopino smo pripravili s segrevanje agaroze (SeaKem LE

agarose, FMC) v pufru 1X TBE do vrelišča. Odstotek agaroze v gelu smo prilagajali

velikostnemu razredu testiranih fragmentov DNA.

Vzorcem smo pred nanosom na gel (5-30 µl/žepek) dodali aplikacijski pufer (0.25 %

bromfenol modro, 0.25 % ksilen cianol, 30 % glicerol v vodi) v vol razmerju ∼10:1.

Bromfenol modro na gelu z 0.5 do 1.4 % agaroze indicira pozicijo 300 bp, ksilen

cianol pa 4 kb.

Elektroforeza je tekla pri sobni temperaturi praviloma najprej pet min pri 80 V in nato

do konca (od 15 min do dveh ur in pol) pri 100 do 120 V. Gel smo barvali ∼30 min v

vodni raztopini etidijevega bromida (0.5 µg/ml) in ga razbarvali 10 min v vodi.

Presoja in fotografiranje (Polaroid 667) elektroforetskih frakcij sta potekala na

transiluminatorju pri valovni dolžini 302 nm.


53

3.5.1 Preparativna elektroforeza

Pod transiluminatorjem (366 nm) smo na gelu locirali želeno frakcijo DNA, jo izrezali

in jo s pomočjo QIAEX Gel Ectraction Kita (QIAGEN) ekstrahirali iz gela in

skoncentrirali ter raztopili v poljubnem volumnu bidestilirane vode.


54

4. REZULTATI

4.1 ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA

4.1.1 Polimerazna verižna reakcija

PCR produkt variabilnega dela kontrolne regije mtDNA je prikazan na sliki 6. Iz

elektroferograma je razvidno, da je polimerazna verižna reakcija potekala specifično,

brez pomnoževanja nespecifičnih regij. Glede na velikostni standrd, ki je na sliki

viden v liniji 5, smo ocenili velikost amplifikata na ∼470 bp.

Slika 6 PCR produkti variabilnega dela kontrolne regije mtDNA na 2 % agaroznem gelu. 1: negativna kontrola; 2-3: potočna postrv; 4: soška postrv; 5: velikostni marker 100 bp (Gibco BRL); 6: ohridska postrv.

4.1.2 Sekvenciranje mtDNA

Tabela 6 prikazuje nukleotidno zaporedje lahke verige 297 bp dolge amplificirane

kontrolne regije mtDNA, ki smo ga določali pri soški postrvi. Navajamo tudi

homologni DNA sekvenci atlantskega lososa in šarenke, ki ju povzemamo po

literaturnih virih (Bernatchez in sod., 1992; Digby in sod., 1992; Shedlock in sod.,

1992). Povdarjeni in oštevilčeni nukleotidi označujejo polimorfna mesta, ki smo jih s

primerjalno sekvenčno analizo odkrili pri različnih populacijah preiskovanih postrvi.

470 bp

1 2 3 4 5 6


55

Tabela 6 Nukleotidna zaporedja amplificiranega dela kontrolne regije mtDNA (lahka veriga) pri soški postrvi (S. marmoratus), atlantskem lososu (S. salar) in šarenki (O. mykiss). Črte označujejo identičnost s sekvenco soške postrvi, pike označujejo delecije. Polimorfna mesta, značilna za atlantskega lososa in postrvi so oštevilčena, polimorfna mesta populacij postrvi pa so povdarjena.

1

S. marmoratus 1 5’ATGTTATACT ACATCTATGT ATAATATTAC ATATTATGTA 40

S. salar ---------- ---------- ----C----- ----------

O. mykiss ---------- ---------- ---------- ----------

2 3

S. marmoratus 41 TTTACCCATA TATATAATAT AGCATGATGA GTAGTACATC 80

S. salar ---------- ---------- ------.--- ---------T

O. mykiss ---------- ---..----C T-----.--- ---------T

4 5

S. marmoratus 81 ATATGTATTA TCAACATTA. GTGAATTT.A ACCCCTCATA 120

S. salar ---------- -------A-- ---G------ ----------

O. mykiss ---------- -------ACG --.G----T- ----------

6 7

S. marmoratus 121 CATCAGCACT AACTCAAGGT TTACATAAAG CAAAACACGT 160

S. salar ---------- --TC------ ---------- ----------

O. mykiss ---------A --TC------ ------T-.C -.C-------

8 9 10 11

S. marmoratus 161 GATAATAACC AACTAAGTTG TCTT.AACCC GATTAATTGT 200

S. salar ---------- ---------- -T-------- ---------A

O. mykiss ---------- ---------- -T—-A---T. ---------C

12

S. marmoratus 201 TATATCAATA AAACTCCAAC TAACACGGGC TCCGTCTTTA 240

S. salar ---------- ---------- ---------- ----------

O. mykiss ---------- ---------- ---------- ----------

13 14 15

S. marmoratus 241 CCCACCAACT .TTCAGCATC AGTCCTGCTT AATGTAGTAA 280

S. salar ---------- A--------- ------AT-- ----------

O. mykiss ---------- .--------- -----G---- ----------

S. marmoratus 281 GAACCGACCA ACGATAT 3’

S. salar ---------- -----TT

O. mykiss ---------- -----TT

4.1.3 Sekvenčna analiza

Med analiziranimi populacijami soške in potočne postrvi smo na 330 bp dolgi DNA

regiji našli štiri variabilna nukleotidna mesta (tabela 7), ki so vključevala šest

mutacijskih dogodkov: pet substitucij (tri transverzije in dve tranziciji) in eno delecijo

oz. insercijo (slika 7).


56

Tabela 7 Polimorfna mesta in različni genotipi, oblikovani na osnovi opaženih mutacij. Genotip F je značilen za atlantskega lososa (Bernatchez in sod., 1992), preostali genotipi pa za populacije postrvi. Številke označujejo sekvenčne pozicije in se nanašajo na tabelo 6. Osenčitve označujejo polimorfna mesta pri postrveh.

Polimorfna mesta

Genotipi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A T - C T A C T C G G T G - G C A

B T - C T A C T C A G T G - G C A

C T - C T A C T C A T T G - G C A

D T A C T A C T C A T T A - G C A

E T - C T A C T C A T T C - G C A

F C - T A G T C T A T A A A A T T


57

C T A G C T A G C T A G C T A G C T A G

C T A G C T A G

A B C D EA BC E D

Slika 7 Sekvenčni polimorfizem 330 bp dolgega dela kontrolne regije pri geografsko različnih populacijah soške in potočne postrvi. Prikazane so vse najdene genetske variante: A, B, C, D in E. Puščice prikazujejo mutacijska mesta.

Na osnovi omenjenih mutacij smo lahko med 44 testiranimi osebki postrvi našli pet

različnih genotipov (tabela 7, slika 7). Njihova porazdelitev glede na geografski izvor

posamezne populacije je prikazana v tabeli 8. Očitno je, da je za obe populaciji soške

postrvi značilen genotip D, ki ga pri populacijah potočne postrvi nismo našli.

Karakterizirata ga insercija adenina na poziciji št. 2 in adenin na poziciji št 12 (tabela

6 ). Potočna postrv kaže zmeren inter-populacijski polimorfizem (genotipi A, B, C in

E). Ta je znotraj populacij prisoten le pri potočni postrvi iz Iške, kjer ga

karakterizirajo genotipi A, B in C, in je omejen na dve točkovni mutaciji (št. 9 in 10),

kjer v prvem primeru prihaja do transverzije in v drugem do tranzicije. Vzorci

preostalih populacij potočne postrvi imajo genotipe več ali manj fiksirane: pri

postrveh iz Mahnečice se večinoma pojavlja genotip B, genotip C je značilen za

ribogojniško populacijo, medtem ko smogenotip E našli le pri obeh vzorcih ohridske

postrvi. Omenjeni genotip se od vse ostalih loči po citozinu na polimorfnem mestu št.

12.

Tabela 8 Porazdelitev genotipov med populacijami soške in potočne postrvi z različnim geografskim izvorom


58

Genotipi

n A B C D E

Potočna postrv

Iška 8 2 3 3 - -

Mahnečica 9 - 8 1 - -

Povodje 3 - - 3 - -

Ohridsko jezero 2 - - - - 2

Soška postrv

Trebuščica 11 - - - 11 -

Zadlaščica 11 - - - 11 -

Sorodstvena razmerja med posameznimi pari genotipov smo ocenjevali na osnovi

parne nukleotidne divergence, ki jo prikazuje spodnji levi del tabele 9. Vrednosti so

izražene v odstotkih in se gibljejo od 0.20 % do 1.21 % (x = 0.99; SD = ±0.31 ) pri

postrveh. Nukleotidne divergence med nekaterimi skupinami genotipov in znotraj njih

so prikazane v tabeli 10. Do največje razlike prihaja, če primerjamo genotip D s

preostalimi genotipi, najmanjšo razliko pa opazimo znotraj skupine z genotipi A, B in

C. Primerjave z genotipom E se uvrščajo med oba omenjena ekstrema. Zgornji desni

del tabele 9 prikazuje število in vrste mutacij med posameznimi pari genotipov. V

splošnem večje število istovrstnih mutacij pogojuje tudi sorazmerno večjo

nukleotidno divergenco med pari; v določenih primerih (npr. CD) pa prihaja do

navidezne nezdružljivosti med tema vrednostima, ki jo je mogoče logično pojasniti z

v plivom zunanje skupine, ki je bila vključena v izračun nukleotidnih divergenc.


59

Tabela 9 Matrika parnih sekvenčnih divergenc, izraženih v odstotkih (pod osnovno diagonalo) in število ter vrste mutacij (I = tranzicija, Z = transverzija in D = delecija) med pari genotipov postrvi in atlantskega lososa (nad glavno diagonalo).

Genotip A B C D E F I Z D Σ I Z D Σ I Z D Σ I Z D Σ I Z D Σ

A 1 - - 1 1 1 - 2 2 1 1 4 1 2 - 3 10 4 1 15

B 0.20 - 1 - 1 1 1 1 3 - 2 - 2 9 4 1 14

C 0.88 0.88 1 - 1 2 - 1 - 1 9 3 1 13

D 1.20 1.21 1.21 - 1 1 2 8 3 2 13

E 1.05 1.05 1.05 1.21 8 4 1 13

F 8.84 8.50 7.82 10.20 8.16

Tabela 10 Nukleotidne divergence med nekaterimi skupinami genotipov in znotraj njih

Genotipi Nukleotidna divergenca (%) Standardna devijacija

ABCDE 0.99 ±0.31

ABCE 0.85 ±0.33

ABC 0.65 ±0.39

D/ABCE 1.21 ±0.01

D/ABC 1.21 ±0.01

E/ABC 1.05 ±0.00

C/ABDE 1.01 ±0.16

Grafični prikaz sorodstvenih odnosov med genotipi je ponazorjen z dvema

filogenetskima drevescema (sliki 8 in 9), izdelanima na osnovi parnih distanc. Prvo

filogenetsko drevesce smo skonstruirali po metodi UPGMA, drugo pa po metodi

Neighbour-Joining (Saitou in Nei, 1987). Iz obeh dendogramov je videti le eno

izrazito grupacijo, ki jo tvorita genotipa A in B. Glede razvrščanja genotipov C, D in

E se oba drevesca med seboj precej razklikujeta. Iz prvega dendograma lahko

razberemo, da je s filogenetskega stališča najstarejši genotip D, sledita pa mu genotipa

E in C. Glede na drugi dendogram pa se je od skupnega prednika pričujočih petih


60

genotipov prvi ločil genotip C, ki je tudi najbližji genotipu atlantskega lososa; genotip

D pa je mlajši od genotipa E in starejši od genotipov A in B. Če zanemarimo časovna

opredeljevanja, vidimo, da sta si dendograma med seboj bolj podobna; oba govorita o

več ali manj enaki medsebojni oddaljenosti genotipov C, D in E, kar kaže na njihovo

relativno dolgo obdobje samostojnega in ločenega razvoja. Povdarjeno monofiletsko

identiteto kažeta genotipa E in D, pri čemer zadnji izstopa po svojem najizrazitejšem

odstopanju od vseh ostalih genotipov.

A

B

C

E

D

F

Slika 8 Filogenetsko drevesce, izdelano na osnovi metode UPGMA, ki prikazuje sorodstvene odnose med genotipi A, B, C, D, E in F.

D

F

.228

.278

.3583.61

.310

.875

4.70

Slika 9 Filogenetsko drevesce, izdelano na osnovi metode Neighbour-Joining, ki prikazuje sorodstvene odnose med genotipi A, B, C, D, E in F.


61

4.1.4 Restrikcijska analiza

Glede na različna restrikcijska mesta, značilna za posamezen genotip, smo izbrali

restrikcijske encime, s katerimi je mogoče nekatere genotipe zanesljivo določati na

osnovi restrikcijske analize (tabela 11).

Tabela 11 Diagnostični restrikcijski encimi za določanje posameznih genotipov. Številke v oklepajih se nanašajo na polimorfna mesta s tabele 6.

Genotip

Encim Restrikcijsko mesto A B C D E

Sma I CCC!GGG (9, 10) � - - - -

Ava I C!Y1CGR2G (9, 10) � � - - -

Alu I AG!CT (12) � � � - -

Mme I TCCRAC (12) - - - � -

Z encimi Sma I, Ava I in Alu I je mogoče razlikovali med genotipi A, B in C (slika

10). Ker je encim Mme I komercialno zaenkrat nedostopen, je mogoče na genotip D

ali E upravičeno sklepali v primerih, ko restrikcija z enim od omenjenih treh encimiov

ne poteče (slika 10). V primerih diagnosticiranja soške postrvi na osnovi genotipa D

je zamenjava z genotipom E malo verjetna, saj je le-ta karakterističen za ohridsko

postrv.

Amplifikati, ki jih cepita encima Sma I ali Ava I, vsebujejo po eno restrikcijsko mesto

za posamezen encim; poleg Alu I-restrikcijskega mesta, ki specifično opredeljuje

genotipe A, B in C, se pri vseh amplifilkatih pojavlja še eno tako mesto, ki genotipsko

ni specifično, in povzroča nastanek približno 50 bp dolgega fragmenta. Ta je na

agaroznem gelu zelo slabo viden (slika 10).

1 Y = C ali T 2 R = A ali G


62

Sma I Ava I Alu I

Slika 10 Restrikcijska analiza amplificiranega dela kontrolne regije mt DNA z encimi Sma I, Ava I in Alu I. Vzorci od leve proti desni: genotipi A, B, C, D in velikostni marker 100 bp.

4.2 ANALIZA MIKROSATELITNE DNA

4.2.1 Kloniranje

Elektroforetska ločitev fragmentov genomske DNA soške postrvi, ki smo jih dobili z

restrikcijo DNA z endonukleazo Sau3A I, je prikazana na sliki 11. Prikazan je tudi

interval s fragmenti DNA, ki so bili po velikosti primerni za izdelavo DNA biblioteke

in izolirani iz gela (slika 11).


63

Slika 11 Zgoraj: Elektroforetska ločitev genomske DNA soške postrvi, razrezane s Sau3A I. Spodaj: Izolacija DNA fragmentov za genomsko biblioteko. Vzorca z zap. št. 1 in 11 sta velikostna markerja (100 bp), vzorec št. 12 je nerazrezana genomska DNA soške postrvi.

Pri kloniranju smo dobili približno 3000 transformiranih klonov E. coli, od katerih jih

je približno polovica vsebovala inserte genomske biblioteke soške postrvi (slika 12).

1 2 3… ...11 12


64

Slika 12 Kloni E. coli; kolonije z inserti so svetle (foto: Andreja Ramšak)

S simultanim testiranjem biblioteke s sondami, specifičnimi za mikrosatelite CA in

GA, smo identificirali 22 pozitivnih klonov (slika 13). Glede na teoretično poprečno

velikost insertov DNA, ki je bila 350 bp, in glede na število pozitivnih klonov smo

tisti del genoma, na katerem smo iskali mikrosatelite, ocenili na ∼525000 bp. Če

upoštevamo, da smo v tem delu genoma našli 22 CA- in GA-mikrosatelitov in če

privzamemo, da je velikost haploidnega genoma salmonidov približno 2,5.109 bp

(Atkin in sod., 1965; Estoup in sod., 1993) ter da so CA- in GA-mikrosateliti

sorazmerno enakomerno razporejeni po genomu, lahko izračunamo, da se v DNA

soške postrvi nahaja ∼105000 CA- in GA-mikrosatelitov oziroma en AC- ali GC-

mikrosatelit na približno vsakih 24000 bp.


65

Slika 13 Replike pozitivnih bakterijskih kolonij na rentgenskem filmu.

4.2.2 Analiza DNA insertov

Velikost DNA insertov v klonih smo ugotavljali s polimerazno verižno reakcijo, pri

čemer smo uporabljali univerzalna oligonukleotidna začetnika T3 in T7, specifična za

vektor. Velikost DNA insertov, ki smo jo določili po gelski elektroforezi

amplifikatov, se je gibala med ∼230 in ∼1200 bp (slika 14). Glede na to, da so vsi

inserti vsebovali plazmidna konca s skupno velikostjo 163 bp, in da so bili najdaljši

klonirani fragmenti dolgi ∼700 bp, so bile maksimalne pričakovane dolžine

amplifikatov ∼900 bp. Pojav večjih amplifikatov so verjetno povzročili inserti

konkatemerov, ki so nastali kot eden izmed možnih produktov ligacije. Za

sekvenciranje smo odbrali inserte s pričakovano velikostjo in s specifičnim

monomorfnim odzivom v PCR, ki smo ga pri nekaterih vzorcih dosegli šele po

optimizaciji PCR (slika 15).


66

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A:

B:

Slika 14 Ocenjevanje velikosti DNA insertov z gelsko elektroforezo. V nadaljno analizo smo vključili vzorce s sledečmi zap. št. in pripadajočimi oznakami: A6: 3/77; A10: 5/79; B1: 3/81; B4: 4/56; B7: 5/65; B10: 10/9. Vzorci A8, A16 in B8, B13 so velikostni markerji (100 bp).

Slika 15 Rezultat optimiziranja PCR pri vzorcih 3/81 in 4/35. 1 in 4: nemodificirana PCR; 2 in 5: zmanjšana koncentracija MgCl2 za polovico; 3 in 6: zmanjšana koncentracija vseh komponent PCR za polovico; 7: velikostni marker (100 bp). Značilnosti šestih sekvenciranih insertov so zbrane v tabeli 12. Štirje inserti vsebujejo

po en popoln mikrosatelit s ponavljajočo se enoto TG/CA (slika 16). Insert 5/79 ima

1 2 3 4 5 6 7


67

nepopolen mikrosatelit (slika 16), ki ga prekinja nukleotid A. Za insert 10/9 pa je

značilen kompleksen mikrosatelit, ki ga tvorita dva popolna TG-mikrosatelita, med

katerima se nahaja krajši AG-ponavljajoči se motiv in 15 nukleotidov, med katerimi je

mogoče prepoznati nepopolen TG-mikrosatelit, ločen z dinukleotidom CA. Pri večini

klonov smo v bližini osredje ponavljajoče se regije opazili še dodatne krajše

dinukleotidne motive (slika 16).

Tabela 12 Nekatere lastnosti šestih kloniranih DNA insertov. Razen v označenem primeru je bila dolžina sekvence ugotovljena s sekvenciranjem.

Klon Dolžina inserta1(bp) Osrednja sekvenca

3/77 237 (TG)14

3/81 307 (CA)60

4/56 6002 (TG)60

5/65 261 (TG)21

5/79 268 (GT)10AT(GT)2

10/9 478 (TG)13(AG)4(TG)2CA(TG)2CGAC(TG)12

1 V dolžino fragmenta ni vključen 163 bp dolg plazmidni del. 2 Dolžina inserta, določena na osnovi velikostnega markerja.


68

G A T C G A T C

a

b

c

c

I II

Slika 16 Nukleotidni sekvenci dveh mikrosatelitov s sosednima regijama. I: insert 3/77; II: insert 5/79; a: popolen mikrosatelit; b: nepopoln mikrosatelit; c: dodatni krajši dinukleotidni motivi.

4.2.3 Oligonukleotidni začetniki

Struktura nukleotidnih regij, ki obdajajo mikrosatelite, je omogočala izdelavo parov

oligonukleotidnih začetnikov za amplifikacijo vseh sedmih mikrosatelitnih lokusov

(tabela 13). PCR smo zaenkrat uspeli optimirati le pri lokusih 3/77 in 10/9.


69

Tabela 13 Oligonukleotidni začetniki, načrtovani za amplifikacijo sedmih mikrosatelitnih lokusov

Mikrosatelitni lokus1 Par oligonukleotidnih začetnikov Uspešnost

amplifkacije 3/77 5’

GCATGATGTGAGGGTCTA3’

5’TTGACTGCACTATGTATTGAC

3’ �

3/81 5’TGAAAACAGAGTGACCCAAG

3’

5’CAGTGTCTCTACCTCGGAAC

3’

-

4/56 5’AGCAGGGGACGAGATTTAGC

3’

5’CCTTCTGAGAATACATCCACATC

3’

-

5/65 5’GTTTGAATGAGCCATCTGC

3’

5’GTGAATGTGTAAAAATACAAAAACGG

3’ -

5/79 5’CAAGTCCAACTGAATATATTTGAG

3’

5’ATAAAATGGACTGACGGGGAG

3’

-

10/9 5’TTTGGAATGATATGGATATGG

3’

5’CTTACAGCCACCTTTATGCG

3’

�

1 Mikrosatelitne lokuse smo poimenovali po klonih oz. insertih, kjer se ti nahajajo.

4.2.4 Analiza mikrostelitnega polimorfizma

Alelni polimorfizem smo opazili pri obeh preučevanih mikrosatelitnih lokusih (3/77

in 10/9; sliki 17 in 18). Aleli in genotipi, ki smo jih našli na omenjenih lokusih, ter

njihova zastopanost znotraj posameznih populacij postrvi, so prikazani v tabelah 14 in

15.


70

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

122

118126

120122

118

Slika 17 Alelni polimorfizem na lokusu 3/77. 1, 2, 7, 8, 10 in 11: potočna postrv donavskega tipa; 3, 4, 5 in 13: atlantska potočna postrv; 6 in 12: ohridska postrv; 9: soška postrv. Velikosti alelov v bp so podane na robovih.

Slika 18 Alelni polimorfizem na lokusu 10/9. 1 in 2: ohridska postrv; 3-5: potočna postrv iz ribogojnice; 6-10: potočna postrv iz Iške ali Mahnečice; 11: križanec med soško in potočno postrvjo; 12-16: soška postrv. Velikosti alelov v bp so podane na robovih.


71

Tabela 14 Porazdelitev alelov in genotipov na lokusu 3/77 glede na različne populacije postrvi. Z = Zadlaščica; T = Trebuščica; I = Iška; M = Mahnečica; MtL = Ribogojnica Mt. Lassen, Kalif.; Pv = Ribogojnica Povodje; Oh = Ohridsko j.; X = križanec soška x potočna postrv.

Soška postrv Potočna postrv Aleli Z T I M MtL Pv Oh X ΣΣΣΣ 118 6 6 12 120 4 4 122 9 7 16 126 24 16 3 13 2 58 ΣΣΣΣ 24 16 12 20 6 6 4 90

Genotipi Z T I M MtL Pv Oh X ΣΣΣΣ 118/118 3 3 6 120/120 2 2 122/122 4 1 5 122/126 1 5 6 126/126 12 8 1 4 1 26

ΣΣΣΣ 12 8 6 10 3 3 2 1 45

Na lokusu 3/77 smo našli štiri alele in pet različnih genotipov: štiri homozigote in en

heterozigot. Celokupna heterozigotnost lokusa 3/77 znaša 0.13 in je v neskladju s

Hardy-Weinbergovim ravnotežjem. Celokupna vrednost vrednost PIC (polymorphic

information content) je 0.48.

Alel 118 smo ugotovili samo pri vzorcih iz ribogojnic Povodje in Mt. Lassen. Vsi ti

vzorci so bili na omenjenem lokusu homozigotni in so izražali izključno alel 118.

Alel 120 je bil karakterisičen le za vzorca ohridske postrvi in je pri tej populaciji

predstavljal edino genetsko varianto.

Alel 122 smo našli samo pri potočnih postrveh iz Iške in Mahnečice. Pri teh dveh

populacijah smo zasledili tudi alel 101 in vse tri možne genotipe, ki jih omenjena alela

lahko sestavljata. Hkrati sta to edini vzorčni populaciji, pri katerih so bili na tem

lokusu osebki heterozigotni.

Alel 126 smo odkrili tudi pri vseh vzorcih obeh populacij soške postrvi ter pri

križancu med soško in potočno postrvjo. Ta alel je edina genetska forma lokusa 3/77,

ki smo jo našli pri soški postrvi.

Tabela 15 Porazdelitev alelov in genotipov na lokusu 10/9 glede na različne populacije postrvi. Z = Zadlaščica; T = Trebuščica; I = Iška; M = Mahnečica; MtL =


72

Ribogojnica Mt. Lassen, Kalif.; Pv = Ribogojnica Povodje; Oh = Ohridsko j.; X = križanec soška x potočna postrv.

Soška postrv Potočna postrv

Aleli Z T I M MtL Pv Oh X ΣΣΣΣ 202 15 6 21 204 6 25 31 206 3 3 212 61 1 1 63 216 6 20 6 2 34 218 1 1 220 1 1 1 3 224 3 1 4 228 1 1 232 1 1 236 1 1 238 1 1 ΣΣΣΣ 82 32 12 20 6 6 4 2 164

Genotipi Z T I M MtL Pv Oh X ΣΣΣΣ 202/202 1 1 202/204 2 3 5 202/212 13 1 14 204/204 11 11 204/212 4 4 206/216 1 1 206/220 1 1 206/236 1 1 212/212 22 22 212/220 1 1 216/216 2 10 3 15 216/220 1 1 216/224 1 1 216/238 1 1 218/232 1 1 224/224 1 1 224/228 1 1

ΣΣΣΣ 41 16 6 10 3 3 2 1 82

Lokus 10/9 je relevanten diagnostični marker, ki omogoča razlikovanje med

taksonoma marmoratus in f. fario. Izraža relativno visok polimorfizem, ki ga

karakterizira vsaj 12 alelov. Vrednost PIC znaša 0.72, celokupna heterozigotnost pa

0.39 (tabela 16). Ta vrednost se statistično signifikantno razlikuje od izračunane

heterozigotnosti, ki temelji na Hardy-Weinbergovem ravnotežju.


73

Aleli, karakteristični samo za soško postrv, so 202, 204 in 212. Drugih alelov pri soški

postrvi nismo zasledili. Frekvence, s katerimi se ti aleli pojavljajo v populacijah iz

Zadlaščice in Trebuščice, so prikazani v tabeli 16. Očitno je, da se populaciji med

seboj zaznavno razlikujeta v pogostnosti pojavljanja teh treh alelov. Te razlike so tudi

statistično potrjene (χ2 = 63.9; P < 0.001). V Zadlaščici prevladuje alel 212, medtem

ko se alel 204 tu le redko pojavlja. Ravno obratno je stanje v Trebuščici, kjer se alel

204 pojavlja v veliki večini, alel 212 pa je zelo redek. Ta alel se je pojavljal tudi kot

ena izmed dveh genetskih variant, ki smo jih našli pri križancu med soško in potočno

postrvjo. Frekvenca alela 202 je pri obeh populacijah približno enaka.

Heterozigotnost znotraj populacije iz Zadlaščice je 0.46, znotraj populacije iz

Trebuščice pa 0.25 (tabela 16). Obe vrednosti statistično signifikantno odstopata od

Hardy-Weinbergovega ravnotežja.

Preostali aleli lokusa 10/9 (tabela 16) so značilni za potočno postrv. Najbolj pogost je

alel 216, ki smo ga našli pri vseh preučevanih populacijah potočne postrvi razen pri

ohridski postrvi. Pri vzorcih iz Mahnečice in ribogojnice Mt. Lassen je to edini

prisoten alel, pri vzorcih iz Iške pa se pojavlja s frekvenco 0.5.

Aleli 206, 236 in 238 ter 218, 228 in 232 so sorazmerno redki; prvi trije so značilni le

za postrvi iz Iške, preostale tri pa smo našli samo pri ohridski postrvi. Alel 220 smo

zasledili pri enem vzorcu iz Iške in pri enem iz ribogojnice Povodje ter pri križancu

med soško in potočno postrvjo.

Največja variabilnost na lokusu 10/9 znotraj posameznih populacij je pri vzorcih iz

Ohridskega jezera (4 aleli; PIC = 0.70) in iz Iške (5 alelov; PIC = 0.62). Nekoliko

manjša je pri vzorcih iz ribogojnice Povodje (3 aleli; PIC = 0.54) ter iz Zadlaščice (3

alelei; PIC = 0.36) in Trebuščice (3 alelei; PIC = 0.31). Vzorčni populaciji iz

Mahnečice in ribogojnice Mt. Lassen sta na tem lokusu monomorfni (tabela 17).


74

Tabela 16 Opažene frekvence alelov lokusa 10/9 pri različnih populacijah postrvi. Z = Zadlaščica; T = Trebuščica; I = Iška; M = Mahnečica; MtL = Ribogojnica Mt. Lassen, Calif.; Pv = Ribogojnica Povodje; Oh = Ohridsko j.; X = križanec soška x potočna postrv.

Aleli Z T I M MtL Pov OH ΣΣΣΣ 202 0.183 0.188 0.128 204 0.073 0.781 0.189 206 0.250 0.018 212 0.744 0.031 0.384 216 0.500 1.000 1.000 0.333 0.207 218 0.250 0.006 220 0.083 0.176 0.018 224 0.500 0.250 0.024 228 0.250 0.006 232 0.250 0.006 236 0.083 0.006 238 0.083 0.006 H

1 0.46 0.25 0.39

PIC2 0.36 0.31 0.62 0.00 0.00 0.54 0.70 0.72

1 H: heterozigotnost; izračunana je le za skupine z več kot 30 vzorci. 2 PIC: polymorphic information content


75

5. DISKUSIJA

Osnovni namen pričujoče raziskave je bil poiskati in opredeliti genetske razlike med

soško in potočno postrvjo. Temu cilju je bil tudi podrejen primarni koncept zbiranja

vzorcev, ki je vključeval približno polovico primerkov iz ene skupine in prav toliko iz

druge skupine živali. Želeli smo, da bi v obeh skupinah zajeli čim več notranjega

polimorfizma, ki pa ga je v eni sami populaciji postrvi, omejeni na majhen življenski

prostor, sicer značilen za večino slovenskih voda, težko pričakovati. Naključni tok

genov v takih okoliščinah slej ko prej pripelje do fiksacije enega izmed alelov, poleg

tega pa k monomorfnosti genotipov pripomore tudi efekt ozkega grla (angl. bottleneck

effect), ki je pri ribjih populacijah, živečih v omejenem okolju, zelo verjeten. Zato

smo se odločili za vzorčenje na več različnih mestih, ki med seboj niso neposredno

povezana. Pri tem smo se osredotočili na tiste populacije, o katerih že obstajajo

določeni neposredni ali posredni podatki, zbrani v preteklih raziskavah. Tako smo

poleg dveh osnovnih skupin soške in potočne postrvi dobili tudi več manjših, med

katerimi so nekatere zastopali le trije ali celo samo dva primerka. Zavedamo se, da

kakršnikoli zaključki na osnovi tako majhnega števila vzorcev niso statistično

značilni. Kljub temu pa so v nekaterih primerih izredno zanimivi in kažejo na

nekatere trende, ki se zdijo logični in bi lahko prispevali k oblikovanju osnutka

prihodnjih podobnih raziskav. Zaradi tega smo v diskusijo vključili tudi te podatke, s

tem da se vseskozi zavedamo njihove možne spekulativnosti in do njih ohranjamo

primerno distanco.

5.1 MITOHONDRIJSKA DNA Genotip D je prvi genetski marker, ki nedvoumno označuje populacije soške postrvi v

Sloveniji. Našli smo ga tako v Zadlaščici kot v Trebuščici, iz česar lahko sklepamo,

da ti dve populaciji izhajata iz skupnega prednika, ki je živel že pred geološkimi

dogajanji, ki so onemogočila stik med tema dvema populacijama. Genotip D so

odkrili tudi pri nekaterih populacijah soške postrvi v rekah severne Italije

(Bernatchez in sod., 1992). Tu so našli tudi rahlo spremenjeno različico genotipa D,

od katerega se ta loči po dodatni tranziciji; vendar ta genetska varianta ni bila značilna

za soško postrv temveč za gardsko. Kaže torej, da bi bil lahko genotip D diagnostičen


76

genetski marker, s katerim bi bilo mogoče opredeljevati različne populacije soške

postrvi na celotnem območju porečja severnega Jadrana. V bodoče bi bilo zanimivo

poiskati osebke soške postrvi še v porečju južnega Jadrana (Neretva) in preveriti, ali

je genotip D karakterističen tudi za to populacijo.

Pri vrednotenju mitohondrijskih genotipov kot genetskih markerjev je seveda treba

upoštevati dejstvo, da se le-ti dedujejo maternalno in zatorej ne povedo nič o poreklu

očetov. S pomočjo tovrstnih markerjev lahko torej nedvoumno le zanikamo določeno

poreklo osebka, ne moremo pa ga potrditi.

Naslednja zelo zanimiva genetska oblika je genotip E. V naši raziskavi smo ga

spoznali kot značilnega za ohridsko postrv. Ta genotip so v predhodnih raziskavah

(Bernatchez in sod., 1992) že našli v Ohridskem jezeru, poleg tega pa še pri nekaterih

populacijh avtohtone potočne postrvi nekaterih francoskih in italijanskih rek z izlivom

v Jadransko morje ter v Gardskem jezeru. Zastavlja se vprašanje, na kakšen način je ta

genotip osvojil tako obsežno področje, čeprav so vodotoki, ki jih naseljuje, med seboj

popolnoma ločeni z Jadranskim morjem, potočne postrvi z ustaljenim načinom

življenja pa praviloma ne zahajajo v morje. Ena izmed možnih razlag se sklicuje na

geološko strukturo območja današnjega jadranskega morja v času zadnje ledene dobe

v pleistocenu (pred ∼750000 leti), ko je bil ta predel kopno vse do “Jabučke kotline”

(zemljepisna širina današnjega Splita), kjer se je reka Pad izlivala v morje

(D’Ambrosi, 1969; Sala, 1988). Na tak način je bil ustvarjen stik med takratnimi

južnimi vodotoki reke Pad in bližnjimi vodotoki Jadranskega porečja (npr. reka

Neretva) z njenim alpskim porečjem. S to hipotezo je logično razložena prisotnost

soške postrvi v Neretvi, teže pa z njo pojasnimo omenjeno razpršenost genotipa E.

Razdalja med “Jabučko kotlino” in reko Bojano, ki povezuje Ohridsko jezero z

Jadranskim morjem, je namreč približno dvakrat daljša kot razdalja med “Jabučko

kotlino” in reko Neretvo. Malo pa je verjetno, da bi neanadromna populacija potočne

postrvi s selitvijo preko morja kolonizirala tako oddaljena mesta. Druga razlaga

domneva, da je genotip E relativno stara genetska forma, vezana na anadromno obliko

postrvi (Salmo trutta mediterranea), ki je živela v Jadranskem morju že v pliocenu

(pred več kot miljon leti) in je izumrla v zadnji interglacialni dobi pred 300000 leti

(Apostolidis in sod., 1996). Ta naj bi preko morja kolonizirala obsežna področja

jadranskega porečja. Obstajajo dokazi (Giuffra in sod., 1994), da je ta populacija v


77

severno italijanskih rekah živela v parapatričnem1 odnosu s soško postrvjo in z njo

ustvarila nekaj hibridnih con, npr. v Gardskem jezeru. Sicer pa naj bi se omenjeni

populaciji med seboj ne križali, čeprav mehanizem, ki bi njuno hibridizacijo

preprečeval, ni poznan (Giuffra in sod,, 1996). Po hipotezi, ki jo zagovarjata

Largiadèr in Scholl (1995), in ki prvenstveno temelji na rezultatih Giuffre in sod.

(1993), naj bi šele potočne postrvi z atlantskim poreklom, ki so bile vložene v biotop

obeh avtohtonih populacij, premostile njune reproduktivne bariere; atlantske postrvi

se namreč uspešno križajo z obema nativnima formama, s čimer je med njima

posredno ustvarjena prosta pot za izmenjavo genov. Glede na omenjene predpostavke

in ugotovitve bi bilo zanimivo preučiti tudi križance med soško in potočno postrvjo v

porečju Soče in na osnovi dobljenih genotipov kontrolne regije mtDNA analizirati

njihovo poreklo. Na ta način bi lahko osvetlili zgodovinski potek različnih

populacijskih dogajanj v porečju Soče.

Naslednja populacija postrvi, ki na preiskovani mtDNA regiji ne odraža

polimorfizma, izhaja iz ribogojnice Povodje. Vse analizirane vzorce karakterizira

genotip C, ki je značilen za atlantski tip postrvi (Bernatchez in sod., 1993). Zanimivo

je, da so se vsi osebki, ki smo jih vzorčili v tej ribogojnici, pigmentacijsko očitno

razlikovali od avtohtone potočne postrvi na Slovenskem (slika 19). Najbolj opazne so

bile naslednje fenotipske različice: izostanek rdečih pik, srebrno siva podlaga in gosta

posejanost črnih pik po celem telesu (slika 20).

Slika 19 Donavski tip potočne postrvi (foto: Andreja Ramšak)

1 Parapatričen = soseden, vendar ne prekrivajoč se


78

Slika 20 Atlantski tip potočne postrvi (foto: Andreja Ramšak)

Iz osebnih informacij direktorja ribogojnice in mag. Mete Povž smo izvedeli, da ta

populacija postrvi izvira iz atlantskega porečja in je bila v ribogojnico Povodje

prinešena v drugi polovici 80-ih let. Tako je prisotnost atlantskega genotipa v tej

ribogojnici logično pojasnjena. V obstoječo plemensko jato, ki je temeljila na

avtohtoni postrvi, so vključili izključno ženske osebke uvožene populacije. Zato lahko

pričakujemo, da velika večina nastalega potomstva nosi atlantski genotip, čeprav

fenotipske razlike zaradi križanja z avtohtonimi samci ne prihajajo vedno do izraza.

Genotip C smo našli tudi pri nekaterih potočnih postrveh iz Iške. Glede na to, da je ta

voda redno poribljana s potočnimi postrvmi iz ribogojnice Povodje, je pojav genotipa

C tudi na tej lokaciji povsem razumljiv. Težje je razložiti prisotnost tega genotipa v

potoku Mahnečica, za katerega smo predpostavljali, da v njem ni neavtohtonih tipov

potočne postrvi. Čeprav sicer kaže, da je delež genotipa C tu zelo majhen in mogoče

statistično gledano zanemarljiv, je s filogenetskega stališča ključnega pomena, kako je

le-ta zašel v vode donavskega porečja. Njegovo pojavljanje znotraj donavskih

populacij potočnih postrvi bi namreč lahko kazalo na starodavno poreklo genotipa C

na tem področju oz. na skupen ancestralni izvor obeh populacij. Po drugi strani pa je

nemogoče dokazati, da genotip C ni rezultat nezabeleženega vnosa postrvi atlantskega

tipa v njene neavtohtone vode.

Večinska genetska varianta, ki smo jo opazili v Mahnečici, je genotip B. Do sedaj je

bil najden izključno v donavskem porečju. Poleg genotipa B se v donavskih vodah


79

pojavlja tudi njegova rahlo spremenjena varianta A, ki je prav tako značilna za postrvi

iz tega rečnega sistema. Oba genotipa smo našli v Iški. Odsotnost genotipa A v

Mahnečici ni presenetljiva in jo lahko razložimo z dejstvom, da je bil ta potok kot del

kraškega ponikalnega sistema že od davne preteklosti izoliran od preostalih donavskih

vodotokov. Poleg tega je Mahnečica majhen potok z velikimi nihanji v vodostaju ter z

naravnimi preprekami, ki preprečujejo migracijo rib proti toku, in kot tak predstavlja

biotop, ki je zelo podvržen efektu ozkega grla (angl. bottleneck effect).

Eden izmed večjih problemov pri interpretaciji polimorfizma variabilnega

nekodirajočega dela mtDNA je, kako verodostojno ovrednotiti posamezne tipe

mutacij. Mutacije v tej regiji so večinoma točkovne in nastopajo kot substitucije in

delecije oz. insercije. Te mutacije nastajajo kot posledica napačnega parjenje

nukleotidov v procesu replikacije (angl. mismatch), ali kot posledica spontanih

mutacij, ki niso vezane na replikacijo, in nastanejo v glavnem zaradi nukleotidne

depurinizacije in/ali deaminacije (Alberts in sod., 1994; Li in Grauer, 1991). Te

napake odpravlja vrsta mehanizmov za popravljanje DNA, ki temeljijo na

prepoznavanju in izrezovanju napačnega nukleotida ter na polimerizaciji in ligaciji

novega ustreznega. Med ekscizijo in polimerizacijo nastopa kratek časovni interval,

ko se na niti DNA pojavlja prazen nukleotidni prostor.

Popravljalni mehanizmi so zelo učinkoviti, niso pa stoodstotno zanesljivi. Če napake

ne popravijo do naslednje replikacije DNA, je mutacija na nek način legalizirana in

vključena v normalen proces nadaljnega podvojevanja. Take mutacije v zarodnih

celicah povzročajo spremembe v genomu nastalih potomcev.

Pri napakah, ki nastajajo zaradi napačnega parjenja nukleotidov med replikacijo, so

bolj verjetne tiste substitucije, ki so s termodinamičnega vidika bolj kompetitivne:

npr. na adenin se namesto timina (pirimidin) lažje veže in tam obstane citozin

(pirimidin) kot gvanin ali adenin (purina), saj prvi povzroči manjšo sterično

konformacijsko spremembo DNA molekule, kot bi jo druga dva.

Iz navedenega lahko zaključimo, da so v nekodirajočih regijah DNA tranzicijske

substitucije favorizirane v primerjavi s transverzijskimi.

Obstaja še en mehanizem, ki prav tako povzroča prevlado tranzicij nad transverzijami.

Gre za deaminacijo metiliranega citozina, ki se ob tem spremeni v timin (slika 21).

Metilirani citozini so pri vretenčarjih pogosti; pojavljajo se večinoma v dinukleotidih

5’-CG-3’in zelo verjetno igrajo represorsko vlogo pri transkripciji genov (Kleinsmith


80

in Kish, 1995). Ta fenomen še dodatno poveča delež tranzicij v primerjavi s

transverzijami.

5-metil citozin timin

Slika 21 Deaminacija metiliranega citozina v timin

Točkovne mutacije lahko nastopajo tudi kot delecije. Hipotetično se tovrstne mutacije

lahko obdržijo v primeru, ko replikacija DNA doseže na pol popravljeno mutacijsko

mesto, ki je v fazi manjkajočega nukleotida. Seveda je časovno gledano ta dogodek v

primerjavi z dogodkom, ko je v DNA vključen napačen nukleotid, bistveno krajši in

so zato tudi tovrstne mutacije manj pogoste.

Očitno je torej, da smer in vrsta mutacij v nekodirajoči DNA nista naključna dogodka:

substitucije so pogostejše od delecij oz. insercij, med substitucijami so tranzicije

pogostejše od transverzij (čeprav je le-teh teoretično dvakrat več), znotraj tranzicij pa

prevladujejo substitucije C→T (Li in Graur, 1991). Popolnoma je torej jasno, da je pri

ocenjevanju divergence nekega para DNA sekvenc potrebno upoštevati pogostnost

pojavljanja posameznih tipov mutacij in jim na tej osnovi dati primerno težo (Irwin in

sod., 1991; Disotell in sod., 1992).

Vendar pa ocenjevanje divergence na tak način ni vedno zanesljivo in korektno.

Upoštevati je namreč treba dejstvo, da se po določenem času mutacije začnejo

kopičiti, pri čemer nastajajo posamezne, večkratne, hkratne, vzporedne, konvergentne

in povratne substitucije (slika 22).


81

A

C

T

G

A

A

C

G

T

A

A

C

G

C

A A

C C-A Posamezna substitucijaT T

G G

A-C-T A Večkratne substitucijeA A

C-G C-A Hkratni substitucijiG G

T-A T-A Vzporedni substitucijiA A

A-C-*T A-*T * = Konvergentna substitucijaC C

G G

C C-T-*C * = Povratna substitucija

A A

C-A

T T

G G

T-A

A A

G-A

G G

A A

A A

T T

C C

G G

C C

Slika 22 Različne vrste nukleotidnih substitucij

Če je stopnja divergence med dvema nukleotidnima sekvencama majhna, je možnost,

da pride na določenem mestu do več kot ene substitucije, zanemarljiva in število

opaženih substitucij med dvema sekvencama bi moralo sovpadati z dejanskim

številom substitucij. Nasprotno je v primeru velike divergence zelo verjetno, da je

opaženo število razlik manjše od dejanskega, kar je posledica večkratnih substitucij,

ki so se zgodile na istem mestu. V takih primerih prihaja do navideznega upadanja


82

števila substitucij in seveda tudi do neujemanja med pričakovanimi in dejanskimi

frekvencami posameznih tipov substitucij, katerih delež se postopoma izenačuje.

Točkovne delecije zaradi svoje nizke frekvence pojavljanja skozi evolucijo ohranjajo

svojo prvobitnost veliko dlje kot substitucije. Zato so za ocenjevanje različnosti

sekvenc DNA, pri katerih je že prišlo do akumulacije substitucij, načelno veliko bolj

informativne in primernejše kot substitucije. Če so delecije enakomerno razporejene

med primerjanima sekvencama in med seboj primerno oddaljene, je njihova identiteta

nesporna. Kadar pa pri vsaki od primerjanih sekvenc DNA zasledimo po eno

točkovno delecijo, ki sta med seboj ločeni le z enim ali nekaj nukleotidi, je

opredelitev mutacije lahko dvolična; tako mutacijo je namreč mogoče interpretirati

tudi kot substitucije vmesnih nukleotidov. V dvoumnih primerih je na osnovi

zakonitosti, ki jim podlegajo mutacije, mogoče oceniti, katera izmed možnosti je bolj

verjetna (Li in Graur, 1991).

Če torej prihaja pri primerjanju sekvenc DNA do neujemanja med pričakovanimi in

opaženimi frekvencami posameznih tipov mutacij, in če se poleg substitucij na

omenjeni DNA regiji pojavljajo tudi točkovne delecije, je zelo verjetno, da je vzrok za

to neujemanje kopičenje substitucij; v primeru, da delecij ni, je verjeten vzrok za

omenjeno neskladje nereprezentativen vzorec oz. premajhno število primerjanih

sekvenc DNA ali prekratka DNA regija primerjanih sekvenc.

V tej raziskavi smo se odločili za upoštevanje vseh treh vrst mutacij, saj gre za

medsebojno zelo sorodne populacije ali vrste, pri katerih čas ločenega razvoja

verjetno še ni vplival na tranzicijsko zasičenje. Filogenetsko težo smo posameznim

mutacijskim tipom dodeljevali na osnovi recipročne vrednosti frekvence njihovega

pojavljanja na območju raziskovane DNA. S takšnim načinom vrednotenja mutacij se

strinja večina sodobnih avtorjev (Meyer in Wilson 1990; Irwin in sod., 1991; Allard in

Honeycutt, 1992). Poleg podatkov, ki smo jih o zastopanosti posmeznih mutacij dobili

preko lastnih rezultatov, smo upoštevali tudi literaturne podatke (Bernatchez in sod.,

1992), s čimer smo se želeli čim bolj približati realnemu številu obstoječih genetskih

variant. Te smo ocenjevali pri soški postrvi in različnih populacijah potočnice ter pri

atlantskem lososu, šarenki in lipanu. Primerjalne analize so se ujemale s pričakovanim

trendom pojavljanja posameznih vrst mutacij: inverzije so ohranjale svoj večinski

delež na intraspecifični ravni. Med vrstami znotraj posameznega rodu smo opazili

relativen upad tranzicij glede na transverzije, med rodovi pa je bila frekvenca obeh

vrst opaženih substitucij več ali manj enaka. Točkovnih delecij na intraspecifičnem


83

nivoju nismo opazili; našli pa smo jih med sorodnimi vrstami (eno med soško in

potočno postrvjo in dve med soško postrvjo in atlantskim lososom), na nivoju rodov

(9 med atlantskim lososom in šarenko) ter med družinami iz podreda Salmonoidae (24

med atlantskim lososom in lipanom).

S to analizo smo pokazali, da zakonitosti pojavljanja posameznih vrst mutacij veljajo

tudi za salmonide in opravičili kriterij, s katerim smo tehtali mutacijske tipe.

Na osnovi genetskih razdalj je po modelu molekularne ure1 mogoče med določenimi

populacijami računati čas njihove medsebojne divergence. To izračunavanje temelji

na Neievi formuli t = kD, kjer je t čas divergence, D = genetska razdalja in k =

konstanta oz. koeficient proporcionalnosti med t in D. Pri tem izračunavanju je seveda

najbolj problematična konstanta k, ki jo je brez oprejemljivih opornih točk iz

preteklosti (organske izkopanine, fosili) zelo težko natančno določiti. V takih primerih

k ocenjujejo posredno preko literaturnih virov, ki so na voljo za podobne organizme.

Tovrstni približki so precej pomanjkljivi in zaradi naslednjih vzrokov bistveno

zmanjšujejo verodostojnost samega izračuna: hitrost evolucijskega spreminjanja je

odvisna od posameznega taksona in njegove evolucijske zgodovine ter od opazovane

regije DNA; močan je vpliv zunanjih dejavnikov kot so hitrost izmenjave generacij,

številčnost populacije in socialna organiziranost taksona. Nadalje je uporaba

molekularne ure v določenih primerih pokazala, da hitrost evolucijskega spreminjanja

ni konstantna (Zajc, 1992). Kljub vsemu veliko raziskovalcev ta model delno

upošteva in ga uporablja vsaj za okvirne časovne opredelitve divergiranja posameznih

populacij. Pri ribah je koeficient k po nekaterih avtorjih ocenjen na ∼6.107 (Browen in

sod., 1979, b; Kocher in sod., 1989). Z drugimi besedami je molekularna ura pri

kontrolni regiji mtDNA pri ribah opredeljena kot ∼1.6 % sekvenčne divergence na

milijon let. Če zaupamo tej predpostavki, lahko na podlagi svojih rezultatov

izračunamo časovno obdobje, ko naj bi prišlo do razhajanja med populacijami, ki smo

jih opredelili z opaženimi genotipi. Teoretično naj bi se to zgodilo pred približno

600000 do 700000 leti. Natančnejša časovna opredeljevanja divergenc med

posameznimi genotipi ne bi bila smiselna, ker so razlike med genetskimi distancami

premalo izrazite. Gre le za približen časovni oris evolucijskega dogajanja med temi

populacijami, ki, kot kaže, sega v sredino pleistocena. To obdobje označuje velika

1 Molekularna ura = časovna povezava med razlikami v nukleotidnem zaporedju posameznih taksonov


84

ledena doba, ki so jo oblikovale štiri poledenitve z vmesnimi otoplitvami. Takratni

dogodki so močno vplivali na oblikovanje zemeljske površine tudi na širšem področju

današnjega Jadranskega morja (Steinenger in Rogl, 1984). Na ta način so se verjetno

precej spreminjali življenski prostor in razmere, v katerih so živele takratne populacije

postrvi, ki so se pod vplivom geoloških dogajanj morda pregrupirale, se ločile in bile

prisiljene živeti v izoliranem okolju s specifičnimi zahtevami in selekcijskimi pritiski.

Kaže torej, da se je začela diferenciacija predniških populacij postrvi v skupine, kot

jih poznamo danes, v več ali manj istem časovnem obdobju. Ob tej predpostavki se

zdi hipoteza o soški postrvi kot arhetipu preostalih populacij postrvi neutemeljena in

malo verjetna. Po drugi strani pa naši rezultati jasno kažejo na monofiletski izvor

soške postrvi in odražajo njeno ločeno evolucijsko vejo znotraj preostalega

populacijskega kompleksa Salmo trutta. Omenjene ugotovitve se v celoti skladajo z

rezultati Bernatcheza in sod. (1992), večinoma pa tudi tudi z izsledki Giuffre in sod.

(1996); edina razlika je v časovni opredelitvi začetka populacijske diferenciacije, do

katere naj bi po ocenah Giuffre prišlo pred tremi miljoni do enega miljona let.

Tudi nukleotidne divergence, ki smo jih izračunali znotraj posameznih populacij in

med njimi, se skladajo z rezultati Bernatcheza in sod. (1992). Soška postrv se na

preučevani regiji mtDNA od preostali populacij potočne postrvi, ki smo jih analizirali,

loči za poprečno 1.2 %, poprečna nukleotidna divergenca znotraj teh populacij znaša

0.85 %, interspecifična variabilnost med postrvjo in atlantskim lososom pa poprečno

8.7 %. Če upoštevamo navedene vrednosti nukleotidnih divergenc in privzamemo

oceno Gyllestena in Wilsona (1988), da se pri salmonidih nukleotidna divergenca

mtDNA giblje znotraj vrste od 0.1 do 2 %, med vrstami pa od 3 do 14 %, lahko

zaključimo, da soška postrv po tem kriteriju ne predstavlja samostojne vrste, ampak

tvori eno izmed oblik vrste S. trutta.

Glede na to, da so bile na populacijah soške postrvi iz Zadlaščice in Trebuščice že

izvedene nekatere aloencimske raziskave (Berrebi in sod., 1994), lahko naše rezultate

primerjamo z aloencimskimi in tako posredno sklepamo na učinkovitost enega in

drugega raziskovalnega pristopa.

Z aloencimskimi testi so pri analizi omenjenih dveh populacij soške postrvi izmed 31

preiskanih encimov našli le enega, s katerim so lahko ti dve populaciji zanesljivo

ločili od potočne postrvi. Gre za superoksid dismutazo (SOD) in alela 100 in 50, od

katerih je bil prvi značilen za potočno, drugi pa za soško postrv. Vendar pa je


85

diagnostična vrednost alela SOD-50 vprašljiva, odkar so ta alel našli tudi pri

avtohtonih populacijah potočne postrvi iz severnega dela Italije (Giuffra in sod., 1996)

ter pri ohridski postrvi in nekaterih potočnicah iz grške reke Alfios (Apostolidis in

sod., 1996).

Posebno zanimiv je tudi encim laktat dehidrogenaza 5 (LDH-5) z aleloma 105 in 120,

od katerih se je prvi izkazal kot značilen za soško postrv iz Zadlaščice, drugi pa za

soško postrv iz Trebuščice (Berrebi in sod., 1996). Vendar pa je alel 105 prisoten tudi

v sredozemskih in donavskih populacijah postrvi in je torej kot diagnostični marker za

soško postrv neprimeren. Vsekakor pa skupaj z encimom SOD in še nekaterimi

drugimi daje dober vpogled v nekatera evolucijska dogajanja na področju soškega

porečja.

Ugotovimo lahko torej, da so se v tem primeru aloencimske analize s filogenetskega

stališča pokazale kot bolj informativne od analiz mtDNA. Pri iskanju markerja, ki bi

bil diagnostičen za soško postrv, pa je bila učinkovitejša in hitrejša analiza mtDNA.

Velika variabilnost, ki so jo opazili pri postrveh, je povzročila, da so najrazličnejše

geografske ali ekološke forme postrvi tudi taksonomsko opredeljevali. To je

pogojevalo različne nomenklature postrvi, od katerih jih je precej zavajujočih in

nekonzistentnih. Tako so nekateri avtorji ekološke oblike (anadromno, jezersko in

potočno) označevali kot posamezne vrste, podvrste ali forme. Vendar pa so strokovne

raziskave pokazale, da je taka klasifikacija dvomljiva, saj ne predstavlja naravnih

populacij, nastalih z razvojem iz monofiletskega prednika (Behnke, 1972; Guyomard

in sod., 1984; Hindar in sod., 1991). Precej pomanjkljivo je zaenkrat obdelan

sistematični in filogenetski status geografsko opredeljenih populacij. Na osnovi

izrazitih morfoloških značilnosti, ki se kažejo tudi na tem nivoju, nekateri raziskovalci

razvrščajo postrvi tudi glede na njihov geografski izvor. Seveda tako opredeljevanje

dostikrat zaplete izrazita fenotipska prilagodljivost postrvi.

Na osnovi lastnih rezultatov analize mtDNA smo lahko s posameznimi genotipi, ki

smo jih določili, opredeljevali geografsko poreklo postrvi. Prav tako smo opazili, da je

pri avtohtonih postrveh z njihovim geografskim poreklom povezana tudi določena

stopnja njihove fenotipske identitete. Tako so po zunanjih znakih prepoznavni in med

seboj ločljivi atlantski (genotip C) in donavski (genotipa A in B) tip postrvi ter soška

(genotip D) in ohridska (genotip E) postrv. Da v omenjenih primerih ne gre samo za

pojav fenotipske plastičnosti, smo se prepričali s primerjavo individuov z različnimi


86

genotipi, ki so živeli v istem okolju in kljub temu ohranili svoje značilne fenotipske

lastnosti. Tako kot smo opazili največjo nukleotidno divergenco med soško postrvjo

na eni strani in preostalimi tremi tipi postrvi na drugi strani, tako smo v tej isti

primerjalni shemi opazili tudi največje razlike v fenotipu. To kaže na dovolj dolgo

obdobje ločenega razvoja posameznih populacij postrvi, v katerem je ob spreminjanju

mitohondrijskega genoma prihajalo tudi do sprememb v jedrnem genomu, vključno z

geni, odgovornimi za zunanji videz živali.

Zanimivo je, da se znotraj soške postrvi pojavljata dve fenotipski različici, ki pa se

glede na mitohondrijski genotip med seboj ne razlikujeta. Populacija iz Zadlaščice je

brez rdeče pigmentacije, za populacijo iz Trebuščice pa je prav ta značilna. Tudi ti

dve populaciji v istem življenskem okolju ohranjata medsebojne fenotipske razlike.

Ta fenotipska diskrepanca, ki se pojavlja tudi drugod v porečju Soče, je povzročala

med ihtiologi in ribiči precej polemik o tem, kakšen naj bi bil značilen izgled “čiste”

soške postrvi. Mnogi so bili mnenja, da vsaka najmanjša sled rdečega pigmenta na

telesu odrasle soške postrvi že kaže na njeno “genetsko kontaminiranost“ s potočnico.

Da to ni res, pojasnjuje genotip D, ki je prisoten v obeh populacijah in nikoli najden

pri potočni postrvi.

Obratno situacijo smo opazili pri populacijah donavskega tipa postrvi, ki so

fenotipsko enotne, izražajo pa dva različna mitohondrijska genotipa. Čeprav je

nukleotidna divergenca med genotipoma A in B v primerjavi s preostalimi pari

genotipov najmanjša, ta fenomen vendarle kaže na to, da tudi pri enakih pogojih

okolja na osnovi genotipov ni mogoče vedno zanesljivo ugotavljati fenotipa.

Glede na to, da mitohondrijski genom ni vezan z jedrnim genomom in da ne vpliva na

fenotip individua, je razumljivo, da pri križancih med nativnimi osebki z različnim

geografskim izvorom ni več neposredne povezave med mitohondrijskim genotipom in

fenotipom.

Povzamemo lahko, da je taksonomsko razvrščanje samo na osnovi fenotipskih znakov

zelo težko, predvsem pa zelo nezanesljivo zlasti v primerih tipiziranja mešanih

avtohtonih in neavtohtonih populacij.

5.2 MIKROSATELITNA DNA V pričujoči raziskavi predstavljamo prve markerje mikrosatelitne DNA za soško

postrv.


87

Kaže, da so CA- in GA- mikrosateliti v genomu soške postrvi pogosti. Ocenili smo,

da se v poprečju pojavljajo na vsakih 24000 bp. Ta vrednost se ujema z oceno

Estoupa in sod. (1993), ki so ugotovili, da se v genomu potočne postrvi CA-

mikrosateliti pojavljajo na vsakih 23 kb in GA-mikrosateliti na vsakih 76 kb. Te

vrednosti sodijo v isti velikostni razred kot tiste, ki so jih do sedaj opazili pri višjih

vretenčarjih. Učinkovitost detekcije mikrosatelitov je odvisna od strogosti pogojev,

pri katerih poteka pregledovanje genomske biblioteke. Ker smo v ta namen

uporabljali komercialni komplet in se držali navodil proizvajalca, na pogoje detekcije

nismo dodatno vplivali. Iz rezultatov pa je razvidno, da so bili ti pogoji verjetno zelo

specifični, saj mikrosatelitov, ki bi imeli manj kot 12 repetitivnih enot, nismo

zasledili. Podatki, ki jih je mogoče dobiti v genski banki ali rezultati, do katerih so

prišli na osnovi pregledovanja genomskih bibliotek pri manj strogih pogoji, pa kažejo,

da so CA-mikrosateliti z manj kot 12 ponovitvami zelo pogosti v humanem in

prašičjem genomu (Weber, 1990; Wintero in sod., 1992). Zato je zelo verjetno, da je

tudi v genomu soške postrvi dejanska razdalja med dvema sosednjima CA- ali GA-

mikrosatelitoma manjša, kot smo jo ocenili.

Mikrosatelitna lokusa 3/77 in 10/9 odražata različen nivo alelnega polimorfizma.

Število alelov na prvem lokusu je štiri, na drugem pa 12, kar znese v poprečju osem

alelov na populacijo. To število je precej večje od tistega, ki je značilno za

aloencimske lokuse, ki v splošnem odražajo en do dva alela na populacijo, pri čemer

število alelov na enem lokusu le redko presega tri ali štiri.

Razlike v polimorfnosti obeh mikrosatelitnih lokusov se odražajo tudi skozi vrednost

PIC, ki je na lokusu 10/9 za eno tretjino večja od tiste na lokusu 3/77.

Heterozigotnost smo zaradi statističnih zahtev računali samo znotraj skupin, ki so

štele več kot 30 živali. Zato smo pri lokusu 3/77 izračunali samo celokupno

heterozigotnost, ki je glede na stopnjo alelnega polimorfizma pričakovano nizka. Na

lokusu 10/9 smo poleg celokupne heterozigotnosti le-to določili tudi za vsako od obeh

skupin soške postrvi. Zanimivo je, da je navkljub visokemu alelnemu polimorfizmu

skupna heterozigotnost sorazmerno nizka (0.39), heterozigotnost, izmerjena v

Zadlaščici, pa relativno visoka (0.46). Vse izračunane heterozigotnosti statistično

značilno odstopajo od Hardy-Weinbergovega ravnotežja. Ta odklon je pričakovan, saj

smo intraspecifično heterozigotnost računali na vzorcih, ki predstavljajo majhne

populacije, ki so zelo podvržene naključnemu toku genov; celokupni heterozigotnosti


88

pa sta bili določeni na osnovi skupin maloštevilnih vzorcev iz različnih lokalitet, ki

združeni v celoto ne predstavljajo genetsko enotne in uravnotežene populacije.

Z analizo mtDNA smo raziskovano populacijo postrvi razdelili v štiri osnovne tipe:

atlantski, donavski in sredozemski tip ter soški tip. Z aleli lokusa 3/77 smo lahko

opredelili prve tri izmed naštetih tipov, medtem ko soškega tipa od donavskega nismo

mogli razlikovati, ker smo alel, značilen za soško postrv, našli tudi pri potočnicah iz

Mahnečice in Iške. Čeprav ta lokus ne omogoča identifikacije čistokrvne soške

postrvi, bi lahko imel pri njeni tipizaciji vendarle določeno diagnostično vrednost, saj

lahko z dokazovanjem drugih alelov ovržemo domnevno čistokrvnost testirane živali.

Nenavadno je, da v Iški, kamor vlagajo postrvi z atlantskim poreklom, nismo našli

alela 93, ki je za ta tip značilen. Vzrok je verjetno v tem, da mitohondrijski genotipi

laže prehajajo skozi hibridne cone kakor geni genomske DNA. Poleg tega so

ribogojniške plemenke atlantskega tipa izključno ženskega spola, zaradi česar se

njihov mitohondrijski genotip ohranja skozi vse nadaljne generacije, saj je moški

genotip izgubljen.

Tudi lokus 10/9 delno kaže na podobno populacijsko strukturo kot kontrolna regija

mtDNA. Trije aleli jasno opredeljujejo genotip D oz. soško postrv in trije aleli genotip

E oz. ohridsko postrv; aleli 206, 236 in 238 so striktno korelirani le z delom

populacije iz Iške, preko česar lahko sklepamo, da karakterizirajo donavsko poreklo

postrvi; poleg mitohondrijskih genotipov B in A so se ti aleli pojavljali še skupaj z

genotipom C, kar je glede na hibridno območje, ki jo predstavlja Iška, razumljivo.

Zanimiva in glede na mtDNA analize nepričakovana pa je porazdelitev alela 216.

Izmed vseh alelov, ki smo jih našli pri potočnih postrveh, je ta najpogostejši. Pojavlja

se s frekvenco 0.71. Značilen je za vse eksperimentalno opredeljene skupine potočnih

postrvi razen za sredozemsko postrv. Ker predstavlja večinsko genetsko varianto tudi

pri ribogojniških (atlantskih) populacijah, bi lahko sklepali, da je v donavsko porečje

prišel z introgresijo atlantske in donavske postrvi. Vendar pa je ta predpostavka malo

verjetna, če upoštevamo, da je alel 216 zelo pogosta ali morda celo edina genetska

varianta lokusa 10/9 pri potočnicah iz Mahnečice, kjer naj bi živele izključno

avtohtone postrvi. Poleg tega se ta populacija od atlantske razlikuje tudi na lokusu

3/77, kjer je za prvo značilen alel 122 in za drugo alel 118. Izgleda torej, da bi bil

lahko alel 216 značilen tako za donavski kot za atlantski tip potočne postrvi, kar zopet

kaže na verjetnost, da imata oba tipa skupnega prednika.


89

Lokusa 3/77 in 10/9 sta torej genetska markerja, s katerima je mogoče razlikovati

različne tipe postrvi. Ker pri dedovanju nista vezana en na drugega, se njuna

informativnost bistveno poveča, če ju obravnavamo skupaj.

Alel 101 lokusa 3/77, ki je značilen tako za soško postrv kot za donavski tip

potočnice, ni povezan s fenotipom, ki je tipičen za eno ali drugo skupino. To je

razvidno iz opažanja, da čistokrvni osebki, ki so na lokusu 3/77 opredeljeni samo s

tem alelom, izražajo enega od obeh fenotipov, križanci pa vmesni fenotip. S podatki,

ki so na voljo, pa tega ni mogoče trditi za alele lokusa 10/9; tisti, ki so značilni za

soško ali potočno postrv, so strogo omejeni na takson, ki ga opredeljujejo; križanci pa

so na tem lokusu heterozigoti s po enim alelom, značilnim za posamezno populacijo.

Tudi kadar genetski markerji niso vezani na značilen fenotip, so z vidika populacijske

analize vendarle zelo informativni. Omogočajo, da na osnovi frekvenc karakterističnih

alelov ugotavljamo razširjenost in delež posameznih populacij. Nadalje lahko z njimi

zasledujemo dinamiko populacij, preko česar lahko posredno sklepamo na

kompeticijo med posameznimi populacijami in na vpliv in učinek različnih umetnih

posegov v biotop, kot so npr. poribljanje ali ribolov. Z njimi lahko ocenjujemo

sorodstvene odnose in na tej osnovi izdelujemo ali popravljamo paritvene sheme.

Omogočajo, da preverimo genotip izoliranih populacij, ki živijo v še neporibljanih

predelih in izražajo značilen fenotip. S tem se zanesljivost ocene, ali gre v resnici za

pričakovan tip neke populacije, bistveno poveča. Teoretično pa je s fenotipsko

nepovezanimi markerji nemogoče stoodstotno zanesljivo opredeljevati fenotip

posameznega osebka. Zaradi različnih kombinacij pri križanju in nepredvidljivih

genskih rekombinacij, ki se zgodijo pri mejozi, prihaja do novih alelnih kombinacij, ki

za čistokrvne osebke niso bile nikoli značilne. Na tak način se lahko nek alel, ki je

npr. značilen za soško postrv, pojavi na kromosomu skupaj z aleli, ki izražajo fenotip

potočne postrvi. V takem primeru so tovrstni genetski markerji zavajujoči in brez

prvotne diagnostične vrednosti. Zato bi bilo za nedvoumno opredelitev soške postrvi

in križancev v prihodnje potrebno poiskati take genetske markerje, ki bi direktno

vplivali na značilne fenotipske lastnosti ali bili v povezavi z geni, ki so za te lastnosti

odgovorni. V ta namen bi bilo treba natančno opredeliti osnovne fenotipske znake

soške postrvi. Sledilo bi iskanje čim večjega števila genetskih markerjev, značilnih za

genetsko čisto soško postrv. Ocenjujemo, da bi tako obsežen genetski monitoring

najhitreje izpeljali z analizo RAPD (angl. random amplifyied polymorphic DNA). V


90

naslednjem koraku bi križali soško in potočno postrv in nato med seboj še osebke F1

generacije. Pri njihovih potomcih bi poiskali osebke, ki bi v celoti ustrezali

predpisanim fenotipskim kriterijem za soško postrv, in preverili poreklo genetskih

markerjev. Tiste markerje, pri katerih bi ugotovili, da opredeljujejo fenotip soške

postrvi tako v starševski kot v F2 generaciji, bi lahko obravnavali kot fenotipsko

vezane.

Tako zasnovana segregacijska analiza predstavlja obsežen in dolgotrajen raziskovalni

projekt, pri katerem pričakovanih in zaželenih rezultatov ni mogoče zagotoviti

vnaprej. Kljub temu je ta raziskava zelo zanimiva z znanstvenega stališča, prav tako

pa bi tudi v praksi omogočala izboljšanje varstvenega načrta za ohranitev genetsko

čistih populacij soške postrvi v Sloveniji.

Na koncu želimo pojasniti, kakšno uporabno vrednost imajo naši genetski markerji,

značilni za soško postrv in za preostale tipe potočne postrvi, v praktični diagnostiki in

ali jih je mogoče uporabljati v rutinskih analizah ter z njimi genotipizirati veliko

število vzorcev.

Tipiziranje postrvi na osnovi genotipov kontrolne regije mtDNA smo z izborom

ustreznih restrikcijskih encimov, ki prepoznavajo specifične nukleotidne sekvence

znotraj posameznih polimorfnih mest, bistveno poenostavili. Na ta način smo se

izognili zamudnemu in zahtevnemu postopku sekvenciranja, ki za rutinske analize ni

primeren. Nadomestili smo ga s polimerazno verižno reakcijo in z restrikcijsko

analizo produktov PCR. Oba postopka je mogoče izpeljati povezano brez vmesnega

čiščenja amplifikatov. Ugotovili smo, da PCR, ki smo jo optimirali v ta namen, poteka

uspešno, četudi je matrična mtDNA nečista, poškodovana in kontaminirana z obilico

genomske DNA. To relativno robustno delovanje polimerazne verižne reakcije

dovoljuje, da mtDNA izoliramo po t.i. postopkih “rough and dirty”, ki sicer ne

zagotavljajo visoko kvalitetne mtDNA, omogočajo pa, da je njena izolacija hitra in

preprosta.

Mnenja smo, da tako poenostavljena metodika omogoča laboratorijskemu tehniku, da

genotipizira 10 do 20 vzorcev na dan.

Analiza mikrosatelitnega polimorfizma je nekoliko bolj zapleten proces, ki poleg

izolacije genomske DNA in polimerazne verižne reakcije za natančno opredeljevanje

posameznih alelov zahteva analizo amplifikatov na poliakrilamidnem sekvenčnem

gelu.


91

Sam postopek izolacije genomske DNA je pri ribah zelo enostaven, hiter in učinkovit.

Zadostuje le nekaj mikrolitrov krvi, iz katere je mogoče v roku treh do štirih ur

izolirati nekaj deset mikrogramov visokokvalitetne genomske DNA. Ker izolacija

poteka z izsoljevanjem, je ta metoda okolju prijazna.

Najzahtevnejši korak pri analiziranju mikrosatelitnega polimorfizma je optimiziranje

PCR. Pri mikrosatelitnih lokusih 10/9 in 3/77 nam je izbor primernih

oligonukleotidnih začetnikov dovoljeval, da smo pogoje PCR poenotili za oba lokusa

in jih kar najbolj poenostavili. To nam je omogočilo, da smo lahko v eni uri na isti

matrični DNA amplificirali dve različni regiji hkrati. Ker se mikrosatelitna markerja

10/9 in 3/77 med seboj po velikosti razlikujeta za približno 100 bp, je s tem postopek

genotipiziranja še dodatno poenostavljen. Njuna razlika v velikosti namreč omogoča,

da se pri denaturacijski elektroforezi na poliakrilamidnem gelu razločno ločita, zaradi

česar lahko pri analiziranju enega vzorca tipiziramo oba lokusa hkrati. Z enim

elektroforetskim tekom na sekvenčnem gelu, ki skupaj z vizualizacijo DNA-

fragmentov traja en dan, je mogoče hkrati analizirati od 24 do 28 vzorcev. Izolacijo

genomske DNA tako velikega števila vzorcev vključno s PCR je možno izpeljati v

enem ali dveh dneh, iz česar lahko zaključimo, da je v enem delovnem tednu na

lokusih 10/9 in 3/77 mogoče genotipizirati približno 50 živali.

Kaže torej, da je omenjene genetske markerje vključno s pripadajočimi analitskimi

metodami primerno vključiti v rutinske teste, s katerimi bi ocenjevali genetsko čistost

soških postrvi in ugotavljali populacijsko strukturo soške in potočne postrvi ter njunih

križancev v porečju Soče.

V pričujoči raziskavi smo prikazali praktično uporabnost raziskovanja in analiziranja

kontrolne regije mtDNA in mikrosatelitnega polimorfizma na modelu soške in

potočne postrvi. Poleg konkretnih ugotovitev, ki se nanašjo na objekt raziskovanja, pa

je pomembno tudi to, da smo vzpostavili uspešno raziskovalno strategijo, ki jo lahko

hitro in učinkovito prenesemo tudi na druge vrste rib z nerazjasnjenim ali ogroženim

genetskim statusom (npr. soški lipan, primorska podust, štrkavec, beli klen).


92

6. POVZETEK Soška postrv je endemit, značilen za večino porečja jadranskega morja. V Sloveniji

živi v porečju reke Soče in predstavlja eno izmed najbolj ogroženih sladkovodnih rib

v Sloveniji. Ogroža jo predvsem potočna postrv, ki so jo v življensko okolje soške

postrvi naselili v začetku tega stoletja in jo do nedavnega vlagali redno in v velikem

številu. Soška in potočna postrv se križata in njuni potomci in plodni. Zato je čista

soška postrv v Sloveniji že zelo redka. Obstaja načrt repopulacijskega programa soške

postrvi, ki temelji na ribogojniški vzreji genetsko čistih plemenskih soških postrvi in

na vlaganju njihovega potomstva v soško porečje. Vzreja genetsko čistih soških

postrvi in spremljanje populacijske strukture in dinamike na območjih vlaganja soške

postrvi pa sta težavni nalogi, ker ni značilnih morfoloških znakov, ki bi omogočali

zanesljivo ločevanje med soško postrvjo in njenimi križanci s potočnico. Zato je bil

osnovni namen naše raziskave preučiti soško postrv z molekularno genetskega vidika

in najti zanjo značilne genetske markerje. Obenem smo želeli razjasniti sorodstvene

odnose soške in potočne postrvi in ugotoviti, ali je opredeljevanje soške postrvi kot

samostojne vrste utemeljeno ali ne.

V raziskavo smo vključili primerke dveh domnevno čistih populacij soške postrvi iz

Trebuščice in Zadlaščice ter vzorce različnih populacij potočne postrvi, ki so se med

seboj razlikovale glede na geografski izvor. Osredotočili smo se na kontrolno regijo

mtDNA in na mikrosatelite genomske DNA. Oba genetska kompleksa predstavljata

področji DNA, ki izražata izrazito nukleotidno variabilnost in omogočata analizo

genetske raznolikosti sorodnih vrst in populacij.

Znotraj kontrolne regije mitohondrijske DNA smo našli tri polimorfna mesta z

različnimi genetskimi variantami, od katerih je bila ena (genotip D) značilna za soško

postrv, s preostalimi štirimi genetskimi variantami pa smo lahko nedvoumno

opredelili ohridsko postrv ter atlantski in donavski tip potočne postrvi. Podobne

rezultate smo dobili pri analizi mikrosatelitne DNA, kjer smo na enem izmed dveh

preučevanih lokusov (10/9) med njegovimi 12 aleli našli tri, ki so bili značilni samo

za soško postrv. Poleg tega smo na osnovi preostalih alelov obeh mikrosatelitnih

lokusov specifično prepoznavali ohridsko postrv ter atlantski in donavski tip

potočnice.


93

Z omenjenimi genetskimi markerji smo ugotovili, da sta populaciji soške postrvi iz

Zadlaščice in Trebuščice genetsko čisti in da se glede na te markerje med seboj ne

razlikujeta. Poleg tega smo ugotovili, da je slovenska avtohtona potočna postrv, ki

naseljuje vode donavskega porečja, resno ogrožena s fenotipsko različnim atlantskim

tipom potočne postrvi.

Ocenjujemo, da so ti genetski markerji primerni za ugotavljanje in spremljanje

populacijske strukture in dinamike soške in potočne postrvi ter njunih križancev v

porečju Soče in verjetno tudi v preostalih naselitvenih območjih soške postrvi.

Vključili bi jih lahko med osnovne kriterije za ocenjevanje genetske čistosti soške

postrvi. Poleg tega predstavljajo dragocen diagnostični pripomoček tudi pri

ugotavljanju porekla populacij potočne postrvi, kjer omogočajo diskriminacijo med

ribogojniškim (atlantskimi) in slovenskim avtohtonim (donavskim) tipom potočnice.

Tehnična izvedba genotipiziranja z omenjenimi genetskimi markerji je relativno

preprosta, hitra in omogoča hkratno testiranje velikega števila vzorcev. Za analizo je

potrebna minimalna količina (10 µl) krvi, kar zagotavlja, da ostane riba po vzorčenju

nepoškodovana. Zaradi analitične prikladnosti, ki je značilna za te markerje, bi bilo

genotipiziranja na njihovi osnovi mogoče uporabljati tudi v rutinske namene.

Z analizami genetskega polimorfizma kontrolne regije mtDNA preučevanih populacij

postrvi smo uspeli okvirno opredeliti filogenetski položaj soške postrvi. Verjetno je

izšla iz prednika, ki je bil skupen večini današnjih tipov evropske potočne postrvi. To

se je zgodilo v pleistocenu in je bilo zelo verjetno pogojeno z geološkimi dogajanji, ki

jih je povzročila takratna ledena doba. Kaže, da se je od takrat naprej soška postrv

razvijala kot samostojna evolucijska veja, ločena od preostalega kompleksa trutta.

Na osnovi nukleotidne divergence znotraj kontrolne regije mtDNA med soško

postrvjo in preostalimi tipi potočnic, ki znaša 1.2 %, soške postrvi ni mogoče uvrščati

v rod Salmo kot samostojno vrsto, temveč le kot eno izmed oblik vrste S. trutta.


94

7. SUMMARY

Marble trout is an endemic species to the majority of the Adriatic region. In Slovenia

it is present only in the Soča river basin and it is considered as one of the most

endangered freshwater fish. The main threat to marble trout was a continuous and

massive introduction of brown trout into the Soča river basin, starting in the beginning

of this century. The two species mated successfully and produced vital and fertile

hybrids. Nowadays, in most rivers hybrids prevail and the existence of marble trout is

restricted to few upper streams of the Soča river basin. An action plan for marble trout

revitalization already exists and is based on hatchery production of genetically pure

breeding marble trout and on stock of the progeny into the Soča river basin. However,

growing genetically pure marble trout and monitoring the population structure and

dynamics in the streams stocked with marble trout is difficult since no reliable

phenotypic signs enabling differentiation between marble trout and array of its various

hybrids with brown trout exist. To accomplish this task effectively the main goal of

our research was to determine marble trout from molecular genetic point of view

trying to find some marble trout specific genetic markers.

The analysis of two presumably pure marble trout populations, originated from the

Zadlaščica and the Trebuščica river, respectively, and specimens of geographically

remote brown trout populations was performed. The mtDNA D-loop region and

microsatellite DNA were focused. Both genetic complexes expressing an intense

nucleotide variability represent very convenient models for studying genetic diversity

of closely related species and subspecies.

Within the mtDNA D-loop region three polymorphic sites revealing five different

genotypes were found, one of them (genotype D) being characteristic only for marble

trout, the others specifying the Ohrid, the Danubian and the Atlantic type of brown

trout, respectively. Similar results were found analyzing two microsatellite DNA loci:

the locus 10/9 revealed 12 alleles, three of them being specific only for marble trout.

Besides, other alleles of both loci enabled the differentiation among Ohrid, Atlantic

and Danubian type of brown trout.

Using these genetic markers we found out the marble trout populations from the

Zadlaščica and the Trebuščica could be considered as genetically pure and


95

homogenous. Furthermore, the severe contamination of Slovenian rivers with non-

native Atlantic brown trout, threatening the native one, was revealed.

Our opinion is that these genetic markers are suitable for analysing and monitoring the

population structure and dynamics of marble trout, brown trout and their hybrids,

living in the Soča river basin as well as in other native range of marble trout. They

should be considered as one of the main criteria for evaluating the genetic purity of

marble trout. They also represent a valuable diagnostic tool for testing the origin of

brown trout populations, enabling the discrimination between hatchery reared

(Atlantic) and Slovenian aboriginal (Danubian) type of brown trout.

Technical performance of genotyping, using these genetic markers, is relatively

simple, quick, and enables a simultaneous testing a large number of samples. For

analysis a minute quantity (10 µl) of blood is requested, providing the fish being

unscathed after the blood sampling. Due to the analytical convenience of these

markers, they could be used even for genotyping in routine work.

Analyzing D-loop region polymorphism of studied trout populations we could

roughly estimate the phylogenetic status of marble trout. Presumably it evolved from

the ancestor, common to the majority of the modern types of European brown trout.

This might have happened in Pleistocene when lots of geological events, caused by

the glacial period, took place. It seems that since then marble trout was evolving as a

separate evolution branch, independently from the rest of the f. fario complex.

According to the nucleotide divergence within the mtDNA D-loop region between

marble trout and the other types of S. trutta, which is 1.2 %, marble trout should be

considered as a subspecies of the species S. trutta rather than a distinctive species

within the genus Salmo.


96

8. ZAHVALA

Svojo doktorsko disertacijo sem izdelal ob sodelovanju in pomoči mnogih kolegov,

prijateljev in znancev, za kar se jim iskreno zahvaljujem. Posebej pa bi rad izpostavil

vse tiste, katerih sodelovanje v pričujočem projektu je bilo ključnega pomena za

njegovo uspešno realizacijo. To so:

Peter Dovč (ideja)

Dennis Hedgecock (mentorstvo v ZDA)

Dušan Jesenšek (material)

Daniel Mcgoldrick (laboratorijska ekspertiza)

Jure Pohar (finance in logistika)

Vsem se najlepše zahvaljujem in se veselim nadaljnega skupnega sodelovanja.


97

9. REFERENCE Abercrombie, M./ Hickman, M./ Johnson, M.L./ Thain, M. The Penguin dictionary of biology. New York, Penguin Books, 1992, 600 s.

Alberts, B./ Bray, D./ Lewis, J./ Raff, M./ Roberts, K./ Watson, J.D. DNA repair. V: Molecular biology of the cell. New York, Gerland Publishing, 1994, s. 242-251.

Allard, M.A./ Honeycutt, R.L. Nucleotide sequence variation in the mitochondrial 12 s rRNA gene and the phylogeny of African mole-rats (Rodentia-Bathyergidea). Mol. Biol. Evol., 9(1992), s. 27-40.

Allendorf, F.W./ Ryman, N./ Stennek, A./ Stähl, G. Genetic variation in Scandinavian brown trout (Salmo trutta L.): evidence of distinct sympatric populations. Hereditas, 83(1976), s. 73-82.

Ambrosi, C. L’Adriatico nel quaternario. Trieste, Tipografia villaggio del fanciullo, 1969, s.147-154.

Amos, B./ Schlöterer, C./Tautz, D. Social structure of pilot whales revealed by analytical DNA profiling. Science, 260(1993), s. 670-672.

Anderson, S./ Bankier, A.T./ Barrell, B.G./ de Bruijn, M.H.L./ Coulson, A.R./ Drouin, J./ Eperon, I.C./ Nierlich, D.P./ Roe, B.A./ Sanger, F./ Chreier, P.H./ Smith, A. J.H./ Staden, R./ Young, G.I. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 290(1981), s. 457-456.

Anderson, S./ de Bruijn, M.H.L./ Coulson, A.R./ Eperon, I.C./ Sanger, F./ Young, I.G. The complete nucleotide sequence of bovine mitochondrial DNA: Conserved features of the mammalian mitochondrial genome. J. Mol. Biol., 156(1982), s. 683-717.

Apostolidis, A./ Karakousis, Y./ Rryantaphyllidis, C. Genetic divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L. (brown trout) populations from Greece and other European countries. Heredity, 76(1996), s. 551-560.

Araya, A./ Amthauer, R./ Leon, G./ Krauskopf, M. Cloning, phisical mapping and genome organization of mitochondrial DNA from Cyprinus carpio oocites. Mol. Gen. Genet., 196(1984), s. 43-52.

Armour, J.A.L./ Jeffreys, A.J. Biology and applications of human minisatellite loci. Curr. Opin. Genet. Dev., 2(1992), s. 850-856.

Armour, J.A.L./ Neumann, R./ Gobert, S./ Jeffreys, A. J. Isolation of human simple repeat loci by hybridization selection. Hum. Mol. Genet., 3(1994), s. 599-565.

Ausubel, F.M./ Brent, R./ Kingston, R.E./ Moore, D.D./ Smith, J.A./ Seidman, J.G./ Struhl, K. Minipreps of plasmid DNA. V. Current protocols in molecular biology III. New York, John Wiley & Sons, 1994, s. 1.6.1.


98

Avise, J.C. Molecular tools. V: Molecular markers, natural history and evolution. New York, Chapman & Hall, 1994 a , s. 44-91.

Avise, J.C. Molecular markers, natural history and evolution. Interpretive tools. New York, Chapman & Hall, 1994 b, s. 96.

Avise, J.C./ Arnold, J./ Ball, R.M./ Bermingham, E./ Lamb, T./ Neigel J.E./ Reeb, C.A./ Saunders, R.C. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA and bridge between population genetics and systematics. Ann. Rev. Ecol. Syst., 18(1987), s. 489-522.

Avise, J.C./ Shapira J.F./ Daniel, S.W./ Aquaedo, C.F./ Lansman, R.A. Mitochondrial DNA differentiation during the speciation process in Peromyscus. Mol. Biol. Evol., 1(1983), s. 38-56.

Barrell, B.G./ Bankier, A.T./ Drouin, J. A. different code in human mitochondria. Nature, 282(1979), s. 189-194.

Barton, N.H./ Hewitt, G.M. Adaptation, speciation and hybrid zones. Nature, 341(1989), s. 497-502.

Beckenbach, A.T./ Thomas, K.W./ Sohrabi, H. Intraspecific sequence variarion in the mitochondrial genome of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Genome, 33(1990), s. 13-15.

Beckmann, J.S./ Weber, J.L. Survey of human and rat microsatellites. Genomics, 12(1992), s. 627-631.

Behnke, R.J. The systematics of salmonid fishes of recently glaciated lakes. J. Fish. Res. Bd. Canada, 29(1972), s. 639-671.

Berg, W.J./ Ferris, S.D. Restriction endonuclease analysis of salmonid mitochondrial DNA. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 41(1984), s. 1041-1047.

Bernatchez, L./ Guyomard, R./ Bonhomme, F. DNA variation of the mitochondrial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations. Mol. Ecol., 1(1992), s. 161-173.

Berrebi, P. Analyse génétique des truites marbrées de la Soča (Slovénie). Rapport, Momtpellier, Université Montpellier 2, 1993, 10 s.

Bibb, M.J./ Van Etten, R.A./ Wrught,C.T./ Walberg, M.W./ Clayton, D.A. Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. Cell, 26(1981), s. 167-180.

Billington, B./ Hebert, P.D.N. Mitochondrial DNA diversity in fishes and its implications for introductions. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 48(1991), s. 80-94.

Birnboim, H.C./ Straus, N.A. DNA from eukaryotic celss contains unusually long pyrimidine sequences. Can. J. Biochem., 53(1975), s. 640-643.


99

Borst, P./ Grivell, L.A. Small is beautiful-porterait of a mitochondrial genome. Nature, 290(1981), s. 443-444.

Botstein, D./ White, R./ Skolnik, M./ Dawis, R.W. Construction of a genetic linkage map using restriction fragment length polymorphism. Am. J. Human Genet., 32(1980), s. 314-331.

Brown, W.M. The mitochondrial genome of animals. V: Molecular evolutionary genetics. New York, Plenum Press, 1985, s 95-130.

Brown, W.M./ George, M./ Wilson, A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76(1979), s. 1967-1971.

Brown, W.M./ Prager, E.M./ Wang, A./ Wilson, A.C. Mitochondrial DNA sequences of primates : Tempo and mode of evolution. J. Mol. Evol., 18(1982), s. 225-239.

Budowle, B./ Giusti, A.M./ Waye, J.S./ Baechtel, F.S./ Fourney, R.M./ Adams, D.E./ Presley, H.A./ Deadman, H.A./ Monson, K.L. Fixed-bin analysis for statictical evaluation of continuous distributions of allelic data from VNTR loci, for use in forensic comparisons. Am. J. Hum. Genet., 48(1991), s. 841-855.

Callen, F.D./ Thompson, A.D./ Shen, Y./ Phillips, H.A./ Richards, R.I./ Mulley, J.C./ Sutherland, R. Incidence and origin of “null” alleles in the (AC)n microsatellite markers. Am. J. Human Genet., 52(1993), s. 922-927.

Cann, R.L./ Brown, W.M./ Wilson, A.C. Polymorphic sites and the mechanisms of evolution in human mitochondrial DNA. Genetics, 106(1984), s. 479-499.

Charlesworth, B./ Sniegowski, P./ Stephan, W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature, 371(1994), s. 215-220.

Clabby, C./ Flavin, F./ Powel, E./ Powel, R. Microsatellites as genetic markers for Atlantic salmon. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.

Crozier, W.W./ Ferguson, A. Electrophoretic examination of the population structure of brown trout, Salmo trutta L., from the Lough Neagh catchment, Northern Irland. J. Fish Biol., 28(1986), s. 459-477.

Danzmann, R.G./ Ihssen, P.E. A phylogeographic survey of brook charr (Salvelinus fontinalis) in Algonquin park, Ontario based upon mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol., 4(1995), s. 681-697.

Davidson, S.W./ Bartlett, S.E./ Birt, T.P./ Green, J.M. Organization of the mitochondrial genome from Atlantic salmon (Salmo salar). Genome, 32(1989), s. 340-342.


100

Digby, T.J./ Gray, M.W./ Lazier, C.B. Rainbow trout mitochondrial DNA: sequence and structural characteristics of the non-coding control region and flanking tRNA genes. Gene, 113(1992), s. 197-204.

Disotell, T.R./ Honneycutt, R.L./ Ruvolo, M. Mitochondrial DNA phylogeny of the old-world monkey tribe Papionini. Mol. Biol. Evol., 9(1992), s. 1-13.

Dorofeeva, E.A. Systematic relations of salmons of the genus Salmo. Ichthyologia, 6(1974), s. 27-36.

Dovč, P./ Hecht, W. Molecular analysis of the D-loop of caprine mitochondrial DNA. V: Animal Genetics, 25(1994), s. 30, Proceedings of the 24th ISAG Conference, Prague, 1994-07-23/29.

Dovč, P./ Snoj, A. Analysis of animal mitochondrial DNA. Acta Chim. Slov., 43(1996), s. 13-19.

Dowling, T.E./ Moritz, C./ Palmer, J.D./ Riesberg, L.H. Nucleic AcidsIII: Analysis of fragments and restriction sites. V. Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, 1996, s. 249-320.

Edwards, A./ Hammond, H.A./ Jin, L./ Caskey, C.T./ Chakraborty, R. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups. Genomics, 12(1992), s. 241-253.

Epplen, J.T./ McCarty, J.R./ Sutou, S./ Ohno, S. Base sequence of cloned snake W-chromosome DNA fragment and identification of male specific putative mRNA in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(1982), s. 3798-3802.

Estoup, A./ Presa, P./ Krieg, F./ Vaiman, D./ Guyomard, R. (CT)n and (GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout). Heredity, 71(1993), s. 488-496.

Ferguson, A./ Mason, F. Allocyme evidence for reproductively isolated sympatric populations of brown trout Salmo trutta L. in Lough Melvin, Irland. J.Fish Biol., 18(1981), s. 629-642.

Ferris, S.D./ Berg, W.J. The utility of mitochondrial DNA in fish genetics and fishery managment. V: Population genetics and fishery management. Seattle, Washington press, 1988, s. 277-299.


101

Fontaine, P.M./ Dodson, J./ Slettan, A. Microsatellite polymorphism among Atlantic salmon (Salmo salar) populations in Quebec waters. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.

Forneris, G./ Rasero, R./ Cauvin, E. Caratterizzazione elettroforetica di una popolazione di trota marmorata (Salmo trutta marmoratus) dell’alto bacino del Po. Riv. It. Piscic. Ittiop., 22(1987), s. 2-8.

Garcia-Marin, J.L./ Jorde, P.E./ Ryman, N./ Utter, F./ Pla, C. Management implications of genetic differentiation between native and hatchery populations of brown trout (Salmo trutta) in Spain. Aquaculture, 95(1991), s. 235-249.

Gillham, W. N. Organelle genome organization and gene content. V: Organelle genes and genomes. New York, Oxford University Press, 1994, s. 50-91.

Giuffra, E. Identificazione genetica e filogenia delle popolazioni di trota comune, Salmo trutta L., del bacino del Po. Ph. D. thesis. Turin, University of Turin, 1993.

Giuffra, E/ Guyomard, R./ Forneris, G. Phylogenetic relationships and introgression patterens between incipient parapatric species of Italian brown trout (Salmo trutta L. complex). Mol. Ecol., 5(1996), s. 207-220.

Giuffra, E./ Bernatchez, L./ Guyomard, R. Mitochondrial control region and protein coding genes sequence variation among phenotypic forms of brown trout Salmo trutta from northern Italy. Mol. Ecol., 3(1994), s. 161-171.

Gjedrem, T./ Eggum, Å./ Refstie, T. Chromosome of some salmonids and salmonid hybrids. Aquaculture, 11(1977), s. 335-348.

Glaser, R.L/ Thomas, G.H./ Siegfried, E./ Elgin, S.C.R./ Lis, J.T. Optimal heat-induced expression of the Drosophila hsp26 gene requires a promoter sequence containing (CT)n.(GA)n repeats. J. Mol. Biol., 211 81990), s. 751-761.

Glenn, T.C. Microsatellite manual, Version 6, Unpubished manuscript, 1995, FTP: onyx.si.edu/protocols/msatmanV#rtf

Goldstein, B.G./ Linares, A.R./ Cavalli-Sforza L.L./ Feldman, M.W. An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics, 139(1995), s. 463-471.

Gray, M.W. Origin and evolution of mitochondrial DNA. Annu. Rev. Cell. Biol., 5(1989), s. 25-50.

Guyomard, R. / Grevisse, G./ Oury, F.X./ Davaine, P. Evolution de la variabilité génétique inter et intra-populations de populations issues de mêmes pools géniques. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 41(1984), s. 1024-1029.

Guyomard, R. Diverité génétique de la truite commune. Bulletin Français de la pêche et de la pisciculture, 314(1989), s. 118-135.


102

Guyomard, R./ Krieg, F. Electrophoretic variation in six populations of brown trout (Salmo trutta L.). Can. J. Genet. Cytol., 25(1983), s. 403-413.

Gyllensten, U./ Wilson, A.C. Mitochondrial DNA of salmonids. V: Population genetics and fishery management. Seattle, Washington press, 1988, s. 301-317.

Hamada, H./ Petrino, M.G./ Kakunaga, T. A novel repeat element with Z-DNA forming potential is widely found in evolutionary diverse eukaryotic genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79(1982), s. 6456-6469.

Hansen, M.M./ Loeschcke, V./ Rasmussen, G./ Simonsen, V. Genetic differentiation among Danish brown trout (Salmo trutta) populations. Hereditas, 118(1993), s. 177-185.

Harrison, R.G Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evotutionary biology. Trends Ecol. Evol., 4(1989), s. 6-11.

Hartl, D.L./ Clarke, A.G. Principles of population genetics. Massachusetts, Sinauer Press, 1988.

Hartley, S.E./ Horne, M.T. Chromosome relationship in genus Salmo. Chromosoma, 90(1984), s. 229-237.

Hearne, C.M./ Ghosh, S./ Todd, J.A. Microsatellites for linkage of genetic analysis of genetic traits. Trends Genet., 8(1992), s. 288-294.

Hindar, K./ Jonsson, B./ Ryman, N./ Ståhl, G. Genetic relationship among landlocked, resident, and anadromous Brown trout, Salmo trutta L. Heredity, 66(1991), s. 83-91.

Hoeh, W.R./ Blakley, K.H./ Brown, W.M. Heteroplasmy suggests limited biparental inheritance of Mytilis mitochondrial DNA. Science, 251(1991), s. 1488-1490.

Hoelzel, A.R./ Bancroft, D.R. Statistical analysis of variation. V: Molecular genetic analysis of populations. New York, IRL Press, 1992.

Hunter, R./ Markert, C. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. Science, 125(1957), s. 1294.

Hynes, R.A./ Duke, E.J./ Joyce, P. Mitochondrial DNA as agenetic marker for brown trout, Salmo trutta L., populations. J. Fish Biol., 35(1989), s. 687-701.

Irwin, D.M./ Kocher, T.D./ Wilson, A.C. Evolution of the cytochrome b gene of mammals. J. Mol. Evol., 32(1991), s. 128-144.

Ishikawa, A./ Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Variable number of tandem repeat marker, RVF9401, in rainbow trout. J. Anim. Sci., 73(1994 a), s. 1213.


103

Ishikawa, A./ Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Variable number of tandem repeat marker, RVF9303, in rainbow trout. J. Anim. Sci., 73(1994 b), s. 1214.

Jeffreys, A.J./ Wilson, W./ Thein, S.L. Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature, 316(1985), s. 67-73.

Jeffreys, J.A./ Royle, N.J./ Patel, J./ Armour, A.L./ MacLeod, A./ Collick, A./Gray, I.C./ Neumann, R./ Gibbs, M./ Crosier, M./ Hill, M./ Singer, E./ Monckton, D. Principles and recent advances in human DNA fingerprinting. V: DNA Fingerprinting: Approches and applications. Basel, Birkhäuser, 1991, s. 1-19.

Karlin, S./ Burge, C. Dinucleotide relative abundance extremes: a genomic signature. Trends Genet., 11(1995), s. 283-290.

Kleinsmith, L.J./ Kish, V.M. Gene regulation in eukaryots. V: Principles of cell and molecular biology. New York, Harper Collins College Publishers, 1995, s. 455-456.

Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol., 16(1980), s. 111-120.

Klotz, L.C./ Komar, N./ Blanken,R.L./ Mitchell, R.M. Calculation of evolutionary trees from sequence data. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76(1976), s. 4516-4520.

Kocher, T.D./ Thomas, W.K./ Meyer, A. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Acad. Sci. USA, 86(1989), s. 6196-6200.

Krieg, F./ Guyomard, R. Electrophoretic evidence for large differentiation between trout populations in Corsica. C.R. Acad. Sc. Paris, 296(1983), s. 1089-1093.

Krieg, F./ Guyomard, R. Population genetics of French brown trout (Salmo trutta L.): large geographical differentiation of wild populations and high similarity of domesticated stocks. Génét. Sél. Evol., 17(1985), s. 225-242.

Kumar, S./ Tamura, K./ Nei, M. MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version 1.0., 1993. The Pennsilvania State University, University Park, PA 16802.

Lagercrantz, U./ Ellegren, H./ Andersson, L. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res., 21(1993), s. 1111-1115.

Lagler, K.F. Freshwater fishery biology. Dubuque, WM. C. Brown Company Publishers, 1977, s.19-35.

Largiadèr, C.R./ Scholl, A. Genetic variation of brown trout (Salmo trutta L) of the Adriatic and Danubian drainages in Switzerland. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.


104

Lewontin, R.C. The genetic basis of evolutionary change. New York, Columbia University Press, 1974.

Li, W.H./ Graur, D. Fundamentals of molecular evolution. Sunderland, Sinauer associates, Inc., 1991, 284 s.

Litt, M./ Luty, J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of dinucleotide repeat within the cardic muscle actin gene Am. J. Hum. Genet., 44(1989), s. 397-401.

Lu, Q./ Wallrath, L.L./ Granok, H./ Elgin, S.C.R. (CT)n (GA)n repeats and heat shock elements have distinct roles in chromatin structure and transcriptional activation of the Drosophila hsp26 gene. Mol. Cell. Biol., 13(1993), s. 2802-2814.

Maniatis, T./ Fritsch, E.F./ Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor, 1982, s.150.

Martínez, P./ Morán, P./ Pérez, J./ Gárcia- Vázquez, E./ Pendás, A.M. Characterization of large microsatellite loci in Atlantic salmon isolated from a cosmid genomic library. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.

McVeigh, H.P./ Bartlett, S.E./ Davidson, W.S. Polymerase chain reaction /direct sequence analysis of the cytochrome b gene in Salmo species. Aquaculture, 95(1991), s. 225-233.

Medrano, F.J./ Aasen, E./ Sharrow, L. DNA extraction from nucleated red blood cells. Biotechniques, 8(1990), s. 43.

Messier,W./ Li, S.H./ Stewart, C.B. The birth of microsatellites. Nature, 381(1996), s. 483.

Meyer, A./ Wilson, A.C. Origin of tetrapods inferred from their mitochondrial DNA affiliation to lungfish. J. Mol. Evol., 31(1990), s. 359-364.

Mignote, B./ Barat, M./ Mounolou, J.C. Characterization of a mitochondrial protein binding to single stranded DNA. Nucleic Acid Res., 13(1985), s. 1703-1716.

Miller, R.R. Classification of the native trout of Arizona with the description of new species, Salmo apache. Copeia, 3(1972), s. 401-422.

Montoya, J./ Gaines, G.L./ Attardi, G. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell, 34(1983), s. 151-159.

Moore, S.S./ Sergeant, L.L./ King, T.J./ Mattick, J.S./ Georges, M./ Hetzel, D.J.S. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species Genomics, 10(1991), s. 654-660.


105

Moritz, C./ Dowling, T.E., Brown, W.M. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics. Ann. Rev. Ecol. Syst., 18(1987), s. 269-292.

Moritz, C./ Hillis, D.M. Molecular Systematics: Context and Controversis. V: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, 1996, s. 1-13.

Mullis, K.B./ Faloona, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase- catalised chain reaction. Methods Enzymol., 155(1987), s. 335-350.

Murphy, R.W./ Sites, J.W/ Buth, D.G./ Haufler, C.H. Proteins: Isozyme electrophoresis. V: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, 1996, s. 51-120.

Murray, V./ Monchawin, C./ England, P.R. The determination of the sequences present in the shadow bands of a dinucleotide repeat PCR. Nucleic Acids Res., 10(1993), s. 2395-2398.

Nelsen, J.S. Fishes of the world. New York, Wiley, 1984. Niegel, J.E./ Avise, J.C. Phylogenetic relatipnship of mitochondrial DNA under various demographic models of speciation. V: Evolutionary process and theory. New York, Academic press, 1986, s. 515-534.

Nishimura, A./ Morita, M./ Nishimura, Y./ Sugino, Y. A rapid and highly efficient method for preparation of competent Esherishia coli cells. Nucleic Acids Res., 20(1990), s. 61-69.

Norden, C.R. Comparative osteology of representative salmonide fish with particular reference to the grayling (thymallus arcticus) and phylogeny. J. Fish. Res. Bd. Canada, 18(1961), s. 679-791.

Osinov, A. Brown trout (Salmo trutta L., Salmonidae) in basins of the Black and Caspian Seas: A population genetic analysis. Genetika, 24(1989), s. 1523-1534.

Osinov, A. Zoogeographical origins of brown trout , Salmo trutta (Salmonidae): data from biochemical genetic markers. J. Ichtyol., 24(1984), s. 10-23.

Pohar, J./ Al-Sabti, K. Kromosomska slika marmorirane postrvi in lipana. Zb. Biotehniške fak. Univ. v Ljubljani, Kmetijstvo (Živinoreja), 32(1978), s. 77-96.

Pomini, F.P. Fenotipi e genotipi nei Salmo italiani. Sci. genet., 1(1939), s. 206-218. Poteaux, C./ Berrebi, P. Brown trout populations structuration analysis with hypervariable markers. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.

Povž, M./ Jesenšek, D./ Berrebi, P./ Crivelli, A.J. Soška postrv Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817, v porečju Soče v Sloveniji. Arles, Tour du Valat, 1996, s. 11-15.


106

Povž, M./ Sket, B. Naše sladkovodne ribe. Ljubljana, Mladinska knjiga, 1990, s. 85-86.

Prokofieva, A. On the chromosome morphology of certain pisces. Cytologia, 5(1934), s. 498-506.

Queller, D.C./ Strassmann, J.E./ Hughes, C.R. Microsatellites and kinship. Trends Ecol. Evol., 8(1993), s. 258-288.

Robins, C.R./ Bailey, R.M./ Bond, C.E./ Brooker, J.R./ Lachner, E.A./ Lea, R.N./ Scott, W.B. A list of common and scientific names of fish from the United States and Canada. Bethesda, Am. Fish. Society, 1980, s. 11-19.

Roewer, L./ Riess, O./ Prokop, O. Hybridization and polymerase chain reaction of simple DNA sequnces for the analysis of forensic stains. Electrophoresis, 12(1991), s. 181-186.

Rubinsztein, D.C./ Amos, W./ Leggo, J./ Goodburn, S./ Jain, S./ Li, S.H./ Margolis, R.L./ Ross, C.A./ Ferguson-Smith, M.A. Microsatellite evolution-evidence for directionality and variation in rate between species. Nat. Genet., 10(1995), s. 337-343.

Ryman, N./ Allendorf, F.W./ Stähl,G. Reproductive isolation with little genetic divergence in sympatric populations of brown trout (Salmo trutta). Genetics, 92(1979), 247-262.

Saitou, N./ Nei, M. The neighbour-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol., 4(1987), s. 406-425.

Sajantila, A./ Pacek, P./ Lukka, M./ Syvanen, A.C./ Nokelainen, P./ Sistonen, P./ Peltonen, L./ Budowle, B. A microsatellite polymorphism in the von Willebrand factor gene: comparison of allele frequencies in different population samples and evaluation for forensic medicine. Forensic Sci. Int., 68(1994), s. 91-102.

Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Dinucleotide repeat polymorphism of rainbow trout, FGT2. J. Anim. Sci.,(1994 a), s.2765.

Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Dinucleotide repeat polymorphism of rainbow trout, FGT3. J. Anim. Sci.,(1994 b), s.2766.

Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Dinucleotide repeat polymorphism of rainbow trout, FGT4. J. Anim. Sci.,(1994 c), s.2767.

Sakamoto, T./ Okamoto, N./ Ikeda, Y. Rapid communication: Dinucleotide repeat polymorphism of rainbow trout, FGT5. J. Anim. Sci.,(1994 d), s.2768.

Sala, B. Loess fauna in deposits of shelters and caves in the Veneto region and examples in other region of Italy. V: The loess in northern and central Italy. Milano, Editrice Gutenberg, 1990, s. 139-149.


107

Sanger, F./ Nicklen, S./ Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-termination inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977), s. 5463-5467.

Schöltterer, C./ Tautz, D. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res., 20(1992), s. 211-215.

Schlötterer, C./ Amos, B./ Tautz, D. Conservation of polymorphic sequence loci in cetacean species. Nature, 354(1991), s. 63-65.

Shedlock, A.M./ Parker, J.D./ Crispin, D.A./ Pietsch,T.W./ Burmer, G.C. Evolution fo the salmonid mitochondrial control region. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1(1992), s. 179-192.

Sket, B. Ključ za določevanje živali. Sladkovodne ribe/Pisces. Ljubljana, Inštitut za biologijo, 1967, s. 52-54.

Slatkin, M. A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics, 139(1995), s. 457-462.

Slettan, A./ Olsaker, I./ Lie, Ø. Atlantic salmon, Salmo salar L., microsatellites at the SSOSL25, SSOSL85 and SSOSL311 loci, SSOSL417 loci. Anim. Genet., 26(1995 a), s. 281-282.

Slettan, A./ Olsaker, I./ Lie, Ø. A polimorphic dinucleotide repeat microsatellite in Atlantic salmon, Salmo salar (SSOSL436). Anim. Genet., 26(1995 b), s. 368.

Slettan, A./ Olsaker, I./ Lie, Ø. Polymorphic Atlantic salmon, Salmo salar L., microsatellites at the SSOSL438, SSOSL439 and SSOSL444 loci. Anim. Genet., 27(1996), s. 57-64.

Slingsby, J.H./ Hogarth, M.B./ Simpson, E./ Walport M.J./ Morley B.J. New microsatellite polymorphisms identified between C57BL/6, C57BL/10, and C57BL/KsJ inbred mouse strains. Immunogenetics, 43(1996), s. 72-75.

Snoj, A./ Pohar, J./ Dovč, P. The First Microsatellite DNA Marker for Marble Trout, BFRO 001. J. Anim. Sci., 75(1997), s. 1983.

Spidle, A.P./ Bentzen, P. Use of microsatellites in conservation genetics of Pacific salmon. V: Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, 1995-07-10/13.

Stalling, R.L./ Ford, A.F./ Nelson, D./ Torney, D.C./ Hildebrand, C.E./ Moyzis, R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in Mammalian genomes. Genomics, 10(1991), s. 807-815.

Stallings, R.L. Conservation and evolution of (CT)n/(GA)n microsatellite seuences at orthologous positions in diverse mammalian genomes. Genomics, 25(1995), s. 107-113.


108

Stallings, R.L. Distribution of trinucleotide microsatellites in different categories of mammalian genomic sequence: implications for human genetic diseases. Genomics, 21(1994), s. 161-121.

Strand, M./ Prolla, T.A./ Liskay, R.M. Petes, T.D. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 365(1993), s. 274-276.

Tautz, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res., 17(1989), s. 6463-6471.

Tautz, D. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences. V: DNA fingerprinting: State of the science. Basel, Birkhäuser Verlag, 1993, s. 21-28.

Tautz, D./ Renz, M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res., 12(1984), s. 4127-4138.

Tautz, D./ Trick, M./ Dover, G.A. Cryptic simplicicity in DNA is a major source of genetic variation. Nature, 322(1986), s. 652-656.

Thomas, W.K./ Beckebach, A.T. Variation in salmonid mitichondrial DNA: evolutionary constraints and mechanisms of substitutions. J. Mol. Evol., 29(1990), s. 101-112.

Tomkinson, A.E./ Linn, S. Purification and properties of a strand specific endonuclease from mouse cell mitochondria. Nucleic Acid Res., 14(1986), s. 9579-9593.

Tsukiyama, T./ Becker, P.B./ Wu, C. ATP-dependent nucleosome disruption at a heat-shock promoter mediated by binding of GAGA transcription factor. Nature, 365(1994), s. 274-276.

Utter, F./ Aebersold, P./ Winans, G. Interpreting genetic variation detected by electrophoresis. V: Population genetics and fishary management. Seattle, Washington Sea Grant, 1988, s. 21-46.

Valdes, A.M./ Slatkin, M./ Freimer, N.B. Allele frequencies at microsatellite loci: the stepwisemutation model revisited. Genetics, 133(1993), s. 737-749.

Verspoor, E. Widespread hybridization between native Atlantic salmon, Salmo salar, and introduced brown trout, S. trutta, in eastern Newfundland. J. Fish. Biol., 32(1988) s. 327-334.

Vuković, T. Sistematika riba. V: Slatkovodno ribarstvo. Zagreb, Jumena, 1982, s. 105-112.

Weber, J.L. Informativness of human (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, 7(1990), s. 524-530.


109

Weber, J.L./ May, P.E. Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet., 44(1989), s. 388-396.

Weissenbach, J./ Gypapy, G./ Dib, C./ Vignal, A./ Morissette, J./ Millasseau, P./ Vaysseix, G./Lathrop, M. A second-generation linkage map of the human genome. Nature, 359(1992), s. 794-801.

White, P.S./ Densmore III, L.D. Mitochondrial DNA isolation. V: Molecular genetic analysis of populations. A practical approach. New York, Oxford University Press, 1992, s. 37-43.

Wilson, G.M./ Thomas K.W./ Beckenbach, A.T. Intra- and inter-specific mitochondrial DNA sequence divergence in Salmo: rainbow, steelhead, and cutthroat trouts. Can. J. Zool., 14(1985), s. 2088-2094.

Wintero, A.K./ Fredholm, A.K./ Thomsen, P.D. Variable (dG-dT)n.(dC-dA)n sequences in the porcine genome. Genomics, 12(1992), s. 281-288.

Wright, J.M. The evolving technology of DNA fingerprinting. Molecular biology in fish, fisheries and aquaculture. An international symposium, Plymouth, UK, July 10-13, 1995.

Zajc, I. Filogenija rodu Triturus: uporaba s PCR pomnoženih delov mitohondrijske DNA. Magistrsko delo. Ljubljana, BF, Oddelek za biologijo, 1992, 94 s.

Zajc, I. Ponavljajoča se zaporedja DNA pri različnih pasmah domačega psa, Canis familiaris. Doktorska disertacija, Ljubljana, MF, 1996, 162 s.

Zardoya, R./ Garrido-Pertierra, A./ Bautista, J.M. The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA genome of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. J. Mol. Evol., 41(1995), s. 942-951.


110

univerza v ljubljani biotehniŠka fakulteta … · kg molekularna biologija / molekularna genetika...

Documents